Dissertations / Theses on the topic 'Enzymes – Composition chimique'

L'enzyme formant l'ethylene (efe ou acc oxydase) a ete extraite de la pulpe de pomme golden delicious et son activite a ete stabilisee in vitro grace a la presence de 1,10-phenantroline. Elle a ete purifiee a homogeneite environ 170 fois par precipitation au sulfate d'ammonium (30-90%) et par chromatographie sur phenyl sepharose, deae mensep 1000, superose et monoq. L'enzyme est active sous sa forme monomerique dont la masse moleculaire a ete estimee a 40 kda. L'enzyme a ete reconnue avec une grande specificite par des anticorps purifies diriges contre une efe recombinante surproduite dans e. Coli a partir du clone d'adnc ptom13 de tomate. Elle n'est pas glycosylee et contient un groupement sh important au niveau de son site actif. Un sequencage partiel d'acides amines a ete realise. Il demontre une grande homologie avec les sequences predites par les adnc correspondants. La determination des caracteristiques biochimiques de l'efe et la comparaison avec celles d'autres hydroxylases ont permis de developper une hypothese sur le mecanisme enzymatique de conversion de l'acc en ethylene. Son ph optimum est 7,4 et sa temperature optimum de 26c. Le km de l'efe vis-a-vis de l'acc est de 15 m. L'ascorbate et le fer peuvent etre consideres comme des co-substrats (km=0,5 mm et km=0,15 m). La localisation subcellulaire de l'efe a ete etudiee in vivo sur des tissus de pomme a divers stades de maturation du fruit. Pour cela, des protoplastes possedant une activite efe importante ont ete prepares. En utilisant des agents permeants (nem) et non permeants (tnbs), sites de localisation de l'efe ont ete demontres, l'un au niveau de l'apaoplasme et plus particulierement au niveau du plasmalemme et le second a l'interieur de la cellule. Une methode de marquage specifique de l'efe par du 14c-tnbs a permis de montrer que l'efe apoplasmique augmente au cours de la maturation du fruit

Depuis le milieu des années 1980, les fluides supercritiques apparaissent comme milieu réactionnel dans le cadre des synthèses enzymatiques. L’intérêt nouveau que suscite ces fluides est semblable à celui des solvants organiques, à savoir la stabilité des enzymes, la solubilisation de substrat hydrophobique, la possibilité de modifier l’équilibre thermodynamique. De plus, ils ont des propriétés de transport qui peuvent s’avérer supérieures à celles des liquides tels que la diffusivité. L’immobilisation des enzymes entraîne une baisse de leur activité intrinsèque. L’utilisation du dioxyde de carbone supercritique plutôt qu’un solvant organique, l’hexane, permettrait de palier à celle-ci en diminuant les limitations dues au transfert de matière interne. L’influence de ces milieux sur les propriétés de transport des substrats a été étudiée. Les triglycérides d’acides gras polyinsaturés n-3 tel que l’acide eicosapentaènoique suscitent un intérêt grandissant dans la lutte des maladies cardio-vasculaires. L’utilisation de lipase comme catalyseur a permis la synthèse de glycérides d’acide eico-sapentaènoique. Cette synthèse a été réalisée conjointement en milieu supercritique et milieu fondu

Ce travail s'inscrit dans une étude des mécanismes métaboliques et moléculaires qui contrôlent l'acidité des fruits charnus. Les baies des cépages Cabernet Sauvignon et Gora Chirine (Vitis vinifera L. ) ont été caractérisées d'un point de vue biochimique. La faible acidité titrable du jus de Gora Chirine à tous les stades de développement, s'explique par les concentrations plus faibles en acides malique, tartrique et citrique, et par une concentration en potassium plus élevée. Le pH vacuolaire, mesuré sur baies entières à deux stades de développement, en utilisant la résonance magnétique nucléaire du C13, n'est pas significativement différent entre les deux cépages. La phosphoénolpyruvate carboxylase (PEPC, EC 4. 1. 1. 31, enzyme clé de la biosynthèse de l'acide malique) a été étudiée pendant le développement de la baie des deux cépages. La teneur en protéine, son activité in vitro et in vivo sont plus élevées dans le cépage faiblement acide que dans celui normalement acide, pour la plupart des stades. Une approche immunologique montre que la PEPC de baie de raisin présenterait le site de phosphorylation consensus impliqué dans la régulation de l'activité enzymatique. La PEPC est plus sensible au pH faible et à l'inhibition par le malate pendant la maturation que pendant les stades de développement plus précoces pour les deux cépages. Elle serait donc moins phosphorylée pendant la maturation. La localisation tissulaire et subcellulaire de la PEPC dans la baie de raisin a été déterminée. Une nouvelle méthode fixation in situ des baies a permis, après une étude structurale et ultrastructurale, de mettre en évidence la PEPC par immunofluorescence dans le cytosol de toutes les cellules de la baie, avec un fort signal dans les cellules de l'exocarpe et au niveau des faisceaux vasculaires, quel que soit le cépage et le stade. Ces résultats ont été partiellement confirmés par une technique immunocytochimique en microscopie électronique. Nos travaux montrent que le contrôle des différences de teneur en acide malique observées entre les deux cépages ne semble pas se faire au niveau de la PEPC. Les différences d'acidité pourraient résulter d'une différence d'efficacité du stockage vacuolaire.

La selectivite de cinq lipases a ete determinee par l'hydrolyse de triglycerides de matiere grasse laitiere. L'aptitude a la transacylation de ces preparations enzymatiques a ensuite ete evaluee sur un milieu test. Enfin, le biocatalyseur le plus performant a ete mis en uvre en presence de matiere grasse laitiere et d'acides gras alimentaires

Deux types d'hydroxycinnamoyl-coa:transferases (ec2. 3. 1)(hts), catalysant la biosynthese des esters 5-hydroxycinnamoyl quinines et shikimiques ont ete purifies a partir de la pomme et la datte, des plantules de radis et des feuilles de scarole. Les eux transferases presentent la meilleure activite avec lep-coumaroyl-coa pouis par ordre decroissant les cafeoyl- et feruloyl-coa, et sont toutes les deux actives avec acides quinique et shikimique mais avec une inversion d'affinite. Le premier groupe d'enzymes mis en evidence chez la pomme et la scarole presente des rapports relatifs vmas/km pour les acides quinique et shikimique de 100:23 et 100:46 chez les deux materiels vegetaux respectivement, et correspond a l'hydroxycinnamoyl-coa:quinate hydroxycinamoyl transferase (hqt) alors que pour le second groupe d'enzymes identifie chez la scarole, la datte et le radis, ces rapports sont de: 43:100; 6:100 et 20:100 respectivement. Ce groupe correspond a l'hydroxycinnamoyl-coa: shikimate hydroxycinnamoyl mtransferases (hst). Hqt et hst presentent plusieurs proprietes tres voisines: des km pour les differents esters coa du meme ordre de grandeur, le pm les ph optima, le meme mecanisme reactionnel et des acides amines impliques dans le site actif de meme nature. Par contre, elles different par leurs phi, leur sensibilite au tris-hcl et le nombre d'aminoacides impliques dans la transesterification. Il existe une relation positive entre la specificite de l'hqt de la pomme et des hsts de la datte et de la scarole et la nature des esters hydroxycinnamiques (ehcs) accumules par ces vegetaux. Par contre, il n'existe aucune correspondance entre l'hqt de la scarole et l'hst du radis et la nature des ehcs accumules

L'apparition d'entéropathies chez les lapereaux après sevrage pourrait être favorisé par une inadéquation entre la composition de l'aliment et la maturation digestive avant le sevrage. Les objectifs de ce travail sont : 1-mieux définir le développement des fonctions digestives, 2-préciser les besoins nutritionnels des lapereaux autour du sevrage, 3-étudier les interactions entre les besoins des lapereaux et ceux de leur mère. Chez le lapereau (25 à 42 jours d'âge), nous observons une forte augmentation des activités totales des enzymes digestives du pancréas (5 à 800 fois selon les enzymes) et du contenu intestinal (2 à 16 fois), indépendante du sevrage. La composition de l' aliment influence peu la maturation fonctionnelle du système digestif. A 25 jours d'âge, l'activité de la plupart des enzymes digestives intestinales est faible, en particulier celle de l'amylase (14 UI/totale). Ce résultat suggère que le taux d'amidon dans l'aliment distribué aux lapereaux avant le sevrage doit être modéré. D'autre part, l'apport de fibres intensifie (+24%) l'activité pectinolytique caecale déjà présente à 25 jours d'âge. Ceci favoriserait un bon équilibre de l'écosystème caecal, justifiant un apport minimum en fibres avant le sevrage. L'inclusion d'une teneur élevée de lipides (4,9%) n'est pas un facteur limitant chez le jeune lapereau, puisqu'elle induit une augmentation de l'activité intestinale de la lipase et améliore la digestion des matières grasses. La substitution de l'amidon par des fibres dans l'aliment de périsevrage améliore les conditions sanitaires des lapereaux après le sevrage (-25% de risque sanitaire), sans altération de leur poids à 70 jours. La distribution d'un aliment peu énergétique en cours de lactation altère les performances de reproduction en cours de lactation altère les performances de reproduction des femelles. La stratégie consistant à distribuer un aliment riche en fibres spécifique aux lapereaux, et un autre aliment riche en énergie aux femelles, résoudrait les problèmes d'antagonisme entre les besoins nutritionnels de la mère et de sa portée.

Ce travail porte sur l'incidence du traitement thermique de la graine de lupin (lupinus albus) sur la degradation ruminale des matieres azotees totale (mat) et leur disparition intestinale a partir des residus ruminaux chez la vache laitiere tarie et canulee. Etude realisee in sacco (sachets ruminaux et sachets mobiles). Apres quelques rappels bibliographiques concernant la graine de lupin et les traitements thermiques, une etude comparative a ete conduite entre les graines de lupin, de soja et de mais (crues ou extrudees a 150c) et le tourteau de soja. Ce travail a permis de mettre en evidence que l'extrusion permet une insolubilisation des mat in vitro de ces differentes graines de 58 a 72%. La degradabilite ruminale in sacco n'est cependant reduite que sur les graines proteagineuses. A l'inverse, la degradation ruminale du mais est accrue avec le traitement thermique. La digestibilite totale n'est pas affectee par l'extrusion. L'effet de differents niveaux thermiques (110, 130, 150 et 180c), a ete benefique sur la valeur azotee du lupin; la valeur pdia est multipliee par un facteur variant de 1,6 a 6 en fonction de la temperature. Les fractions soluble et rapidement degradable, ainsi que la degradabilite theorique diminuent de maniere inversement proportionnelle a l'augmentation de la temperature. Si le mode de broyage et la taille des particules de la graine de lupin crue ont une influence tres marquee sur la solubilite, la degradation ruminale et la digestibilite intestinale des residus ruminaux des mat, en revanche, ils n'ont que peu d'effet sur la graine extrudee a 180c. Par ailleurs, des temperatures d'extrusion elevees ne provoquent pas de blocage de lysine. Le non- developpement de reactions de maillard au sein de la graine chauffee, est explique par l'absence de sucres reducteurs

Les propriétés d’auto organisation de tensioactifs ainsi que celles de la chimie de la silice ont permis de préparer des matériaux mésoporeux organisés selon une symétrie hexagonale, cubique ou lamellaire dont la taille des pores varie de 2 à plus de 10 nm. Ils sont depuis quelques années le centre d’intérêt d’universitaires et d’industriels qui développent des recherches fondamentales et appliquées. La compréhension globale des mécanismes de synthèse et la maîtrise des propriétés structurales et texturales des matériaux mésoporeux sont nécessaires pour envisager leur utilisation dans un quelconque procédé industriel. Dans ce cadre, nous avons étudié les relations entre les propriétés physico-chimiques d’un tensioactif fluoré C7F15C2H4(OC2H4)8OH et les caractéristiques des silices mésoporeuses. Malgré l’existence d’une phase micellaire, les canaux poreux des matériaux obtenus avec ces solutions micellaires ne sont pas organisés. En revanche, l’addition de la perfluorodécaline provoque une structuration du matériau selon une symétrie hexagonale. L’utilisation de divers fluorocarbures, ayant des structures moléculaires différentes, montre que le phénomène est associé au déplacement de la courbe de point de trouble vers les hautes températures. De plus, il a été montre que la préparation de matériaux à porosité hiérarchisée à partir d'émulsions de type huile dans eau est corrélée à la température d’inversion de phase du système eau/huile/tensioactif. Enfin, les matériaux mésoporeux ont été mis à profit pour immobiliser des enzymes et les résultats montrent que les lipases physisorbées conservent une activité catalytique
The self-assembly properties of surfactants and those of silica chemistry have led to the preparation of ordered mesoporous materials with hexagonal, cubic or lamellar symmetry and with pore sizes varying from 2 to more than 10 nm. Recently, they have aroused of great deal of interest to academics and industrialists for the development of fundamental and applied research. However, their use in any industrial process needs a careful consideration of the total comprehension of the synthesis mechanism as well as the control of their structural and textural properties. In this work, the relation between the physicochemical properties of a fluorinated surfactant, C7F15C2H4(OC2H4)8OH, and the characteristics of mesoporous silica was investigated. In spite of the existence of a micellar phase, only wormlike mesoporous materials were obtained. On the other hand, the addition of the perfluorodecalin led to the organisation of the channels according to a hexagonal symmetry. The use of various fluorocarbons of different molecular structures evidenced that this phenomenon is associated to the shift of the cloud point curve towards higher temperatures. Hierarchically porous silica were also prepared from oil-in-water emulsions and their characteristics were correlated to the phase inversion temperature of the surfactant/water/oil system. Finally, the mesoporous materials were used as hosts for the physisorption of enzymes and the results showed that the catalytic activity of the immobilised lipases is preserved

L’objectif principal de cette thèse est de déterminer des facteurs pouvant être considérés comme des marqueurs génériques de la récalcitrance de la biomasse à l’hydrolyse enzymatique. Des analyses chimiques, spectroscopiques et microscopiques ont permis d’étudier la relation entre la dynamique enzymatique et certains facteurs descriptifs de la composition chimique et de la structure d’échantillons de biomasse (paille de blé, miscanthus, peuplier) soumis à quatre prétraitements contrastés.La structure et la composition de la lignine sont les principaux acteurs de la récalcitrance pour chaque biomasse, comme le montre la corrélation négative entre la fluorescence et le rendement d’hydrolyse. Une augmentation de la porosité améliore la saccharification de manières différentes pour chaque biomasse en raison des différences d’organisation de leur paroi. Des mesures de mobilités de sondes fluorescentes de tailles similaires à celles des enzymes ont révélé que les prétraitements impactent la structure pariétale de manière plus importante que la saccharification. Les tailles des pores doivent être au moins 5 fois supérieures au diamètre des enzymes pour qu’elles puissent diffuser efficacement dans les parois, probablement en raison d’une obturation des pores causée par les interactions des enzymes avec la lignine. Des mesures d’interaction des sondes avec la lignine ont montré que la fixation sur la lignine dépend à la fois de la structure du polymère et de son accessibilité déterminée par la taille des pores.Nos résultats ont permis de fournir des informations sur la récalcitrance qui pourront servir de pistes pour permettre une meilleure valorisation de la biomasse
Biomass recalcitrance to enzymatic hydrolysis is a multifactorial phenomenon still challenging to understand. The main objective of this work was to determine factors that could be considered as generic markers of this recalcitrance. The relationship between enzymes dynamics and cell wall chemical and structural properties was studied using a panel of contrasted biomass samples (wheat straw, miscanthus, poplar) submitted to four different pretreatments, using a combination of chemical, spectroscopic and microscopy analyses.Lignin structure and composition were found to be the main factors explaining recalcitrance for all three biomasses, as highlighted by the negative correlations between fluorescence intensity and glucose yield. Increasing porosity improves saccharification differently for each species reflecting the different organisation of their cell walls. Mobility measurements of probes representative of enzyme size revealed that pretreatments have a more important impact on cell wall structure than the subsequent saccharification. Both the activity and mobility of enzymes are governed by pores sizes whose diameter need to be at least 5 times the diameter of the enzymes for the catalyst to diffuse efficiently in the cell wall, likely due to a fill-in effect caused by interactions with lignin. The intertwining between lignin and pores sizes was emphasized by measurements of the probes interactions with lignin revealing that binding depended on lignin structure, but also on its accessibility and on cell wall porosity.Our strategy and results provide insights for the improvement of pretreatment methods allowing a better valorisation of lignocellulosic biomass

Les PLLs sont une famille d’enzyme dont l’activité catalytique est double. L’activité lactonase permet entre autre de détruire les AHLs, molécules médiatrices de la communication chez les bactéries Gram négatives, empêchant ainsi la synchronisation à l’échelle de la population de la sécrétion de facteurs de virulence ou la formation de biofilm. Elles sont non seulement capables d’hydrolyser les molécules possédant un noyau lactone, mais aussi les phosphotriésters par promiscuité de substrat. L’activité phosphotriestérase permet de dégrader les composés organophosphorés (OPs) hautement toxiques, que ce soit les insecticides (Paraoxon) ou les agents neurotoxiques de guerre (Sarin, VX). Les travaux effectués ont consisté à évaluer l’efficacité de la PLL SsoPox, provenant de l’archée extrêmophile Sulfolobus solfataricus, pour empêcher la mise en place de la virulence et du biofilm chez Pseudomonas aeruginosa PAO1. Cette évaluation a été effectuée in vitro et in vivo via un modèle d’infection pulmonaire chez le rat. D’autre part, une étude in vitro a été réalisée sur 73 souches cliniques de P. aeruginosa isolés sur des patients atteints de pied diabétique, en évaluant la quantité de pyocyanine et l’activité protéolytique. Enfin, une phase prospective pour identifier de nouvelles PLLs a permis la caractérisation enzymatique et structurale de 2 nouvelles enzymes, SacPox et VmoLac, contribuant ainsi à affiner la connaissance sur cette famille et leur potentiel d’amélioration par ingénierie protéique. Au final, les PLLs offrent un intérêt biotechnologique majeur et peuvent mener à une valorisation concrète pour la santé humaine mais également pour la bioremédiation des OPs
Phosphotriesterase-Like Lactonases (PLLs) are a family of enzyme displaying a dual catalytic activity. Lactonase activity allows for, among others, the destruction of Acyl Homoserine Lactones (AHLs). These molecules mediate the communication in Gram negative bacteria, allowing them to synchronize group behavior like virulence factor secretion or biofilm formation. Beside their ability to hydrolyze molecules with a lactones moiety, PLL also show substrate promiscuity for hydrolyzing highly toxic organophosphate compounds (OPs), such as pesticides (i.e. Paraoxon) or Chemical Warfare Nerve Agents (CWNAs) (e.g. Sarin & VX). The work described here consisted in evaluating the efficacy of the PLL SsoPox, originating from the extremophile Archaea Sulfolobus solfataricus, to prevent virulence and biofilm formation on the model strain Pseudomonas aeruginosa PAO1. This evaluation was performed both in vitro and in vivo, by using a rat pulmonary infection model. A study has been performed on a strain collection of 73 clinical strains of P. aeruginosa isolated from diabetic foot, to assess the enzyme effects on pyocyanin secretion and protease activity. Finally, a prospective phase to identify new PLLs allowed for the enzymatic and structural characterization of two new enzymes, SacPox and VmoLac, thus contributing to refine the knowledge about this enzyme family and their engineering potential. In conclusion, PLLs are of prime biotechnological interest and could lead to developments in human health, but also for OPs bioremediation with a non aggressive decontamination solution

De nos jours un des plus grands défis environnementaux est la bioremediation du CO2 atmosphérique. La réduction biocatalytique de ce dernier en formiate par les formiate déshydrogénases microbiennes (FDHs) apparaît très prometteuse. Dans ce travail est présentée une caractérisation RPE de deux FDHs similaires nommées ForCE 1 et ForCE 2 issues de la bactérie du sol Bacillus subtilis. Elles appartiennent à la superfamille des enzymes à cofacteur de type Mo/W-bisPGD retrouvées exclusivement chez les procaryotes et catalysant une grande variété de réactions chimiques. Ces deux FDHs sont d’un grand intérêt scientifique. Les analyses de leurs séquences révèlent que leur site actif ne présente pas les résidus consensuels associés à l’activité formiate-déshydrogénase, définissant une sous-famille de FDHs encore non caractérisée. Les voies métaboliques dans lesquelles ces FDHs s’intègrent au sein de cet organisme restent à élucider, ouvrant ainsi la voie à d’autres découvertes en biologie.Le coeur catalytique des ForCEs est composé de deux sous-unités. Les analyses de sequences revèlent que la sous-unité catalytique ForC abriterait cinq centres FeS et un cofacteur de type Mo-bisPGD alors que ForE n’apparait pas héberger de cofacteur. En combinant potentiométrie d’oxydoréduction, spectroscopie de résonance paramagnétique électronique (RPE) multifréquence en onde continue et en mode pulsé, nous avons caractérisé les signatures RPE et les propriétés redox de plusieurs centres paramagnétiques dans l’enzyme ForCE1 purifiée, à savoir quatre centres FeS et deux signatures de type Mo(V) associées au cofacteur à molybdène. Un signal radicalaire intense a également été détecté
Nowadays one of the biggest environmental challenges is the bioremediation of atmospheric CO2. The biocatalytic reduction of CO2 to formate by microbial formate dehydrogenases (FDHs) is very promising. We present the EPR characterization of two similar FDHs, named ForCE 1 and ForCE 2, from the soil bacterium Bacillus subtilis. These enzymes belong to the Mo/W-bisPGD (i.e. pyranopterin guanosine dinucleotide) superfamily, which is widespread in prokaryotes. These two FDHs appear to be of great scientific interest for several reasons : sequence analyses reveal that their active site harbours non-consensual residues for formate-dehydrogenase activity, defining a new FDH sub-familly not yet characterised. Moreover, the way in which these enzymes are integrated into the metabolism of this organism remains to be established, leaving the door open for new biological discoveries. The catalytic core of ForCEs is composed of two subunits. From sequence analysis, the larger one (ForC) is thought to coordinate five iron-sulfur clusters and a Mo-bisPGD while ForE does not appear to harbor any cofactor. By combining redox potentiometry, multifrequency continuous wave (CW) and pulsed EPR spectroscopy, we were able to characterize the EPR signatures and redox properties of several paramagnetic cofactors in the purified enzymes including at least four FeS clusters (the fifth was detected by spin quantitation) and two MoV species associated to the molybdenum cofactor. An unexpectedly intense radical signal was also detected and could be attributed to a highly stabilized menasemiquinone species based on its redox and spectroscopic properties determined by a multi-frequency EPR approach

Les organophosphorés (OPs) sont des composés neurotoxiques qui sont largement utilisés comme pesticides. Cette utilisation intensive a conduit à une importante pollution des sols et des effluents agricoles et sont retrouvés jusque dans les aliments. Ces pesticides sont responsables de 300 000 morts à travers le monde. Les OPs ont également été développés comme agents neurotoxiques de guerre tel que le sarin. Actuellement, il n’existe pas de méthode de décontamination externe satisfaisante pour dégrader les OPs, c’est pourquoi l’utilisation d’enzymes est une stratégie attractive. Parmi les enzymes capables de dégrader les OPs, les phosphotriestérases (PTEs) sont les plus actives mais sont peu stables ce qui limite leurs applications. Les enzymes hyperthermostables ont donc été considérées. Ainsi l’enzyme SsoPox, isolée de l’archée Sulfolobus solfataricus ayant une activité lactonase et une activité de promiscuité phosphotriestérase, a été plus particulièrement étudiée. SsoPox est extrêmement robuste mais son activité phosphotriestérase est en revanche plus faible. Une stratégie d’ingénierie protéique a été réalisée afin d’obtenir un compromis entre l’activité d'une PTE et la stabilité de SsoPox. En utilisant les similarités structurales entre ces deux enzymes, une base de données mutationnelle a été réalisée pour transférer le site actif hautement performant d’une PTE dans la structure hyperstable de SsoPox. Cette stratégie a permis d’obtenir des variants de SsoPox améliorés jusqu’à 2000 fois. L'efficacité de ces variants a été démontrée in vivo chez un modèle animal, la planaire, permettant d'améliorer la survie ainsi que la mobilité et la capacité de régénération
Organophosphates (OPs) are neurotoxic compounds widely used as pesticides. Over the years, utilization of OP led to a considerable environmental contamination of soils and agricultural wastewaters, this pollution is furthermore a major health issue as these insecticides can be found in food. OP are highly toxic and are responsible for 300,000 deaths in the world every year. OPs were also developed as chemical warfare nerve agents such as sarin. Currently, no satisfying method for external decontamination is available, therefore bioremediation with enzymes is highly appealing. Among OP degrading enzymes, phosphotriesterases (PTEs) are the most active biocatalysts but are poorly stable what hinders their potential for bioremediation. Hyperthermostable enzymes from extreme environments were thus considered to circumvent this limitation. In particular, SsoPox isolated from the archaeon Sulfolobus solfataricus, displaying a lactonase activity and a promiscuous phosphotriesterase activity was deeply investigated. SsoPox is extremely robust but its activity for OP degradation is from far lower. A protein engineering strategy was started in order to reach a compromise between PTE activity and SsoPox robustness. Using structural similarities between PTEs and SsoPox, a mutational database was designed in order to transfer the highly performant active site of PTE into the hyperstable scaffold of SsoPox. This strategy led to variants displaying up to 2,000-fold increase against OPs as compared to wild-type enzyme. The variants efficiency was demonstrated in vivo using an original animal model planarian, allowed to enhance survival rate as well as mobility and regeneration capacity

Le dénombrement cellulaire, reflet de l'état sanitaire de la mamelle, est un critère de paiement de la qualité du lait. Éclaircir l'implication des cellules somatiques dans les mécanismes déterminant la composition du lait permettrait une meilleure utilisation de cet indicateur en association avec d'autres paramètres pour le pilotage de sa qualité biochimique et technologique. L’objectif de ce travail est l'étude de l'incidence des cellules somatiques sur l'évolution de la composition du lait à partir de trois modèles de mammites expérimentales. Les mammites à E. Coli ont mis en évidence l'importante augmentation du taux protéique suite à l'afflux de protéines solubles compensée par la baisse de synthèse des caséines. La caséine-beta est hydrolysée avant les caséines-alpha s montrant une séquentialité de la protéolyse. Une infusion d'endotoxine de E. Coli a montré le rôle direct des enzymes des cellules somatiques dans cette protéolyse. Des infections expérimentales à S. Aureus ont confirmé les corrélations élevées entre dénombrement cellulaire et écart de conductibilité électrique avec la teneur en protéose-peptones. Les variations de la part relative de la caséine-beta sont très liées à celles des peptides insolubles à pH 4,6 et des protéose-peptones. Ces modifications sont détectées précocement, une phase inflammatoire caractérisant les sept premiers jours de l'infection. Dans les trois modèles, une interdépendance entre quartiers a été observée, avec une diminution des teneurs en lactose et en caséines et une augmentation de la teneur en ANP dans le lait des quartiers témoins. Ces modifications de la composition du lait peuvent être responsables d'une altération notoire des paramètres de coagulation-présure.

Le procédé de liquéfaction des fruits, nécessite l'emploi d'enzymes pectinolytiques, considérées comme des auxiliaires technologiques. L’optimisation de l'hydrolyse enzymatique passe par une meilleure connaissance de la paroi cellulaire du fruit. La paroi cellulaire de la fraise a été isolée du fruit par une extraction à l'alcool. Le matériel ainsi obtenu (MIA) a été soumis à des extractions successives par l'acide trans-1,2-diamino-cyclohexane-n,n,n',n'-tétraacétique, un tampon succinate pH 4,8, l'acide chlorhydrique dilué à chaud et la soude diluée à froid. L’analyse des différents extraits a permis de montrer que 87% des pectines solubles de la fraise sont extractibles par un agent chélatant du calcium (CDTA). Ces pectines sont faiblement méthylées et peu ramifiées. Les pectines les plus ramifiées nécessitent des conditions d'extraction plus drastiques (HCl et NaOH dilués). Le fractionnement par chromatographie échangeuse d'ions a permis de montrer que certaines fractions pectiques sont riches en oses neutres pouvant provenir des hémicelluloses (xylose, glucose), et en protéines. Les résultats obtenus permettent de suspecter la présence de liaisons entre les pectines, les hémicelluloses et les protéines au sein de la paroi cellulaire. La liquéfaction de la paroi (MIA) et de l'extrait insoluble dans le CDTA à l'aide d'enzymes industrielles a mis en évidence, outre la synergie entre les activités pectinolytiques et cellulolytiques, l'importance des activités hémicellulolytiques et protéolytiques. Ces études ont permis de mettre au point une nouvelle formulation enzymatique permettant d'améliorer le rendement d'extraction du jus et d'optimiser la stabilité des anthocyanes (couleur) au cours du stockage. En outre, cette étude a montré l'effet néfaste de la pasteurisation et de la concentration sur la couleur des jus

En France et Indonésie, Sargassum est une espèce abondante mais elle algue n’a pas encore été exploitée de façon optimale. Sargassum contient de nombreux métabolites primaires ainsi que des composés bioactifs, dont les phlorotannins, ayant une large gamme de propriétés pharmacologiques intéressantes à valoriser. L’hétérogénéité et la complexité de la paroi cellulaire des algues réduisent fortement l’efficacité d’extraction conventionnelle. Cette étude a eu trois principaux objectifs (1) la caractérisation de la composition biochimique de Sargassum et ses variations saisonnières, (2) l'extraction solide-liquide et (3) l'extraction assistée par enzymes des phlorotannins et l’étude de leurs activités biologiques. Dans cette étude, les minéraux de Sargassum représentent d’une valeur importance avec une teneur qui atteint 33% suivi par les protéines avec 24% de la matière sèche. Les sucres ne représentent que 13% de la matière sèche. La composition biochimique de Sargassum, comme pour la plupart des algues, est fortement affectée par les saisons et est liée au cycle de vie de l’algue. La saisonnalité affecte également la production de phlorotannins. L’étude des différents procédés d’extraction montre que les rendements sont plus faibles pour une extraction solide-liquide traditionnelle (5 à 24% de la matière sèche de l'algue) par rapport à l'extraction assistée par enzyme (21 à 38% de la matière sèche de l'algue). L’extraction assistée par enzymes augmente le rendement d’extraction des polyphénols par rapport à l'extraction solide-liquide. Les extraits obtenus par extraction assistée par enzymes présentent une forte activité antiradicalaire
In France and Indonesia, Sargassum is quite abundant yet this alga has not been optimally exploited. Sargassum contains macro and micro molecules and also bioactive compounds, the most known is phlorotannins, showing a wide range of pharmacological properties. Therefore, it is interesting to further valorize this alga. The heterogeneity and complexity of algal cell wall strongly reduces the extraction efficiency application of conventional extraction. Subjects of interest in this study were to characterize the seasonal variation of Sargassum biochemical composition and to extract phlorotannins using conventional and alternative method, i.e. solid-liquid and enzyme- assisted extraction. In this study, minerals represented a significant value with a content reaching 33% followed by proteins with 24% of algal dry material. In the contrary, sugars showed only 13% of algal dry material. Further, the biochemical composition of Sargassum, like most algae, was highly affected by the seasons and related to Sargassum life cycle. In terms of polyphenol compounds in Sargassum, season might be the most influential factor but suitable methods of extraction determine the efficiency to collect these compounds from Sargassum. Solid-liquid extraction, in certain extent, yielded lower (ranging from 5 to 24% of dry algal material) than the enzyme-assisted extraction (ranging from 21 to 38% of dry algal material). Concerning the polyphenol content of Sargassum extracted with these two methods, enzyme-assisted extraction, in certain extent, had higher content than the solid-liquid extraction. Enzymatic extracts showed a strong antiradical activity

Dans une première partie, nous nous sommes penchés sur la caractérisation des principaux constituants du fruit de bluet (Vaccinium cortymbosum) afin d'établir la carte d'identité biochimique des acides carboxyliques, sucres simples, protéines, pectines, constituants d'arome, composés phénoliques (anthocyanines, phénols simples, esters et hétérosides phénoliques), cations ainsi que des activités enzymatiques: invertase, sucrose synthase, sucrose phosphate synthase. Ces résultats devraient aider à une meilleure maitrise des transformations technologiques des fruits. La manifestation d'une composante brune, au cours de la conservation de jus de bluet, nous a amenés dans une deuxième partie, à approfondir le processus de brunissement enzymatique au travers de deux activités polyphénol oxydasiques: péroxydases (POD) et polyphénol oxydases (PPO). L’activité péroxydasique des POD dépend étroitement d'un processus générateur de peroxyde d'hydrogène. Il en ressort que la contribution des POD au brunissement enzymatique des fruits est assujettie aux réactions lentes d'autooxydation de divers substrats, avec génération de peroxyde d'hydrogène. Le broyage des fruits frais conduit à un brunissement intense imputable à la fois à l'acide chlorogénique (AC), aux pigments anthocyaniques, à l'oxygène et à l'activité PPO qui a été partiellement caractérisée. Afin de mieux cerner les mécanismes réactionnels nous avons eu recours à des systèmes modèles parfaitement définis. La cafeyl o-quinone nous a permis d'une part de déterminer la stœchiométrie des réactions quinone/pigments anthocyaniques et d'autre part de faciliter la purification des produits de la réaction en vue de déterminer leurs structures. Les résultats obtenus contribuent à mieux comprendre les mécanismes du brunissement et le rôle des différentes structures mises en jeu. Il en ressort que les PPO exercent une activité déterminante pour la transformation des composés polyphénoliques des fruits tandis que les POD ne semblent manifester qu'une activité limitée

Les composés phénoliques sont impliqués dans les propriétés organoleptiques majeures des aliments dérivant d’une matrice végétale. Ils sont notamment responsables de l’amertume, de l’astringence et de la couleur des produits cidricoles. Le brunissement observé lors de la transformation des fruits est lié à la formation de pigments jaunes-orangés. Il est initié par l’activité d’une enzyme plastidiale, la polyphénol oxydase, qui catalyse l’oxydation des polyphénols en présence d’oxygène. Cela aboutit à la formation de quinones, espèces chimiques très réactives qui sont rapidement impliquées dans des voies réactionnelles ultérieures. Certains produits néoformés sont colorés. Un profilage des molécules colorées présentes dans quatre jus de pomme monovariétaux aux couleurs contrastées a été réalisé en CLHP-DBD-SM. Il a mis en évidence l’existence de tannins oxydés colorés et de composés jaunes-orangés non tannants. Parmi ces derniers, des produits d’oxydation de la phloridzine, dérivant de la classe des dihydrochalcones, ont été clairement identifiés (POPj, XGPOPj). Des approches couplées en milieu réel et solution modèle ont en outre permis d’identifier une nouvelle structure colorée dérivant d’un couplage oxydatif entre une dihydrochalcone et un flavanol monomère. Enfin, des déhydrotrimères d’épicatéchine ont pu être caractérisés en solution synthétique mais n’ont pas été détectés directement dans les jus. Par ailleurs, la couleur exprimée par les pigments formés peut subir des modulations en fonction de l’environnement physico-chimique. A titre d’exemple, la fermentation cidricole génère classiquement une décoloration des moûts ; or la composition du milieu fermentaire évolue sous l’influence de différents paramètres tels que le pH ou le potentiel redox. L’impact d’un milieu réducteur sur la couleur du POPj et d’une déhydrotriépicatéchine de type A, sélectionnés comme pigments modèles des jus de pomme, a été exploré par voltammétrie cyclique et spectroélectrochimie UV-visible. En outre, les changements de propriétés spectrales du POPj liés à son état de protonation ont été rationalisés par des approches de TD-DFT
The phenolic compounds are involved in the main organoleptic properties of plant-derived foods. They are especially responsible for the bitterness, the astringency and the color of apple cider products. The browning observed during fruit processing is related to the formation of yellow-orange pigments. By its catalytic activities, the polyphenol oxidase, a plastidial enzyme, initiates the oxidation of polyphenols in the presence of oxygen. It leads to the formation of quinones, very reactive species which are quickly involved in further chemical reactions. Some of the neoformed products are colored. Four apple juices, showing contrasted colors, were analyzed by reversed-phase HPLC-DAD-MS in order to obtain their profiles in colored compounds. The presence of yellow-orange oxidized tanning and non-tanning compounds was highlighted. Within the latter compounds, some phloridzin oxidation products, deriving from dihydrochalcones, were clearly identified (POPj, XGPOPj). In parallel, coupled approaches in real media and model solutions led to the identification of a new colored structure deriving from an oxidative coupling between a dihydrochalcone and a flavanol monomer. Finally, catechin trimers were also characterized in synthetic medium but they were not detected directly in apple juices. Moreover, the color expressed by the yellow-orange pigments can suffer some variations as a function of the physical-chemical environment. For instance, the cider fermentation results generally in a loss of color in apple juices; but the composition of the fermentative medium evolves under the influence of several parameters, such as pH and redox potential. The impact of reducing conditions on the color of POPj and A-type dehydrotriepicatechin, both selected as model pigments of apple juices, was explored by cyclic voltammetry and UV-visible spectroelectrochemistry. Besides, the changes in spectral properties of POPj, related to its protonation state, were rationalized by TD-DFT calculations

Deux endo-xylanases purifiees a partir d'une preparation commerciale (driselase) issue du basidiomycete polyporus tulipiferae. Alpha -l-furanosidase purifiee a partir d'un surnageant de culture du basidiomycete dichomitus squalens, cultive sur arabinoxylane de paille de ble. Determination des ph et temperatures optimaux pour l'activite de ces enzymes. Etude de leur mode d'action sur arabinoglucuronoxylane de glume d'avoine et sur 4-o-methyle-glucuronoxylane de meleze (analyse des produits d'hydrolyse). Action des enzymes sur un heteroxylane purifie a partir de son de ble industriel peprmet de preciser la structure de cet heteroxylane (compose a 92% de xylose et arabinose, tres ramifie, possedant des chaines laterales complexes)

L'élimination des protéines est une étape clé lors de la production du vin blanc afin d'éviter l'apparition éventuelle d'un voile inoffensif mais inesthétique. Des solutions de rechange à l'utilisation de la bentonite sont activement recherchées en raison des problèmes technologiques, organoleptiques et de durabilité associés à son utilisation. Dans cette étude, MpAPr1, une protéase aspartique extracellulaire préalablement isolée et partiellement caractérisée à partir de la levure Metschnikowia pulcherrima, a été clonée et exprimée de manière hétérologue dans la levure Komagataella pastoris. Les propriétés enzymatiques de MpAPr1 ont été initialement caractérisées dans un extrait brut. Après plusieurs essais faisant appel à différentes techniques, MpAPr1 a été purifié avec succès par chromatographie échangeuse de cations. Son activité contre les protéines de raisin a été initialement testée dans une solution modèle dans des conditions environnementales optimales pour l'activité de MpAPr1 puis dans celles qui règnent lors de la vinification. Ensuite, l'activité de MpAPr1 a été évaluée dans du moût de raisin et au cours de la fermentation alcoolique. La présence de MpAPr1, supplémenté au moût de raisin, a entraîné une dégradation partielle des protéines de raisin tout au long de la fermentation et une légère différence dans la composition en composés volatils du vin. L'étude a confirmé que les protéases aspartiques pourraient représenter une alternative à la bentonite pour l'industrie du vin et que les levures non-Saccharomyces telles que M. pulcherrima pourraient avoir un impact bénéfique sur les propriétés du vin
Protein removal is a key step during the production of white wine in order to avoid the possible appearance of a harmless but unsightly haze. Alternatives to the use of bentonite are actively sought because of technological, organoleptic and sustainability issues associated with its use. In this study, MpAPr1, an extracellular aspartic protease previously isolated and partially characterised from the yeast Metschnikowia pulcherrima, was cloned and expressed heterologously in Komagataella pastoris. Enzymatic properties of MpAPr1 were initially characterised in a crude extract. After several attempts using different techniques, MpAPr1 was successfully purified via cation exchange chromatography. Its activity against haze-forming grape proteins was initially tested in a model solution under optimal environmental conditions for MpAPr1 activity and under those occurring during winemaking. Thereafter, MpAPr1 activity was evaluated in grape must and throughout alcoholic fermentation. The presence of MpAPr1, supplemented to grape must, resulted in the partial degradation of grape proteins throughout fermentation and ultimately in a slight difference in the wine’s composition in volatile compounds. The study provides further evidence that aspartic proteases could represent a potential alternative to bentonite for the wine industry and that non-Saccharomyces yeasts such as M. pulcherrima could have a beneficial impact on wine properties

La mise au point et la validation d’une méthode de dosage par CLHP des alcaloïdes majoritaires (cépharanthine,xylopinine, tétrahydropalmatine) de Stephania rotunda sont réalisées. La méthode est appliquée au dosage des alcaloïdesdans différentes parties de la plante. Le tubercule est la drogue végétale la plus riche en alcaloïdes majoritaires, enparticulier en cépharanthine (1%). Le dosage des alcaloïdes majoritaires des tubercules d’origine différente est effectué.La cépharanthine est beaucoup plus concentrée dans le tubercule de Pailin (1,9%). La comparaison de la compositionchimique du tubercule cultivé et sauvage montre des résultats proches. L’isolement de huit alcaloïdes est effectué parChromatographie Flash. Leur structure est déterminée par SM et RMN. La cépharanthine, la xylopinine, latétrahydropalmatine, la palmatine et la roémérine précédemment décrites sont réisolées. La pseudopalmatine, lastéphanine et la vireakine, alcaloïde nouveau, sont décrites pour la première fois dans la plante. L’étude pharmacologiquede S. rotunda montre que la majorité des extraits testés (76%) présentent in vitro une activité antiplasmodiale intéressantesur la souche W2 de Plasmodium falciparum avec une CI50 < 5 μg/ml. La cépharanthine et la pseudopalmatine sont lesalcaloïdes les plus actifs avec une CI50 de 0,7 et 1 μg/ml, respectivement. Les effets sur la croissance in vitro de la soucheW2, des associations alcaloïdes/alcaloïdes et alcaloïdes/molécules antimalariques de référence sont testés. L’étude in vitrodu métabolisme hépatique de la cépharanthine montre la présence d’un métabolite principal M1 cytochrome dépendant.Une importante variabilité inter-individuelle de la formation de M1 est observée. L’étude de la variabilité inter-sexemontre qu’il n’y a pas de différence significative entre homme et femme. Les études in vitro de différentes espècesanimales indiquent une variabilité inter-espèces. L’enzyme responsable de la formation du métabolite M1 est déterminée.Le CYP3A4 est très fortement impliqué dans la métabolisation de la cépharanthine. Enfin, la détermination structurale dumétabolite majoritaire M1 a été réalisée par CDI-SM/SM. Cette étude nous a permis de conclure que la structure dumétabolite M1 correspond à un composé N-déméthylé
An HPLC method is developed and validated for the simultaneous determination of major alkaloids: cepharanthine,xylopinine, tetrahydropalmatine in tuber of Stephania rotunda Lour. The validated method was successfully applied toquantify the three alkaloids in various parts of the plant. The higher content of major alkaloids, in particularcepharanthine (1%), is found in the tuber of this plant. The major alkaloids of tubers from different regions aredetermined. The cepharanthine is concentrated in tuber of Pailin (1.9%). The comparison of the chemical composition ofcultivated and wild tubers shows similar results. Eight alkaloids were isolated from S. rotunda using FlashChromatography. Their structures are elucidated by MS and NMR. Cepharanthine, xylopinine, tetrahydropalmatine,palmatine and roemerine previously described are reisolated. Pseudopalmatine, stephanine, and vireakine (newaporphine alkaloid) are described for the first time in the plant. Pharmacological study of S. rotunda shows that themajority of extracts (76%) exert in vitro antiplasmodial activity against a chloroquine resistant strain of Plasmodiumfalciparum (W2) with IC50 < 5 μg/ml. Cepharanthine and pseudopalmatine display significative activity with IC50 valuesof 0.7 and 1 μg/ml, respectively. Isobol experiments are performed with W2 strain by combination of alkaloids/alkaloidsand alkaloids/antimalarial reference molecules. In vitro metabolism study of cepharanthine using human liver microsomesshows the cytochrome-dependant formation of a major metabolite M1. Enzymatic kinetics were investigated with pooledhuman liver microsomes to determine Michaelis-Menten constants. Important inter-individual variability of cepharanthinemetabolism is observed. In vitro studies indicate an important inter-species variability. The enzyme responsible for theformation of M1 metabolite is investigated. This study shows that CYP3A4 is involved in the metabolism of thecepharanthine. The structure of M1 metabolite, identified by CDI-MS/MS, corresponds to a N-desmethyle derivative ofcepharanthine

Les changements climatiques mondiaux ont déjà affecté et continueront d’affecter la physiologie de la vigne, en particulier le rendement et la composition des baies à la récolte, et donc, en définitive, la qualité et la typicité des vins produits. Parmi les différentes stratégies possibles d’adaptation de la viticulture au changement climatique (modifications de l’encépagement, création de nouvelles variétés mieux adaptées aux conditions futures,...), le contrôle de la composition des baies à la récolte par le biais d’une modification des pratiques culturales et notamment par des manipulations de la canopée (rapport feuilles/fruits (Fe/Fr), manipulation de l’exposition des grappes, échardage) est certainement celle qui serait la plus rapide à mettre en œuvre.Ma thèse a pour but de rechercher le meilleur point de compromis entre diminution du taux de sucres et maintien de l’acidité, de l’accumulation des composés phénoliques et d’une complexité aromatique proche de l’actuelle, en réponse aux manipulations de canopée (rapport Fe/Fr, échardage) couplées ou non à l’application d’acide abscissique (ABA).Différents ratio Fe/Fr ont ainsi été étudiés sur le cépage d’étude Cabernet-Sauvignon en conditions semi-contrôlées en serre sur boutures fructifères puis au vignoble au sein d’une parcelle de production. L’analyse de la composition des baies en métabolites primaires et secondaires, réalisée lors de ces deux expériences, a permis de déterminer que le ratio 6 feuilles restantes par grappe était la valeur seuil en dessous de laquelle un effet sur les métabolites primaires est visible. Une diminution du taux de sucres a notamment été observée, également associée à la diminution de la concentration en anthocyanes totales qui sont particulièrement importantes dans la définition de la typicité des vins de Bordeaux. L’application d’ABA exogène sur les baies avant la véraison a permis de diminuer les effets négatifs de la modification du ratio Fe/Fr sur l’accumulation des anthocyanes et n’a pas montré d’impact sur la typicité des vins lors des dégustations des microvinifications réalisées au cours de cette étude. Ces résultats analytiques obtenus ont été couplés à des analyses transcriptomiques de type RNAseq et PCR quantitative en temps réel (Fluidigm) afin d’identifier les gènes clefs associés au voies métaboliques primaires et secondaires réagissant aux modulations du ratio Fe/Fr couplées ou non à l’ajout d’ABA. Ainsi, le couplage modulation du ratio Fe/Fr et application d’ABA exogène sur les baies serait une méthode potentiellement utilisable afin de réduire le taux de sucres et de maintenir une typicité bordelaise proche de l’actuelle.La caractérisation fonctionnelle d'un gène potentiellement associé à la voie de biosynthèse des méthoxypyrazines, impliquées dans le caractère végétal du raisin et du vin, a également été mise en œuvre. Différentes approches ont été testées et ont fourni des indices utiles, cependant les résultats obtenus sont encore en cours de confirmation
Global climate changes have already affected and will continue to affect the physiology of grapevine, in particular the yield and berry composition at harvest, and thus ultimately the quality and typicality of the wines produced. Among the different possible strategies of adapting viticulture to climate change (changes varieties, creation of new varieties better adapted to future conditions,...), modulating berry composition at harvest through changing cultural practices, such as manipulations of the canopy (leaf / fruit ratio, grape exposure), may be a fast and efficient option as a short-term adaptation strategy.My thesis aims to find the best point of compromise between reducing the sugar level and, maintaining the acidity, phenolic compounds, and the aromatic complexity by the canopy manipulations (leaves / fruits ratio, secondary shoot removal), coupled or not with the application of abscisic acid.Different leaf / fruit ratios were studied on the Cabernet-Sauvignon cultivar in greenhouse and in vineyard within a plot of production. The berry composition analysis of primary and secondary metabolites, performed in these two experiments, made it possibleto determine that the ratio of 6 leaves remaining per cluster was the threshold value below which an effect on the primary metabolites is visible. A decrease in the sugar content was especially observed, also associated with a decrease in the concentration of total anthocyanins which are particularly important in the definition of the typicality of Bordeaux wines. The application of exogenous abscisic acid to the berries before veraison permitted to reduce the negative effects of the modification of the leaf-to-fruit ratio on the accumulation of anthocyanins and did not affect the typicality of the wines during the tastings of the microvinifications carried out during this study. These analytical results were coupled with transcriptomic analyses of RNAseq and real-time quantitative PCR (Fluidigm) to identify key genes associated with the primary and secondary metabolic pathways reacting to modulations of leaf-to-fruit ratio coupled or not with the addition of abscisic acid.Thus, the coupling modulation of the leaf-to-fruit ratio to the application of exogenous abscisic acid on the berries would be a usable method to reduce the sugar content and maintain a typicality of Bordeaux wines close to the current one.The functional characterization of a gene potentially associated with the biosynthetic pathway of methoxypyrazines, which are involved in vegetable character of grapes and wine, was also conducted. Different approaches have been tested and provided useful clues but the conclusive results are still under further confirmation