Academic literature on the topic 'Electroforesis'

Este artículo presenta una revisión de las técnicas y algoritmos aplicados al procesamiento y análisisde imágenes de electroforesis bidimensional (2DGE). La electroforesis bidimensional permite separar cientos de proteínas en un único gel, mostrando un patrón característico. En el análisis de imágenes es importante una correcta detección de las proteínas presentes, ya que cualquier error en esta etapa puede llevar a la detección de falsas proteínas, o a obviar proteínas importantes, pero de baja abundancia, lo cual afectaría los resultados del análisis. Técnicas de segmentación son empleadas para separar las proteínas del fondo y encontrar anomalías. Los métodos empleados para la segmentación de imágenes 2DGE se pueden clasificar como: basados en detección de bordes, morfológicos, umbralización y basados en regiones. En muchos estudios proteómicos se hace necesario la fusión o registro de imágenes para la identificación y comparación de patrones de varias muestras diferentes. Para este proceso de fusión se pueden usar las imágenes originales o los resultados de la segmentación. A pesar de los avances significativos en el campo de procesamiento de imágenes 2DGE, no se encuentran en la literatura métodos completamente automatizados. Las herramientas comerciales disponibles para el análisis y procesamiento de imágenes 2DGE requieren que el usuario seleccione adecuadamente ciertos parámetros, de los cuales dependen los resultados arrojados por el software. Este artículo revisa diferentes técnicas para el procesamiento de las imágenes 2DGE. Especial atención es dada a las técnicas de segmentación y registro de imágenes.

Microsatellite markers or simple sequences repeats are DNA - based molecular techniques that areused to see the different among accessions and inbred lines. There are three methods to analysis the results ofthe polymerase chain reaction of microsatellite markers namely polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE),capillary electroforesis, and Metaphor Agarose Gel Electroforesis (MAGE), and the Use of MAGE assessedmore easily and economically the polymorphic pattern of DNA markers. This study aimed to obtain fast,effective and efficient in term of easy and cheap technique to identify microsatellite markers of some blackrice cultivars and F2 populations from crosses between black with white rice. The results showed that MAGEsuccessfully separated clearly SSRs alleles with different sizes of less than 25 bp .

Objetivo: Caracterizar las proteínas solubles que se encuentran en la raíz del Lepidium peruvianum G. Chacón, maca, mediante electroforesis unidimensional y electroforesis bidimensional. Diseño: Estudio de tipo observacional y transversal. Lugar: Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición Alberto Guzmán Barrón. Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Lima, Perú. Materiales: Raíces de Lepidium peruvianum G. Chacón ‘maca’ de los ecotipos blanco, amarillo y morado, procedentes de Junín que fueron obtenidas a través de la Universidad Nacional del Centro del Perú. Métodos: La extracción de las proteínas totales solubles se realizó con una solución antioxidante, seguida de electroforesis unidimensional y bidimensional para su caracterización. Principales medidas de resultados: Número de proteínas solubles, peso molecular de las proteínas y puntos isoelectricos de las proteínas más abundantes. Resultados: El análisis electroforético unidimensional mostró predominio de 2 proteínas (72% de las proteínas solubles totales). Una de 22,5 kDa, denominada en el presente trabajo ‘macatina’ (51% de la proteína total); la otra de 17,0 kDa (21% de la proteína soluble total). El mapa electroforético bidimensional mostró que tanto la ‘macatina’ como la proteína de 17,0 kDa son básicas y presentan 3 isómeros de carga que se distribuyen en un rango de punto isoeléctrico (pI) de 7,1 a 8,2. Conclusiones: Las proteínas solubles mostraron un patrón electroforético complejo, siendo la macatina la proteína más abundante.

La técnica de la electroforesis es fundamental en las investigaciones de las áreas científicas, en especial en la biotecnología, y es en esta área donde existe la necesidad de captar el interés de los adolescentes para proyectar futuros científicos que produzcan conocimientos biotecnológicos capaces de apoyar la creciente economía del país. En relación al equipamiento que esto requiere, las actuales soluciones son propias de la ingeniería avocándose sólo a la función primaria "hacer electroforesis", dejando fuera al usuario en su dimensión subjetiva. Es aquí donde la poesía del siseño requiere estar presente, porque claramente se identifica una carencia, que es la falta de un nexo que considere la integración del usuario.

En els últims anys ha augmentat el consum dels derivats sintètics de la catinona, un alcaloide que es troba de forma natural en les fulles del khat, ja que representen una alternativa més assequible i accessible respecte a altres drogues il·lícites més conegudes com les amfetamines. Després de ser consumits, aquests compostos es poden trobar en l'organisme ja sigui metabolitzats o en la seva forma pura a baixes concentracions. Per tant, solen ser necessaris mètodes altament sensibles per determinar aquestes substàncies en mostres biològiques com sang, cabell, saliva o, més comunament, orina. Les catinones presenten un centre quiral i, per tant, es poden trobar en dues formes enantiomèriques (R i S). Cada enantiòmer pot presentar un comportament farmacocinètic i farmacodinàmic diferent i, per tant, tenir diferents efectes en l'organisme. En conseqüència, la enantioseparació de les catinones sintètiques pot ser de gran utilitat. En aquest sentit, l'electroforesi capil·lar és una tècnica molt adequada per a aquest propòsit, ja que la enantioseparació es pot aconseguir simplement afegint un selector quiral a l'electròlit de separació.
En los últimos años ha aumentado el consumo de derivados sintéticos de la catinona, un alcaloide que se encuentra de forma natural en las hojas del khat, puesto que representan una alternativa más asequible y accesible respecto a otras drogas ilícitas más conocidas como las anfetaminas. Después de ser consumidos, estos compuestos se pueden encontrar en el organismo ya sea metabolizados o en su forma pura a bajas concentraciones. Por lo tanto, suelen ser necesarios métodos altamente sensibles para determinar estas sustancias en muestras biológicas como sangre, cabello, saliva o, más comúnmente, orina. Las catinonas presentan un centro quiral y, por tanto, se pueden encontrar en dos formas enantioméricas (R y S). Cada enantiómero puede presentar un comportamiento farmacocinético y farmacodinámico diferente y, por consiguiente, tener diferentes efectos en el organismo. En consecuencia, la enantioseparación de las catinonas sintéticas puede ser de gran utilidad. En este sentido, la electroforesis capilar es una técnica muy adecuada para este propósito, puesto que la enantioseparación se puede lograr simplemente agregando un selector quiral al electrolito de separación
In recent years, the consumption of synthetic derivatives of cathinone, an alkaloid naturally found in the leaves of the khat plant, has increased as they represent a more affordable and accessible alternative to other well-known illicit drugs such as amphetamines. After their consumption, these compounds can be found in the organism either metabolized or in their pure form at low concentrations. Therefore, highly sensitive methods are usually necessary to determine these substances in biological samples such as blood, hair, oral fluids, or, more commonly, urine. Cathinones present a chiral centre, so they can be found in two enantiomeric forms (R and S). Each enantiomer can present different pharmacokinetic and pharmacodynamic behaviour and have different effects on the organism. Consequently, the enantioseparation of synthetic cathinones can be very useful. In these sense, capillary electrophoresis represents an excellent technique for this purpose, since enantioseparation can be achieved simply by adding a chiral selector to the background electrolyte. However, despite of this and other well-known advantages of this analytical technique, one of its main limitations is its poor sensitivity

La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación basada en la migración diferencial de una mezcla de analitos bajo la acción del campo eléctrico. La CE ha sufrido una gran desarrollo a nivel de investigación en la última década pero su implantación a nivel industrial ha sido reducida. La gran variedad de productos y los numerosos controles que implica el control de calidad en la industria ha conducido al desarrollo de técnicas rápidas y con una amplia gama de aplicaciones como la CE. En esta tesis re realiza un estudio sobre la aplicación de esta técnica a campos diversos como el seguimiento de un proceso de oxidación de interés medioambiental o el establecimiento de nuevos métodos de análisis de productos farmacéuticos.

La oxidación de los blanqueantes ópticos utilizados en la industria textil o de la detergencia frente al hipoclorito de las lejías es una de las problemáticas analizadas. La CE se muestra como una técnica idónea para separar e identificar los productos de oxidación del blanqueante con la lejía y permite demostrar que se forman productos no clorados de bajo impacto medioambiental.

El control de calidad en la industria farmacéutica es especialmente riguroso porque el producto final está destinado a consumo humano. La determinación del contenido de principio activo, de impurezas relacionadas, la uniformidad de contenido por unidad de dosis o los tests de estabilidad son ensayos habituales en un laboratorio farmacéutico. El elevado poder de resolución de la CE la hace una técnica adecuada para este tipo de ensayos donde es habitual la separación de compuestos con una estructura química muy parecida. En esta memoria se aplica la técnica a la separación de ocho alquilxantinas usadas en la farmacopea española. El comportamiento electroforético de la mezcla ha sido estudiado y la conclusiones extraídas han sido aplicadas para proponer un método alternativo y ventajoso, respecto al cromatográfico, para el análisis de un fármaco que contiene tres alquilxantinas.
La industria farmacéutica necesita para la determinación de impurezas relacionadas con el principio activo (impurezas de síntesis o productos de degradación) una técnica con sensibilidad y poder de resolución suficiente. El contenido del enantiómero minoritario en principio activos enantioméricamente puros es un ejemplo de este tipo de ensayos. La CE es una técnica muy exitosa en el campo de las separaciones quirales por su alta eficacia y por la variedad de selectores quirales disponibles. La elección de este selector implica la realización de diversas pruebas de ensayo y error hasta encontrar un selector adecuado. En esta tesis se proponen algunos criterios relacionados con la estructura del analito que facilitan esta selección. Estos criterios se usan para la enantioseparación de Dopa y Ketoprofeno, dos principios activos comercializados en su forma enantioméricamente pura. Se desarrollan métodos de análisis en condiciones quirales y aquirales que permiten determinar, respectivamente, el contenido total de principio activo y del enantiómero minoritario. De todo lo anterior, se deduce que la CE es una técnica válida y en muchos casos ventajosa para desarrollar métodos de análisis para compuestos de interés medioambiental y farmacéutico.
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique based on differential migration of solutes in an electrical field. CE has been widely used in Univeristy investigations but its applications in the industry field are very reduced. CE is usually faster and more flexible compared with other separations techniques and those characteristics make CE a good alternative for quality control in industry. The goal of our work is to apply CE to develope methods for quality control in the textile and pharmaceutical industry.
The instability of fluorescent whitening agents (FWAS) with hypochlorite contained in bleach is a major issue in the textile industry. CE is a very useful technique to separate and to identify products formed during this oxidation. Results show that the products formed are not dangerous for the environment and contain no chlorine.
Quality control in the pharmaceutical industry is very rigorous because the final product is bound for humans. Active principle or related impurities determinations are usual assays in pharmaceutical companies. The high efficiency of electrophoretic separations make CE very suitable for the separation of compounds with a similar structure. In this way, CE has been used to study the electrophoretic behavior of a mixture of alkyl-xanthines used in pharmaceuticals. The conclusions obtained allow us to propose a new method applied for the quality control of a pharmaceutical containing three broncodillators.
The enantiomeric impurity contained in active principles marketed as single enantiomer is a determination that demands good resolution and sensitivity. CE is a very succesful technique for Chiral separations. Hoiwever, the most suitable chiral selector is usually elected by trial and error, wich is expensive and time-consuming. We propose some criteria for their election in terms of molecular size, charge and the presence of specific functional groups in the analyte with a view to minimizing the number of trials needed. These criterias has been used to propose new method to control the enantiomeric impurity in Dopa and Ketoprofen pharmaceuticals.
Taken all this into account, we conclude that CE is a valid and useful technique for investigations in environmental or pharmaceutical fields.

La combinació in-line de l'electroforesi capil·lar (CE) amb les tècniques tant en fase líquida com la single-drop microextraccion (SDME), i en fase sòlida com l'extracció en fase sòlida in-line (SPE), i la utilització de la pressureassisted electrokinetic injection (PAEKI) com a tècnica de preconcentració electroforètica, ha estat avaluada en el desenvolupament de mètodes basats en CE per a la determinació de diferents famílies de contaminants orgànics emergents (EOCs) en diferents tipus de mostres. Els resultats van mostrar que aquestes estratègies són adequades per millorar la sensibilitat de la CE, ja que d´una manera senzilla i automatitzada s´aconsegueixen elevats factors de preconcentració. Per tant, podem destacar que l'ús d'aquestes tècniques és una estratègia útil per determinar diferents tipus de mostres a baixos nivells de concentració.
La combinación in-line de la electroforesis capilar (CE) con las técnicas de microextracción tanto en fase líquida, como la single-drop microextraccion (SDME), y en fase sólida, como la extracción en fase sólida in-line (SPE), y la utilización de la pressure-assisted electrokinetic injection (PAEKI) como técnica de preconcentración electroforética, ha sido evaluada en el desarrollo de métodos basados en CE para la determinación de diferentes familias de contaminantes orgánicos emergentes (EOCs) en diferentes tipos de muestras. Los resultados mostraron que estas estrategias son adecuadas para mejorar la sensibilidad de la CE, debido a que de una manera simple y automatizada se consiguen elevados factores de concentración. Por lo tanto, podemos destacar que el empleo de estas técnicas es una estrategia útil para poder determinar diferentes tipos de analitos a bajos niveles de concentración.
The in-line combination of capillary electrophoresis (CE) with liquid microextration techniques, as single-drop microextraction (SDME), solid microextraction tecniques as, in-line solid phase extraction (SPE) and the use of pressure-assisted electrokinetic injection (PAEKI), as an electrophoretic preconcentration technique have been evaluated in the development of CE-based methods for the determination of different families of emerging organic pollutants (EOCs) in different kind of samples. The results showed that these strategies are adequate to improve the limited CE sensitivity, especially when it is used in combination with an ultraviolet detector is resolved in a simple and automatic easily. Therefore, we can emphasize that the use of these techniques is a useful strategy to improve the analysis of EOCs through CE.

El objetivo de éste estudio fue optimizar un método por Electroforesis Capilar de Zona para la determinación rápida de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en la matriz de tejido vegetal de hojas y raíces de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L.). Se compararon dos tratamientos de muestra diferentes para el aislamiento de los analitos de la matriz vegetal, se determinó los niveles de GSH y GSSG en plantas sometidas a estrés por cobre en dos periodos de tiempo (48 horas y 28 días) y se evaluó el efecto de cobre sobre la biomasa y los niveles de macronutrientes presentes en la planta. De los resultados obtenidos se concluye que: La optimización de los parámetros instrumentales, tales como largo de capilar, voltaje aplicado y polaridad de la fuente de poder, así como la optimización de los parámetros relacionados con el electrolito de corrida, tales como composición, concentración, pH y fuerza iónica permiten la separación de ambos analitos en un tiempo inferior a los tres minutos. Las condiciones óptimas fueron: polaridad de la fuente positiva, capilar de 40 cm de largo, voltaje de 20 kV, electrolito borato 300 mM, pH 7,6 y 30 segundos de inyección hidrostática de la muestra. El método optimizado para la matriz vegetal presenta una muy buena correlación entre área bajo la curva y concentración de GSH y GSSG, con coeficientes de correlación de 0,9995 y 0,9994, respectivamente. Los límites de detección fueron 2,75 y 1,68 µmol/L para GSH y GSSG y la recuperación del analito en el proceso fue de 105 y 87 %, respectivamente. En la etapa de tratamiento de la muestra, el uso de un método químico (ácido metafosfórico) es más efectivo que el uso de un método físico (copas de ultrafiltración) para el aislamiento de los analitos desde la matriz proteica. Esta efectividad se reflejo en un menor consumo de tiempo, mayor volumen de muestra obtenido y obtención de una matriz mas limpia. El tratamiento prolongado de las plantas con cobre se manifiesta en síntomas de toxicidad con una drástica disminución de la biomasa de la parte aérea y raíz, en asociación con un descenso de la concentración de potasio en ambos órganos. Este efecto no se observa en plantas tratadas por un periodo corto de tiempo con el metal. Los niveles de cobre alcanzados en la parte aérea y raíz correlacionan positivamente con la concentración de cobre aplicada en ambos tratamientos, siendo las concentraciones más altas observadas en la raíz El cobre aplicado a la planta modifica los niveles de glutatión reducido y oxidado tanto en el tratamiento crónico como en el agudo. El efecto más notorio se manifestó sobre el glutatión reducido contenido en la raíz. Este péptido decrece su concentración a medida que incrementa la concentración de cobre, siendo este efecto independiente de los cambios morfológicos que presenta la raíz y del lapso de tiempo en que el cobre fue aplicado. Los cambios producidos en los niveles de glutatión reducido y oxidado constituyen un buen indicador de la respuesta temprana al estrés por metal en plantas desarrolladas, expuestas a cobre por un periodo de tiempo corto (horas)

En la present tesi doctoral s’han estudiat i desenvolupat diferents sistemes de partició cromatogràfics per poder estimar diferents propietats de biopartició, tant d’interès ambiental com d’interès farmacèutic. La determinació d’aquestes propietats a partir dels mètodes tradicionals implica l’ús de procediments tediosos, d’un elevat cost i, sovint, èticament qüestionables, ja que s’utilitzen éssers vius. Per aquest motiu, l’ús de mètodes cromatogràfics (automatitzats, ràpids i relativament senzills) per estimar aquests paràmetres és d’un gran interès. Amb aquesta fi, s’han compilat diferents sistemes cromatogràfics i de biopartició que han estat caracteritzats a partir d’un mateix model el model de paràmetres de solvatació (SPM). Adicionalment, s’han desenvolupat i caracteritzat a partir del mateix model 4 sistemes cromatogràfics: 3 basats en liposomes i microemulsió de preparats de lecitina i un altre basat en una microemulsió formada per bromur de tetradeciltrimetilamoni (TTAB), 1-butanol i heptà. Tots aquests sistemes s’han comparat a partir dels coeficients normalitzats obtinguts de la caracterització pel SPM utilitzant un seguit d’eines matemàtiques i quimiomètriques. Com més similars són els coeficients normalitzats de l’equació de solvatació, més similars són els sistemes comparats. A continuació, per aquells sistemes cromatogràfics que, a priori, podrien subrogar un sistemes de biopartició d’interès, s’han establert correlacions entre la propietat biològica i el logaritme del factor de retenció del compost en el sistema cromatogràfic (k). Després d’avaluar els resultats obtinguts, es pot concloure que la toxicitat envers certs organismes aquàtics (Capgrossos, Fathead Minnow, Daphnia magna, Tetrahymena pyriformis i Streptococcus sobrinus), propietat d’interès mediambiental, pot subrogar-se a partir de 3 sistemes de cromatografia electrocinètica micel·lar i un sistema de cromatografia líquida de fase inversa. Pel que fa a la partició a la pell i la partició octanol-aigua, propietats d’interès farmacèutic, poden subrogar-se a partir de sistemes de cromatografia electrocinètica de microemulsions. Generalment, aquesta metodologia s’aplica a substàncies neutres i hi ha una manca d’estudis per a substàncies carregades. Però, tenint en compte que la majoria de fàrmacs són compostos àcid-base i que la forma iònica d’un compost presenta habitualment un comportament biològic i químic diferent del de la seva forma neutra, s’ha estudiat la idoneïtat de dos sistemes de cromatografia electrocinètica de microemulsions per estimar el coeficient de distribució octanol-aigua (Do/w) de compostos àcid-base ionitzats. A la literatura ja s’ha demostrat que existeix una bona correlació entre el logaritme del coeficient de partició octanol-aigua (Po/w) i el logaritme del factor de retenció de substancies neutres. Per avaluar la capacitat predictiva d’aquests sistemes per compostos àcid-base, s’han establert perfils k-pH en aquests sistemes per 14 àcids i bases monopròtics. Els resultats obtinguts indiquen que, per obtenir factors de retenció precisos, és recomanable evitar la presència de parells iònics utilitzant una microemulsió amb la mateixa càrrega de l’analit (en aquest cas dodecilsulfat de sodi pels anions i TTAB pels cations). També és necessari introduir un factor de correcció de la viscositat quan es calcula k. S’ha de tenir en compte que per calcular k per a compostos carregats s’ha de determinar la mobilitat electroforètica dels compostos amb i sense la presència de la microemulsió. Tenint en compte que la mobilitat electroforètica està inversament relacionada amb la viscositat, la mobilitat electroforètica pot variar en funció de la viscositat del medi on es mesuri. Tot seguit, a partir del perfils k-pH i de la recta log Po/w-log k establerta per compostos neutres, s’ha estimat el valor de log Do/w de compostos àcid-base a diferents valors de pH i s’ha comparat amb l’obtingut amb els mètodes tradicionals (principalment el mètode shake-flask). Els valors obtinguts a partir de les dues metodologies són similars quan el compost es troba a la seva forma neutra o parcialment ionitzat (fins el 99%), mentre que el log Do/w s’ha sobreestimat quan el compost es troba totalment ionitzat. Finalment, a la recerca de nous sistemes cromatogràfics que permetin estimar altres propietats de biopartició, es va realitzar una estada predoctoral a la Vrije Universiteit Brussel (VUB), situada a Brussel·les (Bèlgica). Durant aquest temps es va desenvolupar una columna monolítica basada en un polímer d’estirè-co-divinilbenzè, la qual es va caracteritzar per a la separació de proteïnes a partir de cromatografia líquida de fase inversa per formació de parells iònics.
The determination of biological properties usually implies expensive and complex procedures which sometimes require the use of living beings, a practice ethically questionable. Thus, the use of physicochemical systems that emulate biopartitioning processes would allow the estimation of biological properties in a faster and automated way avoiding in vivo testing. In the present work, chromatographic and biopartitioning systems characterized in previous works through a same model (the solvation parameter model (SPM)) have been compiled, adding the new developed and characterized systems in the present study. Then, all the systems have been compared using the normalized coeficients resulting from their characterization through the SPM. Finally, correlations between the biological property of interest and the logarithm of the retention factor determined in the best surrogating chromatographic system have been established. The results have shown that toxicity to aquatic species, skin partition, and the octanol-water partition systems can be surrogated employing chromatographic systems based on reserved-phase liquid chromatography and electrokinetic chromatography. Moreover, since there is a lack of studies regarding ionizable solutes, the feasibility of this methodology to estimate biopartitioning properties for ionized compounds have also been evaluated. Particularly, in the present work, the estimation of the octanol-water distribution coefficient of ionized acid-base substances has been studied. With this aim, retention factor-pH profiles have been established for a set of monoprotic acids and bases. To obtain accurate retention factors, the surfactant used to prepare the microemulsion and the ionized solute have the same charge, and a viscosity correction factor has been used. Then, the retention factor of acid-base compounds has been correlated to log Po/w at several degrees of ionization. Results point out that accurate estimations of the parameter can be achieved up to a 99% of ionization. Finally, in order to look for new chromatographic systems presenting different selectivities from those reported to the present, an in-house styrene-co-divinylbenzene monolithic capillary column has been developed and characterized for the separation of a mixture of proteins by ion-pairing gradient reversed-phase liquid chromatography.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Enología
Esta memoria tuvo por objetivos la caracterización química y física de 14 gelatinas de uso enológico presentes en el mercado nacional y el estudio del comportamiento de la composición fenólica global de una solución hidroalcóholica de concentración conocida y de un vino tinto del cv. Cabernet Sauvignon frente a la clarificación con tres dosis diferentes de cada gelatina. Inicialmente, las gelatinas fueron caracterizadas mediante parámetros físicos y químicos como pH, contenido de proteína total, densidad y detección de proteínas en matrices de celulosa. Todas las muestras presentaron densidades similares, mientras que sus pH fueron consecuentes con sus procesos de elaboración. Las gelatinas que presentaron mayores concentraciones proteicas además de una mayor difusión y reactividad al colorante sobre la matriz de celulosa, fueron las muestras de formulación sólida. Luego de comprobar la presencia de proteínas en las muestras analizadas, se realizaron electroforesis SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes, para determinar la composición proteica de cada gelatina. Como estándar de peso molecular se utilizaron las proteínas presentes en la saliva humana. Para las gelatinas líquidas se utilizaron geles con una concentración de 12% de acrilamida, presentando una dispersión no uniforme del material con la presencia de una única banda proteica a los 55 kDa en tres de las seis gelatinas. En el caso de las muestras de formulación sólida, se utilizaron geles con una concentración de 10% de acrilamida. A diferencia del caso anterior, éstas sí presentaron bandas proteicas, sin embargo debido a su gran tamaño, migraron sólo en una fracción del gel, impidiendo determinar sus pesos moleculares exactos. A continuación, se realizaron pruebas de clarificación estableciendo como unidades experimentales de cada ensayo una solución hidroalcóholica de composición conocida y un vino tinto del cv. Cabernet Sauvignon. Se utilizaron dosis de gelatina de 5, 10 y 15 g/hL correspondientes a cada tratamiento. Luego de 48 horas de clarificación, se determinaron parámetros espectofotométricos para conocer el comportamiento de la fracción polifenólica global frente a la acción clarificadora de cada gelatina. Los resultados obtenidos en ambos ensayos, mostraron una mayor extracción y remoción de compuestos por parte de las gelatinas sólidas, especialmente de taninos totales.
The objective of this research was the chemical and physical characterization of 14 oenological gelatins that are available in the national market and the study of the behavior of the phenolic compounds of a hydroalcoholic solution of known concentration and a red wine from the cv. Cabernet Sauvignon after clarification by means of three different doses of each gelatin under study. Initially, the gelatins were characterized through several physical and chemical parameters, such as pH, total protein content, density and protein detection on cellulose matrices. All samples showed similar densities, while their pHs were consistent with their manufacture. With respect to protein concentration and detection in matrices of cellulose, the solid gelatins in solution had higher concentrations and a higher dye diffusion and reactivity on the cellulose matrix compared with the liquid gelatins. After verifying the presence of proteins in samples, was carried out a SDS-PAGE electrophoresis performed in denaturing conditions in order to determine the protein composition of each gelatin. As standard of molecular weight were used the proteins present in the human saliva. For liquid gelatins, were used gels with a concentration of 12% acrylamide, showing an irregular dispersity of the material with the presence of the only protein band of 55 kDa only in three of the six gelatins. In the case of samples of solid formulation, were used gels with a concentration of 10% acrylamide. Unlike the previous case, the solid samples showed bands corresponding to proteins, but they couldn’t be separated correctly, which didn´t allow us to know their exact molecular weights. Next, were carried out clarification tests, establishing as experimental units for each trial, a hydroalcoholic solution of known composition and a red wine of cv. Cabernet Sauvignon. For each gelatin were used three doses of 5, 10 and 15 g / hL corresponding to each treatment. After 48 hours of clarification, were determined spectrophotometric parameters in order to know the global polyphenolic fraction behavior versus the clarifying action of the various gelatins. The results of both trials showed a higher extraction and removal of phenolic compounds using solid gelatins, the total tannins being the most affected compounds.

La linfadenitis caseosa ovina es una enfermedad causada por Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis, que forma piogranulomas externos e internos en los ovinos y caprinos, lo cual provoca disminuciones en la producción de carne, leche o lana, disminuyendo las posibilidades de comercialización. Es considerada una de las enfermedades más importantes, desde el punto de vista económico Países desarrollados y en vía de desarrollo una vez que la enfermedad se instaura dentro de una producción es difícil la erradicación dicha enfermedad. El presente estudio se elaboró 6 bacterinas a partir de 60 aislados de ovinos y caprinos obtenidos dentro del territorio nacional. Dichas bacterinas se seleccionaron conforme a las similitudes y variabilidades en las características fenotípicas de la bacterias a través de los resultados obtenidos por pruebas de identificación de bioquímicas clásicas y sistema identificación API-Coryne (González, 2014) y a las similitudes y variabilidades en las características genotípicas a partir de la identificación de los genes de patogenicidad PLD, rpoB, 16srADN, y genes de virulencia Fag A, Fag B, Fag C, Fag D (Hernández, 2015), presente de los aislados Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis, relacionándose con las manifestaciones clínicas de la enfermedad, con el fin de la determinación del patrón bandeo presentes de dichas bacterinas a través de electroforesis en gel poliacrilamida en condiciones desnaturalizante sistema discontinuo (SDS-PAGE). En este estudio se detectó 8 bandas proteícas con pesos moleculares de 14, 17, 20, 28, 31, 75,108 y 125 kDA presente en 83.33% (5/6) de las bacterinas elaboradas a partir de aislados autóctonos de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis obtenidos de ovinos y caprinos. Se detectó 3 bandas proteícas de alto peso molecular de 125,108 y 75 KDA presente en las bacterinas del pellet (masa celular) y 5 bandas proteícas de bajo peso molecular de 14, 17, 20,28 y 31 kDA en el extracto del sobrenadante.

En este proyecto de tesis, hemos desarrollado 3 nuevos procedimientos por electroforesis capilar (CZE) para el estudio de pacientes con errores congénitos del metabolismo. Es un proyecto de investigación de base tecnológica, ya que se han aplicado los conocimientos de la doctoranda en Química para un desarrollo de procedimientos complejos, que os han permitido avanzar en la identificación de pacientes con enfermedades metabólicas. Estos avances se han plasmado en 3 publicaciones científicas en revistas internacionales. En el primer objetivo, hemos aplicado un procedimiento previamente validado en nuestro laboratorio para el diagnóstico de pacientes con defectos congénitos de la glicosilación (CDG). Gracias a este nuevo procedimiento, hemos podido identificar dos nuevos pacientes que habían pasado desapercibidos con los métodos de análisis convencionales (Casado et al, Cerebellum 2012). Además, el mayor grado de automatización de nuestro procedimiento frente al clásico por isoelectroenfoque permite analizar series más largas de pacientes y cuantificar las diferentes forma s de sialotransferrina en función de su grado de glicosilación, que es el biomarcador para los defectos CDG. En el segundo objetivo, nos propusimos estandarizar la cuantificación del neurotransmisor GABA en líquido cefalorraquídeo de pacientes neuropediátricos, ya que no existían referencias previas que detallaran dicho procedimiento (las disponibles, se basan principalmente en experimentación animal). Conseguimos separar GABA de glutamina, aminoácido que coeluía con el GABA y que está unas 5.000 veces más concentrado. Una vez superados los obstáculos técnicos, establecimos valores de referencia de GABA para una población pediátrica y estudiamos diferentes pacientes con trastornos neurológicos de la infancia. A destacar, que se demostró la utilidad de la determinación de GABA para la monitorización de tratamientos antiepilépticos, ya que muchos de ellos modulan el metabolismo del GABA para reducir las crisis epilépticas. Este trabajo ha sido publicado en la revista Electrophoresis (Casado et al, 2013). En el último objetivo, nos propusimos desarrollar un nuevo procedimiento para el análisis de oligosacáridos en orina, como herramienta para el estudio de pacientes con enfermedades lisosmales y del metabolismo de carbohidratos. En ese caso, la única alternativa tradicional es la cromatografía en capa fina, método no automatizable, largo y poco sensible. Hemos conseguido desarrollar un procedimiento por CZE y detección de fluorescencia inducida por láser que mejora considerablemente el método utilizado convencionalmente en la mayoría de laboratorios que estudian a este tipo de pacientes. Este nuevo procedimiento ha sido recientemente aceptado para publicación (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014).
In this thesis project, we have developed 3 new capillary electrophoresis (CZE) procedures for the study of patients with inborn errors of metabolism. This project has a technical approach, se we have taken advantage of the Chemistry knowledge of the student candidate, which allowed us to progress in the identification of new patients with inborn errors of metabolism and other neurological conditions in paediatric patients. These advances have been published in 3 different international scientific journals. In the first aim, we have applied a previously validated procedure in our laboratory for the diagnosis of patients with congenital disorders of glycosylation (CDG). We were able to identify 2 new cases with a very mild phenotype, who were misdiagnosed with the classical diagnostic procedures (Casado et al, Cerebellum 2012). Moreover, this method allows the analysis of large series of patients, since it is automatable. Furthermore, it allows the quantification of the different forms of sialotransferrin according to its glycosylation pattern, which is the more important biomarker for the study of patients with CDG syndromes. In the second aim, we standardized the quantification of the neurotransmitter GABA in cerebrospinal fluid of neuropediatric patients, since there was not scientific references about this topic (only procedures for the analysis of GABA in animal models were available). We got to separate GABA from glutamine, which co-eluted with GABA and it is about 5,000 times more concentrated than GABA is. Once these technical problems were solved, we established reference values for a paediatric population and we analyzed GABA in a cohort of neuropaediatric patients. As a milestone, we demonstrated that GABA analysis may be useful for the monitoring of antiepileptic therapy, since several antiepileptic drugs modulate GABA metabolism. This work has been published in Electrophoresis journal (Casado et al, 2013). For the last aim, we planned to develop a new procedure for the analysis of urinary oligosaccharides, as a diagnostic tool for the study of patients under the suspicion of having some lysosomal storage diseases and also those with some carbohydrate metabolism defects. The only diagnostic tool generally accepted for this purpose is a thin layer chromatography method (TLC), which is time-consuming, not automatable and probably no sensitive enough for identification of some patients with mild phenotypes. We have developed a new CZE procedure with laser-induced fluorescence detection which dramatically improves the conventional TLC method. The description and validation of this new procedure has been recently accepted for publication (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014).

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario.
La Alantoína es un producto derivado del metabolismo de las purinas, que se produce específicamente por la oxidación del Ácido Úrico. En el reino animal la excreción de Alantoína es sintetizada por varias clases, una son los gastrópodos; los seres humanos no la producen. Es utilizada hace décadas en productos cosmetológicos, dadas sus propiedades antioxidantes. Montar un proceso que permita determinar Alantoína en baba de caracol a través de la técnica de electroforesis capilar y cuantificar la producción de este compuesto bajo diferentes condiciones dietarias han sido los grandes objetivos de esta memoria de título. Se determinaron las condiciones que permitieran distinguir la Alantoína de otros derivados nitrogenados como Xantina, Hipoxantina, Urea y Ácido Alantoico, metabolitos nitrogenados presentes también en la baba de caracol. Las condiciones más adecuadas fueron capilar de 75 μm y 60 cm de largo, a 30 ºC y corriente de 20 KV. Se identificó la presencia de Alantoína en muestras de baba de caracol, previamente concentradas utilizando Alantoína como estándar interno. El método montado permitió la detección de Alantoína, Hipoxantina y Xantina en baba de caracol, simultáneamente. Los análisis efectuados en base a ayuno, dieta con soya y sin soya, demuestran que en un período de tres semanas las diferencias son significativas a favor de la dieta con soya, que aumenta la Alantoína, siendo la dieta sin soya y el ayuno bajos en ésta y sus diferencias no son significativas. La Alantoína en la baba de caracol está directamente relacionada al consumo de purinas en la dieta. Los resultados obtenidos nos han permitido montar una técnica rápida, de bajo costo y sensible para la determinación de Alantoína, permitiendo la investigación para manipular la dieta y mejorar las propiedades antioxidantes de la baba de caracol, utilizada con fines cosméticos

In 1960 Mammen and Seegers reported the discovery of a new protein (autoprothrombin II-A, APC) with both anticoagulant and profibrinolytic activity. They found that APC accelerated clot lysis in vitro and proposed that this was due to a reduction of plasmin - inhibitory activity. Many years later Comp et al (J Clin Inv 68: 1221) reported that the infusion of APC into dogs resulted in an increase in circulating plasminogen activator activity. This observation stimulated more extensive studies of the profibrinolytic effects of APC.In our laboratories we have studied the effect of human APC on clot lysis both in whole blood (human) and in a system of purified human proteins. In these systems 125I-labelled fibrinogen was incorporated in a clot formed after the addition of Jombin (complete clot formation within 5 min) and the subsequent lysis of this clot was followed by measuring the release of I-labelled fibrin degradation products (FDP) into the supernatant. Human t-PA was added to the system to achieve complete lysis of the clot within a few hours.When APC was added to citrated whole blood before clot formation, it was found to accelerate clot lysis in a dose dependent way. This effeg| was specific for APC and dependent on an intact active site, on the presence of protein S (the protein cofactor of APC) and Ca . The presence of APC did not influence the composition of the FDP formed, as analysed by means of SDS-polyacry-1 amide gel electroforesis, and its effect was found to be independent of the presence or absence of a.-antiplasmin.Subsequently we developped a clot lysis system using the purified human proteins of the fibrinolytic system: fibrinogen, FXIII, t-PA, PAI-1 (from human endothelial cells), glu-plasminogen and a -antiplasmin. In this system clot lysis was dependent on the concentrations of plasminogen, -antiplasmin, t-PA and PAI-1, but independent on the thrombin concentration and the presence or absence of phospholipids (purified from human brain). In the absence of PAI-1, no effect of APC on clot lysis was observed. However, in the presence of PAI-1, APC accelerated clot lysis. This effect was independent of the presence or absence of phospholipids and/or protein S and could be explained by the observation that APC can form a complex with PAI-1 (~ 95 kd) and under certain conditions even can convert active PAI-1 (~ 46 kd) into an inactive degradation product (~ 42 kd). However, complex formation is relatively slow anti high PAI-1 concentrations are needed to observe the reaction. The addition of protein S or phospholipids in the presence of Ca did not stimulate complex formation. Therefore, it seems highly unlikely that neutralization of PAI-1 by APC is responsible for the profibrinolytic effect of APC in the whole blood clot lysis.A completely different explanation for the profibrinolytic effect of APC was suggested by the observation that the addition of blood-platelets to the system of purified fibrinolytic components introduced a dependence of the clot lysis rate on the thrombin concentration (decrease in clot lysis at increasing thrombin concentration). This finding opened the possibility that APC stimulated fibrinolysis by reducing the effective thrombin concentration. Subsequent experiments using the whole blood clot lysis system revealed that in the presence of anti-FX antibodies clot lysis was no longer accelerated by APC, while the actual rate of clot lysis depended on the concentration of thrombin added.We like to propose, that in a blood clot lysis system APC most likely accelerates fibrinolysis by reducing the effective thrombin concentration; if at all, neutralization of PAI-1 may play only a minor role.