Dissertations / Theses on the topic 'Deleción'

Els trastorns genòmics són un grup de malalties genètiques causades per reorganitzacions cromosòmiques de segments de DNA de més de 1Kb que resulten de la inestabilitat del genoma en regions que presenten una arquitectura genòmica particular, caracteritzada per la presència de duplicacions segmentals (low-copy repeats – LCR). Els LCR afavoreixen el malaparellament d’aquestes regions durant la meiosi fent-les susceptibles a la recombinació homòloga no al·lèlica (non-allelic homologous recombination – NAHR) que genera diferents tipus de reorganitzacions cromosòmiques en funció de la orientació dels LCR, del número i tipus de cromàtides implicades en la recombinació. Entre les reorganitzacions cromosòmiques generades per NAHR, les delecions i duplicacions són les causants de la majoria de trastorns genòmics. Mentre que el risc de recurrència de trastorns genòmics s’ha establert per consens en ser inferior al 0.5%, recentment s’han descrit haplotips específics que podrien predisposar a aquestes regions a la NAHR i per tant incrementar el risc de transmetre certs trastorns genòmics a la descendència. Aquests haplotips de predisposició a la NAHR poden ser inversions de les regions crítiques o bé variacions del número de còpies dels blocs d’homologia que formen els LCR. La tècnica d'hibridació in situ fluorescent (FISH) en nuclis descondensats d'espermatozoides proporciona una eina útil per estimar la freqüència de NAHR a través dels seus productes. Pel que fa a l’anàlisi d’haplotips de predisposició, la tècnica de FISH sobre fibres estirades cromatina (Fiber-FISH), que permet obtenir una resolució de fins a 1 Kb, presenta un gran potencial per l’anàlisi de l’arquitectura genòmica dels LCR complexes. Així doncs, en aquest treball es va analitzar la freqüència de delecions i duplicacions de les regions 7q11.23, 15q11-q13 i 22q11.2, així com la freqüència d’inversions de la regió 15q11-q13 mitjançant FISH en espermatozoides en una sèrie d’individus control i de tres poblacions problema que consistien en pares amb descendència afecta per tres trastorns genòmics causats per deleció: la síndrome de Prader-Willi (SPW), la síndrome de Williams-Beuren (SWB) i la síndrome de DiGeorge (SDG). A més, es va utilitzar la tècnica de fiber-FISH per mapar LCR complexes. Les dades obtingudes en la població control varen indicar unes freqüències similars de delecions i duplicacions de les regions analitzades i unes freqüències d’inversions de la regió 15q11-q13 que eren un grau de magnitud superiors a les anteriors. Es van observar increments significatius d’anomalies cromosòmiques en espermatozoides d’individus amb descendència afecta per trastorns genòmics: en la població de pares amb descendència afecta per la SPW, 4 dels 16 individus van mostrar increments de delecions i inversions, mentre que 6 dels individus presentaven increments de delecions. Els resultats van suggerir que els increments d’anomalies en espermatozoides són independents de l’origen genètic de la SPW en la descendència. Aquests increments són un reflex de la inestabilitat que presenta la regió 15q11-q13 que la predisposa a diferents tipus de reorganitzacions cromosòmiques. En la població de pares amb descendència afecta per la SWB, 3 dels 15 individus mostraven increments significatius de delecions, mentre que en la població de pares amb descendència afecta per la SDG es van observar increments en 2 dels 10 individus analitzats. Aquests individus s’han de considerar de risc, en el sentit que presenten un risc incrementat de transmetre una anomalia cromosòmica a la descendència. L’anàlisi de les freqüències de delecions i duplicacions de diferents regions en aquests individus van mostrar que els increments d’anomalies cromosòmiques observats en espermatozoides d’individus amb descendència afecta per trastorns genòmics poden tenir el seu origen en la presència d’haplotips de predisposició o en un increment generalitzat de la susceptibilitat a la NAHR. Els increments significatius de delecions i inversions en espermatozoides d’individus amb descendència afecta per trastorns genòmics indiquen un increment de la freqüència del fenomen de NAHR intracromàtide. Es va demostrar que la tècnica de Fiber-FISH permet mapar LCR complexes i avaluar la presència de diferents haplotips. Els estudis de FISH en espermatozoides, dirigits a determinar la incidència de delecions i duplicacions, aporten una informació valuosa en el consell genètic reproductiu en pares amb descendència afecta per trastorns genòmics. Un resultat de FISH en espermatozoides alterat, independentment del valor numèric, s’interpretarà com l’evidència d’anomalies en el procés de recombinació i és indicatiu d’un factor de risc.<br>Genomic disorders are a group of human diseases caused by chromosomal reorganizations of DNA segments longer than 1 Kb resulting from the genomic instability of regions that show specific architectural features, characterized for the presence of low-copy repeats (LCR). LCR favor the mispairing of these regions during meiosis thus increasing their susceptibility to non-allelic homologous recombination (NAHR) that triggers different types of chromosomal rearrangements according with the LCR orientation, the number and type of chromatids involved in the event. Among the chromosomal rearrangements generated by NAHR, the most frequently involved in genomic disorders are deletions and duplications. NAHR events are thought to be sporadic, thus the risk of recurrence have been established in less than 0.5%. However, there have been recently described some haplotypes that could predispose these regions to NAHR thus increasing the risk of transmission of certain genomic disorders to the offspring. Those predisposing haplotypes are both inversions of the critical regions and copy-number variations of the blocks that build the flanking LCRs. The use of fluorescence in situ hybridization (FISH) on decondensed sperm nuclei provides a useful tool to estimate the frequency of NAHR events throughout its products. Besides, the methodology of FISH on stretched DNA fibers (Fiber-FISH) that allow a resolution up to 1 Kb, has a great potential for mapping complex LCRs. In this work we analyzed the frequency of deletions and duplications of the 7q11.23, 15q11-q13 and 22q11.2 regions, plus the frequency of 15q11q13 inversions using sperm-FISH in a series of control individuals and in three populations consisting on fathers with a deletion-caused genomic disorder affected offspring: Prader-Willi syndrome (PWS), Williams-Beuren syndrome (WBS) and DiGeorge syndrome (DGS). Furthermore, we used the Fiber-FISH methodology to study complex LCR. Data obtained in the control population showed equivalent frequencies of sperm deletions and duplications in the regions analyzed and frequencies of 15q11q13 inversions that were an order of magnitude higher than the previous anomalies. We observed significant increases of sperm anomalies in some individuals with genomic disorders affected offspring: in the populations of PWS fathers, 4 out of 16 subjects showed higher frequencies of deletions and inversions, while 6 subjects showed increases of deletions. Results suggested that the increases of sperm anomalies are independent of the genetic origin of the PWS in the offspring. The significant increases of sperm anomalies are a reflex of the genomic instability of the 15q11-q13 region that makes it prone to different types of chromosomal rearrangements. In the populations of WBS fathers, 3 out of 15 individuals showed significant increased frequencies of anomalies and in the population of DGS fathers we observed 2 out of 10 subjects that showed higher frequencies of anomalies. These subjects should be considered risky individuals, because they show an increased risk of transmission of genomic disorders to the offspring. From the analysis of deletions and duplications of different regions in each individual, our results pointed out that the increased frequencies of sperm anomalies had their origin in the presence of predisposing haplotypes and a generalized susceptibility to NAHR events. The significant increases of sperm deletions and inversions suggested that the fathers with genomic disorders affected offspring have an increased frequency of the intrachromatid NAHR mechanism. There have been demonstrated the potential of the Fiber-FISH methodology to map complex LCRs and for the assessment of variable haplotypes. The methodology of sperm-FISH for analyzing the incidence of deletions and duplications, offers valuable information for the reproductive genetic counseling in fathers with offspring affected by a genomic disorder. An altered sperm-FISH result, independently of the numerical value, will be interpreted as the evidence of anomalies in the process of recombination and, therefore, indicates a risk factor.

La síndrome de deleció de 22q11 (S22q11) està considerada una malaltia minoritària, ja que afecta a menys de 5 de cada 10.000 habitants. Les persones amb la S22q11 poden presentar alteracions congènites cardiovasculars, anomalies del paladar, hipocalcemia, immunodeficiència i trets facials típics. L’evidència disponible suggereix un fenotip conductual característic, amb trastorns del comportament, psiquiàtrics, neuropsicològics i lingüístics. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat definir el perfil lingüístic d’una mostra de persones amb la S22q11 que viuen a Espanya. La present tesi compren un total de tres estudis (dos publicats i un en procés de revisió). La mostra del primer va estar formada per 17 participants d’entre 3 anys i 3 mesos i 13 anys i 9 mesos (9,4 ± 3,5 anys) i la del segon i el tercer estudi per 30 subjectes d’entre 5 i 21 anys i 6 mesos (12,14 ± 4,20) amb la S22q11. L’avaluació dels participants va consistir en realitzar registres de veu i administrar diferents proves: secció sobre els òrgans fonoarticulatoris de la prova “Exploración del Lenguaje Comprensivo y Expresivo”, secció de discriminació auditiva de “L’exploració del llenguatge en el nen”, “Evaluación fonológica del habla infantil” o “Avaluació del desenvolupament fonològic en nens catalanoparlants de 3 a 7 anys”, “Clinical Evaluation of Language Fundamentals – 4” en la seva versió espanyola i el test de fluïdesa fonològica verbal. Per tal d’obtenir les dades es va realitzar una entrevista semiestructurada als pares i se’ls va demanar que responguessin el qüestionari “Children’s Communication Checklist” en la seva versió espanyola. Els resultats, pel que fa a la veu, mostren que alguns participants presenten un to més agut de l’esperat per sexe i edat i altres més greu; la meitat manifesten una intensitat disminuïda; i la majoria presenten alteracions del timbre, entre les que destaquen la hipernasalitat i la ronquera. Respecte a la parla, els infants més petits presenten un retard en l’adquisició de fonemes orals en comparació amb seus iguals amb desenvolupament típic, i la majoria empren l’oclusiva glòtica (?) com a so compensatori. Els subjectes de major edat encara presenten dificultats específiques en la producció de determinats sons. Els participants mostren, en general, un nivell baix en totes les àrees del llenguatge, i dificultats tant en pragmàtica com en relació social. Per tant, els participants presenten un perfil lingüístic propi pel que fa a la veu, la parla i el llenguatge. És imprescindible ampliar aquestes troballes amb estudis més amplis.<br>El síndrome de deleción de 22q11 (S22q11) está considerado una enfermedad rara, ya que afecta a menos de 5 de cada 10.000 habitantes. Las personas con el S22q11 pueden presentar alteraciones congénitas cardiovasculares, anomalías del paladar, hipocalcemia, inmunodeficiencia y rasgos faciales típicos. La evidencia disponible sugiere un fenotipo conductual característico, con trastornos del comportamiento, psiquiátricos, neuropsicológicos y lingüísticos. El objetivo de esta tesis ha sido definir el perfil lingüístico de una muestra de personas con el S22q11 que viven en España. La presente tesis comprende un total de tres estudios (dos publicados y uno en proceso de revisión). La muestra del primero estuvo formada por 17 participantes de entre 3 años y 3 meses y 13 años y 9 meses (9,4 ± 3,5 años) y la del segundo y el tercer estudio por 30 sujetos de entre 5 y 21 años y 6 meses (12,14 ± 4,20) con el S22q11. La evaluación de los participantes consistió en realizar registros de voz y administrar diferentes pruebas: sección sobre los órganos fonoarticulatorios de la prueba “Exploración del Lenguaje Comprensivo y Expresivo”, sección de discriminación auditiva de “L’exploració del llenguatge en el nen”, “Evaluación fonológica del habla infantil” o “Avaluació del desenvolupament fonològic en nens catalanoparlants de 3 a 7 anys”, “Clinical Evaluation of Language Fundamentals - 4” en su versión española y el test de fluidez fonológica verbal. Para obtener los datos se realizó una entrevista semiestructurada a los padres y se les pidió que respondieran el cuestionario “Children’s Communication Checklist” en su versión española. Los resultados, en cuanto a la voz, muestran que algunos participantes presentan un tono más agudo de lo esperado por sexo y edad y otros más grave; la mitad manifiestan una intensidad disminuida; y la mayoría presentan alteraciones del timbre, entre las que destacan la hipernasalidad y la ronquera. Respecto al habla, los niños más pequeños presentan un retraso en la adquisición de fonemas orales en comparación con sus iguales con desarrollo típico, y la mayoría emplean la oclusiva glótica (?) como sonido compensatorio. Los sujetos de mayor edad todavía presentan dificultades específicas en la producción de determinados sonidos. Los participantes muestran, en general, un nivel bajo en todas las áreas del lenguaje, y dificultades tanto en pragmática como en relación social. Por lo tanto, los participantes presentan un perfil lingüístico propio en cuanto a la voz, el habla y el lenguaje. Es imprescindible ampliar estos hallazgos con estudios más amplios.<br>22q11 deletion syndrome (S22q11) is considered a rare disease, due to the fact that it affects less than 5 out of 10,000 inhabitants. People with S22q11 may present cardiovascular congenital defects, palate abnormalities, hypocalcemia, immunodeficiency, and typical facial features. The available evidence suggests a characteristic behavioral phenotype, with behavioral, psychiatric, neuropsychological, and linguistic disorders. The objective of this thesis has been to define the linguistic profile of a sample of people with S22q11 living in Spain. This thesis comprises a total of three studies (two already published and one in the process of revision). The sample of the first one was formed by 17 participants aged between 3 years and 3 months and 13 years and 9 months (9.4 ± 3.5 years) and as for the second and third studies, they were formed by 30 subjects between 5 and 21 years of age and 6 months (12.14 ± 4.20) with S22q11. The evaluation of the participants consisted of recording voice samples and administering different tests: the phonoarticulatory organs section of the test on the “Exploración del Lenguaje Comprensivo y Expresivo”, the auditory discrimination section of “L’exploració del llenguatge en el nen”, “Evaluación fonológica del habla infantil” or “Avaluació del desenvolupament fonològic en nens catalanoparlants de 3 a 7 anys”, “Clinical Evaluation of Language Fundamentals - 4” in its Spanish version and the verbal phonological fluency test. To obtain the data, a semi-structured interview was carried out with the parents and they were asked to respond the questionnaire “Children’s Communication Checklist” in its Spanish version. The results, in terms of voice, show that some participants present a higher pitched voice than expected by sex and age and others a lower pitched voice; half show a decreased intensity; and they present alterations of the timbre, among which the hypernasality and the hoarseness stand out. Regarding speech, younger children have a delay in the acquisition of oral phonemes compared to their peers with typical development, and most use the glottal stop (?) as a compensatory sound. Older subjects still have specific difficulties in producing certain sounds. The participants show, in general, a low level in all areas of language, and difficulties both in pragmatics and in social relationships. Therefore, the participants present a specific linguistic profile in terms of voice, speech and language. It is essential to expand these findings with larger studies.

Objetive: To evaluate if the 4G/5G polymorphism of the plasminogen activator inhibitor-1 gene is likely to lead to increase risk of thromboembolic neurological complications and that these complications will increase length of mechanical ventilation and length of stay.<br/>Design: Prospective, case-control study. <br/>Setting: A 14 bed surgical intensive care unit of a university hospital.<br/>Patients: 260 consecutive patients who underwent cardiac surgery with cardiopulmonary bypass and 111 controls were enrolled.<br/>Interventions: DNA was isolated and 4G/5G polymorphism was typed using RFLP methodology. <br/>Measurements and results: Genetic analysis revealed 4G/5G in 131 patients (50.4%), 5G/5G genotype in 82 (31.5%), and 4G/4G in only 47 (18.1%). Prevalence of neurological complications was 20.8% (n= 54) [stroke 5.4% (n= 14) and encephalopathy 15.4% (n= 40)]. A two-fold increase in stroke (8.5% vs 4.7%; RR 1.9, 95% CI 0.7 to 6.3) and encephalopathy (27.7% vs 12.7%; RR 2.6, 95% CI 1.2 to 5.6) was documented in 4G/4G carriers. Multivariate analysis showed that development of stroke or encephalopathy was independently associated with prolonged mechanical ventilation (OR 20, 95% CI 1.2 to 5.6) and that neurological complication (OR 2.4, 95% CI 1.1 to 5.5) and 4G/4G genotype (OR 2.6, 95% CI 1.1 to 6.5) were independently associated with prolonged hospital length of stay &#8805; 2 weeks. <br/>Conclusions: The 4G/4G genotype could increase the risk of thromboembolic neurological complications after cardiac surgery with cardiopulmonary by-pass. The neurological complications resulted in longer time on ventilator and longer hospital stay.<br>A consecuencia del carácter poligénico de las patologías que nos ocupan hace poco probable que un solo polimorfismo pueda explicar todas las complicaciones postoperatorias. Sin embargo, debemos subrayar que esta variación genética pudiera ser un factor de riesgo más que sumado a los ya referidos hiciera más probable la aparición de complicaciones neurológicas. A través del desarrollo de este tipo de complicaciones pudiera explicarse coherentemente que los pacientes estuvieran más tiempo bajo ventilación mecánica y fueran dados de alta más tardíamente del hospital. En definitiva, si futuros estudios confirmasen los presentes hallazgos, y los pacientes homocigotos 4G/4G (junto otros polimorfismos que puedan describirse en el futuro) pudieran considerarse de alto riesgo, la evaluación de estas variables genéticas podrían identificar precozmente pacientes en los cuales realizar una investigación preoperatorio más exhaustiva y considerar, cuando sea posible, la realización de técnicas quirúrgicas alternativas además de añadir información individual sobre el riesgo quirúrgico. Por tanto, nuestro estudio, además de aportar otra variable en el puzzle de etiopatogenia de las complicaciones neurológicas en el postoperatorio de cirugía cardiaca sugiere la consideración de de factores genéticos como marcadores o estratificadores de riesgo perioperatorio.

Els trastorns genòmics són malalties causades per alteracions en regions inestables del genoma que afecten a gens sensibles a dosi. L’arquitectura genòmica d’aquestes regions es caracteritza per la presència de regions de còpia única flanquejada per low-copy repeats. Els risc de recurrència dels trastorns genòmics es considera negligible en famílies on ambdós progenitors presenten un cariotip normal i no expressen trets fenotípics compatibles amb el trastorn que afecta a la seva descendència. No obstant, aquesta consideració es basa en estudis epidemiològics que presenten limitacions relacionades principalment amb un poder estadístic reduït degut a l’anàlisi de cohorts formades per poques famílies. A més, les aproximacions epidemiològiques no aprofundeixen en l’estudi dels mecanismes moleculars que causen les delecions (recombinació homòloga no al·lèlica, NAHR), ni determinen si existeixen factors genètics que predisposen a la NAHR. En aquesta Tesi Doctoral s’ha utilitzat la síndrome de la deleció 22q11.2 com a model d’estudi, per a identificar si, en progenitors amb descendència afecta per trastorns genòmics originats per deleció, existeixen factors que afecten els mecanismes que originen les delecions i que, per tant, incrementen el risc de recurrència i transmissió. Els resultats obtinguts permeten assegurar que una de cada quatre famílies analitzades presenta un risc de transmissió superior a la mitja poblacional. En concret, en un 4% dels progenitors analitzats vàrem identificar la deleció 22q11.2 en mosaic, fet que incrementa notablement el risc de transmissió en aquests individus. A més, vàrem detectar que un 20% dels pares produeixen més delecions 22q11.2 en espermatozoides, la qual cosa s’ha estimat que incrementa el risc de transmissió entre 3 i 5 vegades respecte al risc basal. Per altra banda, vàrem investigar, en els progenitors transmissors de la deleció, les causes que poguessin incrementar la susceptibilitat al fenomen de NAHR i incrementar la generació de delecions. Els nostres resultats han posat de manifest que ni l’edat paterna ni la inversió en heterozigosi de la regió 22q11.2 són factors de predisposició. No obstant, vàrem identificar variants de gens implicats en el procés de recombinació meiòtica (BRIP1, LIG3, PRDM9, RECQL5, SHOC1, TEX19) que mitjançant anàlisis in silico s’han pogut relacionar amb alteracions que predisposen a la NAHR i generen delecions. En conjunt, l’avaluació dels factors de predisposició a la inestabilitat genòmica de la regió 22q11.2 suggereixen que el risc a la NAHR és complex i atribuïble a la confluència de diferents característiques genètiques. Pel que fa a la projecció clínica dels resultats, les nostres dades indiquen que la valoració del risc de recurrència mitjançant l’anàlisi del grau de mosaïcisme i l’anàlisi de delecions en espermatozoides, aportaria una informació rellevant en l’assessorament genètic reproductiu que reben les famílies amb descendència afecta per trastorns genòmics.<br>Los trastornos genómicos son enfermedades originadas por alteraciones en regiones inestables del genoma que afectan a genes sensibles a dosis. La arquitectura de estas regiones se caracteriza por la presencia de regiones de copia única flanqueada por low copy repeats. El riesgo de recurrencia de los trastornos genómicos se considera negligible en familias donde ambos progenitores presentan un cariotipo normal y no expresan rasgos fenotípicos compatibles con el trastorno que afecta su descendencia. No obstante, esta consideración se basa en estudios epidemiológicos que presentan limitaciones relacionadas principalmente con un poder estadístico reducido debido al análisis de cohortes formadas por pocas familias. Además, las aproximaciones epidemiológicas no ahondan en el estudio de los mecanismos moleculares que causan las deleciones (recombinación homóloga no alélica; NAHR), ni tampoco determinan si existen factores genéticos predisponentes a la NAHR. En esta Tesis Doctoral se ha utilizado el síndrome de la deleción 22q11.2 como modelo de estudio, para identificar si en progenitores con descendencia afecta por trastornos genómicos originados por deleción, existen factores que afecten los mecanismos que originan las deleciones y que, por ende, incrementen el riesgo de recurrencia y transmisión. Los resultados conseguidos permiten asegurar que una de cada cuatro familias analizadas presenta un riesgo de transmisión superior a la media poblacional. En concreto, en un 4% de los progenitores analizados identificamos la deleción 22q11.2 en mosaico lo cual incrementa notablemente el riesgo de transmisión en estos individuos. Además, hemos identificado que un 20% de los padres producen más deleciones 22q11.2 en espermatozoides lo cual se ha estimado que incrementa el riesgo de transmisión entre 3 y 5 veces respecto al riesgo basal. Por otra parte, hemos investigado en los progenitores transmisores de la deleción las causas que pudieran incrementar la susceptibilidad al fenómeno de NAHR e incrementar la generación de deleciones. Nuestros resultados han puesto de manifiesto que ni la edad paterna, ni la inversión en heterocigosis de la región 22q11.2 son factores de predisposición. No obstante, hemos identificado variantes de genes implicados en el proceso de recombinación meiótica (BRIP1, LIG3, PRDM9, RECQL5, SHOC1, TEX19) que mediante análisis in silico se han podido relacionar con alteraciones que predisponen a la NAHR y generan deleciones. En conjunto, la evaluación de los factores de predisposición a la inestabilidad genómica de la región 22q11.2 sugieren que el riesgo a la NAHR es complejo y atribuible a la confluencia de diferentes características genéticas. En cuanto a la proyección clínica de los resultados, nuestros datos indican que la valoración del riesgo de recurrencia mediante el análisis del grado de mosaicismo, y mediante el análisis de deleciones en espermatozoides, aportaría una información relevante en el asesoramiento genético reproductivo que reciben las familias con descendencia afecta por trastornos genómicos.<br>Genomic disorders are diseases caused by alterations in unstable regions of the genome that affect dose-sensitive genes. The genomic architecture of these regions is characterized by the presence of single-copy regions flanked by low-copy repeats. The risk of recurrence of genomic disorders is considered negligible in families where both parents present a normal karyotype and do not express phenotypic features compatible with the disorder affecting their offspring. However, this consideration is based on epidemiological studies that present several limitations related to reduced statistical power due to the analysis of cohorts formed by a reduced number of families. In addition, epidemiological approaches do not delve into the study of the molecular mechanisms that cause deletions (nonallelic homologous recombination, NAHR), nor do they determine whether genetic factors predispose to NAHR. In this Doctoral Thesis, the 22q11.2 deletion syndrome has been used as a study model, to identify whether, in parents with offspring affected by genomic disorders caused by deletion, there are factors that affect the mechanisms which give rise to deletions and which therefore increase the risk of recurrence and transmission. The results obtained allow us to ensure that one in four families analyzed has a risk of transmission higher than the population average. Specifically, in 4% of the parents analyzed we identified the 22q11.2 deletion in mosaic, which significantly increases the risk of transmission in these individuals. In addition, we found that 20% of parents produce more 22q11.2 deletions in spermatozoa, which has been estimated to increase the risk of transmission by 3 to 5 times the baseline risk. On the other hand, we investigated, in the parents transmitting the deletion, the causes that could increase the susceptibility to the NAHR phenomenon and increase the generation of deletions. Our results have shown that neither paternal age nor inversion in heterozygosity of the 22q11.2 region are predisposing factors. Nevertheless, we identified variants of genes involved in the meiotic recombination process (BRIP1, LIG3, PRDM9, RECQL5, SHOC1, TEX19) that by in silico analysis could be related to alterations that predispose to NAHR and generate deletions. Taken together, the assessment of predisposing factors for genomic instability in the 22q11.2 region suggests that the risk in NAHR is complex and attributable to the confluence of different genetic traits. Regarding the clinical projection of the results, our data indicate that the assessment of the risk of recurrence by the analysis of the degree of mosaicism and the analysis of sperm deletions would provide relevant information in the reproductive genetic counseling received by families with offspring affected by genomic disorders.<br>Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Biologia Cel·lular

Las pérdidas causadas por podredumbres durante la post-cosecha de frutos cítricos suelen suponer entre un 5 y un 10 % de la producción, siendo Penicillium digitatum el principal hongo patógeno, responsable de hasta el 80 % de las pérdidas causadas por podredumbres en frutos almacenados a temperatura ambiente. A pesar de la importancia económica de este patógeno nuestro conocimiento sobre los mecanismos de patogenicidad/ virulencia son muy escasos, en contraste con el avance experimentado en los últimos años en el conocimiento de las respuestas de defensa del fruto a la infección por este patógeno. Así, en el grupo de Fisiología y Biotecnología Postcosecha del IATA se está trabajando en la caracterización a nivel bioquímico y molecular de las respuestas de los frutos cítricos frente a la infección por P. digitatum y en el proceso de inducción de resistencia en frutos cítricos frente a la infección. Por este motivo en esta Tesis se han desarrollado un conjunto de herramientas esenciales para poder abordar la caracterización funcional de genes involucrados en virulencia/patogenicidad: transformación de P. digitatum mediada por Agrobacterium tumefaciens, utilización de la proteína verde fluorescente como marcadora, metodología para la obtención de mutantes de deleción de genes específicos, incluyendo mutantes nulos ¿ku80, vectores para silenciamiento génico mediante RNAi y la construcción de una genoteca de DNA genómico de P. digitatum. Se ha secuenciado y analizado el factor de transcripción PacC, que controla la expresión de un grupo de genes regulados por el pH ambiental. En P. digitatum se produce una acidificación del medio para adaptarlo al pH óptimo de su arsenal de enzimas. Se han obtenido mutantes de expresión constitutiva de PacC que presentan una disminución la capacidad infectiva en un 20 %. Mediante el empleo de técnicas de alto rendimiento se ha construido una genoteca substractiva de cDNA para obtener fragmentos de genes de P. digitatum que se inducen durante la infección de frutos de naranja y se ha analizado la expresión génica de los mismos y se ha elaborado una macromatriz conteniendo más de 1330 clones de la genoteca. El grupo de genes con mayor representación en la genoteca y con altos valores de inducción, corresponde a genes que codifican cinco proteasas diferentes. Además, en la genoteca substractiva también hay una alta representación de genes que codifican enzimas de degradación de la pared celular, y otras proteínas implicadas en glucólisis, respuesta a estrés o detoxificación. La ya demostrada importancia de las enzimas de degradación de la pared celular en la virulencia de hongos fitopatógenos, su abundancia y niveles de inducción en la macromatriz nos llevaron a estudiar más en profundidad algunos de estos genes (dos poligalacturonasas y una pectin liasa). Para comprobar su implicación en el proceso de infección se secuenciaron y se obtuvieron mutantes de P. digitatum en los que se eliminó el gen. La disminución de la virulencia de estos mutantes sobre frutos de naranja con respecto a la cepa silvestre fue de aproximadamente un 25 %. Del conjunto de genes relacionados con el metabolismo redox se seleccionó por su patrón de expresión el gen ris1, que codifica una naftaleno dioxigenasa posiblemente implicada en la detoxificación de compuestos aromáticos. A diferencia de los mutantes nulos en los genes de las poligalacturonasas o de la pectin liasa, los mutantes nulos ¿ris1 no presentaron ninguna alteración en su capacidad patogénica.<br>López Pérez, M. (2013). Estudio de los factores de patogenicidad/virulencia de Penicillium digitatum sobre frutos cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/34176<br>TESIS

Nos últimos anos, houve um aumento da complexidade e variedade de serviços disponíveis na Internet, fato que tem levado à busca por técnicas eficientes de roteamento de requisições de um cliente ao melhor servidor disponível, sendo uma delas conhecida como application layer anycast (ALA). O objetivo deste mestrado é elaborar meios eficientes de prover anycast na camada de aplicação com qualidade de serviço no contexto de computação em nuvem. Para atingir esse objetivo, um novo sistema foi proposto (GALA, Global Application Layer Anycast). Ele herda características de um outro sistema existente e emprega a geolocalização como diferencial, a fim de melhorar o desempenho geral do algoritmo. Experimentos foram realizados por meio de simulação e os resultados mostraram que esse novo sistema, comparado ao algoritmo herdado, mantém a eficiência das requisições realizadas pelos clientes e diminui consideravelmente o tempo de latência dessas operações. Ainda, o sistema proposto foi desenvolvido em um ambiente real a fim de fortalecer os resultados das simulações. Com os resultados obtidos, o sistema modelado foi validado e sua eficácia confirmada.<br>In the past years, the complexity and variety of available services expanded in the Internet, fact that is drawing attention of many researchers that wish to find out efficient techniques of routing client requests to the closest server, being one of them known as application layer anycast (ALA). Thus, the objective of this research is to elaborate ways to offer application layer anycast that are scalable and select the closest servers with the shortest latency possible, in the context of cloud computing. To achieve this goal, a new system was proposed (GALA, Global Application Layer Anycast). It inherits features from an existing system and applies geolocation to improve its overall performance. Simulation results indicated that the new system, compared to its antecessor, has the same efficiency but decreases considerably the requests latency. Yet, the proposed system was deployed in a real environment to strengthen the simulations results. With the obtained data, the modeled system was validated and its efficiency confirmed.

Treballs publicats recentment demostren que el factor de transcripció CCAAT/enhancer binding protein beta (C/ EBPbeta) regula l'activació microglial. Aquests resultats suggereixen que la inhibició de EBPbeta a les cèl.lules de la micròglia podria resultar neuroprotectora en trastorns del SNC on la inflamació crònica resulta ésser patològica. Amb l'objectiu de corroborar aquesta hipòtesi en models animals de neurodegeneració, durant el desenvolupament d'aquesta tesi doctoral s'ha generat la colònia LysMCre-C/ EBPbeta (fl/fl) amb deficiència selectiva de C/EBPbeta a les cèl.lules de la micròglia. Aquests animals són fèrtils, viables i l'estudi histològic no mostra cap alteració als òrgans i teixits, contràriament a allò observat als animals on el factor de transcripció ha estat eliminat a tots els tipus cel.lulars. Cultius primaris de micròglia mostren que la deleció de C/EBPbeta s'ha produït al 100% de les cèl.lules, mentre que l'expressió del factor de transcripció als astròcits no es veu alterada. La deleció de C/EBP8 a les cèl.lules microglials inhibeix la producció de NO alhora que augmenta la capacitat d'aquestes cèl.lules per a fagocitar i eliminar bacteris. A més, la seqüenciació de l'ARN de la micròglia primària mostra una gran afectació del transcriptoma d'aquest tipus cel.lular en resposta als tractaments amb LPS i LPS+IFNy. En aquestes mostres, la deleció de C/EBPbeta afecta l'expressió de 1068 gens involucrats principalment en les respostes inflamatòria i immune, fet que suggereix la implicació del factor de transcripció en aquests processos biològics. Per tal de corroborar aquests resultats en ratolins adults, s'ha aïllat la micròglia dels SNC d'aquests animals. Les dades obtingudes mostren que el 90% de les cèl.lules micròglials no expressen el factor de transcripció, alhora que l'expressió de gens proinflamatoris es veu clarament redu•la. Finalment, l'expressió de C/EBPbeta augmenta marcadament al model animal d'esclerosi múltiple, EAE, per aquesta raó s'ha induït la patologia als animals LysMCre- EBPbeta (fl/fl) ". Aquests ratolins mostren un retard en l'aparició dels primers símptomes, així com una marcada atenuació de la simptomatologia patològica. Així doncs, els resultats obtinguts en aquest treball demostren que C/EBPbeta és un factor clau en la regulació de l'activació microglial i que la seva inhibició resulta ésser una estratègia terapèutica.<br>Recently published reports demonstrate that the transcription factor CCAAT/enhancer binding protein beta (C/EBPbeta) regulates microglia activation. This suggests that microglial C/EBPbeta inhibition could have therapeutical potential in CNS disorders with a pathogenic neuroinflammatory component. To test this hypothesis in animal models of neurodegenerative diseases, we have therefore generated mice with specific microglial C/EBPbeta deficiency, crossing mice with Cre expression under the microglial/macrophage promoter LysM with C/EBPbetaflm mice. Double mutants LysMCre-C/EBPbetaflm were selected. These animals showed normal fertility, survival and histology in contrast to C/EBPbeta deficient mice. In primary microglial cultures, lack of C/EBPbeta was observed in virtually 100% of microglial cells, whereas astrocytes showed normal C/EBPbeta expression. Microglial C/EBPbeta absence resulted in the almost blockade of NO production induced by LPS+IFNy and in an altered bacterial phagocytic function. Furthermore, RNA sequencing of cultured microglia shows dramatic changes in the microglia transcriptome in response to LPS and LPS+IFNy. In these samples C/EBPbeta deletion alters the expression of 1068 mainly involved in immune and inflammatory responses, suggesting and important role of this transcription factor in this biological processes. To corroborate these findings in adult mice, microglia was acutely isolated from the CNS and analyzed. Data revealed a very high (90%) proportion of C/EBPbeta negative microglial cells also in vivo, as well as, a remarkably reduction of proinflammatory genes expression. Finally, because C/EBPbeta was markedly upregulated by experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in wild-type mice, control and LysMCre-C/EBPbetaflm mice were subjected to EAE. LysMCre-C/EBPbetaflm mice presented a delayed EAE onset and EAE severity was markedly attenuated. Alltogether, these findings support the hypothesis that C/EBPbeta is a key regulator of proinflammatory gene expression in microglial cells and that its inhibition has therapeutical potential.

Diversos estudis demostren com les caspases són silenciades durant el desenvolupament cardíac, aquest fet indica que la funció que porten a terme les caspases en el cor té importància durant el desenvolupament.En aquest treball hem generat una soca de ratolins amb una deleció cardíacespecífica de les caspases executores 3 i 7 (DKO) per tal d’esbrinar quina és la funció d’aquestes caspases en el desenvolupament del cor. Mentre que la manca global de les caspases 3 i 7 comporta una mort prematura i un desenvolupament cardíac anormal, la seva manca específica en el miocardi no suposa problemes de supervivència i el cor té una morfologia normal, demostrant que el fenotip cardíac que presenta el KO global és un efecte secundari de la manca de les caspases en un altre teixit. Aquest estudi descriu com la manca d’aquestes caspases específicament en el miocardi suposa una disminució en la proliferació, que comporta un inferior nombre de cardiomiòcits, que acaba desenvolupant un cor més petit. A més, els nostres resultats demostren com els cors DKO compensen el dèficit de cardiomiòcits desenvolupant una hipertròfia lleu; el desenvolupament d’aquesta hipertròfia va associat a un canvi en la tendència de l’expressió dels gens de diversos grups funcionals, demostrant un canvi adaptatiu d’aquests cors amb l’edat. El fet desencadenant del problema proliferatiu en els DKO sembla tenir relació amb un augment en la resposta inflamatòria, que podria estar induint l’expressió de gens implicats en la desregulació de la proliferació, com Serpina3.Mitjançant la sobre-expressió de les caspases amb el centre catalític mutat hem demostrat com aquesta funció no-apoptòtica de les caspases és independent de la seva activitat catalítica<br>Distintos estudios demuestran como las caspasas son silenciadas durante el desarrollo cardíaco, este hecho indica que la función que llevan a cabo las caspasas en el corazón tiene importancia durante el desarrollo.En este trabajo hemos generado una cepa de ratones con una deleción cardíaco-específica de las caspasas ejecutoras 3 y 7 (DKO) con el fin de encontrar cuál es la función de dichas caspasas en el desarrollo del corazón. Mientras que la falta global de las caspasas conlleva una muerte prematura y un desarrollo cardíaco anormal, su manca específica en el miocardio no supone problemas de supervivencia y el corazón tiene una morfología normal, demostrando que el fenotipo cardíaco que presenta el KO global es un efecto secundario de la falta de las caspasas en otro tejido. Este estudio describe como la falta de estas caspasas específicamente en el miocardio supone una disminución en la proliferación, que conlleva un inferior número de cardiomiocitos, que acaba desarrollando un corazón más pequeño. Además, nuestros estudios demuestran como los corazones DKO compensan el déficit de cardiomiocitos desarrollando una hipertrofia leve; el desarrollo de esta hipertrofia va asociado a un cambio en la tendencia de la expresión de los genes de distintos grupos funcionales, demostrando un cambio adaptativo de estos corazones con la edad. El hecho desencadenante del problema proliferativo en los DKO parece tener relación con un aumento en la respuesta inflamatoria, que podría estar induciendo la expresión de genes implicados en la desregulación de la proliferación, como Serpina3. Mediante la sobre-expresión de las caspasas con el centro catalítico mutado hemos demostrado como esta función no-apoptótica de las caspasas es independiente de su actividad catalítica.<br>Several studies demonstrate that caspases are silenced during cardiac development, this fact indicates that the function that caspases carry out in the heart is important during heart development. In the present work we generated a mice strain with a cardiac-specific deletion of the executioner caspases 3 and 7 (DKO) in order to investigate the function of these caspases during heart development. While the global lack of caspases 3 and 7 causes a premature death and an abnormal cardiac development, their specific lack in the myocardium does not cause survival problems and the heart has a normal morphology, demonstrating that the cardiac phenotype of the global KO is a secondary effect of the lack of caspases in another tissue. This study describes how the lack of caspases specifically in the myocardium supposes a reduction in proliferation, which implies an inferior number of cardiomyocytes, which finally forms a smaller heart. Moreover, our results demonstrate that DKO mice compensate the deficit of cardiomyocytes by developing a mild hypertrophy; the development of this hypertrophy is accompanied by a change in gene expression tendency, showing an adaptive change of these hearts with age. It seems that the proliferative problem in the DKO hearts is related to an increase in the inflammatory response, which could be inducing the expression of genes implicated in the deregulation of proliferation, like Serpina3. By means of the over-expression of non-catalytic caspases we demonstrated that this non-apoptotic function of the caspases is independent of their catalytic activity.

This thesis comprises comparative genomics analyses primarily focussing on the evolution of mammalian proteins. We concentrate on three species of direct relevance as model organisms, for which high quality genome sequences are available, and human. Having previously investigated protein evolution in terms of substitution rates, here we explored less well studied insertions and deletions (indels). We show that indel and substitution frequencies are correlated at the level of protein sequence, and that indels, and in particular insertions, are elevated in regions of low-complexity and repetitive sequence. Furthermore we observe that selection acts more strongly against the incorporation of insertions than deletions in coding sequence. We also look examine in detail the process of evolution following gene duplication in rodents. We show that in general there is a marked increase in evolutionary rate following duplication, which is restricted to the new copy. We find evidence that this increase is sometimes driven by positive selection, and often accompanied by changes in tissue expression profile. These results lead support to the role of neofuntionalisation following gene duplication.<br>Aquesta tesi consta d’anàlisis de genòmica comparada centrades principalment en l'evolució de les proteïnes de mamífers. Les anàlisis se centren en humans i en tres espècies de gran rellevància com a organismes model, per les quals les seqüències genòmiques són d’alta qualitat. Després d'haver investigat prèviament l'evolució de proteïnes considerant les taxes de substitució, en aquesta tesi hem explorat les insercions i delecions (indels), menys estudiades. Demostrem que existeix una correlació entre la freqüència d’indels i substitucions en la seqüència proteica, i que els indels, i en particular, les insercions, són habituals en les regions de baixa complexitat i seqüències repetitives. A més, observem que la selecció actua més fortament en contra de la incorporació d'insercions que de delecions en la seqüència codificant. D’altra banda, també pretenem analitzar detalladament el procés evolutiu després d’una duplicació gènica en rosegadors. Demostrem que, en general, hi ha un marcat augment en la taxa d'evolució després de la duplicació, que es limita a la nova còpia. I trobem evidències que aquest augment és, de vegades, impulsat per la selecció positiva, i, sovint acompanyada de canvis en el perfil d'expressió de teixits. Aquests resultats recolzen el procés de neofuncionalització després de la duplicació gènica.

Introdução: Polineuropatias são doenças do sistema nervoso periférico com etiologias variadas. Dentre elas são freqüentes as inflamatórias e as hereditárias, com prevalência de 0,67-7,7/100000 e 7,9-82,3/100000 para polineuropatia inflamatória desmielinizante crônica (PIDC) e Doença de Charcot-Marie-Tooth (CMT), respectivamente. Existem poucas evidências de sobreposição entre estas duas doenças e também algumas dificuldades diagnósticas em situações específicas. Objetivos: Estudar a freqüência de mutações (duplicações e deleções) do gene PMP22 em uma coorte de pacientes inicialmente diagnosticados como PIDC ou suspeitos de apresentarem as duas condições, os sinais e sintomas sugestivos da sobreposição e os fatores implicados em erro de classificação da neuropatia. Métodos: 111 pacientes com diagnóstico de PIDC foram estudados. DNA foi isolado a partir de leucócitos de sangue periférico segundo protocolo padrão. Duplicações e deleções do gene PMP22 foram avaliadas através de marcadores polimórficos do DNA localizados dentro do cromossomo 17p11.2-12, o qual contém o gene PMP22. Achados clínicos e laboratoriais também foram estudados e comparados entre os grupos. Resultados: Dentre os 111 pacientes estudados, mutações no PMP22 foram encontradas em 10 (9%), sendo duplicações em 9 pacientes e deleção em 1 paciente. Concomitância entre PIDC e CMT foi verificada em 4 pacientes (3,6%), todos com duplicação do PMP22. Os outros 6 pacientes foram diagnosticados como CMT puro (5) ou Neuropatia Hereditária Susceptível à Compressão (1), visto que não apresentaram melhora com o uso de tratamento imunomodulador e/ou imunossupressor (5 casos) ou foi estabelecido diagnóstico alternativo associado (1). Os outros 101 pacientes não tiveram duplicação nem deleção deste gene e, portanto, tinham PIDC apenas. Idade média dos pacientes com PIDC/CMT foi de 23,8±18,0 anos e 43,6±19,3 anos para pacientes sem mutações (p=0,04). Houve diferença estatísticamente significativa na resposta ao tratamento entre os grupos PIDC/CMT X CMT (p=0,008) e PIDC X CMT (p=0,00). Ausência de história familiar e presença de doenças e hábitos ligados ao desenvolvimento de neuropatias periféricas, como diabetes mellitus e ingesta de bebidas alcoólicas, por exemplo, bem como achados atípicos na eletroneuromiografia e na biópsia de nervo podem ter contribuído para a confusão diagnóstica nos casos de CMT puro. Conclusões: Alguns pacientes podem desenvolver PIDC em associação com CMT e se beneficiam do tratamento. A neuropatia hereditária poderia predispor à neuropatia inflamatória, uma vez que estes pacientes tendem a apresentar essa condição em idades mais precoces. Cautela deve ser dispensada àqueles pacientes com suspeita diagnóstica de PIDC que não têm os achados clássicos ou não melhoram com o tratamento, uma vez que podem apresentar outras etiologias para a neuropatia, dentre elas uma neuropatia hereditária, como a CMT.<br>Introduction: Polyneuropathies are peripheral nervous system disorders with a wide range of etiologies. Among them, inflammatory and hereditary are frequent with prevalence of 0.67-7.7/100000 and 7.9-82.3/100000, for chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy (CIDP) and Charcot-Marie-Tooth disease (CMT), respectively. There are a few evidence of ovelapping between these two conditions and also some diagnostic difficulties in specific situations. Objectives: To study the frequency of mutations in PMP22 gene (duplications and delections) among a cohort of patients initially diagnosed as CIDP or suspected to have both conditions, the signs and symptoms related to this ovelapping and factors implicated in misdiagnose. Methods: 111 patients with an initially CIDP suspected diagnosis were studied. DNA was isolated from peripheral blood leucocytes following a standard salting-out protocol. Duplications and delections in the PMP22 gene were analysed by polymorphic DNA markers located within the chromosome 17p11.2-12, wich contains the PMP22 gene. Clinical and laboratory findings were also studied and compared within groups. Results: Among 111 patients studied, 10 (9%) were found to harbor mutations in PMP22 gene, specifically duplications in nine and delection in one. We therefore diagnosed CIDP plus CMT in four patients (3.6%), all of them with a duplicated PMP22 gene. The other six patients were diagnosed as pure CMT (5) or Hereditary Neuropathy with liability to Pressure Palsy (1), as they did not improved with the use of immunomodulatory and/or immunosupressive treatment (five cases) or were found to have alternative associated diagnosis (one patient). The other 101 patients did not show duplication nor delection in this gene, so they had CIDP. Mean age of patients with CIDP/CMT were 23.8±18.0 years and 43.6±19.3 years for patients without mutations (p=0.04). There were statistically significant difference in treatmet response between groups CIDP/CMT X CMT (p=0.008) and CIDP X CMT (p=0.00). The lack of family history and presence of other diseases and habits linked to the development of peripheral neuropathies, as diabetes mellitus and alcohol intake, for instance, as well as atypical findings in electrodiagnostic studies and nerve biopsy may have contributed to misdiagnose in the pure CMT cases. Conclusions: Some patients may develop CIDP in association with CMT and have benefit from treatment. The hereditary neuropathy may predispose to the inflammatory neuropathy as these patients tend to show this condition at younger ages. Caution should be dispensed to those patients with a suspected diagnose of CIDP who do not have the classical disease findings or do not improve with treatment, as they can have alternative etiologies for the neuropathy, among them a hereditary neuropathy as CMT disease.

En aquest treball es presenta l'evolució molecular i estudi funcional de gens localitzats a les duplicacions segmentàries de la regió 7q11.23, implicada en la Síndrome de Williams-Beuren (SWB). S'ha datat l'aparició d'aquestes duplicacions en els últims 25 milions d'anys d'evolució i s'ha proposat un model evolutiu amb reordenaments específics i mecanismes de generació. Correlacions clínico-moleculars en els pacients amb la SWB han permès determinar que l'haploinsuficiència per NCF1, un gen localitzat a les duplicacions, és un factor protector per hipertensió. S'ha proposat un model patogènic per la hipertensió, implicant l'oxidasa NAD(P)H i estrès oxidatiu, suggerint que noves estratègies terapèutiques podrien ser utilitzades. A més, s'ha caracteritzat parcialment la funció de GTF2IRD2, un altre gen de les duplicacions. GTF2IRD2 interacciona amb altres factors de transcripció relacionats, té una localització subcel·lular variable i no s'uneix a ADN. Aquests resultats contribueixen a conèixer millor els mecanismes mutacionals i patogènics de la SWB.<br>This work presents the molecular evolution along with the functional analysis of the genes located in the segmental duplications flanking the 7q11.23 region, involved in Williams-Beuren syndrome (WBS). The generation of the segmental duplications has been dated to the last 25 million years of evolution and an evolutionary model with specific rearrangements and mechanisms has been proposed. Clinical-molecular correlations in WBS patients have allowed to determine that haploinsufficiency at NCF1, a gene located in the duplications, is a protective factor for hypertension. A pathogenic model for hypertension has been proposed, implicating NAD(P)H oxidase and oxidative stress, and suggesting that novel therapeutic strategies could be used. In addition, the functional characterization of another gene of the duplications, GTF2IRD2, has been partially achieved. GTF2IRD2 has been shown to interact with other related transcription factors, to display variable subcellular localization and to lack DNA binding properties. These results contribute to a better knowledge of the mutational and pathogenic mechanisms of the WBS.

碩士<br>嘉南藥理科技大學<br>營養與保健科技研究所<br>98<br>World Health Organization (WHO) has reportered iron deficiency is the most commom nutrional disorder in the world. Iron deficiency with or without concurrent anemia affects about 30% of the global population. Although the rates of deficiency are higher in developing countries, many persons living in developed nations also are iron deficient. The major responsible factor of iron deficiency anemia is poor iron bioavailability in the diet. A number of studies has suggested links between Fe deficiency and lipid metabolism alteration. Moringa oleifera plant is rich in nutrient and used as herbal medicines in India and Africa. The purpose of this study was to evaluate the effects of Moringa leaves on iron bioavailability and hepatic lipid metabolism using a rat hemoglobin (Hb) repletion bioassay. Forty 3-week-old male Wistar-strain rats were used in experiment. In 5-wks depletion period, rats had free access to the iron-deficient diet and deionized water until blood Hb concentration was below 6 g/dL. In the beginning of the repletion period, all rats were divided into five groups according to Hb concentration and body weight : iron-deficient diet (D), D plus 12 ppm Fe from Moringa leaves (12M), D plus 24 ppm Fe from Moringa leaves (24M), D plus 12 ppm Fe as FeSO4 form(12C), D plus 24 ppm Fe as FeSO4 form (24C). D and M groups were fed ad libitum. The C groups was pair-fed to the M groups. In the second week of depletion period, blood for monitoring Hb concentration was drawn from rat’s tails. The repletion period lasted for 5 weeks. Results showed the regenerated Hb concentrations and gains in total Hb and in Hb iron all increased as the increasing dose of iron supplementation either as FeSO4 or as Moringa leaves. Those iron associated parameters in D group had the lowest response. Taking FeSO4 as baseline, the RBV of iron from Moringa leaves are about 29~50%. Fe-deficient rats tended to increase the TG concentrations of serum. Both FeSO4 and Moringa fed rats significantly reduced the rising effect of hepatic TG content induced by iron deficiency. In summary, both Moringa leaves and FeSO4 can decrease the TG concentrations of serum and liver. Moringa leaves has good iron bioavailability than most plant foods. Moringa leaves rich in natural iron source provide an another choice for improving the poor iron nutritional status in developing countries.

碩士<br>國立中興大學<br>生命科學院碩士在職專班<br>90<br>Angiotensin-Converting Enzyme (ACE) Insertion/Deletion (I/D) polymorphism has been shown to be associated with diabetes, hypertension, coronary artery diseases, and diabetic nephropathy, and plasma ACE concentration has been found to be associated with plasma triglyceride and total cholesterol levels in patients with type 2 diabetes。 The goal of this study was to investigate whether ACE gene I/D polymorphism can be associated with metabolic syndrome. 711patients with type 2 diabetes and 750 control subjects were studied. The ACE I/D polymorphism was determined by polymerase chain reaction. The definition and criteria of metabolic syndrome used in this study matched those proposed in the 1998 WHO classification. Our result revealed that Five hundred and thirty-four out of 711 patients with type 2 diabetes (75.1 %) fulfilled the criteria for metabolic syndrome. The prevalence of metabolic syndrome in control subjects with II, ID, and DD genotype were 9.4 %, 11.5 %, and 15.4 %, respectively, and in patients with type 2 diabetes were 68.6 %, 79.2 % and 86.1 %, respectively. The ACE I/D polymorphism was significantly associated with the syndrome in patients with type 2 diabetes (p=0.001). When pooling the controls with diabetes patients, the prevalence of metabolic syndrome in whole study group with II, ID, and DD genotype were 37.9 %, 44.5 % and 51.0 %, respectively and ACE I/D polymorphism was still significantly associated with the metabolic syndrome (p=0.003). Diabetic patients with DD genotype were also found to have a higher prevalence of dyslipidemia (II/ID/DD=43.1% / 53.1% / 65.8%, p< 0.001) and albuminuria (II/ID/DD=36.0% /44.6% / 50.6%, p=0.018), and have higher serum triglyceride levels (II, ID, DD= 155 ± 114 mg/dl, 170 ± 140 mg/dl, and 199 ± 132 mg/dl respectively, p<0.05). Control subjects with DD genotype were also found to have higher prevalence of albuminuria or more advanced nephropathy (II/ID/DD= 5.7% /14.0% /15.4%, p= 0.001), while the prevalence of dyslipidemia was not found to be statistically different in the control group. When pooling the controls with diabetes patients, ACE genotype could still be significantly associated with dyslipidemia (II/ID/DD=34.7%/41.3%/52.2%, p<0.001) and albuminuria or more advanced nephropathy (II/ID/DD=20.3%/28.9%/33.1%, p<0.001). Diabetic patients with metabolic syndrome were found to have higher serum uric acid levels than those without metabolic syndrome (6.4 ± 1.8 mg/dl vs 5.3 ± 1.4 mg/dl, p<0.01). The ACE I/D polymorphism was found to be associated with metabolic syndrome in Chinese patients with type 2 diabetes. This finding may provide genetic evidence to explain the clustering of metabolic syndrome, and suggests that renin-angiotensin system is involved in the pathophysiology of metabolic derangement in patients with type 2 diabetes.

碩士<br>中山醫學大學<br>生化暨生物科技研究所<br>100<br>Pex3p plays an extremely important role in peroxisome biogenesis, and it is an integral membrane protein involved in the early stages of peroxisome biogenesis formation and the maintenance of the integrity of peroxisome biogenesis. Pex3p is involed in the docking of the complex formed by Pex19p and peroxisome membrane protein (peroxisome membrane protein, PMP) on peroxisome membrane, and then Pex19p will promote the insertion of PMP into the peroxisome membrane. When Saccharomyces cerevisiae uses oleic acid as the sole carbon source for its growth, peroxisome becomes an essential organelle because it is the only place in which the fatty acid metabolizes in yeast. In order to understand the function of Pex3p in this research, we are going to deliver pRS406ΔA-pex3-us-ds, including the upper-stream and downstream DNA fragments of PEX3, into the wild type W303.1a, and then PEX3 gene will be deleted by homologous recombination. This PEX3 gene deletion mutant was named ∆pex3. In addition, we are going to clone PEX3 and its promoter into pRS416 to gain pRS416-PPex3-Pex3-HA, and then send pRS416-PPex3-Pex3-HA into the wild type, and observe its protein expression. The experimental results confirmed that pRS416-PPex3-Pex3-HA can express Pex3p successfully. Then, we used the oleic acid selective medium to assy the peroxisome function. Through this experiment, we will observe if Δpex3 can be restored to use oleic acid by pRS416-PPex3-Pex3-HA complementation. Furthermore, we are going to use GFP-PTS1 (Peroxisome Targeting signal 1) to assay peroxisome formation by the fluorescence microscopy technique. The GFP-PTS1 encoding pRS424-Gal-GFP-PTS1 was transformed into the wild type, ∆pex3 mutant and the ∆pex3 (pRS416-PPex3-Pex3-HA) and these strains were assayed by the fluorescence microscopy. So, by these two methods we can conclude whehter the ∆pex3 mutant is correct. Through the two above analytical methods of peroxisomal functions, we have confirmed that the mutant Δpex3 is correct, and the mutant Δpex3 can be used as one of the tools to analyze the function of Pex3p in the future.