Academic literature on the topic 'Conformation des récepteurs'

Les récepteurs-canaux pentamériques (RCPs) sont des canaux ioniques impliqués dans la transmission synaptique et sont modulées par de nombreuses molécules thérapeutiques et/ou addictives. Trois états allostériques des RCPs sont en équilibre à la membrane : un état basal, un état actif, avec un canal ouvert, et enfin lors d’une activation prolongée un état fermé dit désensibilisé. Deux homologues bactériens, GLIC et ELIC, dont la structure est connue, ont permis de concevoir un modèle de transition entre état ouvert (GLIC) et état fermé (ELIC). Ce travail avait pour objectifs 1) d’essayer d’obtenir un état fermé de GLIC pour créer un model plus pertinent et 2) d’obtenir des informations sur les transitions de GLIC dans sa membrane. J’ai donc combiné mutagénèse dirigée, électrophysiologie sur ovocytes de Xénope, biochimie et, en collaboration, la cristallographie aux rayons X. Nous avons réussi à stabiliser une conformation fermée de GLIC, différente de celle d’ELIC. Cette nouvelle conformation, appelée locally-closed, et adoptée par six mutants différents, présente un pore ionique localement fermé et semble correspondre, d’après les données fonctionnelles, à un état intermédiaire sur le chemin de l’activation. J’ai également étendu les résultats obtenus sur GLIC au récepteur de la glycine humain, ce qui montre que GLIC est un modèle pertinent pour l’étude des transitions allostériques des RCPs. Enfin, une nouvelle pharmacologie de GLIC a été développée pour en améliorer l’utilisation en biophysique, ce qui a permis l’identification d’une série de molécules antagonistes
Pentameric Ligand-Gated Ion Channels (pLGICs) are involved in synaptic transmission and modulated by a large number of drugs. Three allosteric states are in equilibrium at the membrane: a basal state, an active state, which is open, and a closed desensitized state observed during prolonged agonist application. Two bacterial homologues of pLIGICs, GLIC and ELIC, whose structure is known, led to a transition model between open (GLIC) and closed (ELIC) conformations. This work had two main goals: 1) capture a closed conformation of GLIC to build a better model and 2) obtain structural data on GLIC when it is at the cell membrane. I combined site-directed mutagenesis, electrophysiology and biochemistry, together with, in collaboration, X-ray crystallography. We stabilized a novel closed conformation of GLIC, different from the ELIC one. This novel conformation, called locally-closed and adopted by six different mutants, exhibits an locally closed ionic pore, and seems to correspond to an intermediate state from basal to active states, according to functional studies. I also expend these findings on the human glycine receptor, showing that GLIC is a valid model for studying allosteric transitions of pLGICs. Finally, a novel pharmacology for GLIC was developed to improve the use of GLIC in biophysical studies, leading to the discovery of a series of antagonist molecules

Les hexaphyrines sont des macrocycles constitués de six unités pyrroliques, elles possèdent des propriétés physico-chimiques intéressantes, dont notamment leur capacité à exister sous deux états oxydés stables, à 26 et 28 électrons π délocalisés. Elles peuvent coordonner jusqu’à deux cations métalliques au sein du macrocycle, cependant elles souffrent d’un manque de réactivité et de prédictibilité quant à la nature des complexes formés. Pour pallier à ces problèmes, nous avons décidé de suivre une stratégie de post-modification du macrocycle, mettant en jeu l’incorporation sans précédent d’un habillage périphérique ou apical fonctionnel. Nous avons cherché à diversifier la nature de l’habillage, en travaillant dans un premier temps sur des fonctions acides carboxyliques portées par un bras, puis par une anse dans le but d’augmenter la préorganisation du système. Cette stratégie s’est montrée fructueuse et durant les études de coordination, quatre cations métalliques, le ZnII, le CdII, le PbII ainsi que le HgII ont montré des réactions de métallations instantanées et inédites à température ambiante. Dans un second temps, nous avons étudié l’influence d’un habillage tripodal sur les propriétés de coordination du macrocycle hexaphyrinique. La métallation dans des conditions spécifiques de ces nouvelles hexaphyrines, a mis en évidence la première synthèse hautement diastéréosélective d’un complexe aromatique avec une topologie en anneau de Möbius. Cette synthèse nous à servi de preuve de concept sur le développement de potentiels détecteurs chiroptiques, basés sur un changement de topologie et d’aromaticité du ligand après métallation induit par l’analyte
Hexaphyrins are six-pyrrole member macrocycles, which possess several interesting physico-chemical properties, and specially their abilities to exist as two stable oxidation states. They also can coordinate two metallic cations, unfortunately they suffer from a lack of reactivity and from unpredictable behaviors regarding the nuclearity of the complexes. To overcome these problems, we decided to follow a macrocycle post-modification strategy, using the unprecedented peripheral dressing of the hexaphyrin. We tried to explore few functions and started working with carboxylic acid groups on a piquet and then on a strap to extend the preorganization of the coordinated function. This strategy showed good results and instantaneous metalation with four metalics cations, ZnII, CdII, PbII and HgII at room temperature. Meanwhile we studied the behavior in coordination chemistry of novel tren-capped hexaphyrin. Thus we highlight the first diastereoselective synthesis, involving the formation of complexes showing Möbius strip topology. This system was used as proof of concept for the development of potential chiroptical sensors, based on a topology switch after metalation triggered by the analyte

La voie de signalisation Hedgehog constitue l’une des plus importantes voies dans le développement embryonnaire et la prolifération des cellules souches chez l’adulte. Cette voie implique deux protéines membranaires, Patched et Smoothened, dont les dysfonctionnements sont associés à de très nombreux cancers. Durant ma thèse, j’ai mis au point l’expression hétérologue du récepteur humain Smoothened (hSmo) et sa purification pour une caractérisation structurale et fonctionnelle. L’expression de hSmo a été réalisée dans la levure Saccharomyces cerevisiae. Utilisant la technique SPR, j’ai démontré que hSmo exprimé à la membrane plasmique de la levure est dans sa conformation native capable de fixer son antagoniste. J’ai ensuite mis au point la purification de hSmo et testé de nouvelles classes de surfactants. J’ai ainsi trouvé les meilleures conditions qui stabilisent le récepteur hSmo en solution après purification. La caractérisation d’une mutation ponctuelle au niveau de la 3ème boucle intracellulaire combinée à l’utilisation des nouveaux surfactants ont permis d’améliorer la stabilité de hSmo en solution. Les conditions que j’ai mises au point permettront l’étude structurale de hSmo et les essais de cristallisation. D’autre part, les stratégies développées en SPR permettront la recherche des partenaires protéiques cytoplasmiques de ce récepteur, encore inconnus à ce jour, afin de mieux comprendre la signalisation en aval de Smoothened. Les données structurales ainsi que la découverte des partenaires protéiques cytoplasmiques de hSmo permettront l’élaboration de nouvelles thérapies anticancéreuses
The Hedgehog pathway is one of the most important pathways in embryogenesis and in proliferation of adult stem cells. This pathway involves two transmembrane receptors, Patched and Smoothened whose dysfunctions have been linked to many human diseases including cancers. This study reports expression and purification of the human GPCR Smoothened, for structure-function relationship characterization. Therefore I developed the heterologous expression of Human Smoothened (hSmo) in the yeast S. Cerevisiae. Using SPR technology, I showed that hSmo, expressed at the plasma membrane of yeast, is in its native conformation able to bind its antagonist, cyclopamine (CPN). Then, I developed the purification of hSmo by affinity chromatography and tested new surfactants. Results show that the new surfactants stabilize hSmo in solution after purification and are preserve antagonist-binding ability of Smo suggesting that purified hSmo maintains its native conformation in solution. In addition, characterization of a single mutation of Smoothened (hSmoG435R) combined to one of the surfactants, revealed an enhanced stability of the receptor. These established conditions will be useful for crystallization assays. SPR strategies developed in this study will also be used for the research of hSmo’s cytoplasmic partners. Together, structural and functional data will contribute to the better understanding of Smo signaling and to the development of new cancer therapies

Les récepteurs nicotiniques (nAChR) sont des protéines membranaires qui appartiennent à la superfamille des récepteurs Cys-loop. Chez les mammifères, ces récepteurs sont impliqués dans la transduction du signal nerveux. Il existe une grande variété de récepteurs nicotiniques qui interviennent dans différents processus cognitifs. De ce fait, ils sont impliqués dans de nombreux dysfonctionnements neuronaux et constituent une cible thérapeutique prometteuse. La conception de nouveaux ligands ciblant ces récepteurs nécessite en amont de caractériser les déterminants structuraux qui définissent l'effet agoniste ou antagoniste d'un ligand pour un récepteur. A ce jour il n'existe pas de protéines à suffisamment haute résolution permettant une étude structurale des interactions protéine-ligand. En revanche il existe des données expérimentales à haute résolution concernant deux types de protéines homologues aux récepteurs nicotiniques qui ont permis de réaliser des études structurales. D'une part, un criblage virtuel réalisé sur une protéine orpheline procaryote homologue aux récepteurs nicotiniques a permis de déceler un antagoniste de cette protéine. D'autre part, les structures de la protéine soluble Acetylcholine Binding Protein homologue des récepteurs nicotiniques ont été utilisées pour étudier les interactions protéine-ligand
For structure calculation, the main source of information from Nuclear Magnetic Resonance (NMR experiments is the Nuclear Overhauser Effects (NOEs), which provide information about the distance between some protons of the molecule studied. The ARIA software package (for "Ambiguous Restraints for Iterative Assignment") is used to analyse and interpret NMR data, to determine a set of three-dimensional structures consistent with experimental data. ARIA uses the above measures in the form of distance constraints imposed, in silico, on the molecule. To impose these distances, the software used so far the "Soft Square" potential which presents a window of tolerance around the target distance measured experimental in order to take into account the uncertainties on the experimental data. A Recent analysis has shown the NOE errors follow a log-normal distribution, suggesting the use of a new log-harmonic potential. The aim of my thesis has been to show the effectiveness of the log-harmonic potential in improving the quality of structures determined by NMR. The first part of my thesis focuses on studying the behaviour of the potential with some examples of structures well known and whose data have been manually prepared. In second part, the recalculation of 398 NMR structures has demonstrated the overall improvement of the qualit of structures calculated with the log-harmonic potential. Finally, in a third part, the study of two protein allowed identifying the properties of the log-harmonic potential for error detection in structures

Les récepteurs couplés de protéines G (RCPG) sont des capteurs biologiques polyvalents responsables de la majorité des réponses cellulaires aux hormones et neurotransmetteurs ainsi que des sens de la vue, de l'odorat et du goût. La transduction des signaux est associée à un ensemble de changements dans la structure tertiaire des récepteurs entraînant l'activation de partenaires intracellulaires dont les protéines G. La dimérisation est un élément central du mode de fonctionnement des RCPG ; cependant, son influence sur la façon dont le signal est transmis est encore mal définie.Nous avons utilisé ici le récepteur BLT1 du leucotriène B4 comme modèle afin d'analyser les changements de conformation au cours de l'activation. Pour cela, nous avons produit le récepteur suivant une approche qui consiste à l'exprimer dans les corps d'inclusion bactériens puis à le renaturer à l'aide de détergents et/ou surfactants originaux. L'accès au récepteur purifié nous a permis de montrer que la protéine G induit une asymétrie dans les changements de conformation au sein de l'homodimère de BLT1. De plus, nous avons pu établir que l'activation de la protéine G se fait essentiellement par le protomère ayant fixé l'agoniste (cis-activation). Enfin, nous avons montré que la forme monomérique du récepteur est parfaitement capable d'induire l'activation de la protéine G, même si le dimère apporte une modulation de la réponse. Ceci indique qu'un monomère de récepteur possède tous les déterminants moléculaires nécessaires à la transmission du signal. L'ensemble de ces résultats apporte un éclairage nouveau sur la façon dont les dimères de RCPG fonctionnent et peuvent moduler la réponse biologique
G-protein coupled receptors are versatile biological sensors that are responsible for the majority of cellular responses to hormones and neurotransmitters as well as for the sense of sight, smell and taste. Signal transduction is associated with a set of changes in the tertiary structure of the receptor that are recognized by the associated intracellular partners, in particular the G proteins. There is compelling evidence that GPCR can assemble as dimers but the way these assemblies function at the molecular level is still under investigation.We used here the leukotriene B4 receptor BLT1 as a model to analyze the conformational changes occurring during activation. To this end, we first produced the receptor in E. coli inclusion bodies and subsequently folded it back to its native state in vitro using original membrane mimetics. Using the purified dimeric receptor, we showed that (i) the G protein induces an asymmetric arrangement of the BLT1 homodimer where each of the protomers is in a distinct conformation, and (ii) the G protein is cis-activated, i.e. the protomer that binds the agonist also activates Gα. Finally, we brought evidence that, although the dimer fully activates its G protein partner, the monomer has per se all the molecular determinant for an efficient functioning. All these data are original evidence that sheds light into the way GPCR dimers are activated and in turn modulate G protein-mediated signaling

Au niveau de la synapse, la liaison des neurotransmetteurs aux récepteurs membranaires induit l’ouverture de canaux ioniques. Le Récepteur de la Glycine (RGly) est un récepteur ionotrope impliqué dans des troubles neuronaux tels que l’addiction, la douleur chronique, ou l’hyperekplexie ; pour cette raison il est important de développer des nouveaux traitements ciblant ce récepteur. Nous avons utilisé des simulations de Dynamiques Moléculaire (DM) et d’électrophysiologie numérique afin d’évaluer la fonction des structures du RGly disponibles et montré qu’aucune d’entre elles ne satisfait les propriétés fonctionnelles de l’état ouvert. Grâce aux simulations de DM, nous avons caractérisé une nouvelle conformation du RGly, qui est compatible avec cet état. Nous avons souligné le rôle majeur des portails latéraux pour la perméation des ions. Nous avons proposé un protocole, nommé pharmacologie dépendante de l’état, pour identifier des molécules modulatrices de protéines allostériques
Signals within neurons are mostly transmitted through chemical synapses. Signal transduction arises from the binding of neurotransmitters to membrane receptors in order to open ion channels. The Glycine Receptor (GlyR) is an ionotropic receptor which is involved in several neurological disorders such as addiction, chronic pain, or hyperekplexia. Because of its implication in human diseases, it is interesting to design novel drugs targeting this receptor. We used Molecular Dynamics (MD) simulations and computational electrophysiology to probe the function of available GlyR structures. We showed that none of the experimental structures display the physiological behavior of the conductive state. Using MD simulations, we captured a novel conformation of the GlyR compatible with a conductive state and demonstrated the importance of lateral portals for ionic permeation. Lastly, we proposed an original protocol, named state-based pharmacology, to discover modulators of allosteric proteins

Cette thèse vise à réaliser une étude approfondie sur le développement de méthodologies pour l’analyse de systèmes complexes. Cela comprend l’étude des systèmes hors d’équilibre, des systèmes d’auto-assemblage, et les systèmes biologiques désordonnés. Les méthodes développées recouvrent principalement la RMN, tel que la mesure de diffusion (DOSY) mais également d’autres techniques telles que la spectrométrie de masse, le dichroïsme circulaire (CD), la microscopie électronique (EM) et diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS). La partie N-terminale du récepteur des androgènes (AR) est utilisée comme un système complexe. D’après la littérature, il est connu que cette région joue un rôle important pour l’activité du récepteur, et elle est également décrite comme étant intrinsèquement désordonnée. Les résultats que j’ai acquis durant la thèse m’ont permis d’identifier une courte région de ce domaine, impliquée dans la formation réversible de fibres amyloïdes, par modulation des conditions d’oxydo-réduction du milieu. Les résultats révèlent un aspect inconnu du mécanisme de AR
My PhD project was focused on the development of methods for the analysis of complex systems and their biophysical characterization. This includes the study of large chemical libraries, self assembly systems, protein-ligand interaction studies and disordered biological systems. A wide range of biophysical methods were used for this purpose. Specially, Nuclear Magnetic Resonance(NMR) but also other techniques such as mass spectrometry, circular dichroism (CD), electron microscopy (EM) and small angle X-ray scattering (SAXS). The N-terminal Domain of the Androgen Receptor is studied as an example of a complex system. This region plays an important role in receptor activity, and is also described as being intrinsically disordered. The results obtained during my thesis shown a short conserved region involved in the amyloid fibers formation under oxidative conditions. These results open new possibilities to understand the mechanism of the AR activity

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs en anglais) représentent la famille de récepteurs intégrales de membrane plus vaste dans la majorité des cellules eucaryotes. Ils jouent un rôle clé dans la transduction de signal, ainsi que la compréhension de leur mécanisme de signalisation représente une des questions principales dans la biologie d'aujourd'hui. Dans la caractérisation du paysage énergétique de ces récepteurs à l'échelle atomique, les structures cristallographiques publiées pendant la décennie dernière par cristallographie aux rayons X représentent la percée scientifique majeure et donnent une contribution fondamentale dans la biologie structurelle de GPCRS. Ces structures représentent un point de départ précieux dans la compréhension du mécanisme de transduction de signal, en plaçant des structures dans l'ensemble conformationnel de ces récepteurs le long du processus d'activation. Pour compléter ce cadre de structures statiques qui correspondent aux états à basse l'énergie et fortement peuplés, une caractérisation de l'ensemble conformationnel et des barrières cinétiques qui sont associées est un point nécessaire et fondamentale. À ce but nous proposons une approche innovant avec la finalité d'observer le paysage conformationnel dynamique des GPCR et étudier la modulation de ces récepteurs par des ligands et des lipides, qui sont connus pour jouer un rôle clé dans la structure et les fonctions des protéines de membrane (e.g.). Un des outilles le plus approprié pour explorer les barrières cinétiques de GPCR c'est la résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution. Pour tirer profit au mieux de cette technique, nous avons utilisé des sondes marqués 13CH3 immergées dans un environnement perdeuteré, qui constitue le marquage isotopique le plus approprié en RMN pour examiner les paysages conformationnels des protéines de grosses dimensionnes ou des complexes de protéines. Nous avons choisi Escherichia coli comme système d'expression pour sa capacité de pousser dans des conditions très hostiles comme des solutions 100%-D2O. Pour surmonter les difficultés habituellement rencontrées lors de l'expression des GPCRs, nous avons appliqué un protocole innovant qui cible l'expression de GPCRs directement aux corps d'inclusion. Ceci permet la production des bonnes quantités de protéines (jusqu’à 6 mg/litres de culture de pur 13CH3-u-2H-GPCRs). Une fois purifié, le récepteur est foldé en amphipols et transféré ensuite à une double couche lipidique appelée nanometric lipid bilayer ou nanodisc (NLB). De façon très important, les mesures pharmacologiques quantitatives indiquent que les récepteurs incorporés dans des NLBs après ce protocole sont stables et entièrement actifs dans les conditions des expériences de NMR.Les investigations par RMN conduites sur le GPCR en NLB ont donné lieu à une résolution jamais obtenue dans le domaine, grâce à la biochimie finement accordée et à la perdeuteration du récepteur. Selon les données obtenues, notre récepteur modèle, le récepteur 2 pour le leukotriene B4 (BLT2), est capable d'explorer plusieurs conformations différentes, même dans l'état pas lié aux ligands, y compris l'état actif. Ce paysage conformationnel est également modulé par des ligands et des lipides. Dans le cas spécifiques, nous avons observé que un incrément dans le contenu de stérol dans la membrane modifie la distribution des différents états conformationnels du récepteur, en favorisant l'état actif, qui indique une régulation allosteric positif du stérol sur l'activation de ce récepteur, comme confirmé aussi par les mesures de liaison du GTP à la protéine G. Cette propriété du stérol est probablement importante pour le contrôle de mécanisme de signalisation de GPCRs
G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of integral membrane protein receptors present in most eukaryotic cells. They play a key role in signal transduction and understanding their signalling mechanism represents one of the main issues in biology today. In the characterization of the energy landscape of these receptors, at the atomic scale, X-ray crystal atomic structures published during the last decade represent the major breakthrough and contribution in the structural biology of GPCRs. They represent a precious starting point in the understanding of the mechanism of signal transduction by placing structures in the conformational ensemble of these receptors along the activation pathway. To complete these static snapshots that correspond to low energy and highly populated states, a characterization of the whole conformational ensemble and associated kinetic barriers is fundamental to complete the picture. To this aim we proposed an innovative approach to observe GPCRs dynamic conformational landscape and how it is modulated by ligands and lipids, that are known to play a key role in membrane protein structures and functions (e.g.). One of the most appropriate tool to explore GPCR kinetic barriers is solution state NMR. To do so, we used 13CH3 probes immersed in a perdeuterated environment, the most appropriate isotope-labelling scheme to investigate conformational landscapes of large proteins or protein complexes with this spectroscopy. We chose Escherichia coli as expression system for its ability to grow in very hostile conditions like 100%-D2O solutions. In order to overcome the usual expression issues concerning GPCRs, we applied an innovative protocol which targets the expression directly to inclusion bodies. This allows the production of high amounts of proteins (up to 6 mg/litre of culture of pure 13CH3-u-2H-GPCRs). Once purified, receptors are folded in amphipols and then transferred to nanometric lipid bilayers or nanodiscs. Importantly quantitative pharmacological measurements indicate that receptors embedded in NLBs following this protocol are stable and fully active in the conditions of the NMR experiments. NMR investigation of a GPCR in a NLB gave rise to a resolution never achieved in the field thanks to a fine tuned biochemistry and a perdeuteration of the receptor. According to our data, the prototypical receptor, the leukotriene B4 receptor (BLT2), is able to explore multiple different conformations, even in the unliganded state, including the active state. This conformational landscape is further modulated by ligands and lipids. In particular, we observed that an increment in the sterol content of the membrane modifies the distribution of the different conformational states of the receptor in favour of the active one, indicating a positive allosteric regulation of the sterol on the activation of this receptor, as confirmed by GTP-to-G protein binding measurements. This property of the sterol is likely important for the control of the signalling properties of GPCRs

Les récepteurs métabotropes au glutamate (mGluR) sont des RCPG de classe C. Ils sont exprimés dans le système nerveux central où, suite à l'activation par le glutamate, ils participent à la modulation de la transmission nerveuse. En raison de leur rôle essentiel dans la régulation de l'activité synaptique, ils représentent des cibles potentielles pour le développement de médicaments contre les troubles neurologiques et psychiatriques telles que la schizophrénie, l'épilepsie, l'anxiété et la douleur. Mon projet de recherche de doctorat a porté sur l'étude du mécanisme d'activation du domaine extracellulaire de liaison au ligand du mGluR (ECD), avec un accent particulier sur ce qui différencie au niveau moléculaire un agoniste partiel d'un agoniste total. A cette fin, j'ai utilisé une méthode innovante à l'échelle de la molécule unique appelée Transfert d'Energie par Résonance de Forster, développé pour l'étude de la dynamique conformationnelle des molécules individuelles à l'échelle de la nanoseconde. J'ai réussi à montrer que le dimère d'ECD oscille entre une conformation active et une conformation de repos sur une échelle de temps de ~100μsec et que les ligands influencent les vitesses de transition entre ces états avec des vitesses intermédiaires pour les agonistes partiels. Ces résultats sont validés par l'utilisation de mutants spécifiques et indiquent clairement que le rôle des ligands n'est pas de stabiliser une conformation donnée mais de modifier le comportement dynamique du récepteur. L'ensemble de ces résultats contribuent à une meilleure description du mécanisme d'activation des mGluRs, et ouvrent potentiellement la voie à la compréhension des RCPG en général
Metabotropic Glutamate Receptors (mGluRs) are class C GPCRs, expressed throughout the central nervous system. They participate in the long term modulation of neural transmission following activation by the excitatory neurotransmitter glutamate. This critical role in the regulation of synaptic activity makes them promising targets in the development of drugs for the treatment of various neurologic and psychiatric disorders such as schizophrenia, epilepsy, anxiety and pain relief. My Ph.D. research project has focused on the study of the activation mechanism of the mGluR extracellular ligand binding Venus-Flytrap domain (VFT), with particular emphasis on the differences between partial and full agonists on a molecular level. To this aim, I have used a state-of-the-art single molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) approach, developed for the study of conformational dynamics of single molecules on the nanosecond to millisecond timescale. I have managed to show that the VFT-dimer constantly oscillates between an active and a resting conformation on a ~100µsec timescale. I also discovered that the role of ligands is to influence the transition rate between these boundary states, and that partial agonists display intermediate transition rates. My results, supported by the use of specific mutants, clearly indicate that the role of ligands is not to stabilize a given conformation but to modify the overall dynamic of the receptor, which favors a conformational selection mechanism. Altogether, these results represent a most-valuable contribution to the better understanding of the activation mechanism of mGluRs, and potentially GPCRs in general

Les récepteurs couples aux protéines G représentent la majorité des récepteurs cibles en thérapie. Différentes conformations de ces récepteurs semblent coexister à la surface cellulaire. Toutefois, leur caractérisation moléculaire et l'impact de ses conformations sur la fonction des récepteurs restent peu connus. Nous nous sommes intéressés à cette question, en prenant comme modèle le récepteur de chimiokines CCR5. En plus de son rôle physiologique, CCR5 est utilisé par la majorité des souches VIH -1 primaires dites « R5 ». Elles sont responsables in vivo de la transmission et du maintien de l'infection. Des individus qui n'expriment pas CCR5, à cause d'un polymorphisme naturel, sont protégés contre l'infection et ne souffrent pas du manque de CCR5. Ce récepteur représente donc une cible de choix pour une stratégie antivirale. Nous avons d'abord montre dans un article publié en 2014 (Jin, JBC 2014) l'existence de conformations particulières de CCR5 à la surface cellulaire, nommées « spare receptors» pour « récepteurs de réserves ». Nous avons exploite les caractéristiques de l'analogue de chimiokine psc-rantes, qui présente une puissante activité antivirale et induit une séquestration intracellulaire des récepteurs à long terme. Nous relevons l'existence d'une population de récepteurs « de réserves » (non reconnues par les chimiokines natives) dans des expériences de compétition de liaison, d'internalisation et de désensibilisation. Nous montrons en particulier que les chimiokines natives sont incapables d'inhiber la liaison de psc-rantes, l'internalisation induite par psc-rantes ou l'induction d'une réponse calcique médiée par psc-rantes. La capacité de cet analogue à cibler une large quantité de récepteurs explique le recrutement massif de B-arrestine2 observe a la membrane plasmique et l'internalisation importante du récepteur, a l'origine de son fort pouvoir antiviral. Ces récepteurs de réserves pourraient être ceux cibles par les VIH pour échapper à la barrière des chimiokines. Ils représentent des lors une cible prioritaire pour inhiber l'infection. Nous nous sommes ensuite intéressés à l'organisation moléculaire de ses conformations. Différents travaux indiquent d'une part que les récepteurs de chimiokines s'organiseraient sous forme d'oligomères constitutifs et, d'autre part, que cette organisation serait nécessaire au transport des récepteurs vers la surface cellulaire, à la liaison des ligands, à la signalisation et au trafic intracellulaire après stimulation. Cette propriété structurale des récepteurs, sujette à controverse pour les GPCR de classe A, pourrait aussi influencer l'entrée des VIH -1 dans certaines conditions, mais cet effet reste mal connu. Par homologie avec les structures cristallographiques récemment décrites de cxcr4 et du récepteur mu opioïde, nous avons proposé en collaboration avec Esther Kellenberger (Strasbourg) un nouveau modèle de dimérisation de ccr5. A partir de ce modèle, nous avons identifié les résidus impliques dans plusieurs interfaces de dimérisation par des approches biochimique et biophysique. En ciblant ces interfaces par mutagénèse dirigée et en utilisant un test original de suivi de l'export des protéines, nous montrons l'importance de la dimérisation de ce récepteur pour son transport a la surface cellulaire. Ce travail nous a également permis de révéler de nouvelles caractéristiques du compose maraviroc, unique antiviral ciblant CCR5 actuellement sur le marché. Celui-ci par interaction avec CCR5 au niveau du reticulum endoplasmique induit une nouvelle conformation de CCR5 qui favorise son export. Ces résultats bientôt soumis pour publication, révèlent plusieurs conformations de CCR5 et montrent leur rôle fonctionnel. A travers cette thèse, nous abordons l'enjeu d'avoir aujourd'hui une vision des conformations des GPCRS, et discutons l'impact qu'elles pourraient avoir sur la fonction de ces récepteurs et leur ciblage thérapeutique
CCR5 (c-c chemokine receptor type 5), a seven-transmembrane receptor, exhibits multiple conformations at the cell surface based on interactions with ligands, heterotrimeric G proteins, B-arrestins, neighboring gpcrs and membrane lipids, and also based on the location and trafficking of the receptor. These conformations play an important role in receptor functions including ligand binding, cell signaling and trafficking. CCR5 also serves as a co-receptor for r5-tropic human immunodeficiency virus, type 1 (HIV-1) entry. The native chemokines ccl3, ccl4, and ccl5 can compete with HIV-1 gp120 for binding CCR5, and are supposed to form a natural barrier against HIV-1. However, their antiviral activity is limited by a pool of CCR5 adopting conformations that have low-chemokine affinity at the cell surface. We demonetrated that this pool of CCR5 that is not stabilized by chemokines could represent a target for inhibiting HIV-1 infection. We exploited the characteristics of the chemokine analog psc-rantes, which displays potent anti-HIV-1 activity. We show that native chemokines fail to prevent high-affinity binding of psc-rantes, analog-mediated calcium release (in desensitization assays), and analog-mediated CCR5 internalization. These results indicate that this pool of spare CCR5 may bind psc-rantes but not native chemokines. Improved recognition of CCR5 by psc-rantes may explain why the analog promotes higher amounts of b-arrestin2/ccr5 complexes, thereby increasing CCR5 down-regulation and HIV- 1 inhibition. Together, these results highlight that spare CCR5, which might permit HIV-1 to escape from chemokines, should be targeted for efficient viral blockade. Numerous studies also showed that gpcr form dimers or larger oligomers, a process that is involved in gpcr conformational changes. The molecular and functional relevance as well as the interaction interfaces of this organization are still poorly understood. To this aim, by using the HIV-1 coreceptor CCR5, we defined by chemical cross-link and molecular modeling two non-exclusive dimer interfaces, and a third one stabilized by the inverse agonist maraviroc, which indicates that CCR5 could also exhibit multiple conformations through homo-dimerization. We then showed, by site directed mutagenesis combined with saturation time-resolved fluorescence resonance energy transfer and a novel export assay, the essential role of dimerization in receptor transport to the cell surface. These results produce a consensual picture of the interfaces between protomers of class a dimers and reveal the impact of dimerization during biogenesis. They also provide new features of the marketed drug maraviroc highlighting both pharmacological chaperone and allosteric inhibitor activities. Overall, distinguishing multiple CCR5 conformations and their corresponding receptor functions has implications for understanding the selective use of CCR5 by HIV-1 and the development of improved strategies to block CCR5 use by HIV-1