Dissertations / Theses on the topic 'Elettrofisiologia'

La tesi tratta del normale funzionamento del cuore in un paziente sano, il ciclo cardiaco con le relative fasi e l'elettrocardiogramma. E alcune delle possibili cause di un paziente malato che richiede l'uso del pacemaker. Analisi di come è strutturato un laboratorio di elettrofisiologia, la preparazione del paziente pre e post-operatorio e gli strumenti necessari. Analisi della storia del pacemaker partendo dai suoi componenti principali. I vari tipi di pacemaker e le modalità di stimolazione. Analisi più approfondita di un pacemaker guidato da un sensore, le indicazioni per l'impianto di pacemaker permanenti e le relative tecniche di inserimento. Per concludere i problemi dovuti e i possibili malfunzionamenti dei pacemaker permanenti e il pacemaker più piccolo del mondo.

La messa a punto di tecniche come il patch clamp e la creazione di doppi strati lipidici artificiali (artificial bilayers) ha permesso di effettuare studi su canali ionici per valutarne la permeabilità, la selettività ionica, la dipendenza dal voltaggio e la cinetica, sia in ambito di ricerca, per analizzarne il funzionamento specifico, sia in quello farmaceutico, per studiare la risposta cellulare a nuovi farmaci prodotti. Tali tecniche possono essere inoltre impiegate nella realizzazione di biosensori, combinando così i vantaggi di specificità e sensibilità dei sistemi biologici alla veloce risposta quantitativa degli strumenti elettrochimici. I segnali in corrente che vengono rilevati con questi metodi sono dell’ordine dei pA e richiedono perciò l’utilizzo di strumentazioni molto costose e ingombranti per amplificarli, analizzarli ed elaborarli correttamente. Il gruppo di ricerca afferente al professor Tartagni della facoltà di ingegneria di Cesena ha sviluppato un sistema miniaturizzato che possiede molte delle caratteristiche richieste per questi studi. L’obiettivo della tesi riguarda la caratterizzazione sperimentale di tale sistema con prove di laboratorio eseguite in uno spazio ridotto e senza l’impiego di ulteriori strumentazioni ad eccezione del PC. In particolare le prove effettuate prevedono la realizzazione di membrane lipidiche artificiali seguita dall’inserimento e dallo studio del comportamento di due particolari canali ionici comunemente utilizzati per questa tipologia di studi: la gramicidina A, per la facilità d’inserimento nella membrana e per la bassa conduttanza del singolo canale, e l’α-emolisina, per l’attuale impiego nella progettazione e realizzazione di biosensori. Il presente lavoro si sviluppa in quattro capitoli di seguito brevemente riassunti. Nel primo vengono illustrate la struttura e le funzioni svolte dalla membrana cellulare, rivolgendo particolare attenzione ai fosfolipidi e alle proteine di membrana; viene inoltre descritta la struttura dei canali ionici utilizzati per gli esperimenti. Il secondo capitolo comprende una descrizione del metodo utilizzato per realizzare i doppi strati lipidici artificiali, con riferimento all’analogo elettrico che ne risulta, ed una presentazione della strumentazione utilizzata per le prove di laboratorio. Il terzo e il quarto capitolo sono dedicati all’elaborazione dei dati raccolti sperimentalmente: in particolare vengono prima analizzati quelli specifici dell’amplificatore, quali quelli inerenti il rumore che si somma al segnale utile da analizzare e la variabilità inter-prototipo, successivamente si studiano le prestazioni dell’amplificatore miniaturizzato in reali condizioni sperimentali e dopo aver inserito i canali proteici all’interno dei bilayers lipidici.

La stimolazione termica è una tecnica esplorata negli ultimi anni in quanto promettente per il differenziamento cellulare. Studi precedenti hanno dimostrato che questo metodo può indurre il differenziamento di diverse tipologie cellulari, dalle staminali alle tumorali, probabilmente attraverso cambiamenti della capacità della membrana e delle proprietà biofisiche dei canali ionici. Tuttavia, i meccanismi che sostengono questo processo restano a oggi sconosciuti. Il presente progetto ha l’obiettivo di studiare gli effetti della stimolazione termica sul comportamento di un modello in vitro di neuroni dei gangli delle radici dorsali (DRG), la linea cellulare F-11, caratterizzata nel nostro laboratorio. Queste cellule possono esprimere canali ionici e recettori di membrana, caratteristici dei neuroni sensoriali, e possono essere impiegate come modello per studiare i meccanismi coinvolti nella proliferazione e nel differenziamento neuronale. Inizialmente, per valutare gli effetti della tecnica di riscaldamento sul modello cellulare scelto, abbiamo effettuato esperimenti di stimolazione “in bulk” utilizzando un incubatore. Le cellule sono state poste nell’incubatore ed esposte a temperature diverse per intervalli di tempo differenti, per due giorni consecutivi. Analisi morfologiche e funzionali sono state condotte a partire dalla semina fino a 8 giorni. I risultati hanno mostrato una differenza significativa nella lunghezza dei neuriti e nelle proprietà elettrofisiologiche (potenziale di membrana, densità di corrente di Na+ e K+, e frequenza della scarica dei potenziali d’azione) nei campioni mantenuti a 41,5°C per 30 minuti rispetto al controllo (mantenuto a 37°C). È stata inoltre condotta un’analisi dei segnali intracellulari di Ca2+ indotti da capsaicina, per verificare l’eventuale coinvolgimento dei canali TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) negli effetti indotti dal calore. I risultati hanno mostrato segnali intracellulari di Ca2+ maggiori nelle cellule riscaldate rispetto al controllo, suggerendo che l’esposizione al calore potrebbe influenzare l’espressione e/o le proprietà dei canali TRPV1, permeabili al Ca2+. Inoltre, il saggio della lattato-deidrogenasi (LDH) ha permesso di escludere effetti citotossici della metodica utilizzata sui campioni trattati. Considerando questi risultati, abbiamo studiato gli effetti di una stimolazione termica localizzata, ottenuta tramite l’irraggiamento di nanoparticelle Prussian Blue (PBNP) con un laser nel vicino infrarosso (NIR). Le PBNP sono state applicate sulla superficie esterna delle petri in cui sono state seminate le cellule, evitando in questo modo il contatto tra di esse e le cellule. Anche con questo approccio si sono registrate differenze significative nella lunghezza dei neuriti e nelle proprietà elettrofisiologiche, confermando l’induzione al differenziamento. Per verificare che l’effetto sulle proprietà cellulari potesse mantenersi nel tempo, ulteriori analisi delle proprietà morfologiche e funzionali sono state condotte a tempi successivi agli 8 giorni. I risultati hanno mostrato che le cellule F-11 possono mantenere un fenotipo differenziato anche a 12 giorni. Le tecniche di riscaldamento utilizzate in letteratura sono risultate efficaci per modificare l’eccitabilità dei neuroni e hanno effetti sulla morfologia, ma a oggi non sono stati ancora riportati gli effetti funzionali. Inoltre, le cellule primarie rappresentano un modello ideale per studiare i neuroni sensoriali, ma la loro disponibilità è limitata. L’uso di una linea immortalizzata ha permesso di effettuare uno studio funzionale degli effetti del riscaldamento, e i risultati ottenuti dimostrano che una stimolazione termica localizzata può essere un metodo promettente per indurre il differenziamento e supportano la possibile applicazione futura di questa tecnica come una nuova strategia per modificare il comportamento neuronale in vivo.
Heating represents a promising approach to induce neurite outgrowth and neuronal function recovery. In previous studies, protocols with different temperatures (from 38°C to 50°C) and durations (from milliseconds to several days) could induced differentiation of different cell types like Xenopus laevis oocytes, cultured mammalian cells, neurons, stem cells and cancer cells. This effect has been attributed to changes in cell membrane capacitance and in ion channel properties, but the underlying mechanism remains so far unknown. The present project was aimed to investigate the eventual modifications, induced by two approaches of thermal stimulation, on the behaviour of a model of dorsal root ganglion (DRG) neurons, the F-11 cell line, previously characterized in our laboratory. These cells could express ion channels and cell membrane receptors consistent with those of sensory neurons and could be employed as a good model to study neuronal proliferation and differentiation mechanisms. Initially, to test if heating could effectively induce differentiation of our cellular model, we performed experiments of bulk stimulation: cells were placed in an incubator at different time and temperature combinations for two consecutive days. Thus, morphological and functional analysis were performed to investigate neuronal differentiation until 8 days. Results showed a significant difference in neurite elongation and in electrophysiological properties (resting membrane potential, Na+ and K+ current density and action potential frequency) in samples maintained at 41,5°C for 30 minutes versus 37°C samples. An intracellular Ca2+ signal analysis evoked by Capsaicin was performed to verify the involvement of TRPV (Transient Receptor Potential Vanilloid) channels in the effects of heating. Results showed that the Ca2+ signal was higher in heated cells compared to the control, suggesting that the treatment could increase the expression and/or the properties of TRPV1 channels, which are permeable to Ca2+. Moreover, we performed a lactate dehydrogenase activity (LDH) assay to verify if the treatment could induce cell stress and results showed that heat had no detrimental effects on F-11 cells. Considering these results, we investigated the effects of a scalable thermal stimulation method, established by irradiating Prussian Blue nanoparticles (PBNPs) with a near infrared laser. A disk of PBNPs-PVA was placed on the outer surface of the petri dish in which the cells were seeded, avoiding a direct contact between the material and the cells, and it was irradiated by a near infrared laser to increase culture medium temperature to 41,5°C. Neurite elongation was significantly increased in irradiated cells compared to non-irradiated control cells and significant differences were also observed during the functional analysis by patch-clamp technique. To verify if the effects on cellular properties could be maintained for a longer period, we performed a functional investigation also on heated and irradiated cells after 12 days in culture. Results showed that F-11 cells could maintain a differentiated phenotype also after 12 days in culture. The heating techniques used in literature could modify neuron excitability and had effects on cell morphology and staining, but the functional effects has not been reported so far. Moreover, primary cells represent an ideal model to study sensory neurons, but their availability is limited. The use of an immortalized cell line allowed to perform a functional study on the effects of heating, and the results demonstrated that a targeted thermal stimulation could be a promising approach to induce cell differentiation and support the future application of this method as a strategy to modify neuronal behaviour in vivo.

Lo scopo dell'elaborato di tesi è la progettazione e lo sviluppo di alcuni moduli di un software per la lettura ad elevato throughput di dati da particolari dispositivi per elettrofisiologia sviluppati dall'azienda Elements s.r.l. Elements produce amplificatori ad alta precisione per elettrofisiologia, in grado di misurare correnti a bassa intensità prodotte dai canali ionici. Dato il grande sviluppo che l'azienda sta avendo, e vista la previsione di introdurre sul mercato nuovi dispositivi con precisione e funzionalità sempre migliori, Elements ha espresso l'esigenza di un sistema software che fosse in grado di supportare al meglio i dispositivi già prodotti, e, soprattutto, prevedere il supporto dei nuovi, con prestazioni molto migliori del software già sviluppato da loro per la lettura dei dati. Il software richiesto deve fornire una interfaccia grafica che, comunicando con il dispositivo tramite USB per leggere dati da questo, provvede a mostrarli a schermo e permette di registrarli ed effettuare basilari operazioni di analisi. In questa tesi verranno esposte analisi, progettazione e sviluppo dei moduli di software che si interfacciano direttamente con il dispositivo, quindi dei moduli di rilevamento, connessione, acquisizione ed elaborazione dati.

Lo scopo di questa tesi è fornire una relazione in merito alla progettazione e allo sviluppo di un modulo software che permetta l'elaborazione e l'analisi di dati acquisiti nell'ambito dell'elettrofisiologia. Questo plug-in software è stato richiesto dall'azienda Elements S.r.l. e dovrà essere integrato in un loro software preesistente il cui nome è EDA (Elements Data Analyzer). Il modulo software creato aggiunge diverse funzionalità ad EDA quali creazione di istogrammi, curve fitting, identificazione di tempi medi di eventi di blocking molecolari, determinazione della conduttanza, cinetica del canale, visualizzazione di spettri del segnale, FFT,filtraggio digitale ed altre misure specifiche.

L’obiettivo di questo lavoro di tesi è stato quindi quello di ricercare e archiviare tutti i dati sperimentali di correnti ioniche umane ventricolari presenti in letteratura fino ad oggi, per costruire uno strumento di facile utilizzo per chiunque abbia la necessità di sviluppare o validare modelli matematici di potenziale d’azione. Partendo da una fase iniziale di ricerca vera e propria degli articoli in letteratura, utilizzando il motore di ricerca PubMed come strumento principale, sono stati estratti e archiviati tutti i dati di interesse, divisi per tipo di corrente, memorizzando le informazioni principali in un foglio di lavoro e salvando i dati sia come immagini che come vettori, per consentirne in futuro una rapida consultazione e un facile utilizzo.

I meccanismi neurali che sottendono i processi sensoriali e motori nel cervello dei primati non sono ancora stati chiariti. Decenni di letteratura neurofisiologica evidenziano la presenza di distinte proprietà neuronali in molti nodi dei circuiti corticali per l’afferramento, dai neuroni puramente motori che codificano lo scopo a quelli sensori-motori che rispondono alla presentazione visiva di oggetti, azioni o entrambi. L’attribuzione di queste proprietà funzionali a specifiche classi neuronali, come agli interneuroni inibitori o ai neuroni piramidali, sarebbe fondamentale per comprendere al meglio le funzioni cognitive e percettive che emergono dalla organizzazione intrinseca del sistema motorio. Ad oggi, molti studi mostrano che i neuroni corticali possono essere identificati prendendo in considerazione le diverse caratteristiche della loro forma d’onda e delle loro proprietà di scarica. Tuttavia, la specifica relazione tra classi neuronali identificate fisiologicamente e le loro proprietà di codifica resta ancora da chiarire, specialmente nelle aree appartenenti al sistema motorio dei primati. Per indagare questo problema abbiamo studiato le caratteristiche dei potenziali d’azione di 355 singoli neuroni ben isolati registrati extracellularmente. I neuroni sono stati registrati in 5 emisferi di tre scimmie macaco mentre svolgevano un compito di raggiungimento e afferramento di tipo go/nogo con tre differenti oggetti bersaglio, e mentre osservavano uno sperimentatore svolgere lo stesso compito. L’attività dei singoli neuroni è stata registrata dall’area intraparietale anteriore AIP (n=86), dall’area premotoria ventrale F5 (n=106) e dall’area pre-supplementare motoria F6 (n=163). Inizialmente abbiamo suddiviso tutte le forme d’onda registrate nelle tre aree in 3 gruppi attraverso una procedura di clustering non supervisionato. Queste tre classi di neuroni presentavano caratteristiche fisiologiche diverse e non si distribuivano uniformemente tra le aree. Nell’ area F6 prevalevano cellule con forma d’onda ampia e il numero di neuroni facilitati e inibiti era bilanciato sia durante il compito di esecuzione sia durante quello di osservazione. Al contrario, i neuroni con forma d’onda stretta risultavano più facilitati dai segnali visivi e dotati di una maggiore modulazione visuo-motoria congiunta sia quando l’azione veniva compiuta sia quando veniva osservata, soprattutto nelle are AIP e F5. Questi risultati chiariscono i meccanismi cellulari alla base dell'elaborazione locale delle informazioni sensori-motorie per la pianificazione, l'esecuzione e l’osservazione di azioni di prensione. Ulteriori studi potrebbero rilevare il contributo di reti cortico-sottocorticali più ampie ai meccanismi chiariti nel presente lavoro.
The neural machinery underlying sensory and motor processes in the primate brain remain largely unclear. Decades of neurophysiological literature evidenced the presence of distinct neuronal properties in many nodes of the cortical grasping network, from purely motor neurons encoding motor goals to sensorimotor neurons responsive to visually presented objects, observed actions or both. The attribution of these functional properties to specific neuronal classes, such as inhibitory interneurons or pyramidal neurons, would be crucial to achieve a better understanding of the motor-based perceptual and cognitive functions stemming from the inner organization of the motor system. To date, several studies showed that cortical neurons can be identified by jointly considering a variety of features of their spike waveform and firing properties, but the specific relation between physiologically characterized neuronal classes and their coding properties remains unclear, especially in areas of the primates’ motor system. To address this issue, here we studied the features of extracellularly recorded spikes of 355 well-isolated single neurons. Neurons were sampled from 5 hemispheres of 3 macaque monkeys while they performed or observed an experimenter performing, a reaching-grasping go/no-go task with three different objects as targets. Single neuron activity was recorded from anterior intraparietal area AIP (n=86), ventral premotor area F5 (n=106) and pre-supplementary motor area F6 (n=163). First, we performed an unsupervised clustering of spike waveforms that reliably dissociated 3 clusters. We found that physiologically-identified classes of cells, unevenly distributed across the investigated areas, carry distinct visuomotor signals. Broadly spiking neurons are prevalent in area F6 and exhibit a balanced amount of facilitated and suppressed activity during action execution and observation. In contrast, narrow spiking neurons are mostly facilitated by visual signals and show greater mutual modulation of their motor and visual response during one’s own and others’ action, particularly in areas AIP and F5. These findings shed light on the cellular mechanisms underlying local processing of sensorimotor information for planning and executing grasping actions and for processing others’ observed action. Further studies may unravel the contribution of larger cortico-subcortical brain network to the mechanisms elucidated by the present work.

La Sindrome di Brugada (BrS) è una patologia caratterizzata da disfunzioni del sistema di conduzione cardiaco, che aumenta il rischio di morte cardiaca improvvisa dovuta ad aritmie ventricolari, in assenza di alterazioni strutturali del cuore. La diagnosi si basa sull'analisi del tracciato ECG, infatti, i pazienti affetti dalla sindrome presentano anomalie in comune. Il tipico pattern ECG, tuttavia, può rimanere latente e i pazienti asintomatici: il primo sintomo spesso coincide con la morte. Le mutazioni del gene SCN5A, codificante il canale cardiaco del sodio, sono considerate la causa più comune dello sviluppo della sindrome, quando non ereditaria. Recentemente, è stata identificata una nuova mutazione (S805L) associata alla BrS. Dalla sua caratterizzazione su cellule HEK 293 e da esperimenti di current-clamp su cellule ventricolari di guinea pig, è stata formulata una nuova ipotesi sull'insorgenza del fenotipo patologico della BrS: la riduzione della corrente di sodio è enfatizzata a potenziali di riposo più negativi rispetto a quelli fisiologici e questo può provocare fenomeni aritmici. Lo scopo della tesi è quello di analizzare, tramite simulazione numerica di modelli matematici di potenziale d’azione ventricolare, come alcuni fattori influenzino il potenziale di riposo cellulare. Allo stesso tempo si vuole verificare come un’eventuale iperpolarizzazione del resting amplifichi l’effetto della mutazione sulla corrente di sodio. Per fare questo, sono state attuate delle modifiche ai modelli Luo-Rudy e O’Hara-Rudy e sono stati definiti dei set di parametri per riprodurre sia la condizione in Wild-type che mutata. Da questa analisi è stato ipotizzato che il fattore incisivo, per quanto riguarda gli aspetti già citati, sia il calo della concentrazione di potassio extracellulare. Infatti, è simulando una condizione di ipokaliemia che si è misurata la maggior perdita di funzione del canale del sodio, che potrebbe causare eventi aritmici letali nel paziente.

Questo elaborato ha avuto come obiettivo la modifica di un modello matematico di potenziale d’azione ventricolare umano per migliorare la relazione che lega la durata del potenziale d’azione all’incremento degli intervalli diastolici, al fine di riprodurre correttamente i risultati sperimentali noti in letteratura. Ruolo principe nell’analisi e nell’implementazione di tale modello è stato quello dello ione calcio, coinvolto in numerosi processi chimici all’interno della cellula cardiaca, e responsabile anche della sua contrazione. Tutte le modifiche effettuate sono state fatte preservando la dipendenza inversa tra la durata del potenziale d’azione e le variazioni di calcio extracellulare, che costituiva il punto di forza del modello considerato rispetto alla sua versione originale. Le modifiche effettuate hanno riguardato in parte la struttura del modello (compartimenti, volumi) e in parte il calcium handling, ovvero la gestione del Ca2+ all’interno della cellula, in termini di flussi e correnti. Il modello così ottenuto, denominato “newORk”, è stato validato rispetto a numerosi protocolli sperimentali (sia di voltage-clamp, sia di current-clamp) presenti in letteratura e i risultati di simulazione hanno dimostrato un comportamento coerente con i risultati in vitro. In particolare la risposta del modello al protocollo S1S2, che non era fisiologica nel modello precedente, viene adesso riprodotta correttamente dal nuovo modello, presentando un aumento dell’APD all’aumentare dell’intervallo diastolico considerato. Il modello qui descritto può quindi essere ritenuto un importante, per quanto specifico, miglioramento nella descrizione matematica della elettrofisiologia cardiaca umana e potrà essere utilizzato per esplorare contesti clinici in cui le concentrazioni di calcio nel sistema cardiocircolatorio si modificano, come per esempio la terapia dialitica.

VDACs are a small family of conserved proteins located in the outer mitochondrial membrane. They conduct ions, metabolites and small molecules, among which the energetic nucleotides ATP, ADP and NADH. Three different VDAC isoforms have been characterized in higher eukaryotes, encoded by three separate nuclear genes. VDAC1 is the most abundant isoform in most cells, being ten and hundred times more prevalent than VDAC2 and VDAC3, respectively. It is thus not surprising that VDAC1 is the isoform most extensively characterized. Functionally, VDAC1 is anion selective and exhibits a single-channel conductance of ~3.5-4.0 nS in 1 M KCl at an applied voltage between -20 mV and 10 mV. Raising the applied voltage results in the channel switching to the so-called “closed state”, with a lower conductance and a channel selectivity reversed to cations. In addition to the poreforming function, VDAC1 has been involved in various interactions and cross-talk with other cellular proteins like hexokinase, tubulin, the Ca2+ gate into mitochondria and the Bcl-2 family members that can impact on the activity of the pore itself and vice versa, testimony to the involvement of VDAC to crucial cell fates like in pathways leading to apoptosis, cancer and degeneration The aim of the PhD project was to perform a comparative study on the human VDAC isoforms focusing on both the whole channels and the individuals N-terminal domains. In this sense, both experimental and computational techniques have been used pointing out their complementarity and contribute to the completeness of the study. After a brief introduction, the methods used during the PhD will be presented. In the third chapter, the results together with the discussion will be described. Firstly, focusing on the structural characterization of the N-termini of the three isoforms. Secondly, the results and the discussion will concern the comparative study of the entire channels. Both of these characterization have been performed with either experimental and computational techniques. Finally, in the 4th chapter a brief conclusion and an outlook on a future perspective will be given.

La distonia DYT1 è una grave forma di distonia generalizzata causata da una mutazione del gene DYT1 che codifica per la proteina TorsinA. La funzione di tale proteina rimane ancora poco chiara anche se è stato proposto che possa svolgere importanti funzioni nel traffico proteico intracellulare e nei processi secretori. Lo striato, all'interno dei gangli della base svolge un importante ruolo nella regolazione dell'attività motoria, ed alterazioni a carico di tale struttura appaiono essere coinvolti nella patogenesi della distonia. Ho registrato pertanto le correnti sinaptiche spontanee sia di tipo GABAergico che glutamatergico in neuroni spinosi striatali (MSNs) da animali che sovraesprimevano la proteina umana mutata (hMT) confrontandoli poi con animali di controllo (CTRL) e con quelli che esprimevano la proteina umana non-mutata (hWT). Gli animali mutati presentavano un significativo aumento nella frequenza degli eventi sinaptici GABAergici (sIPSCs) non accompagnato però da variazioni nell'ampiezza di tali correnti. Al contrario l'attività spontanea di tipo glutamatergico (sEPSC) risultava essere del tutto normale. L'inibizione GABAergica striatale è di origine esclusivamente instrinseca e deriva da due distinte fonti. Una delle più importanti tuttavia fa capo agli interneuroni GABAergici Fast Spiking (FS). Ho pertanto verificato l'ipotesi che tali cellule potessero presentare alterazioni nella loro normale funzionalità. Sia gli sIPSCs che gli sEPSC registrati risultavano tuttavia essere invariati fra gli animali hMT, hWT e quelli di controllo. In condizioni fisiologiche l'attivazione del recettore dopaminergico D2 agisce presinapticamente inibendo il rilascio di GABA. Nei MSNs di animali di controllo e hWT, tale funzionalità risultava essere del tutto preservata. L'applicazione di quinpirolo (agonista D2-like) portava infatti ad una significativa riduzione della frequenza degli sIPSCs misurati. Tale effetto tuttavia era assente negli animali hMT. Inoltre sia MSNs sia FS di topi hMT non presentavano l'effetto inibitorio tipico del quinpirolo sulle correnti sinaptiche evocate tramite stimolazione elettrica (eIPSCs). In conclusione il mio lavoro dimostra la presenza di un'alterata attività del circuito GABAergico striatale in un modello animale di distonia DYT1, che può essere in parte giustificata da una disfunzione del recettore dopaminergico D2.
DYT1 dystonia is a severe form of inherited generalized dystonia, caused by a deletion in the DYT1 gene encoding the protein torsinA. The physiological function of torsinA is unclear, though it has been proposed to perform chaperone-like functions, assist in protein trafficking, membrane fusion and participate in secretory processing. Alterations in GABAergic signaling have been involved in the pathogenesis of dystonia. I recorded GABA- and glutamate-mediated synaptic currents from striatal neurons obtained from a mouse model of DYT1 dystonia. In medium spiny neurons (MSNs) from mice expressing human mutant torsinA (hMT), we observed a significantly higher frequency, but not amplitude, of GABAergic spontaneous inhibitory postsynaptic currents (sIPSCs) and miniature currents (mIPSCs), whereas glutamatergic spontaneous excitatory synaptic potentials (sEPSCs) activity was normal. No alterations were found in mice overexpressing normal human torsinA (hWT). To identify the possible sources of the increased GABAergic tone, I recorded GABAergic Fast-Spiking (FS) interneurons that exert a feed-forward inhibition on MSNs. Both sEPSC and sIPSC recorded from hMT FS interneurons were comparable to hWT and controls.In physiological conditions, dopamine (DA) D2 receptor act presynaptically to reduce striatal GABA release. Notably, application of the D2-like receptor agonist quinpirole failed to reduce the frequency of sIPSCs in MSNs from hMT as compared to hWT and controls. Likewise, the inhibitory effect of quinpirole was lost on evoked IPSCs both in MSNs and FS interneurons from hMT mice. My findings demonstrate a disinhibition of GABAergic synaptic activity, that can be partially attributed to a D2 DA receptor dysregulation. A rise in GABA transmission would result in a profound alteration of striatal output, that might be relevant to the pathogenesis of dystonia.

Le malattie cardiache, ed in particolare i disturbi del ritmo cardiaco, sono una delle principali cause di morte nel mondo, per questo motivo rappresentano una tematica su cui si concentra l’interesse della comunità scientifica. Tuttavia, i meccanismi di regolazione a livello cellulare nell’elettrofisiologia cardiaca sono affetti da una certa variabilità da individuo a individuo che deve essere investigata per la predizione della risposta del tessuto cardiaco a specifiche terapie. Uno dei limiti nell’attuale modellistica matematica risiede proprio nel fatto che non si tiene conto di questa variabilità intercellulare perdendo così informazioni importanti. Per superare questi limiti, sono stati sviluppati modelli in silico che consentono di pianificare nuovi esperimenti e formulare ipotesi con il vantaggio di abbattere sia i costi che i tempi richiesti dagli esperimenti in laboratorio. In particolare, in questo lavoro di tesi ci si è avvalsi dell’approccio delle popolazioni di modelli (PoMs) con lo scopo di descrivere la risposta di cellule hiPS-CSs a due farmaci, E4031 e Nifedipina, che bloccano specifici canali ionici cardiaci. Il primo passo è stato quindi quello di costruire una popolazione di 20000 modelli, randomizzando entro un certo intervallo i parametri corrispondenti alle conduttanze massime delle correnti ioniche cardiache, poi la popolazione è stata raffinata scartando tutti i modelli che non mostravano un potenziale d’azione fisiologico. Il passo successivo è stata la “calibrazione sperimentale”, cioè il confronto tra le simulazioni e i dati sperimentali relativi ai due farmaci. I risultati mostrano come le simulazioni ottenute, seguono in maniera quasi soddisfacente i dati sperimentali per il bloccante della ICaL ma non sono rappresentativi dei dati per il blocco della IKr i quali presentano una morfologia del potenziale d’azione diversa rispetto quello delle cellule virtuali.

Progettazione e implementazione dei moduli di visualizzazione, memorizzazione e analisi di un sistema software di acquisizione dati in real-time da dispositivi prodotti da Elements s.r.l. La tesi mostra tutte le fasi di analisi, progettazione, implementazione e testing dei moduli sviluppati.

The mesolimbic dopamine (DA) system, which originates in the midbrain ventral tegmental area (VTA), shows a reduction in its spontaneous activity after chronic cannabinoid exposure and withdrawal, the critical phases of the drug addiction cycle. These adaptive changes, which result from imbalances between excitatory and inhibitory afferents onto DA cells, are thought to play a critical role into withdrawal-induced negative affective states that eventually lead to relapse into drug taking. The lateral habenula (LHb) exerts a negative control over the VTA via a γ-aminobutyric acid (GABA) structure, the rostromedial tegmental nucleus (RMTg), encoding aversion-related stimuli. In fact, both RMTg and LHb neurons are excited by aversive/unpleasant events and inhibited by rewarding/positive stimuli. Moreover, RMTg GABA neurons express CB1 receptors on their axon terminals impinging upon VTA DA neurons and are a target for cannabinoid action on DA cells. Indeed, acute administration of these drugs reduces RMTg neuron discharge activity and strongly suppresses the inhibition exerted by RMTg afferents, thus contributing to cannabinoid-induced DA neuronal excitation. Therefore, these nuclei represent a potential convergence point for drug-evoked reward and aversive opponent processes. On these bases, in this thesis we tested the possibility that LHb-RMTg pathway is causally involved in the hypodopaminergic state, which is one hallmark of cannabinoid withdrawal. To this aim, we used single unit extracellular recordings from either VTA, RMTg and LHb neurons in anesthetized male Sprague-Dawley rats. In order to induce Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC) dependence, rats were chronically treated with Δ9-THC (15 mg/kg, i.p.), or its vehicle, twice daily for 6.5 days. Administration of the cannabinoid antagonist SR141716A (5 mg/kg, i.p.) precipitated an intense behavioral withdrawal syndrome, whereas abrupt Δ9-THC suspension caused only milder signs of abstinence. Electrophysiological experiments confirmed that Δ9-THC withdrawal produced a marked decrease in the firing rate and burst firing of VTA DA neurons. We then investigated the inhibitory contribution from RMTg afferents to VTA DA neurons. As expected, RMTg electrical stimulation elicited a complete suppression of spontaneous activity in approximately half of the DA neurons examined. Notably, we found that the duration of RMTg-evoked inhibition was prolonged in Δ9-THC withdrawn rats when compared with controls, suggesting an augmented GABA inhibitory input onto DA cells. By contrast, the spontaneous activity of RMTg GABA neurons was reduced in cannabinoid-withdrawn rats. Consistent with results, we also found that firing rate of RMTg-projecting LHb neurons was markedly suppressed after cannabinoid withdrawal. While further highlighting the role of the RMTg as a new master brake for DA neurons, our data support the hypothesis that enhanced GABA inputs from this nucleus might contribute to the hypodopaminergia induced by cannabinoid withdrawal. They also confirm that the LHb-RMTg pathway takes part in the neuronal circuits underlying drug dependence and addiction.

Within the brain, inhibitory signals originating from different GABAergic interneurons play crucial roles in establishing proper neural circuit operations. GABAergic interneurons are also directly involved in multiple neurological disorders, including epilepsy. The inhibitory signal from these cells can, indeed, counteract seizures and pharmacological agents that strengthen GABAergic transmission represent powerful anticonvulsant drugs extensively used by epileptic patients. Among the diverse classes of interneurons, Parvalbumin-expressing (Pv) interneurons have been proposed to play a central role in seizure control. In both experimental epilepsy models and patients these interneurons have been observed to generate a feedforward inhibition that effectively opposes seizure spread. When Pv interneurons were artificially activated in vivo with optogenetic techniques, ongoing seizures were interrupted. However, studies in different experimental epilepsy models revealed that Pv interneurons may, under certain conditions, favor seizure generation. It is therefore highly debated whether an intense activity of Pv interneurons can ultimately result in a pro- or in an anti-convulsant action. In my Doctorate thesis, I used a mouse brain slice model of focal epilepsy in which the epileptogenic focus can be identified and the role of Pv interneurons in the generation and in the propagation of seizure-like events accurately analyzed by a combination of optogenetic, electrophysiological and imaging techniques. I observed that a selective rhythmic activation of Pv interneurons at the focus failed to prevent seizure generation, and it rather contributed to prolong seizure duration by synchronizing the afterdischarges of the clonic phase. Moreover, this pattern of Pv interneuron activation induced in pyramidal neurons a post-inhibitory rebound spiking that enhances neuronal synchrony and promotes seizure generation. In contrast, a selective activation of Pv interneurons distant from the focus blocked seizure propagation and shortened seizure duration at the focus. I then revealed that the reduced seizure duration at the focus was a direct consequence of the propagation block which probably prevented newly generated afterdischarges to travel backwards to the original focus of seizure initiation. The functional dichotomy of Pv interneurons described in the thesis opens new perspectives to our understanding of how local inhibitory circuits govern generation and spread of focal epileptiform activities. Given the wealth of evidence pointing at Pv interneurons as key players in epilepsy, their disfunction might also be at the basis of genetic epilepsies such as the severe myoclonic epilepsy of infancy (SMEI or Dravet syndrome), a rare epileptic encephalopathy characterized by an elevated mortality rate, early onset and seizures associated with elevated body temperature. SMEI is associated with a loss of function of the NaV 1.1 isoform of the sodium channel α−subunit. Recently, a mouse model of SMEI was generated by specific deletion of the SCN1A gene that codes for NaV 1.1. Importantly, in this model GABAergic interneurons, and in particular Pv interneurons, have been proposed to be specifically affected by the NaV 1.1 deletion, resulting in a reduced excitability of these cells that might leads to network disinhibition and possibly seizures. Therefore, in the framework of a broad characterization of synaptic and network activities in in vitro and in vivo models from NaV 1.1 heterozygous KO mice, I report here evidence that the propagation of focal epileptiform events in brain slices from NaV 1.1 KO mice is faster than in WT mice, hinting at a weakening of feedforward inhibition that restrains seizure spread, most likely deriving from Pv interneuron impaired excitability. Finally, as accumulating evidence supports a novel view of brain function where neurons intensively cooperate with astrocytes, I decided to investigate if a specific communication between GABAergic interneurons and astrocytes may exist. Indeed, neurotransmitters can elicit in astrocytes Ca2+ elevations that, in turn, trigger the release of neuroactive molecules, commonly known as gliotransmitters. However, whether and how GABA, the main inhibitory neurotransmitter, can evoke similar Ca2+ elevations in astrocytes and what is the functional outcome of these GABA-activated astrocytes are questions poorly addressed. These questions are particularly relevant in epilepsy, where we observe a massive GABAergic activity during seizure generation and propagation. To this aim, I found that in somatosensory and temporal cortex slices loaded with the Ca2+ indicator Fluo-4 AM, a large number of astrocytes in the layer 5 exhibited somatic Ca2+ rises in response to GABA or Baclofen (a specific GABAB receptor agonist). Patch-clamp recordings in the presence of TTX also revealed that GABAB activation triggered N-methyl-D-aspartate receptor- mediated slow inward currents (SICs) in principal neurons, suggesting that astrocytes in local circuits can convert an intense inhibitory input into a delayed excitatory output. These data support the presence of a dynamic, bidirectional signaling between GABAergic interneurons and astrocytes, which opens new perspectives for our understanding of the role of these different cell types in brain physiopathology.
I segnali inibitori generati da una grande varietà di interneuroni GABAergici hanno un ruolo cruciale nell’assicurare il corretto funzionamento dei circuiti neuronali nel cervello. Gli interneuroni GABAergici sono anche direttamente coinvolti in numerose patologie neurologiche, compresa l’epilessia. L’azione inibitoria di questi interneuroni è in grado di contrastare le crisi epilettiche, e, infatti, gli agenti farmacologici che rafforzano la trasmissione sinaptica GABAergica sono utilizzati come farmaci anticonvulsivanti per i pazienti epilettici. Tra le numerose classi di interneuroni GABAergici, gli interneuroni esprimenti Parvalbumina (Pv) sembrano giocare un ruolo fondamentale nel controllo delle crisi epilettiche. In modelli sperimentali di epilessia ed in pazienti umani è stato dimostrato che queste cellule generano un’inibizione a feedforward, che si oppone efficacemente alla propagazione delle crisi epilettiche. Quando gli interneuroni Pv sono stati attivati artificialmente in vivo con tecniche optogenetiche, le crisi in corso sono state rapidamente interrotte. Ciò nonostante, altri studi hanno dimostrato che gli interneuroni Pv possono, in determinate circostanze, favorire la generazione delle crisi epilettiche. Non è quindi chiaro se l’intensa attività di questo sottogruppo di interneuroni abbia un effetto pro - o anti - epilettico. Nella mia tesi di dottorato ho usato un innovativo modello di epilessia focale in fettine cerebrali di topo, dove il sito di generazione delle scariche epilettiche (focus) può essere precisamente identificato, per studiare il ruolo degli interneuroni Pv nella generazione e nella propagazione delle scariche epilettiche attraverso tecniche di elettrofisiologia, optogenetica e imaging. Innanzitutto ho osservato che l’attivazione ritmica degli interneuroni Pv nella zona focale non è in grado di prevenire la generazione di una scarica epilettica, mentre ha invece contribuito a prolungare la durata della crisi attraverso la sincronizzazione degli afterdischarges, picchi di attività tipici della fase clonica. Inoltre, questo pattern di attivazione degli interneuroni Pv ha indotto nei neuroni piramidali un rebound spiking post – inibitorio che ha intensificato la sincronia della rete neuronale, facilitando così la generazione della crisi. Al contrario, l’attivazione degli interneuroni Pv nelle aree distanti dal focus ha bloccato con successo la propagazione della scarica epilettica e ha ridotto la durata della crisi nel focus. Ho poi dimostrato che la ridotta durata della crisi nell’area focale è una conseguenza diretta del blocco della propagazione che ha probabilmente impedito ai nuovi afterdischarges di viaggiare a ritroso verso il focus per mantenere l’attività epilettica. La dicotomia funzionale degli interneuroni Pv descritta in questa tesi apre nuove prospettive per comprendere come i circuiti inibitori locali governano la generazione e la propagazione dell’attività epilettica focale. Vista la grande mole di dati esistenti che indicano gli interneuroni Pv come protagonisti centrali nell’epilessia, è possibile ipotizzare che disfunzioni a loro carico contribuiscano alla patogenesi di forme genetiche come l’epilessia mioclonica severa dell’infanzia (SMEI, detta anche sindrome di Dravet). Questa grave patologia neurologica è una rara forma di encefalopatia epilettica caratterizzata da esordio precoce, crisi epilettiche associate ad elevata temperatura corporea ed elevato tasso di mortalità. La SMEI è associata ad una mutazione che causa l’inattivazione di uno dei due alleli codificanti la subunità alfa del canale del sodio voltaggio-dipendente NaV 1.1. Recentemente, è stato generato un modello murino di SMEI che riproduce abbastanza bene il fenotipo umano della malattia. In questo modello, gli interneuroni Pv sembrano essere selettivamente affetti dalla delezione dei canali NaV 1.1, provocando in queste cellule una riduzione di eccitabilità che può portare alla disinibizione della rete neuronale e, eventualmente, alle crisi epilettiche. Alla luce di queste premesse, nell’ambito di un’estesa caratterizzazione dell’attività sinaptica e di network in modelli in vitro ed in vivo da topi eterozigoti per la delezione dei canali NaV 1.1, ho osservato che le scariche epilettiche si propagano più velocemente nelle fettine cerebrali provenienti da topi eterozigoti per la delezione rispetto ai topi selvatici di controllo. Questa evidenza suggerisce un indebolimento dell’inibizione a feedforward derivante probabilmente dalla ridotta eccitabilità degli interneuroni Pv. Infine, dato che negli ultimi anni si sta facendo strada con forza una visione del funzionamento del cervello dove i neuroni collaborano strettamente con gli astrociti, ho voluto capire se esiste una interazione specifica tra interneuroni GABAergici ed astrociti, e quali conseguenze questa interazione ha sull’attività neuronale. Infatti, i neurotrasmettitori sono in grado di stimolare risposte Ca2+ negli astrociti le quali, a loro volta, possono provocare il rilascio di molecole neuroattive, comunemente note come gliotrasmettitori. Tuttavia, mentre la comunicazione tra astrociti e neuroni eccitatori è ben caratterizzata, l’interazione con gli interneuroni inibitori è ancora largamente inesplorata. In particolare, questa interazione può essere molto rilevante nell’epilessia, dove osserviamo una massiccia attività GABAergica durante la generazione e la propagazione della scarica epilettica. A questo proposito, ho osservato che nelle fettine di corteccia somatosensoriale e temporale caricate con l’indicatore Ca2+ Fluo-4 AM, la maggior parte degli astrociti nello strato 5 ha mostrato aumenti di Ca2+ in risposta all’applicazione di GABA o di Baclofen (un agonista specifico del recettore metabotropico GABAB). Per verificare se gli astrociti attivati dal GABA possano rilasciare glutammato, ho effettuato registrazioni di patch-clamp da neuroni piramidali grazie alle quali ho potuto verificare che l’attivazione del recettore GABAB negli astrociti provocava correnti depolarizzanti lente (SIC) nei neuroni mediate da recettore NMDA. I risultati di questi esperimenti suggeriscono che gli astrociti possono convertire nei circuiti locali un forte input inibitorio in un output eccitatorio ritardato, e che evidentemente esiste una comunicazione bidirezionale tra astrociti e interneuroni GABAergici che apre nuove prospettive sul ruolo di queste cellule nella fisiopatologia cerebrale.

People seem to automatically appraise the salience of stimuli relevant to survival and automatically direct attention toward whatever may constitute a potential danger. The phenomenon by which threatening stimuli capture more attention in comparison to neutral and pleasant ones is called attentional bias. In the literature, many hypotheses were advanced about attentional processes involved in this bias: it could consist in an early facilitation of the automatic encoding of threatening information, followed by a difficulty in disengaging attention (delayed disengagement), or in an initial orienting of attention toward threat stimuli followed by cognitive avoidance, that inhibits more detailed processing (vigilance-avoidance). Many behavioural and electrophysiological data support the rapid and preferential processing of threatening stimuli, and these have been obtained by using a variety of experimental paradigms: threat stimuli are detected more quickly, require more processing resources, interfere with the execution of other tasks, maintain the subject’s attention for a longer time and make orienting of attention toward other stimuli more difficult. Several studies show that the attentional bias is enhanced in individuals with high levels of trait anxiety or with anxiety disorders, and that it is specifically related to disorder-related stimuli. In specific phobias, information processing usually prioritises the detection and the analysis of phobia-related stimuli. However, this does not seem to occur in blood-injection-injury phobia. Blood phobics do not seem to show a facilitated processing of phobia-related stimuli. In contrast, an attentional bias towards phobia-related stimuli, reflected in larger amplitudes of event-related potential P300 and late positive potentials, can be effectively highlighted during passive viewing in other specific phobics. Blood phobia is peculiar in many ways: at subjective, behavioural and physiological levels. Unlike other specific phobias, disgust is not a secondary emotion, that accompanies fear, but it is the predominant emotion elicited by phobic stimuli. At physiological level, a pattern of cardiovascular activation leading to fainting can be observed. Such a physiological response is associated with uncertainty as to the best behavioural strategy to adopt upon encounter with the phobic stimulus: action or motor inhibition. The present dissertation describes three studies which aimed at investigating the presence of an attentional bias in blood-injection-injury phobia through behavioural and electrocortical measures. Different experimental paradigms and emotional control categories were used to test the specificity of the attentional bias towards phobia-related stimuli and to identify the underlying attentional mechanisms.
Rilevare uno stimolo minaccioso nell’ambiente il più velocemente possibile è una funzione essenziale per gli esseri viventi, in quanto permette una risposta di difesa più efficace e comporta maggiori possibilità di sopravvivenza. Il fenomeno per cui gli stimoli minacciosi catturano attenzione in modo più efficace rispetto a stimoli neutri o piacevoli prende il nome di bias attentivo. Esistono numerose ipotesi in letteratura sui meccanismi attentivi alla base di questo bias. In particolare, vi sono due modelli: il primo sostiene che vi sia una facilitazione precoce nella codifica dell’informazione minacciosa, seguita da una difficoltà nello spostare l’attenzione da tale informazione verso altri stimoli (disingaggio ritardato); il secondo sostiene invece che l’iniziale orientamento dell’attenzione verso l’informazione minacciosa sia seguito da evitamento cognitivo, che ne inibisce una elaborazione più dettagliata (vigilanza-evitamento). Vi sono numerosi studi che hanno prodotto dati comportamentali ed elettrofisiologici a sostegno dell’esistenza di una elaborazione preferenziale degli stimoli minacciosi: ad esempio, gli stimoli di minaccia sono rilevati più velocemente, richiedono più risorse di elaborazione, interferiscono maggiormente nell’esecuzione di compiti concomitanti, mantengono l’attenzione per un periodo di tempo maggiore e rendono difficoltoso lo spostamento dell’attenzione su altri stimoli. Molteplici studi hanno inoltre dimostrato che gli individui con disturbi d’ansia, o con elevati livelli di ansia di tratto, presentano un bias attentivo più marcato, specificatamente nei confronti di stimoli legati al disturbo. E’ noto che nelle fobie specifiche l’elaborazione dell’informazione privilegia la detezione e l’analisi dello stimolo fobigeno. Tuttavia, questo non sembra verificarsi per la fobia di sangue-iniezioni-ferite. A livello elettrocorticale, nelle fobie specifiche si rileva solitamente un bias associato all’elaborazione dello stimolo fobico, che si riflette in compiti di visione passiva in una maggiore ampiezza della componente P300 dei potenziali evento-relati e in una maggiore positività tardiva (LPP). Questo effetto non è tuttavia emerso per la fobia del sangue. Questo disturbo d’ansia è infatti singolare da molteplici punti di vista: a livello soggettivo, è caratterizzato dall’emozione di disgusto, piuttosto che da quella di paura; a livello fisiologico, è caratterizzato da un pattern di attivazione cardiovascolare che spesso conduce allo svenimento; a livello comportamentale, è caratterizzato da un conflitto tra azione e inibizione motoria. Il presente lavoro di tesi descrive tre studi che avevano l’obiettivo di indagare la presenza di un bias attentivo nella fobia di sangue-iniezioni-ferite attraverso misure comportamentali ed elettrocorticali. Sono stati impiegati paradigmi sperimentali e categorie emozionali di controllo differenti al fine di testare la specificità del bias attentivo nei confronti del materiale fobigeno e di identificare i meccanismi attentivi coinvolti.

Razionale ed obiettivi: Lo stroke rappresenta una delle maggiori cause di morte e di invalidità nel mondo. Nella maggior parte dei casi, i danni conseguenti all’ischemia portano a conseguenze più o meno severe. Tuttavia il recupero è spesso dinamico, data la capacità di adattamento del sistema nervoso centrale al danno. I fenomeni di plasticità sinaptica che si verificano nella corteccia cerebrale e nelle strutture sotto-corticali dopo ischemia sono stati studiati a livello sinaptico, cellulare e dell’intero network e molti dati suggeriscono che essi svolgono un ruolo chiave nella sopravvivenza neuronale. In particolare, studi in vivo hanno dimostrato che la deprivazione di ossigeno e glucosio (OGD) esercita cambiamenti a lungo termine dell’efficacia della trasmissione sinaptica sia impedendo l’espressione della LTP fisiologica sia provocando un potenziamento patologico della trasmissione sinaptica eccitatoria denominata LTP post-ischemica (i-LTP). Nel corso di questo studio sono stati analizzati i meccanismi cellulari e molecolari alla base dell’induzione e del mantenimento di queste forme di plasticità sinaptica patologica ed è stata esaminata l’efficacia di diverse strategie neuroprotettive nei confronti del danno ischemico. In primo luogo, sono stati studiati, sui neuroni spinosi dello striato, gli effetti dell'inibizione farmacologica delle subunità NR2B del recettore NMDA per il glutammato sulle alterazioni elettrofisiologiche e morfologiche indotte dall'ischemia focale in vivo. Successivamente, considerando il deficit nell'omeostasi del Na+ e del Ca2+ intracellulari, che si verifica nel corso dell'ischemia cerebrale e che conduce a morte neuronale, è stato analizzato, mediante registrazioni intracellulari, l'effetto dell'inibizione farmacologica dello scambiatore Na+/Ca2+(NCX) sull’attività dei neuroni spinosi del core ischemico, individuato, dopo occlusione permanente dell’arteria cerebrale media (pMCAO), attraverso la registrazione dei potenziali di campo extracellulari. Infine, vista la stretta relazione tra morte neuronale dopo ischemia e metabolismo mitocondriale, abbiamo analizzato nel modello di OGD in vitro, l’effetto neuroprotettivo dell’acetil-L-carntina (ALC), un composto in grado sia di modulare il sistema colinergico sia di interferire con la produzione di energia mitocondriale. Metodi: Le registrazioni elettrofisiologiche sono state ottenute da preparazioni corticostriatali di ratto. Per indurre l’LTP è stato usato il protocollo di stimolazione ad alta frequenza delle fibre corticostriatali (HFS). L’ischemia in vitro è stata indotta mediante OGD, mentre la pMCAO è stata usata come modello di ischemia in vivo. Risultati: L’impiego di antagonisti della subunità NR2B del recettore NMDA, quali l'ifenprodil, è stato in grado di bloccare l'LTP post-ischemico, favorendo il recupero della normale attività sinaptica nella penombra ischemica. Inoltre, la somministrazione sistemica di ifenprodil ha ridotto il volume infartuale e migliorato i deficit neurologici. Il blocco farmacologico di NCX mediante l'applicazione del bepridil o del CB-DMB ha provocato una perdita irreversibile e dose-dipendente dei potenziali di campo registrati nella penombra ischemica oltre ad aver causato alterazioni cellula-specifiche delle proprietà elettrofisiologiche attraverso un meccanismo di azione postsinaptico. Mediante registrazioni extracellulari, infatti, abbiamo dimostrato che ALC esercita un'azione neuroprotettiva e stereospecifica nei confronti dell'ischemia in vitro, mediante l'attivazione dei recettori muscarinici di tipo M2. Studi condotti attraverso registrazioni intracellulari, hanno, inoltre, permesso di confermare l'efficacia dose-dipendente e stereospecifica di tale composto nei confronti dell'OGD e di individuare, attraverso l'applicazione dell'FCCP, un disaccoppiante della catena mitocondriale, il suo coinvolgimento nel metabolismo mitocondriale in condizioni fisiologiche e patologiche. Conclusioni: nel corso del presente studio sui meccanismi di neuroprotezione nei modelli di ischemia cerebrale, abbiamo mostrato che i recettori NMDA che contengono la subunità NR2B giocano un ruolo chiave nell’induzione dell’i-LTP. In seguito abbiamo dimostrato l’efficacia di NCX nel mantenere l’omeostasi ionica nella zona peri-infartuale; infine abbiamo chiarito l’effetto neuroprotettivo dell’ALC nel prevenire la perdita dei potenziali di campo e l’espressione della forma di plasticità sinaptica patologica che si verifica in seguito all’evento ischemico
Background and Purpose: Stroke is the second commonest cause of death and the principal cause of adult disability in the world. In most cases ischemic injuries have been reported to induce mild to severe permanent deficits. Nevertheless, recovery is often dynamic, reflecting the ability of the injured neuronal networks to adapt. Plastic phenomena occurring in the cerebral cortex and in subcortical structures after ischemia have been documented at the synaptic, cellular and network level and several findings suggest that they may play a key role during neurorehabilition in human stroke survivors. In particular, in vitro studies have demonstrated that oxygen and glucose deprivation (OGD) exerts long term effects on the efficacy of synaptic transmission either via the prevention of the stable expression of physiological LTP or by causing itself a potentiation of the excitatory synaptic transmission, named post-ischemic LTP (i-LTP). In the present study we analyzed the cellular and molecular mechanisms underlie the induction and maintenance of these pathological forms of synaptic plasticity and we characterized the differential efficacy of neuroprotective strategies in the neuronal damage induced by ischemia. First, we studied the differential effect of the NR2B subunit antagonist of the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors, ifenprodil, in the induction of LTP and i-LTP as well as in the glutamate-mediated excitotoxicity in an in vivo model of ischemia. Secondly, considering the excessive intracellular accumulation of both Na+/Ca2+ ions which results in subsequent cell death, we have analyzed the effect of the pharmacological inhibition of the plasma membrane Na+/Ca2+ exchanger (NCX) on the physiological properties of striatal neurons recorded from peri-infarct area after in vivo ischemia. Finally, since the neuronal death after ischemia is closely linked to the essential role of mitochondrial metabolism, we have analyzed the neuroprotective role of acetyl-L-carnitine (ALC), a drug that can both modulate cholinergic system and interfere with mitochondrial metabolism, on an in vitro model of brain ischemia. Methods: Electrophysiological recordings were obtained from rat corticostriatal slices preparations. High-frequency stimulation of corticostriatali fibers was used as a LTP-inducing protocol. In vitro ischemia was induced by OGD; in vivo ischemia was induced by permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO). Results: Antagonists selectively targeting NMDA receptors containing the NR2B subunit blocked i-LTP without affecting activity-dependent LTP. This inhibition caused reduction of brain damage, amelioration of neurological outcome and normalization of the synaptic levels of NR2B subunits. Inhibitors of NCX reduced in a concentration-dependent manner the field potential amplitude recorded from the penumbra of corticostriatal slices after pMCAO and induced the cell-type-specific electrophysiological alterations trough a postsynaptic site of action. Following in vitro ischemia, by using extracellular recordings, the pretreatment with ALC produced a progressive and dose-dependent recovery of the field potential amplitude following in vitro ischemia; this effect was stereospecific and requires the activity of choline uptake system and the activation of M2 muscarinic receptors. Intracellular recordings also demonstrated that ALC did not alter the induction or the maintenance of physiological activity-dependent LTP, while it prevented i-LTP in a dose-dependent manner. In the presence of a very low dose of the mitochondrial uncoupler FCCP, ALC no longer prevented i-LTP suggesting that neuroprotective effects of ALC may require a compensatory activity of mitochondrial energy metabolism. Conclusions: During the present study of neuroprotective mechanisms we have shown that NR2B-containing NMDA receptors play a critical role in the induction of i-LTP. Moreover we have demonstrated the ability of NCX in the maintenance of ionic homeostasis in the peri-infarct area and finally we have shown the beneficial effect of ALC preventing the loss of field potential recorded from corticostriatal slices and the expression of pathological synaptic plasticity induced by ischemia.

Questo lavoro di Tesi Magistrale, si focalizza sulla più importante delle aritmie atriali, ovvero la Fibrillazione Atriale, e sul trattamento della stessa attraverso le procedure di ablazione a radio frequenza (RF). Il lavoro di tesi, svolto presso l'Ospedale 'M. Bufalini' di Cesena, affronta in particolare l'uso della tecnologia EnSite NavX (un sistema di mappaggio elettroanatomico delle cavità cardiache) ed EnSite Contact (un sistema basato sulla misura dell'impedenza locale per la valutazione del contatto elettrodo tessuto). L'acquisizione e l'analisi dei dati di ECI (indice di accoppiamento elettrico), forniti dal modulo Contact, hanno permesso di comprendere come questo parametro, derivato dalla misura dell'impedenza locale, possa contribuire a fornire importanti informazioni in real-time all'elettrofisiologo e come lo studio della sua dinamica, con particolare attenzione alle variazioni tra pre e post ablazione, possa risultare utile per verificare l'avvenuta erogazione di energia ai tessuti.

ABSTRACT Introduction. Hepatic encephalopathy (HE) is a neuropsychological syndrome which may accompany acute or chronic liver failure, being mainly due to the toxic effect of ammonia on the central nervous system [83]. HE encompasses a wide clinical spectrum, ranging from minimal forms, which are only detected by use of neuropsychological and/or electrophysiological techniques, to coma [7,8, 11, 144, 175, 190]. HE, even in its minimal form, impinges on quality of life and self-sufficiency [10, 76, 120, 164] and it carries negative prognostic value in terms of survival. Thus it is useful to identify patients with HE and reduced life expectancy, also for purposes of transplant selection procedures. The electrophysiological diagnosis of HE is based on the detection of slow wake-EEG frequencies [8]. However, some studies have shown that the regional distribution of the wake-EEG rhythms is also abnormal [126]. The detection of HE through psychometric and electrophysiological techniques is usually carried out in "standard" conditions. More recently, it has been proposed to artificially induce a condition of hyperammonaemia, thus simulating HE, by the oral administration of an amino-acid load (AAL). These amino-acids mimic the composition of hemoglobin, thus reproducing, at least to some extent, the HE which is observed after a gastrointestinal bleed [4, 65]. This allows doctors and researchers to measure more directly a patient's sensitivity to hyperammonaemia. Disorders of the sleep-wake rhythm are common in patients with cirrhosis, heavily affecting their quality of life [129]. Sleep is regulated by the interaction of two processes: a homeostatic and a circadian process [31]. The former determines the propensity to fall asleep in connection to prior sleep-wake history (i.e. the need for sleep increases with prolonged wakefulness). The latter, which is reflected in the 24-hour rhythm of the hormone melatonin (high plasma levels at night and extremely low levels in the daytime), determines the alternation of periods of low/high sleep propensity in relation to environmental light/dark conditions. The interaction of such two processes results in a high likelihood of falling asleep after a prolonged period of wakefulness and when it gets dark, namely in the evening. The alterations of the sleep-wake rhythm in patients with liver have traditionally been interpreted as being part of the HE syndrome [175]. More recent data suggest that this is the case for excessive daytime sleepiness, while insomnia probably has a different pathogenesis [128]. The causes of sleep-wake abnormalities in patients with cirrhosis are not completely clear. The documented changes in the circadian system (reduced sensitivity to light and altered rhythm/metabolism of melatonin) do not offer a complete explanation [128, 129]. Sleep can also be studied by polysomnography, which reflects homeostatic regulation. Information on homeostatic regulation in these patients is limited [179]. The exact neurochemical correlates of human sleep homeostasis remain unknown, although adenosinergic neurotransmission is likely to be implicated. In healthy subjects caffeine, an adenosine receptor antagonist, significantly affects both the wake EEG (reduction in theta activity, which increases with the increase of sleep pressure) and the sleep EEG, and attenuates the subjective sleepiness which is associated with prolonged wakefulness and sleep deprivation [106]. This set of studies was performed in order to evaluate: - the effect of induced hyperammonaemia on neuropsychological performance and the wake EEG (Study 1); - the relationship between daytime sleepiness, HE, and the sleep EEG (Study 2); - the effects of ammonia-lowering drugs (L-ornithine-L-aspartate, LOLA) and caffeine on the wake and sleep EEG (Study3). Materials and methods. Well-characterized patients with compensated cirrhosis and with no history of HE and matched healthy volunteers were enrolled and underwent: - Assessing and monitoring the quality and time of sleep with questionnaires and sleep diaries. - Oral load of amino acids (AAL), mixture of 54 grams of amino acids mimicking the hemoglobin contained in 400 ml of blood, taken in the morning per os. - Detection time of subjective sleepiness and capillary ammonia. - Neuropsychological assessment, including psychometric paper and pencil (PHES battery), computerized psychometry and EEG recording of wakefulness. - Polysomnographic recording. Patients were given the opportunity to sleep between 17:00 and 19:00 in favorable environmental conditions (dark and isolated room). - Administration of LOLA 20g in 500cc of saline in 4-hour infusion (8-12) or 200mg caffeine per os(at 10 am) under inducedhyperammonemia (Study 3). Results. Study 1. Effects of hyperammonaemia on neuropsychological performance and waking EEG. - The study population included 10 patients with liver cirrhosis (9 men, mean ± SD, age: 54 ± 14 years) and 10 healthy volunteers matched for age and sex (5 men, 49 ± 13 years). One patient (male 55 years) underwent EEG recording also after the insertion of a trans-jugular portal-systemic shunt (TIPS), a procedure which is associated with increased risk of HE. - The subjects were studied with a neuropsychological evaluation and monitoring of capillary ammonia at baseline (4th or 8th day of the study) and after oral amino acids (AAL) (4th or 8th day of the study). - At baseline, patients had higher ammonia levels than healthy volunteers [median (interquartile range): 30 (22-44) vs. 38 (34-47)mmol/L, p < 0.1]. The AAL has produced the expected increase in ammonia in both groups, the peak of ammonia was higher (ammonia 11:00, p < 0.03) and more prolonged in patients. - The AAL has produced a significant slowing of EEG waking such as to define the presence of a minimal HE in 2 (20 %) patients. By contrast, the AAL no significant changes in the psychometric performance paper & pencil or computerized. - At baseline, the dominant frequency EEG activity was slower in patients compared to healthy volunteers in most derivations(p < 0.05). The AAL did not alter the dominant frequency in healthy volunteers, while that of patients slowed further along the midline (p < 0.05). - At baseline, the waking EEG spectral power had an occipital-temporal predominance in both groups. The patients had higher power in all derivations (p < 0.05). The AAL induced a significant increase of power in almost all derivations in healthy volunteers (p < 0.05), while it did not affect power in patients. - In the patient studied on three occasions, the spectral power of dominant wake EEG progressively increased from baseline after AAL and after TIPS, while there was a decrease in the frequency of the wake EEG after insertion of TIPS. Study 2. Effect of hyperammonaemia on sleepiness and sleep EEG. - The study population (see Study 1) was subjected to neuropsychological assessment, detection time of sleepiness and ammonia and polysomnographic recording, in basal conditions (4th or 8th day of the study) and after AAL (4th or 8th day of the study). The AAL has produced - an increase in subjective sleepiness parallel to increased concentrations of ammonia both in patients and in healthy volunteers;in both groups, the peak of sleepiness (at 11 am), absent in basal condition, coincides with the peak concentration of ammonia (p <0.01); - an increase in sleep duration in healthy volunteers compared with baseline (mean ± SD, 49.3 ± 26.6vs. 30.4 ± 15.6 min), although the differences are not statistically significant (p 0.08). No changes arebeen observedon the duration of sleep in patients; - significant decrease in the relative power beta (fast activity)of the sleep EEG in healthy volunteers (p < 0.05); - significant reduction in the relative power of delta (activity very slow)of thesleep EEG in patients (p < 0.05). Study 3. Effects of L-ornithine-L-aspartate (LOLA, substance that reduce ammonia) and caffeine (adenosine receptor antagonist) on cognitive performance,wake and sleep EEG in conditions of induced hyperammonaemia. - The study population consisted of 6 patients with liver cirrhosis (5 men, mean ± SD, age: 61 ± 9 years) and 5 healthy volunteers matched for age, sex and level of education (4 men, 49 ± 12 years). - The subjects were studied with neuropsychological assessment, detection sleepiness and ammonia hourly and polysomnographic recording, after AAL, AAL+LOLA, AAL+caffeine) on the 4th, 11th and 18th day of the study. - patients presented a paper and pencil and computerized psychometric performance significantly worse than the healthy volunteers (p < 0.05); - patients had levels of ammonia above those of healthy volunteers in all conditions; the AAL has produced the expected increase of ammonia in both groups, with a peak higher and more prolonged in patients. - The LOLA has resulted in a reduction although not significant levels of plasmatic ammonia in both groups. - Neither the LOLA nor caffeine resulted in significant changes of subjective sleepiness, on psychometric performance and the wake EEG. - Sleep EEG data are being analyzed (at the Institute of Pharmacology and Toxicology, University of Zurich, Switzerland). Conclusions. - The waking EEG is extremely sensitive to hyperammonaemia. - A moderate/chronic (patients in baseline) or acute (healthy volunteers after AAL) hyperammonaemia results in an increased power of the dominant EEG rhythm, especially over posterior and central areas of the scalp. - An acute on chronic hyperammonaemia (patients after AAL) slows further the dominant EEG frequency. - EEG parameters based on power can provide useful information to the neurophysiological definition of HE. - Hyperammonaemia leads to a significant increase in subjective daytime sleepiness. - Hyperammonaemia causes opposing changes in the sleep EEG of patients and controls, making the sleep of patients fragmented and more superficial, and that of healthy volunteers deeper and more stable. - L-ornithine-L-aspartate leads to a reduction in the levels of ammonia.
L'encefalopatia epatica (EE) è una sindrome neuropsichica che può accompagnare l'insufficienza epatica acuta o cronica ed è legata principalmente all'effetto tossico dell'ammonio sul sistema nervoso centrale [83]. Clinicamente, l'EE è caratterizzata da uno spettro di manifestazioni che va da forme minime, evidenziabili solo con tecniche psicometriche ed elettrofisiologiche, fino al coma, passando per quadri clinici di encefalopatia conclamata, caratterizzati da alterazioni neurologiche e psichiatriche più o meno invalidanti [7, 8, 11, 145, 176, 191]. L'EE, anche nelle sue forme minime, si ripercuote non solo sull'autonomia e sulla qualità di vita del paziente [10, 76, 121, 165], ma anche su quelle familiari e sulle strutture socio-sanitarie. Inoltre, contribuisce ad individuare pazienti con ridotta aspettativa di vita, per i quali può essere indicato l'inserimento in lista per trapianto di fegato. La diagnosi elettrofisiologica dell'EE si basa sulla rilevazione di un rallentamento delle frequenze dell'EEG [8]. Tuttavia, alcuni studi hanno dimostrato che anche la distribuzione regionale dei ritmi dell'EEG di veglia può essere anormale nei pazienti con cirrosi e soprattutto in quelli con EE [127]. Il rilievo di EE mediante tecniche psicometriche ed elettrofisiologiche viene di solito effettuato in condizioni basali. Più di recente, È stato proposto di indurre un’iperammoniemia e quindi di simulare una condizione di EE minima/conclamata lieve tramite la somministrazione orale di un carico di aminoacidi (COAA) mimanti l’emoglobina (simulazione di encefalopatia/iperammoniemia associate al sanguinamento digestivo) e di studiarne l’effetto su psicometria ed elettroencefalogramma [4, 65], misurando quindi più direttamente la sensibilità del singolo paziente all’iperammoniemia. I disturbi del ritmo sonno-veglia sono comuni nei pazienti con cirrosi epatica e incidono pesantemente sulla loro qualità di vita [130]. Il sonno è regolato dall'interazione tra due processi: un processo omeostatico e uno circadiano [31]. Il primo determina la propensione ad addormentarsi in rapporto alla precedente storia di sonno/veglia, facendo sì che la necessità di dormire aumenti con il prolungarsi della veglia. Invece il processo circadiano, che si riflette nel ritmo 24-ore dell'ormone melatonina (livelli plasmatici elevati la notte e pressoché assenti di giorno), determina l'alternarsi di periodi di bassa/alta propensione all’addormentamento in relazione ai segnali ambientali di luce/buio. Il risultato dell’interazione fra questi due processi fa sì che la probabilità di addormentarsi sia alta quando sono passate numerose ore dal risveglio e quando si fa buio, vale a dire la sera. Le alterazioni del ritmo sonno-veglia dei pazienti con cirrosi epatica sono state tradizionalmente interpretate come facenti parte del complesso sindromico dell’encefalopatia epatica [176]. Dati più recenti suggeriscono che l'eccessiva sonnolenza diurna sia effettivamente un tratto dell'EE, mentre l'insonnia abbia una patogenesi distinta [129]. Tuttavia le cause di questi disturbi restano dibattute. Le documentate alterazioni del sistema di regolazione circadiano (ridotta sensibilità alla luce e disturbato ritmo/metabolismo della melatonina) non offrono una spiegazione esauriente [129, 130]. Anche le informazioni disponibili in questi pazienti sulla regolazione omeostatica del sonno, che può essere studiata con la polisonnografia, sono scarse [180]. Le esatte correlazioni neurochimiche dell’omeostasi del sonno umano rimangono sconosciute, anche se sempre più numerose evidenze dimostrano un possibile importante ruolo nella trasmissione adenosinergica. Nei soggetti sani infatti la caffeina, un antagonista recettoriale dell'adenosina, influenza in modo significativo l’elettroencefalogramma di veglia (riduzione dell'attività theta, che aumenta con l’aumentare della pressione del sonno) e di sonno, e attenua la sonnolenza soggettiva associata alla veglia prolungata/deprivazione di sonno [107]. I miei studi di dottorato sono stati eseguiti allo scopo di valutare, in un gruppo di pazienti con la cirrosi epatica e in un gruppo di volontari sani, l’effetto dell’iperammonimia indotta: - sulla prestazione neuropsichica e sull'EEG di veglia (Studio 1); - sul rapporto tra sonnolenza diurna ed EE e sulle caratteristiche dell'EEG di sonno (Studio 2); - sugli effetti di sostanze ipoammoniemizzanti (L-ornitina-L-aspartato, LOLA) e della caffeina (antagonista del recettore dell'adenosina) su EEG di veglia e su EEG di sonno (Studio 3). Materiali e metodi. Sono stati arruolati pazienti ben caratterizzati con cirrosi epatica compensata e con anamnesi negativa per EE minima o conclamata e volontari sani confrontabili per età , sesso e livello d'istruzione. I soggetti sono stati sottoposti a: - valutazione e monitoraggio della qualità e degli orari del sonno con questionari e diari del sonno; - carico orale di aminoacidi (COAA), miscela di 54 gr di aminoacidi mimanti l’emoglobina contenuta in 400 ml di sangue, assunta al mattino per os; - rilevazione oraria di sonnolenza soggettiva ed ammoniemia capillare; - valutazione neuropsichica, comprendente psicometria carta e matita (batteria PHES), psicometria computerizzata e registrazione dell’EEG di veglia. - registrazione polisonnografica. Ai pazienti veniva data la possibilità di dormire tra le 17:00 e le 19:00 in condizioni ambientali favorevoli (stanza buia ed isolata). - somministrazione di LOLA 20gr in 500cc di soluzione fisiologica in infusione di 4 ore (8-12) o caffeina 200mg per os (ore 10) in corso di iperammoniemia dopo COAA (studio 3). Risultati. Studio 1. Effetti dell’iperammoniemia sulla prestazione neuropsichica e sull’EEG di veglia • la popolazione di studio comprendeva 10 pazienti con cirrosi epatica (9 uomini; media ± SD; età : 54 ± 14 anni) e 10 volontari sani appaiati per età e sesso (5 uomini, 49 ± 13 anni). Un paziente (maschio di 55 anni) è stato sottoposto a registrazione EEG anche dopo l'inserimento di uno shunt porto-sistemico trans-giugulare (TIPS), procedura associata ad un aumentato rischio di sviluppo di EE. • I soggetti sono stati studiati con una valutazione neuropsichica e monitoraggio dell’ammoniemia oraria in condizioni basali (4° o 8° giorno di studio) e dopo carico orale di aminoacidi (COAA) (4° o 8° giorno di studio). • Al basale, i pazienti avevano livelli di ammoniaca superiori a quelli dei volontari sani [mediana (range interquartile): 30 (22-44) vs 38 (34-47) µmol/L, p < 0.1]. Il COAA ha prodotto l’atteso aumento dell’ammoniemia in entrambi i gruppi; il picco dell’ammoniemia è stato più alto (ammoniemia ore 11:00, p<0.03) e più prolungato nei pazienti. • Il COAA ha prodotto un rallentamento significativo dell’EEG di veglia tale da definire la presenza di EE minima in 2 (20%) pazienti. Per contro, il COAA non ha prodotto cambiamenti significativi della prestazione psicometrica carta&matita o computerizzata. • Al basale, la frequenza dominante dell'attività EEG era più lenta nei pazienti rispetto ai volontari sani in diverse derivazioni (p<0.05). Il COAA non ha alterato la frequenza dominante nei volontari sani, mentre ha rallentato ulteriormente quella dei pazienti lungo la linea mediana (p<0.05) • In condizioni basali, la potenza spettrale dell’EEG di veglia aveva una predominanza occipito-temporale in entrambi i gruppi. I pazienti avevano potenza superiore in tutte le derivazioni (p<0.05). Il COAA ha indotto un aumento significativo di potenza in quasi tutte le derivazioni nei volontari sani (p<0.05), mentre nessuna modifica della potenza è stata osservata nei pazienti. • Nel paziente studiato in tre occasioni, la potenza dell'attività dominante dell’EEG è aumentata progressivamente dal basale, dopo COAA, dopo TIPS, mentre si è osservato un calo della frequenza dominante dell’EEG dopo l’inserimento della TIPS. Studio 2. Effetto dell’iperammoniemia su sonnolenza ed EEG di sonno • la popolazione di studio (vedi studio 1) è stata sottoposta a valutazione neuropsichica, rilevazione oraria di sonnolenza ed ammoniemia oraria e registrazione polisonnografica, in condizioni basali (4° o 8° giorno di studio) e dopo COAA (4° o 8° giorno di studio). Il COAA ha prodotto • un aumento della sonnolenza soggettiva parallela all’aumento delle concentrazioni dell’ammoniaca sia nei pazienti che nei volontari sani; in entrambi i gruppi il picco di sonnolenza (ore 11), assente in condizione basale, coincide con il picco di concentrazione dell’ammoniaca (p<0.01) • un aumento della durata del sonno nei volontari sani rispetto al basale (media ± SD, 49.3 ± 26.6 vs 30.4 ± 15.6 min), sebbene le differenze non siano statisticamente significative (p= 0.08). Nessuna modifica sulla durata del sonno nei pazienti. • diminuzione significativa della potenza relativa beta (attività veloce) dell’EEG di sonno nei volontari sani (p<0.05); • riduzione significativa della potenza relativa delta (attività molto lenta) del sonno in pazienti (p<0.05); Studio 3. Effetti di L-ornitina-L-aspartato (LOLA, sostanza ipoammoniemizzante) e di caffeina (antagonista del recettore dell’adenosina) su prestazione cognitiva, EEG di veglia e sonno in condizioni di iperammoniemia indotta • la popolazione di studio comprendeva 6 pazienti con cirrosi epatica (5 uomini; media ± SD; età : 61 ± 9 anni) e 5 volontari sani appaiati per età , sesso e livello d’istruzione (4 uomini, 49 ± 12 anni). • I soggetti sono stati studiati con valutazione neuropsichica, rilevazione oraria di sonnolenza ed ammoniemia oraria e registrazione polisonnografica, dopo COAA COAA+LOLA- COAA + caffeina) il 4°, 11° e 18° giorno di studio. • I pazienti rispetto ai volontari sani hanno presentato una prestazione psicometrica sia carta e matita che computerizzata significativamente peggiore rispetto ai volontari sani (p<0.05) • i pazienti avevano livelli di ammoniaca superiori a quelli dei volontari sani in tutte le condizioni; il COAA ha prodotto l’atteso aumento dell’ammoniemia in entrambi i gruppi, con un picco più elevato e più prolungato nei pazienti. • il LOLA ha determinato una riduzione seppur non significativa dei livelli plasmatici dell’ammonio in entrambi i gruppi • né il LOLA né la caffeina hanno determinato cambiamenti significativi su la sonnolenza soggettiva, su prestazione psicometrica e su EEG di veglia • i dati sull’EEG di sonno sono in corso di analisi (presso l’Istituto Farmacologia e Tossicologia dell’Università di Zurigo, Svizzera). Conclusioni. - l'EEG di veglia è estremamente sensibile all'iperammoniemia - un’iperammoniemia moderata/cronica (pazienti in basale) o acuta (volontari sani dopo COAA) si traduce in una maggiore potenza del ritmo dominante di EEG, specialmente sulle zone posteriori dello scalpo. - un’iperammoniemia acuta su cronica (pazienti dopo COAA) rallenta ulteriormente la frequenza dominante dell'EEG - parametri EEG basati sulla potenza possono fornire informazioni utili alla definizione neurofisiologica dell'EE. - l’iperammoniemia comporta un notevole aumento della sonnolenza diurna soggettiva - l’iperammoniemia provoca cambiamenti opposti nell’EEG di sonno dei pazienti e dei controlli, rendendo il sonno dei pazienti più superficiale ed interrotto e quello dei volontari sani più profondo e stabile. - l’EE può forse quindi essere inquadrata come un difetto di vigilanza, che rende simili l’EEG di sonno a quello di veglia, compromettendo quindi il raggiungimento di una veglia “piena” e la produzione di un sonno “ristoratore”. - L-ornitina-L-aspartato determina una riduzione dei livelli di ammoniemia

L'elaborato utilizza un protocollo di apprendimento alla paura sviluppato in collaborazione con il Centro Studi e di Ricerca in Neuroscienze Cognitive , Università di Bologna (sede di Cesena) al fine di analizzare e verificare se e in quali circostanze si verifica l'alterazione di segnali fisiologici, distinguendo una fase di stress da una di rilassamento. I metodi fisiologici utilizzati sono il segnale elettroencefalografico (EEG), il segnale eletrocardiografico (ECG), e la risposta di conduttanza cutanea (SCR). I risultati evidenziano una diminuzione del ritmo alfa (nelle derivazioni occipitali dell'EEG) un aumento dell'attività simpatica (nello spettro di variabilità cardiaca) e un aumento della conduttanza cutanea passando da uno stato di rilassamento a uno di stress.

Abstract in English Helicoverpa armigera ((Hübner) (Lepidoptera, Noctuidae) is the most damaging pest of processing tomatoes in various growing areas of Italy. Control of this pest is still based on the adoption of calendar chemical treatments as the ineffectiveness of monitoring tools do not allow for early detection of adults and to optimize the timing of insecticide applications. The low effectiveness of current used monitoring tools could be due to a different composition of the sex pheromone blend of the Italian pest population. To date, studies on the identification of the sex pheromone of this pest mainly focused on Asian populations while specific data are still lacking on the European ones. For several lepidopteran species, the existence of differences in the sex pheromone composition of populations evolved in different geographical contexts is well documented. During the PhD research activity, field studies were conducted in processing tomato crops, with different ripening period, in order to determine the attractant power of previously identified sex pheromone components of H. armigera towards males. In particular, the attractiveness of individual compounds and their combinations in binary, ternary and quaternary blends were studied. Results of field trapping tests were also accompanied by electroantennographic (EAG) assays in order to evaluated the ability of the male antennal olfactory system to perceive the sex pheromone components. EAG tests showed that all compounds tested are perceived by males and allowed to establish the activation threshold of antennas on stimulation with increasing concentrations of each compound. Field trapping tests showed that males of the pest population present in the Capitanata area (Foggia province) are attracted by different binary, ternary and quaternary mixtures of sex pheromone components confirming the plasticity of the male response to sex pheromone observed in Indian populations. However, in the three-year study, some binary (Z11-16:Ald, Z9-16:Ald) and ternary mixtures (Z11-16:Ald, Z9-16:Ald, 16:Ald) in specific ratios were the most attractive. Male captures obtained by these pheromone blends loaded in rubber septum dispensers were 10 to 50 times higher than those of currently available commercial dispensers. Using an effective pheromone blend to bait different trap models, oil traps captured a number of male moths which was respectively 6 to 13 times higher than that of delta and pagoda traps, currently used to monitor H. armigera. Moreover, oil traps also showed a higher sensitivity in detecting changes in population density and, therefore, to describe the pattern of flight activity. The attractiveness of three mixtures of plant volatile compounds containing respectively green leaf volatiles(GLV), aromatic compounds (mainly emitted from flowers) or terpenoids (emitted by various plant organs) to adult moths as well as the effect of sex pheromone combination with plant volatiles on the male response to the sex pheromone were also assessed. Results obtained from these tests have shown some attractant activity to females of aromatic compounds while all the combinations of plant volatiles and sex pheromone resulted in a significant reduction in male catches, probably due to a competition mechanism at the antennal olfactory receptors. The research activity carried out during the PhD represents the first contribution to the knowledge of the sex pheromone of the Italian population of H. armigera. Results may be used to improve the monitoring of this serious pest and, therefore, the timing of insecticide applications. In addition, the identification of effective sex attractant blends may contribute to the development of innovative and sustainable control strategies of this pest, such us “mating disruption”, “attract and kill” and “mass trapping” methods. Abstract in italiano Helicoverpa armigera ((Hübner) (Lepidoptera, Noctuidae) è il principale fitofago dannoso del pomodoro da industria nei diversi areali di coltivazione in Italia. Il controllo dell’insetto è ancora oggi basato sull’adozione di rigidi schemi di lotta a calendario in quanto l’inefficacia degli strumenti di monitoraggio non consentono di rilevare tempestivamente la presenza dell’insetto in campo e di individuare il momento ottimale per l’esecuzione dei trattamenti insetticidi. La scarsa efficacia degli strumenti di monitoraggio potrebbe dipendere da una differente composizione del blend feromonico sessuale utilizzato della popolazione italiana del fitofago. Infatti, gli studi finora condotti sulla identificazione del feromone sessuale di tale specie hanno riguardato principalmente popolazioni asiatiche mentre mancano dati specifici sulle popolazioni europee. Ben documentata è, inoltre, per diversi lepidotteri, l’esistenza di differenze di composizione del feromone sessuale di popolazioni appartenenti alla stessa specie ma evolutesi in contesti geografici diversi. Durante il dottorato sono state condotte indagini di campo, in coltivazioni di pomodoro da industria a diversa epoca di maturazione, volte a determinare il potere attrattivo, verso i maschi della nottua, dei diversi componenti feromonici finora identificati. In particolare, è stata studiata l’attrattività di composti singoli e loro combinazioni binarie, ternarie e quaternarie. Gli studi di campo sono stati corredati anche da un’indagine elettroantennografica in laboratorio che ha dimostrato la capacità del sistema olfattivo antennale dei maschi dell’insetto di percepire i componenti feromonici saggiati ed ha permesso di stabilire, per ciascuno composto, la soglia di attivazione delle antenne a seguito di stimolazione con dosi crescenti di sostanza. Dai saggi di attrattività in campo è emerso che i maschi di H. armigera della popolazione in studio, presente in Capitanata, sono attratti da diverse miscele binarie e ternarie di componenti feromonici, confermando la plasticità della risposta del maschio al feromone osservata su popolazioni indiane. Tuttavia, alcune miscele binarie (Z11-16:Ald, Z9-16:Ald) e ternarie (Z11-16:Ald, Z9-16:Ald, 16:Ald) si sono confermate, nei diversi anni, come quelle maggiormente attrattive. Le catture di maschi ottenute con tali blend feromonici, posti in erogatori di gomma, sono risultate da 10 a 50 volte superiori a quelle di diversi erogatori commerciali. L’impiego di un blend feromonico maggiormente attrattivo per attivare diversi modelli di trappola ha evidenziato che quella ad olio consente di catturare un numero di adulti da 6 a 13 volte superiore a quello conseguibile con trappola a delta e a pagoda attualmente utilizzate per il monitoraggio dell’insetto. La trappola ad olio, inoltre, ha mostrato una maggiore sensibilità nel rilevare le variazioni di densità della popolazione e, quindi, di descrivere l’andamento del volo. E’ stata valutata l’attività attrattiva di tre miscele di composti volatili vegetali costituite rispettivamente da odori della foglia verde (Green leaf volatiles), composti aromatici (emessi principalmente da fiori) o terpenoidi (emessi da vari organi della pianta) verso i maschi e le femmine del nottuide e l’effetto della combinazione di feromone sessuale e composti volatili di origine vegetale sulla risposta del maschio al feromone. I risultati ottenuti da tali prove hanno evidenziato una certa attività attrattiva dei composti aromatici verso le femmine mentre le sostanze volatili vegetali poste in prossimità dell’erogatore di feromone hanno determinato una significativa riduzione delle catture dei maschi, probabilmente per un meccanismo di competizione esercitato nei confronti delle molecole di feromone a livello dei recettori olfattivi presenti sulle antenne. L’attività di ricerca svolta durante il dottorato rappresenta il primo contributo alla conoscenza del feromone sessuale della popolazione italiana di H. armigera. I risultati ottenuti potranno essere utilizzati per migliorare il monitoraggio della specie e, quindi, il timing delle applicazioni insetticide. Inoltre, l’identificazione di una miscela attrattiva efficace potrà contribuire, nei nostri comprensori, allo sviluppo di strategie innovative ed ecosostenibili di controllo diretto del fitofago, secondo i metodi della confusione sessuale, lotta attratticida e cattura massale.

Il nucleo accumbens (NAc), il maggior componente del sistema mesocorticolimbico, è coinvolto nella mediazione delle proprietà di rinforzo e nella dipendenza da diverse sostanze d’abuso. Le sinapsi glutammatergiche del NAc possono esprimere plasticità, tra cui una forma di depressione a lungo termine (LTD) dipendente dagli endocannabinoidi (eCB). Recenti studi hanno dimostrato un’interazione tra le vie di segnalazione del sistema eCB e quelle di altri sistemi recettoriali, compreso quello serotoninergico (5-HT); la vasta colocalizzazione di recettori serotoninergici e CB1 nel NAc suggerisce la possibilità di un’interazione tra questi due sistemi. In questo studio abbiamo riscontrato che una stimolazione a 4 Hz per 20 minuti (LFS-4Hz) delle afferenze glutammatergiche in fettine cerebrali di ratto, induce una nuova forma di eCB-LTD nel core del NAc, che richiede l’attivazione dei recettori CB1 e 5-HT2 e l’apertura dei canali del Ca2+ voltaggio-dipendenti di tipo L. Inoltre abbiamo valutato che l’applicazione esogena di 5-HT (5 M, 20 min) induce una LTD analoga (5-HT-LTD) a livello delle stesse sinapsi, che richiede l’attivazione dei medesimi recettori e l’apertura degli stessi canali del Ca2+; LFS-4Hz-LTD e 5-HT-LTD sono reciprocamente saturanti. Questi risultati suggeriscono che la LFS-4Hz induce il rilascio di 5-HT, che si lega ai recettori 5-HT2 a livello postsinaptico incrementando l’influsso di Ca2+ attraverso i canali voltaggio-dipendenti di tipo L e la produzione e il rilascio di 2-arachidonoilglicerolo; l’eCB viaggia a ritroso e si lega al recettore CB1 a livello presinaptico, causando una diminuzione duratura del rilascio di glutammato, che risulta in una LTD. Queste osservazioni possono essere utili per comprendere i meccanismi neurofisiologici che sono alla base della dipendenza da sostanze d’abuso, della depressione maggiore e di altre malattie psichiatriche caratterizzate dalla disfunzione della neurotrasmissione di 5-HT nel NAc.
The nucleus accumbens (NAc), a major component of the mesolimbic system, is involved in the mediation of reinforcing and addictive properties of many dependence-producing drugs. Glutamatergic synapses within the NAc can express plasticity, including a form of endocannabinoid (eCB)-long-term depression (LTD). Recent evidences demonstrate cross-talk between eCB signaling pathways and those of other receptor systems, including serotonin (5-HT); the extensive co-localization of CB1 and 5-HT receptors within the NAc suggests the potential for interplay between them. Here, we found that 20 min low-frequency (4 Hz) stimulation (LFS-4Hz) of glutamatergic afferences in rat brain slices induces a novel form of eCB-LTD in the NAc core, which requires 5-HT2 and CB1 receptors activation and L-type voltage-gated Ca2+ channels opening. Moreover, we found that exogenous 5-HT application (5 μM, 20 min) induces an analogous LTD (5HT-LTD) at the same synapses, requiring the activation of the same receptors and the opening of the same Ca2+ channels; LFS-4Hz-LTD and 5-HT-LTD were mutually occlusive. Present results suggest that LFS-4Hz induces the release of 5-HT, which acts at 5-HT2 postsynaptic receptors increasing Ca2+ influx through L-type voltage-gated channels and 2-arachidonoyl-glycerol production and release; the eCB travels retrogradely and binds to presynaptic CB1 receptors, causing a long-lasting decrease of glutamate release resulting in LTD. These observations might be helpful to understand the neurophysiological mechanisms underlying drug addiction, major depression and other psychiatric disorders characterized by dysfunction of 5-HT neurotransmission in the NAc.

Il nucleo accumbens (NAc), il maggior componente del sistema mesocorticolimbico, è coinvolto nella mediazione delle proprietà di rinforzo e nella dipendenza da diverse sostanze d’abuso. Le sinapsi glutammatergiche del NAc possono esprimere plasticità, tra cui una forma di depressione a lungo termine (LTD) dipendente dagli endocannabinoidi (eCB). Recenti studi hanno dimostrato un’interazione tra le vie di segnalazione del sistema eCB e quelle di altri sistemi recettoriali, compreso quello serotoninergico (5-HT); la vasta colocalizzazione di recettori serotoninergici e CB1 nel NAc suggerisce la possibilità di un’interazione tra questi due sistemi. In questo studio abbiamo riscontrato che una stimolazione a 4 Hz per 20 minuti (LFS-4Hz) delle afferenze glutammatergiche in fettine cerebrali di ratto, induce una nuova forma di eCB-LTD nel core del NAc, che richiede l’attivazione dei recettori CB1 e 5-HT2 e l’apertura dei canali del Ca2+ voltaggio-dipendenti di tipo L. Inoltre abbiamo valutato che l’applicazione esogena di 5-HT (5 M, 20 min) induce una LTD analoga (5-HT-LTD) a livello delle stesse sinapsi, che richiede l’attivazione dei medesimi recettori e l’apertura degli stessi canali del Ca2+; LFS-4Hz-LTD e 5-HT-LTD sono reciprocamente saturanti. Questi risultati suggeriscono che la LFS-4Hz induce il rilascio di 5-HT, che si lega ai recettori 5-HT2 a livello postsinaptico incrementando l’influsso di Ca2+ attraverso i canali voltaggio-dipendenti di tipo L e la produzione e il rilascio di 2-arachidonoilglicerolo; l’eCB viaggia a ritroso e si lega al recettore CB1 a livello presinaptico, causando una diminuzione duratura del rilascio di glutammato, che risulta in una LTD. Queste osservazioni possono essere utili per comprendere i meccanismi neurofisiologici che sono alla base della dipendenza da sostanze d’abuso, della depressione maggiore e di altre malattie psichiatriche caratterizzate dalla disfunzione della neurotrasmissione di 5-HT nel NAc.
The nucleus accumbens (NAc), a major component of the mesolimbic system, is involved in the mediation of reinforcing and addictive properties of many dependence-producing drugs. Glutamatergic synapses within the NAc can express plasticity, including a form of endocannabinoid (eCB)-long-term depression (LTD). Recent evidences demonstrate cross-talk between eCB signaling pathways and those of other receptor systems, including serotonin (5-HT); the extensive co-localization of CB1 and 5-HT receptors within the NAc suggests the potential for interplay between them. Here, we found that 20 min low-frequency (4 Hz) stimulation (LFS-4Hz) of glutamatergic afferences in rat brain slices induces a novel form of eCB-LTD in the NAc core, which requires 5-HT2 and CB1 receptors activation and L-type voltage-gated Ca2+ channels opening. Moreover, we found that exogenous 5-HT application (5 μM, 20 min) induces an analogous LTD (5HT-LTD) at the same synapses, requiring the activation of the same receptors and the opening of the same Ca2+ channels; LFS-4Hz-LTD and 5-HT-LTD were mutually occlusive. Present results suggest that LFS-4Hz induces the release of 5-HT, which acts at 5-HT2 postsynaptic receptors increasing Ca2+ influx through L-type voltage-gated channels and 2-arachidonoyl-glycerol production and release; the eCB travels retrogradely and binds to presynaptic CB1 receptors, causing a long-lasting decrease of glutamate release resulting in LTD. These observations might be helpful to understand the neurophysiological mechanisms underlying drug addiction, major depression and other psychiatric disorders characterized by dysfunction of 5-HT neurotransmission in the NAc.

The research presented in the current dissertation investigates two of the most intriguing topics pertaining to the field of developmental cognitive neuroscience, namely, the development of the ability to understand others’ actions and the ability to comprehend others' emotions. Recent research suggests that the human brain is equipped with structures that are active both during first- and third-person experience of actions and emotions. These structures, known as the mirror neuron system (MNS), were originally discovered in monkeys. They have been proposed as a neural mechanism through which others’ actions, intentions, and emotions can be directly understood by bridging the gap between self and others. In fact, when we perceive someone else’s action or emotion expression we activate a network that is also active during action execution or expression of emotions. Despite recent advances in the study of the development of action and emotion processing, the neuro-cognitive correlates of these abilities in infants and children are far from being fully understood. Studies described in this dissertation attempt to fill this gap by investigating the neural correlates of the ability to perceive and understand others’ actions and emotions in preverbal infants and older children. Chapter 1 provides a review of existing models developed to tackle the developmental origins of mirroring mechanisms, and a discussion of the existing debate about the role of the motor system in action and emotion understanding. The studies reported in Chapter 2 and 3, respectively, focus on the neural correlates of 7-month-olds’ processing of human action sounds, as measured through event-related potentials (ERPs), and the neural mechanisms driving toddlers’ ability to understand others' actions, as assessed by frequency oscillation through time-frequency analysis. Furthermore, the development of the ability to understand others' emotions and the role played by the motor system in such an understanding across development will also be explored. The study described in Chapter 4 explores the neural correlates of 7-month-old infants' capability to process static and dynamic facial expressions of emotions, whereas Chapter 5 is dedicated to the investigation of the mechanisms underlying covert facial muscle reactions, as measured through surface electromyography (sEMG), elicited by the observation of emotional expressions in 3-years-old children. Results of the presented research will be discussed in Chapter 6 to provide an integrated picture of the early stages of the development of action and emotion understanding. The existing theoretical debate about the role of the motor system in action and emotion understanding processes will be addressed by proposing a developmental viewpoint.

Il seguente progetto di ricerca si innesta sulla riflessione che la complessità è un fenomeno endemico, presente in molti domini. Fornita una definizione di complessità (che, per ironia, non è compito affatto semplice), possiamo attribuire ai fenomeni sociali e morali tale caratteristica. In questo lavoro abbiamo preso in considerazione come oggetto di ricerca l’impatto che la tecnologia ha da un punto di vista cognitivo e affettivo nei contesti sociali e d’interazione, e nel ragionamento morale. Abbiamo evidenziato quelle che pensiamo siano le principali criticità della letteratura scientifica contemporanea, che possono essere riassunte nei seguenti punti: l’utilizzo esclusivo di dati self-report e la considerazione di fenomeni sociali a partire da casi statistici individuali, con l’assunto, anche se più o meno celato, che uno più uno sia uguale a due. Per questo, lo scopo principale del lavoro è la costruzione e l’implementazione di protocolli che superino questi limiti. Per farlo, abbiamo individuati tre assi attorno ai quali abbiamo sviluppato i tre studi che compongono il corpus scientifico del lavoro: l’elettrofisiologia, l’analisi multi-livello e la tecnica dell’hyperscanning, che permette l’acquisizione di dati fisiologici, e non, su più soggetti contemporaneamente. I tre studi si possono collocare su un continuum che va dalla ricerca di base-laboratoriale al setting più applicato. Nel primo studio, una ricerca di base, abbiamo implementato una versione modificata del noto trolley problem di Foot, andando a randomizzare i fattori che riguardano la natura dell’agente coinvolto (umano o automatico) e il comportamento dell’agente (intervenire o non intervenire nello “stallo” morale). Abbiamo raccolto dati EEG, autonomici, comportamentali e psicometrici. Abbiamo trovato evidenze che indicano che i nostri soggetti sperimentali abbiano applicato schemi morali e meta- rappresentazioni differenti in base alla natura dell’agente e tendano a non considerare l’agente artificiale come un’entità morale. Abbiamo rilevato anche pattern elettrofisiologici dissimili, che coinvolgono il processamento attentivo, emotivo e dell’agentività. Una maggiore complessità di elaborazione si è manifestata nel ragionamento morale che riguardava agenti non-umani. Questa “asimmetria” nel ragionamento morale, a parità di azioni, ci ha portato a concludere che la risposta automatica dell’essere umano potrebbe comportare delle problematiche in futuro. Il lavoro si conclude con una riflessione riguardante la tecnologia automatica, evidenziandone alcuni limiti in termini etico-morali. Nel secondo e terzo studio, che rappresentano la componente più applicata del lavoro, abbiamo cercato di evidenziare possibili differenze tra la modalità face-to-face e quella da remoto, focalizzandoci sul colloquio di selezione e sull’apprendimento in azienda. Abbiamo utilizzato misure elettrofisiologiche, sia centrali che periferiche, e l’analisi qualitativa del contenuto, rilevando dati in contemporanea durante l’interazione sociale. In generale, i dati raccolti indicano un maggior engagement emotivo nei soggetti di durante l’interazione face-to-face, insieme a livelli di arousal più elevati. La condizione remote invece non sembra essere associata a livelli di cognitive load maggiore, come studi precedenti indicavano. Queste evidenze ci hanno portato a concludere che una visione estremamente dicotomica nella valutazione delle due modalità prese in considerazione è da sconsigliare, in favore di un approccio più situazionale. Il lavoro si conclude andando a indicare i limiti degli studi presentati e suggerendo nuovi percorsi di ricerca per il futuro.
This research project lays its foundations on the observed ubiquity of complexity in many phenomena. Given the definition of complexity, human social and moral processes are to be considered part of the set of complex entities. We chose to investigate the cognitive and affective impact of technology and automation in social and morally-charged contexts. Highlighted possible inherent methodological issues in the state-of-art research, such as self-reported- only approaches and one-brain analyses, we propose to address the research object via electrophysiology (electroencephalography and autonomic activity analysis), multi-level analysis (both quantitative and qualitative: electrophysiology, psychometrics, behavioural, and content analysis), and the technique of hyperscanning, the simultaneous data collection in more than one subject and the computing of interbrain connectivity indices, which allows transcending the “one plus one equals two” line of reasoning. From this epistemological and methodological evidence, we proposed and implemented three studies that can be located across a continuum that goes from basic laboratory to fully applied research. In the first study, a basic research design, we implemented a modified version of the renowned Trolley problem, randomizing the agent nature (either human or automated) and its behaviour (intervening or not intervening in the ongoing moral impasse) and collecting the participants’ electroencephalography, autonomic, behavioural, and psychometrics data. We found evidence that suggests the existence of different moral schemata and meta-representations, together with peculiar allocations of brain resources for both the considered factors. The main differences involved attentional, emotional, social, and agency processes, and led to the following interpretation: a morality asymmetry toward humans and artificial agents in morally-charged situations might exist. Thus, we concluded that leaving up to people’s default response could be problematic from a moral and ethical perspective. We furnish a partial solution on the matter and bring to the attention possible inherent threats revolving around automation. In the second and third studies, we designed and implemented applied protocols that aimed at highlighting divergences in face-to-face and remote social interactions. In the second study, we chose to focus on job interviews, typical inter-individual exchanges in the organizational domain, and gather electroencephalography and autonomic data on all the involved social agents. In the third study, we zoomed on learning and training settings and gathered electroencephalography data with the aid of wearable and portable devices. The face-to-face condition seems associated with higher emotional engagement between participants and higher arousal. Remote settings instead seemed not to be particularly linked to increased cognitive difficulty. Thus, when it comes to evaluating the two considered modalities, we suggest the rejection of all-or-nothing or black-or-white interpretations in favour of situation-based examination. In the last part of the work, we listed and discussed the project’s weaknesses, in terms of validity and propose new research paths.

La delezione funzionale della proteina presinaptica Bassoon (Bsn), che fa parte delle proteine scaffolding deputate al corretto assemblaggio e fusione delle vescicole sinaptiche nel processo di release, è associata con l’insorgenza di crisi epilettiche spontanee e con alterazioni nell’attività neuronale e nella morfologia di corteccia a ippocampo. Dato che ricevono numerose afferenze corticali attraverso lo striato, i gangli della base (GB) sono stati implicati nella patogenesi dell’epilessia, anche se il loro ruolo, e in particolare quello del microcircuito striatale, nel limitare la propagazione dell’attività epilettogena è ancora argomento di discussione. Per studiare il ruolo dei GB nell’epilessia abbiamo ipotizzato che la propagazione delle scariche epilettiche dalla corteccia verso lo striato potesse indurre, come meccanismo adattativo, un’alterazione dell’eccitabilità a lungo e breve termine di due sottopopolazioni neuronali del microcircuito striatale: i neuroni di proiezione spinosi e gli interneuroni GABAergici fast-spiking (FS). A questo scopo ci siamo proposti di caratterizzare il fenotipo epilettico e le capacità di apprendimento dei mutanti Bsn e di studiarne la plasticità striatale e ippocampale tramite registrazioni elettrofisiologiche, saggi molecolari e analisi morfologiche. Le crisi epilettiche dei mutanti sono state quindi monitorate e classificate e l’apprendimento procedurale e ippocampo-dipendente valutato attraverso una batteria di test comportamentali. Le registrazioni intracellulari sono state effettuate in vitro da fettine corticostriatali mentre registrazioni extracellulari sono state ottenute da fettine ippocampali. L’espressione di proteine associate al compartimento postsinaptico è stata poi valutata tramite analisi del Western blot mentre uno studio morfologico dei neuroni spinosi e degli interneuroni FS è stato effettuato con la colorazione di Golgi e tecniche di immunoistochimica. I topi mutanti per la proteina Bsn mostravano uno sviluppo di crisi epilettiche ad insorgenza precoce che negli adulti erano associate a un riarrangiamento della plasticità sinaptica all’interno del microcircuito striatale. Sebbene infatti la depressione a lungo termine (LTD) fosse espressa ugualmente nei due genotipi, il potenziamento a lungo termine (LTP) indotto nei neuroni spinosi dei mutanti era ridotto rispetto ai controlli, mentre la LTP ippocampale era completamente assente. L’alterazione striatale era associata a un aumento significativo delle ramificazioni dendritiche e delle spine immature nei neuroni spinosi e a profonde alterazioni di alcune proteine postsinaptiche di importanza fondamentale per la LTP. Le analisi molecolari hanno rilevato infatti che la composizione in subunità del recettore NMDA era profondamenre cambiata, i livelli di BDNF ridotti mentre l’espressione di recettore TrkB nella membrana postsinaptica era significativamente aumentata. Tuttavia, l’aspetto più interessante del pattern di modificazioni osservate in striato era che gli interneuroni FS dei mutanti Bsn presentavano una forma di potenziamento a breve termine della trasmissione sinaptica, non presente nei controlli. Questa forma di plasticità emergente era NMDA- e BDNF-dipendente e si accompagnava a un aumento significativo del numero degli interneuroni nello striato dei topi epilettici rispetto agli animali di controllo. Infine i test comportamentali hanno mostrato che gli animali mutanti presentavano capacità di apprendimento procedurale intatte, mentre presentavano performances ridotte in test di memoria ippocampo-dipendente. I nostri risultati dimostrano che mentre nei topi mutanti per la proteina Bsn si osserva una compromissione della plasticità ippocampale con perdita delle funzioni mnemoniche ippocampo-dipendenti, i sottotipi neuronali dello striato rispondono con meccanismi differenti all’attività epilettogena cronica corticale creando un quadro di riorganizzazione funzionale che preserva funzioni motorie e cognitive. Data l’insorgenza precoce della sintomatologia epilettica, il riarrangiamento della connettività neuronale nello striato e della plasticità sinaptica corticostriatale che si osserva negli adulti potrebbero essere intrerpretati come meccanismi di adattamento volti a proteggere la funzionalità dei GB.
Absence of functional presynaptic scaffolding protein Bassoon (Bsn) in mutant mice is associated with the development of pronounced spontaneous seizures and with consistent alterations in neuronal activity and morphology of hippocampus and cerebral cortex. The basal ganglia network receives a strong glutamatergic series of inputs from cortical regions through the striatum and it has been involved in the pathophysiology of epilepsy. However its functions, and in particular the role of the striatal microcircuit, in limiting epileptogenesis is still debated. To further investigate on the role of BG in limiting epileptic activity, we hypothesized that the spreading of epileptic seizures from the cortex to the striatum may alter both short and long-term excitability in two neuronal subtypes, the striatal fast-spiking GABAergic interneurons (FS) and the medium spiny (MS) neurons as an adaptive mechanism. To this end we first planned to study the epileptic phenotype and the learning skills of mutants. We then propose to characterize the plastic changes by electrophysiological recordings, molecular analyses and morphological studies. Epileptic seizures in mutant mice were video-recorded, classified and procedural learning and hippocampal-based learning skills were evaluated with a battery of behavioral tests. In vitro intracellular recordings were performed from corticostriatal slices obtained from Bsn mutants and WT mice while extracellular recordings were performed in hippocampal slices. Postsynaptic proteins were analyzed by Western blotting while morphological studies of FS and MS were performed in epileptic mice brain with Golgi-staining and unbiased immunohystochemical technique. Bsn mutant mice showed early-onset epileptic seizure development, which in adults were associated to a rearrangement of synaptic plasticity within the striatal microcircuit. In fact, although long-term depression (LTD) was equally expressed in both genotypes, the amplitude of long-term potentiation (LTP) induced in MS neurons of Bsn mutant mice was reduced compared to control, while hippocampal LTP was completely lost. The alteration in striatal plasticity was associated to differences in dendrite branching and spine maturation of MS neurons and to profound modifications of postsynaptic components expression in the whole striatum. In particular, in the striatum of epileptic mice, the NMDA subunit composition was found altered, the BDNF expression decreased and TrkB receptor upregulated. Interestingly, following high frequency stimulation protocol, GABAergic FS recorded from Bsn mutant mice expressed a NMDA and BDNF-dependent short-term potentiation that was absent in WT animals. Moreover FS interneurons were increased in number in the epileptic genotype. Behavioral tests for assessment of learning skills demonstrated that procedural learning capabilities are intact while hippocampal-based functions are compromised in epileptic mice providing evidences for a competition between the two memory systems. Our results indicate that while hippocampal synaptic plasticity is lost, striatal neuronal subtypes are differentially sensitive to continuous seizures and to the associated alterations of BDNF/TrkB signaling. These data suggest that changes of corticostriatal activity develop in early-onset epileptic conditions associated to the lack of functional Bsn. The reorganization of plasticity between neuronal subtypes may protect striatum and downstream BG nuclei from continuous cortical seizures in order to preserve striatal functions.

La Bioelettronica organica è una disciplina sviluppatosi a partire dal XVII secolo con l’esperimento di Luigi Galvani che, applicando uno stimolo elettrico ai muscoli di una rana dissezionata, ne osservò il movimento. La Bioelettronica organica è un’evoluzione della suddetta disciplina nel quale elementi di natura biologica vengono combinati con dispositivi elettronici avanzati, basati sull’utilizzo di materiali organici, con lo scopo di realizzare dispositivi in grado di interagire con la materia vivente per sviluppare nuove metodologie diagnostiche, di analisi e terapeutiche. L’accoppiamento tra dispositivi elettronici organici e il mondo biologico si sviluppa in due direzioni: da un lato una reazione o un processo biologico può trasferire un segnale ad un dispositivo elettronico organico, dall’altro un dispositivo elettronico organico può avviare un processo biologico. In particolare, il mio studio di tesi riguarda l’interazione tra dispositivi elettronici e cellule neuronali in grado sia di riconoscere e analizzare l’attività cerebrale, sia di intervenire sul funzionamento tramite micro-stimoli elettrici localizzati. I materiali elettronici organici, quali polimeri conduttivi e piccole molecole, hanno mostrato di poter consentire la fabbricazione di strumenti elettronici che offrono numerosi vantaggi rispetto a quelli tradizionali a base di silicio, in virtù delle loro proprietà elettroniche e meccaniche, della loro biocompatibilità, dei bassi costi di produzione, così da permettere di minimizzare l’invasività e sviluppare applicazioni sempre più innovative.

In questa tesi sono stati condotti studi morfologici, di sviluppo su diverse diete e studi di elettrofisiologia e risposte comportamentali di larve e adulti di Tenebrio molitor. Sono state studiate le strutture sensoriali su palpi mascellari e labiali di larve di T. molitor utilizzando tecniche di microscopia elettronica a scansione. Sulla base della morfologia sono stati classificati nove tipi di sensilli. Un complesso sensoriale è stato osservato sulla punta di entrambi i palpi mascellari e labiali. Le prestazioni di crescita di T. molitor sono state monitorate su quattro diverse diete composte da sottoprodotti dell’industria alimentare: farinaccio e sansa di oliva inclusa in tre diverse percentuali. Le diete con una inclusione fino al 25% di sansa di oliva si sono dimostrate le migliori, con un minor tempo di sviluppo larvale, una riduzione della mortalità e un maggior aumento di peso delle larve. Le risposte comportamentali delle larve di T. molitor a VOCs emessi da diversi substrati alimentari sono state studiate usando biosaggi a quattro e due vie. Il comportamento larvale è stato analizzato utilizzando un software di tracciamento video. I risultati di questo studio hanno dimostrato che le larve di T. molitor sono significativamente attratte dai volatili emessi sia dal farinaccio che da un mix di farinaccio e sansa di oliva (1:1). Le risposte comportamentali degli adulti di T. molitor a VOCs emessi dal farinaccio sono state esaminate in un olfattometro a caduta. Sono state testate cinque dosi di farinaccio, da 1 g a 200 g. Le femmine hanno mostrato un indice di risposta più elevato a dosi più elevate di farinaccio, mentre i maschi erano attratti indipendentemente dalle dosi. Infine, è stato condotto un test preliminare di elettroantennografia (EAG) su 14 diversi VOCs estratti da farinaccio su insetti adulti. In particolare, le maggiori risposte EAG sono state registrate per pentanale, esanale, (E)-2-esanale, (E, E)-2-4-nonadienale, (E, E)-2,4-esadienale.
The possibility to use Tenebrio molitor to reduce food wastes were investigated. Different field of the entomological research were used: insect morphology, insect rearing and performances on different diets, characterization of Volatile Organic Compounds (VOCs) emitted from food substrates and electrophysiological and behavioral response of larvae and adult insects to the main VOCs identified. Sensory structures on maxillary and labial palps of T. molitor larvae were investigated using scanning electron microscopy. Based on the morphology nine types of sensilla were classified. A sensory complex were observed on the tip of both maxillary and labial palps. The growth performances of T. molitor larvae were monitored under four different diets composed of organic food by-products: wheatmeal, wheatmeal:olive-pomace 3:1, wheatmeal:olive-pomace 1:1, wheatmeal:olive-pomace 1:3. The first two diets appear favorable, with respect to shortening larval development time, reducing mortality and increasing weight gain. Behavioral responses of T. molitor larvae to VOCs emitted by different food substrates was investigated using four and two-way choice. The larval behavior was analysed using a video tracking software. The results of this study showed that T. molitor larvae were significantly attracted to volatiles emitted both by wheatmeal and by a mixture of wheatmeal and olive pomace (1:1). Behavioral responses of T. molitor adults to VOCs emitted by wheatmeal were also investigated in a two-choice pitfall olfactometer. Five doses, ranging from 1 g to 200 g of wheatmeal were tested. Females showed higher Response Index to higher doses of wheatmeal, meanwhile males were attracted independently to the doses. Lastly, a preliminary electroantennography bioassay (EAG) on 14 different VOCs extracted from wheatmeal on adults is presented. In particular the largest EAG amplitudes were recorded for pentanal, exanal, (E)-2-hexanal, (E,E)-2-4-nonadienal, (E,E)-2,4-hexadienal.

Le interfacce cervello-computer o brain-computer interface sono dei sistemi che attraverso la misurazione e l'analisi di segnali provenienti dall'attività cerebrale traducono in azione il segnale registrato, realizzando un canale di comunicazione alternativo alle normali vie neurali. L'obbiettivo di questa tesi è quello di analizzare e differenziare le varie tipologie di BCI dal punto di vista della struttura e dei metodi di acquisizione del segnale e infine classificarle a seconda della funzione che andranno a ricoprire: motoria o cognitiva. Le Interfacce cervello-computer nascono come una tecnologia per ripristinare le funzioni motorie perse a causa di patologie neurodegenerative. Negli ultimi anni però si è sviluppato un crescente interesse nell’utilizzo di queste interfacce anche per ripristinare funzioni cognitive, come ad esempio la memoria o l’attenzione. Lo scopo principale delle brain-computer interfaces utilizzate in medicina riabilitativa è dunque quello di permettere a pazienti che hanno subito gravi lesioni nel sistema nervoso centrale o periferico di essere più autonomi e di migliorare le loro capacità di comunicazione dei loro bisogni e delle loro esigenze ai caregivers.

Il seno coronario è la principale vena della circolazione coronaria, che ha il compito di portare il sangue refluo del cuore all'atrio destro, dove il suo orifizio si trova. Data tale posizione, si ipotizza che sia influenzato dall'attività elettrica del cuore morfologicamente e dimensionalmente, e in particolare in questa tesi si dimostra come in presenza di determinate aritmie sopraventricolari il suo ostio risulti dilatato. Per fare ciò viene analizzato un database contenente informazioni relative a 71 pazienti affetti da AVNRT, FA, flutter atriale e TAE che si sono sottoposti ad una procedura di ablazione transcatetere con radiofrequenza.

Abstract Acetaldehyde is the main metabolite of ethanol ingested through alcoholic beverages. Traditionally considered aversive is presently being viewed as an activating agent of the mesolimbic dopamine system but underlying mechanisms are only partially known. Here we show that acetaldehyde-induced increase in firing rate, burst firing and spikes/burst of antidromically-identified ventro-tegmental area Nucleus Accumbens-projecting neurons are abolished by pretreatment with the opiate unselective antagonist naltrexone (1mg/kg/ip). Similar effects are obtained after administration of naloxone (0.1mg/kg/iv). These results indicate: 1) endogenous opiate system(s) participate in acetaldehyde-induced increments in dopaminergic neuronal activity. 2) These results may explain the reduction in acetaldehyde-induced dopamine release in the nucleus accumbens after blockade of opiate receptors. 3) These findings may offer hints for devising new therapies aimed at reducing alcohol intake and abuse. Considering the paucity of efficacious therapies in alcoholism, acetaldehyde should be considered as a biomarker potentially useful to develop new strategies in the search for effective compounds aimed at reducing excessive alcohol intake, abuse and ultimately alcoholism.

1-Methyl-4-phenylpyridinium (MPP(+) ), a potent parkinsonizing agent in primates and rodents, is a blocker of mitochondrial complex I, therefore MPP(+) -induced parkinsonism is believed to depend largely on mitochondrial impairment. However, it has recently been proposed that other mechanisms may participate in MPP(+) -induced toxicity. We tackled this issue by probing the effects of an acute application of MPP(+) on substantia nigra pars compacta (SNc) dopamine (DA) neurons. On these premises, we decided to study the effects of MPP(+) on SNc DA neurons in acute midbrain slices with electrophysiology techniques. Results MPP(+) (50 μM) was able to hyperpolarize SNc DA neurons by ∼6 mV; cause an abrupt and marked (over 50%) reduction of the spontaneous activity; and inhibit the hyperpolarization-activated inward current (Ih ). MPP(+) shifted Ih activation curve towards negative potentials by ∼11 mV both in Wistar rats and in C57/BL6 mice. Inhibition was voltage- and concentration-dependent (Imax = 47%, IC50 = 7.74 μM). MPP(+) slowed Ih activation kinetics at all potentials. These effects were not dependent of block of mitochondrial complex I/fall of ATP levels; activation of type 2 DA receptor; and alteration of cAMP metabolism. Finally, MPP(+) -dependent inhibition of Ih facilitated temporal summation of evoked EPSPs in SNc DA, but not in CA1 hippocampal neurons. Conclusions Reduced functionality of Ih in SNc DA neurons, via increased responsiveness towards synaptic excitation, might play a role in MPP(+) -induced parkinsonism and, possibly, in the pathogenesis of human Parkinson's.

INTRODUCTION Sleep Talking (ST) is defined as the utterance of speech during sleep. The available literature cannot address ST as a REM or NREM parasomnias. Rarely studied as an isolated phenomenon, we currently have no definite evidence of its neural correlates. Recently, psycholinguistic features of verbal production in ST has been investigated, pointing to coherence with formal features of the language in wakefulness. This evidence, within the hypothesis of an involvement of parasomnias in sleep-related cognitive processing, suggests the importance of understanding the neural mechanism underlying ST. We aimed to investigate EEG correlates predictive of verbal activation (Verbal ST), with a comparison with Non-verbal ST (moaning, laughing, crying, etc…) with the general hypothesis of shared mechanisms with neural correlates of language processing and production. METHOD Six highly frequent ST (3M, 3F, age 19-27, mean 23.83±3.60) recruited through an online survey (general health assessment, PSQI for the self-declared quality of sleep, MUPS for self-declared presence and frequency of the phenomenon). Presence and frequency of ST, together with the compliance in maintaining a regular sleep schedule, has been further assessed through one week of home sleep/dream-logs and audio-activated recorder. The suitable participants have been recorded in the laboratory for at least 2-consecutive nights of video-PSG. We pursued the conditions of Verbal and Non-verbal ST, obtaining a total of 21 Verbal ST and 21 Non-verbal ST in Stage 2 NREM. Control comparison has been performed between Vocalizations (N=42 vocal activations, combining Verbal and Non-verbal) and Baseline (N=42 equivalent sleep interval, 2 mins preceding each ST), to assess time-locking and specificity of the observed EEG pattern, in relation with vocal production. Artifacts were off-line rejected for the 20 seconds EEG preceding each Verbal and Non-verbal ST and Baseline, on a 4-seconds basis. EEG power spectra have been obtained throughout a Fast Fourier Transform (FFT) routine. The power spectra have been then averaged to obtain the canonical sleep EEG bands: delta (0.5-4.5Hz), theta (4.75-7.75Hz), alpha (8-11.75Hz), sigma (12-15.75Hz) and beta (16-24.75Hz), and subsequently log-transformed. RESULTS Statistical comparisons (t-Test) show a general decrement in power spectra for Verbal ST vs. Non-verbal ST for the theta and alpha EEG bands. This effect is strongly lateralized to the left hemisphere and specifically localized on centro-parietal-occipitals channels. A single left parietal channel (P7; theta t=-4.48, p=0.0002; alpha t=-3.29, p=0.0037) was significant also after the Bonferroni correction. T-test comparisons (t=≥2.96; p≤0.0051) for Vocalizations vs. Baseline show a general increment in power spectra for delta on frontal, central and temporal channels, almost on the entire scalp for the alpha band; on Fc2 and C4 for the beta band. CONCLUSIONS Our results suggest shared neural mechanisms between Verbal ST and language programming during wakefulness. Specifically, the selective decrement for the theta band on the left parietal sites is coherent with the literature about linguistic planning in wakefulness, suggesting a possible functional overlapping. Moreover, the phenomenon seems time-locked to the interval of sleep preceding ST, as demonstrated throughout a comparison with a preceding sleep interval.