Academic literature on the topic 'Désorption-ionisation laser assistée par matrice'

Ce mémoire sur les mécanismes de la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est le fruit de travaux réalisés au laboratoire de spectrométrie de masse et de chimie laser (LSMCL) de l'université de Metz. Cette thématique est apparue au laboratoire suite au développement de l'analyse des biomolécules par spectrométrie de masse et à l'expérience accumulée depuis 15 ans sur la désorption laser. Nous nous sommes attachés à décomposer les étapes constituant une analyse MALDI afin de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de ce type d'ionisation. Nous avons plus précisément, à l'aide de molécules modèles (nucléotides, peptides,), étudie l'interaction entre le faisceau laser et les matrices couramment utilisées. Ceci nous a permis de mettre en évidence le rôle important des petites molécules neutres (notamment le dioxyde de carbone) qui sont éjectées lors de l'expansion du nuage gazeux induit par irradiation laser. Dans ce contexte, nous avons étudié des dérivés et des complexes de la cyclodextrine. Cette partie nous a permis d'expliquer les phénomènes d'interaction entre la molécule cible et les molécules de matrice ainsi que l'influence de la longueur d'onde du laser ionisant. A l'aide de la technique MALDI, nous avons pu mettre en évidence des différences structurales et caractériser des complexes d'inclusion intacts
This report on the mechanisms of matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) was realized in mass spectrometry laboratory at Metz'university. This research field appeared in the laboratory after the development of biomolecules analyses by mass spectrometry and the experience stored for fifteen years on "laser desorption". We decomposed the different states of a MALDI experiment for a better understanding of this ionization process. By using some model compounds (as peptides, nucleotides,. . . ) we have studied more precisely the interaction between a laser beam and the different matrices. This allow us to show the great role of small neutral molecules (e. G. Carbone dioxide,. . . ) which are ejected in the plume after the laser pulse. Then, some derivative and complexes of cyclodextrins have been studied. This part is necessary to explain first the interaction between matrix and target molecules and secondly the dependance on the laser wavelength. Thank's to the MALDI technique we can highlight both both structural differences in intact inclusion complexes characterization

La desorption/ionisation laser assistee par matrice (maldi) est actuellement une methode de production d'ions de haute masse moleculaire tres efficace pour leur analyse en spectrometrie de masse. Toutefois, les mecanismes physico-chimiques associes restent encore mal connus. La premiere partie de ce travail est consacree a l'etude des modifications de la surface du materiau au cours des irradiations laser au seuil de production des ions. Pour la matrice d'acide sinapinique, les signaux des differents ions decroissent avec le nombre de tirs laser jusqu'a disparaitre, et seule une irradiation par quelques tirs laser a haute energie permettent de retrouver le signal ionique. L'examen des surfaces irradiees montre que la desorption s'accompagne d'une fusion du materiau et de modifications chimiques (decarboxylation partielle des molecules de matrice). Pour la matrice d'acide 2,5-dihydroxybenzoique, aucune modification de surface n'a pu etre mise en evidence et l'irradiation s'accompagne de l'ejection d'une quantite importante de matiere (environ 200 m 3/tir laser). Les resultats montrent que la desorption serait un phenomene local lie a l'energie laser absorbee. La seconde partie a ete consacree a l'etude des profils temps-de-vol d'ions peptidiques et de matrice dans des conditions d'extraction retardee. L'evolution du temps-de-vol des ions en fonction du temps de retard a leur extraction a ete systematiquement etudiee. Le resultat principal est la mise en evidence de precurseurs des ions sous forme d'amas non covalents dont la taille a pu etre estimee. La charge electrique de ces amas apparaissant en retard (200 a 400 ns suivant la matrice) par rapport a l'impact laser. L'existence de ces amas permet de comprendre les differentes etapes conduisant a la formation des ions protones en maldi.

Le sujet de ce mémoire porte sur une nouvelle technologie, permettant d'améliorer l'utilisation d'un spectromètre de masse dans le domaine de l'analyse instrumentale de petites molécules (100 à 1200 uma), tant sur le point de vue de la rapidité d'analyse, que sur les coûts d'opérations et de maintenance. Dans un marché de plusieurs milliards de dollars, incluant entre autre l'industrie pharmaceutique, toxicologique ou environnementale, cela peut se traduire par des gains énormes. Cet instrument, la source d'ionisation LDTD (Laser Diode Thermal Desorption), a été développé entièrement par une entreprise québécoise et sera l'objet central de la présente étude en étant mis à l'essai afin de détecter et quantifier la présence dans le miel d'un résidu d'antibiotique dangereux pour l'être humain, le chloramphenicol (CAP). Lors du développement de cette méthode, une découverte particulière et fortuite a permis une amélioration de l'efficacité d'utilisation de l'appareil pour certaines applications en utilisant des acides gras comme agents exaltants. On démontrera donc l'efficacité de la source LDTD afin de détecter des niveaux de CAP aussi bas que dans les méthodes jusqu'à présent publiées, mais dans un temps d'analyse près de 100 fois plus rapide.

Dans un contexte d’étude des altérations biologiques survenant après un impact sur le système nerveux central (SNC), ma thèse porte sur l’étude des modifications protéomiques et lipidiques survenant après une lésion du SNC. Une étude spatio-temporelle a été menée sur un modèle TBI de rat afin d'identifier des marqueurs spécifiques de la lésion. En utilisant le MALDI-MSI, nous avons effectués une reconstruction 3D du cerveau lésé 3 jours post-lésion et nous avons représentés les molécules lipidiques spécifiques à la lésion. Après, cette analyse est réalisé avec d’autres délais après l’impact: 1, 3, 7 et 10 jours. En parallèle, une analyse microprotéomique est réalisée sur des coupes de tissus dans une approche visant à corréler les modifications lipidiques et protéiques. Nos résultats ont permis d'identifier une famille de lipides, les acylcarnitines, exprimés dans le cortex lésé avec une intensité maximale à 3 jours post-impact. Les données de protéomiques ont montrés une régulation positive de l’expression de protéines liées à la maladie de Parkinson. Dans l’ensemble, nos résultats décrivent un lien entre le TBI léger et la maladie de Parkinson dès 3 jours après l’impact, avec un rôle possible de l’acylcarnitine. Cette même famille de molécules est aussi présente dans les lésions médullaires. Dans une approche thérapeutique, les résultats précédents ont montrés que la protéine RhoA est un candidat majeur dans SCI. Après avoir utilisé un inhibiteur de RhoA, une étude protéomique a été réalisée pour évaluer l’impact sur ces lésions. Les résultats montrent que les traitements in-vivo et in-vitro avec l’inhibiteur stimule la croissance neuritique et la régénération axonale
In the context of studying biological alterations occurring post impact to the central nervous system, my thesis was focused on studying the proteomic and lipid changes occurring post injury to the brain and spinal cord. A fundamental spatio-temporal study was conducted on an open-head rat TBI model to identify potential injury-specific markers. Using MALDI MSI, we performed 3D reconstruction of the injured brain at 3 days after injury and depicted lesion-specific m/z lipid molecules. After, MALDI MSI was applied on the acute/sub-acute time frame post impact: 1 day, 3 days, 7 days, and 10 days. In parallel, a microproteomic analysis was carried out on tissue segments directly consecutive to the imaged ones in an approach to correlate both lipid and protein changes. Our results yielded the identification of a family of lipids, acylcarnitines, which are expressed within the injured cortex with maximum intensity 3 days post impact. These lipid molecules also were found to be expressed in the substantia nigra and microproteomics data showed an upregulation in expression of Parkinson’s related proteins. Taken altogether, our results depict a role of link between mild-TBI and Parkinson’s disease as early as 3 days post impact, with a possible role of acylcarnitine. This same family of molecules was also present in SCI. In a therapeutic approach previous results showed RhoA protein as a major candidate post impact in SCI. After using RhoA inhibitor treatment, a proteomic study was carried out to investigate its impact on SCI. The results showed that both in-vivo and in-vitro treatment with RhoA inhibitor stimulated neurite outgrowth and helped in axonal regeneration

Ce travail de these montre l'interet de la spectrometrie de masse a desorption/ionisation laser assistee par matrice (maldi-tof ms) comme outil d'analyse structurale des proteines. Le principal objectif de ce travail etait d'ameliorer les performances de cette technique d'ionisation afin de l'integrer dans les strategies d'analyse du laboratoire. La premiere partie presente le principe de fonctionnement d'une source maldi et d'un analyseur a temps de vol (tof) avec une attention particuliere portee sur les parametres conditionnant la resolution et la qualite des spectres maldi-tof. La partie resultats presente le developpement d'approches analytiques nouvelles basees sur la technique d'ionisation maldi et leur application a des problemes de biochimie analytique difficiles a resoudre avec les techniques usuelles tels que (i) la localisation rapide de sites de clivage proteolytiques d'enzymes peu specifiques (proteases leucocytaires, cathepsines) sur des proteines membranaires (recepteur plaquettaires, app) (ii) l'identification precoce de molecules induites (peptides antibacteriens d'insectes, hormone androgene de crustace) directement a partir du tissus ou du fluide dans lequel elles sont produites ou vehiculees (iii) la verification de l'integrite des molecules (diptericine, hormone androgene) au cours de leur purification (iv) la determination de l'heterogeneite de glycosylation de proteines recombinantes (hlh, hfsh) (v) la determination de la stoechiometrie de complexation de proteines multimeriques de haut poids moleculaire (hemolysine, aerolysine). Les donnees presentees demontrent que l'obtention et la qualite des resultats passent par la maitrise de l'etape de preparation de l'echantillon. Un meilleur controle des differents parametres de cocristallisation de l'echantillon avec la matrice permet des ameliorations significatives en terme de sensibilite, de resolution et de precision sur la masse.

La chimie macromoleculaire et son extension vers la chimie des polymeres connait aujourd'hui un essor considerable. L'utilisation de ces molecules geantes dans notre vie quotidienne et dans le domaine industriel est reellement tres importante. Cependant, pour prevoir et ensuite maitriser les proprietes de ces composes, il est indispensable de connaitre avec precision leurs caracteristiques physico-chimiques. Il existe actuellement de nombreuses methodes permettant l'analyse des polymeres synthetiques. La spectrometrie de masse en fait partie et son utilisation s'est particulierement developpee depuis la fin des annees 80 avec l'apparition de deux nouvelles methodes de desorption/ionisation douces : la desorption/ionisation laser assistee par matrice (maldi) et l'ionisation par electronebulisation (esi). En raison de la diversite de taille et de structure de leurs constituants, l'etude des polymeres synthetiques demeure delicate. La caracterisation fiable de tels composes exige que l'intensite des ions observes sur le spectre de masse soit representative de l'abondance des constituants du polymere. L'etude presentee dans ce memoire a ete realisee sur une classe importante de polymeres synthetiques : des polyesters presentant differentes structures (polyesters aliphatiques, semi-aromatiques, lineaires, cycliques). Dans un premier temps, les conditions experimentales de leur analyse par maldi et par esi ont ete optimisees. Par l'etude de differents facteurs (maldi : la matrice, l'agent ionisant, l'energie du faisceau laser et la detection ; esi : le solvant, la nature du sel, le potentiel applique au premier ecremeur, la temperature et le debit du gaz a contre-courant) nous avons mis en relief des effets de discriminations en fonction de la taille ou de la structure des molecules. Ce travail a egalement permis d'apporter des elements de reponses aux differents problemes souleves concernant la desorption et l'ionisation de ces composes.

Ce manuscrit de thèse présente le développement de méthodes basées sur la spectrométrie de masse consacrées à la recherche d'inhibiteurs d'enzymes en milieux complexes, tels que les extraits de plantes. L’enzyme Tyrosinase a été utilisé comme principale cible biologique du fait de son implication dans les processus d’hyperpigmentation cutanée. De ce fait, la recherche d’inhibiteurs de cette enzyme, présente un grand intérêt pour l'industrie cosmétique. La première partie de ce manuscrit décrit la mise en place de la chromatographie d'affinité frontale (FAC), permettant d’obtenir le classement simultané des inhibiteurs présent dans un mélange complexe en fonction de leurs affinités avec la cible biologique. Deux capillaires hydrophiles de phase monolithiques ont été évalués afin de réduire au maximum les interactions non spécifiques indésirables entre les analytes et le support solide d’immobilisation. De plus, nous avons étudié la faisabilité de l’utilisation de phases à base de silice comme support solide d’immobilisation des enzymes dans le cadre de ces analyses par chromatographie d'affinité frontale. La seconde partie du manuscrit de thèse est consacrée au développement et à l’optimisation de l’approche nommée ENALDI-MS (Enzyme-coupled Nanoparticles-Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry) permettant d’accéder à une gamme des faibles masses (m/z 500 Da). Elle est déclinée en une première approche dite par ‘extinction d’ions’ (Ion Fading, IF-ENALDI), basée sur l’identification directe de la liaison des inhibiteurs vis-à-vis de l’enzyme sans pré-traitement de l’échantillon végétal. Une seconde déclinaison de l’ENALDI-MS concerne une approche dite par ‘Ion Hunting’ (IH - ENALDI MS), basée sur une méthode de pré-concentration sélective des inhibiteurs présents dans l'échantillon
This thesis report presents the development of mass spectrometry-based methods for searching for inhibitors of enzymes in complex mixtures, such as plant extracts. Tyrosinase enzyme was used as the main biological target for the reason of a significant importance of its inhibitors in the cosmetic industry as the skin whitening agents. The first part of this report describes Frontal Affinity Chromatography (FAC), an approach enabling simultaneous ranking the inhibitors within the complex mixture according to their affinities to the biological target. Two hydrophilic capillary-scale polymer-based bioaffinity stationary phases were evaluated in the context of the presence of undesirable nonspecific interactions between the analyte and the solid immobilisation support. In addition, we explored the usability of two types of silica-based particles as a solid support for enzyme immobilisation for FAC. The second part of the thesis manuscript is devoted to Enzyme-coupled Nanoparticle-Assisted Laser Desorption/Ionisation Mass Spectrometry (ENALDI MS) as a low-mass compatible extension of the Intensity ion Fading MALDI MS (IF-MALDI MS) method for high-throughput screening of the inhibitors in the complex mixtures. Two variations of ENALDI MS were evaluated: 'Ion Fading' (IF-ENALDI MS), based on on-the-spot binding of inhibitors by enzyme molecules and 'Ion Hunting' (IH-ENALDI MS), based on selective pre-concentration of inhibitors present in the sample

O gênero Trichosporon é composto por leveduras artrosporadas do Filo Basidiomycota e é conhecido agente de infecção fúngica invasiva (IFI) em pacientes imunodeprimidos ou com outros fatores de risco. Em pacientes onco-hematológicos é a principal levedura responsável por IFI depois do gênero Candida. Entre as espécies responsáveis por infecções no homem encontram-se: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. A tecnologia de identificação de fungos por espectrometria de massa (SM) MALDI-TOF ainda carece de padronização para identificação de fungos do gênero Trichosporon, mas a literatura mostra resultados encorajadores. O objetivo deste estudo é padronizar a técnica de espectrometria de massa MALDI-TOF para a identificação das espécies do gênero Trichosporon de importância médica. O estudo foi realizado em cooperação entre a Divisão de Laboratório Central do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (DLC, HC-FMUSP), Instituto de Medicina Tropical da USP (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) e Laboratoire de Parasitologie-Mycologie do Hospital Saint Antoine de Paris, vinculado ao grupo de pesquisa INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\" Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie de Paris. Noventa e três cepas/isolados foram analisado(a)s, sendo dezenove cepas de referência adquiridas junto à coleção holandesa Centraalbureau Schimmelcultures (CBS), 19 isolados do HC-FMUSP e IAL, e 55 isolados de diferentes hospitais franceses. A identificação molecular foi realizada através do sequenciamento da região IGS1 do rDNA e foi considerada como método de referência. O protocolo de extração de proteínas foi estabelecido através da comparação do desempenho de três metodologias (Bruker®, Cassagne et al., Sendid et al.). Os espectros de massa foram obtidos no laboratório de bacteriologia do Hospital Saint Antoine de Paris através do aparelho Microflex LT®. A interpretação dos resultados qualitativos e quantitativos (logscore) foi realizada através do Software Biotyper 3.0®. O desempenho de identificação do banco de espectros de referência Biotyper 3.0® foi comparado a outros cinco bancos criados a partir de espectros de referência (ERs) derivados de 18 cepas de referência CBS, sete isolados clínicos e 11 ERs do banco Biotyper 3.0. O protocolo de extração de proteínas descrito por Sendid et al. foi escolhido como protocolo de referência pois os espectros produzidos tiveram logscore superiores àqueles obtidos através do método do fabricante. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou 32,3% de identificações corretas das espécies, sendo que o banco de ERs in house (número 5, constituído cepas CBS e isolados clínicos) apresentou 98,5% de identificações de espécies. Espectros de referência do banco de dados Biotyper 3.0® foram submetidos à identificação com a utilização dos ERs criados a partir de cepas CBS e isolados clínicos e foram evidenciados com erros de identificação: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). Após padronização do protocolo de extração e criação de banco de ERs com cepas CBS e isolados clínicos caracterizados pelo sequenciamento da região IGS, a SM por MALDI-TOF apresentou-se como potente uma ferramenta para a identificação de fungos do gênero Trichosporon. O banco de ERs Biotyper 3.0® apresentou um fraco desempenho, relacionado a ERs que foram criados a partir de cepas mal identificadas
Trichosporon spp. are arthrospored yeasts from the Filum Basidiomycota that are known to produce invasive fungal infection (IFI) in patients with immunosupression or other risk factors. After Candida, Trichosporon is the second genus of yeasts responsible for IFI in patients with onco-hematological diseases. The most important species related to human infection are: T. asahii, T. inkin, T. mucoides, T. dermatis, T. jirovecii, T. ovoides, T. cutaneum, T. montevideense, T. domesticum, T. asteroides, T. coremiiforme, T. faecale, T. dohaense, T. lactis, T. japonicum. The technology of mass spectrometry (MS) for identification of Trichosporon species has not yet been standardized. However, preliminary promising results can be found in the literature. The objective of this study is to analyse and validate MS MALDI-TOF for the identification of Trichosporon species of medical relevance. This was a multicentric study with collaboration from the Central Laboratory Section from Clinics Hospital of the Medical School from the University of São Paulo (DLC-HCFMUSP), Tropical Medicine Institute from the University of São Paulo (IMT-USP), Instituto Adolfo Lutz (IAL) and Laboratoire de Parasitologie-Mycologie from the Hospital Saint Antoine of Paris and INSERM/UPMC UMR S945 \"Immunité et Infection\", Faculté de Medecine et Université Pierre et Marie Curie of Paris. Ninety three strains/isolates belonging to sixteen Trichosporon species were analysed. Nineteen were purchased from Centraalbureau Schimmelcultures (CBS) yeast collection, 19 belonged to HC-FMUSP and IAL collections, 55 belonged to different French collections. The reference identification method was the IGS1 rDNA sequencing. A protein extraction protocol was first established after comparing the performance of three different methodologies (Bruker(TM), Cassagne et al., Sendid et al.). The mass spectra were obtained through a Microflex LT(TM) mass spectrometer located at the bacteriology laboratory from Saint Antoine Hospital, Paris. Mass spectra, qualitative and quantitative results were produced through the software Biotyper 3.0(TM). The performance of the original main spectrum (MSP) library was compared to other 5 in house libraries built with the combination of MSPs derived from CBS strains (18), clinical strains (7) or (Bruker Daltonics/BD, Germany/USA) (11). The extraction protocol described by Sendid et al. showed better performance when compared to the manufacturer\'s one and was chosen for the subsequent extractions. Among the 6 different reference spectra databases tested, a specific one composed of 18 reference strains plus 7 clinical isolates (database 5) allowed the correct identification of 66 amongst 67 clinical isolates (98,5%). Biotyper 3.0 library produced only 32,3% of correct identifications. Biotyper\'s MSPs were submitted to cross-identification with MSPs derived from CBS strains and clinical isolates and misidentified original MSPs were identified: T. mucoides (2), T. ovoides (1) e T. cutaneum (2). While until now less widely applied to basidiomycetous fungi, MALDI-TOF appears to be a valuable tool for identifying clinical Trichosporon isolates at the species level. The MSP library Biotyper 3.0 showed a poorer performance which was due to misidentified strains utilized as reference for the MSPs