Dissertations / Theses on the topic 'Electroforesis'

La técnica de la electroforesis es fundamental en las investigaciones de las áreas científicas, en especial en la biotecnología, y es en esta área donde existe la necesidad de captar el interés de los adolescentes para proyectar futuros científicos que produzcan conocimientos biotecnológicos capaces de apoyar la creciente economía del país. En relación al equipamiento que esto requiere, las actuales soluciones son propias de la ingeniería avocándose sólo a la función primaria "hacer electroforesis", dejando fuera al usuario en su dimensión subjetiva. Es aquí donde la poesía del siseño requiere estar presente, porque claramente se identifica una carencia, que es la falta de un nexo que considere la integración del usuario.

En els últims anys ha augmentat el consum dels derivats sintètics de la catinona, un alcaloide que es troba de forma natural en les fulles del khat, ja que representen una alternativa més assequible i accessible respecte a altres drogues il·lícites més conegudes com les amfetamines. Després de ser consumits, aquests compostos es poden trobar en l'organisme ja sigui metabolitzats o en la seva forma pura a baixes concentracions. Per tant, solen ser necessaris mètodes altament sensibles per determinar aquestes substàncies en mostres biològiques com sang, cabell, saliva o, més comunament, orina. Les catinones presenten un centre quiral i, per tant, es poden trobar en dues formes enantiomèriques (R i S). Cada enantiòmer pot presentar un comportament farmacocinètic i farmacodinàmic diferent i, per tant, tenir diferents efectes en l'organisme. En conseqüència, la enantioseparació de les catinones sintètiques pot ser de gran utilitat. En aquest sentit, l'electroforesi capil·lar és una tècnica molt adequada per a aquest propòsit, ja que la enantioseparació es pot aconseguir simplement afegint un selector quiral a l'electròlit de separació.
En los últimos años ha aumentado el consumo de derivados sintéticos de la catinona, un alcaloide que se encuentra de forma natural en las hojas del khat, puesto que representan una alternativa más asequible y accesible respecto a otras drogas ilícitas más conocidas como las anfetaminas. Después de ser consumidos, estos compuestos se pueden encontrar en el organismo ya sea metabolizados o en su forma pura a bajas concentraciones. Por lo tanto, suelen ser necesarios métodos altamente sensibles para determinar estas sustancias en muestras biológicas como sangre, cabello, saliva o, más comúnmente, orina. Las catinonas presentan un centro quiral y, por tanto, se pueden encontrar en dos formas enantioméricas (R y S). Cada enantiómero puede presentar un comportamiento farmacocinético y farmacodinámico diferente y, por consiguiente, tener diferentes efectos en el organismo. En consecuencia, la enantioseparación de las catinonas sintéticas puede ser de gran utilidad. En este sentido, la electroforesis capilar es una técnica muy adecuada para este propósito, puesto que la enantioseparación se puede lograr simplemente agregando un selector quiral al electrolito de separación
In recent years, the consumption of synthetic derivatives of cathinone, an alkaloid naturally found in the leaves of the khat plant, has increased as they represent a more affordable and accessible alternative to other well-known illicit drugs such as amphetamines. After their consumption, these compounds can be found in the organism either metabolized or in their pure form at low concentrations. Therefore, highly sensitive methods are usually necessary to determine these substances in biological samples such as blood, hair, oral fluids, or, more commonly, urine. Cathinones present a chiral centre, so they can be found in two enantiomeric forms (R and S). Each enantiomer can present different pharmacokinetic and pharmacodynamic behaviour and have different effects on the organism. Consequently, the enantioseparation of synthetic cathinones can be very useful. In these sense, capillary electrophoresis represents an excellent technique for this purpose, since enantioseparation can be achieved simply by adding a chiral selector to the background electrolyte. However, despite of this and other well-known advantages of this analytical technique, one of its main limitations is its poor sensitivity

La electroforesis capilar (CE) es una técnica de separación basada en la migración diferencial de una mezcla de analitos bajo la acción del campo eléctrico. La CE ha sufrido una gran desarrollo a nivel de investigación en la última década pero su implantación a nivel industrial ha sido reducida. La gran variedad de productos y los numerosos controles que implica el control de calidad en la industria ha conducido al desarrollo de técnicas rápidas y con una amplia gama de aplicaciones como la CE. En esta tesis re realiza un estudio sobre la aplicación de esta técnica a campos diversos como el seguimiento de un proceso de oxidación de interés medioambiental o el establecimiento de nuevos métodos de análisis de productos farmacéuticos.

La oxidación de los blanqueantes ópticos utilizados en la industria textil o de la detergencia frente al hipoclorito de las lejías es una de las problemáticas analizadas. La CE se muestra como una técnica idónea para separar e identificar los productos de oxidación del blanqueante con la lejía y permite demostrar que se forman productos no clorados de bajo impacto medioambiental.

El control de calidad en la industria farmacéutica es especialmente riguroso porque el producto final está destinado a consumo humano. La determinación del contenido de principio activo, de impurezas relacionadas, la uniformidad de contenido por unidad de dosis o los tests de estabilidad son ensayos habituales en un laboratorio farmacéutico. El elevado poder de resolución de la CE la hace una técnica adecuada para este tipo de ensayos donde es habitual la separación de compuestos con una estructura química muy parecida. En esta memoria se aplica la técnica a la separación de ocho alquilxantinas usadas en la farmacopea española. El comportamiento electroforético de la mezcla ha sido estudiado y la conclusiones extraídas han sido aplicadas para proponer un método alternativo y ventajoso, respecto al cromatográfico, para el análisis de un fármaco que contiene tres alquilxantinas.
La industria farmacéutica necesita para la determinación de impurezas relacionadas con el principio activo (impurezas de síntesis o productos de degradación) una técnica con sensibilidad y poder de resolución suficiente. El contenido del enantiómero minoritario en principio activos enantioméricamente puros es un ejemplo de este tipo de ensayos. La CE es una técnica muy exitosa en el campo de las separaciones quirales por su alta eficacia y por la variedad de selectores quirales disponibles. La elección de este selector implica la realización de diversas pruebas de ensayo y error hasta encontrar un selector adecuado. En esta tesis se proponen algunos criterios relacionados con la estructura del analito que facilitan esta selección. Estos criterios se usan para la enantioseparación de Dopa y Ketoprofeno, dos principios activos comercializados en su forma enantioméricamente pura. Se desarrollan métodos de análisis en condiciones quirales y aquirales que permiten determinar, respectivamente, el contenido total de principio activo y del enantiómero minoritario. De todo lo anterior, se deduce que la CE es una técnica válida y en muchos casos ventajosa para desarrollar métodos de análisis para compuestos de interés medioambiental y farmacéutico.
Capillary electrophoresis (CE) is a separation technique based on differential migration of solutes in an electrical field. CE has been widely used in Univeristy investigations but its applications in the industry field are very reduced. CE is usually faster and more flexible compared with other separations techniques and those characteristics make CE a good alternative for quality control in industry. The goal of our work is to apply CE to develope methods for quality control in the textile and pharmaceutical industry.
The instability of fluorescent whitening agents (FWAS) with hypochlorite contained in bleach is a major issue in the textile industry. CE is a very useful technique to separate and to identify products formed during this oxidation. Results show that the products formed are not dangerous for the environment and contain no chlorine.
Quality control in the pharmaceutical industry is very rigorous because the final product is bound for humans. Active principle or related impurities determinations are usual assays in pharmaceutical companies. The high efficiency of electrophoretic separations make CE very suitable for the separation of compounds with a similar structure. In this way, CE has been used to study the electrophoretic behavior of a mixture of alkyl-xanthines used in pharmaceuticals. The conclusions obtained allow us to propose a new method applied for the quality control of a pharmaceutical containing three broncodillators.
The enantiomeric impurity contained in active principles marketed as single enantiomer is a determination that demands good resolution and sensitivity. CE is a very succesful technique for Chiral separations. Hoiwever, the most suitable chiral selector is usually elected by trial and error, wich is expensive and time-consuming. We propose some criteria for their election in terms of molecular size, charge and the presence of specific functional groups in the analyte with a view to minimizing the number of trials needed. These criterias has been used to propose new method to control the enantiomeric impurity in Dopa and Ketoprofen pharmaceuticals.
Taken all this into account, we conclude that CE is a valid and useful technique for investigations in environmental or pharmaceutical fields.

La combinació in-line de l'electroforesi capil·lar (CE) amb les tècniques tant en fase líquida com la single-drop microextraccion (SDME), i en fase sòlida com l'extracció en fase sòlida in-line (SPE), i la utilització de la pressureassisted electrokinetic injection (PAEKI) com a tècnica de preconcentració electroforètica, ha estat avaluada en el desenvolupament de mètodes basats en CE per a la determinació de diferents famílies de contaminants orgànics emergents (EOCs) en diferents tipus de mostres. Els resultats van mostrar que aquestes estratègies són adequades per millorar la sensibilitat de la CE, ja que d´una manera senzilla i automatitzada s´aconsegueixen elevats factors de preconcentració. Per tant, podem destacar que l'ús d'aquestes tècniques és una estratègia útil per determinar diferents tipus de mostres a baixos nivells de concentració.
La combinación in-line de la electroforesis capilar (CE) con las técnicas de microextracción tanto en fase líquida, como la single-drop microextraccion (SDME), y en fase sólida, como la extracción en fase sólida in-line (SPE), y la utilización de la pressure-assisted electrokinetic injection (PAEKI) como técnica de preconcentración electroforética, ha sido evaluada en el desarrollo de métodos basados en CE para la determinación de diferentes familias de contaminantes orgánicos emergentes (EOCs) en diferentes tipos de muestras. Los resultados mostraron que estas estrategias son adecuadas para mejorar la sensibilidad de la CE, debido a que de una manera simple y automatizada se consiguen elevados factores de concentración. Por lo tanto, podemos destacar que el empleo de estas técnicas es una estrategia útil para poder determinar diferentes tipos de analitos a bajos niveles de concentración.
The in-line combination of capillary electrophoresis (CE) with liquid microextration techniques, as single-drop microextraction (SDME), solid microextraction tecniques as, in-line solid phase extraction (SPE) and the use of pressure-assisted electrokinetic injection (PAEKI), as an electrophoretic preconcentration technique have been evaluated in the development of CE-based methods for the determination of different families of emerging organic pollutants (EOCs) in different kind of samples. The results showed that these strategies are adequate to improve the limited CE sensitivity, especially when it is used in combination with an ultraviolet detector is resolved in a simple and automatic easily. Therefore, we can emphasize that the use of these techniques is a useful strategy to improve the analysis of EOCs through CE.

El objetivo de éste estudio fue optimizar un método por Electroforesis Capilar de Zona para la determinación rápida de glutatión reducido (GSH) y oxidado (GSSG) en la matriz de tejido vegetal de hojas y raíces de plantas de tomate (Lycopersicon esculentum L.). Se compararon dos tratamientos de muestra diferentes para el aislamiento de los analitos de la matriz vegetal, se determinó los niveles de GSH y GSSG en plantas sometidas a estrés por cobre en dos periodos de tiempo (48 horas y 28 días) y se evaluó el efecto de cobre sobre la biomasa y los niveles de macronutrientes presentes en la planta. De los resultados obtenidos se concluye que: La optimización de los parámetros instrumentales, tales como largo de capilar, voltaje aplicado y polaridad de la fuente de poder, así como la optimización de los parámetros relacionados con el electrolito de corrida, tales como composición, concentración, pH y fuerza iónica permiten la separación de ambos analitos en un tiempo inferior a los tres minutos. Las condiciones óptimas fueron: polaridad de la fuente positiva, capilar de 40 cm de largo, voltaje de 20 kV, electrolito borato 300 mM, pH 7,6 y 30 segundos de inyección hidrostática de la muestra. El método optimizado para la matriz vegetal presenta una muy buena correlación entre área bajo la curva y concentración de GSH y GSSG, con coeficientes de correlación de 0,9995 y 0,9994, respectivamente. Los límites de detección fueron 2,75 y 1,68 µmol/L para GSH y GSSG y la recuperación del analito en el proceso fue de 105 y 87 %, respectivamente. En la etapa de tratamiento de la muestra, el uso de un método químico (ácido metafosfórico) es más efectivo que el uso de un método físico (copas de ultrafiltración) para el aislamiento de los analitos desde la matriz proteica. Esta efectividad se reflejo en un menor consumo de tiempo, mayor volumen de muestra obtenido y obtención de una matriz mas limpia. El tratamiento prolongado de las plantas con cobre se manifiesta en síntomas de toxicidad con una drástica disminución de la biomasa de la parte aérea y raíz, en asociación con un descenso de la concentración de potasio en ambos órganos. Este efecto no se observa en plantas tratadas por un periodo corto de tiempo con el metal. Los niveles de cobre alcanzados en la parte aérea y raíz correlacionan positivamente con la concentración de cobre aplicada en ambos tratamientos, siendo las concentraciones más altas observadas en la raíz El cobre aplicado a la planta modifica los niveles de glutatión reducido y oxidado tanto en el tratamiento crónico como en el agudo. El efecto más notorio se manifestó sobre el glutatión reducido contenido en la raíz. Este péptido decrece su concentración a medida que incrementa la concentración de cobre, siendo este efecto independiente de los cambios morfológicos que presenta la raíz y del lapso de tiempo en que el cobre fue aplicado. Los cambios producidos en los niveles de glutatión reducido y oxidado constituyen un buen indicador de la respuesta temprana al estrés por metal en plantas desarrolladas, expuestas a cobre por un periodo de tiempo corto (horas)

En la present tesi doctoral s’han estudiat i desenvolupat diferents sistemes de partició cromatogràfics per poder estimar diferents propietats de biopartició, tant d’interès ambiental com d’interès farmacèutic. La determinació d’aquestes propietats a partir dels mètodes tradicionals implica l’ús de procediments tediosos, d’un elevat cost i, sovint, èticament qüestionables, ja que s’utilitzen éssers vius. Per aquest motiu, l’ús de mètodes cromatogràfics (automatitzats, ràpids i relativament senzills) per estimar aquests paràmetres és d’un gran interès. Amb aquesta fi, s’han compilat diferents sistemes cromatogràfics i de biopartició que han estat caracteritzats a partir d’un mateix model el model de paràmetres de solvatació (SPM). Adicionalment, s’han desenvolupat i caracteritzat a partir del mateix model 4 sistemes cromatogràfics: 3 basats en liposomes i microemulsió de preparats de lecitina i un altre basat en una microemulsió formada per bromur de tetradeciltrimetilamoni (TTAB), 1-butanol i heptà. Tots aquests sistemes s’han comparat a partir dels coeficients normalitzats obtinguts de la caracterització pel SPM utilitzant un seguit d’eines matemàtiques i quimiomètriques. Com més similars són els coeficients normalitzats de l’equació de solvatació, més similars són els sistemes comparats. A continuació, per aquells sistemes cromatogràfics que, a priori, podrien subrogar un sistemes de biopartició d’interès, s’han establert correlacions entre la propietat biològica i el logaritme del factor de retenció del compost en el sistema cromatogràfic (k). Després d’avaluar els resultats obtinguts, es pot concloure que la toxicitat envers certs organismes aquàtics (Capgrossos, Fathead Minnow, Daphnia magna, Tetrahymena pyriformis i Streptococcus sobrinus), propietat d’interès mediambiental, pot subrogar-se a partir de 3 sistemes de cromatografia electrocinètica micel·lar i un sistema de cromatografia líquida de fase inversa. Pel que fa a la partició a la pell i la partició octanol-aigua, propietats d’interès farmacèutic, poden subrogar-se a partir de sistemes de cromatografia electrocinètica de microemulsions. Generalment, aquesta metodologia s’aplica a substàncies neutres i hi ha una manca d’estudis per a substàncies carregades. Però, tenint en compte que la majoria de fàrmacs són compostos àcid-base i que la forma iònica d’un compost presenta habitualment un comportament biològic i químic diferent del de la seva forma neutra, s’ha estudiat la idoneïtat de dos sistemes de cromatografia electrocinètica de microemulsions per estimar el coeficient de distribució octanol-aigua (Do/w) de compostos àcid-base ionitzats. A la literatura ja s’ha demostrat que existeix una bona correlació entre el logaritme del coeficient de partició octanol-aigua (Po/w) i el logaritme del factor de retenció de substancies neutres. Per avaluar la capacitat predictiva d’aquests sistemes per compostos àcid-base, s’han establert perfils k-pH en aquests sistemes per 14 àcids i bases monopròtics. Els resultats obtinguts indiquen que, per obtenir factors de retenció precisos, és recomanable evitar la presència de parells iònics utilitzant una microemulsió amb la mateixa càrrega de l’analit (en aquest cas dodecilsulfat de sodi pels anions i TTAB pels cations). També és necessari introduir un factor de correcció de la viscositat quan es calcula k. S’ha de tenir en compte que per calcular k per a compostos carregats s’ha de determinar la mobilitat electroforètica dels compostos amb i sense la presència de la microemulsió. Tenint en compte que la mobilitat electroforètica està inversament relacionada amb la viscositat, la mobilitat electroforètica pot variar en funció de la viscositat del medi on es mesuri. Tot seguit, a partir del perfils k-pH i de la recta log Po/w-log k establerta per compostos neutres, s’ha estimat el valor de log Do/w de compostos àcid-base a diferents valors de pH i s’ha comparat amb l’obtingut amb els mètodes tradicionals (principalment el mètode shake-flask). Els valors obtinguts a partir de les dues metodologies són similars quan el compost es troba a la seva forma neutra o parcialment ionitzat (fins el 99%), mentre que el log Do/w s’ha sobreestimat quan el compost es troba totalment ionitzat. Finalment, a la recerca de nous sistemes cromatogràfics que permetin estimar altres propietats de biopartició, es va realitzar una estada predoctoral a la Vrije Universiteit Brussel (VUB), situada a Brussel·les (Bèlgica). Durant aquest temps es va desenvolupar una columna monolítica basada en un polímer d’estirè-co-divinilbenzè, la qual es va caracteritzar per a la separació de proteïnes a partir de cromatografia líquida de fase inversa per formació de parells iònics.
The determination of biological properties usually implies expensive and complex procedures which sometimes require the use of living beings, a practice ethically questionable. Thus, the use of physicochemical systems that emulate biopartitioning processes would allow the estimation of biological properties in a faster and automated way avoiding in vivo testing. In the present work, chromatographic and biopartitioning systems characterized in previous works through a same model (the solvation parameter model (SPM)) have been compiled, adding the new developed and characterized systems in the present study. Then, all the systems have been compared using the normalized coeficients resulting from their characterization through the SPM. Finally, correlations between the biological property of interest and the logarithm of the retention factor determined in the best surrogating chromatographic system have been established. The results have shown that toxicity to aquatic species, skin partition, and the octanol-water partition systems can be surrogated employing chromatographic systems based on reserved-phase liquid chromatography and electrokinetic chromatography. Moreover, since there is a lack of studies regarding ionizable solutes, the feasibility of this methodology to estimate biopartitioning properties for ionized compounds have also been evaluated. Particularly, in the present work, the estimation of the octanol-water distribution coefficient of ionized acid-base substances has been studied. With this aim, retention factor-pH profiles have been established for a set of monoprotic acids and bases. To obtain accurate retention factors, the surfactant used to prepare the microemulsion and the ionized solute have the same charge, and a viscosity correction factor has been used. Then, the retention factor of acid-base compounds has been correlated to log Po/w at several degrees of ionization. Results point out that accurate estimations of the parameter can be achieved up to a 99% of ionization. Finally, in order to look for new chromatographic systems presenting different selectivities from those reported to the present, an in-house styrene-co-divinylbenzene monolithic capillary column has been developed and characterized for the separation of a mixture of proteins by ion-pairing gradient reversed-phase liquid chromatography.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Enología
Esta memoria tuvo por objetivos la caracterización química y física de 14 gelatinas de uso enológico presentes en el mercado nacional y el estudio del comportamiento de la composición fenólica global de una solución hidroalcóholica de concentración conocida y de un vino tinto del cv. Cabernet Sauvignon frente a la clarificación con tres dosis diferentes de cada gelatina. Inicialmente, las gelatinas fueron caracterizadas mediante parámetros físicos y químicos como pH, contenido de proteína total, densidad y detección de proteínas en matrices de celulosa. Todas las muestras presentaron densidades similares, mientras que sus pH fueron consecuentes con sus procesos de elaboración. Las gelatinas que presentaron mayores concentraciones proteicas además de una mayor difusión y reactividad al colorante sobre la matriz de celulosa, fueron las muestras de formulación sólida. Luego de comprobar la presencia de proteínas en las muestras analizadas, se realizaron electroforesis SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes, para determinar la composición proteica de cada gelatina. Como estándar de peso molecular se utilizaron las proteínas presentes en la saliva humana. Para las gelatinas líquidas se utilizaron geles con una concentración de 12% de acrilamida, presentando una dispersión no uniforme del material con la presencia de una única banda proteica a los 55 kDa en tres de las seis gelatinas. En el caso de las muestras de formulación sólida, se utilizaron geles con una concentración de 10% de acrilamida. A diferencia del caso anterior, éstas sí presentaron bandas proteicas, sin embargo debido a su gran tamaño, migraron sólo en una fracción del gel, impidiendo determinar sus pesos moleculares exactos. A continuación, se realizaron pruebas de clarificación estableciendo como unidades experimentales de cada ensayo una solución hidroalcóholica de composición conocida y un vino tinto del cv. Cabernet Sauvignon. Se utilizaron dosis de gelatina de 5, 10 y 15 g/hL correspondientes a cada tratamiento. Luego de 48 horas de clarificación, se determinaron parámetros espectofotométricos para conocer el comportamiento de la fracción polifenólica global frente a la acción clarificadora de cada gelatina. Los resultados obtenidos en ambos ensayos, mostraron una mayor extracción y remoción de compuestos por parte de las gelatinas sólidas, especialmente de taninos totales.
The objective of this research was the chemical and physical characterization of 14 oenological gelatins that are available in the national market and the study of the behavior of the phenolic compounds of a hydroalcoholic solution of known concentration and a red wine from the cv. Cabernet Sauvignon after clarification by means of three different doses of each gelatin under study. Initially, the gelatins were characterized through several physical and chemical parameters, such as pH, total protein content, density and protein detection on cellulose matrices. All samples showed similar densities, while their pHs were consistent with their manufacture. With respect to protein concentration and detection in matrices of cellulose, the solid gelatins in solution had higher concentrations and a higher dye diffusion and reactivity on the cellulose matrix compared with the liquid gelatins. After verifying the presence of proteins in samples, was carried out a SDS-PAGE electrophoresis performed in denaturing conditions in order to determine the protein composition of each gelatin. As standard of molecular weight were used the proteins present in the human saliva. For liquid gelatins, were used gels with a concentration of 12% acrylamide, showing an irregular dispersity of the material with the presence of the only protein band of 55 kDa only in three of the six gelatins. In the case of samples of solid formulation, were used gels with a concentration of 10% acrylamide. Unlike the previous case, the solid samples showed bands corresponding to proteins, but they couldn’t be separated correctly, which didn´t allow us to know their exact molecular weights. Next, were carried out clarification tests, establishing as experimental units for each trial, a hydroalcoholic solution of known composition and a red wine of cv. Cabernet Sauvignon. For each gelatin were used three doses of 5, 10 and 15 g / hL corresponding to each treatment. After 48 hours of clarification, were determined spectrophotometric parameters in order to know the global polyphenolic fraction behavior versus the clarifying action of the various gelatins. The results of both trials showed a higher extraction and removal of phenolic compounds using solid gelatins, the total tannins being the most affected compounds.

La linfadenitis caseosa ovina es una enfermedad causada por Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis, que forma piogranulomas externos e internos en los ovinos y caprinos, lo cual provoca disminuciones en la producción de carne, leche o lana, disminuyendo las posibilidades de comercialización. Es considerada una de las enfermedades más importantes, desde el punto de vista económico Países desarrollados y en vía de desarrollo una vez que la enfermedad se instaura dentro de una producción es difícil la erradicación dicha enfermedad. El presente estudio se elaboró 6 bacterinas a partir de 60 aislados de ovinos y caprinos obtenidos dentro del territorio nacional. Dichas bacterinas se seleccionaron conforme a las similitudes y variabilidades en las características fenotípicas de la bacterias a través de los resultados obtenidos por pruebas de identificación de bioquímicas clásicas y sistema identificación API-Coryne (González, 2014) y a las similitudes y variabilidades en las características genotípicas a partir de la identificación de los genes de patogenicidad PLD, rpoB, 16srADN, y genes de virulencia Fag A, Fag B, Fag C, Fag D (Hernández, 2015), presente de los aislados Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis, relacionándose con las manifestaciones clínicas de la enfermedad, con el fin de la determinación del patrón bandeo presentes de dichas bacterinas a través de electroforesis en gel poliacrilamida en condiciones desnaturalizante sistema discontinuo (SDS-PAGE). En este estudio se detectó 8 bandas proteícas con pesos moleculares de 14, 17, 20, 28, 31, 75,108 y 125 kDA presente en 83.33% (5/6) de las bacterinas elaboradas a partir de aislados autóctonos de Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis obtenidos de ovinos y caprinos. Se detectó 3 bandas proteícas de alto peso molecular de 125,108 y 75 KDA presente en las bacterinas del pellet (masa celular) y 5 bandas proteícas de bajo peso molecular de 14, 17, 20,28 y 31 kDA en el extracto del sobrenadante.

En este proyecto de tesis, hemos desarrollado 3 nuevos procedimientos por electroforesis capilar (CZE) para el estudio de pacientes con errores congénitos del metabolismo. Es un proyecto de investigación de base tecnológica, ya que se han aplicado los conocimientos de la doctoranda en Química para un desarrollo de procedimientos complejos, que os han permitido avanzar en la identificación de pacientes con enfermedades metabólicas. Estos avances se han plasmado en 3 publicaciones científicas en revistas internacionales. En el primer objetivo, hemos aplicado un procedimiento previamente validado en nuestro laboratorio para el diagnóstico de pacientes con defectos congénitos de la glicosilación (CDG). Gracias a este nuevo procedimiento, hemos podido identificar dos nuevos pacientes que habían pasado desapercibidos con los métodos de análisis convencionales (Casado et al, Cerebellum 2012). Además, el mayor grado de automatización de nuestro procedimiento frente al clásico por isoelectroenfoque permite analizar series más largas de pacientes y cuantificar las diferentes forma s de sialotransferrina en función de su grado de glicosilación, que es el biomarcador para los defectos CDG. En el segundo objetivo, nos propusimos estandarizar la cuantificación del neurotransmisor GABA en líquido cefalorraquídeo de pacientes neuropediátricos, ya que no existían referencias previas que detallaran dicho procedimiento (las disponibles, se basan principalmente en experimentación animal). Conseguimos separar GABA de glutamina, aminoácido que coeluía con el GABA y que está unas 5.000 veces más concentrado. Una vez superados los obstáculos técnicos, establecimos valores de referencia de GABA para una población pediátrica y estudiamos diferentes pacientes con trastornos neurológicos de la infancia. A destacar, que se demostró la utilidad de la determinación de GABA para la monitorización de tratamientos antiepilépticos, ya que muchos de ellos modulan el metabolismo del GABA para reducir las crisis epilépticas. Este trabajo ha sido publicado en la revista Electrophoresis (Casado et al, 2013). En el último objetivo, nos propusimos desarrollar un nuevo procedimiento para el análisis de oligosacáridos en orina, como herramienta para el estudio de pacientes con enfermedades lisosmales y del metabolismo de carbohidratos. En ese caso, la única alternativa tradicional es la cromatografía en capa fina, método no automatizable, largo y poco sensible. Hemos conseguido desarrollar un procedimiento por CZE y detección de fluorescencia inducida por láser que mejora considerablemente el método utilizado convencionalmente en la mayoría de laboratorios que estudian a este tipo de pacientes. Este nuevo procedimiento ha sido recientemente aceptado para publicación (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014).
In this thesis project, we have developed 3 new capillary electrophoresis (CZE) procedures for the study of patients with inborn errors of metabolism. This project has a technical approach, se we have taken advantage of the Chemistry knowledge of the student candidate, which allowed us to progress in the identification of new patients with inborn errors of metabolism and other neurological conditions in paediatric patients. These advances have been published in 3 different international scientific journals. In the first aim, we have applied a previously validated procedure in our laboratory for the diagnosis of patients with congenital disorders of glycosylation (CDG). We were able to identify 2 new cases with a very mild phenotype, who were misdiagnosed with the classical diagnostic procedures (Casado et al, Cerebellum 2012). Moreover, this method allows the analysis of large series of patients, since it is automatable. Furthermore, it allows the quantification of the different forms of sialotransferrin according to its glycosylation pattern, which is the more important biomarker for the study of patients with CDG syndromes. In the second aim, we standardized the quantification of the neurotransmitter GABA in cerebrospinal fluid of neuropediatric patients, since there was not scientific references about this topic (only procedures for the analysis of GABA in animal models were available). We got to separate GABA from glutamine, which co-eluted with GABA and it is about 5,000 times more concentrated than GABA is. Once these technical problems were solved, we established reference values for a paediatric population and we analyzed GABA in a cohort of neuropaediatric patients. As a milestone, we demonstrated that GABA analysis may be useful for the monitoring of antiepileptic therapy, since several antiepileptic drugs modulate GABA metabolism. This work has been published in Electrophoresis journal (Casado et al, 2013). For the last aim, we planned to develop a new procedure for the analysis of urinary oligosaccharides, as a diagnostic tool for the study of patients under the suspicion of having some lysosomal storage diseases and also those with some carbohydrate metabolism defects. The only diagnostic tool generally accepted for this purpose is a thin layer chromatography method (TLC), which is time-consuming, not automatable and probably no sensitive enough for identification of some patients with mild phenotypes. We have developed a new CZE procedure with laser-induced fluorescence detection which dramatically improves the conventional TLC method. The description and validation of this new procedure has been recently accepted for publication (Casado et al, Anal Bioanal Chem 2014).

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario.
La Alantoína es un producto derivado del metabolismo de las purinas, que se produce específicamente por la oxidación del Ácido Úrico. En el reino animal la excreción de Alantoína es sintetizada por varias clases, una son los gastrópodos; los seres humanos no la producen. Es utilizada hace décadas en productos cosmetológicos, dadas sus propiedades antioxidantes. Montar un proceso que permita determinar Alantoína en baba de caracol a través de la técnica de electroforesis capilar y cuantificar la producción de este compuesto bajo diferentes condiciones dietarias han sido los grandes objetivos de esta memoria de título. Se determinaron las condiciones que permitieran distinguir la Alantoína de otros derivados nitrogenados como Xantina, Hipoxantina, Urea y Ácido Alantoico, metabolitos nitrogenados presentes también en la baba de caracol. Las condiciones más adecuadas fueron capilar de 75 μm y 60 cm de largo, a 30 ºC y corriente de 20 KV. Se identificó la presencia de Alantoína en muestras de baba de caracol, previamente concentradas utilizando Alantoína como estándar interno. El método montado permitió la detección de Alantoína, Hipoxantina y Xantina en baba de caracol, simultáneamente. Los análisis efectuados en base a ayuno, dieta con soya y sin soya, demuestran que en un período de tres semanas las diferencias son significativas a favor de la dieta con soya, que aumenta la Alantoína, siendo la dieta sin soya y el ayuno bajos en ésta y sus diferencias no son significativas. La Alantoína en la baba de caracol está directamente relacionada al consumo de purinas en la dieta. Los resultados obtenidos nos han permitido montar una técnica rápida, de bajo costo y sensible para la determinación de Alantoína, permitiendo la investigación para manipular la dieta y mejorar las propiedades antioxidantes de la baba de caracol, utilizada con fines cosméticos

La electroforesis en gel de agarosa es un método de separación molecular muy usado hoy en día, diversas investigaciones son realizadas basadas en este proceso de separación. Para poder realizar estos ensayos se necesita del equipamiento necesario. Dentro de estos equipos se encuentra la fuente de poder para electroforesis, la cual se encarga de proveer el campo eléctrico necesario para poder desplazar las moléculas. Sin embargo, la adquisición de estos equipos en el Perú cuenta con inconvenientes como el tiempo de entrega y el costo de envío de los mismos, debido a que estos equipos son importados. Por este motivo, se propone el diseño e implementación de un prototipo de fuente de poder para electroforesis en gel de agarosa. Para lograr este objetivo, se plantea el uso de una fuente conmutada como el corazón del sistema de potencia utilizado dentro de la fuente de poder. Los requerimientos de la misma deben ser similares a las características que poseen los equipos actualmente existentes en el mercado extranjero. Finalmente, en base a la teoría expuesta se llega a la conclusión de la factibilidad en el diseño e implementación del prototipo de una fuente de poder, brindándose además recomendaciones sobre las alternativas que se pueden tomar para cumplir el objetivo principal.
Trabajo de investigación

Se evaluó las diferencias bioquímicas en el ámbito de la actividades proteolíticas y de la inhibición de la actividad proteolítica ensayas con proteínas de hojas de papa, entre los clones "resistentes" (282LM87B, 220LM87B, 136LM86B y 662LM86B) y "susceptible" (Revolución) a la mosca minadora Liriomyza huidobrensis, Blanchard (Díptera, Agromyzidae), una plaga perjudicial del cultivo de la papa (Solanum tuberosum spp) especialmente en lugares donde el uso de insecticidas es intenso. Las plantas de papa resistentes, y Revolución, fueron sometidas previamente al daño por el ataque de adultos de la mosca minadora (daño por mosca) o por herida con estilete (daño artificial), y para ser evaluados mediante el grado de inducción de las proteínas en las hojas. Entre los clones resistentes, se encontró importantes márgenes de variación de las actividades proteolíticas en las hojas y la inhibición proteolítica de los extractos de larvas por efecto de las proteínas de hojas de los clones 282LM87B y 662LM86B con respecto a Revolución. Las unidades de actividad proteolítica por gramo de proteína de las de hojas (ug-') y las unidades de actividad proteolítica de larvas (U) fueron 20,5 ug-' y 0.05 U con 282LM87B; 20.83 ug-' y 0,12 U con 662LM86B y 17,5 ug-' y 0,25 U con Revolución, respectivamente. Mediante ensayos de zimografía para determinar isoinhibidores de proteasas se encontró dos bandas, de 63 y 105 kDa de peso molecular aproximado, expresados mayormente entre los clones resistentes. Este ensayo determinó una diferenciación visual importante entre los clones resistentes con el susceptible. Se siguió el nivel de expresión de la banda de 105 kDa entre plantas de diferentes edades (20-80 días) dañadas artificialmente y en el cual se observó disminución en el nivel de su expresión en plantas de más de 60 días. Se discute la correlación de los niveles mayores de actividad proteolítica y de la inhibición de la actividad proteolítica hallados en los clones resistentes, especialmente en 282LM87B, con el atributo de la resistencia a la mosca minadora. Palabras claves: Sólanum tuberosum, mosca minadora, zimografia, plantas resistentes.
Tesis

La Electroforesis Capilar en Fase Micelar (MECC) es una nueva técnica de separación desarrollada a partir de la Electroforesis Capilar en Zona (CZE) y basada en principios tanto cromatográficos como electroforéticos, capaz de separar compuestos aniónicos y neutros conjuntamente: mientras que para los compuestos neutros el fundamento de la separación es similar al de la cromatografía líquida, para los compuestos aniónicos la separación está basada principalmente en sus diferentes movilidades electroforéticas.
La presente tesis doctoral se ha planteado con el objetivo principal de profundizar en esta técnica analítica y estudiar su aplicación en la determinación de compuestos de interés medioambiental, concretamente herbicidas de las familias de los fenoxiácidos y las fenilureas y productos derivados de su degradación.
Para ello se ha dividido la memoria en 5 capítulos:
En el capítulo 1º se realiza una introducción de la técnica CZE, estudiándose fundamentos teóricos de separación y detección y su instrumentación. Finalmente se realiza un pequeño estudio experimental de separación de varios herbicidas fenoxiácidos. Con ello se obtiene una base teórica y experimental sobre la Electroforesis Capilar necesaria para el capítulo 2º, en el cual se profundiza en el análisis mediante MECC.
En este capítulo se estudian las bases teóricas de esta técnica y se aplica en la resolución de una mezcla de herbicidas fenoxiácidos y fenilureicos. El estudio de la técnica MECC se completa en el capítulo 3º, donde se optimiza la separación de la mezcla de los herbicidas adicionando a la disolución de trabajo diferentes alcoholes alifáticos. Se discuten las variaciones experimentales observadas y se desarrolla un modelo teórico que explica estas variaciones. En este modelo entran en juego factores como las características fisico-químicas de las micelas y sus variaciones cuando están en contacto con alcoholes lineales.
En el capítulo 4º intentamos superar una de las mayores limitaciones de la Electroforesis Capilar que es la falta de sensibilidad. Para ello se desarrollan sistemas de pre-concentración de la muestra on-line, basados en la inyección de grandes volúmenes de muestra y la posterior eliminación de parte la matriz que contiene esta muestra, y sistemas de pre-concentración off-line mediante columnas de extracción en fase sólida de carbono grafitizado. Con estos dos procedimientos de concentración se consigue llegar a las sensibilidades necesarias para utilizar el sistema MECC en el análisis de pesticidas de muestras medioambientales.
Toda la información obtenida en los capítulos anteriores es aplicada en el capítulo 5º en un estudio de degradación de varios herbicidas fenoxiácidos y fenilureicos. Para ello se tuvo en cuenta diversas vías de degradación como son la fotodegradación o la hidrólisis, y diferentes condiciones ambientales. Con este estudio se consiguieron datos relevantes en la comprensión de los mecanismos de degradación de los herbicidas estudiados: cinéticas de reacción y constantes de velocidad de degradación, productos de derivados de la fotodegradación y la hidrólisis, etc.
Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography (MECC) is a new separation technique developed from Capillary Zone Electrophoresis (CZE) and based on chromatographic and electrophoretic principles. It is able to separate anionic and neutral compounds simultaneously. The separation of neutral compounds by MECC is similar to that by Liquid Chromatography. For anionic compounds, the separation is largely based on its different electrophoretic mobilities.
The main objective of this doctoral thesis is to study this analytical technique and its application in the determination of compounds of environmental interest, concretely, phenylurea and phenoxyalkyl acid herbicides and products derived of their degradation.
The thesis has been divided in 5 chapters:
In the 1st chapter, it is carried out an introduction of CZE procedure, being considered theoretical principles of separation and detection and their instrumentation. It finishes by performing a brief experimental study of separation of several phenoxyalkyl acid herbicides. We obtain a theoretical and experimental basis about Capillary Zone Electrophoresis required in 2nd chapter, in which we examine the analytical technique MECC.
In this chapter, the theoretical principles of this technique are developed and applied in the resolution of a mixture of phenylurea and phenoxyalkyl acid herbicides. The study of MECC is completed in 3rd chapter, where the separation of the mixture of herbicides is optimised adding aliphatic alcohols. The observed experimental variations are discussed and explained by a theoretical model. In this model, it is explained factors like the physico-chemical characteristics of the micelles and their variations when they are in contact with aliphatic alcohols.
In the 3rd chapter, we try to overcome one of the biggest limitations in the Capillary Electrophoresis: the sensibility. We develop on-column sample pre-concentration systems, based on the injection of a very large volume of sample and the elimination of the sample matrix. We also expose off-column sample pre-concentration systems by means of solid phase extraction cartridge of graphitized carbon black. With these concentration procedures, it was possible to achieve the necessary sensibilities to use MECC system in environmental analysis.
All the information obtained in previous chapters is applied in 5th chapter in a degradation study of several phenylurea and phenoxyalkyl acid herbicides. We kept in mind various degradation processes like photodegradation or hydrolysis and different environmental conditions. We reach interesting data to the understanding of degradation mechanisms of the determined herbicides: kinetic of reaction and degradation constants, products derived of photodegradation and hydrolysis, et cetera.

Se realizó el estudio electroforético de proteínas seminales totales de 18 individuos de poblaciones silvestres de Caesalpinia spinosa (Molina) Kuntze, procedentes de Tarma, Ayacucho y Cajamarca, en geles de poliacrilamida con Sodio Dodecil Sulfato SDS-PAGE. Las proteínas fueron extraídas a partir de la harina de la semilla mediante el uso de un buffer de extracción que contenía 0.5M Tris-HCl (pH 8.0), 0.2% SDS, 5M úrea y 1% 2-mercaptoetanol, glicerol al 10 % (v/v). La cantidad de proteínas se determinó mediante el método de Biuret. Asimismo mediante el análisis densitométrico se logró identificar 22 bandas proteicas las cuales mostraron diferencias en sus movilidades. De esta manera se obtuvieron modelos electroforéticos diferentes para algunos de los individuos y mediante un análisis de conglomerados (método UPGMA) se obtuvo un dendrograma que mostró la distinción entre individuos en dicho carácter, permitiendo expresar las diferencias entre ellos. Se identificó que existen bandas únicas las cuales solamente se encuentran en individuos de Cajamarca (banda de 94-91 kDa y de 49-46 kDa) y bandas que son excluyentes pues solamente se encuentran en individuos de Tarma y Ayacucho (64-61 kDa). Por lo que se concluye se concluye que la cantidad de proteínas no guarda relación con la zona de procedencia, que los individuos analizados comparten un mismo acervo genético y que el patrón electroforético de la semillas de “tara” analizadas permite identificar su procedencia geográfica.
Tesis

Orientador: Eduardo Galembeck
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-18T00:57:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brum_ItarajuJuniorBaracuhy_M.pdf: 1893501 bytes, checksum: 59afb345a47fb8e963452a41b2327f1c (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: A área de proteômica visa estudar um conjunto completo de proteínas expressas por um organismo ou tecido numa dada situação, através da identificação e quantificação. Apesar de limitações nas técnicas disponíveis, vem se aumentando o volume de informações oriundos desta área, situação que exige o emprego de ferramentas computacionais para permitir o uso eficiente de dados disponíveis, além de buscar-se novas formas de análise destes. Este projeto visa o desenvolvimento de ferramentas de bioinformática para aplicação em proteômica. Estas ferramentas abrangem as seguintes aplicações: Cálculo Teórico de Ponto Isoelétrico e Peso Molecular de seqüências de aminoácidos, eletroforese-bidimensional teórica, digestão teórica e simulação de eletroforese e identificação de peptídeos, ferramenta para análise de Vias Metabólicas a partir de dados de proteômica
Abstract: The proteomics field aims to study sets of proteins expressed in a cell or tissue, according to a specific situation, through protein identification and quantification. Though technical limitations do exist, the amount of information derived from this field increases each day. And so, there is a need for employing computational tools that enable efficient analysis of data. This project aims developing bioinformatics tools for application in proteomics. The tools here presented comprehend the following tasks: theoretical computation of isoeletric point and molecular weight of aminoacid sequences, theoretical two-dimensional electrophoresis, theoretical triptic digestion and electrophoresis simulation for peptide identification, and analysis of metabolic pathways with proteomics data
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tesis presentada para optar al Grado de Magister en Ciencias de la Acuicultura
El jurel cola amarilla (Seriola lalandi) se viene cultivando en chile, durante los últimos años, y su expansión se debe a la gran demanda en el mercado internacional. El mayor conocimiento científico - técnico ha sustentado su incremento en producción, convirtiéndose en una prominente especie para el desarrollo acuícola. Dentro de las áreas de estudio en acuicultura para el aumento en producción, la nutrición ha tenido un rol relevante, que debido a los tipos de dietas, uso de antibióticos, cambia el status sanitario del pez y la composición microbiana intestinal. Estos últimos son microorganismos asociados a la microbiota normal, que otorgan beneficios como proteger al pez de ataque de patógenos y ayudar en la digestión de los ingredientes incorporados en la dieta. Sin embargo, el conocimiento de la microbiota de esta especie es muy limitada, es por eso que el objetivo de este estudio fue caracterizar la microbiota intestinal de Seriola lalandi de medio silvestre.

Tesis doctoral ; fecha de lectura: 2003 ; Universidad de Burgos, Departamento de Biotecnología y Ciencia de los Alimentos, Área de Bioquímica y Biologia Molecular.
Recurso electrónico gratuito. Bibliografía.

For the selective separation of Noble Metals, different new chelating polymers with the same functional group, based on tri-isobutylphosphine sulphide, have been synthesised. Different spacers between the polymeric matrix and the functional group were introduced during the synthetic process, varying the length and number of heteroatoms (O, S) in the spacer molecule. These polymers show a good affinity towards gold and silver ions and a lower adsorption capacity towards palladium, and do not adsorb all other noble and base metals tested
Nuevos polímeros quelatantes con el mismo grupo funcional, basado en el sulfuro de tri-isobutilfosfina, han sido sintetizados para la separación selectiva de los Metales Nobles. Se han introducido diferentes espaciadores entre la matriz polimérica y los grupos funcionales, variando su longitud y el número de heteroátomos (O, S) presentes. Estos polímeros muestran una buena afinidad para los iones oro y plata, y una capacidad de adsorción inferior para los iones paladio, mientras que no adsorben al resto de Metales Nobles y metales base evaluados
Nous polímers quelatants amb el mateix grup funcional, basat en el sulfur de tri-isobutilfosfina, han estat sintetitzats per a la separació selectiva dels Metalls Nobles. S’han introduit diferents espaiadors entre la matriu polimèrica i els grups funcionals, variant la seva longitud i el nombre d’heteroàtoms (O, S) presents. Aquests polímers mostren una bona afinitat per als ions or i plata, i una capacitat d’adsorció inferior per als ions paladi, mentre que no adsorbeixen la resta de Metalls Nobles i metalls base avaluats

Aquesta Tesi es titula Determinació de constants d’acidesa de substàncies d’interès biològic per electroforesi capil·lar. La Dissertació es focalitza llavors en l’estudi de la determinació de la constant d’acidesa de fàrmacs utilitzant aquesta tècnica d’electroseparació, l’electroforesi capil·lar. La constant d’acidesa o pKa és una propietat fisicoquímica útil en el descobriment i desenvolupament de fàrmacs, on el coneixement de l’estat de ionització d’un grup funcional és sovint essencial per a comprendre les propietats farmacocinètiques i farmacodinàmiques de nous fàrmacs potencials. Gràcies a l’ús d’un patró intern (IS), es va desenvolupar una nova metodologia per a la determinació d’aquestes constants per electroforesi capil·lar (CE), el mètode IS-CE. No obstant això, aquest mètode només es va desenvolupar per a substàncies simples monopròtiques. Així doncs, l’objectiu principal d’aquesta Tesi és establir el mètode IS-CE com a mètode d’alt rendiment per a la determinació de constants d’acidesa de compostos bioactius, així com també dissenyar un prototip específic per aquest mètode per tal d’implementar-lo per a l’anàlisi rutinari de fàrmacs potencials en laboratoris d’anàlisis fisicoquímiques. Aquesta fita ha estat perseguida al llarg d’aquesta Dissertació, cobrint durant el seu desenvolupament cada necessitat que presentava el mètode. Per començar, en aquesta Tesi s’estableix el pKa d’un llistat de patrons interns àcids i bàsics de diferent estructura que cobreixi tot l’interval de pH útil en electroforesi capil·lar i s’amplia l’aplicabilitat del mètode a compostos amb diverses constants d’acidesa. Posteriorment s’optimitzen els paràmetres instrumentals per tal de convertir l’IS-CE en un mètode high throughput IS-CE. Després s’avalua la capacitat del mètode per a la determinació de compostos de baixa solubilitat en aigua i s’amplia per a la determinació de constants d’acidesa de compostos de molt baixa solubilitat utilitzant mescles metanol-aigua. Arribat aquest punt es dissenya una instrumentació específica adaptable al mètode IS-CE, tot simplificant i agilitzant el procés per a la determinació del pKa. En conjunt, aquest treball d’investigació científica ha permès el desenvolupament consolidat d’un mètode ràpid, robust, precís i acurat per a la determinació de constants d’acidesa de compostos bioactius. Així mateix, també ha permès dissenyar un nou prototip per a la implementació d’aquest mètode a l’anàlisi rutinari de fàrmacs potencials en laboratoris de mesures fisicoquímiques i de drug discovery and development.
The Dissertation is then focused on the study of the acidity constant determination of drugs using this electroseparation technique, capillary electrophoresis. The acidity constant or pKa is a useful physicochemical property in drug discovery and development, where the knowledge of the ionization state of a functional group is often essential to understand the pharmacodynamic and pharmacokinetic properties of new potential drugs. In the past, a new method to determine acidity constants by capillary electrophoresis (CE) was developed by the use of an internal standard (IS), the IS-CE method. However, this method was only developed for simple monoprotic compounds. Thus, the main objective of this Thesis is to establish the IS-CE method as a high throughput method for the determination of acidity constants of bioactive compounds as well as to design a specific prototype for this method in order to implement it for the routine analysis of potential drugs in physicochemical analysis laboratories. This goal has been pursued throughout this Dissertation in order to meet the need during the development of this method. First of all, this Thesis establishes the pKa of a list of acidic and basic internal standards with different structures that covers the entire pH-range useful in capillary electrophoresis, and expands the applicability of this method to compounds with several acidity constants. Afterwards, instrumental parameters and experimental conditions are optimized in order to transform the IS-CE method into a high throughput method. Subsequently, the method is evaluated for sparingly soluble compounds in water and extended for the determination of acidity constants of highly insoluble compounds using methanol-water mixtures. At this point a specific instrumentation is designed and adapted to the IS-CE method, simplifying and accelerating the pKa determination process. Overall, the conducted scientific research has allowed the development of a consolidated fast, robust, precise and accurate method for the determination of acidity constants of bioactive compounds. Likewise, a new prototype has been designed for the implementation of this method to the analysis of potential drugs in routine laboratory of physicochemical measurements and drug discovery and development.

El dendrograma construido mediante el cálculo de distancias euclidianas para ambos experimentos genero una distribución de las variedades de maíz, sin embargo, genéticamente la distribución resulto ser diferente, debido a que las características fenotípicas del maíz dependen de factores genéticos, ambientales, del lugar y época donde fue establecido el cultivo. La construcción de un dendrograma mediante SSR mostró que las variedades negras y blancas de Tlachichilpa no reflejan diversidad. De todas las variedades el mayor flujo génico lo mostro el maíz blanco, con Nm = 0.375 individuos que migran por generación.
El maíz es uno de los cereales más importantes a nivel mundial, tiene importancia alimentaria, cultural y económica. México es considerado el centro de diversificación del maíz debido a la gran variedad de razas y colores existentes. La caracterización es un parámetro importante en la evaluación de la diversidad, en la generación de conocimiento de la evolución génica, y en el planteamiento de estrategias de conservación. La revaloración de los recursos genéticos ha ido renovándose por avances en técnicas biotecnológicas que permiten la caracterización mediante huella genética. En este estudio se evaluaron morfológicamente, mediante la distancia euclidiana, 4 variedades cónicas de 2 productores de la comunidad de Tlachichilpa (San Felipe), así como 3 variedades de una parcela experimental de El Cerrillo. Se usaron 6 marcadores moleculares SSR (microsatélites) con el objetivo de caracterizar la diversidad genética. Las relaciones genéticas se calcularon por el método de distancia genética de Rogers y se generó un dendrograma mediante el método de UPGMA. Morfológicamente se observó mayor distribución de las variedades en el dendrograma. También, los datos muestran que no hay distancia genética entre el maíz negro y el maíz blanco de cada productor. Por otro lado, fue evidente un flujo genético mayor para la variedad blanca con Nm=0.362 individuos que migran por generación y menor para la variedad roja con Nm=0.058 individuos que migran por generación.

En las últimas décadas, el análisis de compuestos biomarcadores en muestras biológicas se ha convertido en una herramienta esencial para el diagnóstico, seguimiento y pronóstico de diversas enfermedades. Las principales dificultades en muchos casos son la baja concentración de los biomarcadores, la complejidad de la matriz de la muestra y la limitada disponibilidad de muestra. En esta tesis doctoral, se presentan nuevas estrategias basadas en electroforesis capilar- espectrometría de masas (CE-MS) para la separación, detección, caracterización y cuantificación de péptidos, proteínas y microARNs (miRNAs) biomarcadores en fluidos biológicos. La CE-MS es una técnica excelente para la separación de biomoléculas cargadas y su identificación inequívoca. En esta tesis, se han desarrollado estrategias novedosas para la predicción y optimización de las separaciones de mezclas complejas de péptidos en CE. Para evaluar estas estrategias, se han estudiado los péptidos beta amiloides. Una limitación importante de la CE es su baja sensibilidad en términos de concentración para la mayoría de analitos a causa del pequeño volumen de inyección de muestra. La extracción en fase sólida en línea con la electroforesis capilar (SPE-CE) es una excelente estrategia para disminuir los límites de detección. En esta tesis se han investigado diferentes metodologías de SPE-CE-MS unidireccional empleando sorbentes selectivos, como los sorbentes de inmunoafinidad, afinidad a aptámero, afinidad a metal inmovilizado y el carburo de silicio, para el análisis de proteínas intactas (transtiretina y α-sinucleína), digestos de proteínas y miRNAs en fluidos biológicos. También se ha investigado el potencial de la SPE-CE-MS con una nanoválvula (nvSPE-CE-MS) para el análisis de péptidos en fluidos biológicos. Se ha desarrollado un método de nvSPE-CE-MS empleando un sorbente C18 para el análisis de péptidos opioides y péptidos beta amiloides y se han comparado las ventajas e inconvenientes de la nvSPE-CE-MS respecto a la SPE-CE-MS unidireccional. Finalmente, se han investigado nuevas estrategias para el análisis rápido y eficiente de digestos de proteínas. La tripsina es la enzima proteolítica más comúnmente utilizada y la digestión se realiza habitualmente en disolución, requiriéndose largos tiempos de digestión. Con el objetivo de disminuir el volumen de muestra, su manipulación y el tiempo total de análisis, en esta tesis se ha desarrollado una metodología de análisis de proteínas empleando microrreactores empaquetados con partículas con tripsina inmovilizada en línea con la CE-MS (IMER-CE-MS).
In recent years, an increased emphasis has been placed on the analysis of biomarker compounds in biological samples for the diagnosis, follow-up and prognosis of numerous diseases. The leading difficulties in many of these analyses are the low concentration of the biomarkers, their structural complexity, the sample matrix effects and the limited availability of sample. In this doctoral thesis, we present novel strategies based on capillary electrophoresis- mass spectrometry (CE-MS) for the separation, detection, characterization and quantification of peptide, protein and microRNA (miRNA) biomarkers in biological fluids. MS is a powerful technique for the unequivocal identification of biomolecules due to its potential with regard to the detailed structural characterization of unknown compounds. However, due to the complexity of most biological fluids, the hyphenation of high-performance separation techniques is essential prior to MS analysis. In this regard, CE is a microscale technique that is very suitable for the separation of charged biomolecules. Nevertheless, electrophoretic separation methods must be properly optimized to achieve rapid, efficient, sensitive and high-resolution separations. In this thesis, we have investigated novel strategies to predict and optimize the separation of complex mixtures of peptides in CE. To assess these strategies, amyloid beta peptides, which are biomarkers of Alzheimer’s disease, were studied. A major limitation of CE is the relatively poor concentration sensitivity for most analytes due to the small sample volume that can be injected in the separation capillary. On-line solid- phase extraction capillary electrophoresis (SPE-CE) is a powerful approach for sample clean-up and reduction of the limits of detection. In SPE-CE, analytes from a large volume of sample are retained on a sorbent contained in a microcartridge. In unidirectional SPE-CE, the most typical configuration, the microcartridge is mounted in series to the separation capillary, inserted near the capillary inlet. After sample loading, the microcartridge is washed to remove non-selectively retained molecules. Then, the retained analytes are desorbed in a small volume of eluent, resulting in sample clean-up and concentration enhancement before electrophoretic separation and detection. In the present thesis, selective sorbents, such as immunoaffinity, aptamer affinity, immobilized metal affinity and silicon carbide sorbents have been explored in unidirectional SPE-CE-MS for the analysis of intact proteins, such as transthyretin, which is a biomarker of familial amyloidotic polyneuropathy type I, and α-synuclein, which is related to Parkinson’s disease, protein digests and miRNAs, which are related to cancer, in biological fluids. Unidirectional SPE-CE-MS is straightforward to implement. However, this simple setup has some inherent limitations. On the one hand, the sample volumes introduced using pressure depend on the dimensions of the separation capillary. On the other hand, sample loading is conducted in the same direction as the subsequent separation. Therefore, some of the matrix components could be irreversibly adsorbed in the inner wall of the separation capillary. Furthermore, in many cases, the requirements of on-line preconcentration are incompatible with the BGE necessary for an efficient separation or sensitive MS detection. In order to overcome these drawbacks, some new configurations where the sample is introduced in an orthogonal direction to the separation have been proposed, requiring the use of valves. We have investigated SPE-CE-MS with a nanoliter valve (nvSPE-CE-MS). A nvSPE-CE-MS method with a C18 sorbent for the analysis of opioid peptides and amyloid beta peptide fragments has been developed and the advantages and disadvantages compared to the unidirectional SPE-CE- MS have been discussed. New strategies for high-throughput bottom-up analysis of proteins have also been investigated. Tryptic digestion has been traditionally conducted in solution and requires long digestion times. In contrast, immobilized enzymes allow decreasing the sample volume and the total digestion times, minimize the sample handling, improve the digestion yields, as well as to stabilize the enzyme, avoid its autoproteolysis and simplify its recovery making it reusable. In this thesis, we have investigated on-line immobilized enzyme microreactor capillary electrophoresis-mass spectrometry (IMER-CE-MS) using microreactors packed with immobilized trypsin particles.

En la actualidad la proteómica es una de las herramientas más utilizadas en el estudio de diferentes patologías. Los recientes avances en la proteómica incluyen desde la preparación de la muestra, la espectrometría de masas (MS) y el análisis de datos; convirtiendo esta tecnología en un método básico para la investigación biomédica. La espectrometría de masas (MS) es la base de la proteómica, este campo ha evolucionado muy rápido, permitiendo en la actualidad realizar análisis cualitativos y cuantitativos de las proteínas, además de poder evaluar sus modificaciones post-, la localización subcelular y las interacciones de proteínas. En el desarrollo de este trabajo hemos introducido de manera muy sencilla algunas técnicas de proteómicas para abordar las preguntas diferentes preguntas relacionadas con la patología de las enfermedades neuromusculares. • Las enfermedades neuromusculares (ENM) comprenden un grupo heterogéneo de patologías que pueden afectar a la médula espinal del motor, y las raíces sensoriales, los nervios periféricos, unión neuromuscular y músculo esquelético. Las (ENM) constituyen un grave problema sanitario y social porque en un elevado porcentaje de casos producen invalidez por debilidad muscular progresiva y crónica. Estas enfermedades afectan tanto a personas adultas y ancianos como a jóvenes y niños y además de su efecto personal y familiar devastador tienen un elevadísimo coste económico. El diagnóstico de estas enfermedades se basa en el examen neurológico, pruebas electrofisiologícas, la resonancia magnética, biopsia del músculo y nervio y la detección de autoanticuerpos en el suero y liquido cefalorraquídeo del paciente. La técnica de proteómica que nos ha permitido identificar nuevas moléculas candidatas en alguna de la patologías neuromusculares estudiadas es la electroforesis bidimensional (2D-E) que dependiendo de nuestros objetivos la aplicamos con diversos esquemas, como lo describiremos: • Utilizamos la electroforesis bidimensional como una herramienta de estudio para identificar los cambios en la expresión de las proteínas en la muestra del paciente durante la progresión de la enfermedad y después de una intervención terapéutica. Hemos estudiado un paciente con escleromixedema, una mucinosis dérmica que en algunos casos también afecta al músculo esquelético. Incremento de la proliferación de fibroblastos de la piel asociada frecuentemente a una gammapatía monoclonal. El análisis de esta se ha realizado apartir de cultivos primarios de los fibroblastos del paciente antes enfermo y después del tratamiento. • Identificación de los antígenos diana de nuevos autoanticuerpos en el suero de pacientes con neuropatías inmunomediadas. Hemos combinado la electroforesis bidimensional y Western-blot con suero de paciente para identificar nuevos autoanticuerpos. En este trabajo se encontró una fuerte reactividad contra la P2, una proteína de la mielina. Los resultados fueron validados por ELISA. Nuestros datos amplían el espectro en las neuropatías disinmunes adquiridas y sugieren que la reactividad contra las proteínas de la mielina pueden estar relacionados con una implicación, sobre todo radicular, de una presentación clínica de ataxia sensitiva y alteración motora que se asemeja clínicamente CIDP. • El uso de geles de electroforesis bidimensionales, en un estudio comparativo del perfil de expresión proteica en músculos esqueléticos de controles sanos y pacientes afectos con distintas distrofias musculares (disfelinopatia, calpainopatia, facioescapulohumeral), para identificar proteínas diferencialmente expresadas y específicas en cada una de ellas. Este estudio nos mostro proteínas que eran comúnmente expresadas en todas las distrofias estudiadas y diferencialmente del musculo control. Nosotros centramos nuestros resultados a evaluar las proteínas que eran especificas de la disferlinopatia, y encontramos Incremento en la expresión de las proteínas contráctiles fosforiladas específicas de las fibras tipo I (TPN1, TPM1) lo que sugiere un proceso de transición de tipo de fibra en los pacientes con disferlinopatía. Una sobreexpresión de Rho GDI afecta los niveles de expresión de miogenina proteína necesaria para la diferenciación celular. Lo más relevante de este trabajo fue el hallazgo de una nueva proteína la TRIM 72 incrementada en los pacientes con disferlinopatia, proteína que no se conocía en ese momento su función y que un año más tarde salieron 2 artículos en las indican que esta participa en la reparación de la membrana al igual que la disferlina de hecho estas proteínas forman parte de un mismo complejo implicado en procesos de reparación. Por lo tanto un incremento de la expresión de TRIM 72 en nuestro trabajo sugiere un mecanismo compensatorio por la ausencia de disferlina.
Proteomic techniques application to study neuromuscular diseases Nowadays, proteomics constitutes one of the most frequently used tools to study human diseases. Recent advances in proteomics, including sample preparation, mass spectrometry and data analysis, make this technology a central approach for biomedical research. Mass spectrometry is the basis for proteomics. This field has evolved very fast in terms of development of qualitative and quantative analysis of proteins, dissection of post-translational modifications and unravelling subcellular location and interactions between proteins. Neuromuscular diseases encompass a heterogeneous group of pathologies that can affect from the spinal cord, motor and sensory roots, peripheral nerves, neuromuscular junction and skeletal muscle. Neuromuscular diseases have a high impact on the health system and society because in many cases they lead to patient’s disability due to a progressive muscle weakness. The diagnosis of these diseases is based on neurological examination, electrophysiology, muscle MRI, nerve or muscle biopsy and detection of autoantibodies in patient’s sera. In this thesis we have applied different proteomic strategies to address questions related to the pathophysiology of the neuromuscular diseases studied: • The use of bidimensional electrophoresis as a tool to identify changes in protein expression in patient’s sample during the progression of the disease and after a therapeutic intervention. We have studied a patient with scleromyxedema, a dermic mucinosis that in some cases also affects skeletal muscle. Analysis of fibroblasts proliferation has been analyzed before and after treatment. • Identification of new target antigens of autoantibodies in the sera of patients with immune-mediated neuropathies. We have combined bidimensional electrophoresis and Western-blot and found autoantibodies against P2, a myelin protein. Results were validated by ELISA • The use of bidimensional electrophoresis gels stained with different dyes to perform a qualitative and quantitative analysis of different muscular dystrophies. We found changes common to all dystrophic samples and differential expression of some proteins specific for each muscular dystrophy. .

La MDMA és cap de sèrie dels entactògens. El seu consum provoca toxicitat aguda i neurodegeneració a mig/llarg termini del sistema serotoninèrgic. Es postula que la bioactivació metabòlica podria ser responsable del desenvolupament de neurotoxicitat.

La MDMA té un centre estereogènic. Es consumeix com a racemat, però els enantiòmers tenen perfils farmacològics diferenciats. A més, la MDMA té una depuració metabòlica enantioselectiva i autoinhibible (CYP2D6).

Aquesta tesi presenta l'enantioselectivitat de la depuració metabòlica de la MDMA en consumidors recreatius participants d'un assaig clínic (dosi: 100 mg).

Es sintetitzà material de referència i es desenvolupà metodologia per a l'anàlisi enantioselectiu i diastereoselectiu dels compostos.

S'estudià l'enantioselectivitat en el metabolisme fins a 48h post-administració, obtenint-se raons (R)-MDMA/(S)-MDMA>1 i en augment amb el temps. Les raons del metabòlits majoritaris foren pràcticament constants i properes a 1, possiblement degut a la inhibició metabòlica del CYP2D6 i a la participació d'altres enzims no enantioselectius.
La MDMA es la cabeza de serie de los entactógenos. Su consumo provoca toxicidad aguda y neurodegeneración serotonérgica a medio/corto plazo. Se postula que una bioactivación metabólica podría ser responsable del desarrollo de neurotoxicidad.

La MDMA tiene un centro estereogénico. Se consume como racemato, pero los enantiómeros tienen perfiles farmacológicos diferenciados. Además, presenta depuración metabólica enantioselectiva y autoinhibible (CYP2D6).

Esta tesis presenta la enantioselectividad de la depuración metabólica de la MDMA en consumidores recreativos participantes de un ensayo clínico (dosis: 100 mg).

Se sintetizó material de referencia y se desarrolló metodología para el análisis enantioselectivo y diastereoselectivo de los compuestos.

Se estudió la enantioselectividad en el metabolismo hasta 48h post-administración, obteniéndose relaciones (R)-MDMA/(S)-MDMA>1 y en aumento con el tiempo. Las relaciones de los metabolitos mayoritarios fueron prácticamente constantes y cercanas a 1, posiblemente debido a la inhibición metabólica del CYP2D6 y a la participación de otros enzimas no enantioselectivos.
MDMA is the head of entactogenic compounds. Its consumption causes acute toxicity and mid/long term serotonergic neurodegeneration. It is postulated that a metabolic bioactivation may be responsible for development of neurotoxicity.
MDMA has a stereogenic center. It is consumed as a racemate, but its enantiomers have different pharmacological profiles. Also, MDMA presents an enantioselective and self-inhibited metabolic disposition (CYP2D6).

The present thesis shows data about enantioselective metabolic disposition of MDMA in recreative consumers that participated in a clinical trial (dose: 100 mg).

It was synthesised reference material and it was developed methodology for both enantioselective and diastereoselective analysis MDMA and its main metabolites.

It was studied the enantioselectivity in the metabolism after 48h post-administration. (R)-MDMA/(S)-MDMA ratios were >1 and increasing over time. Major metabolites ratios were practically constant and close to 1, possibly because of the metabolic inhibition of CYP2D6 and the role of other non-enantioselective enzymes.

La presente tesis doctoral se centra en el desarrollo de nuevos métodos de análisis para la identificación y separación de glicopéptidos y glicanos utilizando técnicas microseparativas acopladas a la espectrometría de masas (cromatografía de líquidos capilar y electroforesis capilar, CapLC-MS y CE-MS). Aunque el análisis de los glicopéptidos es una estrategia habitualmente utilizada para la caracterización de productor farmacéuticos, continúa siendo difícil la detección de glicoformas poco abundantes que podrían ser esenciales para diferenciar proteínas endógenas de variantes recombinantes. De este modo, en esta tesis se han desarrollado dos métodos para la purificación selectiva de glicopéptidos, obtenidos de digestos de glicoproteínas, utilizando la eritropoetina humana recombinante (rhEPO) como glicoproteína modelo. Por otro lado, en muchas patologías se han descrito alteraciones en los glicanos de ciertas glicoproteínas en presencia de procesos inflamatorios importantes y muchos tipos de cáncer. Además, dado que ciertas estructuras de glicano así como tipos de enlace han estado relacionados con enfermedades específicas, la caracterización exhaustiva de los tipos de enlace de los isómeros de los glicanos ha suscitado gran interés biomédico en los últimos años. En este sentido, se han establecido en esta tesis doctoral diferentes metodologías para la caracterización de los isómeros de los glicanos de la alfa-1-glicoproteína ácida (hAGP), la cual ha generado interés biomédico dada la alteración de sus glicanos en ciertos procesos inflamatorios y cáncer. Primero, la digestión con diversas exoglicosidasas (sialidasa, fucosidasa y galactosidasa) en combinación con el análisis de los glicanos per cromatografía de líquidos capilar de interacción hidrofílica zwitteriónica acoplada a la espectrometría de masas (CapZIC-HILIC-MS) y la estrategia GRIL utilizando [12C6]/[13C6]- anilina, permitió asignar los enlaces de los ácidos siálicos, así como de las fucosas de los isómeros de los glicanos de la hAGP. Por otro lado, se desarrolló un método para asignar los isómeros de los glicanos per espectrometría de masas en tándem de alta resolución. La posibilidad de separar los isómeros antes de la detección, juntamente con la obtención de la masa exacta de los iones fragmentos, permitió el establecimiento de un método de caracterización de los glicanos fiable por CapZIC-HILIC-MS/MS. Además, la doctoranda realizó una estancia en la Freie Universität Berlin (Berlin, Alemania), bajo la supervisión del Dr. Kevin Pagel, para estudiar la separación de los isómeros de glicanos per espectrometría de movilidad iónica acoplada a la espectrometría de masas (IM-MS). Finalmente, el método por CapZIC-HILIC-MS en combinación con la estrategia GRIL utilizando [12C6]/[13C6]-anilina se aplicó en esta tesis para el análisis de muestras patológicas, con el fin de evaluar posibles alteraciones en los isómeros de los glicanos de dos glicoproteínas de fase aguda, l’hAGP y la transferrina de ratón (mTf), en presencia de ciertos procesos inflamatorios y cáncer. Además, se emplearon herramientas quimiométricas con el objetivo de identificar glicanos como candidatos biomarcadores de estas patologías.
The present thesis is focused on the development of novel analytical methods for the identification and separation of glycopeptides and glycans by microseparative techniques coupled to mass spectrometry. Although the analysis of glycopeptides is a commonly used strategy for glycan characterization of biopharmaceuticals, the detection of low abundant glycopeptides that could be essential to differentiate endogenous and recombinant variants of certain proteins continues to be a challenge. In this thesis, methods to selectively enrich glycopeptides from glycoprotein digests were developed using recombinant human erythropoietin (rhEPO) as model glycoprotein. On the other hand, alterations in glycan structures have been described in presence of important inflammatory processes and many types of cancer. As certain glycan isomers or linkage-types have been related to specific pathologies, the in depth characterization of glycan isomer linkage-types has aroused great interest in last years. In this regard, different methodologies were established in this thesis to characterize human alpha-1-acid glycoprotein (hAGP) glycan isomers, whose glycosylation has been described to be altered in several diseases. Exoglycosidase digestions, tandem mass spectrometry (MS/MS) as well as ion-mobility mass spectrometry (IM-MS) were used with this purpose. Finally, the established method for glycan isomer separation in combination with the GRIL strategy with [12C6]/[13C6]aniline was used in this thesis to evaluate possible glycan isomer modifications in two acute-phase proteins, hAGP and mouse transferrin (mTf), caused by certain inflammatory diseases and cancer. Moreover, multivariate data tools, such as PCA and PLS-DA, were also employed in these studies to identify glycan-based biomarker candidates.

In the present thesis I have worked with particle dispersion in water as well as in liquid crystal. As the first study of this thesis, I have studied the aggregation of isotropic (spherical) and elongated anisometric (pear-shaped) colloidal particles in aqueous medium, confined in two dimensions when subjected to perpendicular external alternating current (AC) electric fields. For low frequencies (f < 2.5kHz) the electrohydrodynamic flow is predominant, and particles tend to aggregate in clusters. On the contrary, for higher frequencies the repulsive dipolar interaction dominates, and particles disperse. Although both types of particles feature a similar behavior under AC field, pear-shaped particles present a richer phase diagram, that is, they have more phases than the spherical ones. I have also found that pear-shaped particles tend to form smaller and more elongated aggregates, with faster aggregation kinetics. I have also tested different ways to measure the strength of the colloidal aggregates using magnetic probes. The following studies of this thesis focus on colloidal dispersions in liquid crystals, which are widely used nowadays to clarify new fundamental concepts and original applications.(1–5) Nematic liquid crystals (NLC) are anisotropic organic fluids whose molecules exhibit the positional disorder of a liquid, but are aligned in a certain direction (called the director of the NLC) (6,7). The director field is usually controlled by certain boundary conditions imposed on the plates of the experimental cell. As a novel way to determine the director orientation, I have demonstrated that paramagnetic anisometric inclusions can be used to locally control the in-plane orientation of the director field by means of external weak magnetic fields. To better understand the phenomenon I have also developed a theoretical model based on the free energy density of the NLC. Additionally, I have found that, by rotating the paramagnetic inclusions more than 100º from their initial orientation, a target pattern of dark and light alternated circles appear. This phenomenon is also captured by the model proposed. In the third phase of this project, I have investigated the controlled motion of micrometer inclusions dispersed in a nematic liquid crystal, propelled by an alternating current (AC) electric field. Recently it has been reported in the literature that micrometric particles can be propelled in NLC by using AC fields, provided that these particles break the symmetry of the NLC director around them. The mechanism explaining this propulsion is called Liquid Crystal-Enabled Electrophoresis (LCEEP) (3). By taking advantage of this mechanism, I have demonstrated that aqueous microdroplets are also propelled by LCEEP. One can make these droplets transport solid polystyrene microparticles, or perform a chemical reaction by coalescing two microdroplets containing separate reactants. In addition, I have also demonstrated the control of the activation or deactivation of LCEEP by using photosensitive particles, which change the NLC director symmetry around them upon UV-visible irradiation. In the last part of this thesis I have developed a novel technique to separately control particle driving from steering under LCEEP. Using photo-induced patterns, I assemble and dynamically control ensembles of particles in a NLC medium. These swarms are assembled, transported and dynamically addressed by local irradiation of the photosensitive cell plate with UV light. With this technique I have demonstrated different potential applications: from the formation and reconfiguration of lattices composed of particle swarms, to segregation of particles with different sizes, as well as the storage and subsequent release of a swarm inside physical constraints, or the formation of particle jets. All these phenomena unveil novel possibilities in the field of collective transport of driven inclusions. References: (1) Koenig, G. M.; Lin, I.-H.; Abbott, N. L. Chemoresponsive Assemblies of Microparticles at Liquid Crystalline Interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. 2010, 107, 3998–4003. (2) Lintuvuori, J. S.; Stratford, K.; Cates, M. E.; Marenduzzo, D. Colloids in Cholesterics: Size-Dependent Defects and Non-Stokesian Microrheology. Phys. Rev. Lett. 2010, 105, 178302. (3) Lavrentovich, O. D.; Lazo, I.; Pishnyak, O. P. Nonlinear Electrophoresis of Dielectric and Metal Spheres in a Nematic Liquid Crystal. Nature 2010, 467, 947–950. (4) Pishnyak, O. P.; Tang, S.; Kelly, J. R.; Shiyanovskii, S.; Lavrentovich, O. D. Levitation, Lift, and Bidirectional Motion of Colloidal Particles in an Electrically Driven Nematic Liquid Crystal. Phys. Rev. Lett. 2007, 99, 127802. (5) Tasinkevych, M.; Mondiot, F.; Mondain-Monval, O.; Loudet, J.-C. Dispersions of Ellipsoidal Particles in a Nematic Liquid Crystal. Soft Matter 2014, 10, 2047–2058. (6) Oswald, P.; Pieranski, P. Nematic and Cholesteric Liquid Crystals: Concepts and Physical Properties Illustrated by Experiments; Taylor& Francis: Boca Raton, 2005. (7) Kleman, M.; Lavrentovich, O. D. Soft Matter Physics - An Introduction; Springer, 2003.
Durant aquesta tesi, he treballat amb dispersions de partícules en l'aigua, així com també amb dispersions en cristall líquid nemàtic (NLC). Com a primer estudi d'aquesta tesi, he investigat la influència de camps elèctrics en dispersions col·loïdals de partícules sòlides en un medi aquós. He estudiat l'agregació de partícules col·loïdals isotròpiques (esfèriques) i anisomètriques allargades (amb forma de pera) en un medi aquós confinat en dues dimensions, quan se sotmet a un camp elèctric de corrent alterna (AC) perpendicular a la superfície de confinament. En un segon estudi he demostrat que es poden utilitzar inclusions anisomètriques paramagnètiques per controlar localment l'orientació d’un NLC, per mitjà de camps magnètics febles. Per entendre millor el fenomen també he desenvolupat un model teòric basat en la densitat d'energia lliure del NLC. A més, he estat capaç de generar patrons complexos, que també s’expliquen amb model proposat. En la tercera fase d'aquest projecte, he investigat el moviment controlat d'inclusions micromètriques disperses en NLC, impulsades per un corrent altern (AC) a traves d’un mecanisme anomenat “electroforesi habilitada per cristall líquid” (LCEEP). He demostrat que microgotes aquoses es poden propulsar per LCEEP. Es pot fer que aquestes microgotes transportin micropartícules sòlides de poliestirè, o dur a terme una reacció química mitjançant la coalescència de dos microgotes que contenen reactius separats. A més, també he demostrat el control de l'activació o desactivació de la LCEEP mitjançant l'ús de partícules fotosensibles, en funció de la irradiació UV-visible. En l'última part d’aquesta tesi he desenvolupat una nova tècnica per a controlar separadament la propulsió i la direcció de moviment de les partícules transportades per LCEEP. Mitjançant l’ús de patrons fotoinduïts, es poden formar i controlar dinàmicament conjunts de partícules en un medi de NLC. Aquests eixams es formen, es transporten i es dirigeixen dinàmicament per irradiació local amb llum UV. Amb aquesta tècnica he pogut demostrat diferents aplicacions potencials: des de la formació i reconfiguració de xarxes cristal·lines compostes d'eixams de partícules, a la segregació de partícules de diferents mides, així com l'emmagatzematge i posterior alliberament d'un eixam dins d’un canal micromètric, o la formació de jets de partícules. Tots aquests fenòmens revelen noves possibilitats en el camp del transport col·lectiu d'inclusions propulsades.

El gran número y diversidad de analíticas que requieren los productos farmacéuticos hacen necesario el desarrollo de metodologías de análisis rápidas y fiables. Actualmente, la aplicación de nuevas técnicas instrumentales para control de calidad, que permitan la obtención de resultados de forma rápida y más económica, es un campo de investigación muy activo en la industria farmacéutica. En esta tesis se han utilizado dos técnicas de reciente aparición: la electroforesis capilar (EC) y la espectroscopia en el infrarrojo cercano (NIR) para desarrollar metodologías de análisis para productos farmacéuticos. Ambas técnicas, aunque muy diferentes, han sido aplicadas con éxito para cubrir distintas necesidades analíticas.
EC se ha utilizado para el desarrollo y la validación de un método para la separación y determinación de los componentes de un preparado farmacéutico. Dado el carácter iónico de los componentes, se trabaja con la modalidad de electroforesis capilar de zona (CZE). La resolución y alta eficacia obtenidas permiten aplicar este método tanto a la determinación del contenido en principio activo como al seguimiento de la estabilidad del preparado. Para resolver los seis posibles isómeros posicionales de un producto derivado del preservante del fármaco se han comparado tres opciones: HPLC, CZE y la cromatografía electrocinética micelar (MEKC). Ésta última es la que permite obtener la mejor resolución, separando cinco de los seis isómeros posibles.
NIR ha sido aplicado tanto en análisis cualitativo como en el análisis cuantitativo de distintos fármacos. La identificación se ha realizado desarrollando bibliotecas de espectros y para mejorar la discriminación entre productos semejantes se ha propuesto una estrategia de trabajo de bibliotecas en cascada (identificación en la biblioteca general y si es necesario en una segunda más restringida y discriminante) que permiten identificar completamente una muestra. También se ha utilizado la técnica NIR en el desarrollo de métodos para la determinación de los principios activos en dos preparados farmacéuticos con presentaciones distintas: un granulado y un gel. Para el granulado, se han comparado distintas estrategias posibles en el desarrollo del método, mientras que para el gel se han discutido las posibilidades para el registro de los espectros. Ambos métodos han sido desarrollados y validados con éxito.
Las metodologías analíticas desarrolladas han demostrado su eficacia en la resolución de varios aspectos del control de calidad farmacéutico. Tanto la electroforesis capilar como la espectroscopia NIR poseen un gran potencial como alternativas a los métodos ya implantados, permitiendo optimizar tiempos y costes.
The high number and diversity of analytical tests required for pharmaceutical products encourages the development of expeditious and reliable analytical methods. Nowadays, the application of analytical techniques to obtain results more and economic and rapidly is a very active research field in pharmaceutical industry. In this work, two recently appeared techniques: capillary electrophoresis (CE) and near-infrared spectroscopy (NIR), have been used in the development of analytical methodologies for different drug products. Despite its differences, both techniques have been successfully applied to solve different analytical problems.
CE has been used in the development and validation of a method for separation and determination of all components in a formulation. Due to ionic condition of all components, capillary zone electrophoresis (CZE) has been chosen as the better electrophoretic mode. The high resolution and efficiency obtained allow to apply this method not only in the determination of the active substance but also for stability control of the formulation. In order to resolve the six possible isomers of a product derived of the preservative in the formulation, three different options have been compared: HPLC, CZE and micellar electrokinetic chromatography (MEKC). Characteristics of the last, which includes a surfactant as pseudostationary phase, allow to obtain a higher resolution, resolving five of the six possible isomers.
NIR has been applied in qualitative and quantitative analysis. In qualitative analysis, NIR has been used in the development of spectral libraries for identifying a vast number of products. A new strategy has been proposed, with the design of cascade libraries (a first identification in a general library and, if necessary, a second one in a more reduced and discriminating sub-library) for complete identification of a sample. In quantitative analysis, NIR has been employed in the development of methods for determining the active in two drug products with different presentations: a granulate and a hydrogel. In the granulate method, different calibration strategies have been compared, while in the hydrogel method the spectral register method has been discussed. Both methods have been successfully developed and validated, yielding very good results.
Analytical methodologies developed have confirmed its usefulness for pharmaceutical quality control. Both CE and NIR show a great potential as alternative methods to conventional techniques, allowing the optimisation of costs and times of analysis.

La determinació de biomarcadors peptídics en fluids biològics resulta de gran interès pel diagnòstic, la monitorització i el pronòstic de nombrosos desordres. En aquesta tesi doctoral s’han explorat diverses metodologies d’extracció en fase sòlida acoblada en línia amb l’electroforesi capil•lar amb detecció per espectrometria de masses (SPE-CE-MS) per a l’anàlisi de biomarcadors peptídics, que es troben a baixa concentració en matrius complexes. S’han estudiat principalment pèptids opiacis que estan relacionats amb desordres neurològics i síndromes de dolor crònic. S’han avaluat diverses fases estacionàries comercials per a l’anàlisi de pèptids opiacis per SPE-CE emprant preconcentradors amb frits i la fase estacionària C18 és la que ha proporcionat millors resultats per a l’anàlisi de mostres de plasma humà. La saturació del preconcentrador s’ha previngut mitjançant un tractament de mostra previ que consta de dues etapes, una precipitació amb acetonitril seguida d’una filtració per centrifugació. Com que l’etapa de filtració és crítica per tal d’obtenir les màximes recuperacions dels anàlits i eliminar la matriu de la mostra, s’han provat filtres de diversos talls moleculars i diverses condicions de filtració. L’acoblament de la SPE-CE a un espectròmetre de masses amb analitzador de temps de vol (TOF-MS) mitjançant una interfase amb líquid auxiliar convencional ha permès disminuir els LOD per a la majoria dels pèptids opiacis en mostres de plasma humà. Per tal de poder detectar concentracions inferiors, s’ha demostrat que la combinació de la SPE-CE amb la tècnica de separació electroforètica isotacoforesi transitòria (tITP) és una bona alternativa. També, s’ha comparat el comportament de preconcentradors amb i sense frits per a l’anàlisi de pèptids opiacis per C18-SPE-CE-UV i C18-SPE-CE-TOF-MS. S’ha avaluat un prototip recentment desenvolupat d’una interfase nanoelectroesprai (nanoESI) sense líquid auxiliar basada en una punta porosa per a l’anàlisi de pèptids opiacis per CE-MS i també, s’ha establert una metodologia de C18-SPE-CE-TOF-MS emprant un innovador preconcentrador sense frits compatible amb les dimensions específiques del capil•lar de separació requerit per a la interfase nanoESI sense líquid auxiliar. Una altra possibilitat per a millorar la detecció de pèptids és utilitzar fases estacionàries amb una selectivitat més elevada que el C18, com les fases estacionàries d’immunoafinitat. S’han explorat dos procediments de preparació d’aquest tipus de fases estacionàries: la immobilització d’anticossos intactes oxidats (immunoglobulina G, IgG) a través dels carbohidrats a partícules de sílice activades amb grups hidrazida i la immobilització de fragments d’IgG (fragment d’unió a l’antigen, Fab’) a partícules de sílice activades amb grups succinimidil. Seguint els procediments establerts, s’ha preparat una fase estacionària amb IgG i una altra amb Fab’ contra les endomorfines 1 i 2 (End1 i End2). S’han optimitzat i avaluat metodologies d’IA-SPE-CE-TOF-MS per a l’anàlisi de mescles de patrons d’End1 i d’End2 i s’han analitzat mostres de plasma humà. També, s’ha explorat l’aplicabilitat d’una fase estacionària d’immunoafinitat amb IgG per a l’anàlisi de biomolècules d’elevat pes molecular per IA-SPE-CE-TOF-MS emprant la glicoproteïna transferrina com a model.
The determination of peptide biomarkers in biological fluids has become crucial for the diagnosis, monitoring and prognosis of numerous disorders. This doctoral thesis explores several on-line solid-phase extraction capillary electrophoresis mass spectrometry (SPE-CE-MS) methodologies for the analysis of peptide biomarkers that are found at low concentration in complex matrices, such as opioid peptides. Several commercial sorbents have been compared for the analysis of opioid peptides by SPE-CE using microcartridges with frits and the C18 sorbent has provided the best results for the analysis of human plasma samples. The saturation of the on-line SPE microcartridge has been prevented by a double-step sample clean-up pretreatment that consists of precipitation with acetonitrile and centrifugal filtration. The coupling of SPE-CE with a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) by a conventional sheathflow interface has provided better LODs. In order to detect lower concentrations, the combination of SPE-CE with the electrophoretic preconcentration technique transient isotachophoresis (tITP) has demonstrated to be a good alternative. The performances of frit and fritless microcartridges have been compared for the analysis of opioid peptides by C18-SPE-CE-UV and C18-SPE-CE-TOF-MS. A recently developed sheathless nanoelectroespray (nanoESI) interface based on a porous tip has also been evaluated for the analysis of opioid peptides by CE-TOF-MS and a C18-SPE-CE-TOF-MS using a novel fritless microcartridge. Finally, two different procedures for the preparation of immunoaffinity sorbents (IA) have been explored: the immobilization of intact antibodies (immunoglobulin G, IgG) or IgG fragments (antigen binding fragment, Fab’) to silica particles. Two IA sorbents against Endomorphins 1 and 2 have been prepared following the established procedures. IA-SPE-CE-TOF-MS methodologies have been optimized and evaluated for the analysis of standards solutions of End1 and End2 and human plasma samples. The suitability of an immunoaffinity sorbent with IgG has also been explored for the analysis of large biomolecules by IA-SPE-CE-TOF-MS using the glycoprotein transferrin as a model.

Fullerenes or Buckyballs are a group of carbon nanoparticles, classified as engineered nanoparticles. The advent of fullerene nanoparticles in commercial, industrial and biomedical applications raises concern about their potential ecological and human health risks. Fullerenes have not been regulated, although the European Commission (European Commission, 2002), the European Parliament (European Parliament, 2008) and the US Environmental Protection Agency (EPA, 2015) have prioritised legislation on nanomaterials handling and disposal. Given the current lack of studies regarding their presence, fate and behaviour in consumer products and environmental matrices and their associated human and environmental risks it is becoming increasingly important to be able to characterise and quantitate fullerene nanoparticles, especially derivatives, in a wide range of matrix types. To fill these knowledge gaps, one of the objectives of this thesis was the development of analytical methodologies for the determination of pristine and surface modified fullerenes by ultra-high performance liquid chromatography coupled to MS (UHPLC-MS) and by nonaqueous capillary electrophoresis (NACE) and micellar electrokinetic capillary chromatography (MECC) with UV-Vis detection in different environmental matrices (water and sediment samples) and cosmetic products, respectively. In addition, in this thesis the size and shape characterisation of surface modified fullerenes in aqueous solutions of different pH and ionic strength values was studied by combining several techniques (CE, AF4-MALS and TEM). Regarding the analysis of fullerenes, the use of a sub-2 µm C18 column, toluene-methanol as a mobile phase and of APPI ionisation source allowed to develop a UHPLC method coupled to MS/(MS) for the analysis of five pristine (C60-C84) and three surface modified fullerenes (PCBM, PCBB and C60-pyrr) in less than 4.5 min showing high sensitivity and selectivity. Furthermore, the employment of H-SIM mode for pristine fullerenes (mass resolving power >12,500 FWHM), and SRM mode for fullerene derivatives, allowed achieving MLODs lower than most of those previously reported in the literature. For the extraction of the water samples, liquid-liquid extraction (LLE) with toluene and the addition of salt is proposed obtaining recoveries higher than 83 %. For sediments we propose the use of pressurised liquid extraction (PLE) performed at a high extraction temperature (150 °C) using one extraction cycle of 10 min achieving good recoveries (70-92 %). The developed methodology allowed us to report for the first time the presence of C60-pyrr, PCBM and PCBB in sediments (2.0 - 8.5 ng Kg-1 levels) and of PCBM and PCBB in pond water samples (0.1- 5.1 pg L-1 levels). Two CE methods, a non-aqueous (NACE) and a micellar (MECC) method have been developed. LOQs at mg L-1 levels were obtained with both methods making possible their application for the analysis of cosmetic products. Both methods (NACE and MECC) were applied for the quantitation of C60 in cosmetic products and the results are comparable to those obtained by LC-MS (in an anti-aging serum). With respect to the characterisation of fullerene aggregates, the use of AF4-MALS demonstrated that fullerene aqueous solutions contain particles of different aggregation degree in agreement with TEM micrographs. The size determination of the studied compounds by AF4 at different salt concentrations demonstrated that the enhanced aggregation of fullerenes with the increase in the ionic strength could explain the broad, multiple and distorted peaks obtained in MECC which were more obvious at high buffer concentration. The hydrodynamic radii of polyhydroxy-fullerenes increased more than 5 times and those of the carboxy-fullerene derivatives up to 180 nm (3rd peak) (for C60-pyrr tris acid) for 0.1M NaCl. The propensity of fullerenes to aggregate in both aqueous solutions and organic solvent mixtures justify the electrophoretic peak profiles observed in MECC (i.e., broad peaks at high electrolyte concentration) and their higher retention in C18 columns using toluene-acetonitrile compared to toluene-methanol mobile phases (due to the formation of bigger aggregates), respectively.
Los fulerenos son cada vez más utilizados en medicina (administración de fármacos), en procesos ambientales (remediación) y en la industria (células solares) debido a sus propiedades estructurales y electrónicas únicas. En este contexto, es importante aumentar el conocimiento actual con respecto a las características, el comportamiento, el destino y la toxicidad de los fulerenos, una nueva clase de contaminantes emergentes orgánicos. Por lo tanto, es cada vez es más importante ser capaz de caracterizar y cuantificar las nanopartículas de fulerenos en una amplia gama de tipos de matriz y para este fin, se necesita el desarrollo de métodos analíticos para su análisis cuantitativo y cualitativo. Además de la determinación de las concentraciones de fulerenos en matrices complejas, se requiere su caracterización en términos de grado de agregación, distribución del tamaño y morfología de la superficie en soluciones acuosas de diferentes características (fuerza iónica y pH) con el fin de proporcionar herramientas para establecer su riesgo. En esta tesis se han establecido metodologías para el análisis de ocho fulerenos en muestras ambientales (agua y sedimentos) por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas y se ha detectado por la primera vez la presencia de tres derivados de fulerenos. Además, se ha desarollado metodología para el análisis de fulerenos hidrofobicos y solubles en agua mediante la electroforesis capilar en medio no-acuoso (NACE) y la cromatografía capilar electrocinética micelar (MECC) y los metodos se han aplicado para la determinación de C60 en productos cosmeticos. Por último, se ha estudiado el comportamiento de agregación de los fulerenos en soluciones acuosas de diferentes características (pHs, fuerzas iónicas) mediante diferentes técnicas (electroforesis capilar (CE), asymetrical flow-field flow fractionation (AF4), microscopia electrónica de transmisión (TEM)). En este contexto se han determinado los tamaños de los agregados formados en las condiciones evaluadas, y la morfología de las partículas.

L'adenocarcinoma pancreàtic és una neoplàsia amb mal pronòstic per la que no existeixen marcadors específics. En aquesta tesi s'han estudiat possibles alteracions de les estructures glucídiques de la ribonucleasa pancreàtica humana (RNasa 1) de sèrum amb l'objectiu de determinar el seu ús diagnòstic. S'han descrit les estructures glucídiques de la RNasa 1 sèrica i de línies cel·lulars endotelials, i s'ha observat un increment en la proporció d'estructures biantenàries amb Fc en la RNasa 1 sèrica de pacients amb càncer de pàncreas, fet que podria ser d'utilitat diagnòstica. També, donada la gran similitud entre les estructures glucídiques descrites per la RNasa 1 sèrica i per l'endotelial, l'origen de la RNasa 1 sèrica sembla ser principalment endotelial. La RNasa 1 també s'ha avaluat per electroforesi bidimensional i s'ha establert una correlació entre el contingut d'àcid siàlic i el seu pI, fet que pot ajudar a la interpretació dels mapes bidimensionals d'altres glicoproteïnes.
Pancreatic adenocarcinoma has one of the highest mortality rates of all neoplasias and it has no specific markers. In this work, possible alterations in the glycan structures of human pancreatic ribonuclease (RNase 1) present in serum are investigated with the aim of determining its diagnostic utility. Serum and endothelial RNase 1 glycan structures have been described and an increase of biantennary structures with Fc in serum RNasen 1 from pancreatic cancer patients could be observed, what can be of diagnosis utility. Also, due to the high similarity between serum RNase 1 and endothelial RNase 1 glycan structures, it was concluded that endothelium can be the main producer of serum RNase 1. RNase 1 was also evaluated by two-dimensional electrophoresis and a correlation between the sialic acid content and the observed pI decrease could be establish, what may be very significant for understanding and interpreting two-dimensional maps from other glycoproteins.

Esta tesis doctoral se ha centrado en el desarrollo de metodologías analíticas adecuadas que permitan la separación, detección, caracterización e identificación de proteínas y metabolitos como biomarcadores de diferentes enfermedades o procesos patológicos. Concretamente, se ha centrado en el análisis de biomarcadores proteicos tales como la transtiretina (TTR), una proteína oligomérica con una gran tendencia a formar agregados amiloides y relacionada con la polineuropatía amiloidótica familiar tipo I (FAP-I), y el antígeno carcinoembrionario humano (CEA), una glicoproteína biomarcadora del cáncer de colon y de la metástasis de hígado (derivada del cáncer de colon). También se ha hecho especial énfasis en el estudio de biomarcadores metabólicos relacionados con la progresión de la enfermedad del Huntington, una enfermedad neurodegenerativa hereditaria caracterizada también por la formación de agregados amiloides. La dificultad de las metodologías empleadas para el análisis de biomarcadores proteicos y metabólicos reside principalmente en el tratamiento de muestra que se tiene que llevar a cabo para aislar y preconcentrar los compuestos de interés presentes en muestras biológicas complejas (tales como suero y plasma) y en la utilización de técnicas de separación y detección adecuadas que permitan la correcta caracterización de dichos biomarcadores. Por este motivo, se han empleado diferentes estrategias para el análisis dirigido (targeted analysis) y no dirigido (untargeted analysis, global profiling) de biomarcadores proteicos y metabólicos, así como para el análisis de proteínas mediante estrategias de top-down y bottom-up, cada una con sus ventajas e inconvenientes. También se han evaluado diferentes técnicas de separación de alta resolución miniaturizadas como la electroforesis capilar (CE), la cromatografía de líquidos capilar (CapLC) y la movilidad iónica (IM), todas ellas acopladas a la espectrometría de masas (CE-MS, CapLC- MS y IM-MS, respectivamente). En resumen, esta tesis doctoral presenta una visión global de las estrategias analíticas más utilizadas actualmente para el estudio de biomarcadores en el campo de la investigación proteómica y metabolómica, con el objetivo de poder diagnosticar, predecir un debut temprano y proponer nuevas dianas terapéuticas a diferentes enfermedades y procesos patológicos.
The present thesis is focused on the separation, detection and characterization of proteins, glycoproteins and metabolites in biological fluids that may be able to act as disease biomarkers. Specifically, it addresses the analysis of amyloidotic neurodegenerative and cancer biomarkers from different proteomics and metabolomics perspectives, depending on the analytical and the sample preparation strategies employed: (i) targeted or untargeted strategies and (ii) top-down or bottom-up strategies (only in the case of proteomics analysis). Furthermore, different microscale separation techniques, such as capillary electrophoresis (CE), capillary liquid chromatography (CapLC) and ion mobility spectrometry (IMS), all of them hyphenated to mass spectrometry (CE-MS, CapLC-MS and IM-MS, respectively) are evaluated for the analysis of different proteins and metabolites of interest. Transthyretin (TTR) is a homotetrameric protein known to misfold and aggregate causing different types of amyloidosis. Familial amyloidotic polyneuropathy type I (FAP-I), which is the most common hereditary systemic amyloidosis, is associated with a TTR variant that presents a single amino acid substitution of valine for methionine at position 30 of the monomeric sequence (Met30). In this thesis, we describe different off-line and on-line immunoprecipitation (IP) procedures under denaturing and non-denaturing conditions for the isolation of TTR from healthy controls and FAP-I human serum samples prior analysis by CE- MS, CapLC-MS and IM-MS. The obtained results permit us to propose complementary and reliable methods to screen, diagnose, and follow-up patients with suspected TTR amyloidosis, as well as to gain a novel insight into the structural changes on TTR proteoforms or oligomers to understand the mechanism underlying FAP-I. Huntington’s disease (HD) is also subject of study of this thesis. HD is an inherited neurodegenerative disorder caused by an expansion of the cytosine-adenine-guanine (CAG) repeat in the exon 1 of the huntingtin gene (HTT), which encodes a stretch of glutamines in the huntingtin protein that make it prone to form amyloid fibrils. However, the mechanisms involving aggregation onset or progression are not fully understand yet. Therefore, studies targeting metabolism as an alternative to the huntingtin protein are regarded as necessary. The present thesis describes the optimization of a plasma pretreatment for optimized recovery of low molecular mass compounds prior to on-line solid-phase extraction capillary electrophoresis mass spectrometry with a C18 chromatographic sorbent (C18-SPE-CE-MS), a novel sensitive method for on-line sample clean-up and concentration enhancement in metabolomics studies. Moreover, it presents the capacity of the C18-SPE-CE-MS methodology to analyze low molecular mass compounds in plasma samples from wild-type (wt) and HD mice in combination with advanced chemometric data analysis tools, such as multivariate curve resolution alternating least squares (MCR-ALS), principal component analysis (PCA) and partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), for the identification of potential metabolite biomarker candidates involved in HD progression, which could provide a window of opportunity for prediction of disease onset, evaluation of HD early progression and response to treatment. Colorectal cancer (CRC) and liver metastatic disease are also studied in this thesis. Specifically, human carcinoembryonic antigen (CEA) is a highly N-glycosylated protein (60% m/m of glycans and 28 N-linked glycosylation sites) found in normal human colonic epithelial cells, as well as in tumor forming CRC cell lines. Despite the demonstrated usefulness of CEA as a biomarker for monitoring CRC and liver metastatic disease patients’ therapy, improvement in the selectivity of CEA detection remains a challenge for clinical tumor diagnosis. This thesis describes a multienzyme sheathless capillary electrophoresis tandem mass spectrometry (CE- MS/MS) strategy for the N-glycosylation analysis of CEA samples purified from human colon carcinoma and human liver metastases. The obtained results permit us to propose novel potential N-glycopeptide markers, which could provide important biologic information on how N-glycosylation may influence CEA structure in CRC and liver metastatic disease.

DETERMINATION OF ANTIBIOTICS IN BIOLOGICAL SAMPLES BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS
The main objective of this Thesis is the development of analytical methods for determining several antibiotic families by capillary electrophoresis.
Other objective of this Thesis is the application of capillary electrophoresis as analytical technique for determining antibiotic residues in biological samples. These samples are very complex and for this reason we have developed pretreatment systems for extracting the compounds from the matrix and to diminish the amount of interfering substances.
In the other way, one of the most important disadvantages in capillary electrophoresis is that usually we can not determine low concentrations. For this reason another objective of this Thesis is to study several ways to decrease detection limits of capillary electrophoresis system. Thus we have studied several on-column preconcentration systems, such as field amplified sample injection and capillary isotacophoresis. These systems are able to increase rapidly and simply the sensibility of the system several magnitude orders.
By this way in this Thesis we have developed several analytical methods for determining several antibiotics and antibiotic families in different types of biological samples. We have studied the following antibiotic families: penicillins, quinolones, tetracyclines and aminoglycosides. Moreover, they have been analysed in several biological samples, such as plasma and different tissue samples (e.g. liver, kidney and muscle). All of these studies have been developed in animal samples except in one of them in which it was developed in human serum.
This Doctoral Thesis is structured in four chapters. The first one includes an introduction in which is explained the antibiotic concept and is described the legislation which controls the administration of antibiotics in animals, and explains the necessity of developing analytical methods to determine residues at low levels in biological samples.
The second one includes a review about several papers in which are developed the analysis of antibiotics in biological samples. There is described which are the systems more used in this kind of studies and the use of capillary electrophoresis as a real and suitable alternative. Moreover, this chapter includes a copy of work which analyzed antibiotics in biological samples by capillary electrophoresis. This work will be published in an international journal, Trends in Analytical Chemistry.
The third chapter includes the experimental part of this Thesis. By this way, this chapter includes the eight works published in international journals (Electrophoresis, Journal of Chromatography B and Chromatographia). Before each paper there is included a brief explanation about the paper contents. Some of published papers are based in the study of several types of pretreatment systems. And the other works include comparative studies to determine which is the best system to increase system sensitivity.
The last chapter describes the conclusions obtained through these works.
DETERMINACIÓ D´ANTIBIÒTICS EN MOSTRES BIOLÒGIQUES PER ELECTROFORESI CAPIL·LAR
L'objectiu fonamental de la present Tesi Doctoral ha estat desenvolupar mètodes analítics per dur a terme la determinació de diferents famílies d'antibiòtics per electroforesi capil·lar.
Un altre objectiu de la present Tesi Doctoral ha estat aplicar l'electroforesi capil·lar com a tècnica analítica per a la determinació de residus d'antibiòtics en mostres biològiques. Degut a la complexitat d'aquestes mostres ha estat necessari desenvolupar sistemes de pretractament de les mostres per tal d'extreure els analits de la matriu i disminuir d'aquesta manera la quantitat de substàncies interferents degudes als components de la matriu de la mostra, els quals molts cops es troben a concentracions molt majors que els compostos d'interès.
Per altra banda, un dels principals inconvenients de l'electroforesi capil·lar és que en molts casos no és una tècnica el suficientment sensible per tal de determinar concentracions baixes. És per això que un altre objectiu d'aquesta Tesi Doctoral ha estat estudiar maneres d'augmentar la sensibilitat del sistema. S'han estudiat sistemes de preconcentració on-column, com és la injecció de grans volums de mostra i la isotacoforesi capil·lar. Aquests sistemes es caracteritzen perque permeten augmentar de manera ràpida i simple la sensibilitat del sistema diversos ordres de magnitud.
D'aquesta manera en la present Tesi Doctoral s'han desenvolupat diferents mètodes analítics per a la determinació de diferents antibiòtics i famílies d'antibiòtics en diferents tipus de mostres biològiques. Les famílies d'antibiòtics estudiades han estat les penicil·lines, les quinolones, les tetraciclines i els aminoglicòsids. I s'han analitzat en diferents tipus de mostres biològiques com són plasma i diferents teixits (fetge, ronyó i múscul). En tots els casos els estudis s´han realitzat en mostres animals, excepte en un cas en el que es va desenvolupar l´estudi en sèrum humà.
Aquesta Tesi Doctoral s'ha estructurat en quatre capítols. En el primer es fa una introducció al concepte d'antibiòtic i es descriu la normativa que hi ha establerta per a la seva administració en animals així com la necessitat de desenvolupar estudis de residus que permetin determinar els antibiòtics a baixos nivells de concentració en les mostres biològiques.
En el segon capítol es mostra una revisió actualitzada de l'estat d'investigació en el camp dels antibiòtics. Es descriu quins han estat els sistemes més utilitzats en aquestes anàlisis i l'alternativa que suposa l'ús de l'electroforesi capil·lar en aquests estudis degut a les seves característiques. Aquest capítol inclou els diferents sistemes de tractament de mostres així com es descriuen diferents sistemes de preconcentració on-column per electroforesi capil·lar. Aquest mateix capítol inclou una còpia del treball que serà publicat a la revista internacional "Trends in Analytical Chemistry" que va sorgir arrel de l'estudi bibliogràfic sobre l'anàlisi d'antibiòtics en mostres biològiques per electroforesi capil·lar.
En el tercer capítol s'inclou la part experimental realitzada en aquesta Tesi Doctoral. Aquest capítol es divideix en vuit apartats que corresponen als vuit treballs publicats en revistes internacionals ("Electrophoresis", "Journal of Chromatography B" i "Chromatographia"). Cada apartat inclou una breu explicació del que s'ha estudiat en el treball així com una còpia del treball publicat. En alguns dels treballs s'han desenvolupat mètodes analítics basats en l'estudi de sistemes de pretractament de les mostres biològiques per tal de dur a terme l'anàlisi dels antibiòtics. S´ha determinat quins tipus de tractament és més adequat en funció de l´antibiòtic i de la mostra. També en aquests treballs s'han desenvolupat estudis comparatius per tal de determinar quins sistemes de preconcentració resulten més efectius per tal d'augmentar la sensibilitat del sistema i com varien els resultats en funció de la família d'antibiòtics que s'està estudiant.
Finalment, en el quart capítol es descriu a quines conclusions s'ha arribat després de l'estudi de recerca realitzat així com dels resultats obtinguts a la part experimental.

Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDA), the most common pancreatic cancer, remains one of the most lethal tumor types, with extremely low survival rates due to late diagnosis and resistance to standard therapies. Expression of tumor-associated carbohydrate antigens such as SLeX enhances several tumor features like cell migration or metastasis, representing a good source of new therapeutic targets and biomarkers. In this work, it has been studied the effect of the inhibition of the expression of the main genes that code for the enzymes responsible for the final steps of SLeX biosynthesis (the α2,3-sialyltransferases). Silencing of ST3GAL3 and ST3GAL4 in two PDA cell lines led to a significant reduction in SLeX associated with a decrease in cell migration, invasion and adhesion to E-selectin, decreasing PDA metastatic potential. Also, using glycoproteomic techniques, we identified the glycoprotein MFAP4 carrying SLeX as potential PDA biomarker since it is only present in PDA tissue samples
El adenocarcinoma ductal pancreático o PDA, es el tipo más frecuente de cáncer de páncreas. El PDA es uno de los tumores más letales, con tasas de supervivencia extremadamente bajas, debido principalmente al diagnóstico tardío y su amplia resistencia a las terapias actuales. La expresión de antígenos carbohidratos asociados a tumores como el SLeX potencia varias características tumorales como la migración celular o metástasis, por lo cual representa una buena fuente de nuevas dianas terapéuticas y biomarcadores. En este trabajo, se ha estudiado el efecto de la inhibición de la expresión de los principales genes que codifican para las enzimas responsables de la biosíntesis de SLeX en sus etapas finales (las α2,3-sialiltransferasas). El silenciamiento de ST3GAL3 y ST3GAL4 en dos líneas celulares de PDA produjo a una reducción significativa en los niveles de SLeX. Este descenso se asoció con una disminución en la migración, invasión y adhesión celular a E-selectina, disminuyendo el potencial metastásico del PDA. Además, mediante técnicas glico-proteómicas, pudimos identificar la glicoproteína MFAP4 portadora de SLeX como potencial biomarcador de PDA, ya que esta glicoforma solo fue detectada en la cohorte de muestras de tejido de PDA

La cromatografia de líquids d'alta eficàcia (HPLC) és la tècnica de separació més àmpliament utilitzada, degut a la seva sensibilitat, exactitud de les determinacions quantitatives i aplicabilitat a anàlits no volàtils o termolàbils d'interès científic i industrial. L'electroforesi capil·lar juga un paper fonamental en bioquímica. Aquesta tècnica permet obtenir anàlisis ràpides amb una elevada resolució i un baix consum de reactius auxiliars, fet que minimitza la generació de residus.

L'objectiu principal d'aquesta tesi doctoral en relació a la cromatografia de líquids ha residit en l'establiment d'un model que expliqui la variació del pH en fases mòbils hidroorgàniques en funció de la fracció del solvent orgànic. El pH de la fase mòbil condiciona el grau d'ionització dels anàlits amb propietats àcid/base, i en funció d'aquesta ionització es produeixen variacions significatives en la retenció cromatogràfica dels anàlits, que poden afectar notablement la selectivitat. Aquest model s'ha desenvolupat pels dos solvents orgànics més usats en HPLC, acetonitril i metanol, i pels sistemes amortidors més comuns (amoni/amoníac, àcid acètic/acetat, àcid fosfòric/dihidrogenfosfat/hidrogenfosfat i àcid cítric/dihidrogencitrat/hidrogencitrat/ citrat) a les concentracions de treball més habituals (de 0.001 a 0.1 mol·L-1), fins a un 60% en volum de modificador orgànic per l'acetonitril i un 80% pel metanol.
Un cop desenvolupat i avaluat el model, el segon objectiu ha consistit en la interpretació i l'estimació dels temps de retenció cromatogràfics d'anàlits amb propietats àcid/base, en termes de la variació dels seus valors de pKa i del pH de les fases mòbils hidroorgàniques en funció del contingut del solvent orgànic.

En relació a l'electroforesi capil·lar zonal (CZE) el primer objectiu ha consistit en la caracterització del nitrometà com a solvent orgànic d'ús en electroforesi capil·lar no aquosa (NACE), en estudiar la viabilitat de la detecció conductimètrica i ultraviolada, la dependència de la mobilitat dels ions en funció de la força iònica del medi, l'establiment d'una escala adequada de pH i fenòmens d'associació. El segon objectiu ha residit en la resolució d'un problema analític concret, la separació d'un fàrmac antidepressiu atípic poc soluble en aigua de dos dels seus metabòlits principals, usant electroforesi capil·lar amb solvents no aquosos, concretament metanol i acetonitril.
"Organic solvents in capillary electrophoresis and liquid chromatography"

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The use of methanol- and acetonitrile- aqueous buffer mobile phases in RP-HPLC is a common election when performing chromatographic separations of ionisable analytes. The addition of organic solvent to the aqueous buffer to prepare such a mobile phase changes the buffer capacity and the pH of the solution. In this thesis work, the variation of these buffer properties is studied for acetic acid-acetate, phosphoric acid-dihydrogenphosphate-hydrogenphosphate, citric acid-dihydrogencitrate-hydrogencitrate-citrate, and ammonium-ammonia buffers. It is well established that the pH change of the buffers depends on the initial concentration and aqueous pH of the buffer, on the percentage of organic solvent added, and on the particular buffer used. The proposed equations allow the pH estimation of methanol- and acetonitrile-water buffered mobile phases up to 80% and 60%, respectively, in volume of organic modifier from initial aqueous buffer pH and buffer concentration (before adding the organic modifier) between 0.001 and 0.01 mol L−1. From both the estimated pH values of the mobile phase and the estimated pKa of the ionisable analytes, it is possible to predict the degree of ionisation of the analytes and therefore, the interpretation of acid-base analytes behaviour in a particular hydroorganic buffered mobile phase.

Nitromethane has several properties that make it an interesting solvent for capillary electrophoresis especially for lipophilic analytes that are not sufficiently soluble in water. In the present thesis we investigated the change of electrophoretically relevant analyte properties (mobilities and pKa values) in nitromethane in dependence on the most important experimental conditions determined by the background electrolyte: the ionic strength and the pH.
Sertindole, an atypical antipsychotic drug, was separated by capillary electrophoresis from its two main metabolites norsertindole and dehydrosertindole. The low solubility of the analytes in water was overcome by the use of methanol and acetonitrile as solvents for the background electrolyte.

RESUMEN La hipusinación es una modificación post-traduccional dependiente de espermidina que activa al factor de traducción eIF5A, y que es esencial en todos los eucariotas. En los últimos años se ha sugerido un importante papel para eIF5A en los procesos de senescencia y respuesta a estrés ambiental en plantas, en el establecimiento de la polaridad celular en levadura y su implicación en enfermedades tales como diabetes, VIH-1 o cáncer en humanos. Con el objetivo de caracterizar a nivel molecular la actividad biológica de eIF5A en plantas, hemos establecido una metodología basada en técnicas bioquímicas e inmunológicas para determinar el patrón de hipusinación de eIF5A en A. thaliana. La puesta a punto de esta metodología nos ha permitido demostrar que el tratamiento con ácido abscísico inhibe la activación por hipusinación de la isoforma eIF5A1. Además, para tratar de estudiar la función de eIF5A durante el desarrollo de A. thaliana, hemos realizado estudios funcionales basados en la caracterización de plantas transgénicas capaces de desactivar genéticamente la ruta dependiente de eIF5A mediante ARN de interferencia, condicionado a la aplicación de dexametasona. La desactivación condicional de la enzima de hipusinación desoxihipusina sintasa, produjo alteraciones durante el desarrollo y en respuesta a condiciones adversas de crecimiento, tales como floración temprana, inhibición del crecimiento de la raíz, alteraciones en los pelos radiculares, ramificación exacerbada del tallo, presencia de elementos traqueales completamente lignificados en hipocotilos, niveles reducidos de óxido nítrico e hipersensibilidad al ácido abscísico, sal y glucosa. Recientemente se ha demostrado que eIF5A es necesario para la traducción de proteínas con más de 3 prolinas sucesivas en su secuencia. El análisis de ontología realizado reveló un enriquecimiento de proteínas con poli-prolinas entre las implicadas en la organización del citoesqueleto de actina. La alteración de la actividad de eIF5A provocó defectos en la estructuración de los filamentos de actina en A. thaliana, S. cerevisiae y H. sapiens. El estudio de mutantes termosensibles de levadura demostró el requerimiento de eIF5A durante el proceso de reproducción sexual a través de la traducción de la formina Bni1. Los experimentos de regulación traduccional en células HeLa demostraron que el silenciamiento vía ARN de interferencia de eIF5A1 provocaba un defecto en la tasa de traducción de la formina FMNL1 y la proteína ezrina. Estos resultados confirman que la actividad esencial de eIF5A en el ribosoma parece conservada en organismos eucariotas, y afecta fundamentalmente a proteínas con poli-prolinas implicadas en la organización del citoesqueleto de actina.
Belda Palazón, B. (2014). Hipusinación del factor de traducción eIF5A dependiente de poliaminas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/48474
TESIS

[EN] The present PhD thesis is focused on the study of new approaches able to improve the performance of microarrays. Aspects such as the nature of the surfaces and the probes, functionalization of the substrates, probe printing, immobilization and target detection were considered in the fabrication process. Within all these features, modulation of the surface behavior and probe anchoring were the most challenging aspects, as the interface is key for the immobilization of the receptors and the later detection, which will determine the performance of the final device. In this work, two microarray types have been developed, one for oligonucleotides and another one for antibodies. Then, a characterization of the reached achievements is done. All the routes have in common the use of light to catalyze the attachment of bioreceptors on the surface substrates, employing click-chemistry reactions. In the first chapter, the state of the art of microarray technology is overviewed, with special focus in the main aspects of microarray design. In the second chapter, the goals for this PhD thesis are settled. These general objectives are addressed in the following experimental chapters. In the third chapter, the effect of hydrophobicity and probe multi-point attachment on the microarray performance are studied. Thus, modulation of glass slide surfaces with alkenyl and alkynyl motifs for the anchoring of mono and multithiolated oligonucleotide probes by thiol-ene and thiol-yne photocoupling reactions, respectively, was accomplished. Surfaces modified with the most hydrophobic silane (alkynyl), or anchoring polythiolated probes, revealed better performances. These microarray systems were applied to the discrimination of SNPs and to detect bacterial genome PCR products. In the fourth chapter, a rational design for the preparation of microarrays of antibodies, is done. The immobilization approach displays the oriented anchoring of thiol-bearing antibody fragments to alkenylated glass slides by thiol-ene photocoupling reaction. Multiplexed detection of cardiac biomarkers is demonstrated. The designed microarray shows higher recognition capacity in comparison to whole antibody microarrays. In the fifth chapter, improvement of a novel methodology for the anchoring of thiolated oligonucleotides has been developed. Due to the interest on modifying highly hydrophobic surfaces, a new photoinduced reaction is set up. Thanks to the features of the named "fluor-thiol photocoupling reaction", immobilization of thiolated probes to surfaces containing C-F bonds in a fast, easy and biocompatible with aqueous media way, was achieved. Hydrophobicity of the surfaces was controlled to get successful hybridizations. Because of the high hydrophobicity of the surfaces, a huge confinement of the probes is accomplished, which allows the approximation of the analytes only where the probe is linked, keeping a high repulsion in the remaining surface. The perfluorinated glass slides improved the immobilization densities and detection capacity, regarding to the alkenylated and alkynylated surfaces, and allowed the discrimination of SNPs and detection of bacterial PCR products, as well. In the sixth chapter, other surfaces different than glass are explored. Thus, polyvinylidene fluoride membranes were employed as substrates for the development of oligonucleotide microarrays. Therefore, a fast, easy and mild functionalization process by UV irradiation and organosilane chemistry, was developed. Then, alkenyl functionalized and non-functionalized membranes were applied to microarray technology by covalent anchoring through thiol-ene and fluor-thiol photocoupling reactions, respectively. Promising results were obtained with both surfaces.
[ES] La presente tesis tesis doctoral se centra en el estudio de nuevas aproximaciones capaces de mejorar el rendimiento de los microarrays. Aspectos como la naturaleza de las superficies y las sondas, la funcionalización de los sustratos, la impresión, la inmovilización y la detección de las sondas se consideraron en el proceso de fabricación. Dentro de todas estas características, la modulación de la superficie y el anclaje de la sonda fueron los aspectos más desafiantes, ya que la interfaz es clave para la inmovilización de los receptores y la posterior detección, lo que determinará el rendimiento del dispositivo final. En este trabajo, se han desarrollado dos tipos de microarrays, uno para oligonucleótidos y otro para anticuerpos. Luego, se ha realizado una caracterización de los logros alcanzados. Todas las rutas tienen en común el uso de la luz para catalizar la unión de los biorreceptores en los sustratos de la superficie, empleando reacciones de la química clic. En el primer capítulo, se facilita una visión general del estado del arte de la tecnología de microarrays con un enfoque especial en los aspectos principales del diseño de microarrays. En el segundo capítulo, se establecen los objetivos de esta tesis doctoral. Estos objetivos generales se abordan en los siguientes capítulos experimentales. En el tercer capítulo, se estudia el efecto de la hidrofobia y el uso de sondas con múltiples puntos de unión, en el rendimiento del microarray. De este modo, se llevó a cabo la modulación de superficies vidrio con grupos alquenilo y alquinilo para el anclaje de sondas de oligonucleótidos mono y multitioladas mediante las reacciones de foto anclaje del tiol-eno y tiol-ino, respectivamente. Las superficies modificadas con el silano más hidrofóbico (alquinilo) y las sondas politioladas ancladas, revelaron mejores rendimientos. Estos sistemas de microarrays se aplicaron a la discriminación de SNPs y a la detección de productos de PCR de bacterias. En el cuarto capítulo, se realiza un diseño racional para la preparación de microarrays de anticuerpos. El enfoque de inmovilización muestra el anclaje orientado de los fragmentos de anticuerpos que contienen tiol sobre superficies de vidrio alqueniladas mediante reacción de foto anclaje del tiol-eno. De esta forma, se demuestra la detección multiplexada de biomarcadores cardíacos. El microarray diseñado muestra una mayor capacidad de reconocimiento en comparación con los microarrays de anticuerpos completos. En el quinto capítulo, se ha desarrollado una nueva metodología para mejorar el anclaje de oligonucleótidos tiolados. Dado el interés en modificar superficies altamente hidrófobas, se establece una nueva reacción fotoinducida. Gracias a las características de la llamada "reacción de fotoacoplamiento de fluor-tiol", se logró la inmovilización de sondas tioladas a superficies que contienen enlaces C-F de una manera rápida, fácil y biocompatible con medios acuosos. La hidrofobicidad de las superficies se controló para obtener hibridaciones exitosas. Debido a la alta hidrofobicidad de las superficies, se logra un gran confinamiento de las sondas, lo que permite la aproximación de los analitos solo donde está unida la sonda, manteniendo una alta repulsión en la superficie restante. Las superficies de vidrio perfluoradas mejoraron las densidades de inmovilización y la capacidad de detección, con respecto a las superficies alqueniladas y alquiniladas, y también, permitieron la discriminación de SNPs y la detección de productos de PCR bacterianos. En el sexto capítulo, se exploran otras superficies diferentes al vidrio. Por lo tanto, membranas de fluoruro de polivinilideno se emplearon como sustratos para el desarrollo de microarrays de oligonucleótidos. Para ello, se desarrolló un proceso de funcionalización rápido, fácil y suave, mediante el empleo de irradiación UV y la química de los organosilanos.
[CAT] La present tesi doctoral es centra en l'estudi de noves aproximacions capaces de millorar el rendiment dels microarrays. Aspectes com ara la naturalesa de les superfícies i les sondes, la funcionalització dels substrats, la impressió, la immobilització i la detecció de les sondes es van considerar en el procés de fabricació. Dins de totes aquestes característiques, la modulació de la superfície i l'ancoratge de la sonda van ser els aspectes més desafiadors, ja que la interfície és clau per a la immobilització dels receptors i la posterior detecció, la qual cosa determinarà el rendiment del dispositiu final. En aquest treball, s'han desenvolupat dos tipus de microarrays, un per a oligonucleòtids i un altre per a anticossos. Després, s'ha realitzat una caracterització dels resultats aconseguits. Totes les rutes tenen en comú l'ús de la llum per a catalitzar la unió dels biorreceptores en els substrats de la superfície, emprant reaccions de la química clic. En el primer capítol, es facilita una visió general de l'estat de l'art de la tecnologia de microarrays amb un enfocament especial en els aspectes principals del disseny de microarrays. En el segon capítol, s'estableixen els objectius d'aquesta tesi doctoral. Aquests objectius generals s'aborden en els següents capítols experimentals. En el tercer capítol, s'estudia l'efecte de la hidrofòbia i l'ús de sondes amb múltiples punts d'unió, en el rendiment del microarray. D'aquesta manera, es va dur a terme la modulació de superfícies de vidre amb grups alquenil i alquinil per a l'ancoratge de sondes de oligonucleòtids mono i multitiolades mitjançant les reaccions de foto ancoratge del tiol-doble enllaç i tiol-triple enllaç, respectivament. Les superfícies modificades amb el silà més hidrofòbic (alquinil) i les sondes politiolades ancorades, van revelar els millors rendiments. Aquests sistemes de microarrays es van aplicar a la discriminació de SNPs i a la detecció de productes de PCR de bacteris. En el quart capítol, es realitza un disseny racional per a la preparació de microarrays d'anticossos. L'enfocament d'immobilització mostra l'ancoratge orientat dels fragments d'anticossos que contenen el grup tiol sobre superfícies de vidre alquenilades mitjançant reacció de foto ancoratge del tiol-doble enllaç. D'aquesta forma, es demostra la detecció multiplexada de biomarcadors cardíacs. El microarray dissenyat mostra una major capacitat de reconeixement en comparació amb els microarrays d'anticossos complets. En el cinqué capítol, s'ha desenvolupat una nova metodologia per a millorar l'ancoratge de oligonucleòtids tiolats. Donat l'interés de modificar superfícies altament hidròfobes, s'estableix una nova reacció fotoinduïda. Gràcies a les característiques de l'anomenada "reacció de fotoacoplament de fluor-tiol", es va aconseguir la immobilització de sondes tioladas a superfícies que contenen enllaços C-F d'una manera ràpida, fàcil i biocompatible amb medis aquosos. La hidrofobicitat de les superfícies es va controlar per a obtindre bones hibridacions reeixides. A causa de l'alta hidrofobicidad de les superfícies, s'aconsegueix un gran confinament de les sondes, la qual cosa permet l'aproximació dels anàlits únicament on està unida la sonda i manté una alta repulsió en la superfície restant. Les superfícies de vidre perfluorades van millorar les densitats d'immobilització i la capacitat de detecció, respecte a les superfícies alquenilades i alquinilades, i també van permetre la discriminació de SNPs i la detecció de productes de PCR bacterians. En el sisé capítol, s'exploren altres superfícies diferents al vidre. Per tant, membranes de fluorur de polivinilidé es van emprar com a substrats per al desenvolupament de microarrays d'oligonucleòtids. Per a això, es va desenvolupar un procés de funcionalització ràpid, fàcil i suau, mitjançant l'ús d'irradiació UV i la química dels organosilan
Agradecer al Ministerio de Economía y Competitividad de España, por su programa de becas doctorales FPI
Jiménez Meneses, P. (2020). Study of substrate modulation and bioreceptor anchoring for the development of high performance microarrays [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137993
TESIS

Els compostos aromàtics sulfonats són substàncies d'origen antropogènic d'ús molt estès tant en processos industrials com en l'àmbit domèstic. Presenten una gran mobilitat en el medi aquàtic i alguns són força persistents en condicions aeròbiques. L'abocament incontrolat d'aquests productes produeix la contaminació de les aigües naturals i urbanes.
Els benzensulfonats (BZS) i els naftalensulfonats (NS), objecte d'aquest estudi, constitueixen un grup important de compostos aromàtics sulfonats. L'electroforesi capil·lar ha esdevingut una de les tècniques analítiques més utilitzades en els darrers anys per la seva determinació.
En la present tesi s'han desenvolupat:
-nous mètodes de separació, emprant l'electroforesi capil·lar per zones (CZE) i la cromatografia micel·lar electrocinètica (MEKC)
-nous sistemes de preconcentració on-capillary, el sample stacking mitjançant la injecció de grans volums de mostra i un sistema de preconcentració basat en els procediments isotacoforètics emprant un únic capil·lar per la preconcentració i la separació
-un nou mètode de detecció per millorar la selectivitat de la tècnica, l'acoblament CE-ESI-MS per identificar BZS i NS en aigües.
Aromatic sulfonates such as benzenesulfonates and naphthalenesulfonates are widely used in a variety of industrial processes.
They are highly soluble in water and they only have a slight tendency to adsorb on organic material. So, they are very mobile in the aquatic environment. The microbiological persistence of some BZS and NSs presents an ecotoxicological risk in natural waters.
Capillary electrophoresis (CE) is increasingly used for determining benzenesulfonates and naphthalenesulfonates. Because of this, two modes of CE, capillary zone electrophoresis (CZE) and micellar electrokinetic chromatography (MEKC), were investigated for the separation of these compounds.
CE has two major limitations: the sample injection volume is low and the optical path-length for on-capillary UV detection is short.
So, they were developed two methods using on-line preconcentration techniques: it was used a stacking procedure (LVSS) and a single-capillary configuration for performing an isotachophoretic procedure.
A CZE-ESI-MS method was optimised in order to overcoming the ambiguous identification of these analytes when they are analysed by CE. It enabled aromatic sulfonates to be identified and quantified in water samples.

En aquesta tesi doctoral, s’ha desenvolupat metodologia analítica per a la purificació, separació i caracterització de prió cel•lular (PrPC) i superòxid dismutasa (SOD-1), dues proteïnes relacionades amb les Encefalopaties Espongiformes Transmissibles (TSEs) i l’Esclerosi Lateral Amiotròfica (ALS), respectivament. Les TSEs es caracteritzen per l’acumulació de la forma patològica del PrPC (PrPSc) al cervell dels animals afectats, mentre que a l’ALS s’observa la formació d’agregats de SOD-1. Avui dia, encara es desconeixen els factors que inicien i regulen les interaccions que condueixen a la formació d’agregats proteics en moltes malalties neurodegeneratives. Alguns autors suggereixen mecanismes basats en els canvis estructurals que s’observen entre la proteïna nativa i la patològica, que estan relacionats amb la conformació, la seqüència d’aminoàcids, els metalls o les modificacions post-transduccionals. En proteïnes oligomèriques com la SOD-1, també s’ha considerat la dissociació dels oligòmers fins a monòmers abans de l’agregació. És doncs necessari millorar el coneixement de l’estructura d’aquestes proteïnes i aprofundir en els mecanismes que governen l’agregació. En aquest treball es proposa una estratègia de purificació per recuperar de manera eficient PrPC de cervell boví emprant mètodes de purificació convencionals no immuniquímics i western blot (WB) per detectar la presència PrPC en les diferents etapes. Tot seguit s’estudia exhaustivament la separació i caracterització de la SOD-1 mitjançant electroforesi capil•lar acoblada a l’espectrometria de masses amb analitzadors de trampa iònica i de temps de vol (CE-IT-MS i CE-TOF-MS), espectrometria de masses amb font d’ionització per desorció amb làser assistida per una matriu i analitzador de temps de vol (MALDI-TOF-MS) i espectrometria de masses de mobilitat iònica amb font d’ionització per nano-electrosprai (n-ESI-IM-MS). Els estudis amb SOD-1 purificada a partir de mostres de sang d’individus sans i pacients amb ALS han permès obtenir algunes conclusions preliminars interessants sobre els canvis estructurals en la proteïna associats a la malaltia.
In this thesis, we developed an analytical method for the purification, separation and characterization of cellular prion (PrPC) and superoxide dismutase (SOD-1), two proteins related to Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSEs) and the Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), respectively. The TSEs are characterized by the accumulation of the pathological form of PrPC (PrPSc) in the brain of affected animals, whereas in ALS it is observed the formation of aggregates of SOD-1. Today, factors that initiate and regulate the interactions that lead to the formation of protein aggregates in many neurodegenerative diseases are still unknown. Some authors suggest mechanisms based on the structural changes observed between the native and the pathology protein which cold be related with the conformation, the amino acid sequence, metals or post-translational modifications. In oligomeric proteins such as SOD-1, the dissociation of oligomers to monomers before aggregation it is also considered. So, it is crucial to increase the knowledge of the structure of these proteins and the mechanisms that govern its aggregation for understanding the disease development. This paper proposes a strategy for having an efficient recovery in the purification of bovine brain PrPC using conventional purification methods that not involves immunochemical procedures. The presence of PrPC was checked at different stages by western blot (WB). Then, the separation and characterization of the SOD-1 by capillary electrophoresis coupled to mass spectrometry with ion trap and time of flight analyzers (CE-IT-MS and CE-TOF-MS), matrix-assisted laser desorption/ionization with a time of flight mass analyzer (MALDI-TOF-MS) and ion mobility mass spectrometry with power nano-electrospray ionization source (n-ESI-IM-MS) was studied. The comparison of purified SOD-1 from blood samples of healthy individuals and patients with ALS have yielded some preliminary interesting conclusions about structural changes in the protein associated with cold be related with the disease.

Resumo: O presente trabalho tem por motivação efetuar a análise das hemoglobinas do 'cágado-de-barbicha', P. geoffroanus, realizando uma caracterização inédita na literatura e que contribuirá com os estudos de hemoglobinas de quelônios. Na medida em que a espécie estudada é capaz de permanecer por longos períodos submersa, quisemos observar as propriedades de transporte de oxigênio de suas hemoglobinas, e o controle alostérico exercido sobre elas. Para isso, traçamos o perfil das isoformas de hemoglobinas em amostras de sangue de Phrynops geoffroanus por procedimentos eletroforéticos em diferentes sistemas, efetuamos a caracterização funcional em relação às propriedades de transporte de oxigênio, fizemos análises da agregação ocasionada pela oxidação de cisteínas livres e também efetuamos análise enzimática de LDH em tecidos musculares.
Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez
Coorientador: Claudia Regina Bonini Domingos
Banca: Maria Luisa Schwantes
Banca: Carlos Roberto Ceron
Mestre

La memòria que es presenta està composta per dos treballs d'investigació que tot i estar relacionats, formen cadascun un capítol independent.
En la primera part del treball s'ha realitzat l'estudi del proteoma de Mycoplasma penetrans mitjançant electroforesis bidimensional i espectrometria de masses. S'ha generat un mapa de referència del proteoma d'aquest patogen humà, que compren els rangs de pH de 4 a 11 en tres finestres, de 4 a 7, de 6 a 9 i de 7 a 11NL (No lineal).
Mitjançant tinció especifica s'ha obtingut el fosfoproteoma d'aquest organisme en el rang de pH de 4 a 7, i també s'han determinat els llocs específics de fosforilació de dos proteïnes, un transportador ABC i el Factor de elongació Tu.
En la segona part del treball s'ha realitzat l'anàlisi del proteoma de Mycoplasma genitalium, ampliant la informació ja existent sobre el proteoma d'aquest patogen humà. S'ha analitzat el proteoma d'aquest organisme en fase de creixement estacionaria final utilitzant gradients estrets de pH.
Per aquest micoplasma també s'ha generat una imatge del fosfoproteoma en el rang de pH de 4 a7, i s'ha pogut, també, determinar el lloc específic de fosforilació d'una proteïna implicada en l'adhesió d'aquest micoplasma, la proteïna P110.
La memoria que se presenta está formada por dos trabajos de investigación que todo y estar relacionados entre si, forman cada uno un capítulo independiente.
En la primera parte del trabajo se ha realizado un estudio del proteoma de Mycoplasma penetrans mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Se ha generado un mapa de referencia del proteoma de este patógeno humano, que comprende el rango de pH de 4 a 11 en tres ventanas, de 4 a 7 de 6 a 9 y de 7 a 11NL (no lineal).
Mediante tinción específica se ha obtenido el fosfoproteoma de este organismo en el rango de pH de 4 a 7, y también se han determinado los sitios específicos de fosforilación de dos proteínas, un transportador ABC y el Factor de elongación Tu.
En la segunda parte del trabajo se ha realizado un análisis del proteoma de Mycoplasma genitalium, ampliando la información ya existente sobre el proteoma de este patógeno humano. Se ha analizado el proteoma de este organismo en la fase de crecimiento estacionaria final utilizando gradientes estrechos de pH.
Para este micoplasma también se ha generado una imagen del fosfoproteoma en el rango de pH de 4 a 7, y se ha podido determinar también, el sitio específico de fosforilación de una proteína implicada en la adhesión de este micoplasma, la proteína P110.
The report herein presented is composed of two research works that although they are related, they form an independent chapter.
In the first part of this research the proteome of Mycoplasma penetrans has been analyzed using the combination of two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry.
A proteome reference map of this human pathogen has been constructed including the pH ranges of 4 to 11 in three windows, from 4 to 7, from 6 to 9 and from 7 to 11NL (Non lineal).
With a specific phosphoprotein staining method, the phosphoproteome of this microorganism has been obtained in the pH range of 4 to 7. The specific phosphorylation sites have been characterized for two proteins, an ABC transporter and the Elongation Factor Tu.
In the second part of this research, the proteome of Mycoplasma genitalium has been analyzed, extending the previous information of the proteome of this human pathogen. The proteome of this microorganism has been analyzed in the final stationary growth phase using narrow pH gradients.
The phosphoproteome has been also analyzed for this microorganism using the specific phosphoprotein staining in the pH range of 4 to 7. The specific phosphorylation site has been characterized in a protein involved in adhesion, the protein P110.

La concentració de proteïnes dels vins blancs és de l'ordre de miligrams per litre. Aquestes proteïnes presenten en el vi càrrega elèctrica positiva degut a que tenen un punt isoelèctric superior al pH del vi. Aquesta càrrega les fa reaccionar amb les substàncies carregades negativament en el vi, especialment polifenols i alguns clarificants addicionats. Aquestes proteïnes influeixen negativament en la qualitat dels vins degut a la tendència a precipitar i produir enterboliments però confereix al vi propietats positives pel que respecta a la estabilització de l'escuma en els vins escumosos i a la influència sobre la volatilitat de les molècules responsables de la aroma dels vins blancs, augmentant llur permanència.

El treball realitzat ha consistit en la posta a punt d'un mètode de separació de les proteïnes dels vins per mitjà de tècniques de cromatografia en columna a baixes pressions, coneguda com FPLC. Aquest mètode te una gran precisió i repetibilitat. Així es poden separar les proteïnes del vi en una proteïna de 60 kDa i un nombre variable en una franja de 20 a 30 kDa, que presenten diferent càrrega elèctrica. La fracció de inferior massa molecular presenta un perfil de separació segons la carrega elèctrica diferent per las cinc varietats viníferes estudiades: chardonnay, pinot noir, macabeu, xarel.lo i parellada.

S'observa una disminució de la concentració de proteïna durant el procés de vinificació que afecta a totes les fraccions separades; no obstant aquesta davallada és major a les fraccions de 20 a 30 kDa de més càrrega elèctrica positiva, el que s'explica per una més gran reactivitat en front als compostos amb carrega negativa en el vi. S'ha estudiat la influència del temps de contacte amb els baixos fins de fermentació sobre les diferents fraccions de proteïnes sense observar cap variació significativa pel fraccionament estudiat. Al llarg de la maduració s'ha detectat un increment de la concentració de proteïna a la fracció de baixa massa molecular, mentre que la fracció de 60 kDa es manté en concentracions similars en el període estudiat. D'aquesta fracció de 20 a 30 kDa s'ha constatat un increment més gran de les proteïnes amb menys càrrega elèctrica. Després d'analitzar el fraccionament de la fracció de 20 a 30 kDa per bescanvi catiònic de les cinc varietats viníferes durant dos anys s'han observat perfils característics per cada varietat vinífera que permeten classificar-les en funció de les fraccions obtingudes, el que fa pensar en una possible eina per la caracterització varietal.
Proteins are present in white wines in small amounts (a few milligrams per litre). These proteins have a positive electric charge because their isoelectric point is higher than the pH of the wine. This charge makes them react with the negatively-charged substances in the wine, particularly polyphenols or fining agents. These proteins have a negative effect on the wine quality due to their tendency to precipitate and produce cloudiness but they are also positive because they stabilize the foam in sparkling wines and increase the permanence of the molecules responsible for the aroma of white wines.

The study consisted of establishing a method for separating proteins from wines using column chromatography techniques at low pressures known as FPLC. This method has high precision and repeatability. Thus the proteins in wine can be separated into a protein of 60 kDa and a variable number of proteins ranging from 20 to 30 kDa, which have different electrical charges. The fraction with the lowest molecular weight has a separation profile which depends on the electrical charge for the five grape varieties studied: Chardonnay, Pinot Noir, Macabeo, Xarel·lo and Parellada.

The protein concentration decreases during the vinification process in all the separated fractions. However, this decrease is more pronounced in the fractions from 20 to 30 kDa which had larger positive charges because they react more to the negatively-charged compounds in the wine. The effect of the contact time between the low fermentation fines and the different protein fractions was studied but no significant variation in the fractioning studied was observed. Throughout the maturation the protein concentration was seen to increase in the low molecular weight fraction, while the concentration of the 60 kDa fraction hardly changed. In the 20 to 30 kDa fraction there was a greater increase in proteins with less electrical charge. The fractioning of the 20 to 30 kDa fraction by cationic exchange of the five grape varieties was analyzed for two years and characteristic profiles were observed for each variety which enables them to be classified according to the fractions obtained. This suggests that it may be a possible tool for characterizing varieties.

Esta tesis consiste en la aplicación de la electroforesis capilar (CE) a la separación y cuantificación de especies cianuradas y al estudio del comportamiento de estas especies y de su destino final. Como material de estudio se han seleccionado distintos procesos industriales (lixiviación de minerales y arenas auriferas, disoluciones de proceso en industrias de recubrimientos electrolíticos, lixiviación intensiva en autoclave de convertidores de automóvil) donde los cianuros tienen aplicación.

En la primera parte de la tesis se ha realizado un estudio detallado de las características de la técnica CE, y posteriormente se ha optimizado una metodología para aplicarla a los distintos problemas que se recogen en el resto de la memoria.

La segunda parte de la tesis se ha dedicado a la aplicación de la ce al estudio de la lixiviación con NaCN de los metales preciosos y estratégicos presentes en minerales auriferos (Au, Ag) y en convertidores de automóviles (PT, PD, RH), obteniendo finalmente un método analítico capaz de ser utilizado para el seguimiento de este tipo de procesos.

En la tercera parte de la tesis se ha realizado la determinación del cianuro libre, del débilmente ligado y del total en aguas procedentes de la industria de los recubrimientos electrolíticos y en disoluciones de cianuros oxidadas con hipoclorito, que es el método mas extendido para tratar las aguas industriales. Para analizar estas formas de cianuros, se han planteado dos soluciones, basadas en la detección indirecta y en la derivatización.

La problemática de la detección del cianuro libre (CN- y HCN (aq)) y de especies relacionadas (CNO-, SCN-, NO3, CI-, SO42- y CIO-) resuelto con la utilización de la fluorescencia indirecta con un detector prototipo con fuente láser.

La determinación de cianuros en muestras reales de disoluciones de recubrimientos electrolíticos se ha conseguido mediante su derivatizacion a NI(CN)42- utilizando una disolución de NI(II)-NH3.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
Uma nova proteinase aspártica foi extraída do cardo Cynara cardunculus L., à semelhança das cardosinas A e B, através de extracção acídica, seguida de purificação em três passos. A purificação envolveu cromatografia de exclusão molecular e cromatografia de troca iónica usando uma coluna Q-Sepharose. Como a cardosina A0 não se encontrava pura efectuou-se uma nova cromatografia de troca iónica usando uma coluna de Mono Q. Após esta cromatografia obtiveram-se 4 fracções denominadas de 1P, 2P, 3P e 4P. Para cada uma destas fracções determinou-se a actividade proteolítica e a especificidade. Fizeram-se estudos de mobilidade aparente quer por SDSPAGE, quer por electroforese em condições nativas. Para as fracções 3P e 4P foi determinado o ponto isoeléctrico da proteína em condições nativas e das subunidades separadamente. Foi determinada a glicosilação dessas duas fracções. Foram, ainda, feitos estudos das fracções 3P e 4P por espectrometria de massa, utilizando electrospray. Os resultados de SDS - PAGE demonstraram não existirem diferenças de massa aparente entre a cardosina A e as fracções 1P, 2P, 3P e 4P da cardosina A0. A electroforese em condições nativas revelou diferenças ao nível de mobilidade de cada uma das fracções e entre estas e a cardosina A, o que demonstra a existência de diferenças de carga entre todas as fracções. Estudos de hidrólise da caseína total e da cadeia ß da insulina oxidada revelaram diferenças de actividade entre a cardosina A e as fracções 1P, 2P, 3P e 4P da cardosina A0. Os resultados da hidrólise da cadeia ß da insulina oxidada indicam que todas as fracções da cardosina A0 apresentam a mesma especificidade que a cardosina A e apontam no sentido de todas elas eventualmente possuírem diferenças ao nível da selectividade. A determinação do ponto isoeléctrico das fracções 3P e 4P, na forma nativa e das subunidades separadamente, permitiu verificar diferenças ao nível do ponto isoeléctrico entre elas. A revelação de géis de SDS -PAGE usando o regente de Schiff (método de PAS) permitiu constatar que as fracções 3P e 4P são glicosiladas nas duas subunidades à semelhança da cardosina A. Os estudos de espectrometria de massa dos digestos trípticos das proteinases, com e sem açúcares ligados, revelam diferenças entre a cardosina A e as fracções 3P e 4P. Todos os estudos das fracções 3P e 4P apontam para o facto de estarmos perante formas enzimáticas distintas da cardosina A possuindo pequenas diferenças ao nível da sequência peptídica e/ou da fracção glicosídica.
A new aspartic proteinase was extracted from the cardoon Cynara cardunculus L. as well as the known cardosins A and B, with acid extraction and further purification in three steps. This purification involves size exclusion and anion exchange chromatographies using Q-sepharose column. Cardosin A0 was not pure and it was resolved a new anion exchange chromatography with a Mono Q column. After this step four fractions denominated 1P, 2P, 3P and 4P were purified. For each fraction proteolytic activity and specificity was determined. Relative mobility for each fraction by SDS-PAGE and electrophoresis under native conditions was carried out. For 3P and 4P fractions isoeléctric point of native protein and subunities separately were determined. Glycosilated was determinate of fractions 3P and 4P. Studies by mass spectrometry using electrospray ionisation of fractions 3P and 4P were performed. Results of SDSPAGE demonstrate that do not exist apparently differences in migration of cardosin A and 1P, 2P, 3P and 4P fractions. Electrophoreses in native conditions revelled protein migration differences between fractions 1P, 2P, 3P and 4P of cardosin A0 and between this fractions and cardosin A. There results demonstrate differences of charge between all fractions. Hydrolytic studies of total casein and ß-chain of oxidised insulin revelled differences of activity between cardosin A and fractions 1P, 2P, 3P and 4P of cardosin A0. Results of hydrolysis of ß-chain of oxidised insulin indicate that all fractions of cardosin A0 have the same specificity as cardosin A and suggest eventually differences in selectivity between all fractions and cardosin A. Isoeletric point determination of fractions 3P and 4P of the native proteins and of each subunit reveal differences between them. Revelation of SDS -PAGE gels by Schiff reagent (PAS method) allowed to verify that fractions 3P and 4P are glycosilated in both subunits as cardosin A. Mass spectrometry studies of tryptic digests of fractions 3P and 4P of cardosin A0 with and without sugars linked reveal differences between cardosin A and fractions 3P and 4P of cardosin A0. All studies of fractions 3P and 4P indicate the fact that we are in the presence of enzymatic forms different from cardosin A, with small differences in peptide sequence and/or glycosydic fraction.

La Tesi Doctoral que porta per títol, "Diferents estratègies per augmentar la sensibilitat en electroforesi capil·lar. Aplicació a la determinació de fàrmacs antiinflamatoris", s'ha basat en el desenvolupament de diferents estratègies per a disminuir els límits de detecció (LODs) de l'electroforesi capil·lar (CE) a la determinació de fàrmacs antiinflamatoris. Les estratègies desenvolupades s'han basat en la injecció d'un gran volum de mostra en el capil·lar mitjançant l'aplicació de tècniques de preconcentració tant electroforètiques com cromatogràfiques, i en l'ús de l'espectrometria de masses (MS) com a sistema de detecció per augmentar la capacitat de detecció dels analits.
La present Tesi Doctoral s'ha centrat en la determinació de fàrmacs antiinflamatoris no esteroïdals (NSAIDs) en el medi ambient aquàtic a baixos nivells de concentració. L'interès a la determinació d'aquests ha augmentat molt darrerament degut al seu elevat consum tant en espècies humanes com en animals. Aquests fàrmacs arriben a les estacions de tractament d'aigües residuals (EDAR) a través de diferents procedències, i posteriorment aquests poden entrar en el medi ambient aquàtic degut a la seva gran estabilitat.

Diferents estudis han demostrat la determinació d'aquests fàrmacs a nivells de baixos ng·L-1 en les aigües superficials. Aquests estudis s'han realitzat principalment tant per cromatografia de gasos (GC) com per cromatografia de líquids (HPLC) emprant l'MS com a sistema de detecció. L'CE també ha estat emprada per la determinació d'aquests fàrmacs, però la seva aplicació principal ha estat en l'anàlisi de mostres biològiques.

Tot i els grans avantatges que proporciona la tècnica d'CE, aquesta presenta una baixa sensibilitat que limita la determinació d'analits a baixos nivells de concentració. Aquest fet és degut com a conseqüència del petit volum de mostra que es pot injectar en el capil·lar i del petit camí òptic que tenen els capil·lars que sutilitzen. Amb l'objectiu de millorar la sensibilitat de la tècnica i
d'ampliar la seva aplicabilitat en altres camps, com el mediambiental, el desenvolupament de diferents estratègies per a disminuir els LODs són molt importants i són objecte d'estudi de diferents grups d'investigació.

En la present Tesi Doctoral s'han aplicat i comparat diferents tècniques de preconcentració electroforètiques per la determinació d'aquests fàrmacs en els diferents modes electroforètics, com l'electroforesi capil·lar per zones (CZE), la cromatografia capil·lar de microemulsió electrocinètica (MEEKC) i la cromatografia capil·lar micel·lar electrocinètica (MEKC). La majoria d'aquestes tècniques s'han basat en la supressió del flux electroosmòtic (EOF) per eliminar la matriu de la mostra del capil·lar desprès d'haver injectat un gran volum de mostra. L'avantatge d'addicionar un supressor de l'EOF al medi electrolític és que aplicant un sol voltatge negatiu es duu consecutivament la preconcentració i la separació electroforètica.

L'aplicació d'una tècnica de preconcentració cromatogràfica, basada en l'acoblament in-line entre l'extracció en fase sòlida (SPE) i l'CE, també s'ha aplicat a la determinació de NSAIDs en una mostra d'aigua. El gran potencial de les tècniques de preconcentració tant electroforètiques com cromatogràfiques és que ha permès la determinació d'aquests fàrmacs a nivells de ng·L-1. Aquests resultats s'han obtingut emprant prèviament la tècnica d'SPE off-line per preconcentrar els analits i netejar la matriu de la mostra.

Una altra estratègia emprada per la determinació de NSAIDs en el medi ambient aquàtic ha estat l'ús de l'MS com a sistema de detecció. Aquest acoblament permet la confirmació i la identificació dels diferents analits que puguin estar presents en una mostra. D'aquesta manera, ha estat possible la determinació dels fàrmacs en estudi en aigües superficials i la identificació d'aquests en les aigües procedents de diferents estacions EDAR. En aquest cas s'han emprat com a tècniques de pretractament la tècnica d'SPE off-line, i la combinació de l'extracció líquid-líquid (LLE) i l'SPE off-line, respectivament.
The entitled Doctoral Thesis, "Diferents estratègies per augmentar la sensibilitat en electroforesi capil·lar. Aplicació a la determinació de fàrmacs antiinflamatoris", has been based on the development of different strategies to decrease the limits of detection (LODs) in capillary electrophoresis (CE) to determine anti-inflammatory drugs. The developed strategies have been based on injecting a large volume of sample into the capillary by application electrophoretic and chromatographic preconcentration techniques, and using the mass spectrometry (MS) as the detection system to increase the detection capacity of the analytes.
This Doctoral Thesis has been centred on the determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in the aquatic environment at low concentration levels. In the last years, the interest to determine them has considerably grown due to the high consume in humans and in animals. These drugs arrive in the sewage treatment plants (STPs) by different source, and subsequently these can entry into the aquatic environment due to its high stability.
Different studies have demonstrated the determination of these drugs at low ng·L-1 levels in surface waters. These studies have principally carried out by gas chromatography (GC) and liquid chromatography (HPLC) by using mass spectrometry as the detection system. CE has also been used to determine these drugs, but its principal application has been for the analysis of biological samples.

Although the high advantages that presents the technique, this shows a low sensitivity that overcomes the determination of analytes at low concentration levels. This is a consequence of the low amount of sample that can be injected into the capillary and the small path length. With the aim of improving the sensitivity and extending the CE applicability in others fields, such as the
environmental, then the development of different strategies to decrease the LODs are very important and these are object of studying of different research groups.

In this Doctoral Thesis have been applied and compared different electrophoretic preconcentration techniques to determine these drugs in the different electrophoretic modes, such as capillary zones electrophoresis (CZE), microemulsion electrokinetic capillary chromatography (MEEKC) and micellar electrokinetic capillary chromatography (MEKC). Frequently, in these preconcentration techniques the sample matrix has been removed from the capillary by suppressing the electroosmotic flow (EOF). The advantage of adding an EOF suppressor in the electrophoretic medium is that the preconcentration and the electrophoretic separation can consecutively be performed by applying an only negative voltage.

The application of a chromatographic preconcentration technique, based on the in-line coupling between solid phase extraction (SPE) and CE, has also been applied to determine NSAIDs in water samples. The high potential of the electrophoretic and the chromatographic preconcentracion techniques, is that allow to determine these drugs at ng·L-1 levels. These results have been obtained by using the technique off-line SPE to preconcentrate the analytes and to clean-up the sample matrix before the application of the preconcentration technique.

Other strategy used to determine NSAIDs in the aquatic environment at low levels has been the use of MS as the detection system. This coupling allows confirming and identifying the presence of the analytes in the sample. So, it has been possible the determination of the studied drugs in surface waters and their identification in the STPs. In this study, the technique off-line SPE and the combination of liquid-liquid extraction (LLE) and off-line SPE off-line, respectively, have been used as the sample pretreatment technique.

La Tesi Doctoral amb el títol "Tècniques de preconcentració combinades amb l'electroforesi capil·lar per a la determinació d'antibiòtics beta-lactàmics" s'ha basat en el desenvolupament de diferents estratègies per a millorar la sensibilitat de l'electroforesi capil·lar. Aquestes estratègies s'han aplicat a la determinació d'antibiòtics beta-lactàmics en diferents matrius.

Els antibiòtics beta;-lactàmics són uns fàrmacs àmpliament utilitzats tant en humans com en animals amb finalitats terapèutiques i profilàctiques. A més, en veterinària també s'empren com a promotors del creixement. Degut al seu extens ús i a que sovint no són completament metabolitzats per l'individu tractat amb aquests fàrmacs, ha sorgit la problemàtica de la seva presència en el medi ambient i en productes alimentaris de consum humà a baixos nivells de concentració. Això ha provocat l'aparició de resistències a aquest tipus d'antibiòtics fet que va lligat a la pèrdua d'eficàcia bacteriana. Així doncs, és important el desenvolupament de mètodes analítics per tal de controlar la presència d'aquests compostos a baixos nivells de concentració.

L'electroforesi capil·lar (CE) és una interessant estratègia per a la determinació d'aquests antibiòtics degut al seu elevat poder de separació, bona resolució i gran eficàcia. A més, els volums de reactius, solvents orgànics i mostra que habitualment s'empren són molt baixos i això es tradueix en un baix cost econòmic i un mínim impacte mediambiental. Tot i això, l'CE presenta una limitació important que és la limitada de sensibilitat en la determinació d'analits a baixos nivells de concentració. Amb l'objectiu de millorar la sensibilitat de la tècnica, en la present Tesi Doctoral s'han estudiat diferents estratègies per tal de preconcentrar els analits i així incrementar la seva concentració prèviament a la separació electroforètica.

D'entre les diferents opcions per a preconcentrar els analits es destaquen les tècniques electroforètiques, basades en la variació de la mobilitat dels analits en diferents medis, i les tècniques cromatogràfiques que consisteixen, fonamentalment, en la retenció dels analits en un sorbent d'extracció en fase sòlida (SPE) i la posterior elució en un volum de solvent més petit que el de la mostra.

En la present Tesi Doctoral s'han aplicat els dos tipus de tècniques en diferents modalitats. Pel que fa a l'aplicació de les tècniques electroforètiques, les diferents opcions estudiades es van establir en funció del mode de separació electroforètica emprat i en el cas de les tècniques cromatogràfiques el paràmetre que es va tenir en compte, va ser el tipus d'acoblament entre l'SPE i l'CE. Finalment, per tal de millorar encara més la sensibilitat de l'CE es va emprar la combinació d'una tècnica electroforètica i una cromatogràfica.

Així doncs, s'han avaluat diferents tècniques electroforètiques de preconcentració en la determinació d'antibiòtics beta-lactàmics per electroforesi capil·lar per zones (CZE), cromatografia de microemulsió electrocinètica (MEEKC) i cromatografia micel·lar electrocinètica (MEKC). Tots els sistemes emprats s'han basat en la introducció d'un gran volum de mostra i la posterior eliminació de la matriu de la mostra de forma que en tots els casos s'han millorat els límits de detecció obtinguts.

Pel que fa a les tècniques de preconcentració cromatogràfiques, les diferents combinacions entre l'SPE i el sistema electroforètic que s'han utilitzat són: l'off-line, l'in-line i l'on-line. En tots els casos s'ha aconseguit una important millora de la sensibilitat dels mètodes d'anàlisi ja que els límits de detecció obtinguts emprant l'etapa d'SPE són considerablement més baixos. A diferència de les tècniques electroforètiques, en aquest cas, la preconcentració sovint implica una neteja de la matriu de la mostra de forma que ha estat possible l'aplicació dels mètodes desenvolupats a mostres reals tal com aigües de riu o residuals d'hospital i fins i tot matrius biològiques com plasma de vaca.
The thesis entitled "Combination of preconcentration techniques with capillary electrophoresis for determining beta-lactam antibiotics" has been focused in the development of several strategies for improving sensitivity in capillary electrophoresis. These strategies have been applied for determining beta-lactam antibiotics in different matrices.

beta-Lactam antibiotics are a family of drug compounds widely used in human and veterinary medicine with therapeutic and prophylactic aims. Moreover, in veterinary medicine they have been used as growth promotors. However, abusive and inappropriate use of antibiotics has led to unexpected problems. On the one hand, they are thought to be responsible for the appearance of bacterial strains that are resistant to antibiotics. As a result, antibiotics can not treat infections efficiently. On the second hand, the presence of antibiotics in the food chain can lead to allergic reactions in certain patients. Therefore, it is important to control their presence in different samples.

Capillary electrophoresis (CE) is a good strategy for the determination of these antibiotics due to its high efficiency, resolution and separation power. Moreover, the amount of reagents, organic solvents and sample needed are really small which makes this technique in a cheap and green one. However, CE presents an important drawback, it lacks sensitivity when low concentration levels are needed. To solve this, in the thesis, several strategies have been studied in order to preconcentrate the analytes and then increase their concentration prior to the electrophoretic separation.

Among the different options for preconcentrating analytes it is important to emphasize the electrophoretic-based and the chromatographic-based techniques. The first ones are based on the principle of focusing the analytes according to their different velocities in two separate zones inside the capillary. Of the chromatographic techniques, solid-phase extraction (SPE) is the most important and allows a large sample volume with low concentration to be converted into a low sample volume with higher concentration.

Both, electrophoretic and chromatographic-based techniques have been applied in this thesis for improving sensitivity. Regarding to the application of the firsts ones, different separation modes were studied. When the chromatographic preconcentration was used, the studies differ in how they combine SPE and CE.

In this way different preconcentration techniques have been evaluated by capillary zone electrophoresis (CZE) and micellar and microemulsion electrokinetic chromatography (MEKC, MEEKC). In all the cases, a large sample volume has been introduced into the capillary and then, the sample matrix has been removed in a way that the detection limits decreased.

As far as chromatographic preconcentration is concerned, the combinations studied between SPE and CE were: off-line, in-line and on-line. Unlike when the electrophoretic preconcentration is used, by using the chromatographic-based one, the sample preconcentration usually involves a sample clean-up. So, it allows the analysis of real samples like river water, hospital sewage water or even biological matrices like cow plasma. Detection limits considerably decreased so, a great improvement in sensitivity has been achieved. Finally, in order to increase even further the sensitivity in CE, the combination of electrophoretic and chromatographic techniques has been studied.

Mestrado em Métodos Biomoleculares Avançados
A saliva é uma mistura complexa de proteínas, glicoproteínas, enzimas, hormonas, minerais e desempenha funções fisiológicas importantes. A maior produção de proteínas da saliva ocorre nas glândulas salivares, parótida, submandibular e sublingual e outras pequenas glândulas da mucosa oral. Apesar das glândulas salivares apresentarem fulcral importância para compreensão de determinadas patologias orais, o conhecimento da sua expressão proteica é ainda reduzido. Assim, o objectivo principal deste trabalho caracterização do proteoma das glândulas salivares, usando o ratinho como modelo animal. A caracterização do proteoma glandular envolveu o fraccionamento subcelular das glândulas parótida e submandibular, obtendo-se para cada uma delas, as fracções nuclear, citoplasmática e a correspondente aos grânulos secretores. Complementarmente foram isoladas células acinares das glândulas, procedendo-se ao seu fracionamento com obtenção da fracção citoplasmática. análise das diferentes fracções efectuou-se utilizando electroforese bidimensional e cromatografia líquida de alta resolução para a separação proteínas e péptidos e a digestão tríptica para posterior identificação por espectrometria de massa. Após a análise comparativa dos mapas 2DE das glândulas parótida submandibular observaram-se perfis característicos distintos. Dos mapas 2DE obtidos para as diferentes fracções de parótida e submandibular foram identificadas, respectivamente, um total de 125 e 100 proteínas, sendo 33 das quais comuns. Da análise dos digestos trípticos dos grânulos indentificaram- parótida 52 péptidos pertencentes a 17 proteínas e na submandibular 255 péptidos pertencentes a 19 proteínas. As diferentes proteínas identificadas pertenciam as diversas classes funcionais, destacando-se a classe proteolítica. Ambas as glândulas apresentaram uma grande variedade de calicreínas, principalmente a glândula submandibular onde se identificaram 15 membros desta família. Este trabalho apresenta uma abordagem generalista da composição proteica das diferentes fracções das glândulas salivares de ratinho, facilitando desenvolvimento futuro de investigações mais específicas e/ou relacionadas com uma patologia específica. ABSTRACT: Saliva is a complex mixture of proteins, glycoproteins, enzymes and hormones that play important physiological functions. The main protein sources of saliva are the salivary glands; parotid, submandibular, sublingual and numerous small glands distributed on the oral mucosa. The knowledge of salivary glands protein expression is scarce and important for the understanding of some oral pathologies. The aim of this work is the characterization of the mouse salivary glands proteome, using the mouse as the animal model. For the glandular proteome characterisation subcelular fractionation of the parotid and submandibular glands was performed, getting for each gland the nuclear, cytoplasmic and secretory granules fractions. Complementarily, glandular acinar cells were isolated and fractionated and the cytoplasmic fraction characterised. The analysis of the different fractions were performed by the separation of proteins and peptides by two-dimension gel electrophoresis (2DE) and high resolution liquid chromatography (HPLC-MS) and tryptic digestion used to further mass spectrometry identification. After the comparative analysis of mouse parotid and submandibular 2DE maps, we observed distinct profiles. From the 2DE maps obtained to the different fractions of parotid and submandibular were respectively identified a total of 125 and 100 proteins, being 33 of them commons. From the HPLC-MS data were identified 52 peptides belonging to 17 proteins in parotid and 255 peptides that belong to 19 proteins in submandibular gland. The different proteins identified belong to several functional classes, namely the proteolytic ones. In the submandibular gland about 32% of the identified proteins were from kallikreins family. The salivary glands express a great variety of kallikreins, mainly the submandibular gland in which was identified 15 proteins of this family. This work is a general approach to the protein composition of the different mouse salivary glands fractions, contributing to future research with clinical applications.

Mestrado em Ciência e Engenharia de Materiais
As comunicações sem fios experimentaram um crescimento excepcional nas últimas décadas e que se prevê que continue nos próximos anos (Capítulo 1, Referêcia 3) Com este crescimento há uma procura crescente de dispositivos de menores dimensões e mais versáteis, do que os actualmente existentes, que permitam maiores níveis de integração, possibilidade de operação a altas frequências e produção a custos reduzidos. Actualmente existe também a necessidade de desenvolver materiais com permitividade dieléctrica relativa (εr) entre 40 - 80, baixas perdas dieléctricas e coeficiente de temperatura da frequência de ressonância (tf) próximo de zero. Actividades de investigação e desenvolvimento para explorar a utilização de tecnologias de fabrico de filmes finos e espessos para substituir os materiais cerâmicos em uso corrente, estão actualmente em curso. Neste contexto, foi explorada no presente trabalho a fabricação de filmes espessos por deposição electroforética (EPD) do composto BaLa4Ti4O15 (BLT), cuja selecção se relaciona com as óptimas propriedades que apresenta para aplicação às frequências das microondas. Foi igualmente tentada a preparação de filmes espessos compósitos de BaLa4Ti4O15 (BLT) - Ba4Nd9.33Ti18O54 (BNT) para preenchimento do intervalo existente em termos de materiais com permitividades dieléctricas 40-80. A escolha da deposição electroforética de entre os vários processos de fabricação de filmes espessos prende-se com as características únicas desta técnica, nomedamente, elevada flexibilidade e simplicidade para aplicação a vários materiais e combinação de materiais, possibilidade de aplicação a uma gama variada de formas e estruturas tridimensionais complexas, densas e porosas e a capacidade de ser utilizada à escala industrial a baixos custos. Neste trabalho foi seguida uma aproximação sistemática para a fabricação dos filmes espessos compósitos pr EPD. Primeiramente procedeu-se à síntese de pós monofásicos de BLT e BNT pelo processo convencional de reacção no estado sólido e a sua pureza foi confirmada por análises de Difracção de Raios X. O tamanho e distribuição de tamanho e a morfologia dos pós de BLT e BNT foram caracterizados por recurso a técnicas de determinação de tamanho de partícula e microscopia electrónica de varrimento. De seguida foram preparadas suspensões dos pós de BNT e BLT em diferentes meios suspensores, como água, etanol e trietanolamina. Ao mesmo tempo, foi estudada a estabilidade das suspensões por análises de tamanho de partícula e medidas de transmitância de luz UV. As suspensões com estabilidade optimizada foram utilizadas para deposição de filmes espessos, em meio básico e meio ácido e foram estudadas as variáveis de processamento, como espessura, massa do depósito, corrente eléctrica em função do tempo e voltagem. Foi também discutido o efeito do passo de prensagem isostática, após deposição, na morfologia e densidade dos filmes e também na sua resposta dieléctrica. Filmes de BLT de 10 mm de espessura depositados sobre folhas de platina e sinterizados a 1600ºC/1h exibem εr = 58, TCεr +30ppm/ºC e perda dieléctrica de 0.002 a 1 MHz. Como termo de comparação foram preparados cerâmicos de BLT. Foi feita a caracterização estrutural, microestrutural e dieléctrica de filmes e cerâmicos de BLT, sinterizados entre 1400ºC e 1600ºC. Filmes espessos compósitos de BNT/BLT e BLT/BNT foram preparados com sucesso por EPD. Através da combinação de camadas de BLT e BNT foram preparados filmes espessos compósitos de 30 μm com εr ~71, TCεr ~-16ppm/ºC e perda dieléctrica de a 1 MHz. Estes resultados são de particular relevância visto que combinam a possibilidade de preparar filmes espessos com propriedades desenhadas para aplicações a frequências elevadas e das microondas com a capacidade de diminuir o tamanho do dispositivo. Embora preliminares estes resultados abrem novas oportunidades tecnológicas, que deverão ser mais exploradas ABSTRACT: Wireless communications have experienced an exceptional growth in the last decades and similar growth is expected for next coming years, according to the ABI analysis [Chapter 1, Reference 3]. With this growth there is an increase demand for the production of devices of smaller dimensions and more flexible than the current in use ones, with increased integration, possibility of operation at high frequencies and produced with reduced costs. There is also a present demand to develop materials with relative permittivity (εr) between 40 - 80, low loss and near zero temperature coefficient of resonant frequency (tf). Research activities to exploit thin and thick film technologies to replace the bulk ceramics are currently underway. Within this context, in this work, the fabrication of thick films by electrophoretic deposition of the tertiary compound BaLa4Ti4O15 (BLT) was exploited, because of the optimal properties for microwave applications of BLT. Simultaneously, the preparation of BaLa4Ti4O15 (BLT) - Ba4Nd9.33Ti18O54 (BNT) composite thick films was attempted to fill the permittivity gap of 40-80 as describe above. The choice of electrophoretic deposition (EPD) technique over other thick film processing techniques is obvious because of its unique features, such as the high flexibility and simplicity for application with various materials and combinations of materials, and on a wide range of shapes and 3D complex and porous structures, and its ability to be scaled-up to the fabrication of large product volumes and sizes at low costs. A systematic approach was used to fabricate the composite thick films. Firstly, BLT and BNT powders were prepared by solid state reaction synthesis and the phase purity of the powders was confirmed by XRD. The size and morphology of the powders were assessed by particle size analysis and scanning electron microscopy. BNT and BLT suspensions were prepared in different suspension media such as water, ethanol and acetone. The pH of the suspension was varied by dilute nitric acid and triethanolamine. Concomitantly the stability of the suspensions was characterised by particle size analysis and UV transmittance measurements. Stable suspensions were used for the deposition of particles in acidic and basic conditions, and the processing parameters such as thickness, deposit weight, current as a function of time and voltage were studied. The effect of iso static pressing and film thickness on the properties and morphology was also discussed. 10 mm thick BLT films on platinum foils and sintered at 1600ºC/1h exhibit εr = 58, TCεr +30ppm/ºC and loss tangent 0.002 at 1 MHz. As a comparison tool, BLT ceramics were prepared as well. Films and ceramics were sintered between 1400ºC to 1600ºC and their morphology and dielectric response assessed. BNT/BLT and BLT/BNT composite thick films were successfully prepared by electrophoretic deposition. By the combination of BLT and BNT layers a 30 μm composite thick film with εr ~71, TCεr ~-16ppm/ºC and loss tangent of 0.002 at 1 MHz were prepared. These results are of particular relevance since they combine the possibility to prepare thick films with tailored properties for high frequency and microwave properties with the aptitude to decrease the device size. Although preliminary these results open further technological opportunities, that should be more explored

Mestrado em Biologia Aplicada - Microbiologia Clínica e Ambiental
The surface microlayer (SML) is located at the interface atmospherehydrosphere and is theoretically defined as the top millimeter of the water column. However, the SML is operationally defined according to the sampling method used and the thickness varies with weather conditions and organic matter content, among other factors. The SML is a very dynamic compartment of the water column involved in the process of transport of materials between the hydrosphere and the atmosphere. Bacterial communities inhabiting the SML (bacterioneuston) are expected to be adapted to the particular SML environment which is characterized by physical and chemical stress associated to surface tension, high exposure to solar radiation and accumulation of hydrophobic compounds, some of which pollutants. However, the small volumes of SML water obtained with the different sampling methods reported in the literature, make the sampling procedure laborious and time-consuming. Sample size becomes even more critical when microcosm experiments are designed. The objective of this work was to determine the smallest sample size that could be used to assess bacterioneuston diversity by culture independent methods without compromising representativeness and therefore ecological significance. For that, two extraction methods were tested on samples of 0,5 mL, 5 mL and 10 mL of natural SML obtained at the estuarine system Ria de Aveiro. After DNA extraction, community structure was assessed by DGGE profiling of rRNA gene sequences. The CTAB-extraction procedure was selected as the most efficient extraction method and was later used with larger samples (1 mL, 20 mL and 50 mL). The DNA obtained was once more analyzed by DGGE and the results showed that the estimated diversity of the communities does not increase proportionally with increasing sample size and that a good estimate of the structural diversity of bacterioneuston communities can be obtained with very small samples.
A microcamada superficial marinha (SML) situa-se na interface atmosferahidrosfera e teoricamente é definida como o milímetro mais superficial da coluna de água. Operacionalmente, a espessura da SML depende do método de amostragem utilizado e é também variável com outros fatores, nomeadamente, as condições meteorológicas e teor de matéria orgânica, entre outros. A SML é um compartimento muito dinâmico da coluna de água que está envolvida no processo de transporte de materiais entre a hidrosfera e a atmosfera. As comunidades bacterianas que habitam na SML são designadas de bacterioneuston e existem indícios de que estão adaptadas ao ambiente particular da SML, caracterizado por stresse físico e químico associado à tensão superficial, alta exposição à radiação solar e acumulação de compostos hidrofóbicos, alguns dos quais poluentes de elevada toxicidade. No entanto, o reduzido volume de água da SML obtidos em cada colheita individual com os diferentes dispositivos de amostragem reportados na literatura, fazem com que o procedimento de amostragem seja laborioso e demorado. O tamanho da amostra torna-se ainda mais crítico em experiências de microcosmos. O objectivo deste trabalho foi avaliar se amostras de pequeno volume podem ser usadas para avaliar a diversidade do bacterioneuston, através de métodos de cultura independente, sem comprometer a representatividade, e o significado ecológico dos resultados. Para isso, foram testados dois métodos de extracção em amostras de 0,5 mL, 5 mL e 10 mL de SML obtida no sistema estuarino da Ria de Aveiro. Após a extracção do DNA total, a estrutura da comunidade bacteriana foi avaliada através do perfil de DGGE das sequências de genes que codificam para a sub unidade 16S do rRNA. O procedimento de extracção com brometo de cetil trimetil de amônia (CTAB) foi selecionado como sendo o método de extração com melhor rendimento em termos de diversidade do DNA e mais tarde foi aplicado a amostras de maior dimensão (1 mL, 20 mL e 50 mL). O DNA obtido foi mais uma vez usado para análise dos perfis de DGGE de 16S rDNA da comunidade e os resultados mostraram que a estimativa da diversidade de microorganismos não aumentou proporcionalmente com o aumento do tamanho da amostra e que com amostras de pequeno volume podem ser obtidas boas estimativas da diversidade estrutural das comunidades de bacterioneuston.

Doutoramento em Ciência e Engenharia de Materiais
Nos dias que correm os engenheiros de circuítos na área da microelectrónica são confrontados com a necessidade de desenhar circuítos que permitam um maior transporte de informação numa menor largura de banda, que consumam menos energia e ao mesmo tempo com a necessidade de criar produtos de dimensões menores e mais flexíveis, com maiores níveis de integração, operação a frequências mais elevadas e a custos mais reduzidos. Neste contexto, a substituição de componentes dieléctricos cerâmicos na forma de monolitos, que são parte integrante de determinados dispositivos microelectrónicos que operam a frequências elevadas (filtros e antennas, por exemplo), por dieléctricos processados na forma de filmes espessos está sob consideração. Com esta aproximação espera-se, por um lado conseguir uma redução do tamanho do dispositivo e dos custos associados à sua produção e por outro lado, e de particular relevância, explorar as oportunidades criadas pela possibilidade de processar filmes conformes com substratos de diferentes formas e de natureza metálica. Novas estruturas e concepções para dispositivos que operam a frequências elevadas deverão ser criadas. Ao mesmo tempo, crê-se contribuir para o desenvolvimento de processos de fabrico de produção em massa de filmes de materiais dieléctricos com desempenho reproductível e a baixos custos. As técnicas de preparação de filmes finos incluem a fabricação por cinta (“tape casting”), por impressão em tela (“screen printing”), por jacto de tinta (“jet printing”) e por deposição electroforética (“electrophoretic deposition”, EPD). A importância da deposição electroforética advém das suas características únicas, que incluem a simplicidade e flexibilidade na aplicação a vários tipos de materiais e combinações de materiais numa gama alargada de formas e dimensões de estruturas, na relação fabricação – custos e na capacidade de dimensionar o processo à escala industrial para fabricação de volumes elevados de produtos e de grandes dimensões. Concomitantemente, quando comparado com os outros processos de fabricação de filmes espessos, a deposição electroforética permite a produção de camadas de uniformidade excepcional com um fácil controlo da sua espessura. Desta forma a fabricação de filmes espessos por deposição electroforética vai de encontro às actuais necessidades da indústria da microelectrónica no que respeita à substituição dos componentes dieléctricos monolitos em uso hoje em dia. Em relação aos materiais, os dieléctricos que podem ser utilizados como componentes de dispositivos de operação às frequências das microondas, deverão possuir perdas dieléctricas baixas, factor de qualidade (definido como o inverso das perdas dieléctricas) elevado, permitividade dieléctrica elevada e coeficiente de temperatura da permitividade baixo. De entre os dieléctricos com baixas perdas, o sistema BaO-Nd2O3-TiO2 representa uma importante família comercial de materiais para utilização às frequências das microondas, em particular a composição 1:1:5, que, porque reúne as características acima mencionadas, é um material de referência para estas aplicações. Embora cerâmicos de BaO-Nd2O3-TiO2 estejam actualmente em produção e comercialmente disponíveis em resonadores, filtros e substratos, entre outras aplicações, o uso de filmes espessos de BNT não foi até à realização deste estudo, referido. Neste trabalho, é explorada a fabricação por deposição electroforética de filmes espessos de BaNd2Ti5O14 (BNT). Para tal é conduzido um estudo sistemático do processo de deposição, desde a prova de conceito de aplicação do processo de deposição electroforética até à definição de condições reprodutíveis e optimizadas de deposição. São utilizados pós comerciais e pós fabricados em laboratório que foram depositados sobre folhas metálicas flexíveis de platina e substratos de alumina. Inicia-se o trabalho pela prova do conceito de aplicação da deposição electroforética ao fabrico de filmes de BNT. Filmes de BNT com 12 a 52 μm de espessura são fabricados a partir de pós de BNT comerciais sobre substratos de platina. Para melhorar a densidade em verde e a microestutura dos filmes obtidos recorre-se a uma etapa intermédia de prensagem isostática dos filmes em verde. O efeito da espessura dos filmes nas propriedades dieléctricas a baixas frequências é analisado. À medida que a espessura do filme aumenta, as propriedades dieléctricas dos filmes de BNT aproximam-se das propriedades dos cerâmicos de BNT em termos de permitividade e perdas dieléctricas. Filmes de BNT com 52 μm de espessura e sinterizados a 1300 °C durante 1 h exibem uma constante dieléctrica e uma perda dieléctrica de 107 e 0.0006 ou um factor de perda Q de 1600 a 1 MHz, respectivamente. A variação de permitividade dieléctrica é inferior a 0.02 % a um campo eléctrico de ±8 kV/cm e na gama de temperatura entre 30-120 °C é abaixo de +58.5 ppm/°C. O estudo revela ainda que não há degradação das propriedades dos filmes de BNT até 1.4 GHz, relativamente às propriedades medidas à frequência de 1 MHz. Após a prova de conceito, são conduzidos estudos de optimização do processo de deposição. Para tal foram especificamente sintetizados por processo convencional de reacções no estado sólido pós de BNT. O sucesso no processo de fabricação por EPD está intimamente relacionado com a escolha do meio de suspensão e aditivos, que devem originar uma suspensão estável com um grau de dispersão das partículas elevado. Neste trabalho são estudados quatro meios suspensores diferentes, que incluem, água, acetona, etanol e ácido acético. As propriedades físico – químicas das diferentes suspensões foram analisadas pelo determinação do potencial zeta, da distribuição do tamanho de partícula e transmitância de luz. Os resultados experimentais revelam que o potencial zeta é uma medida directa da estabilidade das suspensões, visto que o máximo do potencial zeta corresponde ao máximo de dispersão da suspensão que se reflecte também na distribuição do tamanho de partícula e no comportamento em termos de transmissão de luz através da suspensão. O máximo de potencial zeta (61 mV) é obtido para o meio suspensor de acetona com adições de I2, a que corresponde uma transmitância de 10%. O efeito dos diferentes meios suspensores é estudado na deposição, microestrutura e propriedades dieléctricas dos filmes de BNT. De entre os vários meios suspensores, apenas o ácido acético e a acetona com I2 apresentam a capacidade para formação de depósitos e as limitações do ácido acético são analisadas em termos da reproductibilidade do processo. Camadas depositadas de homogeneidade e taxa de deposição elevadas e com superfícies macias foram obtidas com o meio suspensor à base de acetona. Para este caso, o efeito de vários parâmetros de processamento, que incluem o campo eléctrico aplicado, o tempo de deposição e a composição da suspensão e a espessura e morfologia dos filmes é investigada e a discutida. Conjuntamente, e sob as condições optimizadas de deposição é estudado o efeito da temperatura de sinterização na estrutura, microestrutura e propriedades dieléctricas dos filmes espessos de BNT. Para tal filmes de BNT com 10 a 80 μm de espessura foram fabricados por EPD sobre folhas de Pt em diferentes condições. O impacto dos parâmetros de processamento: campo eléctrico, substrato e temperatura de sinterização são analisados e discutidos. Observa-se que um aumento da temperatura de sinterização aumenta acentuadamente a razão de aspecto dos grãos, decresce a permitividade dieléctrica relativa e o coeficiente de temperatura da permitividade TCεr varia de -114 para +12 ppm/°C. É então proposto que a anisotropia do grão observada é facilidade pelas condições de sinterização restrictas (“constrained sintering”). Através do controlo da temperatura de sinterização filmes espessos de TCεr quase nulo, Q elevado com 45< εr<70 podem ser fabricados. Esta descoberta é de especial relevância tecnológica visto que demonstra que o controlo da tensão originada pelo substrato e as condições de sinterização podem ser usadas para controlar a anisotropia do cerscimento do grão e consequentemente as propriedades dieléctricas dos filmes de BaO-Re2O3-TiO2. Ao mesmo tempo o fabrico de filmes com propriedades controladas contribui para a diminuição das dimensões dos dispositivos que operam a frequências elevadas. Esperam-se observações semelhantes em outros sistemas de materiais, o que abre ainda mais o leque de oportunidades em termos tecnológicos. Para aplicações específicas, camadas espessas de dieléctricos sobre substratos isoldaores podem ser necassárias. Contudo a fabricação de filmes por deposição electroforética é incompatível com o uso de substratos isoladores; assim sendo foi desenvolvido e é apresentado neste trabalho um método de fabricação de filmes sobre substratos isoladores por deposição electroforética. Para ultrapassar esta dificuldade, substratos de alumina foram recobertos com uma “camada sacríficio” de grafite. Filmes uniformes e densos foram então depositados sobre substratos de alumina (Al2O3). A influência da espessura da camada de grafite e a sua interacção com os filmes de BNT na estrutura, microestrutura e resposta dieléctrica é avaliada e discutida. Intercações marcadas entre os filems de BNT e os substratos de alumina foram observadas a temperaturas superiores a 1300 ºC. A difusão dos iões de Al para o interior dos filmes origina a formação de segundas fases de aluminatos de neodimio. Contudo filmes de BNT de espessura de 100 μm e sinterizados a 1250 ºC durante 1h exibem uma permitividade dieléctrica relativa e valores de Q de146 e 1161 a cerca de 10 GHz, respectivamente. Crê-se que esta aproximação do uso de uma “camada sacríficio” de grafite sobre substratos não condutores é muito importante e válida, já que pode ser extendida para a deposição de filmes espessos e finos a uma variedade alargada de materiais funcionais sobre um leque também alargado de substratos não condutores. Um outro desafio em termos de industria microelectónica, em particular a relacionada com o fabrico de dispositivos sintonizáveis de operação a frequências elevadas, é a fabricação de dieléctricos de perdas baixas e sintonabilidade elevada. Neste trabalho propõe-se uma aborgadem de engenharia para ultrapassar esta limitação. Assim reporta-se a preparação e caracterização de compósitos de BaNd2Ti5O14 (BNT) - Ba0.5Sr0.5TiO3 (BST) sobre folhas de Pt, através da combinação do processo de deposição electroforética com o processo sol gel. Filmes compósitos de BNT – BST com espessuras de 9μm sobre Pt, homogéneos, densos e uniformes exibem permitividade e perda dieléctrica de 287 e 0.0013 a 1MHz, e sintonização da permitividade dieléctrica de 12% a 33 kV/cm, e coeficiente de temperatura da permitividade de 0.26% entre 28 ºC e 120 ºC, respectivamente. Acima de tudo estes filmes exibem um dos facoters de qualidade K mais elevados referidos na literatura. Assim, a actual limitação de dieléctricos sintonizáveis de baixa perda é de certo modo ultrapassada e considera-se que estes resultados têm uma implicação alargada na comunidade microelectrónica de dispositivos sintonizáveis a frequências elevadas.
Currently RF and MW design engineers are being asked to send more bits over less bandwidth, use less battery power, and create products that are smaller and more flexible, which include increased integration, operation at higher frequencies and reduced costs. In this context the replacement of the current bulk ceramic dielectric components of some microelectronic devices (filters, baluns and antennas) by dielectrics processed as thick films is now being considered. With this methodology it is expected, besides reducing device size, to reduce processing costs and of particular relevancy are the opportunities created by the possibility to process thick films conformally on substrates and on metal foils. New structures and designs for such devices to operate at high frequencies are then expected. At the same time, this drives the search for fabrication processes for films materials to be mass-produced with repeatable performance at very low costs. The techniques for the preparation of thick films include tape casting, screen printing, jet printing or electrophoretic deposition (EPD). The importance of EPD comes from its unique features, such as the high flexibility and simplicity for application with various materials and combinations of materials, and on a wide range of shapes and 3D complex and porous structures, its costeffectiveness, and its ability to be scaled-up to the fabrication of large product volumes and sizes. In addition, when compared with the other methods, EPD enables the fabrication of highly uniform layers with an easy control of the layer thickness. As so, EPD matches well with the current considerations of the microelectronics industry of replacement of bulk dielectric components by dielectrics processed as thick films. Pertaining to materials, dielectrics which may be employed as microwave components must exhibit low loss or high quality factor Q, high relative permittivity and small temperature coefficient of relative permittivity (TCεr). Within low loss dielectrics, the BaO-Nd2O3-TiO2 system represents an important commercial family of microwave materials, particularly the 1:1:5 composition, that because it exhibits low dielectric losses, high quality factor, high relative permittivity and small temperature coefficient of resonant frequency, have been known as an important microwave dielectric material. Although BaO-Nd2O3-TiO2 ceramics are currently being produced for resonators, filters and substrates, among others applications, the use of BNT thick films have not been reported until the realization of this PhD program. In this work, the fabrication of BaNd2Ti5O14 (BNT) thick films by EPD is exploited. For that a systematic research study of the EPD process is conducted from the proof-of-concept till the definition of reproducible and optimised process conditions. Commercial and “home made” BaNd2Ti5O14 powders were used to fabricate BNT films on platinum foils and polycrystalline alumina substrates. The technological feasibility of using EPD for the fabrication of BNT thick films was firstly studied. 12 to 52 μm thick BNT films were fabricated from BNT commercial powders on platinum metallic foils by EPD. To improve the microstructure and density of the films a post deposition isostatic pressing step was used. The effect of film thickness on the dielectric properties at low frequencies was investigated. As the film thickness increases, the dielectric properties of BNT films approach those of BNT ceramics in terms of permittivity and loss tangent. 52 μm-thick BNT film sintered at 1300 °C for 1 h exhibit a dielectric constant and a loss tangent of 107 and 0.0006 (or Q of 1600) at 1 MHz, respectively. The variation in permittivity is less than 0.02 % at a bias voltage ±8 kV/cm. The change of film permittivity with the temperature within the range 30-120 °C is below +58.5 ppm/°C. Compared to at 1 MHz, the dielectric properties of 52 μm thickness BNT films do not show tremendously degradation till up to 1.4 GHz. After the proof-of-concept, the optimization of the EPD process was conducted. For that BNT powders were specifically synthesised by the conventional solid state reaction method. The success in the EPD process is intimately related to a careful choice of the suspension media and additives, which should lead to well-dispersed and stable suspensions for EPD. Four different suspension media, which included de-ionized water, acetone, ethanol, and glacial acetic acid (HAC), were studied. The physicochemical properties of the different suspensions were evaluated and analyzed by zeta potential, particle size distribution and light transmittance. Experimental results revealed that the zeta potential is a straightforward indication of the stability of these suspensions, since the maximum absolute zeta potential corresponds to a maximum of the suspension dispersibility, also reflected in the particle size distribution and suspension light transmittance behaviour. The maximum zeta potential was obtained for acetone with iodine suspensions (61 mV), and the corresponding transmittance was 10%. The effect of different solvents was studied on the deposition, microstructure and dielectric properties of BNT thick films. Among the used solvents, only the acetic acid and acetone with I2 based suspensions showed the ability of forming deposits and the limitations of acetic acid solvent was analyzed in terms of the process reproducibility. Deposits with homogeneous, smooth surface and high deposition yield were obtained upon adding I2 to the acetone based suspension. For the case of acetone with I2 suspensions, the effect of EPD process parameters such as deposition voltage, deposition time and suspension composition, deposited thickness of BNT and film morphology was investigated and discussed. In addition, under the definition of the optimal conditions for EPD BNT thick films, the effect of the post deposition sintering temperature was addressed on the structure, microstructure and dielectric properties of BNT thick films. For that 10 to 80 μm thick BaNd2Ti5O14 (BNT) films were fabricated by electrophor-etic deposition on Pt foils under different conditions. The impact of the processing parameters: electric field during EPD, the substrate effect and the sintering temperature were analyzed and discussed. It was observed that the increase of the sintering temperature increases markedly the aspect ratio of the grains, decreases the dielectric permittivity and TCεr changes from -114 to +12 ppm/°C. It was then proposed that the o bserved anisotropic grain growth is facilitated by the constrained sintering. By controlling the sintering temperature, near – zero TCεr, high Q thick films can be fabricated with 45< εr<70. These findings are of technological relevance since they demonstrate that control of substrate constraint and sintering conditions can be used to control grain anisotropy and thus microwave properties of the BaO-Re2O3-TiO2. The thick films facilitate scaling to small device sizes for high frequency operation. Similar observations are expected in other MW systems thus opening further technological opportunities. For some specific applications, such as multilayer microstrip for band-pass microwave filter applications, thick dielectric layers on insulating substrates may be required. However the fabrication by EPD is incompatible with the use of insulating substrates, so a method of performing EPD on non-conducting substrates was developed and is reported in this work. To overcome the requirement of a conducting substrate, insulating polycrystalline alumina substrates were covered with a sacrificial graphite layer. Uniform and dense BNT layers have been then deposited on alumina (Al2O3) substrate by EPD. The influence of the graphite layer thickness and the interactions between the BNT films and alumina substrates on the final structure, microstructure and dielectric response were addressed and discussed. Severe interactions between the BNT films and alumina substrates were observed for sintering temperatures >1300 °C. The diff usion of Al ions into the films resulted in the formation of neodymium aluminates second phases. However 100 μm thick BNT films sintered at 1250 ºC/1h show relative permittivity and Q values of 146 and 1161 at about 10 GHz, respectively. It is believed that this approach of using sacrificial graphite layers for EPD on non-conducting substrates is extremely valuable since it can be extended for both thin and thick film deposition on a large variety of other non-conducting substrates. Another challenge for the microelectronics agile / tunable industries is the fabrication of low loss tunable microwave dielectrics because lower loss tangents provide lower insertion loss in the device. In the work an approach to overcome this limitation is proposed. The preparation and characterization of BaNd2Ti5O14 (BNT) - Ba0.5Sr0.5TiO3 (BST) composite thick films on flexible platinum foil substrate, via an EPD process combined with a sol gel one was reported. Homogeneous, dense, and uniform 9μm-thick BNT-BST composite thick films on flexible Pt foils exhibit dielectric constants and loss tangent of 287 and 0.0013 at 1MHz, and dielectric tunability of 12% at 33kV/cm, and tempera-ture coefficient of relative permittivity of 0.26% between 28ºC to 120ºC, respectively. Above all these films exhibit one of the highest quality factor (K = 70) reported for dielectric films. As such the actual limitation of low loss high tunable dielectrics is somehow surmount and these results are expected to have broad implications in the community of microwave agile devices.

Introdução: As gamapatias monoclonais constituem um grupo heterogéneo de patologias, caracterizado pela proliferação monoclonal de plasmócitos que produzem e secretam imunoglobulina ou fragmentos desta. Na maioria das vezes, trata-se de uma entidade benigna, usualmente referida como gamapatia monoclonal de significado indeterminado. Contudo, esta pode evoluir para uma situação mais grave como o mieloma múltiplo ou outras gamapatias malignas. A detecção de componente monoclonal através de electroforese e a identificação por imunofixação sérica e/ou urinária de rotina são fundamentais para o seu diagnóstico, dada a sua variabilidade de manifestações clínicas. O principal objectivo deste estudo é salientar a importância da componente laboratorial no diagnóstico das gamapatias monoclonais. Métodos: Efectuou-se uma análise retrospectiva das electroforeses e imunofixações realizadas no Serviço de Patologia Clínica do Centro Hospitalar Cova da Beira durante o ano de 2009. Resultados: Neste estudo, foram incluídos 3407 indivíduos, 1983 (58,2%) do sexo feminino e 1424 (41,8%) do sexo masculino, com uma idade média de 65 anos. Durante o ano de 2009, a incidência de picos monoclonais foi de 3,55%. Os serviços de Hematologia e de Medicina Interna foram os que detectaram o maior número de picos monoclonais. Do total de indivíduos com componente monoclonal, 74 (61,2%) eram do sexo masculino e 47 (38,8%) do sexo feminino, apresentando uma idade média de 72 anos. A incidência das cadeias pesadas foi de 59,5% para IgG, 22,4% para IgM e por último 15,6% para IgA. Em relação às cadeias leves, a incidência de kappa foi de 62% e de lambda 38%. Em 5 indivíduos foram detectados picos biclonais, tendo-se obtido uma incidência de 4,13%. Conclusão: A electroforese de proteínas pode ser considerada um bom método de triagem para detecção precoce de gamapatias monoclonais e a imunofixação para confirmação diagnóstica e para a caracterização das gamapatias monoclonais.
Introduction: Monoclonal gammopathies comprise of a heterogeneous group of pathologies, characterized by the monoclonal proliferation of plasmocytes, which produce and secrete immunoglobulins or fragments of these. In the majority of cases, this is a benign entity known as monoclonal gammopathy of undetermined significance. However, it is possible that these gammopathies may lead to the development of more serious conditions, mainly multiple myeloma and other malignant gammopathies. Critical to the diagnosis of these immunoglobinopathies is the routine detection of the monoclonal component by means of electrophoresis and serous/urinary immunofixation, as they may present with a wide variety of clinical manifestations. The main objective of this study is to emphasize the importance of laboratorial screening in the diagnosis of monoclonal gammopathies. Methods: A retrospective study was carried out, consisting in the analysis of electrophoresis and immunofixations applied to patients of the Clinical Pathology Department of the Cova da Beira Hospital Centre throughout the year 2009. Results: This study comprised of 3407 participants, 1983 (58.2%) females and 1424 (41.8%) males, with an average age of 65 years. Throughout the year 2009, the incidence of monoclonal peaks pregistered at the Cova da Beira Hospital Centre was 3.55%. The departments which detected the largest number of monoclonal peaks were Hematology and Internal Medicine. Within the total number of individuals presenting with monoclonal components, 74 (61.2%) were male and 47 (38.8%) were female, with an average age of 72 years. The incidence of heavy chains was 59.5% for IgG, 22.4% for IgM and 15.6 % for IgA. With respect to the light chains, the incidence of kappa chains was 62% and lambda chains 38%. Biclonal peaks were found in 5 individuals with a corresponding incidence of 4.13%. Conclusion: The electrophoresis of proteins may be considered as a good screening method for the early detection of monoclonal gammopathies, and immunofixation can be employed for confirmation of the diagnosis and characterization of the monoclonal gammopathies.