Academic literature on the topic 'Espécies reativas de nitrogênio (ERN)'

O presente manuscrito é focado sobre a relação entre hemoglobina, auto oxidação, geração de radicais livres (com especial ênfase em espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs)), e os processos bioquímicos e fisiológicos que ocorrem em algumas situações biológicas e patológicas, principalmente acidentes vasculares, tais como acidente vascular encefálico (“derrame”) e infarto do miocárdio (infarto do coração). De fato, os diversos tipos de radicais livres são completamente associados aos processos químicos dos acidentes circulatórios assim como as subsequentes lesões nos tecidos biológicos. Interessantemente, os acidentes circulatórios hemorrágico e isquêmico das doenças vasculares estão relacionadas à presença de diversas espécies de radicais livres. Este trabalho apresenta várias correlações entre estes agentes químicos e bioquímicos, favorecendo compreender o importante papel dos radicais livres neste tipo de doença. É também sugerido que a análise dessas espécies químicas poderia constituir uma estratégia para avaliar a evolução da doença circulatória.

Uma excessiva produção de espécies reativas pode ser prejudicial, superando a capacidade antioxidante e conduzindo a um desequilíbrio redox. A maioria das evidências da formação de espécies reativas em células musculares são "indiretas", ao passo que as evidências "diretas" ainda são escassas. As razões para este fato são múltiplas. Esta revisão sugere a utilização de sondas fluorescentes como DCFH (reativa ao H2O2), DAF-2 (reativa ao NO) e fluoróforo nitróxido (reativa ao O2·-) para determinação dessas espécies. Em adição, o presente estudo sugere que: 1) as medidas "indiretas" de ataque oxidativo em amostras sangüíneas não necessariamente refletem o ataque oxidativo ocorrido nas células musculares; 2) amostras de músculos isolados e homogenatos podem apresentar uma grande quantidade de tecido vascular contendo células endoteliais, hemácias e leucócitos, os quais podem gerar EROs e NO, dificultando a interpretação dos resultados; 3) as sondas fluorescentes DCFH-DA/DCFH, DAF-2-DA/DAF-2 e nitróxido são sensíveis na detecção do H2O2, NO e O2·- respectivamente, em tecido muscular durante contrações; 4) como método alternativo no estudo da produção de EROs e NO em músculo esquelético, culturas de células musculares e fibra muscular isolada são indicados como modelos experimentais.

Introdução. Entre os mecanismos biológicos que originam o qua­dro hiperglicêmico a predominância é do diabetes melittus (DM). O DM representa um grupo de desordens metabólicas caracterizadas por hiperglicemia crônica que ocasiona severas alterações celulares e teci­duais. Objetivo. O presente trabalho analisou através de revisão da literatura o comportamento de células gliais expostas a elevadas con­centrações de glicose, similares às observadas no DM. Método. Foi realizada uma revisão literária através de artigos científicos das bases de dados Pubmed, Science Direct, Scopus e Scielo. Resultados. Foram selecionados artigos e livros entre 1988 e 2009 que discutiam hiper­glicemia, sistema nervoso central e que relacionavam hiperglicemia e células gliais. Conclusão. A hiperglicemia crônica proporcionada pelo DM pode influenciar de maneira danosa o metabolismo cerebral exercendo ações sobre a atividade glial. Podendo afetar a sobrevivência neuronal através da excitotoxicidade glutamatérgica e da produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e de espécies reativas de nitro­gênio (ERN) que geram como consequência o processo de neuroin­flamação. Tal processo inflamatório pode resultar em dano e morte neural caracterizando um processo neurodegerativo.

Em experimento de campo num solo Podzólico vermelho-amarelo, textura superficial arenosa, localizado ná área experimental do Departamento de Solos da Universidade Federal de Santa Maria, foi avaliado o efeito de espécies de cobertura de inverno e de verão no suprimento parcial de nitrogênio e no rendimento de grãos de milho durante os anos agrícolas de1992/93 a 1994/95. Os tratamentos de inverno foram: (a) Consorciação aveia preta (Avena strigosa) + ervilhaca comum (Vicia sativa) + 130kg ha-1 de N mineral no milho e (b) Tremoço azul (Lupinus angustifolius) + 65kg ha-1 de N mineral no milho. Os tratamentos de verão foram: (a) Mucuna cinza (Stizolobium cinereum) e (b) Feijão-de-porco (Canavalia ensiformis), serneadas nas entrelinhas do milho, aproximadamente 100 dias após a semeadura do milho, com a aplicação de 65 kg ha-1 de N mineral no rnilho. As testemunhas foram pousio invernal sem N mineral para o milho, e pousio invernal + 130kg ha-1 de N mineral na cultura do milho. As espécies de verão acumularam o dobro de nitrogênio fitomassa, com destaque para o feijão-de-porco, em relação às espécies de inverno, porém a produção de matéria seca destas espécies de cobertura de verão e no milho em sucessão não foi proporcional a esta maior acumulação de nitrogênio. O rendimento de grãos de milho foi de 4.927, 5.191, 5.405 e 4.772kg ha-1 ern sucessão ao tremoço, mucuna, feijão-de-porco e pousio invernal + N mineral, respectivamente. Isto demonstra que as leguminosas com metade da adubação nitrogenada mineral atingiram níveis semelhantes ao pousio + N no milho, evidenciando a eficiência dessas espécies na fixação de N2 atmosférico e suprimento parcial de nitrogênio ao milho.

O estresse oxidativo constitui-se em uma ameaça constante para o organismo. Em virtude disto, uma série de defesas antioxidantes, além de sistemas de reparo em células evoluíram com o objetivo de proteção contra a destruição e danos ocasionados pelos radicais livres. As plantas produzem uma enorme variedade de antioxidantes que tendem a agir contra o dano celular por meio da remoção de espécies reativas de oxigênio e espécies reativas de nitrogênio. A Lippia origanoides Humboldt, Bonpland e Kunth, família Verbenaceae, é um arbusto aromático conhecido como “Alecrim-do-campo”, sendo responsável por variadas atividades farmacológicas e biológicas, inclusive a proteção antioxidante. Este trabalho teve como objetivo analisar a composição química do óleo essencial de L.origanoides HBK (OELO) e avaliar sua atividade antioxidante in vitro. Para tanto foi avaliado o potencial antioxidante in vitro pelos métodos potencial redutor, 2,2difenil-1-picrilhidrazila (DPPH), inibição da peroxidação lipídica (TBARS), radical hidroxila e oxido nítrico, nas concentrações de 100, 300 e 900 µM. Todas as concentrações apresentaram atividade antioxidante. O potencial redutor, as reduções da produção de TBARS e inibição do radical DPPH• mostraram-se superiores ao controle positivo, o ácido ascórbico, evidenciando uma alta presença de substâncias antioxidantes. Estes resultados sugerem que esta espécie é promissora para a produção de fitoterápico onde a atividade antioxidante seja de ação desejada.

Este artigo é uma revisão do efeito do estresse oxidativo (EO) no Transtorno Bipolar (TB). Esta doença é caracterizada como sendo crônica, grave, com alta morbidade, mortalidade e altas taxas de suicídio. É uma doença progressiva, com episódios cada vez mais curtos e frequentes ao longo do tempo. Modificações ocorrem no cérebro, como alterações na neuroplasticidade, neurotransmissão, falhas na apoptose, ativação no processo imunoinflamatório, com alterações na via de sinalização do cálcio, e mais recentemente, sobre o EO. Esses eventos envolvem uma reorganização patológica no cérebro e, portanto, estão associados a alterações morfológicas, como; redução do volume do córtex pré-frontal, do hipocampo e da amígdala aumentada. Essas alterações estruturais e bioquímicas são conhecidas como neuroprogressão, e apresentam diferenças entre o estágio inicial e final do TB. Neurônios e células da glia têm uma das mais altas demandas de energia, onde estas alterações bioquímicas e anatômicas afetam essas células e principalmente organelas, como as mitocôndrias. A mitocôndria é uma organela especializada que gera trifosfato de adenosina (ATP) sendo considerada a principal fonte de espécies reativas de oxigênio (EROs) e espécies reativas de nitrogênio (ERNs), produzidas pela cadeia de transporte de elétrons (CTE), levando assim ao EO. O papel do EO na fisiopatologia da TB tem sido investigado em vários estudos relatando mudanças nos níveis das enzimas antioxidantes, na peroxidação lipídica e do óxido nítrico (NO). Os mecanismos fisiopatológicos do TB contribuem para uma melhor compreensão da atividade da doença e podem revelar possíveis soluções para o diagnóstico e prognóstico.

Nas últimas décadas, com a transição epidemiológica e elevação da renda média da população, novos padrões de consumo e estilo de vida foram adotados. A partir de então, os alimentos passaram a ser vistos, além de seguros e atrativos, importantes na prevenção de doenças crônicas e manutenção do bem-estar físico e mental. Os radicais livres são espécies reativas de oxigênio e/ou nitrogênio que podem desempenhar funções benéficas ou deletérias no organismo. Entende-se, então, a importância do estudo dos alimentos com capacidade de anular os radicais livres e controlar o estresse oxidativo. As moléculas antioxidantes possuem a capacidade de capturar os radicais livres e evitar a propagação dos efeitos deletérios. Assim, uma dieta baseada em consumo variado eregular de alimentos frescos, in natura e com grande presença de frutas e hortaliças mostra-se indispensável no combate e prevenção à diversas doenças, especialmente às doenças crônicas não-transmissíveis.

OBJETIVO: Avaliar o efeito do pré-condicionamento isquêmico (PCI) em modelo de isquemia e reperfusão (I/R) pulmonar normotérmica em ratos, quantificando a produção de espécies reativas do oxigênio. MÉTODOS: Quarenta e sete ratos Wistar foram randomizados em quatro grupos: controle, sham, I/R e PCI. Após anestesia, animais do grupo controle foram sacrificados por decapitação, pneumonectomizados, e os pulmões esquerdos armazenados em nitrogênio líquido. Animais dos grupos sham, I/R e PCI foram anestesiados, traqueostomizados, ventilados, anticoagulados e submetidos a uma toracotomia esquerda com dissecção da artéria pulmonar esquerda para clampeamento. No grupo sham procedeu-se a dissecção da artéria pulmonar esquerda; no grupo I/R, clampeamento hilar total de 30 min e no grupo PCI, clampeamento da artéria pulmonar esquerda por 5 min seguido por reperfusão de 10 min e um clampeamento hilar total de 30 min. Pulmões foram reperfundidos por 90 min e ventilados com os mesmos parâmetros, acrescidos de pressão expiratória final positiva de 1 cmH2O. Foram obtidas medidas hemodinâmicas e gasométricas antes da toracotomia, antes do clampeamento hilar total, aos 30 e 90 min de reperfusão. A peroxidação lipídica foi estabelecida por meio da determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico. RESULTADOS: A determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico analisada nos grupos controle, sham, I/R, PCI não revelou diferenças significativas, o mesmo ocorrendo com a pressão parcial arterial de oxigênio, pressão parcial arterial de gás carbônico e medidas hemodinâmicas entre os grupos sham, I/R e PCI. CONCLUSÕES: O PCI de 5 min da artéria pulmonar esquerda em modelo de I/R in situ em ratos não atenua a lesão de I/R.

O envelhecimento pode estar associado ao maior acúmulo de lesões celulares decorrentes das espécies reativas do oxigênio e do nitrogênio derivadas do metabolismo mitocondrial. Com a progressão da idade, há acúmulo de proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA oxidados em relação a organismos jovens, de acordo com a teoria dos radicais livres. Entretanto, nem sempre os idosos ou animais envelhecidos apresentam maior estresse oxidativo que os jovens. Este artigo discute o paradoxo da teoria dos radicais livres de acordo com a teoria da biogênese da manutenção adequada do metabolismo mitocondrial. Diversos fatores podem contribuir para a redução do estresse oxidativo, como a hormese induzida pela prática regular de exercícios físicos, a restrição calórica, a ingestão de antioxidantes nutricionais e o aumento da produção de antioxidantes celulares que. Em conjunto, estes promovem a expressão das sirtuínas e das proteínas do choque térmico, protegendo a integridade e funcionalidade mitocondriais, reduzindo o estresse oxidativo e nitrosativo, o que está associado à redução do envelhecimento e aumento da longevidade.

As células da linhagem germinativa são sensíveis a ação do calor, sendo a termorregulação um fator determinante para o sucesso reprodutivo. O aumento da temperatura testicular pode ocorrer devido a fatores internos ou externos e contribui para o aumento da produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, induzindo, assim, a degeneração testicular e perda de células germinativas. Em adição, mudanças nos níveis de testosterona e de corticosteroides em animais submetidos ao estresse térmico podem ser observadas e interferem na capacidade reprodutiva dos mesmos. Por outro lado, em resposta ao calor e com finalidade protetora, há o aumento da síntese de proteínas de choque térmico (HSP). Desta forma, a quantidade e qualidade do sêmen e, consequentemente, a fertilidade são comprometidas pelo estresse térmico testicular, o que torna a realização de estudos que aprofundem o conhecimento sobre as alterações causadas indispensáveis, inclusive para a busca de terapias que preservem e reparem as funções testiculares.

Electrophoretic microsystems (EM) are powerful tools for the separation of species of microsystems analyzes which can easily be combined with electrochemical detection (ECD) and therefore making it ideal for a method of detection. However, the influence of high voltage at the working electrode used for the separation is a problem to be overcome due to the increased signal/noise ratio and possible damage of the electrode and/or the potentiostat. Thus, it was proposed in this thesis one EM hybrid PDMS / glass configuration with dual-channel potentiostat coupled to an electrically isolated in order to minimize the influence of high potential in the separation channel and improve the separation efficiency of the species and subsequently, improve detection limits. The EM contains two separate parallel channels 200 microns and a channel separation and another reference, and each containing a platinum electrode 15 or 50 μm placed about 1 to 4 μm in the channel. An electrode served as the working electrode, positioned in the separation channel, and another electrode as reference electrode, placed in the reference channel. This configuration associated with the electrically isolated potentiostat allowed the amperometric signals were measured without any change or potential interference arising from the high voltage applied separation. Aiming to evaluate the effectiveness of the methodology proposed in this thesis, samples nitrite, tyrosine and peroxynitrite (reactive nitrogen species – RNS), hydrogen peroxide (reactive oxygen species – ROS), ascorbic acid, glutathione and cysteine were injected into the channel containing the working electrode, while simultaneously boric acid buffer pH 11 containing TTAB was injected into the reference channel containing the reference electrode. From this configuration, we obtained a significant reduction in noise level (about 0.94 pA) and a relative improvement in the resolution ratified by electropherograms, compared with using single channel configuration. The limits of detection (LOD) for the chemical species mentioned above were 0.58 μM, 0.14 μM, 0.75 μM, 0.21 μM, 0.82 μM, was not obtained for cysteine and 1.63 μM, respectively. The efficiency can also be seen by analyzing nitrite performed on samples of perfusate blood of sheeps and rats, where have been detected a concentration of 68.05 μM and 22.04 μM, respectively, by the proposed method. It was also proposed in this thesis, microfabrication and evaluation of a PMMA electrophoretic microsystem with single channel configuration coupled to a base made of the same material to fix the microchip with electrochemical detection using a carbon paste electrode. The purpose of the construction of the base was to obtain, by fixing, reproducibility of events. And the microfabrication of PMMA EM aimed the viability of its use in analysis perspective as having the lowest cost per unit made due to the use of CO2 laser for microfabrication, which has a value considerably lower, compared with photolithographic processes. The evaluation of this system was performed through the analysis standards of serotonin and acetaminophen, which proved that the microfabrication of this system showed good reproducibility and repeatability of events, making it viable processing.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Os microssistemas eletroforéticos (MSE) são ferramentas poderosas para a separação de espécies em microssistemas de análises, onde pode ser facilmente combinada com detecção eletroquímica (DEQ) e tornando-se, portanto, um método de detecção ideal. No entanto, a influência da alta tensão no eletrodo de trabalho utilizada para a separação é um problema a ser contornado devido o aumento da relação sinal/ruído e possíveis danificações do eletrodo e/ou do potenciostato. Assim, foi proposto nesta tese um MSE híbrido de PDMS/vidro com configuração de duplo-canal acoplado a um potenciostato eletricamente isolado com objetivo de minimizar a influência do elevado potencial no canal de separação e melhorar a eficiência de separação das espécies e, subsequentemente, melhorar os limites de detecção. O MSE contém dois canais paralelos separados 200 μm, sendo um canal de separação e outro de referência, e cada um deles contendo um eletrodo de platina de 15 ou 50 μm colocados cerca de 1 a 4 μm dentro do canal. Um eletrodo serviu como eletrodo de trabalho, posicionado no canal de separação, e o outro eletrodo como eletrodo de referência, posicionado no canal de referência. Essa configuração associado ao potenciostato eletricamente isolado permitiu que os sinais amperométricos fossem medidos sem qualquer mudança de potencial ou de interferência oriunda da alta tensão de separação aplicada. Objetivando avaliar a eficiência da metodologia proposta nessa tese, amostras de nitrito e peroxinitrito (espécies reativas de nitrogênio – ERN), tirosina, peróxido de hidrogênio (espécie reativa de oxigênio – ERO), ácido ascórbico, glutationa e cisteína foram injetadas no canal contendo o eletrodo de trabalho, enquanto que simultaneamente o tampão de ácido bórico contendo TTAB pH 11 foi injetado no canal de referência contendo o eletrodo de referência. A partir desta configuração, obteve-se uma significativa diminuição no nível de ruído (cerca de 0,94 pA) e uma relativa melhora na resolução ratificadas pelos eletroferogramas, se comparado com a configuração que utiliza canal único. Os limites de detecção (LOD) para as espécies químicas supracitados foram de 0,58 μM, 0,14 μM, 0,75 μM, 0,21 μM, 0,82 μM, não foi obtida para a cisteína, e 1,63 μM, respectivamente. A eficiência também pode ser vista através das análises de nitrito realizadas em amostras de perfusato de sangue de ovelhas e ratos, onde foram detectados uma concentração de 68,05 μM e 22,04 μM, respectivamente, através da metodologia proposta. Foi proposto também nessa tese, a microfabricação e avaliação de um microssistema eletroforético de PMMA com configuração de canal único acoplado a uma base feita do mesmo material para fixar o microchip, com detecção eletroquímica usando eletrodo de pasta de carbono. O objetivo da construção da base foi obter, através da fixação, reprodutibilidade de eventos. E a microfabricação do MSE de PMMA objetivou a viabilidade do seu uso em análises tendo como perspectiva o baixo custo por unidade confeccionada devido ao uso de laser de CO2 para a microfabricação, o qual possui um valor agregado consideravelmente menor, se comparado com os processos fotolitográficos. A avaliação desse sistema foi feita através das análises de padrões de serotonina e acetaminofeno, onde comprovou-se que a microfabricação desse sistema apresentou boa reprodutibilidade e repetitividade de eventos, tornando-se viável o seu processamento.

A taurina (ácido 2-aminoetanosulfônico) é um β-aminoácido não utilizado para a síntese protéica, encontrada livremente no liquido intracelular e um dos aminoácidos livres mais abundantes nos leucócitos, cérebro, músculo esquelético, retina e coração, tendo um papel essencial em diversos processos biológicos. As propriedades antioxidantes da taurina já foram estudadas e testadas, no entanto, a maior parte dos estudos feitos até hoje utilizou concentrações menores do que as fisiológicas. O objetivo deste estudo é investigar as propriedades antioxidantes e de scavenger das concentrações fisiológicas de taurina (i.e.: 1, 15, 30 e 60 mM) contra diversas espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, utilizando diferentes técnicas in vitro. Nós achamos diferentes reatividades da taurina contra diferentes oxidantes testados. Nenhuma reatividade significativa entre taurina e peróxido de hidrogênio foi encontrada. Por outro lado, a taurina reagiu de forma significativa com óxido nítrico e superóxido. Da mesma forma, a taurina foi capaz de impedir a perda da atividade da superóxido dismutase (CuZnSOD) – um alvo descrito do ONOO- – causada por peroxinitrito in vitro. Além disso, a taurina pode agir como scavenger do radical peroxil e diminuir o dano ex vivo causado pelo tert-butilhidroperóxido em fatias de fígado de rato. Os dados deste trabalho demonstram que a taurina, em concentrações fisiológicas, pode ser um eficiente scavenger de diferentes espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, sugerindo um possível papel nas funções celulares e mitocondrial.
Taurine antioxidant properties have already been studied and tested, however most part of the studies used lower concentrations than physiological. This study was undertaken to investigate the scavenging and antioxidant activities of physiological concentrations of taurine (i.e.: 1, 15, 30 and 60 mM) against several reactive oxygen and nitrogen species, using different in vitro assays. We found different reactivity of taurine against different oxidants. No significant reactivity between taurine and hydrogen peroxide was found. Instead, taurine exhibited a significant reactivity with nitric oxide and superoxide. Also, taurine was able to restore superoxide dismutase activity loss caused by peroxynitrite in vitro. In addition, taurine can scavenge peroxyl radical and decrease the ex vivo damage caused by tert-butilhydroperoxide in rat liver slices. The aforementioned experimental data showed that taurine, at physiological concentrations, efficiently scavenge different reactive oxygen species and reactive nitrogen species, suggesting that these properties could be pivotal for the maintenance of cellular and mitochondrial functions.

O Brasil apresenta grande potencial para a exploração da apicultura, dado ao seu vasto território e flora diversificada, o que permite diferentes variedades de méis com propriedades únicas. O estado do Paraná é um dos maiores produtores de méis do país e o investimento em produção que atenda aos mercados mais exigentes estimulou a produção do mel orgânico. O conhecimento desde a antiguidade sobre os efeitos benéficos à saúde pelo mel vem estimulando a pesquisa deste alimento nobre. Assim, este trabalho teve por objetivo estudar méis orgânicos brasileiros certificados (MO) para a caracterização do perfil fenólico, volátil, além da avaliação da capacidade de sequestro das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Os méis foram coletados nos apiários de apicultores com certificação orgânica de dois municípios do sul do Paraná, General Carneiro e Turvo-PR. Nos ensaios foram utilizados extratos fenólicos dos méis, obtidos por meio da utilização da resina Amberlite® XAD®2, bem como méis brutos in natura. Os extratos apresentaram conteúdo de compostos fenólicos significativo, sendo o melato (MO5), de General Carneiro, o de maior teor (117,68± 4,40 mg EAG/g). Para as análises de sequestro das espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, os extratos fenólicos foram sempre superiores aos méis brutos in natura. Os extratos fenólicos, de maneira geral, apresentaram alta capacidade de sequestro para o radical peroxila (ROOo), ácido hipocloroso (HOCl) e óxido nítrico (NOo). Em relação aos melatos, o extrato MO7 apresentou alta capacidade para o sequestro do HOCl (EC50= 4,83 ± 0,13 ?g/mL), enquanto que o MO5 foi melhor para o sequestro do NOo (EC50=2,16 ± 0,18 ?g/mL). Pelo método HPLC-ABTS on-line foi possível identificar e quantificar a contribuição para a atividade antioxidante do ácido ferúlico no extrato (MO1) e do flavonoide kanferol na amostra (MO4). O ácido ascórbico foi identificado e quantificado por HPLC somente nos melatos (MO3, MO5 e MO7). Pela técnica de LC-MS/MS foram identificados a presença dos seguintes compostos fenólicos: ácido caféico, rutina e hesperidina em todos os extratos. A análise de compostos voláteis por SPME-CG/EM mostrou a presença de dois compostos, encontrados apenas nos melatos, que foram o terpineno-4-ol, que possui ação antifúngica, antiparasitológica e anti-inflamatória; e o 3,4-dimetil-1-deceno, podendo assim serem utilizados como marcadores químicos destes méis. O conhecimento da composição química destes méis, bem como a composição fenólica bioativa, contribui para o fornecimento de antioxidantes naturais para a dieta, atenuando assim os efeitos negativos dos radicais livres
Brazil has a great potential to explore beekeeping due to its vast territory and diversified flora, what allows different varieties of honeys with unique characteristics. Parana state is one of the largest honey producers and the investment in production that meets the most demanding markets stimulated the organic honey production. The knowledge since early in history regarding the beneficial health effects promoted by honey is stimulating the scientific research of this noble food. Thus, this paper aimed to study certified Brazilian organic honeys (MO) in order to determine the phenolic and volatile profiles, and also the evaluation of radical scavenging capacity against Nitrogen and Oxygen Reactive Species (RNS and ROS, respectively). The honeys were collected from apiaries from beekeepers with the organic certification from two municipalities of southern Parana, General Carneiro and Turvo, PR. In the essays, phenolic extracts were obtained from honeys by using Amberlite® XAD®2 resin, as well as crude in natura honeys. The extracts showed a significant content in phenolic compounds, with honeydew (MO5), from General Carneiro, showing the highest content (117,68 ± 4,40 mg AGE/g). For the analyzes to determine the radical scavenging capacity against RNS and ROS, the phenolic extracts always showed up superior results in comparison to crude in natura honeys. Phenolic extracts showed, in general, great capacity to scavenge peroxyl radical (ROOo), hypochlorous acid (HOCl) and nitric oxide (NOo). In relation to honeydews MO7 extract showed the highest capacity to scavenge HOCl (IC50= 4,83 ± 0,13 ?g/mL) while MO5 was the sample with better capacity to scavenge NOo (IC50=2,16 ± 0,18 ?g/mL). By using HPLC-ABTS on-line method it was possible to identify and to quantify the ferulic acid in MO1 extract, a compound with an important contribution to the antioxidant activity of this sample, as well as the flavonoid kaempferol in MO4 sample. Ascorbic acid was identified and quantified by HPLC only in the honeydew samples (MO3, MO5 and MO7). The analyzes developed by LC-MS/MS techniques indicated the presence of the phenolic compounds caffeic acid, rutin and hesperidin in all the extracts. The analysis of volatile substances developed by SPME-GC/MS promoted the identification of two compounds found only in the honeydew samples. The compounds were the terpinen-4-ol, which has antifungal, antiparasitological and anti-inflammatory activities; and 3,4-dimethyl-1-decene. Both compounds can be used as chemical markers of these honeys. The knowledge of the chemical composition of the studied honeys, as well as their bioactive phenolic composition, contributes to supply natural antioxidants to human diet, thus attenuating the negative effects of free radicals

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017.
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A febre é o aumento da temperatura corporal que ocorre principalmente em resposta a invasão do organismo por agentes patogênicos e desempenha papel importante na resposta imune de fase aguda e na defesa contra patógenos. Entretanto, a febre também causa efeitos prejudiciais em decorrência do aumento da taxa metabólica e do consumo de oxigênio. Assim, o balanço entre os danos e benefícios deve ser considerado ao se decidir tratar ou não tratar um paciente com antipiréticos. As espécies reativas de oxigênio e nitrogênio são geradas durante processos fisiológicos e patológicos, e podem atuar tanto como moléculas de sinalização celular, quanto como promotoras de estresse oxidativo e nitrosativo. Neste estudo, ratos Wistar machos receberam pré-tratamento oral com dipirona, ibuprofeno, celecoxibe ou n-acetilcisteína 30 min antes de injeção intravenosa de LPS ou veículo, o que levou a redução da resposta febril em todos os animais tratados. A concentração de EROs foi determinada por espectroscopia de ressonância paramagnética associada ao uso da spin probe CMH no sangue, fígado, tecido adiposo marrom (TAM) e hipotálamo de animais febris e tratados com os antipiréticos. Nossos resultados demonstraram aumento na produção de EROs 5 h após a indução de febre no fígado, TAM e hipotálamo e nenhum dos antipiréticos utilizados alterou o perfil dessa produção. Para a estimativa da produção de óxido nítrico, quantificou-se a concentração de HbNO no sangue. Os resultados demonstraram que a concentração de HbNO é 15 vezes maior nos animais que apresentam febre em relação aos controles. Dentre os grupos tratados, apenas a dipirona diminuiu a concentração de HbNO (- 66 %).Os dados desse trabalho sugerem que, durante a febre, há maior concentração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, que podem causar estresse oxidativo e nitrosativo e que a redução da biodisponibilidade de óxido nítrico pela dipirona pode contribuir para o mecanismo de ação desse fármaco.
Fever is the increase in body temperature that occurs primarily in response to invasion of the body by pathogens, and plays an important role in the acute phase of immune response and in defense against pathogens. However, fever also causes harmful effects as a result of increased metabolic rate and oxygen consumption. Thus, the balance between damages and benefits should be considered when deciding whether or not to treat a patient with antipyretics. The reactive species of oxygen and nitrogen are generated during physiological and pathological processes, and can act as both signaling molecules and as promoters of oxidative and nitrosative stress. In this study, male Wistar rats received oral pre-treatment with dipyrone, ibuprofen, celecoxib or nacetylcysteine 30 min prior to intravenous injection of LPS or vehicle, which led to a reduction in febrile response in all treated animals. The concentration of ROS was determined by paramagnetic resonance spectroscopy associated with the use of spin probe CMH in the blood, liver, brown adipose tissue (BAT) and hypothalamus of febrile animals treated with antipyretics. Our results demonstrated an increase in ROS production 5 h after induction of fever in the liver, BAT and hypothalamus, and none of the antipyretics used altered the profile of this production. For the estimation of the production of nitric oxide, the concentration of NOHb in the blood was quantified. The results demonstrated that the concentration of NOHb is 15-fold higher in the animals of LPS group compared to controls. Among the treated groups, only dipyrone decreased the concentration of NOHb (- 66 %). Data from this study suggest that during fever there is a higher concentration of reactive oxygen and nitrogen species, which may cause oxidative and nitrosative stress, and that reduction of the bioavailability of nitric oxide by dipyrone may contribute to the mechanism of action of this drug.

The production of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) is a metabolic situation, observed in different physiological conditions. When their production is exacerbated, there is an efficient antioxidant system able to control and re-install the homeostasis. Oxidative stress results from an acute and chronic imbalance between the production of ROS and antioxidant capacities of living cells and organisms. In the present case, the release of bursts of ROS and RNS by individual macrophages RAW 264.7 was investigated, in real time, in absence and presence of quinones (alpha- and beta-lapachones) and ascorbic acid. A selective electrochemical detection of each ROS or RNS was conducted at platinized carbon fiber microelectrodes positioned at micrometric distances from single cells, always compared to controls. The results show that the presence of beta-lapachone with 0.1 to 100 µM, within one hour of incubation, leads to a decrease of RONS release by macrophages. Conversely, when the incubation time increases (4 hours and more), for concentrations of 1 µM of ortho-quinone, the quantity of the released species increases. Finally, the increasing of the concentration up to 10 µM with four hours of incubation and more is associated to cell death. The exact nature of the released electroactive species was characterized and the original flux could be reconstructed in terms of O2• and NO•. In the first hour, with 10 µM, the decrease of the oxidative burst concerns mainly the RNS species. The amount of ROS, quantified in terms of H2O2 was shown to be higher than in control. At concentration of 1 µM and after longer time incubation, i. e., 4 hours, the amount of ROS, quantified in terms of H2O2 and O2• and NO2- was shown to be higher than in control. It was observed which ONOO- was decreased in both situations. On the other hand, alpha-lapachone was unable to significantly increase ROS and RNS production in macrophage cells, even after 24 hours of incubation. The cytotoxic concentration observed for alpha-lapachone was ten times higher when compared with beta-lapachone. To overcome solubility and bioavailability problems with beta-lapachone, beta-cyclodextrin was used. UV/vis spectroscopy has been used to monitor the inclusion phenomena of beta-lapachone within the cavity of beta-cyclodextrin, together with studies concerning the competitive effects of ethanol concentration on this behavior. A value of 15 ± 5 M-1 was found for the association constant between beta-lapachone and beta-cyclodextrin in phosphate buffer. This clearly indicates that the equilibrium between the free and the complexed substrate is decreased in the presence of EtOH. Amperometry at platinized carbon fiber ultramicroelectrodes allowed quantitative and kinetic investigations of the overall effect of ascorbic acid on oxidative stress responses produced by single cells pertaining to two different cell lines derived from immune cells: macrophages RAW 264.7 and phagocytes PLB-985. These fine and minute amperometric measurements performed on single cells confirmed that in contradiction with its alleged universal anti-oxidant properties, ascorbic acid may affect positively or negatively the RNS content of oxidative bursts produced by each cell type, through affecting the primary production of NO• by the cells. So, vitamin C acts exclusively as an anti-oxidant (viz., reduced the primary NO• flux) onto PMA-treated PLB 985 cells, thus decreasing the quantity of RNS released by these granulocyte-type cells. Conversely, it gives rise to a prooxidant activity (viz., increased the primary NO• flux) onto RAW267.4 macrophage cells, increasing their production of RNS species. These studies demonstrate the advantage of electrochemical methods for analyzing in real-time and quantitatively the effect of pharmacologically active compounds in cells, in case of oxidative burst.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), de nitrogênio (ERN), entre outras espécies reativas, é parte integrante do metabolismo e é observada em diversas condições fisiológicas. Quando sua produção é exacerbada, o organismo dispõe de um eficiente sistema antioxidante que consegue controlar e restabelecer o equilíbrio. O estresse oxidativo resulta do desequilíbrio entre o sistema pró e antioxidante, com predomínio dos oxidantes. A liberação de ERO e ERN em macrófagos individuais da linhagem RAW 264.7 foi estudada em tempo real, em ausência e presença de quinonas (alfa- e beta-lapachonas) e de ácido ascórbico. A detecção eletroquímica seletiva de ERO e ERN, em conjunto e individualmente foi conduzida, utilizando-se microeletrodos de fibra de carbono platinizada, posicionados a distâncias micrométricas de uma célula, sempre em relação a controles. Os resultados do tratamento com beta-lapachona (0,1 a 100 µM), com 1 hora de incubação, mostram que ocorre a diminuição de ERON liberados pelos macrófagos. Contrariamente, quando o tempo de tratamento aumenta (4 e 6 horas) para a concentração de 1 µM, ocorre o aumento da quantidade de espécies reativas liberadas. Em concentração de 10 µM e com tempo de tratamento acima de 4 horas ocorre morte celular. A natureza exata das espécies eletroativas liberadas foi caracterizada e o fluxo original foi determinado em termo de O2• e NO•. No tratamento de 1 hora com 10 µM de beta-lapachona, houve diminuição do surto oxidativo relacionado principalmente às ERNs. A quantidade de ERO, em termos de H2O2 foi muito maior do que o controle. Em diferentes condições, com 1 µM com 4 horas de tratamento, a quantidade de ERO, em termos de H2O2, O2• e NO2-, foi maior que o controle. Nas duas condições, obteve-se a diminuição acentuada de ONOO-. Por outro lado, a incubação com alfa-lapachona não foi capaz de alterar significantemente a liberação de ERON pelos macrófagos, mesmo após 24 horas de tratamento. A concentração citotóxica observada para a alfa-lapachona foi dez vezes maior quando comparada com a beta-lapachona. Para contornar problemas relacionados à solubilidade e biodisponibilidade da beta-lapachona, fez-se uso da ciclodextrina. A espectroscopia no UV/Vis foi utilizada para monitorar o fenômeno de inclusão de beta-lapachona na cavidade da beta-ciclodextrina, com análise do efeito competitivo do etanol. O valor da constante de associação entre a beta-lapachona e a beta-ciclodextrina, em tampão fosfato, foi de 15 ± 5 M-1, mostrando que a presença de etanol afeta a formação do complexo. A amperometria utilizando ultramicroeletrodos de fibra de carbono platinizada permitiu investigar quantitativa e cineticamente o efeito total do ácido ascórbico no surto oxidativo produzido por células individuais pertencentes a duas diferentes linhagens derivadas de células imunes: macrófagos (RAW 264.7) e fagócitos PLB-985. Medidas amperométricas finas realizadas em células individuais confirmaram que o ácido ascórbico pode estimular ou atenuar o surto oxidativo produzido por cada linhagem celular, afetando a produção primária de NO• das células. Assim, a vitamina C reduz o fluxo primário de NO• nas células PLB-985 pré-tratadas com PMA, enquanto aumenta o fluxo primário de NO• em macrófagos RAW 264.7. Esses estudos demonstram a vantagem dos métodos eletroquímicos para analisar em tempo real e quantitativamente o efeito farmacológico de compostos ativos em células, no caso de surto oxidativo.

A fenilcetonúria (PKU) é causada pela deficiência severa da atividade da fenilalanina hidroxilase (PAH), enzima responsável pela conversão de fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), levando ao aumento dos níveis sanguíneos e teciduais de Phe, bem como de seus metabólitos fenilpiruvato (PPA), fenilactato (PLA) e fenilacetato (PAA). Os pacientes com PKU apresentam disfunção neurológica severa, manifestando convulsões, retardo mental e psicomotor, sintomas que estão associados ao acúmulo desse aminoácido e seus metabólitos. A restrição dietética, que faz parte do tratamento da PKU, nem sempre é mantida pelos pacientes e pode afetar o status antioxidante devido à restrição de nutrientes. Estudos recentes em ratos e com pacientes fenilcetonúricos mostram que o estresse oxidativo (EO) pode estar envolvido na neurofisiopatologia dessa doença, possivelmente devido ao aumento na produção de espécies reativas, e diminuição das defesas antioxidantes. O cérebro, órgão afetado na doença, é extremamente sensível ao EO devido a baixas defesas antioxidantes, alta concentração de ferro e lipídeos insaturados. Aparentemente o fígado não é afetado na PKU, mas é um importante órgão de detoxificação e reservatório de GSH (tripeptídeo antioxidante). O ácido lipoico (AL) é um potente antioxidante facilmente adquirido da dieta, absorvido pelo organismo e tem sido sugerido em estudos para o tratamento e prevenção de EO em modelos de doenças neurodegenerativas. Um estudo recente demonstrou um efeito protetor do AL contra o EO gerado por uma concentração tóxica de Phe em cérebro de ratos jovens. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do AL na prevenção do EO gerado em um modelo crônico de PKU induzido por injeções diárias de Phe e α-metilfenilalanina (inibidor da PAH). No presente trabalho, o modelo de hiperfenilalaninemia (HPA) causou, no cérebro, aumento de dano a lipídeos, proteínas e DNA; aumento da atividade da superóxido dismutase e diminuição da atividade da catalase, além de mostrar que essas enzimas podem ter um papel importante neste processo, uma vez que suas atividades são afetadas diretamente pela presença de Phe e seus metabólitos. Também foi possível descrever algumas espécies reativas específicas geradas no processo oxidativo envolvido na HPA, como de H2O2, NO• e O2 •-. E ainda, identificou-se que o EO não está restrito ao cérebro e que o fígado pode ter um papel importante em defesa ao EO encontrado na doença. As enzimas glutationa peroxidase, glutationa redutase, glicose-6-fosfato desidrogenase e o conteúdo total de GSH foram diminuídos pela HPA em cérebro dos animais e a atividade da glutamato cisteína ligase foi aumentada. Já no fígado, todas as enzimas relacionadas ao metabolismo da GSH foram aumentadas pela HPA. O tratamento com AL foi capaz de prevenir as alterações enzimáticas além de impedir o dano a biomoléculas. O AL também preveniu o aumento da produção de H2O2 e NO• no cérebro dos animais submetidos ao tratamento de HPA. Quanto ao metabolismo da GSH, o AL foi capaz de manter as atividades enzimáticas aos níveis do controle além de restaurar a produção de GSH no cérebro dos animais afetados pela HPA. De acordo com os resultados, é possível que um tratamento com antioxidantes seja eficaz na manutenção da homeostasia redox nos pacientes servindo como uma abordagem terapêutica inovadora e adicional ao tratamento dietético já aplicado aos pacientes de PKU.
Phenylketonuria (PKU) is caused by a severe deficiency of phenylalanine hydroxylase (PAH), the enzyme responsible for the conversion of phenylalanine (Phe) to tyrosine (Tyr), leading to increased blood and tissue levels of Phe and its metabolites phenylpyruvate (PPA), phenylactate (PLA) and phenylacetate (PAA). Patients with PKU have severe neurological dysfunction, characterized by seizures, mental retardation and psychomotor symptoms that are associated with the accumulation of this amino acid and its metabolites. A restrict diet important for PKU treatment, is not always maintained by patients and this can affect the antioxidant status due to nutrient limitation. Recent studies in rats and patients with PKU show that oxidative stress may be involved in the neuropathophysiology of this disease, possibly due to increased production of reactive oxygen species and decreased antioxidant defenses. The brain, organ affected in the disease, is extremely sensitive to oxidative stress due to low antioxidant defenses and high concentrations of Fe and unsaturated lipids. Apparently, the liver is not affected in PKU, but it is an important organ of detoxification and GSH reservoir (tripeptide antioxidant). Lipoic acid (LA) is a potent antioxidant easily acquired from the diet, absorbed by the body and has been suggested for the treatment and prevention of oxidative stress in different neurodegenerative diseases in many studies. A recent study showed a protective effect of LA against the oxidative stress generated by a toxic concentration of Phe in the brain of young rats. The aim of this study was to evaluate the effect of LA in preventing the oxidative stress generated in a chronic model of PKU induced by daily injections of Phe and α-methylphenylalanine (PAH inhibitor) for 7 days. The hyperphenylalaninemia (HPA) model caused in brain an increase of damage to lipids, proteins and DNA; increased superoxide dismutase activity and decreased catalase activity, showing that these enzymes may play an important role in this process, since their activities are directly affected by the presence of Phe and its metabolites. It was also reported some specific reactive species generated in the oxidation process involved in HPA as H2O2 , NO• and O2 • -. In addition, it was found that oxidative stress is not restricted to the brain, and the liver may play an important role in defense to oxidative stress found in the disease. Activities of glutathione peroxidase, glutathione reductase, glucose-6-phosphate dehydrogenase and total content of GSH were decreased by the HPA in the brain of animals and the activity of GCL was increased. In the liver, all enzymes related to GSH metabolism were increased by the HPA. Treatment with LA was able to prevent the enzymatic changes in addition to preventing damage to biomolecules. The overproduction of H2O2 and NO• by HPA model was inhibited by LA treatment. Regarding to GSH metabolism, LA was able to maintain enzyme activities and GSH production at control levels in the brain of animals affected by HPA. According to our results, it is possible that a treatment with antioxidants is effective in maintaining redox homeostasis in patients and may be a novel therapeutic approach additional to dietary treatment already applied to PKU patients.

In biological systems, several metabolic and environmental factors are responsible for the production of reactive oxygen (ROS) and nitrogen (RNS) species. The exacerbated production of these reactive species or the significant decrease in the effectiveness of the defenses against them causes the redox imbalance, with consequent damage to biological macromolecules, which is associated to the emergence and progression of several diseases. Among the exogenous antioxidants, phenolic compounds of plants have been highlighted by their ability to scavenge various reactive species. Among the most studied plants, Curcuma longa has many beneficial properties for health, which are mainly associated with the phenolic compounds present in the rhizome, known as curcuminoids (curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin), but the benefits are more particularly attributed to curcumin. Thus, the objective of this study was to investigate the antioxidant capacity of C. longa extracts and to determine their contents in curcuminoids, investigating the antioxidant action of the extract and of each isolated curcuminoid against ROS and RNS. The identification and quantification of curcuminoids, the total phenols content analysis and the antioxidant capacity in terms of scavenging of the 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical (DPPH•) and the FRAP method (ferric reducing antioxidant power) were carried out for methanol (CM), defatted methanol (CHM), ethanol (EC) and hexane (CH) extracts, besides commercial extract (ExtFarC) of C. longa. The elimination capacity of ROS and RNS was performed for CE and isolated curcuminoids (curcumin, demethoxycurcumin and bisdemethoxycurcumin). The CM, CHM and CE had shown the three curcuminoids in their compositions, while, for the ExtFarC, curcumin was the predominant compound. The CE and ExtFarC had shown the higher total phenols content and antioxidant activity by the FRAP method, besides the lower IC50 values for to the DPPH• radical. The use of high performance liquid chromatography (HPLC) with spectrophotometric detection (DPPH•-HPLC-UV) indicated that curcumin and demethoxycurcumin had the greater potential for capture of DPPH•, as observed by the reduction of their peaks in HPLC, at equivalent contact time. In the experiments related to hypochlorous acid (HOCl), nitric oxide (•NO) and peroxynitrite (ONOO‾), the curcuminoids had shown a direct efficiency toward their elimination, similarly to the positive control (quercetin). For CE, despite showing higher IC50 values against these species, in comparison to the isolated compounds, it presented lower IC50 values, when compared to other plants’ extracts, studied by the same methods. Although curcumin is the target of many therapeutic studies for a number of diseases, the present data show that the three curcuminoids can play essential roles against ROS and RNS, and thus, may be considered promising in the prevention and treatment of diseases related to oxidative stress.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Em sistemas biológicos, diversos fatores metabólicos e ambientais são responsáveis pela produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio (ERNs). Quando a produção é exacerbada ou quando há uma diminuição significativa na eficácia das defesas contra essas espécies, ocorre o desequilíbrio redox, causando danos a macromoléculas biológicas, o que está associado ao surgimento e progressão de várias doenças. Dentre os antioxidantes exógenos, os compostos fenólicos de plantas têm se destacado pela capacidade de sequestrar diversas espécies reativas. Das plantas mais estudadas, a Curcuma longa apresenta inúmeras propriedades benéficas para a saúde, que são principalmente associadas aos compostos fenólicos presentes no rizoma, conhecidos como curcuminoides (curcumina, desmetoxicurcumina e bisdesmetoxicurcumina), porém os benefícios são mais particularmente atribuídos à curcumina. Dessa forma, o objetivo do estudo foi avaliar a capacidade antioxidante de extratos de C. longa e determinar seus curcuminoides constituintes, investigando a ação antioxidante do extrato e de curcuminoides isolados contra as EROs e ERNs. A identificação e quantificação de curcuminoides, o conteúdo total de fenóis e a capacidade antioxidante, em termos de sequestro do radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazila (DPPH•) e pelo método de FRAP (do inglês, ferric reducing antioxidant power), foram realizados para os extratos metanólico (CM), metanólico desengordurado (CHM), etanólico (CE), hexânico (CH) e para o extrato comercial (ExtFarC) de C. longa. A capacidade de eliminação das EROs e ERNs foi realizada para o CE e para os curcuminoides (curcumina, desmetoxicurcumina e bisdesmetoxicurcumina). Os extratos CM, CHM e CE apresentaram, em suas composições, os três curcuminoides, enquanto o ExtFarC apresentou a curcumina como componente majoritário. O extrato etanólico (CE) e o ExtFarC apresentaram maior conteúdo total de fenóis e atividade antioxidante pelo método de FRAP e menores valores de IC50 frente ao radical DPPH•. Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com detecção espectrofotométrica (DPPH•-CLAE-UV) indicou que a curcumina e a desmetoxicurcumina apresentaram maior potencial de captura de DPPH•, observado pela redução de seus picos em CLAE, em tempos de contato equivalentes. Nos experimentos de capacidade de eliminação das EROs e ERNs, os curcuminoides apresentaram atividade semelhante ao controle positivo (quercetina) frente ao ácido hipocloroso (HOCl), óxido nítrico (•NO) e peroxinitrito (ONOO‾), mostrando-se eficientes de forma direta contra essas espécies. O extrato CE, apesar de exibir maiores valores de IC50 para essas espécies, quando comparado aos compostos isolados, apresentou valores de IC50 inferiores, em comparação com extratos de outras plantas estudados pelos mesmos métodos. Apesar de a curcumina ser o alvo de estudos com finalidade terapêutica para inúmeras doenças, os dados evidenciam que os três curcuminoides têm papel potencial contra as EROs e ERNs, desta forma são promissores na prevenção e tratamento de doenças relacionadas ao estresse oxidativo.

Sepse, a resposta do organismo a uma infecção, está associada a altas taxas de mortalidade. A razão pela qual um mecanismo protetor resulta num quadro clínico fatal permanece inexplicada. Em trabalho prévio nosso grupo demonstrou que exossomos de origem plaquetária são os mais freqüentes em plasma de pacientes com choque séptico e que estes podem induzir apoptose em células musculares lisas vasculares e células endoteliais em cultura. Demonstramos ainda que tais exossomos possuíam uma fonte enzimática de ROS, uma NADPH oxidase cuja atividade poderia estar associada à indução da apoptose (Janiszewski et al., 2004). No presente trabalho, nós buscamos criar um modelo de geração ex vivo de exossomos similares aos encontrados em pacientes sépticos e identificar possíveis vias responsáveis pela liberação destes e seus efeitos. Choque séptico é uma condição relacionada com exposição a lipopolissacarídeo (LPS) e geração de alta quantidade de trombina, TNF e espécies reativas de nitrogênio. Através de citometria de fluxo revelamos que plaquetas humanas expostas ao doador de NO dietilamina-NONOato e ao LPS geraram exossomos similares àqueles encontrados em pacientes com choque séptico, expondo alta quantidade de tetraspaninas CD9, CD63 e CD81 mas pouca fosfatidilserina. Por outro lado, plaquetas expostas à trombina ou TNF liberaram partículas com características claramente distintas, com alta exposição de fosfatidilserina e baixa de tetraspaninas. Assim como os exossomos sépticos, os exossomos obtidos pela exposição de NO e LPS geraram radical superóxido e NO, como demonstrado pela quimioluminescência da lucigenina (5M) e celenterazinina (5M) e pela fluorescência da 4,5-diaminofluoresceína (10mM) e 2,7-diclorofluoresceína (10mM). A análise por Western Blot nos permitiu identificar as subunidades Nox1, Nox2 e p22phox da NADPH oxidase e a isoforma induzível da enzima NO sintase (NOS) nesses exossomos. Como esperado, inibidores da NOS e da NADPH oxidase reduziram significamente os sinais fluorescentes e quimioluminescentes. Em adição, as células endoteliais em cultura expostas aos exossomos gerados por dietilamina-NONOato e LPS sofreram significativo aumento da taxa de apoptose quando comparadas àquelas expostas a exossomos controle. A inibição da NADPH oxidase assim como da NOS reduziu expressivamente tal efeito. Adição de urato (1mM), mostrou efeito aditivo sobre a inibição do sinal fluorescente, assim como redução adicional da taxa apoptótica, sugerindo papel importante do radical peroxinitrito. Nós propomos, assim, que exossomos derivados de plaquetas podem representar papel adicional no já complexo cenário da sinalização vascular redox. Nesse sentido, uma abordagem baseada em exossomos pode fornecer novas ferramentas para o entendimento e até tratamento da disfunção vascular na sepse
Sepsis, the bodys response to infection, is associated with high mortality rates. Why a protective mechanism turns into a deadly clinical picture is a matter of debate, and goes largely unexplained. In previous work we demonstrated that plateled derived exosomes are found in the plasma of septic patients with septic shock and can induce endothelial and vascular smooth muscle cell apoptosis in culture through an enzymatic superoxide source (Janiszewski et al., 2004). In this work we sought to create a model for ex vivo generation of exosomes, and to identify the pathways responsible for ROS release by exosomes and their effects. Septic shock is a condition related to exposure of lipopolysaccharide (LPS), generation of high amounts of thrombin, TNF and nitrogen reactive species. Through flow cytometry we demonstrated that human platelets exposed to the NO-donor diethylamine-NONOate, and to LPS, generated exosomes similar to those found in the blood of septic shock patients, with high exposure of the tetraspanin CD9, CD63, and CD81, but little phosphatidylserine. On the other hand, platelets exposed to thrombin or TNF released particles with clearly distinct characteristics, such as high phosphatidylserine and low tetraspanin. Like the septic exosomes, the exosomes obtained by NO and LPS exposure generated superoxide radical and NO, as disclosed by lucigenin and coelenterazine chemiluminescence and by 4,5-diaminofluorescein and 2,7-dichlorofluorescein fluorescence. Western Blot analysis revealed the presence of Nox1, Nox2 and p22phox NADPH oxidase subunits and the inducible isoform of NO synthase (NOS) in these exosomes. As expected, NOS inhibitors or NADPH oxidase inhibitors significantly reduced the fluorescence and chemiluminescente signals. In addition, endothelial cells exposed to NO or LPS generated exosomes underwent apoptotic death, while control exosomes had no effects on apoptosis. NADPH oxidase as well as NOS inhibition significantly reduced apoptosis rates. Concomitant generation of NO and superoxide suggests biological effects of the highly reactive radical peroxynitrite. In fact, the peroxynitrite scavenger urate (1 mM) showed an additive effect on fluorescent signal inhibition, as well as on endothelial apoptosis rate reduction. We thus propose that platelet-derived exosomes may be another class of actors in the complex play known as vascular redox signaling. In this sense, an exosome-based approach can provide novel tools for further understanding and even treating vascular dysfunction related to sepsis

Estudos demonstram o envolvimento do superóxido vascular (O-2) na hipertensão arterial, associado à menor vasodilatação, decorrente da redução na biodisponibilidade de óxido nitrico (NO). O treinamento físico (TF) aeróbio tem sido mostrado eficiente em diminuir a pressão arterial em hipertensos, associado a melhora da função endotelial. Entretanto, os mecanismos pelos quais o TF modula a vasomotricidade não são completamente conhecidos. O Objetivo foi avaliar o efeito TF aeróbio (natação, 10 semanas) na resposta vasomotora em aorta de ratos espontaneamente hipertensos (SHR), destacando-se o a produção de O-2 e do NO nesta resposta. Os ratos SHR apresentaram menor resposta vasodilatadora à ACh, bem como vasoconstrição em concentrações elevadas de ACh. Além disso, os ratos SHR apresentarm maior índice de produção de O-2 , menor biodisponibilidade de NO e maior expressão protéica das enzimas eNOS e NOX 4. O TF de natação foi capaz de melhorar a resposta vasodilatadora dependente do endotelio, associado a diminuição do conteúdo de O-2 e aumento da biodisponibilidade de NO em aortas dos ratos. Os resultados demonstram que o TF aeróbico de natação promove redução do estresse oxidativo vascular, aumenta a biodisponibilidade de NO e aumenta a vasodilatação endotélio dependente. Estas alterações vasculares parecem contribuir para a redução da pressão artera nos ratos SHR treinados
Experimental and clinical evidence indicates that vascular superoxide (O-2) play an important pathophysiological role in the development of hypertension, associated with decreased nitric oxide (NO) bioavailability and impaired endothelial-dependent vasorelaxation. Aerobic exercise trainning (AET) decrases blood pressure and improves enthotelial-dependent vasorelaxation in hypertensive. However, the molecular mechanism of trainning-induced improvement of vasomotricity is not completry understood. The purpose of this study was examine the effect of AET (swimming, 10 wk) on the aorta function in SHR rats, emphasizing the O-2 and NO production indices. Resultas: SHR rats showed decreased maximal vasorelatation and paradoxical vasocontriction at high doses of ACh. This resposnes was related to increased O-2 and decreased NO bioavailability, associated with increased expression of eNOS and NOX-4. On the other hand, swimming AET improved the endothelial-dependent vasorelaxation, which were associated with decreased O-2 and improved NO bioavailability. Conclusion: the results show that swimming AET reduces vascular oxidative stress, improves No biodisponibility and increases endotelium-dependent vasorelaxation in SHR rats. These changes may be involved in blood pressure reducton in trained SHR rats

Introdução: A Demência é uma condição em que ocorre perda da função cerebral, neuroinflamação e estresse oxidativo. O Resveratrol (RSV) é um polifenol com ação antioxidante e anti-inflamatória. Objetivo: Verificar se o RSV exerce efeito antioxidante e anti-inflamatório de forma similar em leucócitos isolados de idosos com ou sem demência. Material e Métodos: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética da UFMG (CAAE: 14846619.7.0000.5149). Foram realizados os ensaios de viabilidade celular para determinar as concentrações de RSV (5µM) e H2O2 (150µM). A análise de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) foi realizada pelo ensaio de quimioluminescência. A quantificação de Espécies Reativas de Nitrogênio foi realizada pela dosagem de Óxido Nítrico (NO) via método de Griess. O perfil inflamatório foi analisado pela dosagem das citocinas pró-inflamatórias (TNF e IL-6) e anti-inflamatória (IL-10) por kits comerciais. Os resultados foram expressos em média ± DP (p<0,05). Resultados: Foi observada uma maior produção basal de ROS nos idosos com demência quando comparado ao grupo controle (~260%). O RSV foi capaz de reduzir a produção de ROS em ambos os grupos (Controle ~90% e Experimental ~60%). O tratamento com H2O2 foi capaz de gerar um ambiente oxidante em ambos os grupos e H2O2+RSV foi capaz de diminuir a produção de ROS também em ambos os grupos (Controle ~88% e Experimental ~71%). Observou-se um aumento de NO nos tratamentos com RSV no grupo controle enquanto no grupo com Demência os valores eram aproximadamente 10x maiores. Na análise dos marcadores inflamatórios, observou-se um aumento de TNF e IL-6 e diminuição de IL-10 mais acentuados nos portadores de Demência, onde o RSV teve uma menor capacidade de ação. Conclusão: O RSV atuou como antioxidante e anti-inflamatório em ambos os grupos, porém de forma menos eficaz no grupo com Demência. Tais resultados são importantes para auxiliar na conduta clínica.