Dissertations / Theses on the topic 'Delbrueckii subsp'

Les bacteries lactiques, gram positives, possedent un systeme proteolytique complexe et essentiel (proteinases et exopeptidases) assurant la degradation des caseines du lait. Quatre aminopeptidases (api-iv), une x-prolyl-dipeptidyl-aminopeptidase (x-pro-dpap) et une proteinase de paroi etaient identifiees chez la souche lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus cnrz397. Nos travaux ont consiste a purifier a partir d'extraits de paroi cette cysteine-proteinase hydrolysant rapidement les caseines. Le monomere de poids moleculaire 170000 est actif dans les conditions optimales suivantes: temperature, 42c et ph 5,5. Un mutant deficient pour cette activite a ete obtenu. Par ailleurs, une proline iminopeptidase (pro-ip) a ete mise en evidence dans la paroi du lactobacille. Le gene pip codant pour cette pro-ip a ete clone puis sequence (981 paires de bases dont les 20 premiers acides amines codes du cote nh2-terminal forment une region hydrophobe semblable aux sequences signals des proteines exportees chez les lactocoques). L'expression du gene pip chez e. Coli permet d'obtenir une activite pro-ip amplifiee 1000 fois, dont 50% sont retrouves dans le periplasme, ce qui a facilite la purification de l'enzyme. Cette serine-protease active sous la forme d'un trimere de poids moleculaire 105000 (3 sous-unites de 35000), agit exclusivement sur les di- et tripeptides dans lesquels la proline est en position amino-terminale. L'enzyme est stabilisee en presence de serumalbumine de buf a 30c et a un ph compris entre 6,0 et 7,0. Les 11 premiers acides amines de la sequence nh2-terminale de la pro-ip purifiee correspondent exactement aux residus 33 a 43 traduits du gene pip. La presence d'une autre enzyme, de type aminopeptidase p, liberant un acide amine lie au cote imine d'une proline, a ete mise en evidence. Enfin, le clonage de la x-pro-dpap du lactobacille chez lactococcus lactis s'etant heurte a des problemes de recombinaison et de rearrangement d'adn, de nouvelles souches hotes de lactococcus lactis ont ete isolees

Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus est une bacterie lactique largement utilisee dans l'industrie laitiere. Le bon deroulement des fermentations realisees par cette espece est souvent entrave par le developpement de bacteriophages. Nous avons choisi d'etudier le phage tempere mv4, representatif d'une grande famille de phages de lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus et lactis, pour ameliorer la resistance aux phages, mais egalement pour mieux comprendre la genetique de l'espece bacterienne sur laquelle il se propage. Une quinzaine de genes ont ete identifies grace au sequencage d'un tiers du genome phagique (12kb). Deux operons tardifs ont ete plus precisement etudies: le gene implique dans la lyse bacterienne et le gene codant la proteine majeure de la capside (34 kda). L'etude de l'expression des genes, abordee par cartographie des arn messagers, a permis de mettre en evidence une sequence consensus originale qui pourrait etre celle d'un promoteur de type tardif. De plus, un fragment d'adn phagique doue d'une activite promotrice dans un hote heterologue, lactobacillus casei, a ete caracterise. Dans une bacterie lysogene, l'adn genomique du phage mv4 est integre sous forme de prophage dans le chromosome, mais est egalement present sous forme lineaire extra-chromosomique. Pour apprehender cette forme de lysogenie originale, la region impliquee dans l'integration phagique a ete analysee: le phage mv4 integre son adn par un mecanisme de recombinaison site-specifique qui fait intervenir une enzyme codee par le phage, l'integrase, et un site d'attachement phagique attp. Cette integration a lieu dans l'extremite 3' du gene d'un arn de transfert present sur le chromosome de l'hote. La comparaison des sequences nucleotidiques du phage mv4 avec celle du phage virulent ll-h, apparente a mv4, a permis d'aborder l'evolution des genes au sein d'une meme famille de phages et de demontrer le role des phages temperes dans l'emergence de phages virulents

Lactic acid bacteria are associated with preservation of foods, including milk, meat and vegetables. Yoghurt is produced by the cooperative action of two starter bacteria
S. thermophilus and L. delbrueckii subsp. bulgaricus. In this study, identification and typing of yoghurt starter bacteria were aimed. Traditional home made yoghurts were collected from different areas of Turkey, identification of those isolates at species and subspecies level and typing at strain level were achieved using PCR based methods. In our study, identification of yogurt starter bacteria was studied using species specific primers and ARDRA. These methods were inefficient in identification of yoghurt starter bacteria, at species and subspecies level. Consequently, a reliable and quick method for accurate identification of yoghurt starter bacteria was developed. The new method focuses on amplification of methionine biosynthesis genes, for selective identification of yoghurt starter bacteria together with some cheese starters. Further discrimination by ARDRA enabled differentiation of yoghurt starter bacteria from cheese starters. Confirmation of the proposed method has been accomplished by partial sequencing of the 16S rRNA gene. After correct identification of starter bacteria had been achieved, the strains were typed at strain level using RAPD-PCR and MLST. RAPD-PCR with primer 1254 resulted better fingerprints, compared to primer M13 at strain level. Comparisons of the two typing methods showed that RAPD-PCR revealed strain diversity better than MLST, however MLST was a more robust and reliable method and resulted in clustering of the strains depending on the isolation source.

Ce travail de thèse vise l'étude des effets des étapes de récolte et de concentration des cellules, sur la dégradation des fonctionnalités de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1. Cet objectif s'accompagne de l'identification des mécanismes physiologiques qui expliquent les différences observées. La mise en œuvre de conditions de stress modéré, permettant aux cellules de s'adapter au stress ultérieur de congélation, constitue le troisième volet abordé dans cette thèse. Lors de la première partie du travail, l'effet d'une acidification en fin de fermentation sur la cryotolérance des cellules a été analysé. Un plan d'expériences a permis de définir la condition optimale d'acidification (pH 5,25 pendant 30 min) induisant une adaptation des cellules. Elle conduit à une meilleure résistance à la congélation et au stockage à -20 °C. Deux mécanismes physiologiques à l'origine de cette adaptation ont été identifiés. Le premier est lié à l'augmentation de la concentration de l'acide gras membranaire C18:1. Le deuxième, caractérisé pour l'analyse du protéome cytoplasmique, correspond à une réduction du métabolisme azoté, une augmentation des métabolismes énergétique et nucléotidique, et à une synthèse plus importante de protéines de stress. Dans une deuxième étape, les cellules ont été concentrées selon différentes conditions de centrifugation (vitesse de rotation, durée et température). Celles-ci n'ont pas d'effet sur la résistance de Lb. bulgaricus CFL1 à l'étape de concentration elle-même, mais présentent un effet faible mais significatif sur leur cryotolérance. Les évolutions de la résistance des cellules à la congélation et au stockage étant opposés, l'effet des conditions de centrifugation sur les cellules stockées à long terme est cependant négligeable. La troisième partie de ce travail a permis de quantifier l'impact de la concentration des cellules par microfiltration, sur leur résistance aux différentes étapes du procédé et sur l'état physiologique de Lb. bulgaricus CFL1. Les résultats montrent que les cellules sont moins résistantes à l'étape de microfiltration qu'à la centrifugation. Par contre, la résistance à la congélation augmente significativement (entre 28 % et 88 %) selon les conditions de microfiltration appliquées, par rapport à la centrifugation. La meilleure cryotolérance a été obtenue pour une vitesse tangentielle égale à 2,01 m.s-1 et une pression transmembranaire de 0,15 MPa. Cette meilleure résistance est liée à une augmentation des teneurs en acides gras C16:0, 18:1 et cycC19:0, ainsi qu'à une réduction de la concentration en C14:0. Les résultats des analyses protéomiques montrent aussi que les cellules les plus actives et les plus résistantes voient leur métabolisme énergétique augmenter, alors que leur métabolisme général et azoté est, au contraire, réduit. Finalement, ce travail propose deux voies intéressantes pour l'adaptation de Lb. bulgaricus CFL1, en vue d'améliorer sa cryotolérance. Certaines réponses physiologiques générales induisant ces adaptations cellulaires ont pu être identifiées, aux niveaux membranaire et cytoplasmique.

Ce travail de thèse vise l’étude des effets des étapes de récolte et de concentration des cellules, sur la dégradation des fonctionnalités de Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus CFL1. Cet objectif s’accompagne de l’identification des mécanismes physiologiques qui expliquent les différences observées. La mise en œuvre de conditions de stress modéré, permettant aux cellules de s’adapter au stress ultérieur de congélation, constitue le troisième volet abordé dans cette thèse. Lors de la première partie du travail, l’effet d’une acidification en fin de fermentation sur la cryotolérance des cellules a été analysé. Un plan d’expériences a permis de définir la condition optimale d’acidification (pH 5,25 pendant 30 min) induisant une adaptation des cellules. Elle conduit à une meilleure résistance à la congélation et au stockage à -20 °C. Deux mécanismes physiologiques à l’origine de cette adaptation ont été identifiés. Le premier est lié à l’augmentation de la concentration de l’acide gras membranaire C18:1. Le deuxième, caractérisé pour l’analyse du protéome cytoplasmique, correspond à une réduction du métabolisme azoté, une augmentation des métabolismes énergétique et nucléotidique, et à une synthèse plus importante de protéines de stress. Dans une deuxième étape, les cellules ont été concentrées selon différentes conditions de centrifugation (vitesse de rotation, durée et température). Celles-ci n’ont pas d’effet sur la résistance de Lb. Bulgaricus CFL1 à l’étape de concentration elle-même, mais présentent un effet faible mais significatif sur leur cryotolérance. Les évolutions de la résistance des cellules à la congélation et au stockage étant opposés, l’effet des conditions de centrifugation sur les cellules stockées à long terme est cependant négligeable. La troisième partie de ce travail a permis de quantifier l’impact de la concentration des cellules par microfiltration, sur leur résistance aux différentes étapes du procédé et sur l’état physiologique de Lb. Bulgaricus CFL1. Les résultats montrent que les cellules sont moins résistantes à l’étape de microfiltration qu’à la centrifugation. Par contre, la résistance à la congélation augmente significativement (entre 28 % et 88 %) selon les conditions de microfiltration appliquées, par rapport à la centrifugation. La meilleure cryotolérance a été obtenue pour une vitesse tangentielle égale à 2,01 m. S-1 et une pression transmembranaire de 0,15 MPa. Cette meilleure résistance est liée à une augmentation des teneurs en acides gras C16:0, 18:1 et cycC19:0, ainsi qu’à une réduction de la concentration en C14:0. Les résultats des analyses protéomiques montrent aussi que les cellules les plus actives et les plus résistantes voient leur métabolisme énergétique augmenter, alors que leur métabolisme général et azoté est, au contraire, réduit. Finalement, ce travail propose deux voies intéressantes pour l’adaptation de Lb. Bulgaricus CFL1, en vue d’améliorer sa cryotolérance. Certaines réponses physiologiques générales induisant ces adaptations cellulaires ont pu être identifiées, aux niveaux membranaire et cytoplasmique.

La cryopréservation engendre des dégradations variables de l’activité biologique et des fonctionnalités des bactéries lactiques, notamment chez Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, un starter de l’industrie laitière. Le but de ce travail a été d’identifier les marqueurs cellulaires de cryorésitance et de cryosensibilité afin de mieux comprendre les mécanismes de dégradation sous-jacents et d’améliorer les performances industrielles des bactéries lactiques. La cryopresérvation a ici été considérée comme une combination de deux stress majoritaires : froid et osmotique. Une attention particulière a été portée à l’analyse de la membrane cellulaire, un site majeur de dégradation lié à la congélation, mais également à la paroi cellulaire et aux protéines. De plus, les cellules ont été analysées à différentes échelles d’observation, de la population jusqu’à la cellule unique, afin de quantifier l’hétérogénéité des propriétés cellulaires existant au sein de populations. Dans une première partie de ce travail, des conditions de culture ont été comparées pour identifier deux souches de L. bulgaricus présentant des résistances contrastées vis-à-vis de la congélation. Une analyse génomique comparative des souches a également été menée dans le but de fournir des pistes de compréhension de ces comportements différents. Dans une seconde partie, des propriétés membranaires des cellules ont été évaluées en réponse aux stress froid et osmotique : composition en acides gras, organisation au niveau des chaînes d’acides gras et des têtes phospholipidiques, et fluidité.Leur fluidité membranaire a également été caractérisée à une échelle subcellulaire par microscopie de fluorescence au moyen du rayonnement synchrotron, permettant la quantification des hétérogénéités inter- et intra-cellulaires. Enfin, un développement technique et méthodologique a été entrepris afin de permettre l’analyse de bactéries individuelles en milieu aqueux par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, et ainsi leur signature biochimique en conditions natives. Ces approches complémentaires et multidisciplinaires ont révélé l’existence de propriétés et d’organisation différentes de la membrane des deux souches de L. bulgaricus. Différents types d’interaction entre les molécules cryoprotectrices du milieu extracellulaire et la membrane des deux souches a été proposé, pouvant être à l’origine des dommages causés à la souche sensible. De plus, une hétérogénéité plus importante au sein de la population sensible a été identifiée, attribuée à des différences en termes de composition biochimique et d’organisation au niveau de la membrane et de la paroi. Finalement, ce travail suggère quelques marqueurs cellulaires d’évaluation de la cryorésistance des bactéries lactiques, et fournit des méthodes de caractérisation de l’hétérogénéité biochimique au sein des populations. Ceux-ci pourraient être appliqués à l’étude de toute autre étape critique du procédé de production des bactéries lactiques, et pourraient être utiles pour aller vers la production de ferments homogènes au niveau de leur résistance
Cryopreservation leads to variable degradation of the biological activity and functionality among lactic acid bacteria (LAB), particularly Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, a dairy starter of industrial relevance. The aim of this work was to identify cellular markers of cryoresistance or cryosensitivity for better understanding the mechanisms of cell cryoinjury and increasing LAB industrial performances. Cryopreservation was here considered as a combination of cold and osmotic stresses. A particular focus was given to the analysis of the cell membrane, recognised as a primary site of cryoinjury, but also of the cell wall and proteins. Moreover, cells were analysed from the population level down to the single-cell level to quantify the heterogeneity of cell properties within populations. In the first part of this work, bacterial cultivation conditions were compared to identify two L. bulgaricus strains with markedly different cell cryoresistance. Moreover, a comparative genomic analysis of the strains was performed to provide some clues for the explanation of their different behaviours. In the second part of this work, the membrane properties were evaluated in response to the cold and osmotic stresses: fatty acid composition, organisation of fatty acyl and phospholipid headgroups, and fluidity.Subcellular membrane fluidity was also characterised by fluorescence microscopy using synchrotron radiation, enabling the quantification of inter- and intra-cellular heterogeneities. Finally, original methodological and technical developments were undertaken to achieve the analysis of individual bacterial cells in an aqueous environment by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, for the analysis of the biochemical signature of cells under native conditions. These complementary multidisciplinary approaches revealed different properties and organisation of the membrane of both L. bulgaricus strains. It was proposed that different types of interaction between cryoprotectants of the extracellular matrix and the membrane of both strains could be at the origin of cryoinjury for the sensitive strain. Moreover, a high population heterogeneity characterised the cryosensitive strain, ascribed to differences in terms of biochemical composition and organisation of the membrane and cell wall. Altogether, this work suggests some cellular markers to evaluate LAB cryoresistance and provides methods to characterize population biochemical heterogeneity. These could be applied to any other stressful step of their production process, and should be useful for future production of homogeneous populations of resistant LAB

Des isolats atypiques de lactobacilles thermophiles homofermentaires, provenant de lait caillé de zébu prélevé au Cameroun, avaient été identifiés au groupe Lb. Lactis-Lb. Bulgaricus et à l'espèce Lb. Helveticus, seulement au moyen de tests phénotypiques. Dans notre étude, les tests physiologiques et chimiotaxonomiques ont révélé que ces isolats constituaient un groupe homogène, caractérisé par la présence de granulations métachromatiques, la capacité à hydrolyser le maltose et le tréhalose, l'inaptitude à fermenter le galactose et par la production de la forme d'énantiomère D(-) de l'acide lactique. L’hybridation ADN-ADN a confirmé leur appartenance à l'espèce Lb. Delbrueckii et la mobilité électrophorétique de la D(-) lactate déshydrogénase a précisé l'identification de ces isolats à Lb. Delbrueckii subsp. Bulgaricus. Ils se différencient cependant de cette sous-espèce par leur profil protéique et par la présence de plasmides. Ces variant adaptés à une niche écologique particulière possèdent des aptitudes technologiques telles que l'acidotolérance et la capacité à cultiver à des taux élevés sur lait et sur milieux semi-synthétiques. L’activité bêta-galactosidasique de l'isolat 28P 8, représentatif de cette flore, est inductible et moins importante que celle de la souche-type DSM 20081, constitutive. La présence de cette lactase traduit un système de prise du lactose par une perméase ATP dépendante. Les résultats partiels sur les systèmes de transport d'autres glucides, avec des analogues structuraux et des inhibiteurs métaboliques, confirment le transport du glucose par un système phosphotransférasique dépendant du phosphoénolpyruvate (PEP-PTS)

La presente etude porte sur l'influence de la variabilite clonale de la souche epaississante lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus cnrz 1187 sur la production d'exopolysaccharides au cours de la fermentation du lait (24 heures) en culture pure et mixte avec une souche non epaississante de streptococcus thermophilus, et sur l'implication de ces polymeres dans la texture du yaourt. Deux clones producteurs d'exopolysaccharides, w (blanc) et p (rose) phenotypiquement stables, ont ete selectionnes au rouge de ruthenium. La variabilite clonale n'a que peu d'effet sur le comportement general de fermentation tel que la croissance, l'acidification et la consommation du lactose. Elle affecte, par contre, la production d'exopolysaccharides et leur implication dans le developpement de la viscosite des laits fermentes. La plus forte viscosite est developpee par la souche mere qui atteint un maximum de 280 mpa. S apres 8 heures de fermentation. Le variant w developpe la plus faible viscosite, et le variant p donne un resultat intermediaire. Le variant w produit la plus faible quantite d'exopolysaccharides, le variant p la plus forte et la souche mere produit une quantite intermediaire. En culture pure, la production d'exopolysaccharides debute en phase exponentielle et se poursuit en phase stationnaire. En culture mixte, cette production debute plus tot et elle est plus rapide. Les viscosites des laits fermentes par les cultures mixtes, ainsi que les quantites d'exopolysaccharides produites, sont plus elevees que celles obtenues en culture pure ; mais la relation entre les viscosites et les quantites d'exopolysaccharides produites differe. Selon qu'il s'agit de culture pure ou mixte. La souche mere en culture mixte produit le moins d'exopolysaccharides mais montre la plus forte viscosite. Le variant w, en culture mixte, produit la plus forte quantite d'exopolysaccharides mais developpe la plus faible viscosite. Le variant p montre une viscosite et une quantite d'exopolysaccharides intermediaires. Compares aux exopolysaccharides produits en culture pure, majoritairement composes de galactose et de glucose, les exopolysaccharides, formes en culture mixte contiennent en plus du rhamnose. Ceci suggere que les enzymes conduisant a la synthese des sucres nucleotides impliques dans la synthese des exopolysaccharides ne sont pas les memes du simple fait de la presence de s. Thermophilus. Les proportions en monosaccharides varient au cours de la fermentation differemment selon les souches. De plus, ces proportions varient seulement pendant les 6 premieres heures de fermentation en culture mixte, alors qu'elles ne se stabilisent qu'apres 10 heures en culture pure.

Yogurt is a characteristic fermented dairy product of Turkey and Bulgaria and its popularity has been increasing all over the world. Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lactobacillus bulgaricus) are used together as starter culture in production of yogurt. The objective of this study was to isolate and characterize yogurt cultures from traditionally produced yogurts (i.e. produced without using commercial starter cultures) and to search the genotypic diversity within traditional S. thermophilus isolates. Yogurt cultures were isolated from traditionally produced yogurts collected from different regions of Turkey and identified biochemically. Acidification ability of the isolates was examined and the cultures giving best acidifying rates were further subjected to a selection in terms of their acetaldehyde production ability. Then, phage resistance and proteolytic activity of chosen isolates were tested. Finally, twenty-five L. bulgaricus and twenty-two S. thermophilus isolates were selected as cultures having best technological properties. Furthermore, subtyping studies were carried out to indicate strain diversity among isolates. S. thermophilus was selected as target organism for subtyping in this study. Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) loci are highly polymorphic genetic regions, which are composed of partially palindromic direct repeats interspaced by sequences called spacers. In order to characterize S. thermophilus isolates genotypically, CRISPR1 locus of the isolates were analyzed. Additionally, nineteen isolates selected after CRISPR1 analysis were characterized using multilocus sequence typing (MLST). This provided to compare CRISPR1 analysis with MLST as a typing method. According to CRISPR1 analysis S. thermophilus isolates were grouped into 6 main clusters with a total of 15 sub-clusters. MLST results demonstrated an evolutionary relationship among these strains compatible with that derived from the CRISPR1 analysis.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2016-10-05T12:37:57Z No. of bitstreams: 1 2011 - Simone de Souza Fernandes.pdf: 745580 bytes, checksum: 7836d760ce3ea36d3e5602714715cd42 (MD5)
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Yogurt is a fermented milk resulting from a mutual interaction between the lactic acid bacteria Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. For yoghurt quality assurance, the cell numbers of each microorganism, should not be less than 1x107per gram, therefore a relative ratio lactobacilli and streptococci should be 1:1, although a 1:2 ratio is also accepted. During storage of yoghurt exposed for sale, post-acidification may occur, changing the ratio of the two microorganisms. The objectives of this research were to evaluate yoghurts of four different manufacturers named A, B, C and D, in relation to the number and balance between streptococii and lactobacilli during the storage and its relation with acidity and pH. In this way, yoghurts with up to 20 days of manufacturing (band I) and more than 20 days (band II) were evaluated. Better recovery of L. delbruckii subsp. bulgaricus and S. thermophilus was observed with LB and M17 media respectively, which were used to determine the relative ratio of the two microorganisms. An imbalance in the lactobacilli numbers which were lower than that of streptococci was verified and considered inadequate, in two out of four commercial brands. In yoghurts from the manufacturer A, there was a significant reduction in the number of lactobacilli from band I to band II leading to an increase in the relative ratio of streptococii to lactobacilli. There was no significant difference in the counts of streptococci or bacilli from one band to another with the other three brands of yoghurts. The acidity of yoghurts from manufacturer D revealed significantly higher (P< 0.05) than the others, although it did not result in an increased pH reduction. All samples attended the legislation in relation to total lactic acid bacteria counts, acidity, pH and mould and yeast count
Iogurte ? um leite fermentado resultante de uma intera??o microbiana mutualista entre as bact?rias l?cticas Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Para que a qualidade do iogurte seja garantida o n?mero de c?lulas destes dois microrganismos individualmente, n?o deve ser inferior a 1x107 por grama, portanto uma propor??o relativa de lactobacilos e estreptococos de 1:1 sendo a propor??o 1:2 tamb?m aceita. Durante o armazenamento dos iogurtes expostos para venda podem ocorrer p?s-acidifica??o e modifica??o na propor??o dos dois microrganismos. Os objetivos desta pesquisa foram avaliar iogurtes de quatro diferentes fabricantes as quais foram denominados A, B, C, D quanto ao n?mero e equil?brio entre as duas bact?rias l?cticas durante o armazenamento, e ao mesmo tempo determinar as caracter?sticas f?sico-quimicas (pH e acidez) e contagem de bolores e leveduras. Para tanto, adotou-se duas faixas de avalia??o, faixa I (at? 20 dias de fabrica??o) e faixa II (ap?s 20 dias). Foi observada melhor recupera??o L. delbruckii subsp. bulgaricus e S. thermophilus, respectivamente com os meios LB e M17 que foram usados para determina??o da propor??o relativa dos dois microrganismos. Foi verificado um desequil?brio no n?mero de lactobacilos que foi inferior ao de cocos e, considerado inadequado, em duas das quatro marcas comerciais. Nos iogurtes da marca A houve redu??o significativa no n?mero de lactobacilos da faixa I para faixa II levando a um aumento na propor??o de cocos relativa ao de bacilos. Nos iogurtes dos tr?s outros fabricantes n?o houve diferen?a significativa nas contagens de cocos ou de lactobacilos de uma faixa para outra. Tamb?m n?o foi observada diferen?a significativa de acidez e pH relacionados ao tempo de prazo comercial nas faixas I e II nas quatro marcas de iogurte analisadas. A acidez dos iogurtes do fabricante D foi significativamente mais elevada (P<0,05) que a dos demais, embora n?o tenha resultado em maior redu??o de pH nestes produtos. Todas as amostras analisadas estavam em conformidade com a legisla??o vigente no que se refere ao m?nimo exigido de bact?rias l?ticas totais que ? de 1x107 UFC/mL. Tamb?m estavam em conformidade com rela??o ? acidez, pH e contagem de bolores e leveduras. Palavras-chave: leite

Zvýšená konzumace fermentovaných mléčných výrobků v posledních letech vede k zavádění nových výrobků na trh. Funkční a probiotické produkty jsou v dnešní době také hojně rozšířeny. Cílem diplomové práce bylo posoudit mikrobiální kvalitu komerčních jogurtů a nefarmakologických probiotických výrobků. Bylo zkoumáno 24 vzorků jogurtů a 8 vzorků probiotických mléčných výrobků. Pozornornost byla zaměřena zvláště na kvantifikaci mikroorganismů v jednotlivých výrobcích a na sledování viability buněk. Většina mléčných produktů obsahovala počty odpovídající minimální požadované hodnotě 1x107cfu/ml. Nicméně byly objeveny produkty, které neobsahovaly živé bakterie nebo obsahovaly jen jejich menší množství. To platí zejména pro běžné jogurty. Probiotické mléčné výrobky v zásadě obsahovaly větší množství bakterií než jogurty, protože je u nich navíc požadováno 1x106cfu/ml minimálního množství specifických bakterií jiných než jogurtových startovacích kultur. Isoláty z fermentovaných mléčných výrobků byly identifikovány jako Streptococcus thermophilus and Lactobacillus spp. Isoláty byly poté rozlišeny na jednotlivé kmeny pomocí RAPD použitím tří různých primerů. Byla zjištěna velká různorodost mezi kmeny rodu Lactobacillus spp. používaných různými podniky.

碩士
中國文化大學
生物科技研究所
101
Probiotics are defined as live microbes which could improve the balance of the microbes at host intestinal tract and give health benefit to the host, such as anti-inflammatory, anti-carcinogenic and cholesterol-lowering effects and prevention of allergies. Lactic acid bacteria (LAB) having the property of producing lactic acid from sugars by fermentation are commonly regarded as probiotics based on their putative or proven mechanism. Tolerance to bile salts is among the most crucial properties as it determines the ability of bacteria to survive in gastrointestinal tract and consequently their capacity to play their functional role as probiotics. In this context, the objective of this study is to investigate the growth of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and protein expression under bile salt stress environment, using 2-DE comparative proteomics. Analysis of differential protein expression by tryptic digestion, mass spectrometry analysis, and protein identification by using database search. In vitro stress-resistant experiment indicated Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus could survive under 0.05% and 0.1% bile salt environment, but dead under 0.3%. Therefore, 0.05 and 0.1% bile salt are selected as the stress condition in this study. Identity by proteomic analysis, 10 identified proteins exhibited significant expression level changing by bile salt induced. We speculated these stress-induced of proteins, such as small heat shock protein, prolyl aminopeptidase, nicotinamidase, UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine reductase and pyruvate oxidase, which could prevent protein denaturation, correct folding of partially unfolded proteins, maintain cell wall and cell membrane of Lactobacillus quality, maintain pH value and osmotic pressure in the culture environment, and provide enough energy to resist stress environment. Therefore, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus could survive through bile salt condition, and give health benefit to the host.

碩士
國立嘉義大學
生物農業科技學系研究所
107
E. coli expression system has the advantages of rapid growth, high yield, and low production cost. Yet, a large amount of expressed proteins can aggregate to form insoluble inclusion bodies. Recovery of biologically active proteins from the inclusion body is a great challenge. The goal of this research is to utilize a putative membrane protein of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus to reduce the aggregation of fusion proteins. The putative membrane protein gene of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus was constructed with the E. coli expression vector of pMAL-c5X and transferred into the XL-1 blue competent cells by heat shock. The putative membrane protein was expressed correctly by the XL-1 blue cells as determined by Western blot assay. The growth of XL-1 blue cells with pMAL-c5X-MP vector seemed to be normal as determined by turbidity measurement. Yet, the expressed fusion protein degraded dramatically after 0.6 mM IPTG induction for 6 hours. Colony formation assay was later applied to check the viability of transformed XL-1 blue cells. The XL-1 blue cells were found to lose their colony formation ability after IPTG induction. To explore the effect of this fusion protein on the other competent cells, the pMAL-c5X-MP vector was transferred into two different competent cells, C41 (DE3) and C43 (DE3). The colony formation abilities of the 3 transformed cells were all shown to decrease dramatically after IPTG induction. In conclusion, the turbidity measurement of bacterial growth is not consistent with the colony formation assay when the putative membrane protein is expressed in XL-1 blue cells.

The aim of this study was to explore the characteristics of a non-gelling exopolysaccharide (EPS) obtained from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2483 and a gelling EPS obtained from Sphingomonas elodea ATCC 31461 (31461). The EPSs were isolated from the two bacterial strains grown in milk permeate-based media. They were purified and then characterised using light scattering and viscometric techniques. A greater emphasis of this research was placed on 2483 EPS since its physical characteristics have not been reported to date. In the case of 31461 EPS. a model for gelation of the sodium gellan was proposed based on rheological and light scattering measurements. The rheological properties of the two EPSs were also compared with several commercial polysaccharides. Microscopy examination of 2483 EPS was carried out using confocal laser scanning microscopy (CLSM) and scanning electron microscopy (SEM). In CLSM, the lectin SBA (from Glycine max) Alexa Fluor 488 conjugate was used to stain the EPS since it has affinity for galactopyranosyl residues present in 2483 EPS. The CLSM micrographs showed a random distribution of EPS aggregates in the culture medium. At high magnification, the SEM micrographs showed web-like EPS structures. These structures were formed during the critical point drying process, when the EPS, which filled the interstices and channels of the protein aggregates, dehydrated. The 2483 EPS aggregates were found to be stable at neutral or low pH (~3.9) but were disrupted at high pH (pH 8-10). Procedures commonly used to quantify EPS from culture medium were found to be unreliable. In the development of an improved EPS assay, each of the processing steps was examined. Key improvements included the use of Flavourzyme for protein hydrolysis; optimising ethanol concentration to prevent lactose crystallisation yet allowing complete EPS precipitation; and a suitable centrifugation regime to minimise EPS loss. The improved EPS assay gave reproducible results (5% coefficient of variation). The isolation of 2483 EPS from milk media proved to be a difficult task because of interference from non-EPS components. An effective and simple approach allowing maximum EPS recovery involved the use of a hydrolysed milk medium which was ultrafiltered (UF) to remove molecular species larger than 2.5 x 105 Da. The UF permeate was suitable for the growth of 2483 with an EPS yield of ~400mg/L. Two EPS fractions (namely a soluble and an insoluble fraction) were isolated by ethanol precipitation and the soluble 'ropy' fraction was further purified to achieve ~98% purity. The elemental analysis of the purified fraction revealed the presence of nitrogen (~2.7% w/w). This could be due to the interaction of some peptides (from the growth medium) with the EPS. The polysaccharide composition of the soluble EPS fraction comprised of galactose, glucose, rhamnose and mannose residues (5:1:0.6:0.5). Traces of glucosamine were also found in the fraction. The purified fraction of 2483 EPS was characterised. Using a capillary viscometer, an intrinsic viscosity of ~2013mL/g was determined. The flow curves of the 2483 EPS solutions obtained using a rotational viscometer showed shear-thinning behaviour and an exponent value of ~0.76 (based on the Cross-type model) is typical of random coil polymers. The concentration dependence of the viscosity plot produced gradients of ~1.1 in the dilute domain and ~3.3 in the semi-dilute to concentrated domain. The coil overlap parameters at three concentration domains (c*[ŋ],ccr[ŋ] and c**[ŋ]) were 0.55, 2.86 and 5.67 respectively. The molecular parameters of the 2483 EPS were found via static light scattering measurements to have a weight-average molar mass (Mw.) of ~2 x 106 Da, a z-average root-mean-square radius ((r2g)z1/2) of ~165nm and a low polydispersity index (Mw/Mn ~1.15). The plot of Mw versus (r2g)z1/2 gave a gradient of approximately 0.5, which also suggested that the EPS polymer adopted a random coil conformation. The second part of the research involved gellan gum. Two gellan samples were studied. The first gellan sample was obtained from the fermentation of Sphingomonas elodea ATCC 31461 using milk permeate-based medium (31461). The second sample was a commercial high acyl gellan (LT100). Both gellan samples were converted to their sodium forms (Na-31461 and Na-LT100 gellan) using cation exchange resin and purified. The Na-gellan samples were highly sensitive to changes in Na+ concentrations. From oscillatory measurements, it was found that the complex moduli of the two Na-gellan samples superimposed closely at a specific Na+ concentration. The model for the conformational changes of Na-gellan molecules from a solution to a gel was proposed based on rheological and light scattering data. At very low Na+ concentrations (<19mM, in the case of Na-LT100). Na-gellan molecules were single-stranded (Mw ~2.5 x 10 5 Da) and adopted random coil conformation (exponent value based on the Cross-type model of ~0.76). At a slightly higher Na+ concentration (~19-24mM), Na-gellan molecules formed double-helices which led to a two-fold increase in molecular weight (M w ~5.2 x 105 Da). The double-stranded molecule appeared to be stiffer (exponent value of the Cross-type model ~0.82) and the mechanical spectra (G',G”) demonstrated 'weak ge' characteristics. A further increase in the Na+ concentration (>24mM) resulted in the formation of a gel network. The study also found that at low Na+concentration, both single-stranded and double-stranded Na-gellan molecules had a tendency to form aggregates under zero-shear conditions. The interactions involved in these aggregates were considered weak and transient, according to the Cox-Merz plot and light scattering data.