Academic literature on the topic 'Complexe du pyruvate déshydrogénase'

L'objectif de ce travail est d'explorer en détail le métabolisme de lignées astrocytaires dérivant de la moelle épinière d'embryons de rat. La respiration mitochondriale, certains paramètres de la glycolyse et l'activité de l'oncogène Akt sont étudiés dans les lignées en passages précoces (EP) et dans les lignées en passages tardifs (LP), qui se sont spontanément transformées après avoir été maintenues pendant plus de 35 passages dans le milieu de culture ne contenant pas de pyruvate. Dans les LP, en comparaison avec les EP, il existe une diminution de la glycolyse, une réduction du nombre de mitochondries par cellule et un déficit de la respiration portant sur les complexes I et II+III de la chaîne respiratoire mitochondriale. Le traitement des LP par le pyruvate, pendant 20 passages supplémentaires, ne modifie pas l'état de transformation des cellules. Alors que ce traitement rétablit la glycolyse, aucun effet bénéfique n'est constaté sur le déficit respiratoire. Le traitement des EP par du pyruvate, jusqu'à ce qu'elles soient par définition en passages tardifs, prévient la transformation spontanée. Alors que les EP traitées par le pyruvate ont un déficit modéré de la respiration, elles renferment 2 fois plus de mitochondries par cellule que les EP non traitées. L'augmentation du nombre de mitochondries compense le déficit modéré de la respiration afin de maintenir les capacités d'oxydation dans ces lignées tardives qui ne sont pas transformées. Dans l'ensemble des lignées, l'activité de l'oncogène Akt varie dans le même sens que la glycolyse et que la respiration et est directement stimulée par le pyruvate dans les lignées traitées. En conclusion, ce travail ouvre de nouvelles perspectives quant à la compréhension des mécanismes possiblement associés à la transformation astrocytaire et met en évidence de nouvelles voies thérapeutiques potentielles afin d'améliorer le contrôle des proliférations astrocytaires.

Chez les organismes anaerobies stricts et quelques microorganismes aerobies, la decarboxylation oxydative du pyruvate en acetyl-coa et co#2 est catalysee par la pyruvate: ferredoxine/flavodoxine oxydoreductase (por). Jusqu'a present, cet enzyme a ete isole a partir de quelques microorganismes appartenant a des regnes tres differents allant des archae jusqu'aux protozoaires. Chez les bacteries anaerobies strictes telles que les bacteries sulfato-reductrices (bsr), la por joue un role majeur car elle est impliquee dans la reaction phosphoroclastique qui permet a ces microorganismes de se procurer de l'energie par phosphorylation au niveau du substrat. Nous avons purifie et caracterise la por d'une bsr desulfovibrio africanus. Contrairement aux por des autres organismes anaerobies, la por de d. Africanus est stable vis a vis de l'oxygene au cours de la purification en conditions aerobies. L'enzyme est un homodimere de 270 kda qui possede une molecule de thiamine pyrophosphate (tpp) par sous-unite enzymatique. La por possede egalement comme cofacteur trois centres 4fe-4s par sous-unite dont les potentiels de demi-reduction sont: -390, -515 et -540 mv. Nous avons mis en evidence l'existence de trois etats d'activite de la por de d. Africanus: un etat desactive que l'on observe en purifiant l'enzyme en presence d'oxygene et qui possede une activite specifique de 14 u/mg, un etat actif que l'on obtient en incubant l'enzyme en presence de reducteurs de ponts disulfures tels que le dithioerythreitol ou la thioredoxine, dont l'activite specifique est de 70 u/mg et enfin, un etat inactif irreversible qui est obtenu lorsque l'etat actif de l'enzyme est mis en presence d'oxygene. L'etude du mecanisme reactionnel de l'enzyme par spectroscopie rpe a montre qu'un radical libre etait forme au cours du processus catalytique. Ce radical libre est un intermediaire reactionnel entre le pyruvate et l'acetyl-coa. Les deux electrons produits au cours du processus catalytique seraient ensuite transferres a la ferredoxine i ou ii de d. Africanus. En effet, l'etude de la specificite de la por vis a vis des transporteurs naturels d'electrons a montre que l'activite maximum est detectee en presence de ces deux ferredoxines. De plus, cette etude nous a conduit a purifier et caracteriser trois cytochromes de type c de desulfovibrio africanus. La determination de la structure primaire de la por de d. Africanus a permis de montrer que cet enzyme possede au moins deux domaines fonctionnels situes dans la partie c-terminal de la proteine. Un premier domaine comprend huit residus de cysteines organises en motif caracteristique de l'attachement de deux centres 4fe-4s de type ferredoxine. Ce domaine serait donc implique dans la chelation de deux des trois centres fe-s caracterises biochimiquement. Le troisieme centre serait chelate par quatre cysteines organisees en cluster atypique et situees egalement du cote c-terminal de la proteine. Le deuxieme domaine possede un tripeptide gdg retrouve dans la majorite des decarboxylases et serait donc implique dans l'association du tpp a l'enzyme. Des etudes de cristallisation de la por ont permis l'obtention de cristaux qui diffractent aux rayons x a 3,4 a de resolution. La resolution de la structure tridimensionnelle de cet enzyme est actuellement en cours

L'objectif général de ce travail est l'étude du métabolisme central et plus particulièrement des voies anaplérotiques chez corynebacterium glutamicum lors de la fermentation glutamique. Au cours du procédé utilisé, l'excrétion du glutamate chez C. Glutamicum 2262 est induite par une élévation de la température du milieu de culture de 33°C à 39°C. Ce traitement, en provoquant une orientation du métabolisme vers l'excrétion de glutamate au détriment de la croissance, permet la production de 85 g/l de glutamate en 24 h. Afin d'acquérir le maximum de connaissances concernant deux enzymes anaplérotiques, la phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPc) et la pyruvate carboxylase (Pc), une étude de leur régulation in vitro ainsi qu'une modification de leur activité au cours de la fermentation glutamique ont été réalisées. Les mesures in vitro ont montré que le glutamate est un inhibiteur de l'activité PEPc et, grâce à la mise au point d'une nouvelle méthode de dosage de l'activité Pc, qu'il n'a aucune action sur cette dernière activité enzymatique. Afin de préciser le rôle de ces deux enzymes au cours de la fermentation glutamique, l'activité PEPc a été amplifiée par modification génétique de la souche de C. Glutamicum utilisée alors que l'activité Pc a pu être éliminée par la limitation du milieu de culture en biotine. Les résultats obtenus suggèrent que la Pc est l'enzyme anaplérotique majoritaire pendant la phase de production de glutamate. La PEPc ne pourrait intervenir que pendant les toutes premières heures suivant l'induction de l'excrétion du glutamate.

Lors de ce travail, une étude comparative entre trois souches de C. glutamicum a été réalisée. Celles-ci sont C. glutamicum 2262, une souche surproductrice de glutamate suite à l’élévation de température du milieu de culture de 33 à 39°C, C. glutamicum 2262 NP un variant incapable d’excréter du glutamate dans ces mêmes conditions et C. glutamicum 2262 ∆pks13 un mutant dépourvu de bicouche mycolique externe. Un modèle métabolique original reprenant les différentes modifications physiologiques aboutissant à l’excrétion du glutamate au cours du procédé thermo-induit a été établi. La bicouche mycolique joue un rôle primordial puisque son absence affecte sévèrement la production du glutamate. Dans un premier temps, l’élévation de température serait ressentie au niveau de cette bicouche. Ce ressenti, visualisé par l’accumulation de protéines caractéristiques d’un stress thermique, est nécessaire pour que la bactérie soit en capacité de surproduire le glutamate. Par la suite, la production de glutamate est régulée au niveau de l’α-cétoglutarate déshydrogénase (ODH) grâce à la phosphoprotéine OdhI. Suite au changement de température, celle-ci est déphosphorylée ce qui lui permet d’interagir avec ODH et de provoquer l’inhibition de cette dernière. Ceci se traduit par la redirection sur flux carboné vers la synthèse du glutamate. Aucun de ces évènements n’est observé chez C. glutamicum 2262 ∆pks13. Par ailleurs, l’élévation de température induit une modification de la composition de l’enveloppe cellulaire qui semble intervenir dans le processus physiologique aboutissant à l’excrétion du glutamate puisque très peu de changements sont observés chez C. glutamicum 2262 NP
During this work, a comparative study between three strains of Corynebacterium glutamicum was carried out. These strains were C. glutamicum 2262 which overproduces glutamate after an increase in the culture temperature from 33 to 39°C, C. glutamicum 2262 NP which is unable to produce glutamate in the same culture conditions and C. glutamicum 2262 ∆pks13 devoid of outer corynomycolic acid bilayer. An original metabolic model describing the successive physiological modifications responsible for the glutamate excretion during the temperature-triggered process was established. The presence of the corynomycolic acid bilayer appeared to be necessary since its lack affected dramatically the glutamate production. The temperature increase would be first sensed at the level of the external corynomycolic acid layer. This sensing was visualised through the accumulation of thermal stress proteins. In C. glutamicum 2262 ∆pks13, the synthesis of these proteins was not induced. The glutamate production is regulated at the oxoglutarate dehydrogenase (ODH) level by the phosphoprotein OdhI. A consequence of the temperature increase was the dephosphorylation of this regulatory protein and its interaction with ODH, provoking its inhibition. The carbon flux was then reoriented toward the glutamate synthesis. In C. glutamicum 2262 ∆pks13, no dephosphorylation of OdhI and no change in the ODH activity were not determined. The thermal stress also induced a change in the composition of the corynomycolic acid layer which was correlated with the ability of C. glutamicum 2262 to overproduce glutamate. In C. glutamicum 2262 NP, the composition of the corynomycolic acid layer remained unchanged

Le pyruvate est rapidement decarboxyle par les mitochondries des tumeurs d'ehrlich pour former de l'acetoine qui, si ajoutee aux mitochondries, est rapidement utilisee pour former de petites quantites d'ethanol et de citrate. Elle a aussi ete detectee dans les mitochondries as 30-d mais pas dans celles du foie de rat controle. Elle resulte de la condensation d'acetaldehyde active et d'acetaldehyde par le complexe pyruvate deshydrogenase tumoral (pdh). Elle controle le metabolisme du pyruvate par l'inhibition competitive du complexe pdh, ainsi que l'oxydation du succinate qu'elle inhibe. La forte accumulation de cholesterol dans les membranes mitochondriales entraine une diminution de la fuite passive des protons. Cette derniere, avec la presence insolite d'isozymes de la creatine kinase et la presence d'une hexokinase liee a la membrane externe de la mitochondrie alimentant la glycolyse a partir d'atp mitochondrial, contribuent a distribuer efficacement les molecules energetiques pour les besoins cellulaires comme la division. Une anomalie de la restriction de l'adn mitochondrial as 30-d accompagne ce metabolisme deviant: un des deux sites de restriction par l'enzyme xba i a disparu. Les molecules normales et mutees coexistent avec une heteroplasmie d'environ 50%

Role probable de la pyruvate deshydrogenase au cours de l'inhibition de l'oxydation du glucose dans les enterocytes isoles de rat. Oxydation des acides gras a longue chaine. Tous les effets du vip peuvent etre supprimes par l'adrenaline qui bloque la stimulation par le vip de la production d'amp cyclique

Enterococcus faecalis est une bactérie lactique qui fermente le lactose et qui a la propriété de se développer dans différentes conditions de stress. Chez E. Faecalis deux gènes de lactate déshydrogénase (ldh1 et ldh2) sont présents et le métabolisme conduit principalement à la production de lactate. Lorsque les deux gènes ldh sont interrompus, le rendement en éthanol est amélioré (Yp/s : 0,11 g/g) mais reste insuffisant dans l’optique du développement d’un procédé industriel. Les gènes pdc, codant pour l'enzyme pyruvate décarboxylase, de deux bactéries à Gram positif - Sarcina ventriculi (pdcSv) et Clostridium acetobutylicum (pdcCa) - ont été insérés chez le mutant Δldh2 d'E. Faecalis sous le contrôle du promoteur du gène ldh1. En utilisant le lactose comme substrat, des rendements en éthanol de 0,19 g/g avec pdcSv et 0,18 g/g avec pdcCa ont été obtenus. Le gène pdcCa a également été exprimé chez le double mutant ldh en utilisant un plasmide d’expression et un haut niveau d’expression et d’activité de l'enzyme PDC a permis d’obtenir un rendement en éthanol de 0,46 g/g. E. Faecalis génétiquement modifiée pourrait être utilisée pour la production d'éthanol à partir du lactosérum sous-produit de l'industrie laitière. Les analyses transcriptionnelles ont montré qu’en l'absence d'enzymes LDH, le pyruvate est redistribué vers différentes voies cataboliques en fonction de l'affinité des enzymes afin de maintenir l'équilibre d'oxydo-réduction. Les mutants ldh sont généralement moins résistants à différents stress et moins capables de colonisation tissulaire que la souche sauvage. Cela montre que l'enzyme LDH joue un rôle majeur dans la survie et la virulence d’E. Faecalis
Enterococcus faecalis is a lactic acid bacterium that can metabolize lactose and has the ability to withstand many environmental stresses. E. Faecalis harbours two genes of lactate dehydrogenase (ldh1 and ldh2) and the metabolism leads mainly to the production of lactate. When both ldh genes were deleted the ethanol yield was increased (Yp/s : 0. 11g/g). The pyruvate decarboxylase genes (pdc) , from two Gram positive bacteria - Sarcina ventriculi (pdcSv) and Clostridium acetobutylicum (pdcCa) - were inserted under the control of the ldh1 promoter in the ∆ldh2 mutant strain. Using lactose as substrate, ethanol yield were 0. 19 g/g and 0. 18 g/g, with pdcSv and pdcCa respectively. The pdcCa was also expressed in the ldh double mutant using an expression plasmid carrying a promotor inducible with nisin leading to an ethanol yield of 0. 46 g/g. Therefore, genetically engineered E. Faecalis could be used for ethanol production from dairy wastes rich in lactose. Transcriptional analysis showed that in the absence of LDH enzymes, pyruvate is distributed through different metabolic pathways, depending on the affinity of the enzymes for pyruvate, in order to maintain the redox balance. Therefore, a differential expression of the genes involved in pyruvate metabolism was observed. In addition, the ldh mutants were found to be generally more sensitive to different stresses than the wild type strain and also less capable of colonizing cells host. This shows that the enzyme ldh has a main role in the survival of E. Faecalis under stressed conditions and that it is essential for virulence

Le diagnostic des érythroenzymopathies est fondé sur la mise en évidence de la baisse d'activité de l'enzyme dans les hématies. Cette mesure est délicate pour les raisons suivantes : préparation et conservation des réactifs, précision de la température et du pH, stabilité de l'enzyme au cours du temps. L'inexistence de solutions de contrôle adaptées à l'enzymologie érythrocytaire constitue un handicap qui oblige à recourir à un hémolysat préparé le même jour à partir d'un sujet témoin. L'objectif de ce travail est de préparer un matériel de contrôle destiné aux laboratoires d'analyses médicales pour déterminer des activités enzymatiques et dépister sans erreur les déficits enzymatiques érythrocytaires les plus fréquents, notamment ceux de la glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) et de la pyruvate kinase (PK). Le travail est divisé en deux parties : une première partie, exclusivement bibliographique, comprend un rappel des caractéristiques d'une solution de contrôle enzymatique, une revue des méthodes de stabilisation des enzymes suivie de l'étude des propriétés structurales et catalytiques de G6PD et PK érythrocytaires et de leur exploration biologique. La seconde partie rassemble nos travaux experimentaux permettant de préparer une solution de contrôle à partir d'un hémolysat humain où les deux enzymes endogènes sont stabilisées par l'apport de différents protecteurs. A partir de l'ensemble de nos résultats nous pouvons proposer les modalités permettant d'obtenir des solutions de contrôle possédant des activités G6PD et PK stables, un comportement et une commutabilité trés proches de celles des échantillons des patients : -solution de contrôle liquide prête à l'emploi : hémolysat additionné de TMAO 1 mol/l, de NADP+ 0,5 mmol/l, de PEP 0,5 mmol/l et de glutathion réduit 0,1 mmol/l ; -solution de contrôle lyophilisée : hémolysat additionné de saccharose 10%, (ou tréhalose 10% ou raffinose 10%), NADP+ 0,5 mmol/l, PEP 0,5 mmol/l, N-acétylcystéine 0,25 mmol/l et d'azide de sodium 0,01% (p/v).