Dissertations / Theses on the topic 'E. coli Nissle 1917'

Der probiotische Stamm E. coli Nissle 1917 ist ein Fäkalisolat, das in der Medizin traditionell zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt wird. Durch erfolgversprechende klinische Studien zur Remissionserhaltung bei Colitis ulcerosa, bei denen EcN als therapeutische Alternative zur Standardmedikation eingesetzt wird, ist das Interesse an den Wirkmechanismen von Probiotika stark gestiegen. EcN gehört derzeit zu den am besten untersuchten Probiotika. Einige Wirkmechanismen konnten dadurch schon aufgeklärt werden. So sind vermutlich Strukturkomponenten und stammspezifische Syntheseleistungen an der Ausprägung des probiotischen Phänotyps von EcN beteiligt. Schlüssige Konzepte, die über Gene, Genprodukte und molekulare Mechanismen den probiotischen Effekt von EcN erklären, fehlen bislang. Im Rahmen dieser Arbeit wird das Genom von EcN analysiert und auf der Basis der Genomsequenz mit anderen E. coli-Stämmen verglichen. Mit Hilfe einer Promotor-Reporter-Fusionsbibliothek (Promotorbank) werden intestinal in vivo regulierte Gene identifiziert und dadurch neue Ansätze zur Untersuchung der probiotischen Eigenschaften von EcN geschaffen. Die Grundlage für die molekulare Analyse von EcN ist die manuelle Nachannotation seines sequenzierten Genoms. Die EcN-Sequenz wird mit 13 weiteren annotierten E. coli-Sequenzen verglichen. Nach dieser Analyse kodiert EcN derzeit 121 stammspezifische Gene. Die Genomstruktur ist mit den enthaltenen genomischen Inseln und Prophagen dem Genom des uropathogenen E. coli CFT073 sehr ähnlich. Mit wenigen Ausnahmen kodiert EcN alle in E. coli CFT073 vorhandenen Virulenz- und Fitnessfaktoren, so dass auf der Nukleotidebene die nahe Verwandschaft dieser beiden Stämme bestätigt werden kann. Zudem kann gezeigt werden, dass EcN in artifiziellen Systemen wie der Zellkultur oder gnotobiotischen Mäusen ein pathogenes Potenzial hat, obgleich die Kolonisierungsfähigkeit pathogener Bakterien durch Inkubation mit EcN herabgesetzt wird. Eine wichtige Rolle bei der Besiedlung des Intestinaltrakts und der Immunstimulation von Darmepithelzellen spielt auch die globale Regulation der Genaktivität bei EcN durch den alternativen Sigma-Faktor RpoS, der im Gegensatz zu rpoS-Deletionsmutanten zu einer gesteigerten mRNA-Expression des Tight-junction Proteins ZO-1 führt. Des Weiteren führte die Untersuchung von EcN-Deletionsmutanten zu der Schlussfolgerung, dass einige genomische Inseln für Eigenschaften, die das probiotische Verhalten erklären können, eine Rolle spielen. Durch den Einsatz einer Promotorbank von EcN in konventionellen und gnotobiotischen Mäusen werden erstmalig Sequenzen von intestinal in vivo aktiven Promotoren identifiziert. Der Aufbau eines Promotor-Reportergen-Assays mit dem Biolumineszenz erzeugenden luxCDABE-Operon ermöglichte die Untersuchung ausgewählter Promotoren in vitro. Mit einem In Vivo Imaging System (IVIS) kann in weiteren Experimenten die Aktivität dieser Promotoren in lebenden Mäusen untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wird gezeigt, dass EcN kein vollkommen harmloser probiotischer Stamm ist. Weitere Informationen über EcN sind dehalb wichtig für eine optimierte Anwendung als Therapeutikum. Die molekulare Analyse ist somit eine unbedingt notwendige Grundlage für weiterführende Untersuchungen der Eigenschaften von EcN, die für seinen probiotischen Charakter verantwortlich sind
The probiotic E. coli Nissle 1917 is a fecal isolate which is traditionally used for treatment of various gastrointestinal disorders. In clinical trials where EcN was used as therapeutic alternative for remission maintenance of ulcerative colitis compared to standard medication, promising results led to an increased interest in probiotics. Today, EcN is one of the best studied probiotics. Therefore, several mechanisms of action could be enlightened. Structural components and strain-specific products are responsible for its probiotic effects. But conclusive concepts about genes, gene products and molecular mechanisms that really contribute to the probiotic character of EcN have not been offered so far. In order to create new possibilities to elucidate the probiotic traits of EcN the genome is analysed by taking this as a basis for comparison to other E. coli genomes and identification of intestinal in vivo regulated genes using a promoter-trap-library. The sequenced EcN genome is annotated and compared to 13 other so far annotated E. coli genomes. Concerning these analyses EcN encodes 121 strain-specific genes. The genome structure including the genomic islands and prophages is highly homolog to the uropathogenic E. coli CFT073. EcN encodes most of the virulence and fitness factors that are present in E. coli CFT073. Therefore, the close relationship of these two strains is confirmed at nucleotide level. Furthermore, it is shown that in artificial systems like cell culture assays and gnotobiotic mice EcN reveals a pathogenic potential although EcN is able to decrease colonization efficiency of pathogenic bacteria. The alternative sigma factor RpoS that is responsible for global regulation and activity of several genes seems to play an important role during colonization of EcN in the intestine and its immunostimulatory effects on intestinal epithelial cells. Investigation of EcN-deletion mutants lacking genomic islands and prophages lead to the conclusion that some genomic islands may play a role for specific probiotic traits. This is the first time where a promoter-trap-library was used in conventional and gnotobiotic mice for collection of intestinal in vivo active promoters. Constructing and establishing a promoter-reporter gene assay with the bioluminescent luxCDABE operon made the investigation of selected promoters in vitro possible as well as establishing a bioluminescence assay using an In Vivo Imaging System (IVIS) for investigation of promoter activity in living mice. In this research project was shown that EcN is not a completely harmless probiotic. The genome structure and regulatory mechanisms of gene expression are the strain’s molecular traits that lead to probiotic activity and immunostimulatory effects. Therefore, the molecular analyses presented here, together with the complete genome sequence, are a basis for further investigations of mechanisms that are responsible for the probiotic effects of EcN

The human microbiota refers to the ecosystem of microorganisms living on or within the human body, and is increasingly being implicated as a regulator of health and disease. Abnormal alterations in the development or composition of the intestinal microbiota are referred to as dysbiosis. However, the reciprocal interactions between the microbiota and the host’s diet, immunology and genetics can in turn make it extremely difficult to distinguish the cause and effect of dysbiosis in pathologies. Synthetic biology has facilitated the design and creation of more complex and clinically relevant genetic circuits. The commensal nature of the intestinal microbiota and its constituents provide a number of well tolerated microorganisms such as Escherichia coli NISSLE 1917 (EcN) that could be used as powerful investigative tools. The use of antibiotic selection within synthetic circuits would eventually hinder their investigative power during microbiota experiments. Toxin-Antitoxin (TA) post segregational killing systems are a naturally occurring bacterial mechanism to maintain plasmid stability. Here we show that the Axe/Txe TA system from Enterococcus faecium was able to significantly outperform the more widely used Hok/Sok system to maintain the stability of fluorescent and luminescent reporter plasmids in EcN without antibiotic selection during both liquid culture and in vivo animal experiments. In addition, we created a sensor circuit that in EcN could detect both exogenous and bacterial-derived reactive nitrogen species, which are thought to play a crucial role in the human host inflammatory response. We also developed biosensors for pH and the short-chain fatty acid propionate. Finally, we demonstrated that an EcN sensor could detect and report on environmental signals in vivo from the intestines of the Caenorhabditis elegans worm. Synthetic biological tools such as these could help further elucidate the underlying role of the microbiota in conditions such as inflammatory bowel disease and cancers of the gasterointestinal tract.

Probiotics are generally live preparations of bacteria that exert beneficial effects on host health when ingested in sufficient quantities. The novel probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) has been shown to have a number of beneficial effects in this context, including protection against food-borne pathogens and infectious diarrheal diseases, and maintaining remission of inflammatory bowel diseases by virtue of its anti-inflammatory properties. However, little is known regarding the mechanisms underlying the beneficial effects of this organism. The overall aim of this work was to provide a greater understanding of the mechanisms through which EcN interacts with the mammalian gastro-intestinal epithelium to benefit human health.

La Sclérose en Plaques (SEP) est une maladie d'origine multifactorielle qui se développe chez des individus génétiquement susceptibles en présence de facteurs environnementaux inducteurs. Ma thèse avait pour objectif d'analyser les effets d'un facteur génétique, le variant R63W du gène Vav1 et d'un facteur environnemental, la souche "Escherichia coli Nissle 1917", sur le développement de l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle animal de la SEP. Une région de 1cM comportant un polymorphisme dans le gène Vav1 a en effet été identifiée au laboratoire comme étant responsable de la résistance des rats Brown-Norway à l'EAE. Afin d'établir formellement le rôle de ce polymorphisme dans ce modèle, une souris Knock-In Vav1R63W a été générée. Nous avons montré que les souris Vav1R63W développent une EAE moins sévère. Ceci est associé à un défaut de production de cytokines inflammatoires intrinsèque aux lymphocytes T (LT) CD4 qui n'est pas lié à une augmentation de la fréquence de LT régulateurs. Sur le plan moléculaire, Vav1R63W présente une activité adaptatrice défectueuse conduisant à la diminution de la phosphorylation de ERK, AKT et p38 mais à une activité enzymatique normale. Nos résultats montrent un rôle de la fonction adaptatrice de Vav1 dans les fonctions des LT CD4 et son implication dans la susceptibilité à l'inflammation du système nerveux central (SNC). L'analyse de l'effet d'un traitement oral par le probiotique E. coli Nissle 1917 (ECN) montre un effet bénéfique sur le développement de l'EAE. Ceci est associé à un défaut de la sécrétion de cytokines par les LT CD4, ainsi qu'à une diminution de l'infiltration de LT CD4 auto-réactifs dans le SNC. De plus, la barrière intestinale est moins altérée chez les souris traitées par ECN au cours du développement de l'EAE. L'effet bénéfique de ECN semble être dû à la production d'une génotoxine, la colibactine. Par contre, la colonisation néonatale des souris C57BL/6 par ECN ne reproduit pas le même effet observé à l'âge adulte. Dans l'ensemble, nos résultats montrent un effet bénéfique du changement de la fonction de Vav1 ainsi que du traitement par ECN sur le développement de l'EAE. L'analyse approfondie des mécanismes mis en jeu, permettra une meilleure compréhension de la pathogenèse de la SEP et pourrait contribuer à l'identification de nouvelles options thérapeutiques
Multiple sclerosis (MS) is a demyelinating disease of the central nervous system. It develops in genetically susceptible individuals when they encounter specific environmental factors. The aim of my thesis was to analyze the role of a genetic factor (Vav1R63W variant) and an environmental factor (Escherichia coli Nissle 1917) in the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model of MS. Previous genetic studies of my team suggest the implication of a polymorphism in the Vav1 gene in the resistance of Brown-Norway rats to EAE. In order to analyze the role of the identified polymorphism in the susceptibility to EAE, we generated a Knock-In mouse bearing the same polymorphism (Vav1R63W). Using this model, we showed that Vav1R63W mice develop less severe EAE due to a defect in cytokine production by CD4 T cells. This defect is intrinsic to CD4 T cells and is not linked to the increased proportion of regulatory T cells observed in Vav1R63W mice. We also showed that Vav1R63W present an altered adaptor function as shown by reduced ERK and AKT phosphorylation and decreased calcium flux after TCR stimulation, with no effect on Vav1 enzymatic activity. Thus, our results highlight the role of Vav1 adaptor function in CD4 T cell functions and susceptibility to central nervous system inflammation. Next, I analyzed the impact of the treatment with the probiotic E. coli Nissle 1917 (ECN) on EAE development. Our results showed that the daily oral treatment of adult C57BL/6 mice with ECN ameliorates the course of the disease. In addition to their defect in cytokines production, MOG specific CD4 T cells from ECN treated mice were increased in the periphery. Consequently, ECN treated mice exhibited reduced CD4 T cell infiltration in their central nervous system. Furthermore, analysis of intestinal permeability revealed that its alteration after MOG immunization was partially reversed after ECN treatment. The reduced EAE seems to be due to the secretion of a genotoxin by ECN, the colibactin. In contrast, neonatal colonization of C57BL/6 mice did not protect against EAE. Together, our data showed a beneficial role of the imbalance of Vav1 function and ECN treatment in EAE development. Further analysis of the involved mechanisms will help us to better understand the pathogenesis of MS and to develop new therapeutic strategies for MS

In der vorliegenden Arbeit wurden lebensfähige Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) klinisch gesunden adulten Pferden oral verabreicht und anschließend aus den Faeces der Tiere reisoliert. Der probiotische nicht-pathogene EcN wird in der Humanmedizin seit 1917 erfolgreich zur Behandlung zahlreicher Erkrankungen und Störungen des Verdauungstraktes wie Diarrhöe, Colitis ulcerosa, Morbus Crohn, kollagener Colitis und Pouchitis eingesetzt wird. Des Weiteren konnte in der Anwendung bei neugeborene Säuglingen nach Gabe von EcN eine Kolonisationsprophylaxe und ein immunstimulierender Effekt zu beobacht werden. In der Veterinärmedizin wird EcN unter der Bezeichnung Ponsocol® (Firma Ponsold GmbH, Oschersleben) zur Durchfallprophylaxe beim Kalb eingesetzt. Die vorliegenden Untersuchungen umfassten zwei zeitlich getrennte Feldversuche mit unterschiedlichem Design. Versuch A wurde als placebo-kontrollierter paralleler Gruppenvergleich durchgeführt. Je Gruppe wurde 6 Tiere vom 1. bis 10. Studientag die Studienmedikation oral mit dem Futter gegeben und nachfolgend bis zum 25. Studientag beobachtet. Die Pferde der Verum-Gruppe (n = 6) erhielten täglich 150 x 108 KbE EcN lebend in 150 ml Puffersuspension, die Pferde der Placebo- Gruppe (n = 6) erhielten 150 ml der Puffersuspension ohne EcN. Versuch B wurde mit interner Verlaufskontrolle über 65 Tage durchgeführt. Die Studientiere (n = 6) erhielten EcN in steigender Dosierung (75, 125, 250 und 500 x 108 KbE/Tag) in fünf aufeinander folgenden 10tägigen Applikationsperioden. Die 1. Applikationsperiode begann am 11. Studientag. In den ersten 10 Tagen wurden alle Tiere nur beobachtet. Die Gabe der Medikation erfolgte wie in Versuch A mit dem Futter verabreicht. Die jeweilige Dosis wurde zweimal täglich in gleichen Dosen (7.00 und 16.00 Uhr) appliziert. Das Verum- und Placebohaltige Futter wurde von den Studientieren vollständig und ohne erkennbare Verzögerung aufgenommen. Bei zweimal täglich durchgeführten Allgemeinuntersuchungen aller Tiere ergaben sich unter der EcN-Applikation keine Abweichungen vom physiologischen Zustand. Um EcN in lebensfähiger Form wiederzufinden, wurden den Pferden Kotproben entnommen. Diese wurden entweder nach Zwischenkultivierung (Versuch A und B) oder direkt (Versuch B) mittels PCR auf EcN-spezifische DNA untersucht. Im Studie A wurde der Stamm bei zwei Tieren an Tag 11 gefunden. In Studie B wurde EcN bei zwei Tieren an Tag 20 und bei allen Tieren an den Versuchstagen 25, 32, 35, 40, 42, 45 und 50 gefunden. Nach dem Absetzen der Medikation an Tag 50 war der Stamm bei zwei Tieren an Tag 52 und bei einem Tier an Tag 55 nachweisbar. Bei PCR nach Zwischenkultivierung wurde der Stamm bei allen Pferden der Applikationsstufen 150, 250 und 500 x 108 KbE des Verum-Präparates gefunden. In der Nachsupplementationsperiode wurde der Stamm lediglich bei einem Pferd an Tag 52 gefunden. Als weiterer Befunde wurden in Versuch A statistisch signifikante Modifikationen im Fettsäuremuster der kurzkettigen Fettsäuren gefunden. Bei den zusätzlich durchgeführten mikrobiologischen Untersuchungen ergaben sich keine statistischen gesicherten Einflüsse der Applikation von EcN auf die Zusammensetzung der gastrointestinalen Mikroflora. Die Untersuchungen der Ammoniak- und L-Lactat- und pH-Werte im Kotwasser und der Trockensubstanzgehalte in den Faeces zeigten ebenso keine Beeinflussung durch die Applikation von EcN. Die Ergebnisse beider Versuche zeigen, dass EcN in der Lage ist, die Magen-Darm-Passage beim Pferd nach oraler Applikation lebensfähig zu überstehen. In den gewählten Dosierungen konnten keine negativen Auswirkungen auf die klinische Gesundheit der Pferde gefunden werden. Zur Überprüfung eines probiotischen Effektes des EcN beim Pferd sind weitere Studien nötig.

De nombreuses études portant sur le microbiote intestinal ont mis en évidence son importance dans la physiologie et la physiopathologie de l’hôte. Les bactéries, acteurs majeurs du microbiote, participent au maintien de l’homéostasie intestinale en régulant plusieurs fonctions essentielles allant de la protection de la barrière intestinale au développement du système immunitaire. Des altérations de la composition et de la diversité de ce microbiote ont été observées dans des pathologies du tractus digestif comme le syndrome de l’intestin irritable et les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Afin de restaurer l’homéostasie intestinale, des thérapies utilisant des bactéries probiotiques ont été utilisées. Parmi les bactéries probiotiques testées, Escherichia coli Nissle 1917 (E. coli Nissle 1917) a été décrite comme exerçant des fonctions anti-diarrhéiques, analgésiques et anti-inflammatoires. Néanmoins les mécanismes d’actions impliqués dans ces activités demeurent inconnus. Afin de les mettre en évidence, nous avons utilisé deux approches en spectrométrie de masse pour analyser les lipides bactériens. Une première approche sans apriori, nous a permis de mettre en évidence la production de lipopeptides dont le C12AsnGABAOH constitué d’un acide gras de 12 carbones, d’une asparagine et du GABA, le neurotransmetteur inhibiteur majoritaire du système nerveux. Ce lipopeptide était produit par des enzymes codées par des gènes faisant partis d’un cluster : l’îlot pks. A l’inverse du GABA seul, le C12AsnGABAOH traversait la barrière épithéliale intestinale (BEI) in vitro et in vivo. L’ajout de l’aminolipide par la bactérie confère donc au GABA la capacité d’atteindre les terminaisons nerveuses sensitives. Ce lipopeptide diminuait l’activation neuronale induite par l‘activation de nocicepteurs dans des cultures de neurones sensitifs via le récepteur GABAB. In vivo, il inhibait l’hypersensibilité viscérale induite par l’activation de nocicepteurs chez la souris. Dans une deuxième étude, nous avons réalisé une étude en spectrométrie de masse avec apriori en recherchant les acides gras à longue chaine (AGLC) hydroxylés dans différentes souches d’E. coli. Le C18-3OH un AGLC de 18 carbones possédant une hydroxylation en position 3 était produit en plus grande quantité par les bactéries E. coli Nissle 1917 indépendament de l’ilôt pks. Le C18-3OH n’était pas capable de traverser la BEI et s’accumulait dans les cellules in vitro, dans les tissus ex vivo, et dans le colon in vivo. Dans les tissus, le C18-3OH modulait l’expression de gènes qui était sous la dépendance du récepteur PPAR-γ. Enfin nous avons mis en évidence dans un modèle de colite induite par le DSS que le C18-3OH réduisait la perméabilité paracellulaire et les paramètres inflammatoires chez la souris. Ces travaux de thèse nous ont permis de démontrer pour la première fois que les bactéries E. coli Nissle 1917 pouvaient communiquer avec les cellules de l’hôte en sécrétant des lipopeptides et des AGLC. Deux d’entre eux le C12AsnGABAOH et le C18-3OH étaient des molécules bioactives. Le C12AsnGABAOH inhibait l’hypersensibilité viscérale et le C18-3OH réduisait le statut inflammatoire des cellules épithéliales intestinales. Ces composés lipidiques pourraient être impliqués dans les effets probiotiques exercés par E. coli Nissle 1917 et représenter des agents thérapeutiques dans le traitement de la douleur viscérale et de l’inflammation intestinale
Numerous studies have highlighted the importance of intestinal microbiota in the physiology and physiopathology of the host. Bacteria, the most represented microorganisms of the microbiota, contribute to the maintenance of intestinal homeostasis by regulating several essential functions ranging from the protection of the intestinal barrier to the development of the immune system. Impairment in the composition and diversity of this microbiota have been observed in pathologies of digestive tract such as irritable bowel syndrome and inflammatory bowel disease. In order to restore intestinal homeostasis, therapies using probiotic bacteria were used. Among probiotic bacteria tested, Escherichia coli Nissle 1917 (E. coli Nissle 1917) has been used for its anti-diarrheal, analgesic and anti-inflammatory properties. Nevertheless, the mechanisms of action involved in these therapeutic effects remain unknown. In order to study them, we used two approaches in mass spectrometry to analyse bacterial lipids. A first untargeted approach, allowed us to highlight the production of lipopeptides including C12AsnGABAOH composed by a fatty acid of 12 carbons, an asparagine and GABA (gamma amino butyric acid), the main inhibitory neurotransmitter of the nervous system. This lipopeptide was produced by enzymes encoded by genes of a cluster call the pks island. In contrast to GABA alone, C12AsnGABAOH crosses the intestinal epithelial barrier (IEB) in vitro and in vivo. The addition of the aminolipid by the bacteria confer to the GABA the ability to reach sensory nerve endings. This lipopeptide decreased neuronal activation induced by activation of nociceptors in sensory neuron primary cultures via the GABAB receptor. In vivo, it inhibited visceral hypersensitivity induced by activation of nociceptors in mice. In a second study, we carried out a mass spectrometry targeted approaches looking for hydroxylated long chain fatty acids (LCFA) in different strains of E. coli. C18-3OH a LCFA of 18 carbons with a hydroxylation on its third position was produced in higher amounts by E. coli Nissle 1917 independently of the pks island. The C18-3OH was not able to cross the IEB and accumulated in cells in vitro, in tissues ex vivo and in colon in vivo. In tissues, C18-3OH modulated the expression of genes regulated by PPAR-γ receptor. Finally, in a DSS-induced colitis in mice, C18-3OH decreased paracellular permeability and inflammatory parameters. These thesis works allowed us to demonstrate for the first time that E. coli Nissle 1917 could signal to host cells by secreting lipopeptides and LCFAs. Two of them C12AsnGABAOH and C18-3OH were bioactive molecules. C12AsnGABAOH inhibited visceral hypersensitivity and C18-3OH reduced the inflammatory status of intestinal epithelial cells. These lipid compounds could be involved in the probiotic effects exerted by E. coli Nissle 1917 and represent therapeutic agents in the treatment of visceral pain and intestinal inflammation

In der vorliegenden Arbeit wurde in einem in vitro-Modell mit porcinen intestinalen Epithelzellen (IPEC-J2) der Einfluss des probiotischen E. coli Nissle 1917 (EcN) auf die Infektion mit atypischen EPEC (aEPEC) untersucht. EcN reduzierte bei Vorinkubation auf IPEC-J2 die aEPEC-Infektion drastisch. Konfokale Laserscanning- und Elektronenmikroskopie zeigten, dass EcN die Adhäsion und Mikrokoloniebildung inhibierte, jedoch nicht die Ausbildung von Attaching and Effacing-Läsionen adhärenter aEPEC. Der inhibierende Effekt von EcN wurde durch dessen sehr gute Adhäsionsfähigkeit an IPEC-J2 vermittelt. Die F1C-Fimbrien wurden als wichtigster Adhäsionsfaktor von EcN identifiziert. Darüber hinaus waren auch H1-Flagellen durch Ausbildung interbakterieller Verbindungen maßgeblich an der Adhäsion des Stammes beteiligt. In gleichem Maß wie die Vorinkubation von EcN reduzierte die Koinkubation seines Kulturüberstandes die aEPEC-Infektion, was auf die Abgabe eines inhibierenden Faktors in den Kulturüberstand schließen lässt. Dieser Faktor wurde auch von anderen pathogenen sowie nicht pathogenen E. coli-Stämmen in Schüttelkultur gebildet und scheint deshalb nicht spezifisch für EcN zu sein. Jedoch ermöglichte erst die gute Adhäsionsfähigkeit von EcN auf der Epithelzelloberfläche die Abgabe ausreichender Mengen des Inhibitors und eine Beeinflussung der aEPEC-Infektion. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass durch EcN die initiale Anheftung von aEPEC an die Wirtszelle unterbunden wird. Der inhibierende Effekt von EcN auf die aEPEC-Infektion war zeitabhängig. Im Gegensatz zur Vorinkubation erhöhten Ko- und Nachinkubation von EcN die Adhäsion von aEPEC und hatten einen geringeren inhibierenden Effekt auf die Mikrokoloniebildung. Dieser gegensätzliche Effekt auf die Adhäsion von aEPEC wird möglicherweise von einem zweiten Faktor hervorgerufen. Dieser scheint nur dann wirksam zu sein, wenn der inhibierende Faktor in zu geringer Konzentration oder erst nach Adhäsion von aEPEC vorliegt.
In this study, the effects of the probiotic E. coli strain Nissle 1917 (EcN) on host cell infection with atypical enteropathogenic E. coli (aEPEC) were investigated in an in vitro porcine intestinal epithelial cell model (IPEC-J2). In pre-incubation experiments, EcN drastically reduced the infection efficiencies of aEPEC. Using confocal laser scanning microscopy and scanning electron microscopy, it was shown that EcN inhibited the attachment and formation of microcolonies, but not the formation of attaching and effacing lesions by adherent aEPEC. The inhibitory effect was mediated by the adherent properties of EcN to epithelial cells. The F1C fimbriae were identified as the most important adhesion factor of EcN in vitro. Furthermore, the H1 flagellae were also shown to be involved in the adhesion of EcN, serving as bridges between bacterial cells. Co-incubation of culture supernatants of EcN reduced the infection efficiencies of aEPEC to the same extent as in pre-incubation with EcN bacteria, indicating the secretion of an inhibitory factor by EcN. This factor was also secreted by other pathogenic and non-pathogenic E. coli strains in shaking culture and therefore does not appear to be specific for EcN. However, the outstanding ability of EcN to adhere to epithelial cells largely contributes to the secretion of sufficient concentrations of this inhibitory factor und to the influence on the aEPEC infection. The results suggest that EcN interferes with the initial adhesion of aEPEC to host cells. The inhibitory effect of EcN was found to be time-dependent. In contrast to pre-incubation experiments, co- and post-incubation of EcN actually increased the adhesion efficiencies of aEPEC and showed only minor effects on microcolony formation. This second effect of EcN on aEPEC adhesion, possibly due to a second factor, appears only to be effective when the putative inhibitory factor is either present at low concentrations or after aEPEC is already adherent to host cells.

Durchfallerkrankungen unterschiedlicher Genese sind eine der häufigsten Vorstellungsgründe in der Kleintierpraxis. Neben den Folgen für das betroffene Tier selbst, ist die Erkrankung oft auch eine enorme Belastung für den Besitzer. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erste grundlegende Erkenntnisse zum Einsatz des probiotisch wirksamen Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) als Arzneimittel bei gastrointestinalen Störungen mit der Leitsymtomatik "Diarrhöe" bei der Tierart Hund gewonnen. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich ableiten, dass EcN in der Lage ist, die Magen-Darm-Passage bei solch erkrankten Hunden lebensfähig zu überwinden. Es wurde weiter gezeigt, dass EcN einem Placebo in der Behandlung eines akuten Durchfalls bei der Tierart Hund signifikant überlegen ist.

Zusammenfassung Untersuchungen zur Beeinflussung von experimentellen Salmonella Enteritidis PT4 Infektionen bei Küken durch den probiotischen Stamm Escherichia coli Nissle 1917 Imad Azmi Awadein Mohamed Institut für Bakteriologie und Mykologie, Veterinärmedizinische Fakultät, Universität Leipzig und Institut für Geflügelkrankheiten, Veterinärmedizinische Fakultät, Freie Universität Berlin Eingereicht im Januar, 2004 Schlüsselworte: (E. coli Stamm Nissle 1917, Küken, S. Enteritidis, Probiotika, Bdellovibrionen) (94 Seiten, 48 Abbildungen, 16 Tabellen und 150 Referenzen) 1- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus auf die Reduktion der Ansiedlung von S. Enteritidis PT4, auf die Reduktion der Mortalitätsrate, auf die Gesamtzahl aerober und Gram-negativer Bakterien, auf die Anzahl von Bdellovibrionen und auf das Körpergewicht von SPF-Hühnern. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe konnten bei der Ansiedlung von S. Enteritidis PT4 im Caecum der Testgruppen an den Tagen 14, 21 und 28 signifikante Unterschiede festgestellt werden. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, die eine Mortalitätsrate von 10% aufweist, war die Mortalitätsrate der Testgruppen deutlich reduziert. Ebenso waren in den Testgruppen die aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl am Tag 28 im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe deutlich verringert. Signifikanten Anstieg der Bdellovibrionen Anzahl zeigten die Testgruppen sowohl im Vergleich zur positiven als auch negativen Kontrollgruppe. Beim Vergleich zwischen dem Gesamtkörpergewicht der Testgruppen zu dem der negativen und den überlebenden Tieren der positiven Kontrollgruppe gab es keine signifikanten Unterschiede. 2- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus auf die Reisolation von S. Enteritidis PT4 aus verschiedenen Teilen des Intestinaltrakts und diverser Organe von SPF-Hühnern. In Kropf, Proventrikel, Herzblut, Lunge, Leber und Milz der Testgruppen konnte im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine Reduktion ermittelt werden, die Reisolation von S. Enteritidis aus dem Caecum der Testgruppen zeigte keinen Unterschied im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe. 3- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus an Konzentrationen von Serum-Avidin, IgY gegen S. Enteritidis und IgY gegen E. coli Nissle 1917 bei experimentell mit S. Enteritidis-infizierten SPF-Hühnern. Die Untersuchungen ergaben eine signifikante Senkung der Serum-Avidin-Konzentration im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, vor allem sieben Tage post infectionem mit S. Enteritidis. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen S. Enteritidis konnte bei den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe vor allem an den Tagen sieben verzeichnet werden. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen E. coli Nissle 1917 konnte in allen Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe festgestellt werden. 4- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Reduktion der Ansiedelung von S. Enteritidis PT4, auf die Reduktion der Mortalitätsrate, die aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl, die Bdellovibrionen-Gesamtkeimzahl, Keimzahlen von Lactobacillus, Bifidobacterium und C. perfringens und das Körpergewicht von SPF-Hühnern. Im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe konnte im Caecum der Testgruppen ein signifikanter Rückgang der Ansiedelung von S. Enteritidis an den Tagen 7, 21 und 28 verzeichnet werden, außerdem konnte bei den Testgruppen kein Todesfall festgestellt werden, wohingegen die Sterblichkeitsrate der positiven Kontrollgruppe bei 15% lag. Ein signifikantes Absinken in der totalen Gesamtkeimzahl und der Gram-negativen Gesamtkeimzahl konnte für die Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe an den Tagen 21 beziehungsweise 28 verzeichnet werden. Die Isolation von Bdellovibrionen aus den Testgruppen ergab keinen Unterschied zu den Kontrollgruppen. Die Lactobacillus-Bifidobacterium-Keimzahl war in den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe signifikant erhöht, vor allem am Tag sieben. Die C. perfringens-Keimzahl war in der positiven Kontrollgruppe gegenüber den Testgruppen am Tag 7 und 14 signifikant erhöht. Die Vergleiche des Körpergewichts der Testgruppen, negativer und überlebender Tiere der positiven Kontrollgruppe zeigten keinen signifikanten Unterschied. 5- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Reisolation von S. Enteritidis aus unterschiedlichen Teilen des Intestinaltraktes und aus Organen von SPF-Hühnern. Im Kropf, Proventrikel, Duodenum, Herzblut, Lunge, Leber und Milz konnte bei den Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine Senkung der Reisolationsrate festgestellt werden, wohingegen sich keine Unterschied beim Vergleich der Caeca von positiver Kontrollgruppe und von den Testgruppen zeigte. 6- Untersucht wurden die Auswirkungen der oralen Applikation von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die Konzentrationen von Serum-Avidin, IgY gegen S. Enteritidis und IgY gegen E. coli Nissle 1917 bei experimentell mit S. Enteritidis-infizierten SPF-Hühnern. Bei der Serum-Avidin-Konzentration konnte kein Unterschied zwischen Testgruppen und positiver Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Testgruppen zeigten ihrerseits im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe eine signifikante Erhöhung der Konzentration von IgY gegen S. Enteritidis, vor allem an den Tagen 21 und 28. Ein signifikanter Anstieg der Konzentration von IgY gegen E. coli Nissle 1917 konnte in allen Testgruppen im Vergleich zur positiven Kontrollgruppe, vor allem an den Tagen sieben und vierzehn festgestellt werden. 7- Aus den Resultaten des ersten und des zweiten Versuchs schließen wir, dass der probiotische Stamm E. coli Nissle 1917 das Caecum von 7 bis 28 Tage alten Hühnern erfolgreich kolonialisieren kann. Orale Applikation des Stammes kann die Ansiedlung von S. Enteritidis, aerobe und Gram-negative Gesamtkeimzahl, Mortalitätsrate, Reisolationsrate von S. Enteritidis in Organen und im Intestinaltrakt (mit Ausnahme des Caecums im ersten Versuch) deutlich reduzieren. Die Kombination von E. coli Nissle 1917 und Bdellovibrio bacteriovorus hatte nicht den gewünschten Effekt, der auch von mehreren Autoren in-vitro beobachtet wurde. Bdellovibrionen waren in den Testgruppen des ersten Versuchs im Vergleich zu denen im zweiten deutlich erhöht. Beim durchschnittlichen Körpergewicht konnte kein signifikanter Unterschied zwischen beiden Versuchen festgestellt werden. Der Serum-Avidin-Spiegel war im ersten Versuch in der Testgruppe deutlich reduziert, im zweiten dagegen nicht. Dies ist möglicherweise auf den Effekt von Bdellovibrionen zurückzuführen, bedarf allerdings noch der weiteren Bestätigung. Im Allgemeinen konnten wir eine signifikante Verbesserung des Immunsystems der Vögel als Resultat der oralen Applikation von E. coli Nissle 1917 feststellen. 8- Untersucht wurden die antagonistischen Effekte von E. coli Stamm Nissle 1917 mit und ohne Plasmid auf die in-vitro-Wachstumsrate von S. Enteritidis PT4. Wir konnten feststellen, dass E. coli Nissle 1917 sowohl mit als auch ohne Plasmid die Wachstumsrate von S. Enteritidis erfolgreich reduzieren konnte
Summary Influence of the probiotic strain Escherichia coli Nissle 1917 on experimental infections with Salmonella Enteritidis PT4 in chickens Imad Azmi Awadein Mohamed Institute of Bacteriology and Mycology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Leipzig and Institute of Poultry Diseases, Faculty of Veterinary Medicine, Free University Berlin Submitted in January, 2004 Keywords: (E. coli strain Nissle 1917, chickens, S. Enteritidis, Probiotics, Bdellovibrios) (94 pages, 48 figures, 16 tables and 150 references) 1- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 with Bdellovibrio bacteriovorus on the colonization of S. Enteritidis PT4, reduction of the mortality rate, total aerobic bacterial counts, Gram negative bacterial counts, bdellovibrio bacterial counts and body weight of Specific Pathogen Free chickens were investigated. A significant reduction in the colonization of S. Enteritidis PT4 in the caecum of trial groups at 14, 21 and 28 days old in comparison to the positive control group was observed. A reduction in mortality rate in the trial groups was seen in comparison to the positive control group which had 10 %. The total aerobic and Gram negative bacterial counts were significantly decreased in the trial groups at 28 days old in comparison to the positive control group. Bdellovibrio bacterial counts were significantly increased in the trial groups in comparison to the control groups. No significant difference was seen in the mean body weight of the trial groups in comparison to control groups. 2- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 with Bdellovibrio bacteriovorus on reisolation rate of S. Enteritidis from different parts of the intestinal tract and organs of SPF chickens was investigated. A reduction in the S. Enteritidis reisolation rate was seen from crop, proventriculus, duodenum, heart blood, lungs, livers and spleens of the trial groups in comparison to the positive control group but not from the caecum. 3- The effect of oral application of E. coli strain Nissle 1917 and Bdellovibrio bacteriovorus on the serum avidin levels, IgY against S. Enteritidis and IgY against E. coli strain Nissle 1917 levels of SPF chickens experimentally infected with S. Enteritidis was investigated. A significant reduction in the serum avidin levels was observed in the trial groups at 7 days old in comparison to the positive control group. The antibody levels against S. Enteritidis was significantly increased in the trial group at 7 days old in comparison to the positive control group. A significant increase at day 7 in the antibody levels against E. coli strain Nissle 1917 was seen in the trial group in comparison to the positive control group. 4- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on reduction on the colonization of S. Enteritidis PT4, reduction of the mortality rate, total aerobic bacterial counts, Gram negative bacterial counts, bdellovibrio bacterial counts, Lactobacillus-Bifidobacterium counts, C. perfringens bacterial counts and body weight of SPF chickens were investigated. A significant reduction in the colonization of S. Enteritidis PT4 in the caecum of trial groups at 7, 21 and 28 days old in comparison to the positive control group was observed. No mortalities were seen in the both trial groups in comparison to the positive control group which had 15 % mortalities. The total aerobic and Gram negative bacterial counts were significantly decreased in the trial groups at 21 and 28 days respectively old in comparison to the positive control group. No significant difference was observed in bdellovibrio isolation from the trial groups in comparison to the control group. Lactobacillus-Bifidobacterium bacterial counts were significantly increased in the trial groups at 7, 14 and 21 days old in comparison to the positive control group. A significant reduction in C. perfringens bacterial counts were seen in the trial groups at 7 and 14 days old in comparison to positive control group. No significant difference was observed in the mean body weight of the trial groups in comparison to control groups. 5- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the reisolation of S. Enteritidis from different parts of intestinal tract and organs of SPF chickens was investigated. A reduction in the S. Enteritidis reisolation rate was seen from crop, proventriculus, duodenum, caecum, heart blood, lungs, livers and spleens of the trial groups in comparison to the positive control group. 6- The effect of oral application E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the serum avidin levels, IgY against S. Enteritidis and IgY against E. coli strain Nissle 1917 levels of SPF chickens experimentally infected with S. Enteritidis were investigated. No significant reduction in the serum avidin levels were seen in the trial groups in comparison to the positive control group. The antibody levels against S. Enteritidis were significantly increased in the trial groups at 21 and 28 days old in comparison to the positive control group. A significant increase in the antibody levels against E. coli strain Nissle 1917 were seen in the trial groups in comparison to the positive control group. 7- From the results observed in the first and second experiments we concluded that probiotic strain E. coli Nissle 1917 can successfully colonize the caecum of SPF chickens from 7 to 28 days old. Oral appliction of probiotic strain E. coli Nissle 1917 has significantly reduced the S. Enteritidis colonization, total and Gram negative bacterial counts, mortality rate, reisolation rate of S. Enteritidis in organs and the intestinal tract except the caecum in first experiment in the trial groups in comparison to positive control. The combination between E. coli strain Nissle 1917 and B. bacteriovorus had not achieved the desirable effects in the first experiment which observed by many authors in vitro. Bdellovibrio was significantly increased in the trial groups of the first experiment in comparison to the second experiment. This may be a possible effect of Bdellovibrio which is yet to be confirmed. No significant difference was observed in the mean body weight in both experiment. A significant reduction of serum avidin levels were observed in the trial groups of the first experiment but not in the second experiment. We have observed a significant improvement in the immune system of the birds as a results of oral application of E. coli strain Nissle 1917. 8- Antagonistic effect of E. coli Nissle 1917 with and without plasmid on the growth rate of the S. Enteritidis PT4 in vitro was investigated. We concluded that E. coli Nissle 1917 with and without plasmid successfully reduced the growth rate of S. Enteritidis in comparison to the control one

El intestino de los mamíferos es uno de los ecosistemas más densamente poblados. Los microorganismos que lo habitan constituyen la denominada microbiota, que cumple importantes funciones para el huésped. Alteraciones en la composición de la microbiota pueden ser la base de diversas patologías, por ello la administración de probióticos se contempla como una estrategia preventiva o terapéutica. Con la finalidad de profundizar en aspectos moleculares de la comunicación microbiota-epitelio intestinal, hemos abordado estudios sobre las proteínas secretadas por la cepa probiótica E. coli Nissle 1917 (EcN). El objetivo de este trabajo fue abordar estudios encaminados a caracterizar el secretoma de la cepa EcN, establecer qué proteínas son secretadas a través de OMVs y proceder a la caracterización funcional de una de ellas. El análisis in silico del proteoma de OMVs, así como del secretoma global de la cepa EcN indican que las proteínas identificadas desempeñan funciones relacionadas con la adhesión, modulación del sistema inmune o supervivencia de la bacteria en nichos del huésped. El análisis protéomico de OMVs obtenidas en diferentes medios evidenciaron que el medio de crecimiento influye en la composición de las proteínas exportadas a través de vesículas, lo que puede repercutir en el tipo y diversidad de funciones asociadas a estas estructuras. Una de las proteínas identificada en el sobrenadante de cultivos de la cepa EcN en medio LB fue la proteína Sat (serin protease autotransporter toxin), codificada por un gen presente en la isla genómica II de esta cepa. Estudios previos habían descrito esta proteína sólo en cepas patógenas, no existiendo referencias sobre la función de Sat en la cepa probiótica. Por tanto, nuestro objetivo fue analizar si Sat es expresada en el tracto intestinal y secretada en forma activa por la cepa EcN. Con este análisis se pretendía establecer si Sat ha de ser considerada un factor de virulencia o, por el contrario, un factor fitness que contribuye a una mejor colonización a nivel intestinal. Los resultados obtenidos en este trabajo nos permitieron afirmar que Sat, no debe ser considerada un factor de virulencia. La proteína es secretada y expresada en forma funcional. Sin embargo, a pesar de poseer actividad serin proteasa y actuar sobre la permeabilidad paracelular, este último efecto es compensado por otros componentes secretados por la cepa probiótica. La proteína Sat, no parece estar implicada en la formación de biofilms, ni posee actividad citotóxica sobre células Caco-2 polarizadas. Estudios de colonización en modelos murinos permitieron establecer además que Sat no es requerida para la colonización intestinal. Sin embargo quedó demostrado tanto en modelos in vivo como en modelos de competición in vitro en crecimiento planctónico, que la cepa EcNsat::cm es capaz de desplazar a la EcN wild type, además de desplazar más eficientemente a una cepa enteropatógena como EPEC.
Microorganisms that inhabit the mammalian intestine are called microbiota, which performs important functions for the host. Changes in microbiota composition are the basis of various pathologies. Thus, probiotic administration is seen as a preventive or therapeutic strategy. To deep in molecular aspects of probiotic/ intestinal epithelium cross-talk, we addressed studies to characterize proteins secreted by the probiotic E. coli Nissle 1917 (EcN). Proteomic analysis of outer membrane vesicles (OMVs) and the global secretome of EcN indicated that the identified proteins perform functions related to adhesion, immune system modulation or bacterial survival in host niches. Proteomic analysis of OMVs showed that the growth medium influences the protein composition of these vesicles, which can affect the type and variety of functions associated with these structures. One protein identified in the EcN secretome was Sat (serine protease autotransporter toxin). This protein has been proposed to act as a virulence factor in pathogens but its role in probiotic strains has not been addressed so far. Our aim was to characterize Sat from EcN to establish whether it is a virulence or a fitness factor that contribute to better colonization of gut. Our results show that Sat is expressed and secreted as an active serine protease. Its effect on paracellular permeability seems to be compensated by other factors secreted by this probiotic. Moreover, Sat does not display cytotoxic activity on polarized Caco-2 cells. Analysis of biofilm formation and studies using murine models allowed us to establish that Sat is not required for intestinal colonization. However, in vivo colonization competition experiments showed that the EcNsat::cm outcompete the wild type strain. In vitro experiments confirmed that EcNsat::cm is able to displace in planktonic growth wild type EcN as well as enteropathogenic E. coli (EPEC). Results presented rule out that Sat is a virulence factor in strain EcN.

L’implantation d'Escherichia coli dans l’intestin résulte de stratégies adaptatives globales permettant à la bactérie de survivre face aux changements de conditions environnementales. Sur le plan métabolique, la colonisation de l’intestin par E. coli parait associée à la disponibilité de sources de carbone préférentielles glycolytiques, alors que la maintenance et la persistance reposent sur sa capacité à utiliser différents substrats alternatifs (principalement gluconéogéniques) lorsque les substrats préférentiels deviennent limitant. Cette activation des processus gluconéogéniques, qui implique une réorganisation fonctionnelle complète du métabolisme, est associée in situ à de profonds remaniements physiologiques (perte de motilité, formation de biofilms, etc) nécessaires à la persistance d'E. coli dans l’intestin. Ces différents processus sont coordonnés par des réseaux de régulation particulièrement complexes, dont le système Csr (Carbon storage regulator), un des principaux régulateur post-transcriptionnel d'E. coli. Lors de ces travaux, nous avons analysé le rôle du système Csr dans la nutrition carbonée et le contrôle du métabolisme central d'E. coli sur des sources de carbone supportant sa croissance dans l'intestin et représentatives des principales voies de son métabolisme central (glycolyse, voie des pentoses phosphate, voie d'Entner-Doudoroff cycle de Krebs). Cette étude a été réalisée chez deux souches d'E. coli présentant des capacités d'implantation distinctes : la souche de laboratoire K12 MG1655, et la souche Nissle 1917, un excellent colonisateur appartenant au groupe phylogénétique B2. Une analyse détaillée du fonctionnement métabolique par des approches systémiques quantitatives haut-débit (métabolomique et analyse des flux métaboliques par marquage isotopique) a été mise en place. Elle a été exploitée pour caractériser finement le comportement métabolique de souches sauvages et de mutants du système Csr d'E. coli sur différentes sources de carbone, identifier des caractères métaboliques propres à chaque souche, et étendre le rôle du système Csr dans la nutrition carbonée et dans le contrôle du métabolisme central d'E. coli. Nos résultats démontrent que i) Csr favorise l'utilisation d'un large spectre de sources de carbone aussi bien glycolytiques que gluconéogéniques, ii) Csr contrôle un nombre de voies métaboliques plus important que ce que l'on pourrait attendre à partir de ses cibles identifiées, et iii) que le contrôle global exercé par le système Csr sur le fonctionnement du métabolisme central dépend de la source de carbone. Un rôle du système Csr dans le contrôle du métabolisme redox (production de NADH et de NADPH) et énergétique (production d'ATP), non reporté à ce jour, est également démontré. Enfin, nos résultats suggèrent un rôle de Csr dans le contrôle de la balance anabolisme-catabolisme d'E. coli. Ces travaux renforcent le rôle potentiel du système Csr dans l'adaptation d'E. coli face aux changements de conditions environnementales
The implantation of Escherichia coli in the gut results from global adaptive strategies that allow the bacteria to survive in the changing environment of the intestine. At the metabolic level, recent findings indicate that colonisation is mainly related to the utilization of sugars and sugar derivatives through glycolytic pathways. In contrast, persistence of E. coli in the gut is supported by less favorable substrates, including small organic acids. The use of the latter compounds requires activation of gluconeogenic pathways, and efficient switching between glycolytic and gluconeogenic carbon sources is likely to be a major feature of successful adaptation to life in the intestine. These adaptive processes are controlled by highly sophisticated regulatory networks, such as the Csr (carbon storage regulator) system which is the main post-transcriptional regulator in E. coli. Csr was found to control a broad range of phenotypes allowing E. coli to successfully implant and persist in the gut, such as biofilm formation, motility as well as many functions involved in carbon nutrition, including glycolysis, gluconeogenesis, acetate and glycogen metabolism. Although Csr is likely to play an important role in the adaptation of bacteria to the nutritional context of the host, it is poorly understood sofar. In this work, we investigate the role of the Csr system in the control of E. coli metabolism on physiologically-relevant carbon sources representative of the main glycolytic (Entner-Doudoroff pathway, pentose phosphate pathway, glycolysis) and gluconeogenic pathways of E. coli. This work was carried out on two E. coli strains with distinct implantation capabilities : the K12 MG1655 laboratory strain and the Nissle 1917strain, an efficient colonizer of the gut belonging to the highly competitive B2phylogenetic group. First, we designed a complete methodology (metabolomics and 13C-metabolic flux analysis) for quantitative, system-level investigations of the actual operation of E. coli metabolism. Then, we performed detailed, system-level investigations of wild-type strains and Csr mutants. This work provides valuable information regarding systemic properties of E. coli metabolism, and identifies metabolic specificities of the Nissle 1917strain likely involved in its competitiveness in the gut. The role of Csr appears to be qualitatively and quantitatively the same in both K12 MG1655 and Nissle 1917 strains. We show that i) Csr enhances the utilisation of a broad spectrum of glycolytic and gluconeogenic carbon sources, ii) Csr controls a range of metabolic pathways wider than expected from its known target enzymes, and iii) the actual impact of the Csr system on the central metabolism of E. coli depends on the carbon source. We also demonstrate that Csr controls energy and redox metabolism in E. coli. Csr enhances the production of ATP and of reduced cofactors (NADH and NADPH), and we suggest that it also may control the catabolism-anabolism balance in E. coli. Finally, our results reinforce the potential role of the Csr system in the global adaptation of the bacterium to the gut environment

The inflammatory bowel diseases (IBD) are chronic inflammatory processes that affect the gut of susceptible individuals. One of its main forms, ulcerative colitis (UC), is restricted to the colonic mucosa and is characterized clinically by weight loss, rectal bleeding and diarrhea. Such manifestations present periods of remissions and relapses, and there is no cure. The attention now to the treatment of UC is facing probiotics, among which Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) deserves great prominence by presenting comparable effects to the drug of choice in the treatment of mild to moderate UC, mesalazine. The aim of this study was to evaluate the effect of the EcN probiotic in a murine model of UC induced by Dextran Sulfate Sodium (DSS). For this, we used female BALB/c mice with induced colitis (3.5% DSS solution) for 7 days. There was a significant improvement between the groups treated and not treated with the probiotic in clinical signs of disease. The inflammatory state generated was significantly reduced, with a decrease in the recruitment of neutrophils and eosinophils to the focus of inflammation, without, however, observed changes in the levels of macrophages. The intestinal permeability, which is typically increased during the onset of IBD, tended to a reduction after treatment with EcN. Histological analysis regarding the preservation of the intestinal epithelium, the beneficial effect of the probiotic can be observed in 67% of the samples (n 2 in 3).No difference was observed in the rates of reactive oxygen species produced in DSS model after the treatment with the probiotic. The analyzis showed that the probiotic EcN model has beneficial effect in acute UC, however further analysis are necessary in order to investigate the mechanisms by which this effect is realized.
As doenças inflamatórias intestinais (IBD) são processos inflamatórios crônicos que acometem o intestino de indivíduos susceptíveis. Uma de suas principais formas, a colite ulcerativa (UC), restringe-se à mucosa colônica e apresenta como principais sinais clínicos perda de peso, sangramento retal e diarreia. Tais manifestações clínicas apresentam períodos de remissões e recidivas, não existindo cura. A atenção atualmente para o tratamento da UC está voltada para os probióticos, dentre os quais a Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) merece grande destaque por apresentar efeitos comparáveis ao da droga de escolha no tratamento da UC branda ou moderada, a mesalazina. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito probiótico da EcN em modelo murino de UC induzida por sulfato de sódio dextrano (DSS). Para isso, utilizamos fêmeas de camundongos BALB/c, com indução de colite (solução de DSS 3,5%) durante sete dias. Observou-se uma melhora significativa do grupo tratado, em comparação ao não tratado com o probiótico, em relação aos sinais clínicos da doença. O estado inflamatório gerado foi significativamente reduzido, com diminuição no recrutamento de neutrófilos e eosinófilos para o foco de inflamação, sem, entretanto, observar alteração nos níveis de macrófagos. A permeabilidade intestinal, que está tipicamente aumentada durante o acometimento das IBD, mostrou uma tendência a redução após o tratamento com a EcN. Na análise histológica referente a preservação do epitélio intestinal, o efeito benéfico do probiótico pode ser observado em 67% do n amostrado (n 2 em 3). Nenhuma diferença foi observada nas taxas de espécies reativas de oxigênio produzidas no modelo de DSS após o tratamento com o probiótico. As análises permitiram concluir que o probiótico EcN possui efeito benéfico em modelo agudo de UC, entretanto mais análises são necessárias a fim de se investigar os mecanismos pelos quais tal efeito é desempenhado.

Escherichia coli are bacteria found in bowels of warm blooded animals. Most subspecies are harmless and part of the normal gut flora. However, E. coli have the ability to exchange genetic material with other bacteria, and some E. coli have acquired genes coding for virulence factors. VTEC, E. coli with the ability to produce verotoxin are commonly found in cattle, but certain types can cause severe disease in humans, known as enterohaemorrhagic E. coli, EHEC.     In this study, isolates of E. coli and other bacteria in the family Enterobacteriaceae from calves were subtyped and clustered using MALDI-TOF. Ten strains were selected for experimental competition analysis against E. coli MG1655.     The aim of the study was to identify strains of bacteria with the potential to outcompete VTEC in the cattle host and decrease the risk of human infections.     Three of the bacterial strains were able to outcompete the laboratory strain, and in future studies these strains can be analysed when competing against VTEC. The rest of the strains were outcompeted. Four known strains of VTEC were analysed competing the laboratory strain, showing weak ability to compete. Finally, a highly pathogenic strain of VTEC was analysed against Escherichia coli Nissle 1917, known for its ability to outcompete many strains of bacteria. Nissle could not outcompete the tested VTEC strain under the tested conditions.     In conclusion the majority of the bacterial strains isolated from calves were identified as E. coli and three of the isolates showed good ability to compete against the laboratory strain.

Probiotics are defined as live microorganisms that confer beneficial effects to health when administered in a sufficient amount. In previous studies about the beneficial effects of probiotic bacteria to health, particularly in the fields of intestinal mucosa defence responses, specific probiotics, in a strain-dependent manner, show some potential to reinforce the integrity of intestinal epithelium and/or regulate some immune components. However, the mechanisms involved in the interactions between probiotics or bioactive components of probiotics with the intestinal epithelium are still not yet clearly defined or systematically studied. Among all possible routes of modulation by probiotics of intestinal epithelial cell–mediated defence responses, modulations of mucin and trefoil factor expression as well as the cytokine profiles are important components of the innate and adaptive mucosal immune responses of the intestinal epithelial cells and are considered to play important role in the intestinal defence responses against pathogenic bacteria. This thesis examined and characterized the in vitro modulation effects by metabolic products of two commonly studied probiotics bacterial strains, Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) and Escherichia coli Nissle 1917 (EcN), on the intestinal epithelial cell-mediated defence responses. It was found that the metabolic products of EcN decreased the transcriptional levels of secretory mucins MUC5AC, MUC5B and MUC2 while LGG metabolic products only down-regulated that of MUC5AC. In partial agreement with the reduction of mucin gene expression levels, intracellular MUC5B and MUC2 mucin expression was reduced by EcN metabolic products and MUC5AC and MUC2 by the metabolic products of LGG. In contrast, the extracellular MUC5AC and MUC2 mucin expression tended to increase upon the effects of both LGG and EcN metabolic products, which might result from accumulative effects of the modulation on extracellular mucin secretion during the time of treatment or the differential responsiveness of cellular mucin gene and protein expression upon stimulation. The expression of trefoil factor 3 in both gene and protein levels upon the effects of EcN metabolic products while those of LGG enhanced the transcriptional but not protein level. As for the modulation of cytokine profiles, LGG metabolic products mainly influence the secretion of anti-inflammatory cytokines such as IL-4, IL-5 and IL-10 in a moderate manner while EcN metabolic products exerted broad pro-inflammatory potential to the intestinal epithelial cells by inducing the secretion of pro-inflammatory cytokines such as IL-8, MCP-1, TGF-α, TNF-α and GM-CSF, which indicated that the metabolic products of LGG and EcN might initiate differential signaling pathway to influence the intestinal epithelial adaptive immune responses. To conclude, the present research provides evidence to substantiate that LGG and EcN display differential modulation mechanisms of the intestinal epithelial cell-mediated defence responses that involve intestinal-cell mediated mucin and trefoil factor secretion as well as pro- and anti-inflammatory cytokine expression.
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Biological Sciences
Master
Master of Philosophy

碩士
南臺科技大學
生物科技系
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Trehalose is a nonreducing disaccharide formed by an α,α-1,1-glycosidic bond between two glucose molecules.Its sources include bacteria, yeast, fungi, insects, invertebrates, and plants, and it exhibits important biological functions in organisms, such as providing a source of energy and carbon and protecting organisms against environmental stresses such as drought, freezing, high temperature, and high salinity. These properties have broadened the application value of trehalose in the food, cosmetics, and pharmaceutical industries. Trehalose synthase converts maltose into trehalose in a single step through an intramolecular conversion reaction. Maltose is a cost-effective and easily obtained substrate that has great potential for industrial production of trehalose using trehalose synthase. Escherichia coli Nissle 1917 is classified as a probiotic and does not have endotoxins, in contrast to other E. coli strains; therefore, developing it as a host for expressing recombinant proteins would have high applicability. The present study constructed the T7 expression system in E. coli Nissle 1917 and used it to express recombinant thermostable trehalose synthase. In addition, the difference between this system and the pET system was evaluated, and this recombinant enzyme was used for trehalose biosynthesis. In addition, to achieve enzyme immobilization, we attached a chitin-binding domain (ChBD) gene to the N-terminus or the C-terminus of the trehalose synthase gene and evaluated the efficacy of enzyme immobilization. The results showed that using E. coli Nissle 1917 as an expression host for biosynthesis of thermostable trehalose synthase and constructing a trehalose conversion process have great potential for commercial development.

Shiga toxin produzierende E. coli (STEC) stellen mit einer Infektionsdosis von gerade einmal 100 Bakterien ein großes Risiko für unsere Gesundheit dar. Betroffene Patienten können milde Krankheitssymptome wie wässrigen Durchfall aufweisen, welcher sich allerdings zu blutigem Durchfall oder dem hämolytisch urämischen Syndrom (HUS) weiterentwickeln kann. Die Ursache für das Krankheitsbild ist das zytotoxische Protein Shiga-Toxin (Stx), welches von STEC Stämmen produziert wird, eukaryotischen Zellen angreift und den apoptotischen Zelltod induziert. Es konnte gezeigt werden, dass infizierte Patienten in ihrem Krankheitsverlauf stark variieren, was unter anderem auf die Zusammensetzung ihrer Mikrobiota zurückzuführen sein könnte. Diesbezüglich können zum Beispiel einige Bakterien bereits die Darmbesiedlung von STEC Stämmen unterbinden, wohingegen andere die Toxin Produktion der pathogenen Stämme beeinflussen und wieder andere von den stx tragenden Phagen infiziert werden können und daraufhin selbst zu Toxin produzierenden Stämmen werden. Da die genetischen Informationen für das Toxin auf einem Prophagen im Genom der STEC Stämme kodiert ist, führt eine Antibiotika Behandlung von infizierten Patienten zwar zum Tod der Bakterien, hat allerdings auch einen Wechsel vom lysogenen zum lytischen Phagen Zyklus und damit einen enormen Anstieg an freigesetztem Stx zur Folge. In den letzten Jahrzehnten kam es immer wieder zu Epidemien mit STEC Stämmen, welche auch einige Todesopfer forderten. Die Behandlung von Patienten erfolgt auf Grund von mangelnden Behandlungsmöglichkeiten meist nur symptomatisch, weswegen neue Strategien für die Behandlung einer STEC Infektion dringend benötigt werden. Der probiotische E. coli Stamm Nissle 1917 (EcN) zählt bereits seit mehr als 100 Jahren als Medikament für Behandlungen von Darmentzündungen. In vitro und in vivo Studien mit dem probiotischen Stamm und STEC Stämmen konnten zeigen, dass EcN die Produktion von Stx unterdrückt und gleichzeitig die STEC Zellzahl reduziert. Diese Ergebnisse waren der Anlass für diese Studie in der die Auswirkungen von EcN auf STEC Stämme genauer untersucht wurden, um eine mögliche Behandlung von STEC Infektionen mit dem Probiotikum zu gewährleisten. Eines der Hauptziele dieser Studie war es, herauszufinden, ob EcN von stx-Phagen infiziert werden kann und damit selbst zu einem Toxin Produzenten wird. In diesem Falle wäre eine Behandlung mit dem E. coli Stamm ausgeschlossen, da es den Krankheitsverlauf verschlimmern könnte. Verschiedene experimentelle Ansätze in denen versucht wurde den YaeT stx-Phagen Rezeptor tragenden Stamm zu infizieren schlugen fehl. Weder mittels PCR Analysen, Phagen Plaque Assays oder der Phagen Anreicherung konnte eine Lyse oder eine Prophagen Integration nachgewiesen werden. Transkriptom Analysen konnten zeigen, dass Gene eines lambdoiden Prophagen in EcN in Anwesenheit von stx-Phagen stark reguliert sind. Auch andere E. coli Stämme, welche sich ebenfalls durch eine Resistenz gegenüber einer stx-Phagen Infektion auswiesen, wurden positiv auf lambdoide Prophagen untersucht. Einzig dem stx-Phagen sensitiven K-12 Stamm MG1655 fehlt ein kompletter lambdoider Prophage, weswegen die Vermutung nahe liegt, dass ein intakter lambdoider Prophage vor der Superinfektion mit stx-Phagen schützten kann. In weiteren Experimenten wurde der Einfluss der Mikrozin-negativen EcN Mutante SK22D auf STEC Stämme untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass SK22D nicht nur die Produktion des zytotoxischen Proteins unterdrückt, sondern auch mit der Produktion der stx-Phagen von allen getesteten STEC Stämmen interferiert (O157:H7, O26:H11, O145:H25, O103:H2, O111:H- und zwei O104:H4 Isolate vom STEC Ausbruch in Deutschland im Jahr 2011). Transwell Studien konnten zeigen, dass der Faktor, welcher die Transkription des Prophagen unterdrückt, von SK22D sekretiert wird. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die Präsenz von SK22D den lysogenen Zustand des Prophagen stützt und somit den lytischen Zyklus unterdrückt. Da stx-Phagen eine große Gefahr darstellen andere E. coli Stämme zu infizieren, haben wir uns in weiteren Studien dem Einfluss von EcN auf isolierte Phagen gewidmet. Die Kultivierungsexperimente von EcN mit Phagen zeigten, dass der probiotische Stamm in der Lage war die stx-Phagen in ihrer Effizienz der Lyse des K 12 Stammes MG1655 von~ 1e7 pfus/ml auf 0 pfus/ml nach einer 44 stündigen Inkubation zu inaktivieren. Diese Inaktivierung konnte auf die Aktivität eines hitzestabilen Proteins, welches in der stationären Wachstumsphase synthetisiert wird, zurückgeführt werden. Studien welche einen Anstieg der Biofilmmasse zur Folge hatten zeigten eine gesteigerte Effizienz in der Phagen Inaktivierung, weswegen Komponenten des Biofilms möglicherweise die Phagen Inaktivierung herbeiführen. Neben dem direkten Einfluss auf die Phagen wurde auch ein Schutzeffekt von SK22D gegenüber dem stx-Phagen empfänglichen K 12 Stämmen untersucht. Lysogene K 12 Stämme zeichneten sich durch eine enorme Stx und stx-Phagen Produktion aus. Die Präsenz von SK22D konnte den K 12 vermittelten Anstieg der pathogenen Faktoren unterbinden. Transwell Ergebnisse und Kinetik Studien lassen vermuten, dass SK22D eher die Phagen Infektion von K-12 Stämmen unterbindet als die Lyse von lysogenen K-12 Stämmen zu stören. Eine mögliche Erklärung für den Schutz der K-12 Stämme vor einer stx-Phagen Infektion könnte darin liegen, dass die K-12 Stämme innerhalb der SK22D Kultur wachsen und dadurch von den infektiösen Phagen abgeschirmt werden. Zusammenfassend konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass der probiotische Stamm EcN sowohl die Lyse von STEC Stämmen unterdrückt als auch die infektiösen stx-Phagen inaktiviert und sensitive E. coli Stämme vor der Phagen Infektion schützen kann. Diese Ergebnisse sollten als Grundlage für in vivo Studien herangezogen werden, um eine mögliche Behandlung von STEC infizierten Patienten mit dem Probiotikum zu gewährleisten
Shiga toxin producing E. coli strains (STEC) are a great concern to human health. Upon an infection with as few as 100 bacteria, humans can develop disease symptoms ranging from watery to bloody diarrhea or even develop the hemolytic uremic syndrome (HUS). The major factor contributing to the disease symptoms is Shiga toxin (Stx) which can bind to the eukaryotic cells in the intestine of the human and induce cell death via apoptosis. Based, among other things, on the microbiota composition, the impact of STEC can vary. Some bacteria of the microbiota can interfere with the colonization of STEC strains in the first place. Others cannot impair the colonization but interfere with the toxin production and there are still others which are even infected by stx encoding phages, being released from STEC strains. Those previously harmless bacteria subsequently contribute to the toxin increase and worsen the disease progression. Since the genetic information of Stx is encoded on a prophage, antibiotic treatment of patients can lead to an increased toxin and stx-phage release and is therefore not recommended. Several STEC epidemics in different countries, which even resulted in the death of some patients, demonstrated that there is an urgent need for alternative treatment strategies. The E. coli strain Nissle 1917 (EcN) has been used as a probiotic to treat gastrointestinal infections for more than 100 years. It harbors several fitness factors which contribute to the establishment of an intact intestinal barrier in the human gut. Moreover, studies with EcN unraveled that the probiotic E. coli can interfere with the colonization of STEC strains and their toxin production. This study aimed to investigate if EcN could be a possible alternative or supplementary treatment strategy for STEC infected patients, or a preventive treatment for the patient’s close contact persons. Therefore, EcN was firstly investigated for a possible stx-prophage integration into its’s genome which would eliminate it from being a potential treatment due to the possibility of disease worsening. Despite the presence of the stx-phage surface receptor YaeT, EcN demonstrated a complete resistance towards the lysis and the lysogeny by stx-phages, which was proven by PCR, phage-plaque assays and phage enrichment approaches. Transcriptome data could unravel that a lambdoid prophage in the genome of EcN is involved in the resistance towards the phage infection. Other commensal E. coli tested presented a stx-phage resistance as well and in silico analysis revealed that all of them harbor a complete lambdoid prophage besides the stx-phage susceptible K-12 strain MG1655. We assume that the resistance of EcN towards a stx-phage infection is connected to the presence of an intact lambdoid prophage which interferes with superinfection. Further experiments regarding the impact of the microcin negative EcN mutant SK22D towards STEC strains depicted that SK22D did not only interfere with the toxin production but also negatively regulated the transcription of the entire stx-prophage in coculture with all STEC strains tested (O157:H7, O26:H11, O145:H25, O103:H2, O111:H- and two O104:H4 isolates from the 2011 outbreak in Germany). This influence on the pathogenic factor production was evinced to be cell contact independent as SK22D could even interfere with the pathogenic factor production when being separated from the STEC strain EDL933 by a Transwell membrane with the pore size of 0.4 µm. From this data we concluded, that factor(s) released by SK22D interfere with the lysis of STEC strains by stabilizing the lysogenic state. Another positive aspect of EcN towards the pathogenicity of STEC strains was encountered when EcN was incubated with isolated stx-phages. The probiotic strain could reduce the infectivity of the phages towards a MG1655 lysis from ~ 1e7 pfus/ml to 0 after 44 h of incubation. Various approaches to determine the characteristics of the factor(s) of EcN which are involved in the phage inactivation depicted it to be a heat resistant stationary phase protein on the surface of EcN, which could be a component of its biofilm. Regarding the protective role of EcN we could further evince that SK22D was capable of interfering with the lysogenic K 12 mediated increase of Stx and stx phages. Lysogenic K-12 strains were characterized by a huge increase of Stx and stx-phage production. The presence of SK22D anyhow, could interfere with this K-12 mediated pathogenic factor increase. Transwell and stx phage infection kinetics led to the proposal that SK22D interfered with the stx-phage infection of K-12 strains in the first place rather than disturbing the lysis of lysogenic K 12. The protection from the phage infection could be due to the growth of K 12 strains within the SK22D culture, whereby the phage susceptible strains are masked from phage detection. Summarizing, this work could underline the beneficial attributes of EcN towards the STEC pathogenicity in vitro. These results should be considered as pioneers for future in vivo studies to enable EcN medication as a supportive STEC infection treatment strategy

Der probiotische Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) ist eines der wenigen Probiotika, die als aktive Komponente eines Medikaments in mehreren Ländern zugelassen sind. Am besten ist die Wirksamkeit des EcN für die Remissionserhaltung von an Colitis Ulcerosa leidenden Patienten dokumentiert. Diese Fähigkeit ist vermutlich darauf zurückzuführen, dass EcN in der Lage ist die Produktion des humanen beta-Defensins 2 (HBD2) mittels seiner Flagelle zu Induzieren. In dieser Studie wurden rekombinante EcN Stämme konstruiert, die ein Defensin zu produzieren vermögen. Zu diesem Zweck wurden Kodon-optimierte Defensingene in Expressionsplasmidvektoren kloniert, die entweder die Proform mit der Signalsequenz oder die reife Defensinform des humanen -Defensins 5 (HD5) oder des humanen -Defensins 2 (HBD2) unter der Kontrolle des T7-Promotors kodieren. Die Synthese dieser Defensine wurde mittels Western-Blot nach der Induktion der Expression und der Lyse der rekombinanten EcN Stämme demonstriert. Das rekombinante reife HBD2 mit einem N-terminalen His-Tag konnte mittels Ni-Säulen-Chromatographie aufgereinigt werden. Das so gewonnene HBD2 zeigte antimikrobielle Aktivität gegen E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes. In einem zweiten Ansatz wurde der Teil des HBD2-Gens mit dem yebF-Gen fusioniert, der das reife HBD2 kodiert. Das resultierende Fusionsprotein YebFMHBD2 wurde von dem entsprechenden EcN Stamm nach Induktion der Expression sekretiert. Die Präsenz von YebFMHBD2 im Medium war nicht das Ergebnis von Zellyse wie Western-Blots spezifisch für die -Galaktosidase und das Maltose-Bindeprotein mit dem Kulturüberstand zeigten. Dieser Kulturüberstand inhibierte das Wachstum von E. coli, Salmonella enterica Serovar Typhimurium und Listeria monocytogenes nach Dialyse und Aufkonzentration sowohl in Agardiffusionsassays als auch in Flüssigcokultur. Damit konnte gezeigt werden, dass EcN ein für die Produktion von bestimmten humanen Defensinen geeignetes Probiotikum darstellt. EcN ist bei der Behandlung von Morbus Crohn Patienten nicht aktiv. Dies ist vermutlich in der genetisch bedingten Unfähigkeit zur ausreichenden Defensinproduktion solcher Individuen begründet. Als ein erster Schritt in der Entwicklung von alternativen Ansätzen zur Behandlung Morbus Crohn Patienten wurden in dieser Arbeit EcN Stämme konstruiert, die in der Lage sind HD5 oder HBD2 zu produzieren
The probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (EcN) is one of the few probiotics licensed as a medication in several countries. Best documented is its effectiveness in keeping patients suffering from ulcerative colitis (UC) in remission. This might be due to its ability to induce the production of human beta defensin 2 (HBD2) in a flagellin-dependent way in intestinal epithelial cells. In contrast to ulcerative colitis, for Crohn´s disease (CD) convincing evidence is lacking that EcN might be clinically effective, most likely due to the genetically based inability of sufficient defensin production in CD patients. As a first step in the development of an alternative approach for the treatment of CD patients, EcN strains were constructed which were able to produce human alpha-defensin 5 (HD5) or beta-defensin 2 (HBD2). For that purpose codon-optimized defensin genes encoding either the proform with the signal sequence or the mature form of human alpha defensin 5 (HD5) or the gene encoding HBD2 with or without the signal sequence were cloned in an expression vector plasmid under the control of the T7 promoter. Synthesis of the encoded defensins was shown by Western blots after induction of expression and lysis of the recombinant EcN strains. Recombinant mature HBD2 with an N-terminal His-tag could be purified by Ni-column chromatography and showed antimicrobial activity against E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes. In a second approach, that part of the HBD2-gene which encodes mature HBD2 was fused with yebF gene. The resulting fusion protein YebFMHBD2 was secreted from the encoding EcN mutant strain after induction of expression. Presence of YebFMHBD2 in the medium was not the result of leakage from the bacterial cells, as demonstrated in the spent culture supernatant by Western blots specific for ß-galactosidase and maltose-binding protein. The dialyzed and concentrated culture supernatant inhibited the growth of E. coli, Salmonella enterica serovar Typhimurium and Listeria monocytogenes in radial diffusion assays as well as in liquid coculture. This demonstrates EcN to be a suitable probiotic E. coli strain for the production of certain defensins

Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) gehört zu den am besten untersuchten und charakterisierten probiotischen Bakterienstämmen. Seit Beginn des letzten Jahrhunderts wird er als Medikament eingesetzt, um verschiedene Darmerkrankungen wie z.B. Diarrhöe, entzündliche Darmerkrankungen und Verstopfung zu behandeln. Die Flagelle des EcN vermittelt Beweglichkeit und kann die Produktion von humanem β-Defensin 2 (hBD2) durch Epithelzellen induzieren. Somit ist dieses Organell direkt in die probiotische Funktion des EcN involviert. Es konnte gezeigt werden, dass die Flagellen anderer Bakterien, wie z.B. dem probiotischen Stamm Bacillus cereus CH oder den pathogenen Stämmen Pseudomonas aeruginosa und Clostridium difficile, die Adhäsion an intestinalen Mucus, welcher von Epithelzellen sekretiert wird, vermitteln. Allerdings blieb unklar, welcher Teil der Flagelle an welche Mucuskomponente bindet. Die Fähigkeit effizient an Wirtgewebe zu adhärieren wird als wichtiges Attribut eines probiotischen Stammes angesehen. Ex vivo Adhäsionsstudien mit Kryoschnitten humaner Darmbiopsien haben gezeigt, dass die Flagelle des EcN in die effiziente Adhäsion an humanes Darmgewebe involviert sein muss. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit die Funktion der Flagelle des EcN als Adhäsin untersucht. Zunächst wurde die hyperflagellierte Variante EcN ATHF isoliert und durch verschiedene Experimente, z.B. Schwärmagartests und Elektronenmikroskopie, charakterisiert. Weitere ex vivo Adhäsionsstudien mit EcN ATHF zeigten eine höhere Adhäsionseffizienz dieser hyperflagellierten Variante und bestätigten damit die Rolle der Flagelle bei der effizienten Adhäsion von EcN an die Kryoschnitte der humanen Darmbiopsien. Interessanterweise fungierte die Flagelle in in vitro Studien mit den humanen Epithelzellen Caco-2 und T24 nicht als Adhäsin. Diese Unterschiede zwischen den in vitro und ex vivo Studien führten zu der Annahme, dass die Flagelle des EcN in vivo die Adhäsion an Mucus vermittelt, welcher von den Caco-2- und T24-Zellen nicht produziert wird, aber in den Kryoschnitten der Darmbiopsien nachgewiesen wurde. Diese Vermutung wurde durch in vitro Adhäsionsstudien mit der Mucin-produzierenden Epithelzelllinie LS174-T bestätigt, da die Flagellen für eine effektive Adhäsion an diese Zellen essentiell waren. Zudem reduzierte die Präinkubation flagellierter EcN-Stämme mit Mucin2 ihre Adhäsionseffizienz an Kryoschnitte humaner Darmbiopsien. Um die direkte Interaktion zwischen Flagellen des EcN Wildtyps und Mucus zu zeigen, wurde ein ELISA etabliert. Es konnte eine direkte konzentrationsabhängige Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und Mucin2, bzw. humanem Mucus (Kolon) beobachtet werden. Interessanterweise konnte keine Interaktion zwischen isolierten Flagellen des EcN Wildtyps und murinem Mucus (Duodenum, Ileum, Caecum, Colon) festgestellt werden. Dies weist darauf hin, dass die Mucuszusammensetzung zwischen verschiedenen Spezies variiert. Verschiedene Kohlenhydrate, welche bekannte Mucusbestandteile sind, wurden auf ihre Interaktion mit der Flagelle von EcN getestet und Gluconat wurde als ein Rezeptor identifiziert. Die Präinkubation isolierter Flagellen mit Gluconat reduzierte ihre Interaktion mit Mucin2, bzw. humanem Mucus signifikant. Zudem wurde die oberflächenexponierte Domäne D3 des Flagellins, der Hauptuntereinheit der Flagelle, als möglicher Interaktionspartner von Mucin2, bzw. humanem Mucus ausgeschlossen. Flagellen, die aus einer Domäne D3 Deletionsmutante isoliert wurden, zeigten sogar eine effizientere Bindung an Mucin2, bzw. humanen Mucus. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Änderungen des pH-Wertes signifikante Effekte auf die Interaktion zwischen Mucus und isolierten Flagellen hatten, vermutlich aufgrund von Konformationsänderungen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Flagelle als neues und scheinbar wichtigstes Adhäsin in vivo für den probiotischen Stamm EcN identifiziert. Hierfür wurden sowohl eine hyperflagellierte Variante, eine ΔfliC Mutante, sowie der dazugehörige komplementierte Stamm verwendet. EcN ist zudem der erste probiotische Stamm für den eine direkte Bindung der Flagellen an humanen Mucus nachgewiesen werden konnte. Die Mucuskomponente Gluconat konnte dabei als wichtiger Rezeptor identifiziert werden. Da einige pathogene Bakterien ihre Flagelle zur Adhäsion an Wirtsgewebe nutzen, könnte dieses Organell EcN dazu befähigen, mit Pathogenen um die erfolgreiche Kolonisierung des Darms zu konkurrieren, was als wichtige Eigenschaft eines Probiotikums betrachtet wird
Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) is one of the best studied and characterized probiotic bacterial strains. It is in use as a drug since the beginning of last century to treat various diseases and dysfunctions of the human intestinal tract, e.g. diarrhea, inflammatory bowel diseases and obstipation. The flagellum of EcN mediates motility and is able to induce human beta defensin 2 (hBD2) production by epithelial cells. Therefore, this organelle is directly involved in EcN’s probiotic function. It has been shown that the flagella of several other bacteria, including the probiotic strain Bacillus cereus CH or the pathogenic strains Pseudomonas aeruginosa and Clostridium difficile, mediate adhesion to intestinal mucus, which is secreted by epithelial cells. However it remained unclear which part of the flagella binds to which mucus component. The ability to adhere efficiently to host tissue is considered to be an important attribute for a probiotic strain. Ex vivo adhesion studies with cryosections of human gut biopsies have revealed, that the flagellum of EcN must be involved in efficient adhesion to human intestinal tissue. Thus, the function of EcN’s flagellum as an adhesin was investigated in this work. First, the hyperflagellated variant EcN ATHF was isolated and characterized by several experiments, e.g. motility tests and electron microscopy. Further ex vivo adhesion studies with EcN ATHF demonstrated a higher adhesion efficiency of this hyperflagellated variant confirming the role of the flagellum for adhesion of EcN to cryosections of human gut biopsies. Interestingly, EcN’s flagellum did not function as an adhesin in in vitro adhesion studies with the human epithelial cells Caco-2 and T24. These differences between the in vitro and ex vivo studies led to the assumption, that in vivo the flagellum of EcN mediates adhesion to mucus, which is not produced by Caco-2 and T24 cells, but was shown to be present in the cryosections of human gut biopsies. This was confirmed by in vitro adhesion studies with the mucin-producing epithelial cell line LS174-T, as flagella were essential for efficient adhesion to these cells. Furthermore, preincubation of flagellated EcN strains with mucin2 (porcine stomach) reduced their adhesion effiency to cryosections of human gut biopsies. To demonstrate the direct interaction between flagella from EcN wildtype and mucus, an ELISA was established. A direct concentration-dependent interaction between isolated flagella from EcN wildtype and mucin2 as well as human mucus (Colon) could be observed. In contrast, there was no direct interaction between isolated flagella from EcN wildtype and murine mucus (Duodenum, Ileum, Ceacum, Colon), indicating that mucus composition varies among different species. By testing different carbohydrates - known to be constituents of mucus - for their interaction with the flagellum of EcN, gluconate was identified as one receptor. Preincubation of isolated flagella with gluconate significantly reduced their interaction with mucin2 or human mucus. Additionally, the surface exposed domain D3 of flagellin, the major subunit of the flagellum, could be excluded to be responsible for the interaction with mucin2 or human mucus. Flagella, which were isolated from a domain D3 deficient mutant, bound even more efficient to mucin2 as well as to human mucus. Furthermore the change of pH had significant effects on the interaction between mucus and isolated flagella, probably due to conformational changes. In summary, this study identified the flagellum as a novel and apparently major adhesin in vivo of the probiotic EcN by employing a hyperflagellated variant, a ΔfliC mutant as well as the corresponding complemented strain. Additionally, EcN is so far the first probiotic strain, for which it has been shown, that its flagella directly bind to human mucus. Thereby the mucus component gluconate was identified as an important receptor. As some pathogens have been reported to use their flagella for adhesion to human host tissue, this organelle might enable EcN to compete with pathogens for successful colonization of the gut, which has been postulated to be a prerequisite for probiotics

In the last years more than one hundred microbial genomes have been sequenced, many of them from pathogenic bacteria. The availability of this huge amount of sequence data enormously increases our knowledge on the genome structure and plasticity, as well as on the microbial diversity and evolution. In parallel, these data are the basis for the scientific “revolution” in the field of industrial and environmental biotechnology and medical microbiology – diagnostics and therapy, development of new drugs and vaccines against infectious agents. Together with the genomic approach, other molecular biological methods such as PCR, DNA-chip technology, subtractive hybridization, transcriptomics and proteomics are of increasing importance for research on infectious diseases and public health. The aim of this work was to characterize the genome structure and -content of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H31) and to compare these data with publicly available data on the genomes of different pathogenic and non-pathogenic E. coli strains and other closely related species. A cosmid genomic library of strain Nissle 1917 was screened for clones containing the genetic determinants contributing to the successful survival in and colonization of the human body, as well as to mediate this strain’s probiotic effect as part of the intestinal microflora. Four genomic islands (GEI I-IVNissle 1917) were identifed and characterized. They contain many known fitness determinants (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), as well as novel genes of unknown function, mobile genetic elements or newly identified putative fitness-contributing factors (Sat, Iha, ShiA-homologue, Ag43-homologues). All islands were found to be integrated next to tRNA genes (serX, pheV, argW and asnT, respectively). Their structure and chromosomal localization closely resembles those of analogous islands in the genome of uropathogenic E. coli strain CFT073 (O6:K2(?):H1), but they lack important virulence genes of uropathogenic E. coli (hly, cnf, prf/pap). Evidence for instability of GEI IINissle 1917 was given, since a deletion event in which IS2 elements play a role was detected. This event results in loss of a 30 kb DNA region, containing important fitness determinants (iuc, sat, iha), and therefore probably might influence the colonization capacity of Nissle 1917 strain. In addition, a screening of the sequence context of tRNA-encoding genes in the genome of Nissle 1917 was performed to identify genome wide potential integration sites of “foreign” DNA. As a result, similar “tRNA screening patterns” have been observed for strain Nissle 1917 and for the uropathogenic E. coli O6 strains (UPEC) 536 and CFT073. I. Summary 4 The molecular reason for the semi-rough phenotype and serum sensitivity of strain Nissle 1917 was analyzed. The O6-antigen polymerase-encoding gene wzy was identified, and it was shown that the reason for the semi-rough phenotype is a frame shift mutation in wzy, due to the presence of a premature stop codon. It was shown that the restoration of the O side-chain LPS polymerization by complementation with a functional wzy gene increased serumresistance of strain Nissle 1917. The results of this study show that despite the genome similarity of the E. coli strain Nissle 1917 with the UPEC strain CFT073, the strain Nissle 1917 exhibits a specific set of geno- and phenotypic features which contribute to its probiotic action. By comparison with the available data on the genomics of different species of Enterobacteriaceae, this study contributes to our understanding of the important processes such as horizontal gene transfer, deletions and rearrangements which contribute to genome diversity and -plasticity, and which are driving forces for the evolution of bacterial variants. At last, the fim, bcs and rfaH determinats whose expression contributes to the mutlicellular behaviour and biofilm formation of E. coli strain Nissle 1917 have been characterized
Bislang wurden die kompletten Genomsequenzen von mehr als 100 Bakterien ermittelt. Mehr als ein Drittel dieser Organismen wird als pathogen eingestuft. Die Verfügbarkeit dieser Sequenzinformation vergrößert unser Wissen über die bakterielle Genomstruktur und – plastizität sowie über mikrobielle Diversität und Evolution. Diese Daten bilden die Grundlage für viele Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologie, der industriellen-, Umwelt- und medizinischen Mikrobiologie: neuartige Typisierung-, Diagnostik- und Therapieansätze sowie die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe basieren auf und profitieren von der ständig zunehmenden Menge an DNA-Sequenzen. Genomanalysen sind zusammen mit anderen molekularbiologischen Methoden wie PCR, DNA-Chiptechnologie, subtraktive Hybridisierung und Proteomanalysen von zunehmender Bedeutung für die Erforschung von Infektionskrankheiten und das öffentliche Gesundheitswesen. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Genomstruktur und des Genominhaltes des apathogenen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1) und der Vergleich mit verfügbaren Daten verschiedener pathogener und apathogener E. coli Stämme sowie anderer eng-verwandter Spezies. Eine Cosmid-Genbank des Stammes Nissle 1917 wurde nach Klonen durchsucht, die für Fitnessfaktoren kodieren, welche zur erfolgreichen Kolonisierung des menschlichen Verdauungstraktes und zum probiotischen Charakter dieses Stammes beitragen. Vier genomische Inseln (GEI I-IVNissle 1917) wurden nachgewiesen und charakterisiert. Auf diesen GEIs befinden sich verschiedene bekannte Fitness-Determinanten (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), bislang nicht charakterisierte ORFs, mobile genetische Elemente und bislang für den Stamm Nissle 1917 nicht beschriebene Gene, die möglicherweise zur Fitness und Adaptabilität dieses Stammes beitragen. Die GEIs I-IVNissle 1917 sind jeweils mit einem tRNAGen assoziiert und ähneln hinsichtlich ihrer Struktur und chromosomalen Lokalisation entsprechenden Inseln im Genom des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 (O6:K2(?):H1). Interessanterweise fehlen auf diesen wichtige Virulenzgene uropathogener E. coli (hly, cnf, prf/pap). Eine etwa 30 kb große Region der GEI IINissle 1917, die von IS2 Elementen flankiert wird, kann spontan deletieren, was zum Verlust verschiedener Fitnessdeterminanten (iuc, sat, iha) führt. Darüber hinaus wurde der chromosomale Sequenzkontext von tRNA-Genen mittels PCR auf die Integration von „Fremd-DNA“ hin untersucht, die durch horizontalen Gentransfer erworben wurde (tRNA Screening), und mit denen anderer apathogener und pathogener E. coli Stämme verglichen. Der genomweite Anteil an tRNA-Gen-assoziierter, möglicherweise horizontal erworbener DNA, die im I. Summary 2 apathogenen E. coli K-12 Stamm MG1655 fehlt, unterschied sich dabei nicht bedeutend im Stamm Nissle 1917 und den uropathogenen E. coli O6 Stämmen CFT073 und 536. Die Verbreitung von DNA-Regionen der GEIs des Stammes Nissle 1917 wurde mittels PCR bei apathogenen E. coli-Isolaten sowie bei uropathogenen E. coli O6:K5-Isolaten untersucht. Nur zwei UPEC O6:K5-Isolate enthielten alle GEI-Bereiche, die in diese Untersuchung einbezogen waren, unterschieden sich jedoch vom Stamm Nissle 1917 durch ihre Phänotypen. Die Makrorestriktionsanalyse der Genomstruktur des E. coli Stammes Nissle 1917 zeigte, daß letztere der des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 sehr ähnelt. Um die Ursache für den semi-rauhen Phänotyp des Stammes Nissle 1917 zu untersuchen, wurden die wa* und wb* Determinanten dieses Stammes, die für die LPS-Biosynthese verantwortlich sind, kloniert und sequenziert. Das bislang unbekannte Serotyp O6-spezifische O-Antigenpolymerase-kodierende Gen wzy des Stammes Nissle 1917 wurde charakterisiert und mit dem des rauhen O6 Stammes 536 verglichen. Eine Punktmutation, die zu einem vorzeitigen Translationsstop der wzy-Transkripte des Stammes Nissle 1917 führt, wurde als Ursache für den semi-rauhen Phänotyp und damit auch die Serumsensitivität dieses Stammes verantwortlich gemacht. Zur Untersuchung der Kolonisierungsfähigkeit des E. coli Stammes Nissle 1917 wurden verschiedene Faktoren, die an der Biofilmbildung bzw. am multizellulären Verhalten beteiligt sind, sequenziert und näher analysiert. Die Seqenzierung der fim Determinante zeigte, daß das fimB Gen, das für die Expression der Typ 1-Fimbrien benötigt wird, durch die Insertion eines IS-Elementes inaktiviert wurde. Untersuchungen zum multizellulären Verhalten zeigten, daß der Stamm Nissle 1917 den sogenannten „rdar“ Morphotyp, hervorgerufen durch Expression von Curli-Fimbrien und Cellulose, bei 30 °C und bei 37 °C exprimiert, nicht jedoch die uropathogenen E. coli Stämme 536 und CFT073. Das Cellulosebiosynthese-Operon (bcs) sowie das Gen rfaH, das für einen Transkriptionsantiterminator kodiert, wurden im Stamm Nissle 1917 inaktiviert, um deren Bedeutung für den „rdar“ Morphotyp zu untersuchen. Während Cellulose für die Expression des „rdar“ Morphotyps benötigt wird, hatte die rfaHInaktivierung keinen Einfluß auf dieses mulizelluläre Verhalten des E. coli Stammes Nissle 1917. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß der apathogene E. coli Stamm Nissle 1917 durch eine spezifische Kombination phänotypischen Eigenschaften gekennzeichnet ist, die ihn von anderen bislang untersuchten E. coli Stämmen unterscheidet. An der Evolution dieses Stammes, möglicherweise aus einem pathogenen „Vorfahren“, waren vielfältige Gentransfer- und Deletionsprozesse sowie Punktmutationen beteiligt

E. coli Nissle 1917 (EcN) zählt durch seine fast hundertjährige Nutzung als Arzneimittel und aufgrund der weitreichenden Forschung während der letzten Jahrzehnte mittlerweile zu einem der am besten untersuchten Probiotika. EcN wird als Medikament zur Remissionserhaltung von Patienten mit Kolitis, bei chronischer Verstopfung und bei Durchfall von Kleinkindern eingesetzt. Der enteroaggregative – hämorrhagische - E. coli (EAHEC) mit dem Serotyp O104:H4 war 2011 in Deutschland für den bisher größten EHEC-Ausbruch seit Beginn der Aufzeichnungen verantwortlich. Es fehlt bis zum heutigen Tage immer noch an effektiven Möglichkeiten einer Infektionsprophylaxe oder einer Behandlung der Erkrankung. Ein alternatives Therapeutikum wird daher dringend benötigt. In dieser Arbeit wurden die antagonistischen Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme wie dem EHEC Stamm EDL933 oder klinischen EAHEC O104:H4 Isolaten untersucht. Es wurden die Auswirkungen von EcN auf die Adhäsion an humane Epithelzellen, das Wachstum und die Shiga Toxin Produktion der pathogenen Stämme untersucht. Zusätzlich wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen nachgewiesen. Zunächst wurde die Adhäsionseffizienz der verschiedenen E. coli Stämme bestimmt. Der am schlechtesten an die humanen Epithelzelllinien Caco-2 und LS-174T adhärierende Stamm war EcN. Dies ist insofern überraschend, da von Probiotika erwartet wird, besser als Pathogene an Epithelzellen zu adhärieren. Dem ungeachtet konnte jedoch gezeigt werden, dass EcN die Adhäsion von zwei EAHEC O104:H4 Isolaten, des nahe verwandten enteroaggregativen E. coli (EAEC) Stammes 55989 und des enterohämorrhagischen (EHEC) E. coli Stammes O157:H7 EDL933 an beide Zelllinen hemmt. Die von EcN produzierten Mikrozine M und H47 konnten hier für einen Teil des beobachteten anti-adhäsiven Effektes von EcN auf die pathogenen E. coli Stämme verantwortlich gemacht werden. Die Mikrozine wurden hier als einzige Substanz, die das Wachstum der pathogenen E. coli Stämme beeinflusst, identifiziert. Einer der wichtigsten Virulenzfaktoren von EAHEC und EHEC Stämmen ist das Shiga Toxin. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass EcN die Shiga Toxin Produktion der am häufigsten auftretenden EHEC Stämme (´Big Five´: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) und der klinischen Isolate von EAHEC O104:H4 im Zellkulturmedium DMEM hemmt. Auffällig war, dass die Stx1 Produktion von EHEC O103:H2 und O111:H- nicht nur von EcN, sondern auch von E. coli K-12 Stamm MG1655, gehemmt wurde, im Gegensatz zur EcN-spezifischen Blockierung der Stx2-Produktion in den Serotypen O104:H4, O26:H11, O145:H25. Die Reduktion der Stx-Produktion in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, sowie EHEC O26:H11 war zum Teil von der Mikrozinproduktion abhängig. Diese hatte jedoch keinen Einfluss auf die Stx-Produktion in EHEC O157:H7 EDL933 und EHEC O145:H25. Bei Verwendung von LB-Medium zeigte sich im Gegensatz zum DMEM-Medium keine Mikrozin-Abhängigkeit der Toxinproduktion bei den EAHEC Isolaten TY3730 und TY3456. Die Toxinproduktion von EHEC EDL933 wurde ebenfalls nicht durch die Deletion der Mikrozin-Gene in EcN beeinflusst. Studien der Toxinproduktion in SCEM-Medium zeigten ebenfalls eine EcN-Dosisabhängige Reduktion der Stx-Produktion in Co-Kultur. Um den Mechanismus der Hemmung der Stx-Produktion zu untersuchen, wurden Versuche mit der EcN-Mutante EcN::luxS durchgeführt. Diese Deletion des AI-2 ´Quorum sensing´ Moleküls in EcN hatte allerdings keinen Einfluss auf die Hemmung der Stx-Produktion. Der Einsatz von Acetat führte, im Gegensatz zu publizierten Ergebnissen, nicht zu einer Reduktion der Stx-Produktion. Auch eine Beeinflussung der Lyse der EHEC-Bakterien, oder der Verminderung der Sekretion von Shiga Toxin durch EcN, konnte widerlegt werden. Zur Untersuchung der Stx-Expression wurde ein Assay mit einem biolumineszenten C-P (Chromosom-Plasmid) Reporter System etabliert. Damit konnte die Shiga Toxin Expression im Stammhintergrund EHEC EDL933 in Echtzeit untersucht werden. Hier wurde wiederum eine Reduktion der Shiga Toxin Expression in Co-Kultur mit EcN erfolgreich nachgewiesen. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass EcN nicht nur die Shiga Toxin Produktion von nicht-induzierten EAHEC Bakterien, sondern auch in mit Mitomycin C induzierten Bakterien hemmt. Als wichtiger Sicherheitsaspekt einer Behandlung mit EcN wurde die Resistenz von EcN gegenüber Shiga Toxin Phagen untersucht. Die Infektion der Bakterien wurde hierbei mit stx-spezifischer PCR, Phagen-Plaque-Assay, Stx-ELISA und K+-Efflux Assay untersucht. Es konnte durch diese verschiedenen Methoden erfolgreich gezeigt werden, dass EcN nicht durch Shiga Toxin Phagen infiziert wird. Als möglicher Resistenzmechanismus kommt hier eine Mutation vom Phagenrezeptor LamB in Frage, was jedoch noch bestätigt werden muss. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit wichtige antagonistische Effekte von EcN auf pathogene E. coli Stämme untersucht, die als Grundlage von neuen und dringend benötigten Behandlungen von EHEC-Infektionen dienen können
Due to extensive studies in the last decades and its centennial application as a pharmaceutical, E. coli Nissle 1917 (EcN) is among the best characterized probiotics. EcN is used as remedy for remission maintenance of ulcerative colitis, chronic obstipation and diarrhea in children. The enteroaggregative – haemorrhagic - E. coli (EAHEC) strain O104:H4 was responisible for one of the biggest outbreaks of EHEC recorded so far, that took place in Germany in 2011. Currently, there is no effective prophylaxis or treatment available for EHEC infections in humans. Therefore, alternative therapeutics are desperately needed. The antagonistic effects of EcN on pathogenic E. coli strains like the EHEC O157:H7 strain EDL933 or clinical isolates of EAHEC O104:H4 were investigated in this study. The influence of EcN on adhesion to human epithelial cell lines, the growth and the Shiga toxin production of pathogenic strains were analysed. Furthermore, the resistence of EcN against Shiga toxin phages was proven. Initially, the adhesion efficiency of EcN and pathogenic E. coli strains were determined in monocultures. EcN showed the lowest number of adhering bacteria to Caco-2 and LS-174T cells. This was insofar surprising, since probiotics are expected to adhere more efficiently to epithelial cells than pathogens. Regardless of this fact, it could be shown that EcN is inhibiting the adhesion of two EAHEC O104:H4 isolates, the closely related EAEC strain 55989 and the EHEC O157:H7 strain EDL933 to both cell lines. The microzins M and H47, which are produced by EcN, can be held responsible for a fraction of the observed anti-adhesive effect of EcN. The Microzins were also identified as the only substance that was influencing the growth of the pathogenic E. coli strains. One of the most important virulence factors of EHEC and EAHEC strains is Shiga toxin. In this study could be shown, that EcN is inhibiting the Shiga toxin production of the most common EHEC strains (big five: O157:H7, O26:H11, O103:H2, O111:H-, O145:H25) and two clinical isolates of EAHEC O104:H4 in the cell culture medium DMEM. Interesingly, the Shiga toxin 1 production of EHEC O103:H2 and O111:H- was not only reduced by EcN, but also the E. coli K-12 strain MG1655. In contrast, the Stx2 production of the serotypes O104:H4, O26:H11, O145:H25 was only blocked by EcN. The reduction of the Shiga toxin production in EAHEC O104:H4 TY3730 und TY3456, as well as EHEC O26:H11 was partly dependent on the microcin production of EcN. No influence of microzins on the Stx production of EHEC O157:H7 EDL933 and EHEC O145:H25 was detected. When using LB-medium instead of DMEM-medium, no influence of microzin on the Shiga toxin production of neither EAHEC TY3730 and TY3456, nor EHEC EDL933 could be shown. Experiments with SCEM-medium also resulted in an EcN-dose-dependent inhibition of Shiga toxin production of pathogenic E. coli strains in co-culture with EcN. In order to investigate the mechanism responsible for the observed effects, the EcN mutant EcN::luxS was used in co-culture experiments. However, the deletion of the quorum sensing molecule AI-2 in EcN::luxS had no influence on the Stx production. Using acetate in the experiments did not, in contrast to published results, lead to a reduction of Shiga toxin production. In addition, an influence of EcN on lysis of EHEC strains or the secretion of Shiga toxin could be ruled out. To study the Shiga toxin expression an assay with a bioluminescent C-P (chromosome-plasmid) reporter system was successfully established. Here, Shiga toxin expression could be monitored in real time with the strain background EHEC EDL933. Moreover, a reduction of Shiga toxin expression in co-culture with EcN could be detected. In further experiments could be shown, that EcN is not only reducing the Shiga toxin production in uninduced bacteria, but also in the Mitomycin C induced EAHEC O104:H4 strain TY3730. An important safety issue, in order to use EcN as a pharmaceutical against EHEC strains, is the resistance of EcN against Shiga toxin phages. The infection of bacteria was here investigated with phage plaque assay, stx-PCR, Stx-ELISA and K+-efflux assay. With these different methods could be successfully shown, that EcN is not infected by the tested Shiga toxin phages. A mutation in the phage receptor LamB could be a possible, but still unconfirmed, phage resistance mechanism of EcN. In summary, this study showed important antagonistic effects of EcN against pathogenic E. coli strains, which could be the foundation of new and desperately needed treatment options of EHEC infections

Durchfallerkrankungen unterschiedlicher Genese sind eine der häufigsten Vorstellungsgründe in der Kleintierpraxis. Neben den Folgen für das betroffene Tier selbst, ist die Erkrankung oft auch eine enorme Belastung für den Besitzer. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden erste grundlegende Erkenntnisse zum Einsatz des probiotisch wirksamen Escherichia coli Stamm Nissle 1917 (EcN) als Arzneimittel bei gastrointestinalen Störungen mit der Leitsymtomatik "Diarrhöe" bei der Tierart Hund gewonnen. Aus den vorliegenden Ergebnissen lässt sich ableiten, dass EcN in der Lage ist, die Magen-Darm-Passage bei solch erkrankten Hunden lebensfähig zu überwinden. Es wurde weiter gezeigt, dass EcN einem Placebo in der Behandlung eines akuten Durchfalls bei der Tierart Hund signifikant überlegen ist.

Gastrointestinal infections account for high morbidity and mortality in humans every year across the globe. The increasing emergence of antibiotic resistance among the gastrointestinal pathogens and the induction of virulence factors by antibiotics makes it highly risky to only depend on antibiotic therapy for intestinal infections. Most of these infections are associated with an imbalance in the gut microbial population whereas the restoration of the balance with probiotic supplements can result in an improvement of the health condition. Probiotics are therefore considered as successful support in the treatment of gastrointestinal infections. E. coli Nissle 1917 (EcN) is the active component of the probiotic medication Mutaflor® and has been used in the treatment of various gastrointestinal disorders for more than 100 years. Several studies have reported antagonistic effects of EcN against enterohemorrhagic E. coli (EHEC) in vitro and in vivo. However, detailed investigations on the probiotic mechanisms and safety aspects of EcN are a pre-requisite, for administering EcN to treat EHEC infected patients or to use EcN as a prophylactic for the patient’s close contacts. In this regard, the first part of the study aimed to understand the nature and behaviour of EcN in the presence of pathogenic or non-pathogenic E. coli strains. Transcriptomic analysis was deployed to this end. We investigated the changes in EcN’s transcriptome after different time points of coculture with the EHEC strain EDL933 or the K-12 strain MG1655. The transcriptome data reported a strain-specific response in EcN at all the investigated time points (3 h, 5 h, 7 h and 8 h) of coincubation. The alterations in gene regulation of EcN were highly pronounced in initial timepoints (3 h and 5 h) of coincubation with EDL933, which gradually decreased over time. In the presence of MG1655, the alterations were strongly differentially regulated only at later time points (7 h and 8 h). The unique transcriptional response of EcN towards two different E. coli strains, that are genetically more than 98 % identical, was startling. 12 More importantly, this can be considered as a beneficial trait of EcN over a chemical-pharmaceutical preparation like an antibiotic that might act identically on all target cells. Bacteriophages are one of the most abundant members of gut microbiota. On the one hand, the infection of a probiotic strain by a lysogenic phage could transfer genetic material coding for pathogenic factors or antibiotic resistance into an otherwise beneficial probiotic bacterium and thereby converting it into a virulent pathogenic bacterium. On the other hand, infection by a lytic phage could result in bacterial lysis and prevent the bacterium from exerting its probiotic effect. Thus, in order to successfully establish and colonise the gut, it is crucial for any probiotic to be resistant against phage infections. To address this, in the second part of the study, we investigated the phage resistance of EcN towards the lysogenic lambda and the lytic T4 phage. EcN showed complete resistance against tested phages and was also able to inactivate these phages upon coincubation. In the case of lambda phages, the resistance was attributed to the presence of a lambdoid prophage (prophage 3) in the genome of EcN. In addition, the overexpression of one of the early genes of EcN’s prophage 3 (i.e. phage repressor gene pr) in the phage sensitive MG1655 conferred partial protection against lambda phage infection. Moreover, the inactivation was mediated by binding of lambda phages to its receptor LamB. Experiments with lytic T4 phages revealed that the EcN’s K5 polysaccharide capsule was crucial for its T4 phage resistance, while its lipopolysaccharide (LPS) inactivated the T4 phages. Apart from protecting itself, EcN displayed even a protective role for the tested K-12 strains, by interfering with the lysogeny and lysis by these phages. In summary, this work highlights two novel positive traits of the probiotic strain EcN: i) the strain-specific response that was evident from the global transcriptome analysis of EcN when incubated with other E. coli strains, and ii) lytic and lysogenic phage resistance. Both these traits are additional safety aspects for a well-characterised probiotic strain and encourage its application in therapeutics
Gastrointestinale Infektionen sind jedes Jahr weltweit für eine hohe Morbidität und Mortalität beim Menschen verantwortlich. Das zunehmende Auftreten von Antibiotikaresistenzen bei gastrointestinalen Pathogenen und die Induktion von Virulenzfaktoren durch Antibiotika machen es hoch riskant Darminfektionen ausschließlich mit Antibiotika zu behandeln. Die meisten gastrointestinalen Infektionen sind mit einem Ungleichgewicht in der mikrobiellen Darmpopulation verbunden, während die Wiederherstellung des Gleichgewichts mit Probiotika zu einer Verbesserung des Gesundheitszustands führen kann. Daher gelten Probiotika als hilfreiche Unterstützung bei der Behandlung von Magen-Darm-Infektionen. E. coli Nissle 1917 (EcN) ist der aktive Bestandteil des probiotischen Medikaments Mutaflor® und wird seit mehr als 100 Jahren zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt. Mehrere Studien haben über die antagonistische Wirkung von EcN gegenüber enterohämorrhagischer E. coli (EHEC) sowohl in vitro als auch in vivo berichtet. Detaillierte Untersuchungen zu den probiotischen Mechanismen und Sicherheitsaspekten von EcN sind jedoch Voraussetzung für eine mögliche Verabreichung von EcN zur Behandlung von EHEC-infizierten Patienten oder für die Verwendung von EcN als Prophylaxe für den engsten Umkreis der infizierten Patienten. In dieser Hinsicht zielte der erste Teil dieser Studie darauf ab, die Natur und das Verhalten von EcN in Gegenwart von pathogenen oder nicht-pathogenen Bakterienstämmen zu verstehen. Zu diesem Zweck wurden die Veränderungen im Transkriptom von EcN nach verschiedenen Zeitpunkten der Co-Kultur mit dem EHEC-Stamm EDL933 oder dem K-12 Stamm MG1655 untersucht. Die Transkriptomdaten zeigten eine stammspezifische Reaktion von EcN zu allen untersuchten Zeitpunkten (3 h, 5 h, 7 h und 8 h) der Co-Inkubation. Die Veränderungen in der Genregulation von EcN waren zu den primären Zeitpunkten der Co-Kultur mit EDL933 (3 h und 5 h) sehr ausgeprägt und nahmen im Laufe der Zeit allmählich ab. Während der Co-Kultur mit MG1655 hingegen, kam es erst zu späteren Zeitpunkten zu einer starken Veränderung in der Genregulation (7 h und 8 h). Diese einzigartige transkriptionelle Reaktion von EcN auf zwei verschiedene E. coli Stämme, die genetisch zu mehr als 98 % identisch sind, war verblüffend. Diese Eigenschaft von EcN kann als vorteilhaft gegenüber einem chemisch-pharmazeutischen Präparat wie einem Antibiotikum angesehen werden, welches auf alle Zielzellen identisch wirken könnte. Bakteriophagen sind einer der häufigsten Bestandteile der Darm Mikrobiota. Durch die Infektion eines probiotischen Stammes mit einem lysogenen Phagen ist es möglich, dass genetisches Material, das für pathogene Faktoren oder Antibiotikaresistenzen kodiert, übertragen wird und das Probiotikum dadurch zu einem virulent pathogenen Bakterium umgewandelt wird. Darüber hinaus könnte die Infektion durch einen lytischen Phagen zur Lyse des Probiotikums führen wodurch seine probiotische Wirkung unterbunden werden würde. Für eine erfolgreiche Besiedlung des Darms ist es daher für Probiotika entscheidend gegenüber Phagen Infektionen resistent zu sein. Um dieses Problem anzugehen, wurde im zweiten Teil der Studie die Phagen Resistenz von EcN gegenüber dem lysogenen Phagen Lambda und dem lytischen Phagen T4 untersucht. EcN zeigte eine vollständige Resistenz gegenüber den getesteten Phagen und konnte darüber hinaus die Phagen während der Co-Inkubation inaktivieren. Bei den Lambda-Phagen konnte die Resistenz auf das Vorhandensein eines Lambda-Prophagen (Prophage 3) im Genom von EcN zurückgeführt werden. Dies wurde durch das Ergebnis, dass die Überexpression eines der frühen Gene von EcNs Prophagen 3 (dem Phagen-Repressor pr) im Phagen sensitiven K-12 Stamm MG1655 zu einem partiellen Schutz gegenüber einer Lambda-Phagen Infektion führte, gestützt. Die Inaktivierung der Lambda-Phagen hingegen wurde durch die Bindung der Phagen an EcNs Rezeptor LamB vermittelt. Experimente mit lytischen T4-Phagen konnten aufzeigen, dass die K5-Polysaccharid Kapsel von EcN entscheidend für seine T4-Phagenresistenz ist, EcNs Lipopolysaccharid (LPS) wiederum die T4-Phagen inaktiviert. Abgesehen davon, dass EcN sich selbst vor Phagen Infektionen schützt, konnte gezeigt werden, dass EcN eine Phagen initiierte Lysogenie oder Lyse der getesteten K-12-Stämme verhindert. Zusammenfassend hebt diese Arbeit zwei neue positive Eigenschaften des probiotischen Stammes EcN hervor: i) die stammspezifische Reaktion, die sich aus der globalen Transkriptomanalyse von EcN während der Inkubation mit anderen E. coli-Stämmen ergab, und ii) die lytische und lysogene Phagenresistenz. Beide Merkmale sind zusätzliche Sicherheitsaspekte eines bereits gut charakterisierten probiotischen Stammes und unterstützen seine therapeutische Anwendung