Academic literature on the topic 'Detecció molecular'

La detecció de l’orgien de la contaminació fecal a l’aigua perment millorar la gestió del medi i mitigar la contaminació en l’origen recuperant amb més eficiència les zones afectades; a més a més permet estimar el risc sanitari que porta associat; prendre les mesures legals oportunes i establir responsabilitat econòmiques. Fins a l’actualitat s’han descrit un elevat número de tècniques i marcadors que indiquen la presència de contaminació i permeten conèixer el seu origen. Abans de la implementació d’aquestes metodologies cal conèixer altres factors. Aquests mètodes s’han definit en una determinada àrea demogràfica i per una determinada població, per tant, cal conèixer si existeix variació geogràfica i temporal, saber-ne la prevalència i persistència al medi, valorar la distribució entre espècies, materialitzar procediments stàndars que puguin ser utilitzats en qualsevol laboratori. A més a més, estudis previs han suggerit que cap dels indicadors de l’origen de la contaminació fecal presenta un 100% d’eficiència i especifitat, així que és necessària la combinació de varis d’ells per tal d’incrementar la discriminació entre diferents oríigens. Aquesta treball consisteix en tres parts diferenciades que volen aprofundir ens les mancances dels mètodes per a determinar l’origen de la contaminació. En la primera part (Capítol 2) s’ha valorat 10 marcadors diferents descrits prèviament: dues espècies del gènere Bifidobacterium marcadores de contaminació humana: Bif. adolescentis i Bif. dentium, dos marcadors específics d’humans (HF183 i HF134) i dos de rumiants (CF128 i CF193) que detecten espècies no cultivades del grup Bacteroidetes, un marcador del gen esp de soques d’Enterococcus faecium específiques d’humans i 3 marcadors d’ADN mitocondrial de cèl•lules humanes, bovines i porcines. Tot i que alguns dels marcadors moleculars analitzats presenten una elevada sensibilitat i especificitat, cap d’ells assegura un 100% d’encert. Això ha fer que es valorés la possibilitat de desenvolupar models predictius amb combinacions d’ells. D’aquesta manera s’ha obtingut una discriminació del 79,6% entre 4 oríigens diferents: humà, boví, porcí i avícola i d’un 90,1% distingint entre contaminació d’origen humà o no humà. A la segona part, veient la importància de Bif. adolescentis i Bif. dentium com a marcadors de contaminació fecal humana, s’ha utilitzat la tècnica de DGGE per tal d’aprofundir en l’ecologia del gènere. S’ha analitzat la distribució d’espècies en mostres d’aigua residual de diferents orígens. Bif. adolescentis s’ha confirmat com una de les espècies majoritàries en mostres d’origen humà. A la vegada, s’han definit espècies majoritàries en mostres d’origen boví com Bif. pseudolongum ssp. pseudolongum i Bif. thermophilum. Aquesta espècie també ha estat majoritària en porcs juntament amb una espècie que no identificada prèviament. En aus s’ha detectat una sola espècie identificada com Bif. saeculare. En els últims anys s’han dissenyat un elevat nombre de PCRs i q-PCRs específiques d’espècies no cultivades del grup Bacteroidetes per discriminar entre diferents hostes. En la tercera part, s’ha volgut aprofundir en el coneixement de la persistència del gènere Bacteroides i conèixer els factors ambientals que afecten la seva supervivència. Mitjançant experiments in situ al riu Llobregat s’ha observat la persistència de les soques tipus Bact. fragilis i Bact. thetaiotaomicron, majoritàries en aparell digestiu humà i espècies ambientals de l’aigua residual. S’ha realitzat el seguiment de la supervivència mitjançant tècniques de cultiu i tècniques moleculars. S’ha observat una major supervivència de Bact. fragilis a baixes temperatures que altes. Bact. thetaiotaomicron ha mostrat el contrari, major supervivència a l’estiu quan s’ha registrat una menor concentració d’oxigen dissolt a l’aigua. En aquesta espècie s’ha descrit prèviament una menor tolerància a l’oxigen. La presència de predadors a l’aigua també afecta de manera important la supervivència del gènere.<br>Faecal pollution is one of the main causes of degradation of surface and coastal water quality. Faecal pollution can be attributed to different sources, for example urban sewage, sewer misconnections, slaughterhouse wastewaters, manure run-off and solid disposals. The principal faecal bacterial indicators E. coli and Enterococcus are used to show the presence of pollution as well as the faecal load in water. However, these indicators do not discriminate between the possible sources of pollution. During the last decade many authors have described different methodologies based on molecular tools to detect different Microbial Source Tracking (MST) markers. However there is a lack of knowledge about the behaviour of the markers when they appear in the environment. Usually these markers have been described in a specific geographical area. For this reason their geographical and temporal stability has to be tested. Other aspects such as their prevalence and persistence in the aquatic environment must be known and standard operating procedures must be determined. The current project aimed to address these questions. 144 samples of different human and animal sources around Catalonia were collected in order to evaluate the applicability of some described MST markers, e.g. Bifidobacterium adolescentis, Bif. dentium, Bacteroides species human and ruminant specifics, esp gene of Ent. faecium and mitochondrial DNA of human, bovine and swine cells. The specificity and sensitivity of the markers was determined. Each marker alone does not give 100% source discrimination and for that reason predictive models were developed. These models increased the capacity of source discrimination using the lowest possible number of markers. Bif. adolescentis and Bif. dentium have been described as human specific species. Denaturant gradient gel electrophoresis technique was used to broaden the knowledge of Bifidobacterium distribution among different animal sources and to describe new species specificity to enable their uses as new MST markers. In addition, Bacteroidetes species have shown themselves to be capable MST markers. How environmental factors such as temperature and dissolved oxygen affect their survival in the environment has been studied in order to predict the durability of the markers in these environments. For this purpose, molecular techniques such as PCR and Q-PCR and cultivable methodologies combined with colony hybridization were used.

Les crisis sanitàries relacionades amb els aliments han posat en evidència la complexitat del procés de producció i la necessitat d'abordar la seguretat alimentària amb un plantejament global que comprengui tota la cadena, des de les fases més primàries de la producció fins al consum, amb la prioritat bàsica de la protecció de la salut de la població. <br/>Els aliments contaminats representen la principal via de transmissió dels microorganismes. Garantir un risc zero en la presència d'algun d'aquests agents no desitjables en un aliment és impossible. No obstant, la producció d'aliments segurs és una responsabilitat compartida entre els fabricants i les autoritats competents. <br/>Actualment l'aplicació en determinades fases de la producció de sistemes d'Anàlisi de Perills i Punts Crítics de Control (APPCC) és un instrument molt valuós per a la millora dels nivells de seguretat alimentària, i els principis en els quals es basa són suficientment flexibles com per poder ser aplicats en tots els tipus d'establiments alimentaris.<br>The sanitary attacks related with food have shown the complexity of the productivity process and the necessity to tackle the food safety like a global approach which includes everything from the primary steps of production to the consumption, taking into account that the priority is to protect the health of the population. <br/>The contaminated food is the most important way of transmission of microorganisms. It is impossible to guarantee the zero risk in the presence of one of these undesirable agents in food. However, the production of safety food is a responsibility shared between the producers and the competent authorities. <br/>Nowadays, the application in some steps of the production of the Analysis of Critical Control Points (HACCP) represents an important tool to improve the levels of food safety and the principles are flexible enough to be applied in all kind of food establishment.

Stored products include all postharvest agricultural foodstuffs that do not require refrigeration and that can be preserved for several months under proper conditions as cereal grain and other raw material or processed food. Regrettably, in the Mediterranean region, the presence of insect pests such as the internal feeders of grain: Rhyzopertha dominica (F.) (Coleoptera: Bostrichidae), Sitophilus spp. (S. granarius (L.), S. oryzae (L.) and S. zeamais (Motschulsky)) (Coleoptera: Curculionidae) and Sitotroga cerealella (Olivier) (Lepidoptera: Gelechiidae) as well as the moth usually present in warehouses and grain mills, Ephestia kuehniella (Zeller) (Lepidoptera: Pyralidae), induce important quantitative and qualitative damage before consumption. Among the integrated pest management strategies for the control of these concerning stored product pests, biological control with the introduction of parasitoids as natural enemies represents a good alternative to the use of pesticides. Unfortunately, for the correct implementation and success of this sustainable approach, higher management knowledge is required. For this reason, the aim of this thesis was to assess different biological control approaches for the control of the most important stored product pests. A major issue for the cereal industry is the early detection of insects during grain storage and processing, especially when immature stages of the pests are hidden inside the grain kernels, such as happens with the internal feeders. Then, the first two chapters of this thesis are dedicated to the development of two Polymerase Chain Reaction (PCR) methodologies for internal feeder’s diagnosis. First, in chapter 1, a realtime PCR (qPCR) protocol for the detection and quantification of R. dominica in rice as a model system to quantify internal feeders in grain with a simple methodology is presented. On the other side, in chapter 2, a multiplex PCR protocol for the simultaneous detection and identification of the five most prevalent internal feeder pest species in different grains and processed food is described and then, also tested with commercial samples. For the effective use of natural enemies it is vital to understand and consider the interactions among physical, chemical and biological factors that take place when the grain is stored. For this reason, the third chapter of the thesis is focused on assessing the effectiveness of the parasitoid Anisopteromalus calandrae (Howard) (Hymenoptera: Pteromalidae) released in three different densities (10♀♀, 20♀♀ or 40♀♀ parasitoids) to control high infestations of the weevils R. dominica and S. zeamais in two kilos of rice under two risk temperatures (23ºC and 28ºC). The last chapter of the thesis is devoted to the optimization of an economic and easy to use device called Bankerbox for the control of the moth E. kuehniella by rearing and progressively releasing the parasitoid Habrobracon hebetor (Hüber) (Hymenoptera: Braconidae). In this perfectionated Bankerbox version, to avoid the risk of contamination of the stored products, Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) larvae was chosen as host to rear the parasitoid. Then, three different treatments were tested, one with E. kuehniella 4th instar larvae and two with G. mellonella: one containing 4th instar larvae and the other with mixed larval stages (2nd and 4th instar larvae). The research carried out in this thesis attends to increase the knowledge for the proper use of integrated pest management strategies by providing feasible alternatives to the use of pesticides in the stored product industry for the control stored product pests.

El Retinoblastoma és el tumor intraocular maligne més freqüent en l'edat pediàtrica, amb una incidència d'entre 1/16.000 i 1/25.000 nascuts vius. És hereditari en el 40% dels casos, amb una segregació de caràcter autosòmic dominant, i no hereditari en el 60%.<br/>Per a determinar si un pacient presenta la forma hereditària o no hereditària de la malaltia, cal un diagnòstic genètic, pel que l'objectiu principal d'aquest treball va ser l'establiment d'un protocol de diagnòstic addient.<br/>Es va realitzar un estudi citogenètic i d'hibridació in situ fluorescent, i un estudi molecular, utilitzant les tècniques de detecció directa de mutacions per PCR i digestió enzimàtica, la tècnica de SSCP, i la seqüenciació automàtica. Es va portar a terme d'altra banda un estudi indirecte per anàlisi de lligament, en famílies amb al menys dues generacions d'individus afectes<br/>A partir d'aquest treball s'han obtingut els resultats i conclusions següents:<br/>1.- Mitjançant l'estudi citogenètic s'ha detectat un 4,2% d'anomalies constitucionals que justifiquen el fenotip dels pacients<br/>2.- Mitjançant FISH s'han detectat mutacions constitucionals en el 14,3% dels individus estudiats, que justifiquen el seu fenotip<br/>3.- En l'anàlisi de lligament utilitzant els marcadors BamHI, XbaI, Tth 111 I, Rb1.20, i VNTR16 s'ha observat un percentatge d'heterozigots del 46,6%, 60%, 34,5%, 74,2% i 84,6% respectivament<br/>La utilització conjunta de cinc marcadors polimòrfics ha permès identificar l'al·lel del gen RB1 al que va lligada l'herència del retinoblastoma en les famílies estudiades<br/>4.- L'anàlisi dels exons 8 i 18, que contenen codons CGAarg, per digestió amb enzims de restricció, ha permès detectar mutacions en dos pacients (5%), caracteritzades per seqüenciació, i els resultats obtinguts estan d'acord amb el fenotip dels pacients <br/>5.- El cribatge de mutacions mitjançant SSCP ha permès la detecció, en quatre pacients, de tres variants, (3,1%, 2,8%, 5,8% dels pacients estudiats per cada exó), caracteritzades mitjançant seqüenciació<br/>6.- La baixa incidència d'anomalies detectades mitjançant SSCP es justifica tant per l'alt percentatge de pacients amb retinoblastoma esporàdic unilateral i unifocal inclòs a l'estudi (35%), com per l'elevada heterogeneitat mutacional del gen RB1, i per la baixa eficiència del mètode.<br/>7.- El diagnòstic genètic mitjançant l'anàlisi de mutacions ha permès l'assessorament als familiars de risc, i oferir un diagnòstic prenatal<br/>L'anàlisi indirecta ha estat útil per a la detecció de portadors adults no afectes, i per a determinar la condició de no portadors de pacients en edat de risc, fet que els pot excloure de revisions oftalmològiques<br/>8.- La variabilitat clínica i l'heterogeneitat genètica de la malaltia, fan necessari utilitzar un protocol d'estudi genètic, tant per pacients amb retinoblastoma bilateral com unilateral, aplicable a la rutina clínica en termes de cost-benefici.<br>Retinoblastoma (Rb) is the most common intraocular tumour in children, with an incidence of 1 in 16.000-23.000 live births. Of all Rb-patients, 40% have a heritable predisposition; this form is inherited as an autosomal dominant trait, with high, but incomplete penetrance.<br/>In order to determine carrier status it's necessary to establish a test suitable for genetic diagnosis.<br/>Cytogenetic and fluorescence in situ hybridization analysis, as well as a molecular study of mutations by enzymatic digestion, SSCP and PCR sequencing were carried out. In patients with positive family history, we have employed intragenic polymorphic markers in a linkage analysis<br/>Our main results and conclusions are as follow:<br/>1.- Cytogenetic and FISH analysis allowed the detection of constitutional mutations in 4,2% and 14,3% of patients respectively<br/>2.- Segregation of disease-causing gene was followed by linkage analysis in all families studied<br/>3.- Enzimatic digestion analysis of exons 8 and 18 revealed mutations in two patients (5%), confirmed by sequencing, and related to patient's phenotype<br/>4.- Mutation screening by SSCP allowed the detection of three alterated patterns (3,1%, 2,8%, 5,8% of patients studied for each exon), all of them characterized by sequencing<br/>5.- The low frequency of mutations found in our study using SSCPis explained by the high percentage of unilaterally sporadic affected patients analyzed (35%), as well as by the wide spectrum of mutations affecting Rb gene, and by the low efficiency of SSCP<br/>6.- Direct detection of mutations has allowed genetic assessment of parents, and can be applied in prenatal screening<br/>Indirect analysis has allowed unequivocal identification of gene carriers as well as exclusion of repeated ophthalmological examination of those individuals who don't carry the mutant gene. The study has been applied prenatally<br/>7.- Because of clinical and genetic heterogeneity, a procedure for genetic testing is required, both for bilaterally and unilaterally affected patients. This procedure needs to be applicable to clinic routine

La contaminació química planteja un gran perill per als ecosistemes naturals i té un gran impacte en la disponibilitat dels recursos d'aigua. Els contaminants amb activitat biològica específica que interaccionen amb el metabolisme dels sistemes reguladors i/o hormonals dels éssers vius reben el nom general de xenobiòtics. Donada la seva toxicitat potencial a baixes concentracions, és fonamental desenvolupar les eines capaces de detectar les interaccions entre aquests xenobiòtics i els receptors cel·lulars. Els bioassaigs basats en la utilització de llevats modificats genèticament, també coneguts com a RYA, han demostrat ser una eina excel·lent per a la detecció de xenobiòtics. En aquest treball s'han desenvolupat i analitzat diferents versions de RYA a fi d'implementar un protocol automatitzable per a l'avaluació i el control de l'impacte ambiental causat per diferents xenobiòtics. El RYA s'ha utilitzat per a correlacionar la presència de xenobiòtics amb activitats biològiques potencialment nocives en mostres ambientals i per a establir relacions entre l'estructura química i l'afinitat de diferents compostos químics i dels seus derivats per diferents receptors nuclears de vertebrats. Finalment, s'ha realitzat un exercici d'intercalibració del sistema RYA per a la detecció d'estrogenicitat en mostres d'aigua a nivell europeu i s'ha aplicat en la detecció de xenobiòtics en mostres ambientals i en la monitorització de mètodes de tractament d'aigües residuals.<br>Chemical pollution represents a great danger to the natural ecosystems and has a major impact in the availability of water resources. Those pollutants with specific biological activity and able to interact with the metabolism of hormonal systems of living beings are generally named xenobiotics. Given its potential toxicity in lower concentrations, it is essential to develop specific tools to detect the connections between these xenobiotics and cellular receptors. The bioassays based on genetically modified yeast strains, also known as RYA, are excellent tools for xenobiotic detection. In this work, different versions of RYA were developed and analysed in order to implement a mechanised protocol to evaluate and control the environmental impact caused by different xenobiotics. These protocols have been used to connect the presence of xenobiotics with biological activities of environmental relevance and to correlate chemical structure of chemical components and of their derivatives and their capacity to interact with nuclear receptors. Finally, we conducted an interlaboratory exercise on the use of RYA for detection of estrogenicity in waters at European level. All these techniques have multiple applications to detection of xenobiotics in environmental samples and in the surveillance of the efficiency and the routinely control of residual water treatment plants.

Una de les principals limitacions a la que s‘enfronta la producció de mol·luscs bivalves és la prevenció i control de malalties, que es dispersen, principalment, pel moviment d‘estocs. A les Balears, hem trobat paràsits de bivalves poc patogènics com Bucephalus haimeanus, Mytilicola intestinalis, i metacercàries de tremàtodes. També altres que suposen un risc per a la producció, com Marteilia refringens, Perkinsus mediterraneus i P. olseni. La presència de M. refringens és una greu amenaça, doncs produeix desordres fisiològics que poden matar l‘hoste. Probablement, als anys 80, la desaparició dels bancs ostrícoles va ser causada per aquesta malaltia. Els musclos també són susceptibles a la infecció per M. refringens, però són resistents a la malaltia. L‘any 2004, es va detectar una mortalitat al banc de la rossellona (Chamelea gallina) de s‘Arenal de Palma de Mallorca. Per detectar l‘espècie causant de la malaltia es va recórrer a tècniques histològiques, hibridació in situ, PCR i PCR niada. La seqüència obtinguda a partir d‘un bloc de parafina va mostrar un 99,1 % de similitud amb les M. refringens tipus O. D‘aquesta manera es va concloure que l‘agent etiològic era M. refringens i posteriorment que la prevalença era del 55,1%. La ubicació específica de les cèl·lules de Marteilia refringens en els teixits de la rossellona es va determinar per hibridació in situ, trobant totes les fases conegudes, inclosa la d‘esporulació, el que demostra que el paràsit completa la infecció a la rossellona. Perkinsus mediterraneus infecta a una gran varietat de mol·luscs bivalves a l‘arxipèlag balear: Ostrea edulis, Mimachlamys varia, Arca noae, Chamelea gallina, Pinna nobilis i Venus verrucosa, sense mortalitats associades a aquest paràsit. Perkinus olseni sols s‘ha detectat en V. verrucosa, però en el present estudi no l‘hem trobat. La recerca de Perkinsus spp. s‘ha realitzat mitjançant RFTM i la determinació de l‘espècie per PCR-RFLP i seqüenciació. La prevalença de P. mediterraneus ha estat semblant a la d‘altres espècies de Perkinsus i la dinàmica de la seva infecció es semblant a la de P. marinus en la badia de Chesapeake, amb valors màxims de detecció del paràsit al setembre i octubre, després del màxim estival de temperatura, i regressió de la infecció a l‘hivern. Hem trobat 12 haplotips de P. mediterraneus amb una elevada similitud genètica. Les diferències es fan majors en incloure seqüències procedents de la bases de dades del GenBank, augmentant el nombre d‘haplotips a 24. Les anàlisis filogenètiques han detectat, en conjunt, tres grups diferents d‘O. edulis de Menorca, que es diferencien d‘altres llinatges coespecífics. Les anàlisis recolzen aquesta diferenciació entre les poblacions de Menorca i Mallorca, la qual sembla, en bona part deguda a l‘aïllament geogràfic del port de Maó. Malgrat això, altres factors, com la variabilitat ambiental, diferents localitats i dates de detecció, la translocació d‘animals, l‘activitat humana, etc, poden tenir certa influència. Al Mediterrani occidental es troben tres espècies de Perkinsus. Malgrat que es coneix que es produeixen co-infeccions a l‘escopinya gravada del port de Maó amb P. olseni i P. mediterraneus, no hem trobat cap cas, ni tampoc bivalves afectats per P. chesapeaki, espècie que s'ha trobat al delta de l'Ebre. A diferents mostreigs de C. gallina hem detectat la presència de M. refringens i P. mediterraneus. Encara que no hem trobat co-infecció, aquesta no es pot descartar, perquè els individus són molt joves i possiblement ambdós patògens estiguin a fases inicials d‘infecció.Tenint en compte que l‘esporulació de M. refringens s‘inicia quan la temperatura de l‘aigua és de 17ºC (mes de maig), que les zoospores de P. mediterraneus apareixen més tard (setembre-octubre) i que les mortalitats es detecten al juny-juliol, és més probable que la causa de la mortalitat sigui la marteiliosi.<br>Una de las principales limitaciones a la que se enfrenta la producción de moluscos bivalvos es la prevención y control de enfermedades, dispersadas, principalmente, por movimiento de partidas. En las Baleares, hemos encontrado parásitos de bivalvos poco patogénicos como Bucephalus haimeanus, Mytilicola intestinalis y metacercarias de tremátodos. También otros que suponen un riesgo para la producción, como Marteilia refringens, Perkinsus mediterraneus y P. olseni. La presencia de M. refringens es una grave amenaza, pues produce desórdenes fisiológicos que pueden matar al huésped. Probablemente, en los años 80, la desaparición de los bancos ostrícolas fue causada por esta enfermedad. Los mejillones también són susceptibles a la infección por M. refringens, pero són resistentes a la enfermedad. En 2004, se detectó una mortalidad en el banco de la chirla (Chamelea gallina) de s‘Arenal de Palma de Mallorca. Para detectar la especie causante de la enfermedad se recurrió a técnicas histológicas, hibridación in situ, PCR y PCR anidada. La secuencia obtenida a partir de un bloque de parafina mostró un 99,1% de similitud con M. refringens tipo O. De esta manera se concluyó que el agente etiológico era M. refringens y posteriormente, que la prevalencia era del 55,1%. La ubicación específica de las células de Marteilia refringens en los tejidos de la chirla se determinó por hibridación in situ, encontrando todas las fases conocidas, incluida la de esporulación, lo que demuestra que el parásito completa la infección en la chirla. Perkinsus mediterraneus infecta a una gran variedad de moluscos bivalvos en el archipiélago balear: Ostrea edulis, Mimachlamys varia, Arca noae, Chamelea gallina, Pinna nobilis y Venus verrucosa, sin mortalidades asociadas a este parásito. Perkinsus olseni sólo se ha detectado en V. verrucosa, pero en el presente estudio no lo hemos encontrado. La búsqueda de Perkinsus spp. se ha realizado mediante RFTM y la determinación de la especie por PCR-RFLP y secuenciación. La prevalencia de P. mediterraneus ha sido similar a la de otras especies de Perkinsus y la dinámica de su infección es similar a la de P. marinus en la bahía de Chesapeake, con valores máximos de detección del parásito en septiembre y octubre, después del máximo estival de temperatura, y regresión de la infección en invierno. Hemos encontrado 12 haplotipos de P. mediterraneus con una elevada similitud genética. Las diferencias se hacen mayores al incluir secuencias procedentes de la bases de datos del GenBank, aumentando el número de haplotipos a 24. Los análisis filogenéticos han detectado, en conjunto, tres grupos diferentes de O. edulis de Menorca, que se diferencian de otros linajes coespecíficos. Los análisis apoyan esta diferenciación entre las poblaciones de Menorca y Mallorca, la cual parece, en buena parte debida al aislamiento geográfico del puerto de Mahón. Sin embargo, otros factores, como la variabilidad ambiental, diferentes localidades y fechas de detección, la translocación de animales, la actividad humana, etc, pueden tener cierta influencia. En el Mediterráneo occidental se encuentran tres especies de Perkinsus. Aunque se conoce que se producen coinfecciones en la escupiña grabada del puerto de Mahón con P. olseni y P. mediterraneus, no hemos encontrado ningún caso, ni tampoco bivalvos afectados por P. chesapeaki, especie que se ha detectado en el delta del Ebro. En diferentes muestreos de C. gallina hemos detectado la presencia de M. refringens y P. mediterraneus. Aunque no hemos encontrado coinfección, ésta no se puede descartar, porque los individuos són muy jóvenes y posiblemente ambos patógenos estén en las fases iniciales de infección. Teniendo en cuenta que la esporulación de M. refringens se inicia cuando la temperatura del agua es de 17ºC (mes de mayo), que las zoosporas de P. mediterraneus aparecen más tarde (septiembre-octubre) y que la mortalidad se detecta en junio-julio, lo más probable es que la causa sea la marteiliosis<br>One of the main issues in bivalve mollusc production is the prevention and control of diseases, scattered mainly by stock movements. In the Balearic Islands, we found low pathogenic bivalve parasites as Bucephalus haimeanus, Mytilicola intestinalis and trematode metacercariae. Furthermore, we found others that are a threat for their welfare, like Marteilia refringens, Perkinsus mediterraneus and P. olseni. M. refringens is a serious threat, because it causes physiological disorders that could kill the host. Presumably, in the 80s, this disease was the agent of oyster banks die out. Mussels are susceptible to the infection, but they are resistant to the disease. Mass mortality was detected in 2004 at the striped Venus shell (Chamelea gallina) bed in S‘Arenal beach. We use histological techniques, in situ hybridization, PCR and nested PCR to detect the disease agent. From a paraffin block we retrieved a sequence which showed 99.1% similarity with M. refringens type O. Thus, it was concluded that the aetiological agent was M. refringens. Subsequently, we found a prevalence of 55.1%. Marteilia refringens specific location in striped Venus shell tissues was determined by in situ hybridization. We observed all known stages, including sporulation, thus this parasite could complete its vital cycle in C. gallina, and so striped Venus shell should be considered as a new host of M. refringens. A wide bivalve mollusc variety is infected by Perkinsus mediterraneus in Balearic Islands: Ostrea edulis, Mimachlamys varia, Arca noae, Chamelea gallina, Pinna nobilis and Venus verrucosa, but they are not killed by this parasite. Perkinsus olseni has only been detected in V. verrucosa from Mahon harbour, although we have not detected it in another bivalve species. Perkinsus spp. search was performed using RFTM and species was established by PCR-RFLP and sequencing. P. mediterraneus prevalence was similar to other Perkinsus species and their infection dynamics is like P. marinus’ in Chesapeake Bay, with maximum detection values in September and October, after summer peak temperature with infection regression in winter. We have found 12 P. mediterraneus haplotypes, all of them sharing a high similarity. Differences grow up when we added GenBank sequences. Then, the haplotype number raised 24. Three groups of O. edulis from Minorca were revealed by phylogenetic analyses which are different from other co-specifics lineages. Analysis supported this differentiation among populations from Minorca and Majorca. This differentiation could be due to Mahon harbour geographic isolation. Nevertheless, another factors, such environmental variability, different detection locations and dates, animal translocations, human activity, etc., might also have some influence. There are three Perkinsus species at the western Mediterranean. Although it is known that co-infections between P. olseni and P. mediterraneus can happen in warty Venus shell from Mahon harbour, we have not found any occurrence. Furthermore, we have not detected infection by P. chesapeaki, although it has been found in the Ebro delta. We have found out M. refringens and P. mediterraneus presence in different C. gallina samples. Although coinfection has not been found, we cannot discard it, because individuals are very young and perhaps both pathogens are in early infection stages. Given that M. refringens sporulation starts when water temperature is 17ºC (May), P. mediterraneus zoospores appear later (September-October) and mortality is detected in June-July, in this way, marteiliosis might be the candidate.

La presencia de microorganismos patógenos en alimentos es uno de los problemas esenciales en salud pública, y las enfermedades producidas por los mismos es una de las causas más importantes de enfermedad. Por tanto, la aplicación de controles microbiológicos dentro de los programas de aseguramiento de la calidad es una premisa para minimizar el riesgo de infección de los consumidores. Los métodos microbiológicos clásicos requieren, en general, el uso de pre-enriquecimientos no-selectivos,<br/>enriquecimientos selectivos, aislamiento en medios selectivos y la confirmación posterior usando pruebas basadas en la morfología, bioquímica y serología propias de cada uno de los microorganismos objeto de estudio. Por lo tanto, estos métodos son laboriosos, requieren un largo proceso para obtener resultados definitivos y, además, no siempre pueden realizarse. Para solucionar estos inconvenientes se han desarrollado diversas metodologías alternativas para la detección identificación y cuantificación de microorganismos patógenos de origen alimentario, entre las que destacan los métodos<br/>inmunológicos y moleculares. En esta última categoría, la técnica basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en la técnica diagnóstica más popular en microbiología, y recientemente, la introducción de una mejora de ésta, la PCR a tiempo real, ha producido una segunda revolución en la metodología diagnóstica molecular, como pude observarse por el número creciente de publicaciones científicas y la aparición continua de nuevos kits comerciales. La PCR a tiempo real es una<br/>técnica altamente sensible -detección de hasta una molécula- que permite la cuantificación exacta de secuencias de ADN específicas de microorganismos patógenos de origen alimentario. Además, otras ventajas que favorecen su implantación potencial en laboratorios de análisis de alimentos son su rapidez, sencillez y el formato en tubo cerrado que puede evitar contaminaciones post-PCR y favorece la automatización y un alto rendimiento. <br/>En este trabajo se han desarrollado técnicas moleculares (PCR y NASBA) sensibles y fiables para la detección, identificación y cuantificación de bacterias patogénicas de origen alimentario (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis y Salmonella spp.). En concreto, se han diseñado y optimizado métodos basados en la técnica de PCR a tiempo real para cada uno de estos agentes: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, y también se ha optimizado y<br/>evaluado en diferentes centros un método previamente desarrollado para Salmonella spp. Además, se ha diseñado y optimizado un método basado en la técnica NASBA para la detección específica de M. avium subsp. paratuberculosis. También se evaluó la aplicación potencial de la técnica NASBA para la detección específica de formas viables de este microorganismo. <br/>Todos los métodos presentaron una especificidad del 100 % con una sensibilidad adecuada para su aplicación potencial a muestras reales de alimentos. Además, se han desarrollado y evaluado procedimientos de preparación de las muestras en productos cárnicos, productos pesqueros, leche y agua. De esta manera se han desarrollado métodos basados en la PCR a tiempo real totalmente específicos y altamente sensibles para la determinación cuantitativa de L. monocytogenes en productos<br/>cárnicos y en salmón y productos derivados como el salmón ahumado y de M. avium subsp. paratuberculosis en muestras de agua y leche. Además este último método ha sido también aplicado para evaluar la presencia de este microorganismo en el intestino de pacientes con la enfermedad de Crohn's, a partir de biopsias obtenidas de colonoscopia de voluntarios afectados.<br/>En conclusión, este estudio presenta ensayos moleculares selectivos y sensibles para la detección de patógenos en alimentos (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis) y para una rápida e inambigua identificación de Salmonella spp. La exactitud relativa de los ensayos ha sido excelente, si se comparan con los métodos microbiológicos de referencia y pueden serusados para la cuantificación de tanto ADN genómico como de suspensiones celulares. Por otro lado, la combinación con tratamientos de preamplificación ha resultado ser de gran eficiencia para el análisis de las bacterias objeto de estudio. Por tanto, pueden constituir una estrategia útil para la detección rápida y sensible de patógenos en alimentos y deberían ser una herramienta adicional al rango de herramientas diagnósticas disponibles para el estudio de patógenos de origen alimentario.<br>The presence of pathogens in foods is among the most serious public health concerns, and the diseases produced by them are a major cause of morbidity. Consequently, the application of microbiological control within the quality assessment programs in the food industry is a premise to minimize the risk of infection for the consumer. Classical microbiological methods involve, in general, the use of a non-selective pre-enrichment, selective enrichment, isolation on selective media, and subsequent confirmation using morphological, biochemical and/or serological tests. Thus, they are laborious, time consuming and not always reliable (e.g. in viable but non-culturable VBNC forms). A number of alternative, rapid and sensitive methods for the detection, identification and quantification of foodborne pathogens have been developed to overcome these drawbacks. PCR has become the most popular microbiological diagnostic method, and recently, the introduction of a development of this technique, RTi-PCR, has produced a second revolution in the molecular diagnostic methodology in microbiology. RTi-PCR is highly sensitive and specific. Moreover, it allows accurate quantification of the bacterial target DNA. Main advantages of RTi-PCR for its application in diagnostic laboratories include quickness, simplicity, the closed-tube format that avoids risks of carryover contaminations and the possibility of high throughput and automation.<br/>In this work, specific, sensitive and reliable analytical methods based on molecular techniques (PCR and NASBA) were developed for the detection, identification and quantification of foodborne pathogens (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and Salmonella spp.). Real-time PCR based methods were designed and optimised for each one of these target bacteria: L. monocytogenes, L. innocua, Listeria spp. M. avium subsp. paratuberculosis, and also a real-time PCR based<br/>method previously described for Salmonella spp. was optimised and multicenter evaluated. In addition, an NASBA-based method was designed and optimised for the specific detection of M. avium subsp. paratuberculosis. The potential application of the NASBA technique for specific detection of viable M. avium subsp. paratuberculosis cells was also evaluated.<br/>All the amplification-based methods were 100 % specific and the sensitivity achieved proved to be fully suitable for further application in real food samples. Furthermore, specific pre-amplification procedures were developed and evaluated on meat<br/>products, seafood products, milk and water samples. Thus, fully specific and highly sensitive real-time PCR-based methods were developed for quantitative detection of L. monocytogenes on meat and meat products and on salmon and cold smoked salmon products; and for quantitative detection of M. avium subsp. paratuberculosis on water and milk samples. The M. avium subsp. paratuberculosis-specific real-time PCR-based method was also applied to evaluate the presence of this bacterium in the bowel<br/>of Crohn's disease patients using colonic biopsy specimens form affected and unaffected volunteers. In addition, fully specific and highly sensitive real-time NASBA-based methods were developed for detection of M. avium subsp. paratuberculosis on water and milk samples.<br/>In conclusion, this study reports selective and sensitive amplification-based assays for the quantitative detection of foodborne pathogens (Listeria spp., Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis and) and for a quick and unambiguously identification of Salmonella spp. The assays had an excellent relative accuracy compared to microbiological reference methods and can be used for quantification of genomic DNA and also cell suspensions. Besides, in combination with sample pre-amplification treatments,<br/>they work with high efficiency for the quantitative analysis of the target bacteria. Thus, they could be a useful strategy for a quick and sensitive detection of foodborne pathogens in food products and which should be a useful addition to the range of diagnostic tools available for the study of these pathogens.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario.<br>La importancia que reviste el Distemper Canino -una de las principales enfermedades infecciosas que afectan tanto a los caninos domésticos y silvestres como también a varios otros mamíferos terrestres y marinos- junto a la dificultad de su diagnóstico -basado en los signos clínicos- ha motivado que a la fecha se hayan realizado diversos estudios en la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile para la detección óptima del agente etiológico: el Virus Distemper Canino. La técnica molecular utilizada es la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a transcripción reversa, utilizando como blanco de detección los diferentes genes que componen su genoma: N, P, F, M, H y L, con el fin de encontrar el método que permita el diagnóstico de la enfermedad ante-mortem de manera precoz. Así, en esta Memoria de Título, se utiliza el gen M que codifica la proteína de la Matriz viral y se implementó un protocolo de detección molecular que completa la información respecto a cuál sería el gen óptimo a utilizar en el diagnóstico de la enfermedad. Para ello se utilizaron 20 muestras de RNA total, obtenido desde sangre periférica de perros de distintas razas, edades y estado de vacunación contra Virus Distemper Canino, que presentaron signos clínicos y que ya eran positivos a la RT-PCR que detecta el gen N del virus. La técnica detectó el genoma viral en el 70% de aquellas analizadas, observándose una banda cercana a los 500 pb, cuyos productos amplificados presentaron intensidad y nitidez evidentes a la visualización. El porcentaje de identidad nucleotídica (PIN) respecto de las dos secuencias consenso obtenidas del total de muestras (mediante el programa online Clustal Omega), arrojó un 99% para ambas secuencias, comparadas con las secuencias de Virus Distemper Canino que entrega el programa informático de alineamiento de secuencias online de libre acceso BLAST. Los resultados permiten concluir que, si bien la elección del gen M como blanco de detección permite detectar VDC, no resulta de elección para la detección certera del virus, y por ende, para ser utilizada en el diagnóstico de la enfermedad causada por este<br>The importance of the Canine Distemper -one of the main infectious diseases affecting domestic and wild canines as well as several other mammals both terrestrial and marine- and the difficulty of its diagnosis -based on clinical signs- has motivated to the date several studies that have been carried out in the Faculty of Veterinary and Animal Sciences of the University of Chile to detect the etiological agent: the Canine Distemper Virus. The molecular technique used is the Polymerase Chain Reaction associated with reverse transcription and the different genes that make up its genome have been used as a detection target: N, P, F, M, H and L, in order to find an method that allows the early diagnosis of ante-mortem disease. Thus, in this Title Memory, the M gene that encodes the protein of the virus Matrix is used and a molecular detection protocol was implemented that completes the information regarding which would be the optimal gene to be used in the diagnosis of the disease. For this, 20 samples of total RNA were used, obtained from peripheral blood of dogs of different breeds, ages and vaccination status against Canine Distemper Virus, which showed clinical signs and which were already positive to the RT-PCR that detects the N gene of virus. The technique detected the viral genome in 70% of those analyzed, generating a band close to 500 bp, whose amplified products presented clear intensity and sharpness to the visualization. The percentage of nucleotide identity (PIN) with respect to the two consensus sequences obtained from the total samples (using the Clustal Omega online program) yielded 99% for both sequences compared to the Canine Distemper Virus sequences delivered by the alignment software of free access online sequences BLAST. The results allow us to conclude that although the choice of the M gene as a detection target allows to detect VDC, it is not of choice for the accurate detection of the virus, and therefore, to be used in the diagnosis of the disease caused by it

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario<br>El Virus Distemper Canino (VDC) es un agente infeccioso de amplia distribución, responsable de la enfermedad denominada Distemper Canino (DC) que afecta a una amplia diversidad de carnívoros terrestres (reportándose incluso en primates) y marinos. Afecta agresivamente a perros domésticos (con una tasa de mortalidad aproximada del 50%). Por tanto, el impacto clínico del VDC es importante. El VDC es codificado por 6 genes, N, P/V/C, M, F, H y L. Casi todos ellos se han usado para identificación de linajes y diagnóstico de la enfermedad. En este trabajo y utilizando Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a Retrotranscripción (RT-PCR) se analizaron 22 fragmentos de Ácido Ribonucleico (RNA) obtenidos de sangre periférica de 22 perros diagnosticados con VDC clínicamente y positivos a VDC mediante RT-PCR (gen N) con el objetivo de lograr implementar la detección del gen de la proteína grande (L) como alternativa diagnóstica. En este sentido, se diseñó un par de partidores que generaron un fragmento de ácido desoxirribonucleico (DNA) de alrededor de 450 pares de bases (pb), el cual mediante análisis bioinformático confirmó su identidad (PIN>94%). Así, esta implementación abre la discusión sobre el mejor método alternativo, en conocimiento de que la detección del gen P mediante RT-PCR anidado lo es actualmente. Un análisis de sensibilidad pondría dilucidar esta incógnita prontamente. Se concluye por tanto que esta técnica molecular ofrece un efectivo método diagnóstico para la presencia de VDC en perros domésticos.<br>The Canine Distemper Virus (CDV) is a widespread responsible for the Canine Distemper Disease that affects a broad diversity of carnivore mammals (and some cases in primates have been reported) globally. Domestic dogs are extensively and aggressively (with a ~50% mortality rate) infected by the CDV. Therefore, the clinical impact of the CDV is remarkable. The CDV is encoded by six genes, N, P/V/C, M, F, H and L. Almost all of which have been previously studied for lineage identification and disease diagnosis. In this study we used Reverse Polymerase Chain Reaction tests (RT-PCR) to analyseobtain 22 fragments of Ribonucleic acid (RNA) from peripheral blood of 22 subject dogs clinically diagnosed with CDV and positive to CDV by RT-PCR (N gene). The aim of this study was to implement a protocol of detection of the Large Protein Gene (L) to be employed as an alternative diagnostic. To achieve this, a pair of primers that generated a fragment of deoxyribonucleic acid (DNA) of ~450 base pairs (bp) was designed, which, using a bioinformatic analysis, confirmed its identity (PIN > 94%). Therefore, the implementation of this protocol opens the discussion about the best alternative method, within the context that the detection of the P gene through Nested RT-PCR is currently the best available protocol. A sensitivity analysis may potentially elucidate this question. Consequently, the main conclusion is that the molecular technique implemented in this study offers an effective diagnostic method to optimize the detection of VDC in domestic dogs.<br>Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010.