Academic literature on the topic 'Escherichia coli HT115 (DE3)'
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Journal articles on the topic "Escherichia coli HT115 (DE3)"
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Ahn, Seung-Joon, Kelly Donahue, Youngho Koh, Robert R. Martin, and Man-Yeon Choi. "Microbial-Based Double-Stranded RNA Production to Develop Cost-Effective RNA Interference Application for Insect Pest Management." International Journal of Insect Science 11 (January 2019): 117954331984032. http://dx.doi.org/10.1177/1179543319840323.
Full textAbstract:
RNA interference (RNAi) is a convenient tool to identify and characterize biological functions in organisms. Recently, it has become an alternative to chemical insecticides as a biologically based control agent. This promising technology has the potential to avoid many problems associated with conventional chemical insecticides. In order for RNAi application to be practical for field use, a major hurdle is the development of a cost-effective system of double-stranded RNA (dsRNA) production for a large quantity of dsRNA. A handful of research reports has demonstrated microbial-based dsRNA production using L4440 vector and HT115 (DE3) Escherichia coli for application to vertebrate and invertebrate systems. However, the dsRNA yield, production efficiency, and biological purity from this in vitro system is still unclear. Thus, our study detailed biochemical and molecular tools for large-scale dsRNA production using the microbial system and investigated the production efficiency and yield of crude and purified dsRNAs. An unrelated insect gene, green fluorescent protein (GFP), and an insect neuropeptide gene, pyrokinin (PK) identified from Drosophila suzukii, were used to construct the recombinant L4440 to be expressed in the HT115 (DE3) cell. A considerable amount of dsRNA, 19.5 µg/mL of liquid culture, was isolated using ultrasonic disruption followed by phenol extraction. The sonication method was further evaluated to extract crude dsRNA without the additional phenol extraction and nuclease treatments and also to reduce potential bacterial viability. The results suggest that the ultrasonic method saved time and costs to isolate crude dsRNA directly from large volumes of cell culture without E coli contamination. We investigated whether the injection of PK dsRNA into flies resulted in increased adult mortality, but it was not statistically significant at 95% confidence level. In this study, the microbial-based dsRNA production has potential for applied RNAi technology to complement current insect pest management practices.
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Niño-Sánchez, Jonatan, Li-Hung Chen, Jorge Teodoro De Souza, Sandra Mosquera, and Ioannis Stergiopoulos. "Targeted Delivery of Gene Silencing in Fungi Using Genetically Engineered Bacteria." Journal of Fungi 7, no. 2 (February 9, 2021): 125. http://dx.doi.org/10.3390/jof7020125.
Full textAbstract:
Exploiting RNA interference (RNAi) in disease control through non-transformative methods that overcome the hurdle of producing transgenic plants has attracted much attention over the last years. Here, we explored such a method and used non-pathogenic bacteria as a versatile system for delivering RNAi to fungi. Specifically, the RNaseIII-null mutant strain of Escherichia coli HT115(DE3) was transformed with two plasmid vectors that enabled the constitutive or IPTG-inducible production of double-stranded RNAs (dsRNAs) against genes involved in aflatoxins production in Aspergillus flavus (AflC) or virulence of Botrytis cinerea (BcSAS1). To facilitate the release of the dsRNAs, the bacterial cells were further genetically engineered to undergo a bacteriophage endolysin R-mediated autolysis, following a freeze-thaw cycle. Exposure under in vitro conditions of A. flavus or B. cinerea to living bacteria or their whole-cell autolysates induced silencing of AflC and BcSAS1 in a bacteria concentration-dependent manner, and instigated a reduction in aflatoxins production and mycelial growth, respectively. In planta applications of the living bacteria or their crude whole-cell autolysates produced similar results, thus creating a basis for translational research. These results demonstrate that bacteria can produce biologically active dsRNA against target genes in fungi and that bacteria-mediated RNAi can be used to control fungal pathogens.
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Bernadus, Zefanya G., Fatimawali Fatimawali, and Beivy Kolondam. "TRANSFORMASI PLASMID YANG MENGANDUNG GEN merB PADA Escherichia coli BL21(DE3)." PHARMACON 8, no. 1 (February 28, 2019): 196. http://dx.doi.org/10.35799/pha.8.2019.29254.
Full textAbstract:
ABSTRACTDNA transformation is one of the methods for inserting DNA into bacterial cells. The current transformation method is widely used to transfer plasmids containing genetic material. This study aims to evaluate the results of plasmid transformation containing merB gene in Escherichia coli BL21(DE3) bacteria. The stages of the research carried out were preceded by the microbiological identification of the E. coli BL21(DE3) bacteria used as hosts. Then the plasmid transformation containing merB gene into the E. coli BL21(DE3) host cell using the heat shock method was carried out. The transformation results were evaluated by observing at the presence of E. coli BL21(DE3) colonies on agar Luria Bertani (LB) media containing ampicillin antibiotics. Plasmids in E. coli BL21(DE3) were isolated and analyzed by 1% agarose gel electrophoresis. The results showed the success of the transformation indicated by the growth of E. coli BL21(DE3) bacteria in agar LB media containing ampicillin and the visualization on agarose gel resulted that the plasmid which carried the merB gene could be transformed in to the E. coli BL21(DE3) bacteria.Keywords : Plasmids, merB genes, heat shock, Escherichia coli BL21(DE3)ABSTRAKTransformasi DNA merupakan salah satu metode untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri. Metode transformasi saat ini dipakai secara luas untuk mentransfer plasmid yang mengandung bahan genetika. Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi hasil transformasi plasmid yang mengandung gen merB pada bakteri Escherichia coli BL21(DE3). Tahapan penelitian didahului dengan identifikasi secara mikrobiologi bakteri E. coli BL21(DE3) yang digunakan sebagai inang. Selanjutnya dilakukan transformasi plasmid yang mengandung gen merB kedalam sel inang E. coli BL21(DE3) menggunakan metode heat shock. Hasil transformasi dievaluasi dengan melihat adanya koloni E. coli BL21(DE3) pada media agar Luria Bertani (LB) yang mengandung antibiotik ampisilin. Plasmid pada E. coli BL21(DE3) diisolasi dan dianalisis dengan elektroforesis gel agarose 1%. Hasil penelitian menunjukkan keberhasilan transformasi dengan adanya pertumbuhan bakteri E. coli BL21(DE3) pada media LB yang mengandung ampisillin dan hasil visualisasi pada agarose gel terlihat bahwa plasmid yang membawa gen merB dapat ditransformasikan ke dalam bakteri E. coli BL21(DE3).Kata Kunci : Plasmid, gen merB, heat shock, Escherichia coli BL21(DE3)
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Zhang, X., X. Liu, J. Ma, and J. Zhao. "Silencing of cytochrome P450 CYP6B6 gene of cotton bollworm (Helicoverpa armigera) by RNAi." Bulletin of Entomological Research 103, no. 5 (April 16, 2013): 584–91. http://dx.doi.org/10.1017/s0007485313000151.
Full textAbstract:
AbstractRNA interference (RNAi) induced through double-stranded RNA (dsRNA) has been used widely to study gene function in insects. In this paper we demonstrate the efficacy of RNAi in the cotton bollworm, Helicoverpa armigera. Using CYP6B6 as the target gene, which is expressed in the fat baby and midgut of the lepidopteran pest H. armigera, we constructed the vector which expressed dsRNA of CYP6B6. Northern blot analysis showed that dsRNA expressed in the Escherichia coli (HT115) was target gene. The results also showed that the gene expression level and protein expression level of H. armigera larvae fed with dsRNA expressed by E. coli were significantly lower than those of all controls, but the gene expression level was more obvious than that at the protein level; significant lethality differences were also found between HT115 bacteria containing L4440-dsC1 treatment and HT115 bacteria containing L4440 vector or CK (ddH2O) in instar larvae on 4 day when continuous feeding, 32.45% mortality was recorded in the group of feeding HT115 bacteria containing L4440-dsC1 on 10 day. Our results suggest that the RNAi pathway can be exploited to control insect pests.
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Noll, Stephan, Jan Reyelt, Thomas Rysiok, Roland Kellner, Detlef Güssow, Stefan Jäkel, Stefanie Hager, and Harald Kranz. "Gezielte Optimierung von Escherichia coli BL21(DE3)." BIOspektrum 19, no. 2 (March 2013): 211–13. http://dx.doi.org/10.1007/s12268-013-0292-2.
Full text
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Feng, Li Li, Jian Fei Zhang, Hui Luo, and Zheng Li. "Surface Modification of Acrylonitrile Fibers and Membrane by Nitrilase from Escherichia Coli BL21 (DE3)/pET-Nit." Advanced Materials Research 175-176 (January 2011): 651–55. http://dx.doi.org/10.4028/www.scientific.net/amr.175-176.651.
Full textAbstract:
The surface of polyacrylonitrile fibers and membrane were modified by nitrilase from Escherichia coli BL21 (DE3)/pET-Nit. Escherichia coli BL21(DE3)/pET-Nit was able to convert nitrile groups on PAN fibers and membrane to corresponding carboxylic acid as indicated by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). An increase of O/C atomic ratio on the fiber and membrane surface showed an increase in hydrophilicity and fabric-dyeing efficiency. Strength of treated fiber decreased by only 1.17%, because only surfacial nitrile groups of acrylic fibers were hydrolyzed by E.coli BL21(DE3)/pET-Nit.
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Liang, Rong, Chang Liu, Xiu Juan Meng, and Song Yi Lin. "Optimization of Proliferation Conditions of Recombinant Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28b(+)-aroGM150." Advanced Materials Research 915-916 (April 2014): 887–90. http://dx.doi.org/10.4028/www.scientific.net/amr.915-916.887.
Full textAbstract:
Applying Escherichia coli (E. coli) for fermentation is a very common technology. However combined with genetic engineering techniques to construct the recombinant Escherichia coli and study their growth characteristics has become the hot spot now. The recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) /pET-28baroGM150 had been constructed by our laboratory in the previous experiment. And the purpose of this study was to optimize the proliferation conditions of Escherichia coli BL21 (DE3) /pET-28baroGM150. In order to make the recombinant Escherichia coli grow stable under suitable conditions, using the density of bacteria and plasmid stability as indexes, three factors were tested including temperature, initial pH and loading volume. And the results indicated that the optimal proliferation temperature of the recombinant strain was 30°C, initial pH value was 6.5, loading volume was 150 mL medium of 1000 mL bottles.
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Kim, Sinyeon, Haeyoung Jeong, Eun-Youn Kim, Jihyun F. Kim, Sang Yup Lee, and Sung Ho Yoon. "Genomic and transcriptomic landscape of Escherichia coli BL21(DE3)." Nucleic Acids Research 45, no. 9 (March 31, 2017): 5285–93. http://dx.doi.org/10.1093/nar/gkx228.
Full text
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Pandey, Ramesh Prasad, Ha Young Jung, Prakash Parajuli, Thi Huyen Trang Nguyen, Puspalata Bashyal, and Jae Kyung Sohng. "A Synthetic Approach for Biosynthesis of Miquelianin and Scutellarin A in Escherichia coli." Applied Sciences 9, no. 2 (January 9, 2019): 215. http://dx.doi.org/10.3390/app9020215.
Full textAbstract:
Grapevine (Vitis vinifera) glycucuronosyltransferase (VvGT5) specifically catalyzes flavonol-3-O-glucuronosylation and the blue flowers of Veronica persica (Lamiales, Scrophulariaceae) uridine diphosphate (UDP)-dependent glycosyltransferase (UGT88D8) as flavonoid 7-O-specific glucuronosyltransferases, were chosen, codon optimized, and employed to synthesize the high valued flavonoids glucuronoids, miquelianin and scutellarin A in Escherichia coli. A single vector system was constructed to overexpress entire UDP-glucuronic acid biosynthesis pathway genes, along with a glucokinase gene in Escherichia coli BL21 (DE3). The newly generated E. coli BL21 (DE3) piBR181-glk.pgm2.galU.ugd.UGT88D8 strain produced 12 mg/L (28 µmol/L) of scutellarin A from apigenin, representing only 14% of maximum conversion percentage. Similarly, the strain E. coli BL21 (DE3) piBR181-glk.pgm2.galU.ugd.VvGT5 produced 30 mg/L (62 µmol/L) of miquelianin, representing a 31% conversion of quercetin. This production profile is a good starting point for further host engineering, and for production of respective compounds.
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Qin, Weitong, Xiaoqing Liu, Xiaoxia Yu, Xiaoyu Chu, Jian Tian, and Ningfeng Wu. "Identification of cadmium resistance and adsorption gene from Escherichia coli BL21 (DE3)." RSC Advances 7, no. 81 (2017): 51460–65. http://dx.doi.org/10.1039/c7ra10656d.
Full textDissertations / Theses on the topic "Escherichia coli HT115 (DE3)"
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Bento, Flavia de Moura Manoel. "Silenciamento gênico por interferência de RNA (RNAi) em traça-do-tomateiro, Tuta absoluta (Meyrick), utilizando bactérias expressando dupla fita de RNA (dsRNA)." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/11/11137/tde-06042018-144427/.
Full textAbstract:
O uso da técnica de RNAi vem sendo avaliada em diversos insetos-pragas pois, é uma estratégia inovadora que pode ser integrada no manejo de importantes pragas agrícolas. Os insetos da Ordem Lepidoptera são reconhecidos por apresentarem recalcitrância à técnica de silenciamento utilizando dsRNA. Assim, ajustes devem ser feitos aos métodos de entrega de dsRNA para que haja estabilidade da molécula até atingir o mRNA alvo de silenciamento no inseto. O silenciamento gênico por RNAi possui potencial de uso para o controle da \"traça-do-tomateiro\" Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae), uma das principais pragas do tomateiro no mundo. O objetivo do trabalho foi selecionar e avaliar o silenciamento de genes de T. absoluta, utilizando o método de entrega de dsRNA via bactéria E. coli HT115 (DE3), disponibilizada em dieta artificial. Também, objetivando a aplicabilidade da utilização de bactérias que se desenvolvam no mesmo hábitat de insetos-pragas, estudou-se a colonização das bactérias endofíticas Pantoea agglomerans linhagem 33.1, Burkholderia sp. linhagem SCMS54 e Burkholderia ambifaria linhagem RZ2MS16 em plantas de tomateiro e lagartas de T. absoluta, para posterior transformação e tentativa de utilização como estratégia de entrega de dsRNA para silenciamento de genes alvos de T. absoluta. Foram avaliados, por meio da metodologia de dieta artificial, oito genes de T. absoluta: juvenile hormone inducible protein - JHP; juvenile hormone epoxide hydrolase protein - JHEH; ecdysteroid 25-hydroxylase - PHM; chitin synthase A - CHI; glutathione S-transferase epsilon 2 - GST; carboxylesterase - COE; alkaline phosphatase - AP e; arginine kinase - AK. Por meio de avaliação dos parâmetros biológicos (mortalidade larval; duração da fase larval e peso de pupas) e expressão gênica em cinco períodos de alimentação, comprovou-se a eficiência da metodologia na avaliação do silenciamento gênico por RNAi, sendo possível realizar screening de grande quantidade de genes e avaliar os efeitos do silenciamento gênico no desenvolvimento de T. absoluta. Os genes AK, CHI e JHP apresentaram resultados positivos quanto ao silenciamento gênico e mortalidade larval, sendo promissores para uso de silenciamento por RNAi como estratégia de controle de T. absoluta. Pantoea agglomerans apresentou os melhores resultados de colonização de plantas de tomateiro \"Micro-Tom\" e lagartas de T. absoluta, além de estarem presentes em tecidos preferencialmente utilizados na alimentação das lagartas. Porém, lagartas não apresentaram diferenças na mortalidade larval ao se alimentarem de plantas de tomateiro \"Micro-Tom\" inoculadas com bactérias de P. agglomerans transformadas.The use of RNAi technique has been evaluated in several insect pests because it is an innovative strategy that can be integrated in the management of important agricultural pests. Insects of the Order Lepidoptera are recognized to present recalcitrance to gene silencing using dsRNA. Thus, adjustments should be done to dsRNA delivery methods to have molecule stability until it reaches the mRNA target for silencing in the insect. Gene silencing by RNAi has potential use to control the tomato leafminer Tuta absoluta (Meyrick, 1917) (Lepidoptera: Gelechiidae), one of the main insect pests of tomato crop worldwide. The objective of this work was to select and evaluate the silencing of T. absoluta genes using dsRNA delivery method via E. coli HT115 (DE3) bacterium, offered in artificial diet. Also, aiming the applicability of the use of bacteria growing in the same habitat of insect pests, we evaluate the colonization of the endophytic bacteria Pantoea agglomerans strain 33.1, Burkholderia sp. strain SCMS54 and Burkholderia ambifaria strain RZ2MS16 in tomato plants and T. absoluta larvae for further transformation and potential use as dsRNA delivery strategy for silencing target genes of T. absoluta. We evaluated eight genes of T. absoluta: juvenile hormone inducible protein - JHP; juvenile hormone epoxide hydrolase protein - JHEH; ecdysteroid 25-hydroxylase - PHM; chitin synthase A - CHI; glutathione S-transferase epsilon 2 - GST; carboxylesterase - COE; alkaline phosphatase - AP and; arginine kinase - AK. Evaluating biological parameters (larval mortality, larval stage duration and pupal weight) and gene expression in five feeding periods, we proved the efficiency of the methodology in the evaluation of gene silencing by RNAi, and evaluated the effects of gene silencing on the development of T. absoluta. The genes AK, CHI and JHP presented positive results regarding gene silencing and larval mortality, being promising to use RNAi silencing as a strategy to control T. absoluta. Pantoea agglomerans showed good results colonizing \"Micro-Tom\" tomato plants and T. absoluta larvae, besides being present in tissues preferentially used by larvae for feeding. However, larvae did not show differences in larval mortality when feeding on tomato plants inoculated with transformed P. agglomerans.
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Vu, Thi Bich Ngoc, Thi Thao Nguyen, Thi Hoa Chu, and Thi Tuyen Do. "Cloning and expression of recombinant thrombin in Escherichia coli JM109 (DE3)." Saechsische Landesbibliothek- Staats- und Universitaetsbibliothek Dresden, 2017. http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:bsz:14-qucosa-227848.
Full textAbstract:
Prothrombin, a protein involved in blood coagulation, is a plasma glycoprotein composed of the Gla domain, two adjacent kringle domains, and a serine protease domain. Prothrombin is a thrombin precursor playing the important role in the coagulation physiological as well as pathological condition. Thrombin is the key to convert the fibrinogen into fibrin by switching activation of XIII factor, pushed plasminogen into plasmin, the develope of the fibroblast and helps the stabilization of thrombolysis. In this study, the prothrombin gene was 936 bp in lengths and encoded 312 amino acids from bovine lung was optimized codon, was cloned in pET21a+ vector and expression in E. coli, in order to replace traditional bandages having slow affect, reduce the cost of products, cater the comunity health. The results showed that initially the successful cloning and expression of recombinant prothrombin in E. coli JM109(DE3)Prothrombin, 1 glycoprotein huyết tương liên quan tới quá trình đông máu gồm 2 vùng Gla, 2 vùng Kringle và 1 vùng serine protease. Prothrombin là tiền chất của thrombin có vai trò quan trọng trong sinh lý đông máu cũng như tình trạng bệnh lý. Thrombin được xem như chìa khóa để chuyển hóa fibrinogen thành fibrin bằng cách hoạt hóa các yếu tố đông máu như XIII, thúc đẩy chuyển plasminogen thành plasmin và kích thích tăng sinh các tế bào tơ (fibroblast), giúp ổn định quá trình làm tan huyết khối. Trong nghiên cứu, các gen prothrombin được tách dòng từ phổi bỏ có kích thước 936 bp, mã hóa cho 312 axit amin được tối ưu hóa codon, nhân dòng vào vector pET21a+ và biểu hiện trong E. coli. Mục đích của nghiên cứu nhằm tạo ra băng gạc cầm máu nhanh, giá thành rẻ, phục vụ sức khỏe cộng đồng và thay thể băng gạc truyền thống. Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy đã nhân dòng và biểu hiện thành công prothrombin tái tổ hợp ở chủng E. coli JM109(DE3)
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Santos, Juan Carlos Flores. "Cultivo de Escherichia coli BL21 (DE3) para produção de L-asparaginase II." Universidade de São Paulo, 2017. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/9/9134/tde-27042017-172422/.
Full textAbstract:
Utilizada amplamente como agente terapêutico no tratamento da leucemia linfoblástica aguda (LLA), a L-Asparaginase II (ASNase) é uma enzima que atua diminuindo a concentração de asparagina livre no plasma. Dessa forma, impede o fornecimento de asparagina para a proliferação de células malignas, as quais ao contrário das células saudáveis, não conseguem sintetizar a asparagina. A ASNase utilizada atualmente no Brasil é importada, o que gera problemas com custo e abastecimento. Sendo assim, é notavelmente atrativa a procura por sistemas que apresentem níveis elevados de expressão de asparaginase e o encontro de formas de produzir tal enzima para um fácil acesso e, se possível, com menor potencial alérgico. Isso nos incentiva a estudar a produção biotecnológica de ASNase produzida em Escherichia coli BL21 (DE3) recombinante que super expressa esta enzima. O objetivo deste trabalho foi estabelecer, em agitador orbital e sistema descontínuo, os parâmetros do cultivo e indução da bactéria Escherichia coli BL21 visando à produção de ASNase, os quais serão úteis para futuros estudos em sistema descontínuo-alimentado. Nosso trabalho avaliou fatores que influenciam a fase de crescimento e/ou a fase de indução da E. coli BL21 (DE3): meio de cultivo baseado na composição elementar, controle do pH, uso de glicose ou glicerol como fonte de carbono, formação de acetato, tempo inicial e final da indução, permeabilização celular para secreção da ASNase, concentração de indutor, temperatura de pós-indução. Nós apresentamos uma estratégia para produção extracelular de ASNase em E. coli BL21 (DE3) pelo crescimento em meio Luria Bertani (LB) modificado para permeabilização celular. A produtividade volumétrica de ASNase extracelular foi 484 IU L h-1 em agitador orbital, correspondendo a 89 % de secreção após 24h de pós-indução com IPTG a 37 ºC. Isto representou rendimento 50 % maior para a ASNase total e 15,5 vezes mais secreção de ASNase em relação ao uso do meio LB modificado. Entretanto no cultivo em biorreator de 3 L nas mesmas condições (exceto a forma de aeração: 500 rpm de agitação e 1 vvm de vazão de ar, kLa = 88 h-1) operado em regime descontínuo foram obtidos resultados semelhantes aos cultivos em agitador orbital, sendo a produtividade volumétrica da ASNase extracelular igual a 525 IU L h-1 após 20 h de pós-indução. A biomassa obtida para agitador orbital e biorreator foi 3,26 e 2,63 g L-1, respetivamente. Por esse motivo, esses resultados foram considerados promissores para aumentar a produtividade nos futuros ensaios em biorreator operado em regime descontinuo-alimentado.Widely used as a therapeutic agent in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL), L-Asparaginase II (ASNase) is an enzyme that works by reducing the concentration of free asparagine in plasma. Thus, it prevents the delivery of asparagine to the proliferation of malignant cells, which unlike healthy cell, cannot synthesize asparagine. ASNase currently used in Brazil is imported, which causes problems with cost and supply. Thus, the search for systems with high levels of asparaginase expression and the finding of ways to produce this enzyme for easy access and, if possible, with a lower allergic potential, are strikingly attractive. This encourages us to study the biotechnological production of ASNase in recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) which super expresses this enzyme. The objective of this work was to establish, in shaker and batch bioreactor system, growth and induction parameters of the Escherichia coli BL21 aiming the production of ASNase, which will be useful for future studies in a fed-batch system. Our work evaluated factors that influenced the growth and induction phase of E. coli BL21 (DE3): culture medium based on elemental composition, pH control, use of glucose or glycerol as carbon source, formation of acetate, initial and final induction time, cellular permeabilization for ASNase secretion, inducer concentration, post-induction temperature. We performed a strategy for extracellular production of ASNase in E. coli BL21 (DE3) by growing in modified Luria Bertani (LB) medium for cell permeabilization. The volumetric productivity of extracellular ASNase was 484 IU L h-1 on shaker, which reached 89% secretion at 24 h of post-induction with IPTG at 37°C. This represented an increase yield of 50 % regarding to the total ASNase formed and 15.5 times the ASNase secretion as compared to that attained with LB modified. While in batch 2L-bioreactor cultivation under the same conditions (except for the aeration employed: 500 rpm of stirring and 1 vvm of air flow, kLa = 88 h-1) it was obtained similar results in relation to shaker cultures. The volumetric productivity of extracellular ASNase was 525 IU L h-1 at 20 h of post-induction. The biomass obtained for shaker and bioreactor were 3.26 and 2.63 g L-1, respectively. For this reason, we consider these promising results to increase productivity in future studies in bioreactor operated as fed-batch regimen.
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Schlegel, Susan. "From protein production to genome evolution in Escherichia coli." Doctoral thesis, Stockholms universitet, Institutionen för biokemi och biofysik, 2013. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:su:diva-94993.
Full textAbstract:
The aim of my Ph.D. studies was to improve production yields of membrane- and secretory proteins in the widely used E. coli protein production strain BL21(DE3). In this strain expression of the gene encoding the protein of interest is driven by the powerful T7 RNA polymerase (T7 RNAP) whose gene is located on the chromosome and under control of the strong, IPTG-inducible lacUV5 promoter. Unfortunately, the production of many membrane and secretory proteins is 'toxic' to BL21(DE3), resulting in poor growth and low production yields. To understand this ‘toxicity’, the BL21(DE3) derived mutant strains C41(DE3) and C43(DE3) were characterized. Somehow, these strains can efficiently produce many ‘toxic’ membrane and secretory proteins. We showed that mutations weakening the lacUV5 promoter are responsible for this. These mutations result in a slower onset of protein production upon the addition of IPTG, which avoids saturating the Sec-translocon capacity. The Sec-translocon is a protein-conducting channel in the cytoplasmic membrane mediating the biogenesis of membrane proteins and translocation of secretory proteins. Next, we constructed a BL21(DE3)-derivative, Lemo21(DE3), in which the activity of T7 RNAP can be precisely controlled by titrating in its natural inhibitor T7 lysozyme using the rhamnose promoter system. In Lemo21(DE3), the expression level of genes encoding membrane and secretory proteins can be set such that the Sec-translocon capacity is not saturated. This is key to optimizing membrane and secretory protein production yields. Finally, reconstructing the evolution of C41(DE3) from BL21(DE3) in real time showed that during its isolation C41(DE3) had acquired mutations critical for surviving the starvation conditions used, and provided insight in how the mutations in the lacUV5 promoter had occurred.At the time of the doctoral defense, the following paper was unpublished and had a status as follows: Paper 3: Manuscript.
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Angardi, Vahideh. "Influence Of Oxygen Transfer On Benzaldehyde Lyase Production By Recombinant Escherichia Coli Bl21(de3) Plyss." Master's thesis, METU, 2007. http://etd.lib.metu.edu.tr/upload/12608779/index.pdf.
Full textAbstract:
In this study, the effects of oxygen transfer conditions on the synthesis of the enzyme benzaldehyde lyase as intracellular in recombinant E. coli BL21 (DE3) pLysS was investigated sistematically and a comprehensive model was developed to determine benzaldehyde lyase activity. For this purpose, the research program was carried out in mainly two parts. In the first part of study, the effects of oxygen transfer together with the mass transfer coefficient (KLa), enhancement factor E (=KLa/KLao), volumetric oxygen transfer rate, volumetric and specific oxygen uptake rates, mass transfer and biochemical reaction resistancesmoreover, the variation in product and by-product distribution, specific substrate uptake rates, yield and maintenance coefficient were investigated in the pilot scale batch bioreactor at QO/VR = 0.5 vvm and agitation rates of N= 250, 500, 625, and 750 min-1, and dissolved oxygen levels DO= 20%, 40% conditions, while medium components were CGlucose= 8.0 kg m-3, C(NH4)2HPO4= 5.0 kg m-3 and salt solution at controlled pHc=7.2. The highest cell concentration and benzaldehyde lyase activity were obtained at DO=40% condition as 3.0 kg m-3 and A=1095 Ucm-3, respectively. v Then a mathematical model was proposed to estimate benzaldehyde lyase activity as function of time, agitation rate, cell concentration, dissolved oxygen concentration, and by-product concentration with reasonable accuracy.
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Bellão, Carolina. "Avaliação de fontes de carbono e condições de indução na expressão de canacistatina em Escherichia coli BL21 (DE3)." Universidade Federal de São Carlos, 2006. https://repositorio.ufscar.br/handle/ufscar/3974.
Full textAbstract:
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Previous issue date: 2006-03-30Universidade Federal de Sao Carlos
Canecystatin (CC) is a competitive and reversible protease inhibitor which blocks the proteolytic enzymes activities of insets, fungus e nematodes, prejudicing thus the growth, development and reproduction from these pathogenics organisms. CC is produced by sugarcane, but with limited production, difficulting extraction and purification for production of commercials products, so recombinant DNA technology is one alternative for increase of CC production. Nowadays, CC is produced in the Molecular Biology Laboratory of the Department of Genetic and Evolution of UFSCar (LBM-DGE/UFSCar) from E. coli BL21(DE3) in shaker, utilizing a high cost commercial culture medium (Circlegrow®). With the purpose of produce CC in higher scale, the aim of present work was the study the CC expression in E. coli BL21(DE3), evaluating different carbon source, kind of inductor and induction moment in shaker, as well as confirming the expression conditions in airlift bioreactor of 6 L working volume. In the experiments carried out in shaker were obtained similar cellular growth when utilized glycerol, glucose, fructose e fructose + glucose, and low cellular growth when utilized galactose. It was observed high expression when galactose was utilized as carbon source and IPTG 0,4 mM as inductor. When lactose at 4 e 40 mM was utilized as inductor, CC expression occurred only in the culture containing galactose as carbon source. Volumetric production (in mg/L) of CC up to 61% those from standard culture was obtained, with exception the culture that utilized galactose induced with 0,4 mM of IPTG and 4 mM of lactose, and specific production (mgCC/gcells) greater 75% from standard culture. With respect of cultures in airlift bioreactor, CC expression was superior to expression culture carried out in shaker utilizing glucose with carbon source, approximately 80% of CC concentration obtained in the standard culture after 1 hour of induction and achieving more than 90% in the second hour of induction. In terms of specific production, in this culture was obtained 79,9 mgCC/gcell, value approximately 25% superior to the standard culture.
A canacistatina (CC) é um inibidor competitivo e reversível de proteases, que bloqueia a atividade proteolítica de enzimas de insetos, fungos e nematóides, prejudicando assim o crescimento, desenvolvimento e reprodução destes organismos patogênicos. É produzida em quantidades limitadas pela cana-de-açúcar, inviabilizando sua extração e purificação para produção de produtos comerciais, sendo a tecnologia de DNA recombinante uma alternativa para o aumento da sua produção. Atualmente, a CC é produzida no laboratório de Biologia Molecular do Departamento de Genética e Evolução da UFSCar (LBM-DGE/UFSCar) por de E. coli BL21(DE3) em mesa incubadora rotativa utilizando o meio de cultura comercial (Circlegrow®) de alto custo. Com a finalidade de se produzir CC em maior escala, o presente trabalho teve como objetivo o estudo da expressão de CC em E. coli BL21(DE3), avaliandose diferentes fontes de carbono, tipo de indutor e momento de indução, em mesa incubadora rotativa no sentido de se avaliar a expressão, bem como comprovar as novas condições de expressão em biorreator airlift de 6 L de capacidade útil. Nos ensaios em mesa incubadora rotativa foram obtidos crescimentos celulares semelhantes quando se utilizou glicerol, glicose, frutose e frutose + glicose, e baixo crescimento celular quando se utilizou galactose. Foi observada uma alta expressão quando se utilizou galactose como fonte de carbono e IPTG 0,4 mM como indutor. Quando foi utilizada lactose como indutor em concentrações de 4 e 40 mM, observou-se expressão de CC apenas nos cultivos com galactose como fonte de carbono. Foram obtidas produções volumétricas (mg/L) no máximo de 61% da concentração de CC obtida no cultivo padrão, com exceção dos cultivos com galactose induzidos com 0,4 mM de IPTG e 4 mM de lactose, e produção específica (mgCC/gcélula) com valores superiores a 75% do obtido no cultivo padrão. Quanto aos cultivos em biorreator airlift, expressão de CC foi superior à do cultivo realizado em mesa incubadora rotativa utilizando glicose como fonte de carbono, em torno de 80% da produção obtida no cultivo padrão após 1 hora de indução, alcançando 90% na segunda hora. Em termos de produção específica, nesse cultivo obteve-se 79,9 mgCC/gcélula após 2 horas de indução, cerca de 25% superior ao cultivo padrão.
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Morales, Álvares Alice da Cunha. "Obtenção e caracterização estrutural de uma leucil-aminopeptidase de Leptospira interrogans sorovar hordjo expressa em Escherichia coli "BL21-DE3"." reponame:Repositório Institucional da UnB, 2010. http://repositorio.unb.br/handle/10482/8027.
Full textAbstract:
Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010.Submitted by Washington da Silva Chagas (washington@bce.unb.br) on 2011-04-19T21:55:21Z No. of bitstreams: 1 2010_AlicedaCunhaMoralesAlvares.pdf: 3239774 bytes, checksum: 1a6bf8a22db3e2e23b2651cbe67dc9f1 (MD5)
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Neste trabalho apresentamos estudo biofísico e estrutural de uma leucil aminopeptidase (LAP), proteína recombinante expressa em Escherichia coli e presente em Leptospira interrogans sorovar Hardjo (LAPr-Li). Essa proteína está diretamente relacionada com a patogenicidade dessa bactéria e com a doença leptospirose em animais e humanos. A LAPr-Li foi obtida por transformação do vetor pET19b-HapepA em E. coli BL21-DE3, expressa a 20ºC, após indução com IPTG 0,3 mM, e purificada por cromatografia de afinidade e de exclusão molecular. Essa enzima apresenta atividade ótima na forma hexamérica em pH 8,5 e temperatura 50ºC. A LAPr-Li é formada por dímeros de trímeros formando o hexâmero, cuja atividade depende desta estrutura. A estrutura secundária é constituída de 44,7% de ?-hélice e 11,6% por folhas-?. A forma hexamérica, de diâmetro 15,2 nm e massa molecular 320 kDa, foi confirmada por ensaios de oligomerização dependentes da temperatura, por espalhamento de luz dinâmico. Estudos de atenuação de fluorescência, utilizando atenuadores carregados e neutros e ajustes de Stern-Volmer, revelaram que a proteína apresenta duas populações de triptofanos. A caracterização dos microambientes foi baseada nas constantes de Stern-Volmer (KSV) obtidas para atenuação com cloreto de césio, apresentou maior acesso aos resíduos de triptofanos, quando comparado ao iodeto de potássio, carregado negativamente. As constantes de atenuação de fluorescência para o césio foram KSV1= 38,6 M-1 e KSV2= 6,4 M-1 e para iodeto KSV1= 4,4 M-1 e KSV2= 0,4M-1. A estabilidade estrutural da LAPr-Li foi analisada a partir de curvas de desnaturação térmica e química obtidas por dicroísmo circular. A elevação da temperatura para 50ºC em pH 8,5 induziu modificações na estrutura secundária e, consequentemente, na conformação da proteína. As curvas de desnaturação térmica (25-95ºC) indicaram maior estabilidade estrutural da LAPr-Li nos pHs 3,0 e 5,0, onde nenhuma alteração estrutural e desnaturação foi observada. Em região alcalina (8,0, 8,5 e 9,0) a LAPr-Li não é desnaturada completamente, resultando, portanto, em valores de ?G25 mais baixos (~2,0 kcal.mol-1) comparados àqueles obtidos nos pHs 6,0 (3,52 kcal.mol-1) e 7,0 (6,63 kcal.mol-1), onde a proteína se desnaturou completamente. Esse último resultado foi confirmado com a curva de desnaturação, utilizando cloridrato de guanidina em água, onde a desnaturação completa da LAPr-Li resultou no valor de ?GH2O de 6,32 kcal. mol-1. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT
In this work we present the biophysical studies of the leucine aminopeptidase (LAP), a recombinant protein expressed in Escherichia coli and present in Leptospira interrogans serovar Hardjo (LAPr-Li). This protein is related to pathogenicity of the bacteria and the leptospirosis disease in animals and humans. The LAPr-Li was obtained by transformation of the vector pET19b-HapepA in E. coli BL21-DE3, expressed at 20°C after induction with 0.3 mM IPTG, and purified by affinity and size exclusion chromatography. The enzyme presents optimal activity as hexamer at pH 8.5 and 50°C. LAPr-Li is self assembled as hexamer from trimers of dimmers and its secondary structure consists of 44.7% α-helix and 11.6% for β-sheets. The hexamer with diameter of 15.2 nm and molecular weight 320 kDa was confirmed by dynamic light scattering oligomerization assays. Fluorescence decay studies using charged and neutral quenchers and Stern-Volmer fitting revealed two different populations of tryptophan (exposed and buried) in negatively charged microenvironment. The cesium chloride had greater access to tryptophan residues, when compared to potassium iodide, negatively charged. The constants of fluorescence decay for cesium was KSV1 = 38.6 M-1 and KSV2 = 6.2 M-1 and iodide KSV1 = 4.4 M-1 and KSV2 = 0.4 M-1. The structural stability of LAPr-Li was analyzed from thermal and chemical denaturation curves by circular dichroism spectroscopy. The increase of temperature to 50ºC at pH 8.5 induced secondary structure and conformational changes of the protein. It promotes flexibility of the enzyme that appears to be essential for enzymatic activity. The thermal denaturation curves (25-95ºC) indicated higher structural stability of LAPr-Li at pH 3.0 and 5.0 in which no denaturation profile was observed. At pH 8.0, 8.5 and 9.0 LAPr-Li was partially denatured resulting in lower values of G25 (~ 2.0 kcal.mol-1) compared to those obtained at pH 6.0 (3.52 kcal.mol-1) and 7.0 (6.63 kcal.mol-1), where the protein was completely denatured. The latter result was confirmed by denaturation using aqueous solution of guanidine hydrochloride, where the complete denaturation of LAPr-Li resulted in GH2O value of 6.32 kcal.mol-1.
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Castilla, Sedano Anderson Javier. "Producción del péptido antibiótico microcina J25 y evaluación de su efecto inhibitorio sobre las cepas de Escherichia coli: ATCC 10536, MG1655 y BLR(DE3) NOVAGEN®." Bachelor's thesis, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, 2021. https://hdl.handle.net/20.500.12672/16447.
Full textAbstract:
La crisis de resistencia a antibióticos es un problema que afecta tanto el ámbito de salud
como el de las actividades productivas tales como la acuicultura. Por ello, es necesario
buscar nuevas moléculas inhibidoras con potencial para que sirvan de base al desarrollo
de nuevos antibióticos. Una fase importante es el desarrollo de sistemas que permitan
ensayar de manera rápida múltiples moléculas candidatas. La presente tesis tiene como
objetivo producir el péptido antibiótico Microcina J25 y determinar la susceptibilidad de
tres cepas de Escherichia coli a este, con el fin de establecer la idoneidad de estas cepas
para la construcción de un sistema reportero. La Microcina J25 se obtuvo mediante
expresión recombinante e inducción controlada. De las tres cepas evaluadas, solo la
cepa ATCC 10536 mostró susceptibilidad al péptido antibiótico. El análisis bioinformático
comparativo de las secuencias de las proteínas involucradas en el ingreso de la
Microcina J25, FhuA, ExbB, ExbD y TonB, así como el de la subunidad β’ de la enzima
ARN polimerasa (blanco de la Microcina J25) no revelaron diferencias. Por otro lado, sí
se hallaron diferencias en la secuencia de la proteína SbmA, pero la información
disponible no permite concluir si estas desigualdades son la causa de la diferencia de
susceptibilidad observada. Se concluye que la cepa de Escherichia coli ATCC 10536 es
la más apropiada para construir el sistema reportero.
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Benevides, Kristina, Oscar Broström, Kalman Grim Elison, Hugo Swenson, Andrei Vlassov, and Josefin Ågren. "Stabil och antibiotikafri läkemedelsproduktion i rekombinant Escherichia coli." Thesis, Uppsala universitet, Institutionen för biologisk grundutbildning, 2017. http://urn.kb.se/resolve?urn=urn:nbn:se:uu:diva-323719.
Full textAbstract:
Den här rapporten presenterar ett antibiotikafritt, stabilt och kromosombaserat expressionssystem för läkemedelsproduktion i Escherichia coli på beställning av företaget Affibody AB. E. coli-stammen BL21(DE3) valdes som värdorganism för expressionssystemet. Systemet består av en genkassett som innehåller en T7-promotor, en 5′-UTR från genen ompA och en terminatorsekvens från RNA-operonet rrnB. Fyra kopior av genkassetten ska integreras i pseudogenerna caiB, yjjM, hsdS och yjiV. En datormodell som modellerar det egentliga kopietalet i cellerna har skapats i mjukvaran MATLAB, vilket visar att det uppskattas vara maximalt 32 kopior av genkassetten per cell på grund av replikation av kromosomen. Ett högt pH i fermentorn; att använda fed-batch och blandade kolhydratkällor; och att använda stammen BL21(DE3) minskar acetatproduktionen i cellen. En lägre acetatproduktion kan leda till en högre produkthalt. En proteinutbytesmodell för mjukvaran MATLAB har konstruerats för att uppskatta koncentrationen av Affibody®-molekylen i en E. coli cell.
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Correia, Tuana Oliveira. "Quitinase de Classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata): Estudo preliminar da expressão do gene, clonagem, expressão e purificação em Escherichia coli BL21(λ)DE3 e determinação da estrutura através da modelagem por homologia." reponame:Repositório Institucional da UFC, 2007. http://www.repositorio.ufc.br/handle/riufc/18295.
Full textAbstract:
CORREIA, Tuana Oliveira. Quitinase de Classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata): Estudo preliminar da expressão do gene, clonagem, expressão e purificação em Escherichia coli BL21(λ)DE3 e determinação da estrutura através da modelagem por homologia. 2007. 90 f.Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007.Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T14:28:51Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5)
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In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RTPCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81D1053 (resistant) e TE9741907F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CE31(resistant) e TE974111F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RTPCR with IT81D1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDSPAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijão de corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future.
No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressão de um gene de quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressão desse gene em células de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinação via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteína. A expressão do gene da quitinase de classe I de feijão-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. Nessas reações, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estágios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetível). A expressão foi avaliada também em folhas, raízes, epicótilo e hipocótilo de dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo nematóide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetível). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genômico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqüenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressão da proteína recombinante foi induzida na presença de IPTG 1mM. A proteína recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada através de um SDS-PAGE. A proteína purificada através de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com Níquel imobilizado não apresentou atividade quitinásica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios ativos das moléculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijão-de-corda parece apresentar expressão constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutações pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína, o que ainda deve ser elucidado no futuro.
Books on the topic "Escherichia coli HT115 (DE3)"
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Pérez Reytor,, Diliana Celeste. Identificación de nuevos marcadores de virulencia en cepas no toxigénicas de vibrio parahaemolyticus. Universidad Autónoma de Chile, 2019. http://dx.doi.org/10.32457/20.500.12728/87462019dcbm7.
Full textAbstract:
Vibrio parahaemolyticus es la principal causa de gastroenteritis transmitida por mariscos en todo el mundo. La virulencia de V. parahaemolyticus se ha atribuido hasta ahora principalmente a la hemolisina directa termoestable (TDH) y la hemolisina relacionada con TDH (TRH). Recientemente el Sistema de Secreción de tipo III del cromosoma II (T3SS2), el cual codifica para varios efectores, ha sido relacionado con citotoxicidad y enterotoxicidad. Después de la aparición y posterior caída de la cepa pandémica, se han notificado casos de diarrea producidos por cepas clínicas que carecen de los genes tdh, trh y T3SS2 en muchos países, incluido Chile. Estas cepas, llamadas “no toxigénicas”, constituyen el 9-10% de los casos de diarrea a nivel mundial y aunque se han hecho avances en la descripción de los factores de virulencia de V. parahaemolyticus, la capacidad de las cepas no toxigénicas para causar enfermedad no ha sido completamente entendida. El hecho de que los genes tdh y trh se utilizan para estimar la carga de cepas patógenas en los mariscos durante el análisis de riesgo llama la atención sobre cuán fiables son estos análisis para detectar la gran variedad de cepas potencialmente patógenas presentes en las aguas y productos marinos. Por otra parte se conoce que en Vibrio, la evolución de la virulencia, parece estar estrechamente asociada a su capacidad para generar diversidad genética, en parte, a través de la modificación de la expresión génica, aunque mayoritariamente a través de transferencia genética horizontal (HGT). Con base en lo descrito anteriormente, esta propuesta hipotetiza que las cepas no toxigénicas de Vibrio parahaemolyticus han adquirido nuevos factores de virulencia mediante transferencia genética horizontal. Es por ello que el objetivo de esta tesis es: Identificar y caracterizar nuevos factores de virulencia en cepas chilenas no toxigénicas de Vibrio parahaemolyticus adquiridos mediante transferencia génica horizontal. Esta tesis está organizada en tres capítulos, el capítulo 1 comprende el marco teórico, el planteamiento del problema, la hipótesis y los objetivos. El capítulo 2, correspondiente al desarrollo del objetivo 1, en el cual se caracteriza el genoma de seis cepas no toxigénicas de V. parahaemolyticus aisladas del Sur de Chile. Uno de los principales hallazgos de este estudio fue la variabilidad genética de estas cepas al analizar su genoma accesorio. Este análisis mostró además la presencia de nuevas islas genómicas y elementos tipo profagos que codifican toxinas como zonula occludens (Zot) y repeats-in-toxin (RTX), ambas descritas en otros patógenos como V. cholerae donde se consideran factores de virulencia, aunque últimamente se ha descrito que la pérdida de RTX no afecta la virulencia de esta bacteria. En el capítulo 3 y final de esta tesis, se aborda el objetivo 2 que corresponde a la caracterización de posibles nuevos factores de virulencia, en este caso, la toxina Zonula Occludens (Zot). Aunque se sabe que Zot aumenta la permeabilidad epitelial intestinal por interacción con el receptor celular de zonulina PAR2 y esta unión desencadena una cascada de eventos intracelulares que conducen al desensamblaje de las uniones estrechas intercelulares, lo que se ha asociado con la producción de la diarrea en V. cholerae, el potencial patógeno de Zot de V. parahaemolyticus no se ha investigado aún. La cepa clínica PMC53.7, tdh/trh/T3SS2/negativa, resultó ser altamente citotóxica en cultivo celular de Caco-2 y contiene en su genoma accesorio un gen homólogo de zot. Con este antecedente, se caracterizó la toxina Zot en la cepa clínica PMC53.7 de V. parahaemolyticus y sus efectos sobre la barrera epitelial intestinal. El gen zot de PMC53.7 se clonó y se expresó en Escherichia coli BL21(DE3) y los efectos sobre la barrera epitelial intestinal se examinaron usando el modelo celular Caco-2. Se evaluó el cambio en la distribución de las proteínas de transmembrana asociadas a uniones estrechas (ZO-1 y ocludina), y en la distribución de actina en monocapas de Caco-2. Tras el tratamiento con Zot, se observó una modificación de la morfología celular. El cambio en las distribuciones de ocludina y F-actina se observó como una fragmentación de los límites brillantes de las células, con áreas de baja y alta intensidad, lo que indica una pérdida y redistribución de las proteínas asociadas a uniones estrechas. Los resultados de este trabajo sugieren que V. parahaemolyticus Zot puede contribuir a la virulencia de cepas no toxigénicas. En resumen, estos estudios han arrojado información sobre la diversidad de cepas de V. parahaemolyticus del sur del Pacífico, en especial aquellas que no poseen los principales factores de virulencia descritos para este microorganismo. Además, se caracteriza por primera vez una toxina Zot de V. parahaemolyticus en una cepa aislada de un paciente. Finalmente, los ensayos preliminares realizados en cultivo celular demostraron un posible potencial patógeno de esta toxina en la barrera epitelial intestinal.
Conference papers on the topic "Escherichia coli HT115 (DE3)"
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Vasconcelos, Brenda Martins, Victor Guimarães Ribeiro, Tiago Souza Salles, Thayane da Encarnação Sá Guimarães, and Mônica Ferreira Moreira. "ANÁLISE DO EFEITO OVICIDA DO dsRNA QUITINA SINTASE NO MOSQUITO Aedes aegypti (DIPTERA: CULICIDAE)." In I Congresso Brasileiro de Biotecnologia On-line. Revista Multidisciplinar de Educação e Meio Ambiente, 2021. http://dx.doi.org/10.51189/rema/803.
Full textAbstract:
Introdução: O mosquito Aedes aegypti é o principal vetor das arboviroses dengue, chikungunya, Zika e febre amarela. Para que ocorra a produção e a maturação de ovos, as fêmeas do mosquito realizam o repasto sanguíneo, quando ocorre a infecção e transmissão viral. A melhor maneira de evitar a propagação destas doenças é através do controle vetorial. Inseticidas químicos são utilizados no controle, entretanto, ao longo do tempo, os mosquitos adquirem resistência a esses compostos. Neste contexto, o RNA de interferência (RNAi) tem sido uma grande alternativa para o controle. Os genes de quitina sintase (CHSA e CHSB) são considerados excelentes alvos de silenciamento, pois, não são transcritos em vertebrados e plantas. Objetivos: Analisar os efeitos do silenciamento dos genes CHSA e CHSB na oviposição dos mosquitos tratados com dsRNACHS em baixas concentrações. Materiaisemétodos: A produção de dsRNA foi feita in vivo através da transformação de Escherichia coli, cepa HT115 com o plasmídeo L4440, contendo o inserto para a região do sítio catalítico de CHSA e CHSB e GFP (gene não-relacionado para mosquitos), usado como controle. Estas culturas foram lisadas com clorexidina 0,5%. O experimento foi feito em triplicata biológica, utilizando 10 larvas de 4° instar por grupo em 2 mL de água. Foi utilizado, em ambas condições, a concentração 2x10-5 µg/mL de células contendo dsRNACHS ou dsRNAGFP. Os mosquitos adultos sobreviventes foram alimentados com sangue de aves para testar a capacidade de oviposição e a viabilidade dos ovos postos. Resultados: As fêmeas adultas oriundas das larvas tratadas com dsRNACHS tiveram menor postura de ovos, e estes apresentaram fenótipo de ressecamento e deformidades, acarretando baixa eclosão, quando comparados com o controle. Conclusões: Concluímos que o dsRNACHS administrado afeta a produção e a qualidade dos ovos das fêmeas de Ae. aegypti, sendo uma boa estratégia de controle para este inseto.
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Manlin, Xu, Chi Yuchen, Xie Hongfeng, and Chen Na. "The Prokaryotic expression of TasA protein of Bacillus subtilis strain A6 in Escherichia coli BL21(DE3)." In 2011 6th IEEE Conference on Industrial Electronics and Applications (ICIEA). IEEE, 2011. http://dx.doi.org/10.1109/iciea.2011.5976042.
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Liang, Rong, Song-Yi Lin, Jun Pu, Le Xu, Xiu-Juan Meng, and Lin-Zhu Ren. "Research on Optimal Proliferation Conditions of L-tryptophan Produced Recombinant Escherichia coli BL21 (DE3) / pET-28b-aroGM175." In 2015 International Conference on Medicine and Biopharmaceutical. WORLD SCIENTIFIC, 2016. http://dx.doi.org/10.1142/9789814719810_0150.
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Indriyani, A., S. Gaffar, F. P. U. Latifah, and I. P. Maksum. "Co-expression of recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) in Escherichia coli BL21 (DE3) with Bacillus cereus phospholipase C." In THE 8TH INTERNATIONAL CONFERENCE OF THE INDONESIAN CHEMICAL SOCIETY (ICICS) 2019. AIP Publishing, 2020. http://dx.doi.org/10.1063/5.0002067.
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