Academic literature on the topic 'Épissage (génétique)'

Les pseudohypoparathyroïdies (PHP) sont des maladies rares, caractérisées par une résistance à l’action rénale de la parathormone. Le défaut génétique est localisé au locus GNAS, qui code la sous-unité alpha stimulatrice des protéines G (Gαs). Ce locus est le siège de régulations complexes, épissage alternatif et empreinte parentale éteigant de façon tissu-spécifique l’expression de l’allèle paternel. Des mutations hétérozygotes perte de fonction, des épimutations responsables d’une perte d’expression sont associées à un large spectre pathologique : PHP1A, PHP1B, ossification hétérotopique, ostéodystophie, obésité, retard de croissance in utero, etc., dont les mécanismes restent encore incomplètement connus.

L’utilisation de l’information portée par l’ADN nécessite une étape de transcription des gènes en ARN et, dans certains cas, une phase de traduction en protéine. La transcription est un phénomène complexe, régulé (un gène eucaryote contient des séquences régulatrices permettant l’initiation et la régulation de la transcription) qui produit trois types d’ARN : les ARN messagers (ARNm), les ARN de transfert (ARNt) et les ARN ribosomiques (ARNr). Les ARNt et les ARNr sont des constituants de la machinerie de traduction des ARNm. En effet, après la transcription, l’ARNm va être maturé (épissage, polyadénylation ...) puis va sortir du noyau pour aller dans le cytoplasme où sa séquence nucléotidique sera traduite en séquence d’acides aminés. Les protéines acquièrent ensuite leur structure définitive après des modifications posttraductionnelles diverses. La régulation de l’expression des gènes peut intervenir à chacune des étapes (transcription, maturation et/ou traduction).

Découvert en 1977, l'épissage est une étape de maturation post-transcriptionnelle consistant à rabouter les exons et éliminer les introns d'un ARN pré-messager. Pour que l'épissage soit correctement pris en charge par l'épisome et ses protéines auxiliaires, différents signaux sont présents le long de la séquence de l'ARN pré-messager. Il est maintenant reconnu que près de la moitié des mutations pathogènes chez l'homme impactent l'épissage, aboutissant à un dysfonctionnement du gène. Il est ainsi indispensable pour les biologistes d'être capables de détecter ces signaux sur une séquence génomique.Cette thèse a donc pour but de concevoir de nouveaux algorithmes permettant d'apporter la puissance de calcul des ordinateurs au service de la biologie de l'épissage. La solution proposée, Human Splicing Finder (HSF), est capable de prédire les trois types de signaux d'épissage à partir d'une séquence quelconque extraite du génome humain. Nous avons évalué l'efficacité de prédiction d'HSF dans l'ensemble des situations associées à des mutations pathogènes pour lesquelles il a été démontré expérimentalement leur impact sur l'épissage et par rapport aux autres algorithmes de prédiction. Parallèlement à ces apports directs tant pour la connaissance des processus biologiques de l'épissage que pour le diagnostic, les nouvelles approches thérapeutiques génotype-spécifiques peuvent également bénéficier de ces nouveaux algorithmes. Ainsi HSF permet de mieux cibler les oligonucléotides anti-sens utilisés pour induire le saut d'exon dans la myopathie de Duchenne et les dysferlinopathies.La reconnaissance récente de l'intérêt majeur de l'épissage dans des domaines aussi variés que la recherche fondamentale, la thérapeutique et le diagnostic nécessitaient un point central d'accès aux signaux d'épissage. HSF a pour objet de remplir ce rôle, en étant régulièrement mis à jour pour intégrer de nouvelles connaissances, et est d'ores et déjà reconnu comme un outil de référence
Discovered in 1977, splicing is a post-transcriptional maturation process that consists in link-ing exons together and removing introns from a pre-messanger RNA. For splicing to be cor-rectly undertaken by the spliceosome and its auxiliary proteins, several signals are located along the pre-messanger RNA sequence. Nearly half of pathogenous mutations in humans are now recognized to impact splicing and leading to a gene dysfunction. Therefore it is es-sential for biologists to detect those signals in any genomic sequence.Thus, the goals of this thesis were to conceive new algorithms: i) to identify splicing signals; ii) to predict the impact of mutations on these signals and iii) to give access to this information to researchers thanks to the power of bioinformatics. The proposed solution, Human Splicing Finder (HSF), is a web application able to predict all types of splicing signals hidden in any sequence extracted from the human genome. We demonstrated the prediction's efficiency of HSF for all situations associated with pathogenous mutations for which an impact on splicing has been experimentally demonstrated. Along with these direct benefits for the knowledge of biological processes for splicing and diagnosis, new genotype-specific therapeutic approaches can also benefit from these new algorithms. Thus, HSF allows to better target antisense olignucleotides used to induce exon skipping in Duchenne myopathy and dysferlinopathies.The recent recognition of the major interest of splicing in various domains such as fundamen-tal research, therapeutics and diagnosis needed a one stop shop for splicing signals. HSF has for object to fulfill this need, being regularly updated to integrate new knowledge and is already recognized as an international reference tool

Le transfert de l'information du gène à la protéine nécessite la synthèse et la maturation de l'arn pré-messager. Une des étapes de cette maturation correspond à l'épissage du transcrit primaire, au cours duquel les séquences non codantes seront excisées. Une des caractéristiques de la réaction d'épissage est de conserver l'ordre génomique des exons, puisque toute jonction exonique doit s'établir entre le site donneur d'epissage d'un exon et le site accepteur d'epissage d'un second exon en aval du premier. Nous avons mis en évidence l'existence d'une réaction d'epissage de polarité inverse entre les sites donneur du cinquième ou sixième exon et le site accepteur du deuxième exon, plus en amont dans le locus du proto-oncogène humain ets-1. Nous avons montré que cette réaction d'épissage inverse était spécifique de ces exons. Les exons impliqués dans l'épissage inverse ont la particularité d'être adjacents à de larges régions introniques, et l'un d'entre eux est un exon alternatif
Nous avons démontré que le mécanisme d'épissage inverse est intramoléculaire et que les transcrits comprenant une jonction exonique inversée ont une structure circulaire. Les molécules d'arn circulaires que nous avons identifiées, ne contiennent que la séquence exonique du deuxième au cinquième exon, ou au sixième exon du locus de ets-1. Nous avons observé une localisation cytoplasmique et une stabilité élevée pour ces molécules d'arn. Le taux d'expression des transcrits circulaires est de l'ordre de 1% du taux d'expression du transcrit linéaire de ets-1. La faible expression de transcrits circulaires pour le locus de ets-1 a-t-elle une signification biologique? Le mécanisme d'épissage inverse a été mis en évidence pour d'autres gènes, pour lesquels l'expression de transcrits circulaires est majoritaire sinon plus élevée que celle du transcrit habituel. Ces transcrits circulaires pourraient ainsi avoir une fonction en tant que molécule d'arn, comme cela a été démontré pour certains arns messagers

Au cours de la différenciation érythroïde, la reconnaissance de l'exon 16 est indispensable à la fonction de la protéine 4. 1R du globule rouge mature. La rétention de cet exon est un processus d'épissage alternatif dont la régulation est encore totalement inconnue. Mon projet de thèse avait pour but la recherche de voies de régulation de l'inclusion de l'exon 16. Pour cela, j'ai étudié à la fois l'implication éventuelle de voies de signalisation par inhibition de kinases déterminées et de facteurs de transcription impliqués dans la différenciation érythroïde, en général, par surexpression. Ce travail a permis d'impliquer dans la régulation positive la kinase P38 et un facteur érythroïde à la fonction inconnue Herf1 et dans la régulation négative la kinase PI3K et surtout le facteur de transcription Spi-1. Ce dernier capable d'interagir directement avec l'exon 16 et ses introns a été impliqué dans l'évènement d'épissage en lui-même

Le processus d'epissage alternatif permet de generer differentes proteines biologiquement actives a partir d'un meme gene. Par la technique de rt-pcr, nous avons mis en evidence un produit d'amplification minoritaire de taille inferieure au fragment correspondant a l'arnm de la melanin-concentating hormone (mch) a partir d'extraits hypothalamiques de differentes souches de rats. Apres sequencage, ce fragment c'est avere correspondre a un nouveau messager dans lequel les exons i et iii du gene mch sont directement joints. Cette association abouti a la production d'une nouvelle proteine, de sequence homologue a celle de la pro-mch dans sa partie c-terminale (83 acides amines) qui contient le peptide signal, et differente pour l'extremite c-terminale (42 acides amines) puisqu'un decalage de phase ouverte de lecture conduit a une nouvelle orf. Cette proteine de 125 acides amines nommee mgop pour mch gene overprinted protein pourrait generer, apres clivage d'un doublet basique, un peptide de 14 acides amines chez le rat (toumaniantz et coll. , endocrinology, 137, 1996). Afin d'etablir l'importance d'un tel phenomene d'epissage, le transcrit mgop a ete caracterise a partir d'extraits hypothalamiques egalement chez la souris, le macaque et l'homme. Le sequencage a revele quelques mutations pour la souris et l'addition de deux residus pour l'homme, mais toujours avec une forte conservation de la partie c-terminale. L'analyse des resultats de rt-pcr indique que l'expression du transcrit mgop est propre a certaines aires cerebrales (hypothalamus et cortex) et qu'elle peut aussi etre peripherique (thymus, testicule) chez le rat comme chez l'homme. L'utilisation d'anticorps diriges contre la partie c-terminale de mgop a permis d'identifier des neurones a mgop dans l'hypothalamus lateral chez ces deux especes. Des etudes de colocalisation indiquent que 99% des neurones exprimant le mgop produisent egalement de la mch. Cependant, des corps cellulaires a mgop ont ete observes dans les noyaux periventriculaires ainsi que dans le cortex ou aucun site de production de mch n'est detectable. De plus ces deux systemes ont des cartographies de projection sensiblement differentes. Ainsi, les noyaux supra-chiasmatiques, ventromedians et arques presentent une forte densite de fibres mgop mais tres peu de terminaisons a mch. La localisation particuliere des sites de synthese et de projection suggere une implication eventuelle de mgop ou des produits de clivage dans les regulations de la reproduction, du rythme circadien ou du comportement alimentaire.

L'épissage alternatif des pré-ARNm est un mécanisme majeur de diversification de l'information génétique et ses dérégulations sont liées à des maladies. L'inclusion de l'exon 16 est essentielle à la protéine 4. 1R cytosquelettique pour la stabilité de l'hématie, elle n'a lieu qu'en fin de différenciation érythroi͏̈de. Nous avons cherché les séquences, éléments cis, et leurs ligands, facteurs trans, requis pour cet événement. Des stratégies in culturo (transfections de minigènes 4. 1 R, surexpression de facteurs d'épissage et étude de l'inclusion de l'exon 16 sur les ARNm 4. 1 R endogènes ou exogènes) et in vitro (gels retard, pontage aux UV) ont été appliquées. Nous avons établi un modèle de régulation in cis. Puis j'ai focalisé mon travail sur le répresseur portant 2 motifs UAG, sites putatifs d'hnRNP A1. Nous avons montré que le rôle de hnRNP A1 est minime dans cette répression mais qu'en revanche, le répresseur recrute KSRP, un autre facteur d'épissage, de façon indépendante des motifs UAG

L'inclusion de l'exon 16 permet la production d’une protéine 4. 1R fonctionnelle, essentielle à l’intégrité des membranes cytoplasmiques dans les érythroblastes mature. Dans notre étude, nous avons identifié KSRP comme protéine majoritairement fixée sur l’ESS de l’exon 16. Sa fixation requiert hnRNP A1 in vitro mais n’influe pas sur l’épissage de l’exon 16 de manière directe et indirecte. De plus, nous avons observé que dans les protéines hnRNP A/B uniquement hnRNP A2 régule in vivo l’inclusion de l’exon 16 dans le système érythroïde. Ces données ont permis de créer un modèle de régulation de l’épissage de l’exon 16 permettant de mieux apréhender les mécanismes d’épissage essentiels contribuant à la formation des cellules érythroïdes différenciées. Ce modèle montre que les protéines hnRNP A1, hnRNP A2 et KSRP font partie du complexe ribonucléoprotéique fixé sur l’ESS in vitro mais que seul hnRNP A2 inhibe l’inclusion de l’exon 16 in vivo
The inclusion of exon 16 in the mature protein 4. 1R messenger RNA (mRNA) is a critical event in red blood cell membrane biogenesis. It occurs during late erythroid development and results in inclusion of the 10kDa domain needed for stabilization of the spectrin/actin lattice. We here identified KSRP as a predominant splicing factor that binds to ESS16, a splicing silencer within exon 16. Its binding requires hnRNP A1 protein in vitro but does not affect exon 16 splicing in intact cells. In addition, we observed that the regulation of the exon 16 inclusion in the erythroid system is not affected by hnRNP A1 in vivo, but rather is modulated by hnRNP A2 in an isoform specific manner

L'épissage alternatif est un mécanisme fondamental qui participe à la régulation de l'expression génique. C'est grâce à l'épissage que l'on peut obtenir, à partir d'un même ARN pré-messager, plusieurs ARN messagers matures différents. Ce mécanisme est de ce fait important pour la diversité protéomique. . .

L'acquisition de l'identité hépatique est déterminée par l'action des facteurs de transcription enrichis dans le foie (LETF). Le sujet de cette thèse porte sur l'un des LETF : HNF4alpha. Le travail expérimental a eu pour but d'approfondir l'étude de la régulation de son expression et des aspects liés à son activité transcriptionnelle. Le produit du gène HNF4alpha est indispensable pour le développement et la différenciation hépatique. Plusieurs isoformes sont issues du même gène. HNF4alpha7 résulte de la transcription à partir d'un promoteur alternatif situé en amont du promoteur qui donne lieu à l'isoforme, HNF4alpha1. .
The establishment of hepatic identity results from two processes : specific gene expression and acquisition of a defined morphology. Specific gene expression is regulated at the transcriptional level by the liver-enriched transcription factors. Among these, HNF4alpha is essential for development and hepatic differentiation. My work focused on the study of the expression and transcriptional activity of the isoforms encoded by the HNF4alpha gene. HNF4alpha1 and HNF4alpha7 transcripts originate from alternative promoters and the corresponding proteins possess different amino-termini. . .

Le projet de ma thèse se base sur une observation faite sur la distribution de taille des introns issue des données de séquençage du génome de la paramécie. Ces données montrent que les génomes eucaryotes contre-sélectionnent, au cours de l’évolution, les introns "traductibles", c'est-à-dire qui ne créent pas de codons de terminaison précoces (PTC) en cas de rétention dans l’ARN messager. Ainsi, l’évolution semble avoir façonné les introns de telle manière que les ARNm non épissés ne soient pas traductibles. Cette contre-sélection est intrigante puisqu’elle suggère que les introns sont fréquemment traduits, impliquant qu’ils sont significativement retenus dans les ARNm. Des expériences préalables montrent que l’inactivation de UPF1, acteur clé du Nonsense-mediated mRNA Decay (NMD), un mécanisme très conservé de surveillance des ARNm qui cible et dégrade les ARNm contenant des PTC, entraîne une augmentation de 10% à 490% de la fraction des formes non épissées. Ainsi, l’épissage semble être relativement inefficace et les cellules eucaryotes s’en remettraient au NMD, pour produire les profils d’épissage observés. Le sujet de thèse est un approfondissement du rôle du NMD, et plus généralement de la traductibilité des pre-ARNm dans le contrôle des profils d’épissage. J’ai voulu au cours de ma thèse tester plusieurs hypothèses liées à ces premières observations. D’abord, une confirmation du contrôle traductionnel de l’épissage par le NMD devait être faite en inactivant UF2, un autre acteur clé du NMD. Ensuite, j’ai construit un système rapporteur de l’épissage pour mesurer précisément l’effet du NMD et de la "traductibilité" des introns sur les quantités d’isoformes d’ARNm produites Enfin, j’ai préparé des banques transcriptomiques de cellules dépourvues d’activité NMD pour observer le contrôle traductionnel à l’échelle du génome et découvrir l’efficacité et la précision globales de l’épissage. Mes résultats confirment le contrôle traductionnel de l’épissage précédemment observé, et mettent en valeur le caractère inefficace mais surtout imprécis du mécanisme d’épissage. En outre, j’ai pu observer sur quelques introns que la présence d’un codon stop dans leur séquence n’améliore pas leur reconnaissance et leur excision au cours de l’épissage

Les maladies génétiques qui touchent la myéline du système nerveux central (SNC), ou leucodystrophies, sont responsables de tableaux cliniques extrêmement variés. Dans ce travail, nous nous sommes intéressées aux formes avec paucité de la myéline, ou hypomyélinisation, impliquant le gène PLP1 (Xq23) codant pour les protéines majeures constitutives de la myéline du SNC : PLP et DM20. Les "PLP-pathies" se traduisent par un déficit moteur variable selon les différentes mutations allant des formes sévères de la maladie de Pelizaeus-Merzbacher (PMD) à des formes modérées et tardives de paraplégie spastique (SPG2). Cependant, pour une grande partie des patients souffrant de PMD et de SPG2, l'implication du gène PLP1 n'a pas pu être montrée suggérant soit une hétérogénéité génétique soit des mécanismes mutationnels alternatifs de PLP1. Cette cohorte de patients, dénommée PMLD(Pelizaeus Merzbacheer like disease), a fait l'objet de cette étude. Nous avons, d'une part testé plusieurs gènes candidats dont le gène MBP, codant pour la 2ème protéine constitutive majeure de la myéline du SNC, le gène GPM6B et le gène OLIG2 codant pour un facteur de transcription, puis d'autre part recherché des méchanismes mutationnels alternatifs de PLP1 en recherchant des remaniements intragéniques et en explorant les régions non codantes et le niveau d'expression de PLP1 par l'étude des transcrits PLP et DM20 à partir des fibroblastes. Si nous avons pu montrer que les gènes candidats testés ainsi que les remaniements intragéniques de PLP1 ne sont pas majoritairement impliqués dans ce groupe de leucodystrophie, l'étude des transcrits a montré, en revanche, l'intérêt de l'utilisation des fibroblastes comme modèle d'étude de l'épissage et du niveau d'expression de PLP1 et a permis de suggérer qu'une anomalie de régulation de l'expression de PLP1 pourrait être impliquée chez certains patients PMLD
Genetic diseases affecting primarily the myelin of the central nervous system (CNS), or leucodystrophies, include a large variety of phenotypes. The aims of this work lead with hypomyelinating forms, displaying a defect in myelin production and implicating the PLP1 gene which encodes the major proteins of CNS myelin, i. E. PLP and DM20. "PLP-pathies" are characterized by motor development impairment and encompass a wide continuum spectrum extending from severe forms of Pelizaeus-Merzbacher disease (PMD) to relatively mild late onset spastic paraplegia (SPG2). However, a large proportion of patients presenting with a PMD or a SPG2 phenotype remains without identified PLP1 mutations suggesting either genetic heterogeneity or PLP1 gene alternative mutational mechanisms. This cohort of patients, called PMD like (PMLD), has been studied in this work to test both hypotheses. First, different candidate genes have been tested, including MBP which encodes the second major proteins of CNS myelin; GPM6B, which present close similarities with DM20 and OLIG2 which encodes a transcription factor oligodendrocyte specific. Secondly, the existence of PLP1 alternative mutational mechanisms has been evaluated by looking for small intragenic rearrangements, and for qualitative and quantitative abnormalities analyzing PLP and DM20 transcripts from patients' fibroblasts. Obtained results have excluded the implication of the tested candidate genes as well as PLP1 small intragenic rearrangements in the aetiology of PMLD. On the other hand, qualitative and quantitative analysis of PLP/DM20 transcripts from fibroblasts have demonstrated their usefulness and suggested that a PLP1 gene expression dysregulation could be involved in a subset of PMLD patients