Dissertations / Theses on the topic 'Developmental biology/Embryology'

Model organism studies have been fundamental in understanding evolutionary and developmental biology. However, non-model organisms present opportunities to study unique characteristics and as comparisons to model organisms, leading us toward broader and more relevant perspectives on diversity. The Euphilomedes genus of ostracods is an example of a non-model group with potential for evolutionary and developmental studies. Ostracoda is an ancient, basally branching lineage of Crustaceans with a complete and prodigious fossil record. Despite the group’s promise for evolutionary studies, much remains unknown about the basic biology of this clade. There are a limited number of embryogenesis studies in Ostracoda; here, I study development in Euphilomedes. In Chapter 1, I study the main events in Euphilomedes’ embryology, focusing on cleavage and cell migration. I describe the general embryology of Euphilomedes, and devise a visual staging scheme for their development. Using fluorescent nuclear staining and microscopy, I visualize nuclei in cleavage throughout development of nuclear divisions and migrations during development. The meroblastic cleavage observed in Euphilomedes resembles that of another Myodocopid ostracod, Vargula hilgendorfii. Finally, immunostaining for acetylated-alpha tubulin and phalloidin staining are used to visualize the general anatomy of the embryonic brain. This provides new protocols for visualizing the nervous system, enabling more detailed nervous system studies in the future. In Chapter 2, I explore differential gene expression patterns in the developing eyes of juvenile Euphilomedes. Euphilomedes have sexually dimorphic eye types – males have lateral compound eyes, while females instead have eye rudiments. Previous studies in E. carcharodonta show that genes in the retinal determination and phototransduction gene networks have differential expression in males and females during eye development. In this thesis, we attempt to compare these patterns to expression in a sister species, E. morini.

O ácido retinóico (AR) é essencial para a embriogênese. A principal enzima sintetizadora de AR durante o desenvolvimento é a ALDH1A2 (RALDH2), uma retinaldeído desidrogenase que converte retinaldeído a AR. Para entendermos como o gene da aldh1a2 é regulado identificamos regiões evolutivamente conservadas (ECRs) em vertebrados e testamos seu potencial regulatório. Identificamos uma ECR localizada no intron1 da aldh1a2, conservada em anfíbios, aves e mamíferos que atua como um enhancer em estruturas derivadas de ectoderme, endoderme e mesoderme. Animais transgênicos transientes e permanentes mostram a ativação desse enhancer na região da placa do teto do tubo neural e epicárdio, local onde esse enhancer é ativado em células derivadas do órgão pro-epicárdico após o contato e/ou proximidade com células do miocárdio. A identificação de um enhancer conservado no gene da aldh1a2 suporta a idéia de que esse gene possui uma regulação modular e mostra que a abordagem evolutiva é uma eficiente ferramenta para a identificação de mecanismos de controle desse gene.
Retinoic acid (RA) is essential for embryogenesis. The key RA synthetic enzyme during early development is ALDH1A2 (RALDH2), a retinaldehyde dehydrogenase that converts retinaldehyde into RA. To understand how aldh1a2 is regulated we screened the gene for evolutionary conserved regions (ECRs) among vertebrates and assayed their regulatory potential. We describe an aldh1a2 intron 1 ECR (identified as RALDH2.2) that is conserved in amphibians, avians and humans and acts as an enhancer in derivatives of ectoderm, endoderm and mesoderm. Transient and stable transgenesis in mice reveal strong activity of the raldh2 intron 1 enhancer at the roof plate of the neural tube and at the growing epicardium. Transgenic mice indicate that the enhancer is activated in proepicardium-derived cells by contact and/or close proximity to the myocardium. The identification of an aldh1a2 conserved enhancer supports the idea of a modular regulation and shows that the evolutionary approach is an efficient tool to identify control mechanisms of the aldh1a2 gene.

Development in the annual killifish Austrofundulus limnaeus can follow two distinct developmental trajectories. Typical development includes the entrance of embryos into a state of metabolic and developmental arrest termed diapause. Alternately, embryos can escape diapause and develop directly without pause. These two trajectories are characterized by differences in the rate and timing of developmental, morphological, and physiological traits. Insulin and Insulin-like growth factor (IGF) signaling (IIS) is known to regulate entrance into diapause in a variety of invertebrates. In this thesis I explore the possible role of IGFs in the regulation of development and diapause in embryos of A. limnaeus. Here I report stage-specific expression of IGF-I and II proteins and their associated mRNA transcripts. Patterns of IGF-I protein expression are consistent with IGF signaling playing a major role in supporting the escape trajectory. In addition, treatment of embryos with a potent inhibitor of the IGF-I receptor (IGF1R) mimics the diapause developmental pattern even under conditions that should favor direct development. Evaluation of mRNA gene expression patterns in the two developmental trajectories suggests a role for IGF-I signaling through the RAS-MAPK-ERK pathway, which may be promoting the escape phenotype. Additionally, IGF-I activity may be enhanced in escape trajectory embryos though upregulation of IGF binding protein 2 (IGFBP-2) mRNA. These data suggest a major role for IGF signaling in the promotion of the escape trajectory, and thus we predict that specific mechanisms are in place in diapause-bound embryos that block IGF signaling and thus promote entrance into diapause. The data presented here suggest that blocking IGF signaling is critical for induction of diapause, but also suggests that other signaling pathways are likely also at play. Other pathways such at the TGF-beta signaling molecules and SMAD pathway, may also be involved in the direct regulation of the diapause phenotype, as has been shown for other animal models of developmental arrest.

Une étape initiale fondamentale dans le développement des vertébrés est l'organisation des cellules de l'embryon en trois feuillets embryonnaires primordiaux: ectoderme, mésoderme et endoderme. Chez l'embryon de xénope, le développement de l'endoderme et l’induction du mésoderme est initié par le gène maternel VegT codant pour un facteur de transcription à boîte T dont l'ARNm est localisé au pôle végétatif de l'ovocyte. Actuellement, les facteurs et mécanismes impliqués dans la formation de l'ectoderme, qui reste pluripotent jusqu'à la gastrulation, sont mal connus.

Des travaux récents du laboratoire ont montré que le gène XSeb4R, codant pour une protéine de liaison à l'ARN à motif RRM, présente maternellement de manière ubiquitaire dans la blastula, interagit directement avec la région 3'UTR de l'ARNm VegT, stabilisant et stimulant sa traduction. La déplétion de XSEB4R inhibe la formation de l'endoderme et du mésoderme et sa surproduction produit l’effet inverse. Ces observations ont montré que XSeb4R joue un rôle essentiel via VegT dans la formation de l'endoderme et du mésoderme.

Dans cette étude, nous avons testé l’hypothèse selon laquelle XSeb4R jouerait également un rôle au pôle animal dans la spécification de l’ectoderme. Nos résultats montrent que la protéine XSEB4R lie les régions 3’UTR des transcrits Sox3, Zic2a et Zic2b. Nous avons observé que la surexpression de XSeb4R stabilise les transcrits maternels Sox3 et Zic2 a et b, et qu’elle active la traduction des transcrits Zic2b mais pas celle de Sox3 ou Zic2a. Enfin, nous avons montré que la perte de fonction de XSeb4R induit une expansion du mésoderme vers l’ectoderme dans l’embryon au stade blastula. Ces résultats démontrent que XSeb4R joue un rôle important dans la spécification de l’ectoderme chez l’embryon de xénope.

Doctorat en Sciences
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Le développement d'un embryon est une interaction de phénomènes, impliquant des réarrangements morphogénétiques, mouvement collective et différenciation cellulaire. Comment une forme complexe, composée de nombreux tissus différents, résulte d'un pool symétrique de cellules identiques n'est pas encore totalement dévoilé. Dans cette thèse, nous nous intéressons à comprendre l'un des premiers événements qui brise la symétrie de l'embryon et établit une direction dans laquelle les différents tissus du futur corps seront répartis : l'établissement de la polarité antéro-postérieure (A-P), qui marquera le locus où la gastrulation va commencer. La manière dont cet axe est établi a été partiellement élucidée. Nous savons que le processus est contrôlé par des signaux chimiques, morphogènes, sécrétés par certains sous-groupes de cellules du tissu extra-embryonnaire. Les conditions minimales d'observation de la polarité ne sont cependant pas encore claires. Avec ce travail, nous avons l'intention de construire un système synthétique in vitro pour découvrir les ingrédients minimaux pour observer la brisure de symétrie dans une structure symétrique, qui imite l'épiblaste en morphologie et en expression génétique. Nous observons comment ce système réagit sous stimulation homogène avec des morphogènes. Nous comparons les résultats obtenus, à une situation où la symétrie du stimulus est brisée. Pour stimuler les cellules avec un stimulus directionnel, nous faisons recours à la microfluidique : nous avons développé un dispositif qui nous permet de stimuler notre épiblaste synthétique avec un gradient de morphogènes. Notre dispositif d'origine reposait sur un débit continu pour établir un puits et une source parfaits pour maintenir le gradient. Nous avons observé une perte d’expression du gene Nodal que nous n'avons pas observée en stimulant les organoïdes uniformément. Nous émettons l'hypothèse que le débit continu est responsable de l'élimination d'une partie de la signalisation sécrétée par les cellules. En modifiant le dispositif pour induire une stimulation uniforme, mais en produisant un gradient de molécules sécrétées, nous avons pu observer la polarité des organoïdes d'une manière plus cohérente qu'en les stimulant uniformément. Nous concluons que ces expériences suggèrent l'existence d'un mécanisme d'autorégulation dans l'embryon pour établir la polarité, et que ce mécanisme coopère avec d'autres pour assurer la robustesse de la polarisation, et qu'une source localisée de molécules de signalisation pourrait être pertinente pour augmenter la fréquence de l'observation de la polarité des organoides des cellules souches embryonnaires. Nous prévoyons que d'autres études utilisant des gradients statiques permettront de pousser ce résultat plus loin. Enfin, nous proposons un système qui permettrait d'étudier un aspect sous-investi du développement : le rôle du confinement physique. Comme on le voit, l'embryon précoce est confiné par le tissu extra-embryonnaire, lui appliquant une contrainte. Nous suggérons qu'il serait intéressant d'étudier l'aspect confinement, en le dissociant de l'aspect signalisation. Pour ce faire, nous proposons d'adapter une méthode d'encapsulation développée à l'origine pour cultiver des organoïdes de cellules cancéreuses, pour encapsuler des cellules souches embryonnaires
The development of an embryo is an interplay of phenomena, involving morphogenetic rearrangements, collective migration and cell differentiation. How a complex shape, made of many different tissues, arises from a symmetric pool of identical cells is still not fully unveiled. In this thesis, we are interested in understanding one of the first events that breaks the symmetry of the embryo and establishes a direction along which, the different tissues of the future body will be allocated: the establishment of the Antero-Posterior polarity (A-P), that will mark the locus at will gastrulation will start. How this axis is established has been partly elucidated. We know that the process is controlled by some chemical signalling, morphogens, released by some subgroups of cells in the extra-embryonic tissue. The minimal conditions for observing polarity however are still not clear. With this work we intend to build a synthetic in vitro system to find out the minimal ingredients to observe symmetry breaking in a symmetrical structure, that mimics the Epiblast in morphology and gene expression. We observe how this system reacts under homogeneous stimulation with morphogens. We compare the results obtained, to a situation where the symmetry of the stimulus is broken. To feed the cells with a directional stimulus, we make use of microfluidics: we developed a device that allows us to stimulate our synthetic Epiblast with a gradient of morphogens. Our original device was relying on continuous flow to establish a perfect sink and source to maintain the gradient. We observed a loss of Nodal expression that we did not observe when stimulating the organoids in bulk. We hypothesise the continuous flow to be accountable for washing out some secreted signalling downstream of the signal we induce differentiation with. By modifying the device to induce a uniform stimulation, but producing a gradient of secreted molecules, we were able to observe polarity arising in the organoids in a more consistent way than in bulk. We conclude that these experiments hint to the existence of a self-regulated mechanism in the embryo to establish polarity, and that this mechanism co-operate with others to ensure the robustness of the polarisation, and that a localised source of signalling molecules could be relevant to increase the frequency of observation of polarity in Embryonic Stem Cells only organoids. We anticipate that further studies making use of static gradients devices would allow to push this result further. Last, we propose a system that would allow the study of an underinvestigated aspect of development: the role pf physical confinement. As seen, the early embryo is confined by the Extra-embryonic tissue, applying a constraint to it. We suggest that it would be interesting to study the confinement aspect, uncoupling it from the signalling aspect. To do so, we propose to adapt an encapsulation method originally developed to grow cancer cells organoids, to encapsulate Embryonic Stem Cells

O Proepicárdio (PE) é uma estrutura transitória que dá origem aos componentes dos vasos coronários. Para avaliar seu potencial vascular em sítio adulto, transplantamos um coração neonatal para o pavilhão auricular de um animal adulto. Duas semanas depois, 2 PEs de embriões GFP+ foram transferidos para a superfície deste coração. Em outro grupo, transferimos os PEs diretamente para o pavilhão auricular. Para avaliar a incorporação de células GFP, e investigar sua diferenciação realizamos ensaios de imunofluorescência (IF) para GFP em combinação com outros marcadores. A adição do PE em sítio adulto teve como resultado a participação deste em processos de vasculogênese, iniciando a formação de novos vasos sanguíneos via formação de ilhotas sanguíneas e em um processo angiogênico, diferenciando-se em células endoteliais que se incorporaram aos vasos já existentes. Baseados nisso podemos afirmar que o PE possui potencial vasculogênico/angiogênico em sítio adulto, podendo ser exploradas como modelo para revascularização cardíaca e recuperação de tecidos vasculares.
The Proepicárdio (PE) is a transient structure giving rise to all components of the coronary vessels. To evaluate the vasculogenic potential of the PE in an adult site, a neonatal heart was transplanted into the subcutaneous of an adult ear Later, two PE from GFP-transgenic mice were transferred to the surface of this heart. In another group, we transferred the PEs directly into the ear pinna. To evaluate the incorporation of GFP cells derived from the PE, and to investigate their possible differentiation, we performed immunofluorescence (IF) for GFP in combination with other markers. The addition of PE in an adult site resulted in its participation in a vasculogenic and in an angiogenic processes. Based on this we conclude that PE cells can differentiate and likely participate in a neovascularization process when transplanted to adult sites. These findings demonstrate that the vasculogenic potential of the PE cells is conserved in an adult site and our model is adequate to study the mechanisms involved in the development and regeneration of vasculature.

TGFβ signalling via Smad transcription factors is essential for axis patterning and subsequent cell fate specification during mammalian embryogenesis. However, the cellular and molecular mechanisms have been difficult to characterise in vivo due to early embryonic lethality of mouse mutants and redundant functional activities. Here I show that combined deletion of closely related Smad2 and Smad3 in mouse embryonic stem cells impairs induction of lineage specific gene expression during differentiation, while extra-embryonic gene expression is up-regulated. Preliminary data suggest that the underlying mechanism of this differentiation defect reflects the inability of Smad2/3^-/- cells to establish lineage priming. Collectively, these findings identify novel downstream target genes controlled by Smad2/3 and an absolute requirement for Smad2/3 during embryonic differentiation. TGFβ signalling via Smad1 and Smad4 is essential for induction of the transcription factor Blimp1 required for primordial germ cell specification. The direct upstream regulators of Blimp1 are unknown, but T-box factors have recently been suggested to play a role. In a second project, I performed tissue- specific ablation of the T-box transcription factor Eomes as well as components of the TGFβ signalling pathway in either the visceral endoderm or the epiblast to examine tissue-specific functions for Blimp1 induction. I show that Eomes and Smad2 functions in the visceral endoderm as well as Eomes function in the epiblast are dispensable for Blimp1 induction, but rather are required to restrict Blimp1 induction to posterior epiblast cells. In contrast, epiblast-specific Smad4 or Smad1 mutants fail to robustly induce Blimp1 in the epiblast. My preliminary analysis suggests that competence to induce primordial germ cell fate is dependent on the interplay of Smad2/Eomes functions in the visceral endoderm and Smad1/4 functions in the epiblast. Collectively, this thesis provides insight into the transition from pluripotency to cell fate specification in the mammalian embryo that is impossible to obtain from human embryos in vivo.

Au cours de ce travail de thèse, nous avons abordé l’étude des gènes BTBD6 et Dmrt5 au cours du développement embryonnaire en utilisant les avantages complémentaires de plusieurs organismes modèles.

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L'une des caractéristiques les plus frappantes des animaux multicellulaires, aussi appelés les métazoaires, est leur étonnante diversité morphologique. Des études de type phylogénétique ont permis de mettre en relation cette abondance et cette variété observées au sein des formes de vie animale avec des différences au niveau de processus moléculaires, cellulaires, tissulaires et organiques. Parmi ces différences, celle affectant les programmes de développement apparaît comme un aspect clé de la diversité des métazoaires. Les programmes de développement reposent entre autres sur la mise en œuvre de communications entre cellules, ou entre milieu environnant et cellules, et ces communications sont assurées au niveau moléculaire par le déploiement de cascades d'activités protéiques nommées les voies de signalisation. Une des voies de signalisation essentielles au cours du développement de nombreux métazoaires est la voie de l'acide rétinoïque (AR). Le fonctionnement et les rôles de cette voie pendant le développement animal ont fait l'objet de nombreuses recherches, ces travaux ayant aboutis à des découvertes majeures. Néanmoins des analyses supplémentaires restent requises afin de mieux comprendre l'histoire évolutive de cette voie, du métabolisme de l'AR à la transmission de son signal, en passant par l'identification de ses gènes cibles, ses interactions avec d'autres voies de signalisation, et ses fonctions au cours du développement, le tout au sein du règne animal. Dans ce contexte, étudier cette voie chez un métazoaire tel que le céphalochordate amphioxus, qui possède une voie de signalisation de l'AR équivalente à celle des vertébrés, mais avec une redondance moléculaire moindre, représente une étape importante pour identifier l’architecture et les fonctions ancestrales de cette voie parmi les chordés.Chez l’amphioxus, la voie de signalisation de l'AR est étudiée depuis plus de 20 ans, mais peu de choses sont encore connues sur la régulation de la biodisponibilité de l'AR pendant le développement et sur la nature de ses gènes cibles et du réseau régulateur qu’ils définissent. Le but de mon travail de thèse a par conséquent été d’étudier ces deux aspects fondamentaux de la voie de signalisation de l'AR chez l'amphioxus. Au cours de mon projet de recherche, j’ai utilisé comme modèle d’étude l'amphioxus européen, Branchiostoma lanceolatum, pour lequel j’ai également mis en œuvre de nombreuses améliorations du système de culture ainsi que développer des techniques d’analyses in vivo, comme la microinjection d'ARNm dans des œufs
One of the most striking features of multicellular animals, the metazoans, is their amazing morphological diversity. Even though phylogenetic research has made remarkable progress towards revealing how the abundance and variety of animal life forms relates on the molecular, cellular, tissue, and organismal level, the alteration of developmental programs has been revealed as a key aspect in this process. During development, a rather limited number of signaling pathways has been shown to be instrumental for generating metazoan diversity. The retinoic acid (RA) signaling pathway is one of these instrumental signaling cascades. A significant amount of time and work has been used to characterize the functions and roles of RA signaling during development, although further work is required to better understand the evolutionary history of the RA signaling network, from metabolism to signal transduction passing by the interactions with other signaling cascades and its developmental functions and how they evolve with time. In this context, model organisms with representative, vertebrate-like RA signaling cascades, such as the cephalochordate amphioxus, will be an important case-study in order to identify the blueprint of an ancestral RA network.The amphioxus RA signaling pathway was initially studied about 20 years ago, even though not much is known about the bioavailability of RA during development. Moreover, the target genes of the RA signaling pathway and their hierarchical relationship during amphioxus development represent an interesting open question. Therefore, this work aimed at providing a detailed description of two fundamental aspects of the RA signaling pathway during amphioxus development: (1) the regulation of the bioavailability of RA in the developing embryo and (2) the target genes under the control of the RA signaling pathway together with their hierarchical regulatory relationship. To address these questions, the European amphioxus, Branchiostoma lanceolatum, was used as a model system.During my research project, not only these questions were fundamental, but also the implementation of amphioxus as a reliable model system and thus the establishment of multiple aquaculture improvements as well as in vivo techniques, such as the microinjection of mRNAs into amphioxus eggs. Furthermore, to characterize the bioavailability of RA during development of amphioxus, I focused on the study of the enzymes that mediate the catabolism of RA endogenously, the CYP26 subfamily proteins. I thus described the evolutionary diversification of CYP26 genes in deuterostomes as well as their expression, their function and the mechanisms that govern the feedback loop controlled directly by RA during amphioxus development.Additionally, to shed light on the target genes under the control of the RA signaling pathway during amphioxus development, I combined pharmacological treatments using retinoid-specific drugs with two different techniques of high throughput sequencing: RNAseq, that revealed the entire RNA profile and thus the genes being expressed at a given moment in time, and ATACseq (assay for transposase-accessible chromatin) that provided a global overview of accessible regions of the chromatin (i.e. open chromatin regions). By combining the data obtained by these techniques, I revealed a new set of genes that are under the control of the RA signaling pathway as well as new potential regulatory loops driving RAR-mediated expression. Moreover, I established a framework to characterize gene hierarchies during development that can be widely applied to other signaling pathways and organisms

Le laboratoire d’Embryologie Moléculaire étudie les mécanismes moléculaires contrôlant le développement embryonnaire et utilise comme système expérimental l’embryon de xénope. En collaboration le laboratoire du Dr Daniel Christophe, nous avons abordé l’étude du gène XHRT1 chez le xénope. Ce gène est l’orthologue du gène HRT-1/Hey1/Hesr-1/HERP2/CHF2 de souris. Celui-ci, avec deux autres protéines apparentées (HRT2 et HRT3) forme une sous-famille de facteurs de transcription de type bHLH-O qui se différencient des autres facteurs bHLH-O par l’absence d’un motif carboxy-terminal de séquence « WRPW » et par la présence d’un nouveau motif carboxy-terminal conservé de séquence « TEI/VGAF ». Le rôle de ces facteurs HRT dans le développement est encore actuellement mal connu.

Dans un premier temps, nous avons déterminé le profil d’expression de XHRT1 au cours de l’embryogenèse. Nous avons observé que ce gène est fortement exprimé au stade neurula dans le plancher du tube neural, et que plus tardivement celui-ci est exprimé dans différentes régions du système nerveux, dans les somites et le dans le pronéphros. Comme attendu pour un membre de la famille des facteurs bHLH-O, nous avons également observé que l’expression précoce de HRT1 au niveau du plancher du tube neural est bien régulée par la voie de signalisation Notch.

Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au rôle et au mode d’action du facteur XHRT1 dans le développement du plancher du tube neural. Nous avons pu montrer que XHRT1 agit comme répresseur transcriptionnel et que cette répression nécessite la présence du domaine bHLH et de séquences en aval de celui-ci. Nous avons montré en embryon que la surexpression précoce de XHRT1 induit un blocage de l’expression des marqueurs du mésoderme et une augmentation de marqueur du plancher du tube neural, ce qui est en accord avec le modèle selon lequel la voie de signalisation Notch interviendrait dans le choix de la destinée des cellules de la région médiane en inhibant la différenciation des cellules en notocorde et en favorisant leur différenciation en cellules du plancher du tube neural. XHRT1 n’étant cependant activé qu’à partir du stade neurula, nous avons conclu que les effets observés n’étaient probablement pas dus à XHRT1 mais à un autre facteur bHLH-O apparenté exprimé plus précocement dans les cellules de la ligne mediane de l’embryon. Afin d’éviter ces effets non spécifiques précoces, nous avons utilisé un vecteur d’expression de XHRT1 permettant un contrôle temporel de l’activité de la protéine. Nous avons ainsi montré que l’activation de XHRT1 au stade neurula dans l’ectoderme inhibe la différenciation des cellules précurseurs neurales en neurones et qu’il pourrait ainsi jouer un rôle important dans le développement du plancher du tube neural. Nos résultats ont montré également que XHRT1 est capable d’homo- et hétérodimériser in vivo avec les facteurs Xhairy1 et Xhairy2b coexprimés avec XHRT1 dans le plancher du tube neural. Enfin, nous avons montré que les propriétés de dimérisation de XHRT1 sont dépendantes non seulement du domaine bHLH, mais aussi du domaine Orange et des séquences situées en aval, séquences jouant un rôle important dans le choix du partenaire.

Des travaux récents ayant montré que la voie de signalisation Notch joue un rôle important dans le développement du rein, nous avons voulu déterminer l’importance de XHRT1 dans le développement du pronéphros. Nos résultats ont montré que XHRT1 ainsi que d’autres facteurs bHLH-O sont exprimés de manière dynamique, d’abord dans le glomus puis dans la partie dorso-antérieure de l’ébauche du pronéphros à l’origine des tubules proximaux, et que leur expression est régulée positivement par Notch. La surexpression de XHRT1 à la fin de la neurulation inhibe la formation du canal et du tubule distal, tandis que l’inhibition de la traduction de la protéine entraîne une réduction de l’expression de marqueurs spécifiques des tubules proximaux et du glomus. Ces résultats démontrent que XHRT1 joue un rôle important comme médiateur de la voie de signalisation Notch dans le pronéphros.
Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire
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Le tégument est formé de deux tissus, un épithélium et un mésenchyme. Il comprend la peau et la cornée. Au niveau de la face, ces derniers ont une origine embryonnaire commune: ectoderme et cellules des crêtes neurales. J'ai tout d'abord contribué à la mise en évidence de l'acquisition par le derme embryonnaire de ses capacités inductrices sur l'épiderme, et de l'indépendance de la différenciation de l'épithélium cornéen vis-à-vis de son mésenchyme, le stroma. Mes travaux principaux ont été d'établir quelle était la signature moléculaire du programme cornéen, et à quel moment et comment ce programme est mis en place chez l'embryon. La comparaison des transcriptomes des cellules souches de la cornée à celui des cellules souches épidermiques chez la souris montre 3621 gènes communs et 1768 gènes cornéens propres, en plus de Pax6, le gène clé de l'oeil, et de K12, la kératine type de la différenciation terminale de l'épithélium cornéen. La cornée résultant, selon un dogme ancien, d'une induction par le cristallin, j'ai effectué des expériences chez l'embryon de poulet de 2 jours afin de le vérifier. L'ablation chirurgicale de la placode cristallinienne ayant mis en évidence sa régénération, j'ai prévenu sa formation en électroporant Gremlin, un inhibiteur de BMP4, requis lors la spécification du cristallin par la vésicule optique. L'obtention d'oeil sans cristallin mais avec un épithélium cornéen exprimant K12 montre que le programme cornéen s'effectue par défaut lorsque le programme cristallinien est interrompu. Cet arrêt se produit normalement à la périphérie de la placode cristallinienne qui s'invagine, lors de la migration des cellules des crêtes neurales, productrices de Gremlin. Les précurseurs de l'épithélium cornéen sont donc communs avec ceux du cristallin, qui sont connus pour se ségréger chez l'embryon lors de la formation du domaine préplacodal au stade neurula.

L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une sérine protéase, impliquée dans de nombreux processus physiopathologiques au sein du système nerveux central (e.g. corticogenèse, rôle anti-apoptotique sur les oligodendrocytes). Des travaux du laboratoire ont montré que la migration oligodendrocytaire était retardée chez des souris déficientes en tPA comparativement à des souris sauvages au cours du développement embryonnaire. Les cellules précurseurs d’oligodendrocytes (OPCs) doivent se différencier en oligodendrocytes myélinisants afin d’enrouler leurs prolongements et de former une gaine de myéline. Mes travaux de thèse ont consisté à étudier les effets du tPA sur ces paramètres au cours du développement dans la moelle épinière chez la souris. Nos travaux montrent dans un premier temps, que le tPA est exprimé de façon transitoire au sein d’oligodendrocytes myélinisants. L’expression de tPA au sein de ces cellules est transitoire, atteignant un pic à 15 jours post-natal, qui correspond à la phase active de la myélinisation. Dans un second temps, dans un modèle de souris déficientes en tPA, un retard de différenciation des OPCs vers un phénotype d’oligodendrocytes matures au cours du développement embryonnaire est observé. Nous mettons également en évidence, un phénotype dysmyélinique chez les souris déficientes en tPA (myéline non compacte et anomalies ultrastructurelles de la myéline). Bien que ce phénotype ne présente ni des différences dans la tractographie des fibres détectables à l’IRM et ni de troubles dans la conduction nerveuse, des atteintes de la démarche ont pu être mises en évidence. Le tPA semble donc être un facteur déterminant dans la compaction de la gaine de myéline. Les souris déficientes en tPA pourraient être un modèle relevant pour étudier les pathologies dysmyélinisantes
Tissue-type plasminogen activator (tPA) is a serine protease involves in many central nervous system physiopathological processes (e.g. corticogenesis, anti-apoptotic effect on oligodendrocytes). Our laboratory has shown that oligodendrocyte migration was delayed in tPA-deficient mice during embryonic development. In order to become myelinating cells, oligodendrocyte precursors cells (OPCs) had to differentiate, and wrap their processes around axons to form a myelin sheath. My thesis work consisted in studying the effects of tPA on these parameters throughout development in mice spinal cord. First, we showed a transient expression of tPA in myelinating cells, reaching a peak at P15, which corresponds to active myelination. Secondly, we observed a delay in OPCs differentiation towards a myelinating phenotype. Furthermore, tPA-deficient mice displays a dysmyelination phenotype with uncompacted myelin and ultrastructure anomalies. Neither differences in fiber tractography of spinal cord tracts detectable on MRI, nor central conduction disorders were revealed in this phenotype. However, tPA-deficient mice displayed gait abnormalities. Consequently, tPA seems to be a important factor to drive myelin compaction and tPA-deficient mice could be a relevant model to study dysmyelinating disorders

La crête neurale (CN) est une structure transitoire apparaissant en bordure de la plaque neurale chez les embryons de vertébrés. Au cours du développement embryonnaire, les cellules de la CN prolifèrent, subissent une transition épithélio-mésenchymateuse, migrent et se différencient en de nombreux types cellulaires tels que des neurones et cellules gliales du système nerveux périphérique, des mélanocytes, des cellules musculaires lisses ou des élements du squelette cranio-facial. Afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant la prolifération et la spécification des cellules de la CN, nous avons étudié le rôle de deux facteurs de transcription, Hairy2 et Stat3, via des expériences de perte et gain de fonction chez l’embryon de xénope.

Le gène Hairy2 code pour un facteur de transcription bHLH-O répresseur. Il est exprimé précocement au niveau de la bordure de la plaque neurale incluant la CN présomptive. Nous avons montré que Hairy2 est requis pour la prolifération des cellules de la CN en aval de signaux FGFs et qu’il maintient les cellules dans un état indifférencié en réprimant l’expression précoce des gènes spécifiques de la CN. Hairy2 réprime aussi la transcription du gène Id3 codant pour un facteur HLH essentiel à la prolifération des cellules de la CN. Id3 affecte également Hairy2. Nous avons observé que la protéine Id3 interagit physiquement avec Hairy2 et bloque son activité, démontrant que les interactions entre Hairy2 et Id3 jouent un rôle important dans la prolifération et la spécification des cellules de la CN.

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Le but des recherches du laboratoire de génétique du développement est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement neural des vertébrés. C’est la raison pour la quelle, j’ai identifié deux EST (BC071005 et BC077938) spécifiques de l’expression génique chez le Xenopus laevis. Sur base de la littérature, ces deux gènes présentent des profils d’expression intéressants, caractéristiques des gènes impliqués dans la neurogenèse.

Le premier clone d’ADNc code pour l’homologue du facteur de transcription Homez, contenant trois homéodomaines et deux motifs leucine zipper et dont la fonction est inconnue. Mes résultats ont montré que chez l’embryon de xénope au stade neurula, Homez est exprimé préférentiellement dans la plaque neurale, l’expression la plus forte étant détectée dans les domaines où les neurones primaires apparaissent. Plus tard, Homez est détecté dans le tube neural dans des cellules neurales postmitotiques en cours de différenciation. En accord avec ce profil d’expression, j’ai observé que Homez est régulé positivement par l’atténuation des signaux BMPs et par le facteur proneural Ngnr1 et négativement par la voie Notch. Bien que le facteur Homez ne soit pas suffisant pour induire une expression ectopique de marqueurs neuronaux dans l’embryon de xénope, j’ai pu montrer, en utilisant une approche de morpholino antisens, que celui-ci est requis en aval du facteur Ngnr1 pour la différenciation des précurseurs neuraux en neurones primaires.

Le deuxième clone code pour l’homologue du facteur CBFβ qui s’associe avec une famille de protéines CBFα1-3/Aml1-3/Runx1-3 pour former un complexe hétérodimérique liant l’ADN. Alors que chez la souris, les facteurs Runx1 et Runx3 jouent un rôle important dans la neurogenèse dans les ganglions spinaux et que chez le xénope, Runx1 est requis pour la formation des neurones Rohon-Beard, le rôle de CBFβ au cours du développement du système nerveux est actuellement mal connu. Mes résultats ont montré que chez l’embryon de xénope au stade neurula, CBFβ est coexprimé avec les facteurs Runx1-3 en bordure de la plaque neurale, mais de manière plus étendue et plus précoce. Comme attendu pour un marqueur de la bordure de la plaque neurale, j’ai observé que l’expression de CBFβ est régulée par les signaux BMP, Wnt, FGF et Notch. De manière intéressante, son expression est induite par les facteurs proneuraux alors que celle de Runx1 est inhibée. Des expériences de perte de fonction à l’aide de morpholinos antisens bloquant la traduction de CBFβ ont été réalisées. Ces expériences suggèrent que le facteur CBFβ est nécessaire à la mise en place de la CN et à la différenciation des neurones de Rohon-Beard.
Doctorat en Sciences
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Born and educated for the most part in the United States, I have enjoyed the luxury of excellent mentorship during my career thus far as an independent scientist in France. All these mentors have taken it on trust that my training for a Ph.D. also included the necessary tools for directing original research responsibly, at all levels. However, the habilitation is an obligate rite of passage for researchers in France, Germany, Sweden and a number of other European countries. It ensures both that I am competent to not only continue to conduct original research, and that I have a directive seam in my research interests over time that is sufficiently rich to support myself and those trainees who will learn from my experience and contribute their efforts by my side to advancing science. To demonstrate that the faith of these esteemed colleagues has been well-placed since my Ph.D., I hereby present, to the best of my ability, my acquired credentials and my near- to mid-term projects. The over-arching theme of my work has been to identify molecular hallmarks and improve the physiopathological understanding of congenital and progressive conditions implicating a highly plastic embryological cell population known as the neural crest. These neural crest cells (NCC) participate directly or indirectly in the formation of a stunning array of tissues organs during embryogenesis. When the genes regulating the differentiation, proliferation, or migratory and appropriately invasive behavior of NCC are muted, this can lead to associations of pediatric congenital malformations or tumorigenesis. I make use of avian and, more recently, murine models, as well as careful observations effected on tissues derived from normal human embryos, to tease apart those mechanisms.

Morphogens are secreted signalling molecules that are expressed in restricted groups of cells within the developing tissue. From there, they are secreted and travel throughout the target field and form concentration gradients. These concentration profiles endow receiving cells with positional information. A number of experiments in Drosophila demonstrated that the morphogen Decapentaplegic (Dpp) forms activity gradients by inducing the expression of several target genes above distinct concentration thresholds at different distances from the source. This way, Dpp contributes to developmental fates in the target field such as the Drosophila wing disc. Although the tissue distribution as well as the actual shape and size of the Dpp morphogen concentration gradient has been visualized, the cell biological mechanisms through which the morphogen forms and maintains a gradient are still a subject of debate. Two hypotheses as to the dominant mechanism of movement have been proposed that can account for Dpp spreading throughout the Drosophila wing imaginal target tissue: extracellular diffusion and planar transcytosis, i. e. endocytosis and resecretion of the ligand that is thereby transported through the cells. Here, I present data indicating that implications of a theoreticalanalysis of Dpp spreading, where Dpp transport through the target tissue is solely based on extracellular diffusion taking into account receptor binding and subsequent internalization, are inconsistent with experimental results. By performing Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) experiments, I demonstrate a key role of Dynamin-mediated endocytosis for Dpp gradient formation. In addition, I show that most of GFP-Dpp traffics through endocytic compartments at the receiving epithelial cells, probably recycled through apical recycling endosomes (ARE). Finally, a Dpp recycling assay based on subcellular photouncage of ligand is presented to address specifically the Dpp recycling event at the receiving cells.

Les voies de signalisation Wnt et FGF sont parmi les plus importantes dans les communications inter-cellulaires qui régissent le développement et l’homéostase des tissus embryonnaires ou adultes. Bien que l’on connaisse énormément de choses sur ces voies et les protéines qui les composent, plusieurs questions persistent quant à leur régulation. Notre travail fait usage du modèle amphibien Xenopus laevis dans l’étude du rôle de deux MAP4K kinases de la famille Misshapen: xTNIK et xMINK dans la balance entre les branches «canonique» et «non-canonique» de la signalisation Wnt, ainsi que dans l’étude d’une nouvelle protéine adaptatrice de l’endocytose: E-Syt2 et de son rôle dans la régulation de la signalisation FGF. La voie signalétique Wnt est principalement traduite par la famille des récepteurs serpentins Frizzled vers deux voies distinctes : la voie dite «canonique» régulant la β-catenine nucléaire, et la voie dite «non-canonique» qui active les petites GTPases Rac et RhoA ainsi que la MAP-kinase JNK et les PKCs. Nous montrons ici que TNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) et xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) sont des composantes essentielles de ces deux voies de réponse. xTNIK et xMINK interagissent ensemble in vivo et subissent un clivage protéolytique libérant des domaines Kinase et Citron-NIK-Homology (CNH) respectivement activateur et suppresseur du signal. Les deux kinases interviennent dans la voie «non-canonique» cependant, alors que xTNIK est également un médiateur de la voie «canonique», xMINK y joue un rôle antagoniste et ces effets dépendent de leurs activités catalytiques. Nous apportons enfin la preuve qu’une régulation spécifique du clivage protéolytique des deux pro-enzymes dans les différents tissus embryonnaires régule leur activité de façon différentielle et suggérons qu’il s’agit là d’un mode d’aiguillage de la réponse Wnt entre les voies «canonique» et «non-canonique» in vivo. Enfin, nous montrons que la protéine membranaire de type synaptotagmine E-Syt2 est essentielle dans la phase précoce de l’endocytose du récepteur aux FGF activé, elle-même nécessaire à l’activation de ERK et à l’induction du mésoderme. E-Syt2 interagit spécifiquement avec le récepteur aux FGF activé ainsi qu’avec l’Adaptin-2. Il est en outre requis en amont de Ras dans l’activation de ERK et nos données identifient donc E-Syt2 comme un adaptateur endocytique de la voie de la clathrine.
The Wnt and FGF pathways are among the most critical inter-cellular signalling pathways controlling embryo development and the homeostasis of adult tissues. Although much is known about the signal transduction routes and proteins constituting these pathways, many questions concerning their regulation remain to be answered. The present work uses the Xenopus laevis model system to study the role of two kinases of the Misshapen family of MAP4K signalling kinases, xTNIK and xMINK, in the balance between canonical and non-canonical branches of Wnt signalling, and the role of a new endocytic adapter protein, E-Syt2, in regulation of FGF signalling by endocytosis. Wnt signals are predominantly transduced via the Frizzled family of serpentine receptors to two distinct pathways, the canonical pathway regulating nuclear -catenin and a non-canonical pathway that activates the small GTPases Rac and RhoA, the JNK MAP-kinase and PKC. My work shows that xTNIK (Traf2 and Nck-interacting kinase) and xMINK (Misshapen/NIKs-related kinase) are essential and indeed integral components of both the canonical and non-canonical Wnt pathways. xTNIK and xMINK interact with each other and are proteolytically cleaved in vivo to generate Kinase domain fragments that are active in signal transduction, and Citron-NIK-Homology domain (CNH) fragments that are suppressive. The Kinase domain fragments of xTNIK mediate both canonical and non-canonical signalling, whereas those derived from xMINK mediate non-canonical signalling but strongly antagonize canonical signalling. This work suggests that tissue specific regulation of the proteolytic cleavage of xTNIK and xMINK controls the balance between canonical and non-canonical Wnt signalling. The synaptotagmin-related membrane protein E-Syt2 was found to be essential for an early phase of activated FGF receptor endocytosis that is necessary for functional ERK activation and mesoderm induction. E-Syt2 interacts selectively with the activated FGF receptor and with Adaptin-2, and is required upstream of Ras for ERK activation. Together these data identified E-Syt2 as an endocytic adapter for the Clathrin-dependent pathway.

Une caractéristique fondamentale des vertébrés est leur organisation métamerique, visible au niveau de la colonne vertébrale. Cette organisation se met en place au cours du développement embryonnaire et l'émergence des précurseurs des vertèbres, les somites, formés à partir du mésoderm paraxial présomitique (PSM). Depuis la découverte d'une activité transcriptionelle oscillatoire de la voie de signalisation Notch dans le PSM, on propose que cette activité oscillatoire représente l'action d'une horloge embryonnaire, l'horloge de segmentation, responsable de contrôler la formation des somites de façon périodique. Dans cette étude, je présente la découverte d'une nouvelle association de la voie Wnt avec l'horloge de segmentation en décrivant l'activité oscillatoire de Axin2, une cible de la voie Wnt, dans le PSM. Ensuite, j'ai mise en place un system d'imagerie biphoton qui nous permet d'observer l'action de l'horloge de segmentation en temps réel et in vivo dans les embryons de souris. Ce système permet de mesurer directement les paramètres des oscillations. Ultérieurement je décris la découverte d'un gradient d'expression de la protéine -caténine dans le PSM. A l'aide d'expériences de recombinaisons homologues conditionnelles nous avons déterminé que ce gradient de - caténine contrôle la maturation et différentiation des cellules dans le PSM. De plus, ce gradient constitue un signal essentiel et permissif pour les oscillations de l'horloge de segmentation. En conclusion, je propose un nouveau modèle de mise en place des somites incorporant les résultats présentés.

A 3,5 jours de développement (E3.5), l'embryon de souris est composé d'une couche externe de trophectoderme (TE) entourant la cavité blastocélique et la masse cellulaire interne (MCI). La MCI comprend une population hétérogène de précurseurs d'épiblaste (Epi) et d'endoderme primitif (EPr) dans une configuration "poivre et sel". A E4.5, ces cellules ségrégent, les cellules d'EPr migrant vers la surface de la MCI pour former un épithélium. A E4.75 cet épithélium donne naissance à 2 tissus distincts : un épithélium d'endoderme viscéral (EP) et à l'endoderme pariétal (EP) qui migre le long du TE. Une transition épithélium-mésenchyme est impliquée dans la formation de l'EP. Je m'intéresse au rôle de Dkk1, un inhibiteur de la voie Wnt canonique et activateur de la voie Wnt/PCP, et Noggin, un inhibiteur des BMP, dans la différenciation de l'endoderme extraembryonnaire. J'ai montré que Dkk1 est un marqueur de l'EPr qui devient apicalement polarisé à E4.5. Son expression est ensuite restreinte aux cellules de l'EP. J'ai aussi montré que Noggin est exprimé dès la préimplantation puis dans l'EP et au niveau de la charnière EV-Ep. Par des expériences de perte et de gain de fonction des voies Wnt et BMP et en utilisant les souris mutantes j'ai analysé le rôle de ces deux facteurs dans la différenciation de l'endoderme extraembryonnaire
At 3.5 days of development (E3.5), the mouse embryo consists of an outer layer of trophectoderm (TE) surrounding the blastocelic cavity and the inner cell mass (ICM). The ICM is composed of intermingled populations of epiblast (Epi) and primitive endoderm (PrE) precursors, that sort to form two distinct tissues. At E4.75 this epithelium differentiates into visceral endoderm (VE) and parietal endoderm (PE) that migrates along TE. An epithelium-mesenchyme transition (EMT) is involved in PE formation while the VE is maintained as an epithelium. My work focuses on the role of Dkk1, a Wnt canonical pathway inhibitor and Wnt/PCP pathway activator, and Noggin, a BMP pathway inhibitor, in extraembryonic endoderm differentiation. I have shown that Dkk1 is a marker of PrE precursors and is apically polarised at E4.5. Afterwards, its expression is restricted to PE. Noggin is expressed during preimplantation and then in PE and EV-EP hinge. By gain and loss of fonction experiments of Wnt and BMP pathways and by using mutant mice, I studied the role of these two factors in extraembryonic endoderm differentiation

Multi-tissue pattern formation during development is a complex process in which extracellular communication events specify distinct cell types and regulate exquisite embryonic morphogenesis. The sea urchin embryo provides an excellent model for studying pattern formation due to relative genetic and morphological simplicity. The larval skeleton is secreted via biomineralization by the skeletogenic primary mesenchyme cells (PMCs). The PMCs undergo an epithelial-mesenchymal transition and migrate as individual cells within the blastocoel into stereotypic positions; this regulated PMC migration and positioning is required for normal skeletal patterning. Elegant PMC transplant experiments have demonstrated that PMC positioning, and thus skeletal patterning, is directed by ectodermal cues, and not by cues internal to the PMCs. In recent years, new efforts have been made to identify the ectodermal gene products that regulate skeletal development. The transcription factors Otp, Pax2/5/8 and Strim1, signaling by FGF, VEGF, and Wnt5a ligands have all been implicated in skeletal development in the sea urchin embryo; however, loss-of-function analysis for most of these gene products results in inhibition of skeletogenesis, suggesting that they regulate biomineralization and not PMC positioning and patterning. Notably, no skeletal patterning genes have previously been identified that pattern specific parts of the larval skeleton. This dissertation takes candidate-based and systems-level approaches to identify novel skeletal patterning genes that pattern distinct parts of the larval skeleton. We find that activation of the Alk4/5/7 receptor is required during gastrulation for anterior PMC positioning and skeletal patterning. We next test the function of the TGF-ß ligand Univin and find that it is necessary and sufficient for secondary skeletal patterning, indicating that Univin is a likely signaling ligand in anterior skeletal patterning. We also report a ventral accumulation of sulfated proteoglycans that requires function of the sulfate transporter, SLC26a2/7. This SLC-dependent sulfated proteoglycan accumulation is necessary and sufficient to attract PMCs to the ventral territory, and thereby pattern the ventral transverse skeletal elements. Finally, BMP5-8 function is required for left-side skeletal and serotonergic neuron development. Together, these studies reveal novel ectodermal genes that specifically regulate skeletal patterning across the anterior-posterior, dorsal-ventral, and left-right axes in Lytechinus variegatus embryos.
2017-01-01T00:00:00Z

During development of the vertebrate embryo, a highly conserved tissue called the organizer forms during gastrulation, and is required for establishment of the basic body plan. In mouse, the organizer gives rise to the node and notochord, which are both transient signaling centres involved in patterning the body axes. The genetic regulation and morphogenesis of these tissues, particularly in the mouse, is not well understood. To follow the formation of these tissues we used time-lapse live imaging together with conventional cell lineage tracking. This showed that the notochord has distinct morphogenetic origins along the anterior-posterior axis: anterior head process forms by condensation of dispersed midline organizer cells; trunk forms by convergent extension of node cells; tail forms from posteriorly migrating node cells—this challenges the previously accepted model that tail notochord forms by node regression. We have also found there are distinct genetic requirements within these different regions. Previous mouse mutant analysis showed that conserved transcription factors Foxa2 and Noto are required for either all notochord regions or just tail notochord, respectively. We found a novel genetic interaction between the two demonstrated Foxa2 compensates for Noto specifically in the trunk notochord. Furthermore, we found Noto has a conserved role in regulating axial (notochord) versus paraxial (somite) cell fate. Therefore, we proposed there are three distinct regions within the mouse notochord, each with its own unique morphogenetic origins and genetic control. We have also conducted two microarray-based screens to identify novel gene expression patterns in the node and notochord. First, we compared Foxa2 mutant and wild type gastrula embryos. Second, we isolated notochord progenitors from early somite stage embryos. Extensive in situ hybridization screening based on both data sets revealed over 50 node and notochord expression patterns. Lastly, we screened Foxa2-bound chromatin regions near these notochord-specific genes using a transient zebrafish expression assay, and identified two novel notochord cis-regulatory modules. Together, we found a combination of classical genetics, embryology, and novel imaging techniques, has given us a better understanding of the morphogenesis and genetic regulation of pattern formation in the developing mouse embryo.

The migration of the cranial neural crest is an essential part of cranio-facial development in every vertebrate embryo. The cranial neural crest (CNC) is a transient population of cells that forms the lateral border of the anterior neural plate. In the tailbud stage Xenopus embryo, the neural crest cells delaminate from the neural tube, and undergo a large-scale migration from the dorsal to ventral region of the embryo. The CNC travels along distinct pathways, and populates specific regions of the embryos face. Once the CNC ceases migrating, it differentiates into a variety of tissues that are essential for cranio-facial structure and function. Some of these tissues include bones, muscle, cartilage, and ganglia. The CNC receives a concert of signals from neighboring tissues during and after CNC migration as well as signals transmitted among CNC cells, which act together to determine the fate of each CNC cell. Therefore, the proper migration of the CNC is an essential part of cranio-facial development. What molecules are important for the process of CNC migration? As one might imagine, a milieu of different molecules and interactions are essential for this complicated embryological process to occur. The work presented in this dissertation will focus on the role of a cell adhesion molecule that is important for Xenopus CNC migration. Typically, the amount of cell adhesion decreases within tissues undergoing migration. This behavior is essential to allow fluidity within the tissue as it moves. However, cell adhesions are fundamental for cell migration to occur because the moving cells need a platform on which to mechanically propel themselves. These interactions can occur between the migrating cell and extracellular matrix molecules (ECM), or can happen between cells. The cranial neural crest utilizes both cell-ECM and cell-cell interactions during the process of migration. The amount of cell adhesion mediated by either of these mechanisms will depend on where the cell is located within the CNC. Cells located at the periphery of the CNC tissue, which is surrounded by a matrix of ECM, will have more cell-ECM interactions. Cells located deeper in the CNC tissue, where there is little ECM, will rely more on cell-cell interactions. The work presented in this thesis focuses on a cell-cell adhesion molecule that is part of the cadherin superfamily of molecules. With this in mind, these studies should be descriptive of the environment within the CNC, and to a less degree the environment between the CNC and the surrounding tissues. The work presented in this dissertation will focus on cadherin-11, which is a classical cadherin that is specifically expressed in the cranial neural crest during its migration. How does cadherin-11 function in the CNC during this process? The work presented here suggests that the main role of cadherin-11 in the CNC is to perform as a cell adhesion molecule. However, too much cell adhesion is inhibitory to migration. In this respect, many of the studies described in this work indicate that cadherin-11 mediated cell adhesion is tightly regulated during CNC migration. Here I show that cadherin-11 is extracellularly processed by ADAM metalloproteases, ADAM9 and ADAM13, which removes the adhesive domain of cadherin-11. This extracellular cleavage event occurs throughout CNC migration, and is likely the main mechanism that regulates cadherin-11 mediated cell adhesion. Cleavage of cadherin-11 by ADAMs does not seem to affect its ability to interact with cytoplasmic binding partners, â-catenin and p120-catenin. This observation supports the idea that the “purpose” of cadherin-11 cleavage is to regulate cell adhesion, and not to induce (cell autonomous) signaling events. Additionally, the secreted extracellular domain of cadherin-11 (EC1-3) retains biological activity. This fragment can bind to a number of cell surface molecules in tissue culture including full-length cadherin-11 and specific members of the ADAM family. This observation suggests that EC1-3 may interact with full-length cadherin-11 molecules in vivo, and inhibit cadherin-11 mediated cell adhesion during CNC migration. EC1-3 can rescue CNC migration in embryos that overexpress cadherin-11, further supporting this hypothesis. Many of the above observations have been published in my first-author paper entitled “Extracellular processing of cadherin-11 by ADAM metalloproteases is essential for Xenopus cranial neural crest migration” published in the journal Molecular Biology of the Cell in 2009. Some of the unpublished work in this dissertation further focuses on how EC1-3 effects CNC migration in an ex vivo environment. During these studies, the observation was made that overexpression of EC1-3 in a cranial neural crest explant produces abnormal directional movement. In these experiments, it appeared as though certain regions of the CNC explant were “attracting” other regions of the explant. The preliminary studies described in chapter IV are aimed at answering the question; does EC1-3 attract migrating CNC cells? Here, we generated a Matlab program in order to effectively quantify the amount of directional movement of CNC explants presented with a source of EC1-3. In addition to quantifying cell directionality, this program can also decipher between cells moving with random or directed motion, and measure the velocity of cell migration within certain coordinates. Therefore, this program should be useful other ex vivo studies that require the observation of these features. To conclude, the work presented in this dissertation suggests that the role of cadherin-11 during cranial neural crest migration is predominately based on the adhesive function. In order for CNC migration to proceed, the amount of cadherin-11 mediated cell-cell adhesion is tightly regulated throughout this process. These cell-cell interactions are likely important for “sheet” and “branch” migration where CNC cells maintain a lot of cell-cell cohesion.