Dissertations / Theses on the topic 'Espécies reativas de oxigénio (ERO)'

Dietas hiperlipídicas e a esteatose hepática são condições extremamente prevalentes. Trabalhos anteriores mostraram que a esteatose está associada a um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), e que isso pode mediar danos no fígado. Neste trabalho nós investigamos os possíveis mecanismos que desencadeiam os aumentos nas taxas de geração de ERO por meio da administração de dietas hiperlipídicas. Nós descobrimos que mitocôndrias de animais sujeitos a dietas hiperlipídicas não apresentaram diferenças significativas quanto a capacidade respiratória máxima e acoplamento, mas eram capazes de gerar mais ERO especificamente quando usados substratos do metabolismo de ácidos graxos. Além disso, foi observado que muitas isoformas de acil-CoA desidrogenases estavam mais expressas nos fígados de animais alimentados pela dieta hiperlipídica. No entanto, quando realizados ensaios de atividade enzimática apenas a acil CoA desidrogenase de cadeia longa (VLCAD) foi mais ativa. Estudos conduzidos com mitocôndrias permeabilizadas e expostas a grupos acil-CoA de diferentes tamanhos sugerem que a VLCAD pode ser uma fonte da produção aumentada de ERO em animais submetidos a dietas hiperlipídicas. Esta produção foi estimulada pela ausência de NAD+. Concluindo, nossos estudos descobriram uma nova fonte importante na geração de ERO estimulada por dietas hiperlipídicas, a VLCAD<br>High fat diets and accompanying hepatic steatosis are highly prevalent conditions. Previous work has shown that steatosis occurs concomitantly with enhanced reactive oxygen species (ROS) generation, which may mediate further liver damage. Here we investigated mechanisms leading to enhanced ROS generation following high fat diets (HFD). We found that mitochondria from HFD livers present no differences in maximal respiratory rates and coupling, but generate more ROS specifically when fatty acids are used as substrates. Indeed, many acyl-CoA dehydrogenase isoforms were found to be more highly expressed in HFD livers, although only the very long chain acyl-CoA dehydrogenase (VLCAD) was more functionally active. Studies conducted with permeabilized mitochondria and different chain length acyl-CoA derivatives suggest that VLCAD is a source of enhanced ROS production in mitochondria from HFD animals. This production is stimulated by the lack of NAD+. Overall, our studies uncover VLCAD as a novel, diet-sensitive, source of mitochondrial ROS

Trabalho apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas<br>Os efeitos de várias substâncias, sejam elas fármacos ou não, vão sendo acumulados durante toda a vida de um organismo. Alguns desses efeitos podem ser mais pronunciados relativamente a outros, pelo que vão desencadear respostas mais acentuadas e marcadas. Ao longo deste trabalho, foram estudados os efeitos que alguns fármacos poderão exercer em sistemas biológicos, nomeadamente ao nível do stress oxidativo, incluindo a indução de alterações deletérias em lípidos, proteínas e DNA; paralelamente, fez-se uma análise da resposta biológica em relação à presença de agentes oxidantes, que envolve o metabolismo antioxidante. Entende-se por stress oxidativo, uma situação em que ocorre um desequilíbrio entre o sistema de defesa antioxidante e a produção de compostos oxidantes, que contribui para a geração de radicais livres. Contudo, existem mecanismos de defesa, que tanto podem ser enzimáticos, (ex.: certas enzimas, como a superóxido dismutase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e catalase), como podem ser não enzimáticos (incluem-se nesta categoria certas vitaminas, como a vitamina A, vitamina E, flavonóides e flavonas). The effects from multiple substances, either drugs or not, accumulate during an organism life time. Some of these effects may have a deeper impact than others, triggering sharper and more intense responses. Throughout this dissertation project, the effects that some drugs have on biological systems we be studied, namely at the level of oxidative stress, including inducing deleterious changes in lipids, proteins and DNA. At the same time, an analysis was made about the biological response concerning the presence of oxidizing agents, which involves the metabolism antioxidant. Oxidative stress refers to a situation where an imbalance occurs between the antioxidant defense system and production of oxidizing compounds, which contributes to the generation of free radicals. However, there are defense mechanisms, which can be either enzymatic (certain enzymes such as superoxide dismutase, glutathione peroxidase, glutathione reductase and catalase), as can be non-enzymatic (including on this category certain vitamins, such as vitamin A, vitamin E, flavonoids and flavones).

Submitted by Maurílio Figueiredo (maurilioafigueiredo@yahoo.com.br) on 2013-03-06T19:19:24Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PolpaAçaíModula.PDF: 1709102 bytes, checksum: 4c2b43a647e6c66927e9ba80f372d500 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Neide Nativa (neide@sisbin.ufop.br) on 2013-03-13T19:37:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PolpaAçaíModula.PDF: 1709102 bytes, checksum: 4c2b43a647e6c66927e9ba80f372d500 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2013-03-13T19:37:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_PolpaAçaíModula.PDF: 1709102 bytes, checksum: 4c2b43a647e6c66927e9ba80f372d500 (MD5) Previous issue date: 2011<br>Açaí (Euterpe oleracea Mart.) recentemente foi identificado como uma fonte promissora de antioxidantes naturais. O estresse oxidativo e a redução dos mecanismos de defesa antioxidante são fatores importantes no desenvolvimento das complicações do diabetes. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar o possível efeito protetor da polpa de açaí sobre a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) por neutrófilos e sobre o sistema de defesa antioxidante hepático em ratos controle e diabéticos. Ratas Fischer foram divididas em 4 grupos de 8 animais de acordo com o tratamento recebido, Controle (C), Açaí (A), diabético (D), e diabético + açaí (DA). O diabetes foi induzido por uma única injeção intraperitoneal de estreptozotocina (35mg/kg de peso corporal) no primeiro dia do experimento. Os grupos C e D receberam dieta padrão (AIN-93), os grupos A e DA receberam dieta padrão acrescida com 2% da polpa de açaí. Ao final de 4 semanas os animais foram anestesiados e eutanasiados. A suplementação da dieta com 2% da polpa de açaí por 30 dias aumentou os níveis de mRNA para γ-glutamilcisteína sintetase (γ-GCS) e glutationa peroxidase (GPx) no tecido hepático, aumentou o conteúdo de glutationa total e reduziu a produção de EROs por neutrófilos em ratos controle. Os ratos diabéticos apresentaram redução na expressão de mRNA que codificam para a Zn-superóxido dismutase (Zn-SOD), GPx and γ-GCS e aumento nos níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e proteínas carboniladas quando comparado aos ratos controle. A suplementação com a polpa de açaí não alterou a expressão de enzimas antioxidantes em ratos diabéticos, no entanto apresentou efeito protetor, através da redução da peroxidação lipídica e aumento de glutationa total no fígado desses animais. Esses resultados sugerem que a polpa de açaí pode modular a produção de ROS por neutrófilos a apresentar efeito favorável sobre o sistema de defesa antioxidante hepático. _________________________________________________________________________________________<br>ABSTRACT: Açai (Euterpe oleracea Mart.) has recently been identified as a promising source of natural antioxidants. Because increased oxidative stress and impaired antioxidant defense mechanisms are important factors in the development of diabetic complications, the present study was undertaken to evaluate the possible protective effects of açai on the production of reactive oxygen species (ROS) by neutrophils and on the liver antioxidant defense system in control and streptozotocin-induced diabetic rats. Female Fischer rats were divided into four groups, control (C), açai (A), diabetic (D), diabetic + açai (DA). Diabetes was induced by a single intraperitoneal injection of streptozotocin (35 mg/kg body weight). Animals in groups C and D were fed a standard diet (AIN-93); those in groups A and DA were given the standard diet with 2% (w/w) açai pulp added for 30 days. Supplementation of the diet with 2% açai for 30 days was found to increase levels of mRNA for gamma-glutamylcysteine synthetase (γ-GCS) and glutathione peroxidase (GPx) in liver tissue, to increase the glutathione (GSH) content of the liver and to decrease ROS production by neutrophils. Compared to control animals, diabetic rats exhibited lower levels of mRNA coding for Zn-superoxide dismutase (Zn-SOD), GPx and γ-GCS and higher levels of thiobarbituric acid-reactive substances (TBARS) and carbonyl proteins in hepatic tissues. Although açai supplementation did not change the level of expression of mRNAs coding for antioxidant enzymes in diabetic rats, it showed a protective effect, decreasing lipid peroxidation and increasing GSH content in the liver. These findings suggest that açai can modulate ROS production by neutrophils and that it has a significant favorable effect on the liver antioxidant defense system.

Embora a cisplatina (cis-diaminocloroplatina II) seja um efetivo agente anticâncer, seu uso clínico é altamente limitado, predominantemente devido ao seu potencial nefrotóxico. Muitos estudos têm demonstrado que a cisplatina causa disfunção mitocondrial em células epiteliais renais e danos ao DNA nuclear devido à ação de espécies reativas de oxigênio tais como superóxido e radicais hidroxila. O aumento na produção destas espécies de oxigênio causa liberação de citocromo c no citosol, iniciando uma cascata de eventos que leva à morte celular por apoptose. A proteção seletiva da mitocôndria contra espécies reativas de oxigênio geradas pela cisplatina nos tecidos intactos tais como os rins, é fundamental na quimioterapia de pacientes com câncer. O presente estudo investigou os efeitos da cisplatina na bioenergética, no estado redox e no estresse oxidativo mitocondrial renal, bem como o potencial protetor da dimetiltiouréia (DMTU), um antioxidante seqüestrador de radicais hidroxila, com relação à toxicidade renal induzida pela cisplatina. Método: Ratos Wistar machos adultos pesando de 200 a 220 g foram divididos em quatro grupos de 8 animais cada. Ao primeiro grupo foi administrada cisplatina (10 mg/ kg) por via intra peritonial (i.p.). O segundo grupo recebeu somente injeções de DMTU (500 mg/kg, i.p., seguida de 2 injeções diárias de 125 mg/Kg, i.p). O terceiro grupo de animais foi tratado com DMTU (500 mg/kg, i.p.), imediatamente antes da injeção de cisplatina (10 mg/kg, i.p.), seguida de 2 injeções diárias de DMTU (125 mg/Kg, i.p.). O grupo controle recebeu somente solução salina (1ml/200g, i.p.). Os animais foram sacrificados 72 horas após a injeção de cisplatina (ou salina). Resultados: O tratamento com a cisplatina resultou em uma marcante diminuição da função renal demonstrada pela elevação dos níveis plasmáticos de uréia e de creatinina, concomitante a uma significativa alteração nos parâmetros relacionados à função Resumo ix mitocondrial (síntese de ATP, estado 3 da respiração, RCR, ADP/O, potencial de membrana e transporte de cálcio); ao estresse oxidativo mitocondrial (oxidação da cardiolipina, atividade da aconitase, lipoperoxidação, níveis de proteína carbonila e proteína sulfidrila); ao estado redox mitocondrial (oxidação do NAD(P)H, relação glutationa reduzida e glutationa oxidada) e à apoptose (atividade da caspase 3). O pré-tratamento dos animais com DMTU preveniu a falência renal aguda e as alterações dos parâmetros mitocondriais , sendo capaz de inibir a morte celular por apoptose. Conclusão: Os resultados demonstram o papel central da mitocôndria na falência renal aguda induzida pela cisplatina, bem como o efeito protetor do DMTU e sugerem que o desenvolvimento de potentes seqüestradores de radicais hidroxila, passíveis de uso clínico, poderia contribuir de forma marcante na prevenção dos danos renais resultantes da quimioterapia com este fármaco.<br>Although cis-diamminedichloroplatinum (II) (cisplatin) is an effective anticancer agent, its clinical use is highly limited predominantly due to its adverse effects on renal functions. Many studies have shown that cisplatin causes mitochondrial dysfunction and direct injury to nuclear DNA by generating reactive oxygen species such as superoxide and hydroxyl radicals. Overproduction of reactive oxygen species causes the release of cytochrome c into cytosol, thereby triggering the sequence of events leading to cell death via apoptosis. The selective protection of mitochondria against reactive oxygen species generated by cisplatin in intact tissues, such as kidney, is of critical importance in the chemotherapy of patients with cancer. The present study examined the effects of cisplatin on renal mitochondrial bioenergetics, redox state and oxidative stress as well as the protective potential of dimethylthiourea (DMTU), a hydroxyl radical scavenger, against the cisplatin-induced nephrotoxicity. Methods: Adult male Wistar rats weighing 200 to 220g were divided into 4 groups with 8 animals each.. The first group was given a single intraperitoneal (i.p.) injection of cisplatin (10 mg/kg). The second group was given only DMTU (500 mg/kg body weight, i.p, followed by intraperitoneal injections of 125 mg/Kg twice a day until sacrifice). A third group of animals was given DMTU (500 mg/kg body weight, i.p.), just before cisplatin injection (10 mg/kg body weight, i.p.), followed by intraperitoneal injections of DMTU (125 mg/Kg body weight) twice a day until sacrifice. The control group was treated only with saline solution (1ml/200g body weight, i.p.). Animals were sacrificed 72 hours after the treatment. Results: Cisplatin treated animals presented a marked impairment of the renal function evidenced by the elevation of plasmatic creatinine and urea levels simultaneously to a significant alteration of the parameters related to: (a) the mitochondrial function assessed by ATP synthesis, Summary xi state 3 respiration, RCR, ADP/O ratio, membrane potential, calcium uptake; (b) the mitochondrial oxidative stress assessed by cardiolipin oxidation, aconitase activity, lipid peroxidation, protein carbonyls and protein sulphydryl; (c) the mitochondrial redox state assessed by NADPH/NADP+ ratio, GSH/GSSG ratio and (d) apoptosis assessed by caspase-3 activity. DMTU substantially inhibited cisplatin-induced mitochondrial injury and cellular death by apoptosis, thereby suppressing the occurrence of acute renal failure. Conclusions: Results show the central role of the mitochondria in the cisplatin-induced renal acute failure, the protective potential of DMTU and suggest that the development of potent hydroxyl radical scavengers suitable for use in man could minimize the adverse effects of cisplatin in the kidney of patients under chemotherapy.

A cisplatina (cis-diaminodicloroplatina II) é um efetivo agente anticâncer, porém seu uso clínico é altamente limitado, predominantemente devido à sua nefrotoxicidade. Muitos estudos têm demonstrado que a cisplatina causa disfunção mitocondrial em células epiteliais renais devido à ação de espécies reativas de oxigênio tais como ânions superóxido e radicais hidroxila. A proteção seletiva das mitocôndrias renais contra espécies reativas de oxigênio geradas pela cisplatina é fundamental na quimioterapia de pacientes com câncer. Vários estudos têm sugerido que o carvedilol é capaz de proteger contra a toxicidade mitocondrial cardíaca induzida pelo quimioterápico doxorubicina. Assim, no presente estudo investigou-se o potencial protetor deste fármaco contra a toxicidade mitocondrial renal induzida pela cisplatina, bem como os mecanismos moleculares envolvidos nesta proteção. Foram estudados 4 grupos (n=6, cada) de ratos Wistar machos tratados da seguinte forma: (i) Grupo controle: uma injeção intraperitoneal (i.p.) de DMSO (0,2mL/200g, i.p.) imediatamente antes da injeção de solução salina isotônica (2 ml/200g, i.p.) e posteriormente uma injeção diária de DMSO (0,2mL/200g, i.p.) em dois dias consecutivos; (ii) Grupo cisplatina (CISP): uma injeção de cisplatina (10 mg/kg, i.p.); (iii) Grupo carvedilol (CV): uma injeção de carvedilol (1 mg/kg, i.p.), seguida de uma injeção diária de carvedilol em dois dias consecutivos (1 mg/Kg, i.p) e (iv) Grupo carvedilol + cisplatina (CV+CISP): uma injeção de carvedilol (1mg/kg, i.p.), imediatamente antes da injeção de cisplatina (10 mg/Kg, i.p.) seguida de uma injeção diária de carvedilol nos dois dias seguintes (1 mg/Kg, i.p.). Os animais foram sacrificados 72 horas após o início do tratamento. O grupo CV+CISP apresentou uma significativa redução na lesão renal, marcada pela diminuição da concentração de uréia e creatinina plasmáticas, quando comparado ao grupo CISP. A avaliação da função mitocondrial comprovou o efeito protetor do carvedilol contra a toxicidade mitocondrial renal da cisplatina através da significativa melhora nos valores da (i) RCR, (ii) do consumo de oxigênio no estado 3 e (iii) da razão ADP/O. Além disso, no grupo CV+CISP o potencial de membrana mitocondrial e a captação de cálcio mitocondrial foram preservados. Adicionalmente, a redução da oxidação do NADPH, da cardiolipina, da glutationa e das proteínas sulfidrilas, bem como a redução na formação de MDA no grupo CV+CISP sugerem efeito protetor do carvedilol contra o estresse oxidativo mitocondrial. O grupo CV+CISP também apresentou menor ativação da caspase-3, o que sugere menor indução de apoptose. Os grupos CISP e CV+CISP apresentaram concentrações semelhantes de platina na suspensão mitocondrial renal, indicando que o mecanismo de proteção do carvedilol provavelmente não envolve a formação de complexos e a subseqüente inativação da cisplatina. Os resultados do presente estudo são promissores, pois o carvedilol é um fármaco de uso seguro e já estabelecido na clínica e a comprovação do seu efeito protetor contribuirá para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção dos danos nefrotóxicos da cisplatina.<br>Cisplatin (cis-diamminedichloridoplatinum II) is an affective anticancer agent; however its clinical use is highly limited, predominantly due to its nephrotoxicity. Many studies have shown that cisplatin cause mitochondrial dysfunction in renal epithelial cells due to the generation of reactive oxygen species, such as superoxide anions and hydroxyl radicals. The selective protection of the renal mitochondria against the reactive oxygen species generated by cisplatin is of critical importance in the chemotherapy of cancer patients. Some studies have suggested that carvedilol can protect against the cardiac mitochondrial toxicity induced by the chemotherapeutic agent doxorubicin. Therefore, in the present study we investigated the protective effect of carvedilol against renal mitochondrial toxicity, as well as the molecular mechanisms involved in this protection. We studied 4 groups (n=6, each) of male Wistar rats treated as follows: (i) Control group: one injection of DMSO (0,2 mL/200g body weight, i.p.), intraperitoneal injection (i.p.), immediately before the injection of isotonic saline solution (2mL/200g body weight) followed by one injection of DMSO (0,2 mL/200g body weight, i.p.) in the two following days; (ii) Cisplatin group (CISP): one injection of cisplatin (10 mg/kg body weight, i.p.); (iii) Carvedilol group (CV): one injection of carvedilol (CV) (1mg/kg body weight, i.p.) in three consecutive days and (iv) Carvedilol + Cisplatin group (CV+CISP): one injection of carvedilol (1mg/kg, body weight, i.p.) immediately before the injection of cisplatin (10mg/kg, body weight, i.p.), followed by one injection of carvedilol (1mg/kg, body weight, i.p.) in the two following days. Animals were killed 72h after the beginning of the treatment. CV+CISP group presented a significantly reduced renal injury, marked by the decrease of urea and creatinine plasmatic levels, as compared to the CISP group. The evaluation of the mitochondrial function showed the protective effect of carvedilol against the renal mitochondria toxicity induced by cisplatin, as demonstrated by the improvement in the values of (i) RCR; (ii) the oxygen consumption on state 3 respiration and ADP/O ratio. Besides that, in the CV+CISP group the mitochondrial membrane potential and the mitochondrial calcium uptake were preserved. Additionally, the lower oxidation of NADPH, cardiolipin, glutathione and sulfhydryl proteins, as well as the lower values of MDA in the CV+CISP group, suggests a protective effect of carvedilol against the mitochondrial oxidative stress. CV+CISP group also presented lower values of caspase 3, which suggests lower induction of apoptosis. The groups CISP and CV+CISP presented a similar platinum concentration in the mitochondrial suspension, which indicates that the protective mechanism of carvedilol probably does not involve complex formation with cisplatin and its ensuing inactivation. The present results are promising, since carvedilol is a safe drug, which is currently used in the clinical practice and the evidence of its protective effect will contribute to the development of new strategies to prevent the nephrotoxic damage of cisplatin.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico<br>Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias.<br>Enteroaggregative Escherichia coli is a pathogen related to cases development of acute or persistent diarrhea. The inflammatory response induced by EAEC is linked to induction of IL-8 release, which acts stimulating neutrophils diapedesis through the epithelium. Macrophages, similarly to neutrophils, are phagocytic cells that produce reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Iron is an essential microelement to bacteria, been used as cofactor of enzymes in fundamental cellular processes but it is involved in ROS generation through Fenton reaction. On this report we evaluated the consequences of different EAEC strains interaction with activated human macrophages (U937 lineage). All tested strains showed filaments on the adherence tests with macrophages, unlike to what occurs in the interaction with other cellular lineages as HEp-2, T84 e Caco-2. Considering the possibility of H2O2 macrophage produced generates hydroxyl radical through Fenton reaction, the strains were grown in medium containing iron chelator 2,2-dipiridil. Iron chelation did not suppress filamentation, however decreased the adherence of 042 e 17-2 strains. Strains pretreated with a H2O2 subletal dose (60 M) by 60 minutes, which resulted in a bacterial adaptative response, also did not decrease the filamentation associated to adherence beside H2O2 pretreatment decreased the adherence of EAEC strains tested. In order to verify if H2O2 induces filamentation through DNA lesions and SOS induction, we evaluated the survival of a triple mutant deficient in three enzymes involved in BER and a mutant deficient in SOS response induction, both E. coli K12 derived. Both mutants presented similar survival levels like wild strain. This result suggest that H2O2 is not involved in SOS induction and filamentation response. Activated macrophages show microbicidal action, which is related to enzymes such as IDO (indoleamine dioxygenase), associated to reduction of L-tryptophan available to microorganism. In this way, we performed adhrence macrophages assays supplementing the interaction medium with L-tryptophan. Our results showed that tryptophan addition reduced the filamentation of adhered EAEC strains. Thus, we suggested that L-tryptophan reduction could be responsible for SOS response induction and bacterial filamentation.

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária<br>Os suínos são animais extremamente sensíveis ao stress térmico, tendo as altas temperaturas efeitos negativos sobre os parâmetros reprodutivos das fêmeas e a qualidade do sémen dos machos. Esta influência negativa sobre os parâmetros espermáticos, assim como a diminuição da qualidade das doses de sémen durante o armazenamento, deve-se em parte às espécies reativas de oxigénio, que quando em excesso causam stress oxidativo e têm uma série de consequências, nomeadamente a diminuição da motilidade dos espermatozóides e a instabilização das membranas lipídicas e do ADN, o que consequentemente afeta o poder fertilizante dos espermatozóides. A relação entre a qualidade do sémen e os resultados de fertilidade é um indicador importante para as explorações e centros de inseminação. Neste contexto, o presente ensaio teve como objetivo avaliar o efeito da utilização de um diluidor suplementado com antioxidantes (MR-A® antiox), em comparação com um diluidor comercial (MR-A®), nos parâmetros de fertilidade in vivo, nomeadamente na taxa de gestação, taxa de parto, número de leitões vivos (NV) e número de leitões mortos (NM), e ainda estimar a influência da temperatura sobre os mesmos. Para o efeito, foram inseminadas 134 porcas F1 (LW x LR), com sémen proveniente do mesmo varrasco RAM2 (Duroc x Pietrain), divididas em dois grupos: grupo controlo (GC) com o diluidor comercial MR-A ® e grupo teste (GT) com o diluidor MR-A® antiox. Procedeu- se ainda a uma breve análise do sémen, e posteriormente foram registados para cada porca o diagnóstico de gestação, os NV, os NM e os mumificados. Os resultados não mostraram diferenças significativas (p>0,05) entre os grupos, pelo que o desempenho das fêmeas inseminadas não foi influenciado pelo diluidor utilizado, embora as médias no GC tenham sido superiores em todos os parâmetros analisados (taxa de gestação de GC 9,5% superior ao GT; NV = 11.79 vs 11.04; NM = 2.14 vs 2.17). Foi também possível aferir a influência da paridade sobre a prolificidade (p<0,05), sendo que fêmeas com maior número de partos apresentaram menor número de NV e maior número de NM. Por outro lado, também foi registada a influência da temperatura sobre a taxa de gestação, concluindo-se que quanto mais baixas as temperaturas maior o número de diagnósticos positivos.<br>ABSTRACT - Advantages of adding antioxidants to swine semen extender for conservation - Pigs are extremely susceptible to thermal stress, with high temperatures having negative effects on reproductive parameters of females and semen quality of males. This negative influence on espermatic parameters, as well as the decrease in the quality of semen doses during storage, is partly due to reactive oxygen species, which when in excess cause oxidative stress and have a series of consequences, namely the reduction of sperm motility and instabilization of lipid membranes and DNA, which consequently affects the fertilizing power of sperm. The relationship between semen quality and fertility results is an important indicator for farms and insemination centers. In this context, the present assay aims to evaluate the effect of using an extender supplemented with antioxidants (MR-A ® antiox), in comparison with a commercial extender (MR-A®), in the parameters of fertility in vivo, namely in the gestation rate, farrowing rate, number of piglets born alive (NV) and number of stillborns (NM), and also estimate de influence of temperature on them. For this purpose, 134 sows F1 (LW x LR) were inseminated, with semen from the same boar RAM2 (Duroc x Pietrain), divided in two groups: control group (GC) with the commercial MR-A® extender and test group (GT) with MR-A® antiox extender. A brief analysis of semen was also carried out, and subsequently the gestation diagnosis, NV, NM and mummified were recorded for each sow. The results did not show any significant diferences (p>0,05) between groups, which means that the performance of the inseminated sows was not influenced by the extender, although the averages in the GC were higher in all analysed parameters (gestation rate of GC was 9,5% above GT; NV = 11.79 vs 11.04; NM = 2.14 vs 2.17). It was also possible to assess the influence of parity on litter size (p<0,05), where females with higher number of births show lower number of NV and higher number of NM. On the other hand, the influence of temperature on gestation rate were also recorded, concluding that the lower the temperature, the higher the number of positive diagnos<br>N/A

Electrophoretic microsystems (EM) are powerful tools for the separation of species of microsystems analyzes which can easily be combined with electrochemical detection (ECD) and therefore making it ideal for a method of detection. However, the influence of high voltage at the working electrode used for the separation is a problem to be overcome due to the increased signal/noise ratio and possible damage of the electrode and/or the potentiostat. Thus, it was proposed in this thesis one EM hybrid PDMS / glass configuration with dual-channel potentiostat coupled to an electrically isolated in order to minimize the influence of high potential in the separation channel and improve the separation efficiency of the species and subsequently, improve detection limits. The EM contains two separate parallel channels 200 microns and a channel separation and another reference, and each containing a platinum electrode 15 or 50 μm placed about 1 to 4 μm in the channel. An electrode served as the working electrode, positioned in the separation channel, and another electrode as reference electrode, placed in the reference channel. This configuration associated with the electrically isolated potentiostat allowed the amperometric signals were measured without any change or potential interference arising from the high voltage applied separation. Aiming to evaluate the effectiveness of the methodology proposed in this thesis, samples nitrite, tyrosine and peroxynitrite (reactive nitrogen species – RNS), hydrogen peroxide (reactive oxygen species – ROS), ascorbic acid, glutathione and cysteine were injected into the channel containing the working electrode, while simultaneously boric acid buffer pH 11 containing TTAB was injected into the reference channel containing the reference electrode. From this configuration, we obtained a significant reduction in noise level (about 0.94 pA) and a relative improvement in the resolution ratified by electropherograms, compared with using single channel configuration. The limits of detection (LOD) for the chemical species mentioned above were 0.58 μM, 0.14 μM, 0.75 μM, 0.21 μM, 0.82 μM, was not obtained for cysteine and 1.63 μM, respectively. The efficiency can also be seen by analyzing nitrite performed on samples of perfusate blood of sheeps and rats, where have been detected a concentration of 68.05 μM and 22.04 μM, respectively, by the proposed method. It was also proposed in this thesis, microfabrication and evaluation of a PMMA electrophoretic microsystem with single channel configuration coupled to a base made of the same material to fix the microchip with electrochemical detection using a carbon paste electrode. The purpose of the construction of the base was to obtain, by fixing, reproducibility of events. And the microfabrication of PMMA EM aimed the viability of its use in analysis perspective as having the lowest cost per unit made due to the use of CO2 laser for microfabrication, which has a value considerably lower, compared with photolithographic processes. The evaluation of this system was performed through the analysis standards of serotonin and acetaminophen, which proved that the microfabrication of this system showed good reproducibility and repeatability of events, making it viable processing.<br>Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior<br>Os microssistemas eletroforéticos (MSE) são ferramentas poderosas para a separação de espécies em microssistemas de análises, onde pode ser facilmente combinada com detecção eletroquímica (DEQ) e tornando-se, portanto, um método de detecção ideal. No entanto, a influência da alta tensão no eletrodo de trabalho utilizada para a separação é um problema a ser contornado devido o aumento da relação sinal/ruído e possíveis danificações do eletrodo e/ou do potenciostato. Assim, foi proposto nesta tese um MSE híbrido de PDMS/vidro com configuração de duplo-canal acoplado a um potenciostato eletricamente isolado com objetivo de minimizar a influência do elevado potencial no canal de separação e melhorar a eficiência de separação das espécies e, subsequentemente, melhorar os limites de detecção. O MSE contém dois canais paralelos separados 200 μm, sendo um canal de separação e outro de referência, e cada um deles contendo um eletrodo de platina de 15 ou 50 μm colocados cerca de 1 a 4 μm dentro do canal. Um eletrodo serviu como eletrodo de trabalho, posicionado no canal de separação, e o outro eletrodo como eletrodo de referência, posicionado no canal de referência. Essa configuração associado ao potenciostato eletricamente isolado permitiu que os sinais amperométricos fossem medidos sem qualquer mudança de potencial ou de interferência oriunda da alta tensão de separação aplicada. Objetivando avaliar a eficiência da metodologia proposta nessa tese, amostras de nitrito e peroxinitrito (espécies reativas de nitrogênio – ERN), tirosina, peróxido de hidrogênio (espécie reativa de oxigênio – ERO), ácido ascórbico, glutationa e cisteína foram injetadas no canal contendo o eletrodo de trabalho, enquanto que simultaneamente o tampão de ácido bórico contendo TTAB pH 11 foi injetado no canal de referência contendo o eletrodo de referência. A partir desta configuração, obteve-se uma significativa diminuição no nível de ruído (cerca de 0,94 pA) e uma relativa melhora na resolução ratificadas pelos eletroferogramas, se comparado com a configuração que utiliza canal único. Os limites de detecção (LOD) para as espécies químicas supracitados foram de 0,58 μM, 0,14 μM, 0,75 μM, 0,21 μM, 0,82 μM, não foi obtida para a cisteína, e 1,63 μM, respectivamente. A eficiência também pode ser vista através das análises de nitrito realizadas em amostras de perfusato de sangue de ovelhas e ratos, onde foram detectados uma concentração de 68,05 μM e 22,04 μM, respectivamente, através da metodologia proposta. Foi proposto também nessa tese, a microfabricação e avaliação de um microssistema eletroforético de PMMA com configuração de canal único acoplado a uma base feita do mesmo material para fixar o microchip, com detecção eletroquímica usando eletrodo de pasta de carbono. O objetivo da construção da base foi obter, através da fixação, reprodutibilidade de eventos. E a microfabricação do MSE de PMMA objetivou a viabilidade do seu uso em análises tendo como perspectiva o baixo custo por unidade confeccionada devido ao uso de laser de CO2 para a microfabricação, o qual possui um valor agregado consideravelmente menor, se comparado com os processos fotolitográficos. A avaliação desse sistema foi feita através das análises de padrões de serotonina e acetaminofeno, onde comprovou-se que a microfabricação desse sistema apresentou boa reprodutibilidade e repetitividade de eventos, tornando-se viável o seu processamento.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro<br>A célula epitelial é o primeiro contato entre os micro-organismos e o hospedeiro. Essa interação pode levar a produção de diversas citocinas, quimiocinas, moléculas inflamatórias e também estimular a geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). Neste trabalho avaliamos se a interação com as células HEp-2 poderia ser genotóxica para os mutantes derivados de Escherichia coli K-12 deficientes em algumas enzimas que fazem parte do sistema de reparo por excisão de base (BER). Além disto, avaliamos a expressão do sistema SOS, que é induzido pela presença de danos no genoma bacteriano. Os resultados obtidos mostraram a presença de filamentos, na interação com células HEp-2, principalmente, no mutante xthA (BW9091) e no triplo mutante xthA nfo nth (BW535). Quando a interação foi quantificada na ausência da D-manose, observamos um aumento das bactérias aderidas. Além disto, a quantidade e o tamanho dos filamentos também aumentaram, mostrando que as adesinas manose-sensíveis estavam envolvidas na filamentação bacteriana. Para comprovar se o aumento da filamentação observada neste ensaio foram uma consequência da indução do sistema SOS, desencadeada pela interação com as células HEp-2, quantificamos a expressão do SOS, na presença e na ausência da D-manose. De fato, observamos que a indução do SOS na ausência da D-manose foi maior, quando comparada, com o ensaio realizado na presença de D-manose. Além disto, observamos que a ausência de xthA foi importante para o aumento da filamentação observada na ausência de D-manose. Diante destes resultados, verificamos se a resposta de filamentação ocorreria quando as bactérias interagiam com uma superfície abiótica como o vidro. Observamos também inúmeros filamentos nos mutantes BER, BW9091 e BW535, quando comparados a cepa selvagem AB1157. Essa filamentação foi associada à indução do SOS, em resposta a interação das bactérias com o vidro. Em parte a filamentação e a indução do SOS observadas na interação ao vidro, foram associadas à produção de ERO. Quantificamos também o número de bactérias aderidas e observamos que as nossas cepas formavam biofilmes moderados. Contudo, a formação de biofilme dependia da capacidade da bactéria induzir o sistema SOS, tanto em aerobiose como em anaerobiose. A tensão do oxigênio foi importante para interação dos mutantes BER, uma vez que os mutantes BW9091 e BW535 apresentaram uma quantidade de bactérias aderidas menor em anaerobiose. Contudo, a diminuição observada não estava vinculada a morte dos mutantes BER. Também realizamos microscopia de varredura na cepa selvagem e nos mutantes, BW9091 e BW535 e confirmamos que as três cepas formavam biofilmes tanto em aerobiose como em anaerobiose. Observamos uma estrutura sugestiva de matriz extracelular envolvendo os biofilmes da cepa selvagem AB1157 e do mutante BW9091. No entanto, a formação desta estrutura por ambas as cepas dependia da tensão de oxigênio, pois nos biofilmes formados em anaerobiose essa estrutura estava ausente. Em conclusão, mostramos que na interação das bactérias com a superfície biótica e abiótica, ocorreu lesão no genoma, com indução do SOS e a resposta de filamentação associada.<br>The epithelial cell is the first contact between microorganisms and host. This interaction results in production of several cytokines, chemokines, and inflammatory molecules by epithelial cells and also stimulate the generation of reactive oxygen species (ROS). In the present study, we have evaluated whether the interaction to HEp-2 cells causes genotoxicity to mutants derived from Escherichia coli K-12 deficient in some enzymes that are part of the system of base excision repair (BER). Moreover, we measured the expression of SOS system, which is induced by the presence of damage to the bacterial genome. Our results showed mainly presence of filamentous bacterial growth in xthA mutant (BW9091) and triple xthA nfo nth mutant (BW535) when submitted to HEp-2 cells interaction assays. When experiments were performed in the absence of mannose, data showed enhanced interaction of viable bacteria to HEp-2 cells for all strains tested. Furthermore, the removal of D-mannose resulted in an increase in both number and size of bacterial filamentous forms, indicating the involvement of mannose-sensitive adhesins in the filamentation of these strains. In order to verify whether the increased filamentation growth in this assay was a consequence of SOS induction, triggered by interaction to HEp-2 cells, we measured expression of SOS in the presence and absence of D-mannose. Indeed, we observed higher expression of SOS response in the absence of mannose than in experiments performed in the presence of D-mannose. Moreover, we observed that the absence of xthA was important to filamentation increasing in absence of D-mannose. Based on these results, we verified if interaction to abiotic surfaces, like glass, could lead to filamentation of these strains. We also observed numerous filaments in BER mutants, BW9091 and BW535, when compared to wild-type strain AB1157. The filamentation observed was a consequence of SOS induction, triggered by attachment to the glass surface. In part, the filamentation and SOS induction observed in these experiments were related to ROS production. We also quantified interacted bacterial cells and it was observed moderated biofilm formation in all strains tested. However, biofilm formation depended on the ability of the bacteria to induce the SOS response, under both aerobic and anaerobic conditions. The oxygen tension was important factor for interaction of the BER mutants, since these mutants exhibited decreased quantitative adherence under anaerobic conditions. However, this decrease was not related to BER mutants death. Scanning electron microscopy was also performed in the wild-type strain and BER mutants (BW9091 e BW535) and biofilm formation was confirmed under both aerobic and anaerobic conditions. We observed a structure similar to a extracellular matrix which involved biofilms of wild type strain (AB1157) and xthA mutant (BW9091). However, the formation of this structure by both strains depended on the oxygen tension, since biofilm formation, under anaerobiosis condition, did not presented this structure. In conclusion, was provided that bacterial interaction to biotic and abiotic surfaces can lead to damage of bacterial genome, resulting in SOS induction and associated filamentation.

Este estudo se propôs a avaliar o potencial inflamatório das partículas eliminadas na exaustão do diesel (PED) e 1,2-naftoquinona (1,2-NQ) sobre outros compartimentos, como o músculo liso vascular (aorta torácica; RTA) e do corpo cavernoso isolados de ratos (RCC) e os mecanismos envolvidos via ensaios funcionais e bioquímicos. A injeção i.tr. das PED e 1,2-NQ em ratos Wistar causou inflamação e hiporreatividade das vias aéreas associados ao aumento significativo do relaxamento evocado pela ACh na RTA. No RCC desses mesmos animais, tanto o GTN quanto o estímulo elétrico (EFS) causou maior relaxamento. O conteúdo basal de TBARs na RTA e pulmão foi reduzido, embora outros testes indicadores de estresse oxidativo e / ou atividade antioxidante não mostraram diferenças entre os grupos. As taxas de expressão gênica / protéica da nNOS no RCC de ratos não diferiram do grupo controle, mas a expressão da eNOS e iNOS foi reduzida na RTA e RCC. Não foram quantificadas concentrações séricas do TNF<font face=\"Symbol\">&#945 ou IL-1<font face=\"Symbol\">b, sugerindo que os efeitos sistêmicos ocorrem independentemente destas citocinas. Conclui-se que o tratamento agudo de ratos com a mistura de poluentes induziu inflamação das vias aéreas (e hiporreatividade), capaz de afetar outros compartimentos, como a musculatura lisa vascular (RTA) e do RCC.<br>We tested the hypothesis that local inflammation in the airways evoked by intra-tracheal instillation of the environmental chemical 1,2-naphthoquinone (1,2-NQ) and diesel exhaust particles (DEP) is capable of targeting other systemic compartments, such as vessels (rat thoracic aorta; RTA) and corpus cavernosum (RCC), and possible involved mechanisms. After 3h, this treatment induced airways hyporresponsiveness to ACh and local inflammation. This effect was associated with decreased numbers of leukocyte in the blood and spleen and increased number of leukocytes in the bone marrow. Pollutant treatment also markedly increased ACh-induced relaxation in RTA and by both GTN- and electrical stimulation-induced relaxation in RCC. Exposure to pollutants did not affect FE-induced contraction in RTA. Neither serum levels of cytokines (TNF<font face=\"Symbol\">&#945 e IL-1<font face=\"Symbol\">b) nor basal concentration of total nitrate were different amongst groups. No evidence of increased catalase activity in RTA, RCC and lung was found. The treatment reduced the eNOS e iNOS gene expression in RTA e RCC, without significantly affecting the nNOS gene expression in RCC. Our results are consistent with the hypothesis that DEP-induced airways hiporresponsiveness and inflammation can account to produce systemic changes, such as structural and functional changes in the RTA and RCC by means of substances derived from endothelium or due to the ability of these pollutants to act to stimulate the production of scavenger of free radical.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz<br>Introdução: Apesar da baixa incidência, o Cancro Oral possui um prognóstico negativo associado, traduzindo-se numa alta taxa de mortalidade, muito por causa da falta de um diagnóstico precoce desta doença oncológica. Associada a esta doença surgem lesões na mucosa oral que provocam muitas dores e desconforto ao paciente, influenciando negativamente a sua qualidade de vida. Devido a uma grande tolerância a antibióticos e antimicrobianos estas lesões são cada vez mais difíceis de curar, havendo a necessidade de se encontrarem novas alternativas. É neste sentido que aparecem os antioxidantes, como importantes substâncias com um papel determinante no processo de cicatrização. Desenvolvimento: Os antioxidantes aparecem como uma importante solução para evitar o stress oxidativo, processo que se encontra relacionado com a formação de lesões na mucosa oral. Os antioxidantes podem ser obtidos através da alimentação ou de suplementos alimentares, apresentando como função primordial a remoção de espécies reativas que são produzidas em excesso, impedindo assim as chamadas lesões oxidativas. As Vitaminas C, E, A, os carotenoides e retinoides encontram-se presentes em vários alimentos, como frutas e verduras, podendo ser facilmente consumidos pelos indivíduos. O poder antioxidante destas substâncias pode trazer grandes benefícios para a saúde humana, nomeadamente, na cicatrização de lesões. Conclusão: Apesar de vários estudos já terem sido realizados, estes não são consensuais pelo que é necessário a realização de mais investigações para que mais evidência científica possa ser publicada acerca da importância dos antioxidantes no que toca ao tratamento de lesões orais devido ao cancro oral.

Dissertação de mestrado, Oncobiologia - Mecanismos Moleculares do Cancro, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2017<br>Durante o a progressão tumoral, as células cancerígenas perdem acesso ao oxigénio (hipóxia) e à disponibilidade de nutrientes devido ao crescimento celular rápido e descontrolado. O HIF- α é o principal fator de transcrição que regula a resposta hipóxica ativando genes responsáveis pela sobrevivência das células cancerígenas. Vários estudos têm demonstrado que células sujeitas a um stress hipóxico exibem níveis elevados de espécies reativas de oxigénio (ERO) comparadas a células em normóxia. Devido às propriedades reativas destas espécies, as ERO podem contribuir para a oxidação de proteínas, peroxidação de lípidos e danos no DNA que podem resultar na morte celular ou mutagénese. Contudo, a ERO peróxido de hidrogénio (H2O2) é um segundo mensageiro importante na ativação de várias vias de sinalização que regulam a proliferação, diferenciação, migração e apoptose. Os sistemas antioxidantes têm certamente um papel fundamental na progressão tumoral durante condições de hipóxia regulando os níveis de ERO de forma a evitar que estes atinjam níveis letais para a célula. O nosso laboratório identificou recentemente uma proteína com função reguladora redox, a anexina A2 (ANXA2) e provou que a sua função antioxidante tem um papel crucial na progressão tumoral e resistência a quimioterapêuticos. Neste estudo propus-me a investigar o papel da ANXA2 em vias de sinalização durante a hipóxia. A ativação de vias de sinalização em linhas celulares cancerígenas pré estabelecidas com a depleção (knockdown) de ANXA2 como MDA MB 231, HT1080 e A549, e respetivos controlos foi estudada por western blot, estas células foram submetidas a tratamentos com CoCl2, um agente indutor de hipóxia química e a hipóxia real (1% O2) , durante diferentes intervalos de tempo. Para estudar possíveis alterações génicas, recorreu-se à técnica de qRT-PCR utilizando células sujeitas à hipóxia vs células controlo. Ensaios de iodoacetamida biotinilada BIAM foram realizados por forma a estudar alterações redox em proteínas durante a hipóxia (1% O2). Os níveis intracelulares de ERO foram analisados em células depletadas de ANXA2 vs controlo as quais foram submetidas a um tratamento de hipóxia química com CoCl2. Os nossos resultados mostram que a depleção de ANXA2 nas três linhas celulares levam a uma maior acumulação de HIF-α comparado a células controlo. Curiosamente em células HT1080 e A549 depletadas de ANXA2 observou-se a acumulação de HIF 2-α, o que não aconteceu nas células controlo. Também se observou a acumulação e sobre-expressão de PRDX II, (proteína antioxidante) em células MDA MB 231 depletadas de ANXA2 comparativamente com as células controlo. Estas células poderão estar a tentar compensar a depleção de ANXA2, aumentando os níveis de outra proteína antioxidante, a PRDX II. Os resultados revelaram um aumento significativo de VEGFD nas células A549, depletadas de ANXA2, comparado às células controlo. Os resultados de expressão génica revelaram que a depleção de ANXA2 afetou a expressão de genes alvo de HIF-α como o GLUT1.

Dissertação de Mestrado Integrado em Engenharia Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>A capacidade dos organismos vivos manterem um equilíbrio harmonioso com a natureza permitiu a sobrevivência e a evolução até aos dias de hoje. Mas este equilíbrio é influenciado por muitos comportamentos que fazem parte da vida quotidiana. A agitação e o ritmo acelerado da atualidade podem ser a origem de doenças, muitas delas irreversíveis. Nos últimos tempos considera-se que as causas de doenças neurodegenerativas como as de Alzheimer, Parkinson e depressão e de muitas outras doenças estão associadas ao estilo de vida atual. As pessoas lidam diariamente com stress no trabalho e no ambiente escolar e familiar. Estas situações são tão habituais que a população em geral já as considera “normais”. Por outro lado, o estilo de vida cada vez mais industrializado, mantém as pessoas em contacto com uma infinidade de fármacos e produtos de cuidado pessoal (PPCPs) que se podem acumular no organismo humano. A exposição contínua a este tipo de situações pode levar a um desequilíbrio da atividade cerebral e causar danos permanentes. Mecanismos fisiológicos diversos, incluindo os de defesa, atuam constantemente tentando restabelecer o equilíbrio. Estes processos podem beneficiar muito da ação de nutrientes específicos. Tendo em conta as considerações anteriores, o objetivo principal deste trabalho consistiu em estudar respostas a stress fisiológico, envolvendo uma hormona de stress ou um conservante de um produto de cuidado pessoal. Para tal utilizaram-se fatias cerebrais (400 µm) de ratos Wistar e efetuaram-se registos de autofluorescência e de fluorescência relacionados com a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e com o potencial de membrana mitocondrial (Δψm), nas sinapses das fibras musgosas da área CA3 do hipocampo. No primeiro conjunto de experiências utilizou-se a corticosterona, a principal hormona libertada nos ratos em situações de stress, em concentrações de 1 µM, 4 µM e 10 µM. Inicialmente mediram-se sinais de autofluorescência das proteínas mitocondriais NADH e FAD, tendo-se verificado que a oxidação de NADH é mais sensível às variações de corticosterona e que este sinal se aproxima lentamente do valor basal quando a hormona deixa de estar presente. Por outro lado, nestas experiências a corticosterona tem uma ação irreversível na oxidação da proteína FADH2, uma vez que o sinal não recupera quando a hormona de stress é retirada. Fatias incubadas com o indicador fluorescente H2DCFDA, permitiram analisar variações de ROS, que aumentaram entre 1% e 6% para as concentrações estudadas. A ação de 10 µM de corticosterona foi persistente pois o excesso de ROS manteve-se na ausência da hormonaNo estudo feito com o conservante imidazolidinil ureia (IU), libertador de formaldeído, utilizaram-se as seguintes concentrações de IU: 1 µM, 50 µM e 100 µM. Nestas experiências observaram-se aumentos na autofluorescência de FAD, que eram irreversíveis para as concentrações mais elevadas de IU. Em fatias incubadas com o indicador H2DCFDA verificou-se que na presença de 50 µM e 100 µM de IU houve um aumento do sinal de ROS entre 2% a 4%. Foram também detetadas variações no potencial de membrana mitocondrial, em fatias contendo o indicador fluorescente rodamina 123. Os resultados indicam que para todas as concentrações de IU houve um aumento reversível do sinal sendo, para 100 µM, a recuperação lenta.O organismo contém defesas antioxidantes que ajudam a reduzir os efeitos oxidativos provocados por situações como as consideradas anteriormente. Por vezes a sua ação é insuficiente verificando-se um aumento de ROS irreversível, como se observou para as maiores concentrações da hormona de stress corticosterona e do conservante IU. Por isso, a ingestão alimentar pode ser uma fonte muito importante de antioxidantes com uma ação positiva no equilíbrio oxidativo. A importância dada a alimentos com propriedades antioxidantes, como os cogumelos tem sido crescente. Este alimento é rico em compostos bioativos que lhe conferem atividade antioxidante, incluindo compostos fenólicos, fitoquímicos, polissacarídeos, vitaminas, carotenóides e minerais, que proporcionam efeitos benéficos na saúde, para além das propriedades nutricionais. Por estes motivos, realizou-se um terceiro conjunto de estudos focado na caracterização da composição química de três espécies de cogumelos: Lentinula edodes koshin (shiitake), Pleurotus ostreatus e Pleurotus citrinopileatus. Analisaram-se também extratos de fitoquímicos destas espécies, que podem ter um papel importante na redução do stress oxidativo.<br>The ability of living organisms to maintain a harmonious balance with nature has allowed survival and evolution to this day. But this balance is influenced by many behaviors that are part of everyday life. The unrest and the accelerated rhythm of the present day can be the source of diseases, many of them irreversible. In recent times the causes of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's, Parkinson's and depression and of many other diseases are considered to be associated with the current lifestyle.People deal with stress at work and in the school and family environment on a daily basis. These situations are so common that the general population already considers them “normal”. On the other hand, the increasingly industrialized lifestyle keeps people in contact with an enormous variety of pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) that can accumulate in the human body. Continued exposure to these types of situations can lead to an imbalance in brain activity and cause permanent damage. Various physiological mechanisms, including the defense ones, constantly work to try to restore the balance. These processes can benefit much from the action of specific nutrients. Taking into account the previous considerations, the main objective of this work was to study responses to physiological stress, involving a stress hormone or a preservative of a personal care product. For that, brain slices (400 µm) from Wistar rats were used and autofluorescence and fluorescence records related with the production of reactive oxygen species (ROS) and with the mitochondrial membrane potential (Δψm), were made at the mossy fiber synapses of CA3 hippocampal area.In the first set of experiments, corticosterone, the main hormone released in rats in stressful situations, was used in 1 µM, 4 µM and 10 µM concentrations. Initially, autofluorescence signals from the mitochondrial proteins NADH and FAD were measured and it was found that NADH oxidation is more sensitive to changes in corticosterone and that this signal slowly approaches the baseline when the hormone is not present. On the other hand, in these experiments corticosterone has an irreversible action in the oxidation of the FADH2 protein, since the signal does not recover when the stress hormone is removed. Slices incubated with the fluorescent indicator H2DCFDA allowed the analysis of ROS changes, which increased between 1% and 6% for the studied concentrations. The action of 10 µM of corticosterone was persistent because the excess of ROS remained in the absence of the hormone.In the study carried out with the preservative imidazolidinyl urea (IU), which releases formaldehyde, the following IU concentrations were used: 1 µM, 50 µM and 100 µM. In these experiments, increases in FAD autofluorescence were observed, which were irreversible for the higher concentrations of IU. In slices incubated with the indicator, H2DCFDA, it was found that in the presence of 50 µM and 100 µM IU there was an increase in ROS fluorescence between 2% and 4%. Changes in the mitochondrial membrane potential were also detected in slices containing the fluorescent indicator rhodamine 123. The results indicate that for all IU concentrations there was a reversible signal increase occurring, for 100 µM, a slow recovery.The body contains antioxidant defenses that help reducing the oxidative effects caused by situations like those previously considered. Sometimes their action is insufficient and there is an irreversible increase in ROS, as was observed for the higher concentrations of the stress hormone corticosterone and of the IU preservative. Therefore, food can be a very important source of antioxidants with a positive action in the oxidative balance.The importance given to nourishment with antioxidant properties, such as mushrooms has been growing. This food is rich in bioactive compounds that give it antioxidant activity, including phenolic compounds, phytochemicals, polysaccharides, vitamins, carotenoids and minerals, which provide beneficial effects on health, in addition to the nutritional properties.For these reasons, a third set of studies was carried out focusing on the characterization of the chemical composition of three mushroom species: Lentinula edodes koshin (shiitake), Pleurotus ostreatus and Pleurotus citrinopileatus. Phytochemical extracts from these species, which can play an important role in reducing oxidative stress, were also analyzed.<br>Outro - Enquadrado no projeto 0340_SYMBIOSIS_3_E, co-financiado pelo FEDER através do Programa INTERREG V A Espanha – Portugal (POCTEP).

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>A terapia fotodinâmica (PDT) é uma estratégia terapêutica pouco invasiva que assenta na administração de um fotossensibilizador (PS) e posterior irradiação do tecido alvo. A interação do PS fotoestimulado com o oxigénio molecular, presente no tecido alvo, origina espécies reativas de oxigénio (ROS) que induzem uma cascata de reações que culmina com a morte celular. As propriedades fotofísicas e fotoquímicas do fotossensibilizador têm um papel importante na eficiência da terapia. A modulação destas propriedades através da alteração estrutural do PS permite o desenho de uma vasta gama de fotossensibilizadores com potencial aplicação clínica. Porfirinas e os seus derivados, clorinas e bacterioclorinas, são frequentemente utilizados como fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica. Nesta dissertação foram estudadas as propriedades fotofísicas e fotoquímicas de duas porfirinas (P10 e P11) e das bacterioclorinas correspondentes (LUZ10 e LUZ11). Para tal, recorreu-se a técnicas espectroscópicas como a fotólise por relâmpago e a adaptação desta técnica para a determinação do rendimento quântico de oxigénio singuleto. A complementação destas técnicas com calorimetria fotoacústica permitiu uma melhor compreensão das reações ocorrentes no sistema após fotoestimulação. Em suma, as porfirinas estudadas apresentam, relativamente às bacterioclorinas, maior rendimento quântico de oxigénio singuleto e maior tempo de vida do estado tripleto. O relaxamento do estado tripleto das porfirinas é quase exclusivamente realizado pela transferência de energia para o oxigénio molecular, sendo pouco provável a ocorrência de mecanismos de transferência de carga. Nas bacterioclorinas, o relativamente curto tempo de vida do estado tripleto e baixo rendimento quântico de oxigénio singuleto sugerem a existência de mecanismos de transferência de carga significativos.<br>Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive therapeutic strategy based on the administration of a photosensitizer (PS) followed by the irradiation of the target tissue. The interaction between the photostimulated PS and molecular oxygen, present in the tissue, generates reactive oxygen species (ROS) that induce a cascade of reactions that end in cellular death. The photophysical and photochemical properties of the photosensitizer play an important role in the efficiency of the therapy. The modulation of these properties through structural modification of the PS allows the design of numerous PS with potential clinical application. Porphyrins and its derivatives, chlorins and bacteriochlorins, are widely used as photosensitizers in photodynamic therapy. In this dissertation the photophysical and photochemical properties of two porphyrins (P10 and P11) and their bacteriochlorin derivatives (LUZ10 and LUZ11) were studied. These properties were studied using spectroscopic techniques such as flash photolysis and its adaptation to determine singlet oxygen quantum yield. These techniques were complemented with photoacoustic calorimetry that allowed a better understanding of the occurring reactions after photostimulation. In conclusion, the studied porphyrins present a higher singlet oxygen quantum yield and longer triplet state lifetime, relative to the bacteriochlorins. The quenching of porphyrins’ triplet state is almost exclusively done by energy transfer to molecular oxygen, as the charge transfer mechanisms are unlikely to happen. Bacteriochlorins, on the other hand, present shorter triplet state lifetime and lower singlet oxygen quantum yield, which suggests charge transfer mechanisms are significant in the quenching process.<br>FCT

Tese de mestrado em Química, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015<br>O peróxido de hidrogénio (H2O2) é um dos oxidantes mais versáteis que existe. Através de catálise o peróxido de hidrogénio pode ser convertido em radical hidroxilo ficando mais reativo. Apesar da sua elevada reatividade, o peróxido de hidrogénio é um metabolito natural em muitos organismos, quando decomposto, resulta em oxigénio molecular e água. O peróxido de hidrogénio tem uma elevada importância em diversas áreas como áreas alimentares, farmacêuticas, entre outras. Devido a esta multiplicidade de funções, o nível de concentração de H2O2 ou, mais precisamente, o controlo da sua concentração, é crucial para evitar efeitos adversos, incluindo toxicidade. Os materiais nanoporosos possuem potencial interesse como sistemas de armazenamento e posterior libertação de espécies terapêuticas no nosso organismo. A biocompatibilidade é um requisito fundamental para que um material possa ser utilizado na libertação de fármacos. Os materiais de estrutura mesoporosa desempenham um papel importante na área medicinal a nível de produtos farmacêuticos. Neste trabalho foram sintetizadas sílicas mesoporosoas e sílicas mesoporosas funcionalizadas, compósitos e compósitos funcionalizados e o zeólito cancrinite. A caraterização dos materiais foi feita essencialmente por difração de raios X, adsorção de azoto a -196 °C, TG-DSC e DRIFT. Alguns dos materiais preparados são capazes de armazenar e libertar uma quantidade de H2O2 compatível com concentrações no organismo, apresentando uma cinética de libertação lenta e linear com o tempo. Foram efetuados ensaios toxicológicos em células HeLa com alguns materiais selecionados, com uma concentração de material próxima do limite biológico máximo. Os materiais testados demonstraram possuir baixa citotoxicidade.<br>Hydrogen peroxide (H2O2) is one of the most versatile oxidants that exists. Hydrogen peroxide can be converted into hydroxil radical through catalysis becoming more reactive species. Despite its high reactivity, hydrogen peroxide is a natural metabolite in many organisms, when decomposed, resulting in water and molecular oxygen. The hydrogen peroxide has a highly important in various fields such as food, pharmaceutical areas, among others. Due to this multiplicity of functions, the level of concentration of H2O2 or, more precisely, the control of its concentration, it is crucial to avoid adverse effects including toxicity. The nanoporous materials have potential interest as storage systems and subsequent release of therapeutic species in our organism. The biocompatibility is a fundamental requirement for that a material can be used in the release of drugs. The mesoporous materials have an important role in the medical the level of products pharmaceuticals. In this work were synthesized mesoporous silica and mesoporous silica functionalized, composites and composites functionalized and a cancrinite zeolite. The characterization of the materials was essentially made by X-ray diffraction, nitrogen adsorption at -196 ° C, TG-DSC and DRIFT. Some of the materials prepared are capable of storing and releasing a quantity of H2O2 compatible with concentrations the body, with a slow release kinetics and linear over time. Toxicological tests were performed on HeLa cells with some selected materials, with a concentration of materials near the maximum biological limit. The materials tested were found to have low cytotoxicity.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Universitário Egas Moniz<br>A carcinogénese é um processo complexo e generalizado de formação de patologia neoplásica, que pode ser influenciado e desencadeado por meio de ataques indiscriminados por parte de espécies reativas derivadas do oxigénio. Estas espécies têm um papel fundamental em cascatas vias de sinalização e fatores de transcrição fundamentais para o bom desempenho celular. Esta sinalização bem como os fatores de transcrição são essenciais para fenómenos como proliferação, crescimento e divisão celular, tal como eventos tumorais evasivos como a angiogénese e a metastização. Esta revisão monográfica tem como objetivo, o esclarecimento do processo complexo de formação de cancro. Focando-se no papel das várias espécies reativas do oxigénio entre outras e dos seus ataques sem discriminação ao conteúdo intracelular e extracelular. Para produção desta monografia, foi efetuada pesquisa bibliográfica de diversos artigos científicos e alguns livros, compreendidos, na sua generalidade entre os anos 1999 e 2019. Deste modo, para a pesquisa feita foram utilizadas algumas bases de dados como ScienceDirect, Google Scholar e PubMed, mediante a utilização de palavras-chave.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz<br>Embora a curiosidade em redor do envelhecimento não seja algo recente, atualmente com o aumento da esperança média de vida, o panorama do envelhecimento é agora, mais do que nunca, um tema de relevância extrema. A complexidade da definição do “envelhecimento” prende-se, em parte, ao facto de este ser um processo multifatorial, influenciado por mecanismos bioquímicos variados. Esta tese pretende conceder uma visão global sobre como as manifestações externas do envelhecimento são um espelho que reflete os processos internos inerentes ao mesmo. Para tal, faz-se referência tanto a mecanismos bioquímicos que favorecem o envelhecimento, como também a mecanismos bioquímicos protetores.

Dissertação de mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015<br>As consequências negativas do stress fazem-se sentir em todos os componentes celulares desde o ADN às membranas lipídicas, passando pelas proteínas, podendo mesmo ter como última consequência a morte celular programada (apoptose). Por forma a minimizar os danos causados por stress as células possuem uma complexa maquinaria de resposta a qualquer alteração ambiental que coloque em causa a sua homeostasia. Entre os sistemas mais eficazes encontram-se as proteínas conhecidas de choque térmico (Heat Shock Proteins, HSP) que atuam tanto ao nível mitocondrial controlando a libertação de proteínas pró-apoptóticas, como ao nível pós-mitocondrial impedindo a ativação de caspases. Apesar do papel citoprotetor estar bem estudado em diversos tipos celulares, pouco se sabe acerca do efeito das HSP quando sobre-expressas em linhas linfoides humanas como a U937. Assim sendo, seria interessante caraterizar o papel destas proteínas (HSPs) num modelo de apoptose induzida, quer por espécies reativas de oxigénio (Reactive Oxygen Species, ROS) através de peróxido de hidrogénio (H2O2), quer por sobrecarga de cálcio intracelular induzida por tapsigargina (TG) na linha celular cancerígena U937. De seguida verificou-se o efeito da sobre-expressão de HSPs num modelo de viabilidade/morte celular induzida por H2O2 ou TG. O último passo foi averiguar se a morte celular estava relacionada com a via das caspases, para tal procedeu-se à medição da atividade da caspase-3 sob as mesmas condições. Os resultados mostraram uma diminuição da expressão de HSP70 e HSP90 após 24 h de tratamento com H2O2 (60 μM) e TG (2,5 μM) comparativamente com células U937 não tratadas. O H2O2 (60 μM) e a TG (2,5 μM) também se mostraram eficazes em diminuir a viabilidade celular para 70 % e 40 %, respetivamente. Viabilidade esta que é completamente restaurada na presença de 1 ng/mL de HSP47, HSP60, HSP70 e HSP90 em células tratadas com H2O2 (60 μM), mas não em células tratadas com TG (2,5 μM). Resultados similares são observáveis nos testes para avaliação da atividade de caspase-3, ou seja, a TG (2,5 μM) é mais eficaz na sua ativação do que o H2O2 (60 μM), e apenas o efeito do H2O2 pode ser revertido por HSPs.

As S-Transferases da Glutationa (GST) são uma superfamília de enzimas multifuncionais ubiquitárias, que participam na destoxicação celular, na protecção das macromoléculas do ataque dos electrólitos reactivos, incluindo as espécies reactivas de oxigénio (ROS) e de agentes quimioterápicos. De entre os mecanismos antioxidantes existentes no organismo, a GST é a enzima intracelular mais abundante, com múltiplas funções como agente anti-oxidante. Neste estudo, analisou-se a associação dos polimorfismos da GSTT1 e GSTM1 null nas diferentes especialidades, num grupo de Nadadores de alta competição. Para a realização deste trabalho, usou-se como população de estudo um grupo de Nadadores de Elite Portugueses, contendo 33 atletas de elite, dos quais 20 são do sexo masculino e 13 do sexo feminino. E um grupo controlo constituído por 52 indivíduos, representativos da população em geral. Este grupo é constituído por 38 individuos do género masculino e por 14 do género feminino. O ADN genomico foi extraído de amostras de sangue, recolhido por punção capilar, e colocada num pedaço de papel de filtro, e a determinação genomica foi realizada por PCR. A análise estatística foi feita com base em Odds ratios (ORs) estimados com intervalos de confiança de 95%. Pela análise por género conclui-se que a presença da proteína GSTT1 parece ser fundamental para todos os atletas independentemente do género. Os resultados sugerem que a existência da proteína GSTT1 nos dímeros que integra, parece conferir propriedades especificas e vantajosas para as especialidades da natação.<br>Glutathione S-Transferases are a superfamily of ubiquitous multifactorial enzymes, which play a key role in cellular detoxification, protecting macromolecules from attack by reactive electrophiles, including reactive oxygen species (ROS) and chemotherapeutis agents. GSTs are the most abundant intracellular enzymes, and have multiples roles as anti-oxidant enzyme. In this study, we analyzed the association of the GSTM1 and GSTT1 null polymorphisms, in a group of competitive swimmers of different specialities. We undertook a case-control study in a group of Portuguese competitive swimmers that included 33 athletes, 20 were male and 13 female. The control group had 52 individuals, 38 males and 14 female. Genomic DNA was extracted from blood samples, and genotyping analyses were performed by PCR methods. Odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals were calculated using SPSS. We found that the presence of GSTT1 protein seems to be important for all athletes and is independent of their gender. The results suggest that the presence of GSTT1 protein in the dimmers that it can integrate seems to confer specific and advantageous characteristics in swimming specialities.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz<br>A formação de espécies reativas de oxigénio (ROS) é a principal responsável pela ocorrência de danos celulares no organismo. Estas espécies reativas são geralmente controladas pela presença de espécies antioxidantes, que ajudam a manter o equilíbrio do ambiente. Contudo, quando a ação das espécies antioxidantes para com as ROS já não é eficaz ocorre um desequilíbrio homeostático por aumento de espécies reativas, dando assim origem ao aparecimento de um mecanismo denominado de stress oxidativo. O mecanismo de stress oxidativo pode ser desencadeado por diversos fatores, sendo eles exógenos (radiações ultravioleta, temperaturas altas, químicos e da alimentação) ou endógenos (ação mitocondrial), que independentemente do tipo de fonte, vão ter uma ação prejudicial para o ser vivo. A principal ação destas espécies reativas de oxigénio consiste no ataque a diversas moléculas importantes do organismo, nomeadamente, a lípidos, proteínas e ao ácido desoxirribonucleico (DNA), que ao interferirem com estas moléculas vão comprometer o seu bom funcionamento, provocando danos graves nas células e, por conseguinte, o aparecimento de um vasto leque de patologias. De modo a perceber o mecanismo de ação das ROS é necessário recorrer a metodologias analíticas e amostras biológicas específicas para efetuar a sua deteção e análise. Porém, devido à instabilidade e reatividade característica destas espécies, torna-se impossível a sua medição e, consequentemente, a perceção da extensão do dano oxidativo causado. Assim, a utilização de biomarcadores de stress oxidativo torna-se uma opção viável para contornar o problema de análise das espécies reativas de oxigénio, uma vez que estes marcadores biológicos são moléculas mais estáveis, específicas e sensíveis com a capacidade de serem mensuráveis, e desse modo úteis para a compreensão da ação do stress oxidativo no organismo.

Dissertação de mestrado, Ciências Farmacêuticas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016<br>O cancro é uma das principais causas de morte no mundo. Em Portugal é respon-sável por cerca de 25 mil mortes por ano, sendo as principais neoplasias malignas as do estômago, cólon, reto e ânus, traqueia, brônquios e pulmão, e mama. A maioria dos tra-tamentos convencionais para esta patologia, como a quimioterapia e a radioterapia, acar-retam inúmeros efeitos adversos, que podem ser bastante debilitantes. Em casos mais ex-tremos é mesmo necessário recorrer à cirurgia. A terapia fotodinâmica é uma estratégia terapêutica emergente que consiste na utilização de um composto, o fotossensibilizador, que, quando exposto a radiação de um determinado comprimento de onda, é ativado em meio celular, dando origem a espécies reativas de oxigénio, nomeadamente oxigénio singleto. Estas espécies reativas, por sua vez, desencadeiam mecanismos de oxidação que conduzem à destruição das células, por apoptose, necrose ou autofagia. Para além dos mecanismos de morte celular, também estão envolvidos mecanismos de estimulação imunitária e de destruição vascular. Os fo-tossensibilizadores utilizados atualmente são seletivos para células tumorais, o que torna a terapia fotodinâmica uma boa estratégia antineoplásica. Apresenta várias vantagens re-lativamente a outras terapêuticas convencionais, como a grande especificidade tumoral, não é um tratamento invasivo e, comparativamente, apresenta efeitos adversos mínimos. Nesta monografia são descritos os mecanismos de proliferação tumoral assim como o suporte teórico relativo à terapia fotodinâmica e seus mecanismos. Também são apresentados alguns dos fotossensibilizadores mais utilizados para a terapêutica antineo-plásica, assim como as suas aplicações clínicas.

As espécies reativas de oxigénio e azoto desempenham um papel importante em certas funções fisiológicas, como na inflamação, mas em situações de sobreprodução ou desregulação podem ter vários efeitos lesivos para as biomoléculas. O objetivo foi construir um modelo matemático de equações diferenciais ordinárias (ODEs) que descrevesse a rede de reações químicas entre as diferentes espécies reativas e as biomoléculas. Para tal: a) foram recolhidas da literatura e utilizadas as constantes cinéticas das várias reações para escrever as equações cinéticas de todas as reações que constituíram o sistema estudado; b) com base nas várias equações cinéticas foram construídas as equações diferenciais que descreviam a evolução temporal de cada espécie química no sistema, recorrendo à abordagem do tipo Continuously Stirred Batch Reactor (CSBR); c) otimizou-se os parâmetros do modelo de modo a obter um sistema em estado estacionário que mimetizou as condições observadas na circulação sistémica; d) foi feita a análise do modelo com recurso à análise de fluxos e de coeficientes de controlo, que identificaram quais os principais pontos de controlo do sistema. Com estes passos obteve-se um modelo matemático robusto que permitiu a simulação de situações fisiológicas como a desregulação dos sistemas de produção de espécies reativas ou o efeito de antioxidantes sobre o nível global de espécies reativas e sobre o nível de lesões induzidas às biomoléculas: ▪ As concentrações de estado estacionário das espécies tamponantes do sangue bem como da água, do hidrónio e do anião hidróxido mantiveram-se constantes em todas as variações; ▪ As variações do óxido nítrico e do superóxido ocorreram exatamente de acordo com o que se esperava; ▪ A variação da concentração do anião nitrato correspondeu à variação da concentração do peroxinitrito, indicando a composição do mesmo; ▪ Todas as espécies reativas tiveram a variação das suas concentrações como esperado em relação da variação das concentrações de estado estacionário dos antioxidantes. Contudo, não foi possível obter um modelo que descreva adequadamente o sistema de tamponamento do sangue, tendo-se identificado a origem desse erro no excessivo detalhe utilizado para descrever essas reações.<br>Reactive oxygen and nitrogen species play an important role in certain physiological functions, such as in inflammation, but in situations of overproduction or deregulation, they may have several detrimental effects on biomolecules. The goal was to construct a mathematical model of ordinary differential equations (ODEs) that describes the network of chemical reactions between different reactive species and biomolecules. For such: a) they were collected from literature and kinetic constants of the various reactions were used to write the kinetic equations of all the reactions that constituted the studied system; b) based on the various kinetic equations the differential equations that described the temporal evolution of each chemical specie in the system were constructed, using the Continuously Stirred Batch Reactor (CSBR); c) the model parameters were optimized to obtain a steady-state system that mimicked the conditions observed in the systemic circulation; d) the analysis of the model using flow and control coefficients analysis was performed, which identified the main control points of the system. These steps yielded a robust mathematical model that allowed the simulation of physiological situations such as the deregulation of reactive species production systems or the effect of antioxidants on the global level of reactive species and on the level of biomolecule induced lesions: ▪ Steady-state concentrations of the buffering species in the blood as well as water, hydronium and hydroxide anion remained constant in all variations; ▪ Changes of nitric oxide and superoxide went exactly according to what was expected; ▪ The variation of the concentration of the nitrate anion corresponded to the variation of the peroxynitrite concentration, indicating its composition; ▪ All reactive species had the variation of their concentrations as expected in relation to the variation of the steady-state concentrations of the antioxidants. However, it was not possible to obtain a model that adequately describes the blood-buffering system, and the origin of this error was identified in the excessive detail used to describe these reactions.

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>As mitocôndrias desempenham um papel fundamental na homeostase celular. Para além do seu papel essencial na função energética, estes organelos produzem e eliminam espécies reativas de oxigénio (ROS). Historicamente associados a um papel nocivo e relevante no stress oxidativo, ROS são igualmente sinalizadores ubíquos da mitocôndria para o resto da célula. Sestrin 2 (Sesn2) é uma proteína induzível por ROS, que exibe propriedades antioxidantes e inibitórias da atividade do mTORC1. Além disso, Sesn2 foi recentemente identificada como um elemento ativo da indução de mitofagia e consequentemente do controlo da qualidade da população mitocondrial. Considerando estas características, esta proteína representa um potencial regulador da mitohormesis. Este conceito define que níveis moderados de produção de ROS mitocondriais não só induzem uma adaptação oportuna ao atual stress, mas também aumentam a capacidade de resposta a stresses secundários. Nesta perspetiva, este trabalho foi focado na compreensão do envolvimento mitohormético da mitofagia mediada por Sesn2.Aqui demonstramos que 18 h de restrição de glucose diminuíram a produção celular total de ROS. Além disso, apesar de não ter sido observado um aumento significativamente de superóxido mitocondrial às 3 h, verificamos uma diminuição subsequente deste radical às 6 h em células privadas de glucose. Um aumento do conteúdo em Sesn2 foi também observado, em conjunto com um grau superior de fragmentação mitocondrial e aumento de mitofagia. Estas alterações não foram associadas a alterações na ativação da caspase-3, o que parcialmente sugere a preservação de uma normal suscetibilidade à apoptose em resposta a 18h de restrição de glucose. O impacto destes eventos foi posteriormente analisado numa subsequente exposição a 24 h de hiperglicemia. Em células pré-expostas a 18h de restrição de glucose não foi verificado um aumento de produção de ROS e mitofagia durante as 24h de hiperglicemia. Estes resultados sugerem que 18 h de restrição de glucose representam um processo similar de indução de mitohormesis em C2C12, na qual o aumento do conteúdo em Sesn2 pode melhorar a funcionalidade mitocondrial através da promoção de mitofagia. Além disto, o envolvimento da Sesn2 durante a aquisição de resistência ao transiente stress pode igualmente explicar a menor extensão verificada dos efeitos prejudiciais de exposição à hiperglicemia, uma vez que o aumento de ROS e a remoção de mitocôndrias disfuncionais foi indetetável em células pré-expostas.Em conclusão, estes resultados sugerem um possível papel da Sesn2 numa adaptação mitohormética que permite uma maior resistência a outras condições associadas à indução de stress oxidativo, como a hiperglicemia.<br>Mitochondria are major controllers of the overall cellular homeostasis. They represent the energy supply of the cell and have the capacity to produce and detoxify reactive oxygen species (ROS). Historically represented by their harmful accumulation and dramatic role in oxidative stress, ROS are ubiquitous transmitters of information from mitochondria to the rest of the cell. Sestrin 2 (Sesn2) is an ROS-inducible protein, that exhibits anti-aging properties i.e. suppression of oxidative stress and mTORC1. Moreover, in a recent study Sesn2 was identified as an active mitochondrial homeostasis mediator due to its regulation of mitophagy. Considering these features, Sesn2 is a potential regulator of mitohormesis. This concept defines that low-level of mitochondrial ROS generation ensures a rapid adaptation to a mild stress and enhances long-term resistance to subsequent stresses. In this perspective, this work was focused on the understanding of the mitohormetic involvement of Sesn2- mediated mitophagy.Here we demonstrated that 18 h of glucose restriction decreased total cellular ROS generation. Moreover, even though we did not observe significantly increased production of mitochondrial superoxide at 3 h, we did verify a subsequent decrease of this radical at 6 h in glucose-deprived cells. Also, Sesn2 upregulation was observed after 6 and 18h, which was accompanied by mitochondrial fragmentation and induction of mitophagy. Furthermore, these changes were not associated with alterations in caspase-3 activation, which might do not translate a greater sensitivity to apoptosis from cells under 18 h of glucose deprivation. Moreover, cells previously exposed to glucose deprivation were later exposed to 24h hyperglycemia to verified the last-mentioned changes impact in response to another stress. In fact, these cells showed no hyperglycemic- mediated ROS and mitophagy increased after the 24 h exposure. Thus, we suggested that short-term glucose deprivation resembles a mitohormetic induction condition where Sesn2 upregulation leads to enhanced mitochondrial function through promotion of mitophagy. Moreover, these events might support the less extent of hyperglycemic detrimental effects, once the ROS increased and removal of dysfunctional mitochondria were undetectable in pre-exposed cells. Our findings suggest the possible Sesn2 enrolment during a pre-exposure with glucose deprivation, fundamentally through the modulation of mitophagy. Consequently, we believe that its upregulation might ensure the enhanced adaptation to further conditions associated with induction of oxidative stress, such as hyperglycemia.

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>O metilfenidato (MFD) é um psicostimulante da família das anfetaminas que é prescrito como primeira linha de tratamento para a Perturbação de Hiperactividade e Défice de Atenção (PHDA). Em doses terapêuticas o MFD é considerado seguro e manifesta poucos efeitos secundários. Contudo, o uso deste fármaco tem também muito sucesso entre jovens adultos saudáveis que procuram uma melhoria no desempenho cognitivo e em desportos de alta competição. Neste momento ainda se sabe muito pouco sobre os efeitos do MFD no cérebro, essencialmente numa condição não-patológica. Tendo em conta que o seu consumo sem controlo médico atingiu números preocupantes, é extremamente importante esclarecer como o uso de MFD pode afetar o cérebro de indivíduos saudáveis. As células da microglia são consideradas os macrófagos residentes do sistema nervoso central (SNC) e são responsáveis pela homeostasia e defesa imune do cérebro. No entanto, em determinadas condições têm um efeito deletério. Após uma activação clássica, estas células apresentam um fenótipo pró-inflamatório caracterizado pela expressão de citoquinas pró-inflamatórias e produção de espécies reactivas de oxigénio (ERO) que de acordo com os níveis libertados podem ter um efeito positivo de sinalizações/defesa, ou negativo contribuindo para a neurodegenerescência. Por outro lado, uma ativação alternativa da microglia pode desencadear uma resposta anti-inflamatória por parte destas células e contribuir para a regeneração e recuperação de tecidos. Existem poucos estudos na literatura que relacionam o consumo de MFD com a activação da microglia. Assim, o objectivo do presente trabalho foi avaliar o papel do metilfenidato nas células da microglia e esclarecer alguns dos efeitos que podem advir do uso incorrecto deste fármaco. Os nossos resultados mostram que o MFD (500 µM) não induz morte das células da microglia mas leva a um aumento rápido e transitório dos níveis proteicos da citoquina pró-inflamatória interleucina-1β (IL-1β) e do inflamassoma NLRP3. Além disso, estes efeitos fazem-se acompanhar por um aumento na produção intracelular de ERO, o qual foi prevenido pela vitamina C (200 µM). Testámos ainda o efeito deste fármaco em ratos Wistar adultos saudáveis, que foram administrados oralmente com uma dose de 1.5 mg/kg/dia durante 21 dias consecutivos. Concluímos que a administração crónica deste psicoestimulante levou a uma ativação das células da microglia no córtex pré-frontal (CPF), a um aumento da produção intracelular de ERO, mas sem efeito significativo nos astrócitos. Mostrámos ainda uma diminuição significativa da marcação de células endoteliais sugerindo uma disfunção da barreira hemato-encefálica. Em conclusão, os nossos resultados mostram que o MFD causa a activação da microglia quer na linha celular N9 quer no córtex pré-frontal de ratos submetidos a um protocolo de administração crónica deste fármaco. Para além disto, a activação da microglia é acompanhada por várias características pró-inflamatórias (expressão de IL-1β, activação do NLRP3 e produção intracelular de ERO), as quais podem estar envolvidas na resposta e/ou adaptação das células da microglia ao ambiente envolvente.<br>Methylphenidate (MPH) is an amphetamine-like psychostimulant widely prescribed for attention-deficit hyperactivity disorder (ADHD). Therapeutic use of MPH is considered safe and produces few side effects. However, MPH has become very popular among healthy young adults in search for cognitive and competitive sports enhancement. At the present moment, little is known about MPH effects in the brain, especially in a non-pathological condition. Taking into account that MPH misuse/abuse is becoming worrisome it is imperative to understand how MPH consumption affects the brain of healthy individuals. Microglial cells are considered the immune resident macrophages of the central nervous system (CNS) and are responsible for the brain homeostasis and immune defense. Yet, under certain conditions they may have a deleterious effect on the brain. Upon a classical activation, these cells can display a pro-inflammatory phenotype characterized by pro-inflammatory cytokines expression and reactive oxygen species (ROS) production that, according to the levels released, will have a positive effect of signaling/defense or a negative effect leading to neurodegeneration. Nevertheless, an alternatively activation of microglial cells can trigger an anti-inflammatory response by these cells and contribute to tissue repair and regeneration. There are only a few studies relating MPH consumption and microglial activation. Therefore, the aim of the present work was to evaluate MPH effects in microglial cells and clarify some of the consequences that may result from MPH misuse. Our results show that MPH (500 µM) does not cause microglial cell death but leads to a fast and transient upregulation of the pro-inflammatory cytokine IL-1β and the inflammasome NLRP3. Moreover, these effects were accompanied by an increase in intracellular ROS levels, which was prevented by vitamin C (200 µM). Furthermore, we investigated the impact of chronic MPH administration (1.5mg/kg/day, p.o, during 21 days) in healthy Wistar Rats. We showed that MPH leads to microglial activation in the prefrontal cortex (PFC), which was accompanied by ROS production without astrocyte activation. Interestingly, MPH also decreased endothelial staining, suggesting a blood-brain barrier dysfunction.Overall, our results show that MPH causes microglial activation both in microglia N9 cellular line and in rat PFC. Moreover, microglial response is accompanied by several cellular pro-inflammatory hallmarks (IL-1β expression, NLRP3 activation and intracellular ROS production) which can be involved in microglia response and/or adaptation to the surrounding environment.<br>Outro - COMPETE 2020, PORTUGAL 2020

Candida albicans é um fungo comensal responsável por infeções no Homem, como as candidíases oral e vaginal. Por ser o agente causal de várias patologias, o seu estudo tem despertado um particular interesse uma vez que as infeções causadas por este fungo oportunista são umas das principais causas de morte em pacientes com imunodeficiência. Adicionalmente, C. albicans tem a particularidade de se adaptar facilmente a diferentes nichos biológicos e apresenta elevada resistência aos antifúngicos devido à sua capacidade de defesa antioxidante. O stresse oxidativo e a sua desintoxicação, através dos sistemas biológicos que agem de modo a remover ou reparar os danos causados pelas espécies reativas de oxigénio (ROS), pode ser desencadeado em C. albicans pelas defesas do hospedeiro ou por agentes químicos exógenos. O presente trabalho tem como objetivo compreender os mecanismos associados ao stresse oxidativo provocado pelo isotiocianato de benzilo (BITC) em C. albicans. Assim, dois isolados (O33 e O51) da mucosa oral de C. albicans e uma estirpe de coleção (C. albicans ATCC 90028) foram colocados a crescer em meio líquido Yeast Malt com e sem BITC (0,03 M) ao longo de 24 horas de ensaio, tendo sido avaliadas as suas respostas ao stresse oxidativo: de defesa antioxidante enzimática (superóxido dismutase, SOD, e catalase, CAT) e não enzimática (ROS totais, peróxido de hidrogénio, peroxidação lipídica, glutationa reduzida/glutationa oxidada, ácido eritro-ascórbico, compostos fenólicos totais e prolina), intra e extracelularmente. Em geral, na presença do BITC e no meio intracelular, a atividade das enzimas SOD (p < 0,001) e CAT (p < 0,05) aumentaram, diminuindo a concentração das ROS existentes (p < 0,001) e a peroxidação lipídica (p < 0,01). Contudo, as respostas não enzimáticas, como o ácido eritro-ascórbico, prolina e compostos fenólicos variam muito com a estirpe. Em conclusão, o BITC induz stresse oxidativo em C. albicans, sendo a intensidade e a resposta estirpe-dependente.<br>Candida albicans is a commensal fungus responsible for infections in man, such as oral and vaginal candidiasis. Because it is the causal agent of several pathologies, its study has aroused a particular interest since the infections caused by this opportunistic fungus are one of the main causes of death in patients with immunodeficiency. Additionally, C. albicans has the peculiarity of easily adapting to different biological niches and presents high resistance to antifungals due to its capacity of antioxidant defense. Oxidative stress and its detoxification, through biological systems that act to remove or repair damage caused by reactive oxygen species (ROS), can be triggered in C. albicans by host defenses or by exogenous agents. The present work aims to understand the mechanisms associated with oxidative stress caused by benzyl isothiocyanate (BITC) in C. albicans. Thus, two isolates (O33 and O51) from the oral mucosa of C. albicans and a collection strain (C. albicans ATCC 90028) were grown in Yeast Malt broth with (0.03 M) and without BITC over 24-hour assay and evaluated their responses to oxidative stress: enzymatic (superoxide dismutase, SOD, and catalase, CAT) and non-enzymatic (Total ROS, hydrogen peroxide, lipid peroxidation, reduced glutathione/oxidized glutathione, erythro-ascorbic acid, total phenolic compounds and proline), antioxidant defenses, both in intra- and extracellularly. In general, in the presence of BITC and in the intracellular medium, the activity of SOD (p <0.001) and CAT (p <0.05) enzymes increased, decreasing the total ROS (p <0.001) and lipid peroxidation <0.01). However, non-enzymatic responses, such as erythro-ascorbic acid, proline and phenolic compounds vary greatly among strains. In conclusion, BITC induces oxidative stress in C. albicans, and the intensity and type of response seemed strain-dependent.

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019<br>Existe uma grande variedade de cancros que afetam o sistema nervoso central, esta monografia focar-se-á no glioma, um tipo de cancro agressivo e virtualmente incurável com as práticas atuais, que incluem excisão cirúrgica, radioterapia e quimioterapia. Recentemente, como alternativa aos tratamentos convencionais foi dada uma maior importância aos sistemas antioxidantes e ao seu envolvimento neste tipo de tumores malignos. A presente monografia refere-se precisamente a interação entre os principais sistemas redox, nomeadamente o Sistema da Tiorredoxina e glutationa e o seu papel nas várias etapas da tumorogénese do glioma. Apesar destes sistemas desempenharem um papel importante contra o stress oxidativo, pela detoxificação de vários radicais livres, peróxidos entre outros compostos oxidantes. Nas células tumorais este sistema encontra- se sobre-expressão, o que constitui um mecanismo de defesa, da célula tumoral contra o stress oxidativo gerado pelo seu crescimento descontrolado. Através da sobre- expressão destes sistemas redox, as células cancerígenas são capazes ainda de inibir a morte celular, controlar a sinalização celular ou promover a ativação de fatores de crescimento, entre outros. Torna-se assim evidente que a modulação destes sistemas constitui um novo alvo terapêutico a considerar.<br>There exists a great variety of cancers that affect the central nervous system, this document will focus on the glioma, a rare, aggresive and virtually incurable cancer with the available procedures, like radiotherapy , chemotherapy or surgical excision. Nowadays, attention is being directed to the importance of redox systems, as an alternative to the traditional treatment. The present document will focus precisely, on the interaction between the main redox systems and cancer cells. The two main redox systems present in the human body are: tioredoxin and glutathione system. Despite this systems having a important function in the detoxification of peroxides and other kinds of oxidant compounds, in cancer cells this systems are highly up-regulated, which kind of constitute a defense mechanism of the cancer cell against their own generated oxidative stress due to the exponential growth rate. This way the cancer cells are able to perpetuate the infinite growth, inhibit cell death, control cellular signaling or promote the growth factor activation. Therefore it is imperative that we understand the mechanism underneath these systems, so that in a near future we will be able to modulate them as we please.

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2021<br>Abstract Epilepsy is a prevalent neurological disorder that affects 65 million people worldwide, according to the World Health Organization. It is characterized by the occurrence of seizures, due to an excessive and deregulated neuronal activity. In the last decades, many researches proved a correlation between epilepsy and neuroinflammation. Temporal lobe epilepsy, one of the most common and severe forms of epilepsy, affects mainly the hippocampus and is associated to inflammatory events that promote neuronal death and and increase in the expression of inflammatory markers. Interleukin (IL)-1β has a key role, promoting synaptic dysfunction, hyperexcitabillity and neuronal death. Taking this into account, neuroinflammation is considered a potential therapeutic target for epilepsy. Recently, an inflammatory mediator, the NLRP3 inflammasome was found to be related to the epileptogenic process. This cytoplasmic protein complex is composed of 3 domains: the sensor (NLRP3) that detects stress or infection signs, the adaptor, ASC, and the effector, Caspase-1 which ensures the conversion of pro IL-1β into IL-1β, when activated. For this epileptogenesis model, rhinal-cortex-hippocampus organotypic slices were used, in order to simulate hippocampus environmental features in vivo, as the neuronal connectivity and the synaptic plasticity, allowing the epileptiform activity. Previous studies showed NLRP3 domains expression with this model, as well as an increase in the expression of intracellular IL-1β throughout the culture. This work aims to explore reactive oxygen species (ROS) as potential activators of NLRP3 inflammasome, in this ex vivo model of epileptogenesis. Control (CTL) and epileptic-like (EL) slices were maintained under a serum reduction protocol throughout the time. Samples of CTL and EL organotypic slices were collected at 3, 7, 14 and 21 days in vitro (DIV), and assays of ROS quantification, immunoprecipitation and ELISA were performed. In the second phase of this project, slices were maintained in the presence of an antioxidant and its impact in the ROS production, NLRP3 inflammasome assembly and IL-1β release was later evaluated. ROS production was evaluated through a fluorescence detection assay. An immunoprecipitation assay, followed by a western blot analysis, was carried out in order to assess NLRP3 inflammasome assembly, throughout the detection of its components: NLRP3 protein and ASC. The secretion of the pro-inflammatory cytokine IL-1β was assessed by ELISA. All the assays were performed in samples of CTL and EL slices from all time points. After that, the process was repeated with an antioxidant treatment applied to the cultures. Statistical analysis was performed in GraphPad Prism with Two-way Analysis of Variance (ANOVA) and statistical significance was considered when p…

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia<br>Nowadays, cancer is a worldwide disease. There are millions of people living with the diagnosis of cancer. The raise of incidence has several causes, such as the increase of life expectancy and lifestyle changes.Similarly, this increase of incidence has led to the investment of research on this area in recent years. Thereby, it is necessary to put into practice a constant research not only in forms of detection, but also in forms of prevention and treatment of cancer, in order to improve the quality of life of these patients, not only during treatment, but also after.Today there are numerous anticancer treatments, such as chemotherapy and radiation therapy. However, it is very difficult to treat a cancer. These difficulties are based in problems such as resistance to medication and side effects. It is imperative to study the evolution of cancer, its characteristics, as in the characteristics of cancer cells versus normal cells, so that individualized treatment can be achieved.The main objective of this manuscript is to explore the effects of reactive oxygen species on cancer cells, for the treatment of this disease. It will be described some of the characteristics of cancer cells and some of the characteristics of reactive oxygen species. The focus will be based on anticancer treatment with reactive oxygen species, advantages and disadvantages of this treatment and the concerns that exist in its implementation. Finally, the role of the pharmacist in monitoring cancer patients will be discussed.<br>O cancro é uma doença que, atualmente, atinge o mundo inteiro. Existem milhões de pessoas a viver com o diagnóstico de cancro. O aumento da incidência tem várias causas, desde o aumento da esperança média de vida, às mudanças do estilo de vida. A incidência desta doença levou a que a investigação nesta área aumentasse muito nos últimos anos. É necessário que esta investigação seja constante e que procure não apenas formas de deteção, mas também formas de prevenção e de tratamento, de forma a conseguir melhorar a qualidade de vida destes doentes durante e após o tratamento. Atualmente, existem inúmeros tratamentos anticancerígenos, como a quimioterapia e a radioterapia. No entanto, é muito difícil conseguir um tratamento apropriado. Estas dificuldades têm várias origens, como por exemplo, a resistência à medicação e os efeitos colaterais. É imperativo estudar a evolução do cancro, as características das células cancerígenas e o que as distingue das células normais, de forma a conseguir-se fazer uma terapêutica individualizada. A presente monografia explora os efeitos das espécies reativas de oxigénio nas células cancerígenas, com o propósito de serem usadas no tratamento do cancro. Descrevem-se algumas características das células cancerígenas e das espécies reativas de oxigénio. O seu foco é uma nova abordagem ao tratamento anticancerígeno com as espécies reativas de oxigénio, os prós e os contras desta terapia e as preocupações que existem na sua implementação. Por fim, é ainda comentado, de forma breve, o papel do farmacêutico no acompanhamento de doentes oncológicos.

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>Função homeostática mitocondrial e um balanço redox, são essenciais para obter vias de sobrevivência e de morte celular adequadas. Daí que a mitocôndria constitui um forte alvo para estratégias de intervenção terapêutica. Antioxidantes com base em ácidos fenólicos, abundantes na natureza, têm vindo a despertar um grande interesse devido às suas propriedades intrínsecas de regulação redox. Apesar do seu uso limitado como agentes terapêuticos devido a limitações farmacocinéticas, são moldes úteis em processos de descoberta de novos fármacos. Novos agentes mitocondriotrópicos foram desenvolvidos pelo nosso grupo – AntiOxCIN4 e AntiOxBEN2, com base em ácidos hidroxicinâmicos e hidroxibenzóicos, respetivamente, que exploram a ligação de um catião lipofílico para gerar acumulação específica na mitocôndria. Daí que, com este projeto, pretendemos não só validar o uso de novos antioxidants exogenos ligados a um catião de TPP+ como forma viável de os redirecionar à mitocôndria e com isso mitigar a frequência de eventos relacionados com o stress oxidativo, mas também revelar e compreender os potenciais efeitos que os mesmos podem ter no metabolismo celular e estado redox de fibroblastos da derme humanos normais.Aqui, estudamos a capacidade dos antioxidantes mitocôndriotrópicos de modular o metabolismo de células NHDF, a sua infuência no estado redox celular, os seus efeitos nos níveis de proteína de AMPK, as suas diferentes toxicidades dependentes da dose na massa celular, atividade metabólica e níveis de ATP, tal como potencial toxicidade mitocondrial, e finalmente a sua influência na expressão de vários transcritos mitocondriais.Demonstramos com sucesso que ambos o AntiOxCIN4 e o AntiOxBEN2 têm a capacidade de modular o metabolismo de células NHDF, uma vez que ambos aumentam a taxa glicolítica, evidenciado pelo aumento dos rácios lactato/alanina. O fluxo glicolítico de células tratadas com AntiOxBEN2 é significativamente mais alto, coerentemente acompanhado por um aumento da absorção de glucose e de produção de lactato quando comparado a células controlo não tratadas. Esta modulação metabólica não foi acompanhada por alterações na expressão de AMPK como foi hipotisado. Nenhum dos antioxidantes redirecionados à mitocôndria alterou o estado redox das células. De um modo geral, o AntOxBEN2 demonstrou uma toxicidade mais elevada, do que aquela do AntiOxCIN4, visto que células tratadas com o primeiro mostraram maiores diminuições da massa celular, atividade metabólica e níveis de ATP.Privação celular de glucose na presença de glutamina e piruvato provou ser um excelente indicador da toxicidade de um composto sobre a mitocôndria quando acompanhado da medição dos níveis celulares de ATP e de ensaios de citotoxicidade. Mostramos que a presença de AMPK é essencial para despertar uma adaptação celular quando os antioxidantes mitocondriotrópicos são adicionados a células. Adicionalmente, provamos que a presença de AntiOxCIN4 não afeta negativamente a respiração mitocondrial, ao contrário de células tratadas com AntiOxBEN2 que mostram uma capacidade respiratória deficiente juntamente com uma menor capacidade de produção de ATP.Os níveis de expressão genética de Glut-1 e Hif-1α estavam aumentados (em 75.27% e 34.82%, respetivamente) em células tratadas com AntiOxBEN2 quando comparado a células controlo, possivelmente ajudando à compreensão da maior incorporação de glucose e do comportamento glicolítico hiperativo observado durante todo o projeto. Células tratadas com AntiOxBEN2 também mostraram níveis mais baixos de LC3 e de PINK, ambos os quais são marcadores de autofagia, sugerindo que o tratamento com AntiOxBEN2 pode diminuir a capacidade autofágica de células NHDF. Por outro lado, AntiOxCIN4, praticamente não mostra efeitos negativos em células tratadas, mantendo porém todos os benefícios antioxidantes.<br>Homeostatic mitochondrial function and redox balance is essential for proper cellular survival and death signaling. Thus, mitochondria pose as strong targets for therapeutic intervention strategies. Antioxidants based on naturally-occurring phenolic acids have shown great pharmacological interest due to their intrinsic redox regulating properties. Despite their limited use as therapeutic agents due to pharmacokinetic drawbacks, they are useful scaffolds in drug discovery processes. Novel mitochondriotropic agents developed by our research group AntiOxCIN4 and AntiOxBEN2, based on hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acids, respectively, exploit the covalent binding of a lipophilic cation to drive specific accumulation in mitochondria. Thus, with this global project we intend to not only validate the use of novel exogenous antioxidants coupled to a TPP+ cation as a viable way of targeting mitochondria and mitigating oxidative stress related events, but also to reveal and understand the broad spectrum of potential cellular effects that they might have on the cellular metabolism and redox state of normal human dermal fibroblasts.Herein, we studied the mitochondriotropic antioxidants’ ability to modulate NHDF cell metabolism, their influence on cellular redox state, their effects on AMPK protein levels, their different dose-dependent toxicologic patterns on cell mass, metabolic viability and ATP levels, as well as potential mitochondrial toxicity, and finally their influence on the expression of several mitochondrial transcripts.We successfully demonstrate that both AntiOxCIN4 and AntiOxBEN2 have the ability to modulate the cellular metabolism of NHDF cells, as both compounds increase the cells’ glycolytic rate, as observed by increased lactate/alanine ratios. The glycolytic flux of cells treated with AntiOxBEN2 is significantly higher, coherently, paired with a higher uptake of glucose and lactate production when compared to that of control untreated cells. This metabolism modulation was not accompanied by changes in AMPK expression as was hypothesized. None of the mitochondria-targeted antioxidants altered the cellular redox state. Overall, AntiOxBEN2 demonstrated higher toxicity than AntiOxCIN4 as a larger decrease of cell mass, metabolic viability and ATP occurred when cells were treated with the former.Cellular glucose deprivation in the presence of glutamine and pyruvate proved to be an excellent indicator of a compound’s toxicity on mitochondria when coupled with the measurement of ATP levels and cytotoxicity assays. We show that the presence of AMPK is essential for the metabolic adaptation observed when the mitochondriotropic antioxidants were added to cells. Additionally, we proved that the presence of AntiOxCIN4 does not negatively affect mitochondrial respiration, unlike AntiOxBEN2-treated cells which show deficient respiratory and ATP producing capabilities.Glut-1 and Hif-1α gene expression levels were increased (by 75.27% and 34.82%, respectively) in AntiOxBEN2-treated cells when compared to control cells, possibly helping to explain the higher glucose uptake and glycolytic behavior seen throughout this work. AntiOxBEN2-treated cells also presented lower LC3 and PINK levels, both of which are autophagy markers, implying that AntiOxBEN2 may diminish the autophagic capability of NHDF cells. AntiOxCIN4, on the other hand, shows little to no negative effects on treated cells, whilst maintaining all of the antioxidant benefits.<br>FCT

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz<br>A determinação do stress oxidativo tem sido alvo de intensos estudos nos últimos anos, devido ao seu elevado potencial de impacto na saúde humana. No presente trabalho realizou-se uma revisão bibliográfica sobre os principais métodos de medição do stress oxidativo em seres vivos entre 2010 e 2015. De modo a situar o tema, descreveu-se inicialmente o conceito de stress oxidativo e as principais doenças associadas. A seguir apresentaram-se as principais espécies de radicais responsáveis por oxidação, os principais agentes antioxidantes, enzimáticos e não enzimáticos, e os principais biomarcadores de avaliação do stress oxidativo. Em relação aos métodos analíticos, procedeu-se ao seu agrupamento de acordo com o analito em causa. No âmbito das espécies reativas de oxigénio (ROS) e azoto (RNS), apresentam-se as principais sondas fluorescentes e quimioluminescentes, nomeadamente lucigenina, hidroetidina (DHE) e MitoSOX, características da medição de radical superóxido, assim como as relativas à determinação do peróxido de hidrogénio, nomeadamente diclorofluoresceína (DCFH-DA), HyPer, boronato e Amplex red (AmR). Ainda no âmbito de ROS abordou-se a ressonância de spin electrónico (ESR), que se destaca por detetar os radicais livres envolvidos na auto-oxidação. A propósito de RNS, são comentadas a diaminofluoresceína (DAF2-DA) e a dihidrorodamina (DHR), como meios de determinação dos níveis de monóxido de azoto e peroxinitrito, respectivamente. Relativamente aos biomarcadores, apresentam-se os métodos de análise dedicados à detecção dos F2-isoprostanos, hidroperóxidos de lípidos, e malondialdeído (MDA), associados à peroxidação lipídica, e aqueles referentes aos derivados hidroxilados da guanosina, utilizados na determinação do dano oxidativo no DNA e RNA. Os métodos cromatográficos, hifenados com espectroscopia de quimiluminescência, de fluorescência, e espectrometria de massa (MS/MS), além de detectores electroquímicos (ECD), são os mais frequentemente utilizados, juntamente com os imunoensaios enzimáticos (ELISA). No que respeita aos antioxidantes, a diversidade de metodologias é mais evidente, embora prevaleçam os métodos por cromatografia líquida.

The skin is the largest organ of the human body and is responsible for numerous vital functions as being a physical protective barrier against the invasion of pathogenic microorganisms, penetration of harmful chemicals, and of ultraviolet rays, while having also important roles as in body fluid homeostasis and the elaboration of immune and sensitive responses. The cooperation between the various constituting elements of the skin (keratinocytes, fibroblasts, immune system cells, motor and sensitive nerve fibres, glands, blood and lymphatic vessels) together with the microorganisms residing on its surface is important to keep the body healthy. Numerous common skin disorders such as atopic dermatitis, psoriasis and acne can be associated with an individual's genetic predisposition, but also with an imbalance in the microflora of the skin or even to an uncontrolled activation of responses of the innate and adaptive immune system due often to over-expression of proteins such as cyclooxygenase-2 (COX-2), responsible for the genesis of chronic inflammatory processes and oxidative stress that lead to the production of molecules such as nitric oxide (NO) and reactive oxygen species (ROS) that, when in excess, become toxic and harmful to the cells. Humulus lupulus Linnaeus, belonging to the Cannabaceae family, is popularly used in beer making and in traditional medicine for its relaxing therapeutic properties, such as the treatment of insomnia and anxiety. The inflorescence of H.lupulus is the part of the plant mostly used because it is where the lupulin gland is located, an organ harbouring mainly 15-30% of resins (hard and soft resins), essential oils, polyphenols, among other minority compounds responsible for the medicinal character of the plant. These secondary metabolites of H.lupulus are known to have a high anti-inflammatory, anxiolytic, antidepressant, antioxidant and antimicrobial potential. In this dissertation, the capacity of aqueous extracts of the flower, the mix aqueous extract (mixture of stems, leaves and flowers), the flower hydrolate and the mix hydrolate of H.lupulus was studied to decrease multiplication of Gram-positive (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and Cutibacterium acnes) and Gram-negative (Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa) bacteria by the microdilution method and in the alteration of the metabolic activity of 3T3 fibroblast cells and RAW macrophages from mouse skin by the colorimetric method, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). The impact of these extracts on the production of NO was also evaluated by the Griess method, production of ROS by fluorescent molecules such as H2DCFDA, and on the expression of COX-2 an agent involved in the inflammation processes after activation of macrophages by lipopolysaccharide (LPS) by Western blot. The results show that H.lupulus flower hydrolate presents higher antibacterial capacity (especially against Gram-positive bacteria), strong antioxidant capacity, because it significantly reduces the production of ROS reduces inflammation, decreasing the production of NO and decreasing the expression of COX-2 by LPS activated macrophages. The remaining extracts also presented anti-inflammatory and antioxidant effects, but less evident than the flower hydrolate. Mix hydrolate and aqueous extract showed a low antibacterial effect for some of the strains under study and did not significantly alter the metabolic activity of 3T3 fibroblasts and RAW macrophages. This study demonstrated that H.lupulus, mainly the inflorescence of the plant (flowers), has chemical elements with anti-inflammatory, antioxidant and antibacterial capacities supporting the concept of being H.lupulus products very interesting to be used in treatment and prevention of diseases of the skin while respecting its physiological constitution . However, further studies are necessary in order to better understand the profile of the different chemical compounds of H.lupulus and to establish the best effective concentration yet non-toxic for the cells and microbiota of skin.<br>A pele, é o maior órgão do corpo humano e é responsável por inúmeras funções vitais como barreira física protetora contra a invasão de microrganismos patogénicos, penetração de produtos químicos nocivos e de raios ultravioleta, mas também desempenha papéis importantes na homeostasia corporal e na elaboração de respostas imunes e sensitivas. A cooperação existente entre os vários elementos constitutivos da pele (queratinócitos, fibroblastos, células do sistema imunitário, fibras nervosas motoras e sensitivas, glândulas, vasos sanguíneos e linfáticos) e até mesmo com os microrganismos, da sua superfície é importante para manter o organismo saudável. Inúmeros distúrbios frequentes da pele como a dermatite atópica, a psoríase e a acne podem estar associadas a uma predisposição genética do indivíduo, mas também a um desequilíbrio da microflora da pele ou mesmo a uma ativação sem controlo de respostas do sistema imunitário inato e adaptativa devido muitas vezes a sobrexpressão de proteínas tais como a ciclooxigenase-2 (COX-2) responsáveis pela génese de processos inflamatórios e de stress oxidativo crónicos que levam à produção de moléculas como o óxido nítrico (NO) e espécies reativas de oxigénio (ROS) que quando em excesso se tornam tóxicos e deletérios para as células. O Humulus lupulus Linnaeus, pertencente a família dos Cannabaceae é popularmente utilizado na confeção da cerveja e na medicina tradicional pelas suas propriedades terapêuticas relaxantes, como, por exemplo, no tratamento de casos de insónia e ansiedade. A inflorescência do H.lupulus é a parte da planta mais utilizada por ser onde está localizada a glândula da lupulina, órgão constituído maioritariamente por resinas 15- 30% (resinas duras e macias), óleos essenciais, polifenóis, entre outros compostos minoritários responsáveis pelo carater medicinal da planta. Estes metabolitos secundários do H.lupulus são conhecidos por apresentarem um alto potencial anti-inflamatório, ansiolítico, antidepressivo, antioxidante e antimicrobiano. Na presente dissertação, foi estudada a capacidade de extratos aquosos da flor, do mix (mistura de caules, folhas e flores), do hidrolato da flor e do hidrolato do mix do H.lupulus na diminuição da multiplicação de estirpes bacterianas Gram-positivas (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis e Cutibacterium acnes) e Gram-negativas (Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa) pelo método de microdiluição e na alteração da atividade metabólica de células de fibroblastos 3T3 e de macrófagos RAW provenientes da pele de ratinhos através do método colorimétrico, brometo de [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium] (MTT). Foi também avaliado o impacto destas substâncias na produção de NO, através do método de Griess, produção de ROS através de moléculas fluorescentes como o H2DCFDA, e na expressão da COX-2, agente interveniente nos processos de inflamação após ativação dos macrófagos pelo lipopolissacarideo (LPS), por Western blot. Os resultados obtidos demonstram que o hidrolato da flor do H.lupulus apresenta maiores capacidades antibacterianas, especialmente contra as bactérias Gram-positivas, forte capacidade antioxidante, porque diminui significativamente a produção de ROS, reduz a inflamação, diminuindo a produção de NO e a expressão da COX-2 pelos macrófagos ativados pelo LPS. Os restantes extratos apresentaram também efeito anti-inflamatório e antioxidante, mas menos evidente do que o hidrolato da flor. O hidrolato do mix e o extrato aquoso do mix demonstraram um baixo efeito antibacteriano para algumas das estirpes em estudo e não alteraram significativamente a atividade metabólica dos fibroblastos 3T3 e dos macrófagos RAW. Este estudo demonstrou que o H.lupulus, principalmente a inflorescência da planta (flores) possui elementos químicos com capacidades anti-inflamatórias, antioxidantes e antibacterianas, podendo ser bastante interessantes na conceção de produtos à base de lúpulo com o intuito terapêutico e de prevenção de doenças que possam surgir na pele respeitando ao mesmo tempo a sua constituição fisiológica. Contudo mais estudos são necessários de modo a se conhecer melhor o perfil dos diferentes compostos químicos do H.lupulus bem como de modo a se estabelecer concentrações não toxicas para as células e microrganismos que compõem a microbiota da pele.

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.<br>As Doenças Inflamatórias Intestinais (DII) são um grupo de doenças crónicas do trato gastrointestinal (GI) com elevada incidência a nível mundial. Estas doenças são caracterizadas por uma excessiva produção de mediadores pro-inflamatórios, excessiva ativação do fator de transcrição NF-κB e disfunção na barreira intestinal para além de, um aumento do stress oxidativo. Hoje em dia ainda não existe um tratamento específico para as DII e os fármacos usados para o tratamento estão associados a vários efeitos secundários. A falta de um tratamento e os efeitos secundários associados às terapias usadas criam a necessidade de investigar novas estratégias de tratamento mais eficazes e seguras. Os polifenóis, nomeadamente as antocianinas, são compostos abundantes na alimentação, e mostram possuir uma grande variedade de efeitos benéficos na saúde humana. Estes são conhecidos pela sua grande capacidade antioxidante e anti-inflamatória e, apesar da extensa biotransformação e baixa biodisponibilidade, as antocianinas mostram ser uma boa forma para tratamento e prevenção das DII. A cianidina-3-glucósido é uma antocianina descrita como um composto com grande capacidade antioxidante e anti-inflamatória, sendo metabolizada ao longo do trato gastrointestinal. O principal metabolito resultante dessa metabolização é o ácido protocatecuico. Este ácido fenólico, devido à presença de grupos hidroxilo ligados ao anel aromático, possui uma grande capacidade redutora de radicais, podendo estar envolvido nos efeitos benéficos da cianidina-3-glucósido. Este trabalho foi idealizado com o objetivo de realizar um estudo comparativo entre a cianidina-3-glucósido e o ácido protocatecuico relativamente aos efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios em células epiteliais do intestino, células HT-29, estimuladas com uma mistura de citocinas pro-inflamatórias, a IL-1α, o TNF-α e o IFN-γ. Inicialmente, num ensaio sem células, tanto o ácido protocatecuico como a cianidina-3-glucósido mostraram ser bons agentes redutores de radicais livres, possuindo uma atividade antioxidante superior à do Trolox. No entanto, em termos comparativos a cianidina-3-glucósido foi mais eficiente como composto antioxidante que o ácido protocatecuico.Relativamente aos ensaios em células, nem a cianidina-3-glucósido nem o ácido protocatecuico foram tóxicos para as células numa concentração até 25 μM, mas também não as protegeram da citotoxicidade induzida pela mistura de citocinas. A mistura de citocinas é capaz de desencadear a produção de diversos marcadores inflamatórios, nomeadamente, de óxido nítrico pelas células intestinais que foi, no entanto, fortemente contrariada quando as células foram pré-incubadas com a cianidina-3-glucósido 25 μM. Por outro lado, a pré-incubação com ácido protocatecuico 25 μM não conferiu uma proteção significativa. As citocinas induziram também uma alteração no estado redox das células, avaliado em termos de glutatião intracelular assim como de formação de espécies reativas de oxigénio. No primeiro caso, nem a cianidina-3-glucósido nem o ácido protocatecuico, 25 μM, contrariaram o efeito das citocinas, mas no segundo, conferiram alguma proteção, particularmente quando se avaliou a formação de espécies oxidantes por microscopia de fluorescência.<br>Inflammatory Bowel Diseases (IBD) are a group of chronic inflammatory diseases of the gastrointestinal tract with a high incidence worldwide. These diseases are characterized by an excessive production of pro-inflammatory mediators, excessive activation of the transcription factor NF-κB, dysfunction of intestinal barrier in addition to an increase in oxidative stress. Nowadays, there is still no specific treatment for IBD, and the drugs used are associated with various side effects. The lack of treatment and side effects associated to the therapies used creates the need to investigate new, safer and more effective therapeutic strategies. Polyphenols, including anthocyanins, are compounds largely available in the diet and they show a wide variety of beneficial effects on human health. These are known for its high antioxidant and anti-inflammatory activities and, despite the extensive biotransformation and low bioavailability, anthocyanins show to be a good strategy for the treatment and prevention of IBD. Cyanidin-3-glucoside is an anthocyanin with antioxidant and anti-inflammatory capacity, highly metabolized in the gastrointestinal tract being the protocatechuic acid the major metabolite formed. This phenolic acid, due to the presence of hydroxyl groups attached to the aromatic ring, possesses a great capacity to reduce radicals and may be involved on the health benefits observed by cyanidin-3-glucoside. This study was idealized with the aim to conduct a comparative study between cyanidin-3-glucoside and protocatechuic acid and its antioxidant and anti-inflammatory effects on intestinal epithelial cells, the cell line HT-29, stimulated with a pro-inflammatory cytokines mixture, IL-1α, TNF-α and IFN-γ. Initially, with a cell-free assay, both protocatechuic acid and cyanidin-3-glucoside have shown to be good free radical reducing agents, having a higher antioxidant activity then Trolox. However, in comparative terms, cyanidin-3-glucoside was more efficient as antioxidant then protocatechuic acid. In cell studies, neither cyanidin-3-glucoside nor protocatechuic acid were toxic in concentrations up to 25 μM, but failed to protect cells from cytokines-induced cytotoxicity.The mixture of proinflammatory cytokines also induced a significant increase in nitric oxide production by intestinal cells which was strongly counteracted when cells were pre-incubated with cyanidin-3-glucoside 25 μM. Cytokines also induced a change in the redox state of the cells evaluated in terms of intracellular glutathione as well as the formation of reactive oxygen species. Pre-incubation of the cells with cyanidin-3-glucoside or protocatechuic acid (25 μM) did not protect cells from glutathione depletion but have shown some protection against reactive oxygen species when assessed by fluorescence microscopy.

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>Os cancros colorretal e da mama são muito frequentes e uma das principais causas de mortalidade. Atualmente, para além dos fármacos usados nos tratamentos de quimioterapia destes cancros, como o 5-FU, o irinotecano, etc, são também usados três complexos metálicos, a cisplatina, a carboplatina e a oxaliplatina. No entanto, estas opções quimioterapêuticas apresentam efeitos adversos e as células tumorais têm tendência a desenvolver resistência aos fármacos. Sendo assim, existe a necessidade de desenvolver novos agentes mais eficientes para quimioterapia.Num trabalho anterior, realizado na Unidade de Biofísica da Universidade de Coimbra, em parceria com o grupo de Orgânica do Departamento de Química, foram desenvolvidos complexos de 99mTc, modificados com ligandos derivados do 4-nitroimidazole com o objetivo de serem usados na deteção de hipóxia tumoral. Os resultados revelaram que os complexos conseguiam atravessar a membrana celular e acumular nas células tumorais, postulou-se a hipótese de que a substituição do tecnécio por cobre poderia conferir atividade citotóxica aos complexos. Estudos anteriores revelaram que os complexos de Cu(II) apresentavam atividade antitumoral, sendo capazes de provocar morte celular, e que alguns imidazóis e derivados apresentam atividade farmacológica, incluindo atividade antitumoral.Neste contexto, esta dissertação teve como objetivo a síntese de novos complexos de Cu(II) derivados do imidazole e posterior avaliação da sua atividade antitumoral, com recurso a testes in vitro, nas linhas celulares de cancro colorretal, LS1034 e WiDr, e da mama, MCF-7 e HCC1806.Numa primeira fase, sintetizaram-se complexos de Cu(II) derivados do imidazole, partindo do 4-nitroimidazole, do 1-(3-aminopropil)imidazole e do benzoimidazole. Os ligandos derivados do 4-nitroimidazole e do benzoimidazole foram preparados numa sequência sintética de dois passos, a partir dos seus precursores (1-(2-bromoetil)-4-nitroimidazole e o 1-(2-bromoetil)-1H-benzoimidazole, respetivamente) sendo posteriormente reagidos com aminas. Os ligandos derivados do 1-(3-aminopropil)imidazole foram preparados por reação deste imidazole com diferentes salicilaldeídos: bromados, clorados e mono ou dissubstituídos. Os ligandos foram complexados com acetato de cobre mono-hidratado, originando os complexos de Cu(II) correspondentes.Na segunda parte do trabalho foi avaliada a atividade antitumoral dos complexos de Cu(II) sintetizados, nas quatro linhas celulares tumorais. Foi determinada a atividade metabólica das células, após tratamento com os complexos, e calculados os valores de IC50 (concentração inibitória média) a partir das curvas dose-resposta. Os complexos de Cu(II) derivados do 4-nitroimidazole e do benzoimidazole, modificados com um grupo ciclo-hexilamina, apresentaram uma maior atividade antiproliferativa, especialmente o último complexo, com valores de IC50 entre 1,2 e 6,57 µM, nas quatro linhas celulares. De salientar que estes valores de IC50, nalguns casos, são mais baixos que os obtidos para fármacos já usados na prática clínica. Em termos de relação estrutura-atividade e com base nos resultados de estudos de proliferação celular, conclui-se que a presença de um grupo ciclo-hexilamina na estrutura dos compostos poderá ser responsável pela maior atividade antitumoral dos complexos.Utilizando o complexo que apresentou melhores valores de IC50, realizaram-se estudos de viabilidade e ciclo celular. Para todas as linhas celulares, verificou-se que a viabilidade das células diminuía na presença do complexo e era acompanhada por morte celular, necrose. Avaliou-se ainda o stresse oxidativo, pela medição da produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e da produção intracelular da defesa antioxidante GSH, nas linhas celulares quimiorresistentes HCC1806 e LS1034. Aparentemente o complexo induz alterações nos níveis de ROS e GSH, que denotam a possível existência de stresse oxidativo, sendo necessário estudos mais detalhados.Adicionalmente, fizeram-se estudos de seletividade em duas linhas celulares de tecido normal, HFF1 e CCD841 CoN. Os resultados revelaram que o composto mais citotóxico possui alguma seletividade para as células tumorais, uma vez que a diminuição da viabilidade das células normais não foi tão acentuada. Foi ainda realizado um estudo de hemocompatibilidade, por quantificação da hemoglobina libertada. O estudo revelou que o composto não apresenta atividade hemolítica, uma vez que a libertação de hemoglobina foi quase nula, o que demonstra a manutenção da integridade da membrana dos eritrócitos.Com base nos resultados, o complexo de Cu(II) do benzoimidazole modificado com ciclo-hexilamina pode vir a ser promissor no tratamento do cancro, especialmente em casos de quimiorresistência.<br>Colorectal and breast cancer are very common and one of the main causes of mortality. Currently, in addition to the drugs used in chemotherapy treatments, such as 5-FU, irinotecan, etc., three metal complexes, cisplatin, carboplatin and oxaliplatin are also used. However, these chemotherapeutic options have adverse effects and tumor cells have tendency to develop drug resistance. Thus, there is a need to develop new more effective chemotherapy agents.In previous work carried out at the Biophysics Unit of the University of Coimbra, in collaboration with the Organic group from the Department of Chemistry, 99mTc complexes modified with 4-nitroimidazole derived ligands were developed, with the purpose of being used in the detection of tumoral hypoxia. The results revealed that the complexes were able to cross the cell membrane and accumulate in tumor cells. It was hypothesized that the replacement of technetium by copper could confer cytotoxic activity to the complexes. Previous studies have revealed that Cu (II) complexes have antitumor activity, being able to cause cell death, and that some imidazoles and derivatives have pharmacological activity, including antitumor activity.In this context, this dissertation aimed at the synthesis of new Cu(II) complexes derived from imidazole and their subsequent evaluation of their antitumor activity, using in vitro tests in colorectal, LS1034 and WiDr, and breast, MCF-7 and HCC1806, cancer cell lines.Firstly, Cu (II) complexes derived from imidazole were synthesized, starting from 4-nitroimidazole, 1-(3-aminopropyl)imidazole and benzoimidazole. The 4-nitroimidazole and benzoimidazole derived ligands were prepared in a two-step synthetic sequence from their precursors (1-(2-bromoethyl)-4-nitroimidazole and 1-(2-bromoethyl)-1H-benzoimidazole, respectively) being subsequently reacted with amines. Ligands derived from 1-(3-aminopropyl)imidazole were prepared by reacting it with different salicylaldehydes: brominated, chlorinated and mono or disubstituted. The ligands were complexed with copper acetate monohydrate, yielding the corresponding Cu (II) complexes.In the second part of the work the antitumor activity of the synthesized Cu (II) complexes was evaluated in the four tumor cell lines. The metabolic activity of the cells was determined, after treatment with the complexes, and the IC50 values (mean inhibitory concentration) were calculated from the dose-response curves. The Cu(II) complexes derived from 4-nitroimidazole and benzoimidazole, modified with a cyclohexylamine group, had higher antiproliferative activity, especially the latter complex, with IC50 values between 1.2 and 6.57 μM, in the four cell lines. It should be noted that these IC50 values, in some cases, are lower than those obtained for drugs already used in clinical practice. In terms of structure-activity relationship and based on the results of cell proliferation studies, it may be concluded that the presence of the cyclohexylamine group may be responsible for the greater antitumor activity of these complexes. Viability and cell cycle studies were carried out, using the complex that presented the best IC50 values. For all cell lines, cell viability was found to decrease in the presence of the complex, resulting in cell death by necrosis. Oxidative stress was also evaluated by measuring the production of reactive oxygen species (ROS) and the intracellular production of the GSH antioxidant defense in the chemoresistant HCC1806 and LS1034 cell lines. Apparently, the complex induces changes in the ROS and GSH levels, which indicate the possible existence of oxidative stress. More detailed studies will be necessary.Additionally, selectivity studies on two normal tissue cell lines, HFF1 and CCD841 CoN, were carried out. The results revealed that the most citotoxic compound has some selectivity for tumor cells, since the decrease in viability of normal cells was not as significant. A hemocompatibility study was also done by quantification of the released hemoglobin. The study showed that the compound does not exhibit hemolytic activity, since the release of hemoglobin was almost nil, which demonstrates the maintenance of erythrocyte membrane integrity.Based on the results, the Cu(II) complex of benzoimidazole modified with cyclo-hexylamine may be promising in cancer treatment, especially in cases of chemoresistance.

Introdução: Ao longo dos últimos anos, o número de pessoas da população portuguesa com diabetes mellitus (DM) tem vindo a aumentar. Em 2013, mais de 1 milhão de pessoas em Portugal entre os 20-79 anos tinha diabetes (13% da população). O impacto do envelhecimento da população refletiu um aumento de 11% na taxa de prevalência da diabetes entre 2009-2013. Na diabetes mellitus há um aumento da produção de espécies reativas de oxigénio e uma diminuição das defesas antioxidantes, o que se traduz por um stress oxidativo responsável por várias complicações da doença. O controlo da glicémia é fundamental para a estabilização da diabetes bem como das suas complicações. Visto ter uma elevada taxa de morbilidade e mortalidade é imperativo o diagnóstico precoce e o controlo da doença. O impacto que a doença tem na qualidade de vida das pessoas e os custos que a terapia farmacológica acarreta, faz com que cada vez mais se fale no uso de terapêuticas alternativas, como por exemplo plantas naturais. As plantas medicinais contêm vários antioxidantes naturais como flavonóides e vitamina C e E. Objetivos: Com esta revisão de literatura pretendo avaliar o uso de antioxidantes naturais juntamente com a terapêutica farmacológica de base no controle dos valores da glicémia, bem como as complicações inerentes à diabetes mellitus, explorando assim as vantagens e desvantagens de alguns antioxidantes naturais. Metodologia: Para a presente revisão de bibliografia foi utilizada a base de dados Medline, utilizando sem restrições os termos de pesquisa “antioxidants” e “diabetes”, selecionando os artigos com maior relevo para o tema a abordar. Resultados: Vários estudos têm sido feitos nos últimos tempos sobre este assunto, no entanto, os resultados dos estudos nem sempre são consensuais. Se, por vezes, estudos experimentais demonstraram eficácia dos antioxidantes, quando passaram aos ensaios clínicos essa eficácia já não foi totalmente comprovada. Conclusões: Apesar dos vários benefícios aparentes de alguns nutrientes em estudos experimentais e em determinados ensaios clínicos, dados mais consistentes são necessários quanto ao benefício dos antioxidantes na terapia da DM. Assim, é necessário a elaboração de mais ensaios clínicos randomizados, duplamente-cegos controlados por placebo com amostras de maior dimensão e a decorrer num maior período de tempo, para definir com precisão o valor e o lugar dos suplementos na prevenção e gestão da diabetes.<br>Introduction: Over the last few years, the number of people in the Portuguese population with diabetes mellitus (DM) has increased. By 2013, more than 1 million people in Portugal between the ages of 20-79 had diabetes (13% of the population). The impact of population aging reflected an 11% increase in the prevalence rate of diabetes between 2009-2013. In diabetes mellitus there is an increase in the production of reactive oxygen species and a decrease in antioxidant defenses, which translates into an oxidative stress responsible for several complications of the disease. Glycemic control is essential for the stabilization of diabetes as well as its complications. Because of the high rate of morbidity and mortality, early diagnosis and control of the disease is imperative. The impact that the disease has on the quality of life of the people and the costs that the pharmacological therapy entails, leads to an increasing discussion about the use of alternative therapies, such as natural plants. Medicinal plants contain various natural antioxidants like flavonoids and vitamin C and E. Objectives: With this literature review, I intend to evaluate the use of natural antioxidants together with the basic pharmacological therapy in the control of glycemic values, as well as the inherent complications of diabetes mellitus, thus exploiting the advantages and disadvantages of some natural antioxidants. Methodology: For the present review of the bibliography, the Medline database was used, using the terms "antioxidants" and "diabetes" without restriction, selecting the articles with greater relevance for the subject to be addressed. Results: Several studies have been done in recent times on this subject however, the results of the studies are not always consensual. If experimental studies have shown antioxidant efficacy at times, when they have passed to the clinical trials this efficacy is no longer fully proven. Conclusions: Despite the various apparent benefits of some nutrients in experimental studies and in certain clinical trials, more consistent data is needed regarding the benefit of antioxidants in DM therapy. Thus, more randomized, double-blinded, placebo-controlled trials with longer and longer-term samples are needed to accurately define the role and location of supplements in diabetes prevention and management.

Dissertação de Mestrado em Química Medicinal apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>O cancro da mama e o cancro colorretal são, respetivamente, o segundo e terceiro tipos de cancro com maior incidência e, por isso, estão associados a elevadas taxas de mortalidade em todo o mundo. Embora exista uma série de fármacos quimioterapêu-ticos usados para o tratamento destas doenças, que incluem os complexos metálicos de platina, as fluoropirimidinas, os taxanos, as antraciclinas, entre outros, de uma for-ma geral eles apresentam algumas desvantagens. Entre elas, destacam-se os efeitos adversos severos, bem como o desenvolvimento de resistência aos fármacos por parte das células tumorais ao longo da terapêutica. Assim, é fundamental o desenvolvimento de novos fármacos antitumorais que ultrapassem estes problemas. Estudos anteriores demonstraram que complexos metálicos salen derivados do ácido (+)-canfórico exibem atividade antitumoral, especialmente complexos metálicos com ligandos di e tetraclorados. Segundo a literatura, complexos de ruténio têm apresen-tado elevada atividade citotóxica, demonstrando maior seletividade para as células tumorais. A sua menor toxicidade relativamente, por exemplo, aos complexos de pla-tina, torna-os uma alternativa credível e promissora aos fármacos atualmente utiliza-dos em quimioterapia. Neste enquadramento, o objetivo do trabalho descrito nesta dissertação foi sintetizar novos complexos de Ru(III) e Ru(II), com ligandos salen e salan, di e tetraclorados derivados do ácido (+)-canfórico e, recorrendo a estudos in vitro, testar a sua atividade antitumoral em linhas celulares de cancro da mama, MCF-7 e HCC1806, e colorretal, LS1034 e WiDr. A finalidade deste estudo passa por perceber se o número de átomos de cloro, o número de oxidação do metal e/ou as alterações no esqueleto do ligando (ligando salen ou salan) influenciam a atividade citotóxica do complexo. Na primeira parte do trabalho foi efetuada a síntese dos complexos de ruténio deriva-dos do ácido (+)-canfórico. Esta síntese envolveu inicialmente a preparação da dia-mina derivada do ácido (+)-canfórico pela reação de Schmidt. Depois, a reação da dia-mina com derivados de salicilaldeído sob irradiação por ultrassons, originou os ligan-dos salen. Uma vez obtidos os ligandos salen, os mesmos foram reduzidos para obter os correspondentes ligados salan. Para finalizar, os ligandos salen e salan foram com-plexados com Ru(III) e Ru(II), dando origem aos respetivos complexos de ruténio. A segunda parte do trabalho envolveu a análise da atividade antitumoral dos comple-xos de ruténio sintetizados, nas linhas celulares de cancro da mama, MCF-7 e HCC1806, e colorretal, LS1034 e WiDr, através de estudos in vitro. Primeiro avaliou-se a atividade antiproliferativa de todos os complexos, e observou-se que todos apresen-tavam atividade antiproliferativa dependente da concentração de compostos, nas linhas celulares em estudo. No entanto, o complexo mais promissor foi o complexo de Ru(III) do ligando salen tetraclorado, com valores de IC50 que compreendem 2,1-3,7 M. A atividade antiproliferativa promissora deste composto pode ser devida à presença, em simultâneo, de duas características relevantes, a pre-sença dos quatro átomos de cloro, responsáveis por aumentar a lipofilicidade do com-plexo e, consequentemente, a sua captação pela célula tumoral, e o número de oxida-ção +3, que permite que estes complexos atuem como profármacos. Com este complexo mais promissor, prosseguiram os estudos de viabilidade e ciclo celular, nos quais se observou uma diminuição da viabilidade celular para todas as linhas celulares, sendo esta mais marcada nas linhas HCC1806 e LS1034, acompanhada de notória morte celular por necrose para a concentração mais elevada e de morte celular por apoptose para a concentração intermédia. Avaliou-se também o stresse oxidativo induzido nas células pelo complexo, através da avaliação da produção de ROS e da defesa antioxidante GSH. Os resultados indicam que houve alterações a nível de stresse oxidativo, nomeadamente na produção intracelular de peróxidos e superóxidos, e que esta alteração está muito provavelmente relacionada com o tipo de morte celular induzida pelo complexo. Realizaram-se ainda estudos de seletividade com recurso a duas linhas celulares de tecido saudável: HFF1 e CCD841 CoN. Observou-se que o complexo mais promissor apresentou elevada seletividade para linhas celulares tumorais, visto que não diminuiu de forma considerável a viabilidade das células não tumorais. Para concluir os estudos, avaliou-se a hemocompatibilidade do complexo, por quantificação da hemoglobina libertada. Os resultados revelaram que o complexo não afeta a integridade da membrana dos eritrócitos, facto suportado pela reduzida libertação da hemoglobina para o soro. Com base nos resultados obtidos, o complexo de Ru(III) tetraclorado salen demonstrou possuir características que o poderão tornar uma alternativa eficaz e segura para o tratamento do cancro da mama e colorretal.<br>Breast cancer and colorectal cancer are, respectively, the second and third most prevalent cancers, and are therefore associated with high mortality rates worldwide. Although there are a number of chemotherapeutic drugs used for the treatment of these diseases, which include platinum metal complexes, fluoropyrimidines, taxanes, anthracyclines, among others, they generally have some disadvantages. These include severe adverse effects as well as the development of resistance to the drugs by the tumor cells throughout the therapy. Thus, the development of new antitumor drugs that will overcome these problems is fundamental.Previous studies showed that metal complexes derived from (+)-camphoric acid exhibit antitumor activity, especially metal complexes with di-and tetrachlorinated ligands. According to the literature, ruthenium complexes have shown high cytotoxic activity, demonstrating greater selectivity for tumor cells. Their lower toxicity relatively to, for example, platinum complexes makes them a credible and promising alternative to currently used chemotherapy drugs. In this context, the objective of the work described in this dissertation was to synthesize new Ru(III) and Ru(II) complexes with di- and tetrachlorinated salen and salan ligands and, using in vitro studies, test their antitumor activity in breast cancer MCF-7 and HCC1806 cell lines, and in colorectal cancer LS1034 and WiDr cell lines. The purpose of this study is to determine whether the number of chlorine atoms, the oxidation number of the metal and / or changes in the backbone of the ligand (salen or salan ligand) influence the cytotoxic activity of the complex. In the first part of the work the synthesis of ruthenium complexes derived from cam-phoric acid was carried out. This synthesis initially involved the preparation of the diamine derived from (+)-camphoric acid through the Schmidt reaction. The subse-quent reaction of the diamine with salicylaldehyde derivatives under ultrasound irradi-ation gave the salen ligands. These ligands were reduced to give the corresponding salan ligands. Finally, the salen and salan ligands were complexed with Ru(III) and Ru(II), giving rise to the corresponding ruthenium complexes. The second part of the work involved the analysis of the antitumor activity of the ru-thenium complexes that were synthesized, in the breast cancer cell lines, MCF-7 and HCC1806, and colorectal cancer cell lines LS1034 and WiDr, by in vitro studies. The antiproliferative activity of all the complexes was first evaluated and all of them showed antiproliferative activity in the cell lines under study, dependent on the con-centration of compounds. However, the most promising complex was the Ru(III) com-plex of the tetrachlorinated salen ligand, with IC50 values of 2.1-3.7 μM. It is very im-portant to note that these values are lower than many of those obtained with drugs currently used in the chemotherapeutic treatment of breast and colorectal cancers. The promising antiproliferative activity of this compound can be due to the simultane-ous presence of two relevant characteristics, the presence of the four chlorine atoms, responsible for increasing the lipophilicity of the complex and, consequently, its uptake by the tumor cell, and the oxidation number +3, which allows these complexes to act as prodrugs. With this most promising complex, viability and cell cycle studies were undertaken, in which a decrease in cell viability was observed for all cell lines, which was more marked in the HCC1806 and LS1034 cell lines, accompanied by cell death by necrosis for the highest concentration and cell death by apoptosis for the intermediate concen-tration. The oxidative stress induced in the cells by the complex, was also determined through the evaluation of ROS production and GSH antioxidant defense. The results indicate that there were alterations in oxidative stress, namely in the intracellular pro-duction of peroxides and superoxides, and that this alteration is most probably related to the type of cell death induced by the complex. Selective studies were also performed using two healthy tissue cell lines: HFF1 and CCD841 CoN. It was observed that the most promising complex showed high selectivity for tumor cell lines, since it did not significantly decrease the viability of non-tumor cells.To conclude the studies, the hemocompatibility of the complex was assessed by quantifying the released hemoglobin. The results revealed that the complex does not affect the erythrocyte membrane integrity, supported by the reduced release of he-moglobin to the serum. Based on the results obtained, the tetrachlorinated salen Ru(III) complex has been shown to have characteristics that may make it an effective and safe alternative for the treatment of breast and colorectal cancer.

A toxicidade dos Líquidos Iónicos (LIs) para organismos aquáticos tem sido alvo de bastante interesse, dado que, apesar de a estes compostos se ter atribuído, geralmente, um carácter “verde”, algumas evidências do contrário têm sido encontradas. No entanto, a avaliação da toxicidade dos LIs tem-se baseado num reduzido número de espécies, o que é limitativo dada a variação de sensibilidade que diferentes espécies podem exibir a diferentes classes de LIs. Só considerando esta sensibilidade diferencial é possível validar, de uma forma integrada, as regras heurísticas que se assumem para a ecotoxicidade de LIs (efeito do anião, do catião e da extensão da cadeia alquílica do catião). Neste contexto, foram selecionados 4 LIs modelo – 2 baseados no catião colina e 2 baseados no catião imidazólio - e a sua toxicidade para uma grande variedade de espécies foi determinada, o que permitiu o desenvolvimento de curvas de distribuição de sensibilidade de espécies e, consequentemente, a determinação de valores de referência que sinalizam as concentrações de LI a que 5% e 50% das espécies das comunidades aquáticas deverão estar afetadas (HC5 e HC50). Esta abordagem integradora permite estabelecer relações mais fidedignas entre a estrutura dos LIs e a sua ecotoxicidade. Observou-se que os valores de EC50 apresentavam uma ampla gama de variação, sendo que a espécie mais sensível a cada LI era variável. A variação da toxicidade, no global, apresenta a seguinte ordem: cloreto de colina ([Chol]Cl) ≈ dihidrogenocitrato de colina ([Chol][DHCit]) ≤ cloreto de 1-etil-3-metilimidazólio ([C2mim]Cl) < cloreto de 1-dodecil-3-metilimidazólio ([C12mim]Cl). Assim, foi possível validar as regras heurísticas reconhecidas inicialmente, não deixando de ser preocupante a elevada toxicidade (comparativamente) do [C12mim]Cl. Numa segunda fase do trabalho foi estudada a resposta de Daphnia magna ao potencial stress oxidativo imposto pela exposição a cada um dos 4 LIs selecionados. Esta resposta foi avaliada através da quantificação substâncias reativas ao ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS), que denunciam dano oxidativo membranar, assim como da atividade de enzimas com papel relevante na eliminação das espécies reativas de oxigénio (ROS) - glutationa redutase (GR) e a enzima de biotransformação, glutationa S-transferase (GST). O aumento da atividade da enzima GR verificado após exposição ao [C12mim]Cl demonstra o potencial deste LI como indutor de stress oxidativo. Estes resultados apenas permitem validar a regra heurística do aumento da cadeia alquílica do catião ao nível sub-celular.<br>The toxicity of Ionic Liquids (ILs) to aquatic organisms has been receiving considerable interest since, although these compounds have generally been attributed a "green" character, some challenging evidence has been found. However, the evaluation of the toxicity of ILs has been based on a reduced number of species, which is limiting given the sensitivity variation that different species can exhibit to different classes of ILs. Only if appraising this differential sensitivity it is possible to validate, in an integrated way, the heuristic rules that are assumed for the ecotoxicity of ILs (role of the anion, cation and cation alkyl chain extension). In this context, 4 ILs - 2 based on cationic choline and 2 based on the imidazolium cation were selected, and their toxicity towards a great variety of species was determined, which allowed the development of species sensitivity distribution curves and consequently, the estimation of reference values that signal the IL concentrations at which 5% and 50% of the aquatic communities species should be affected (HC5 and HC50). This integrative approach allows establishing more reliable relationships between the structure of ILs and their ecotoxicity. It was observed that EC50 values presented a wide range of variation, and the species most sensitive to each IL was variable. The overall toxicity order was as follows: choline chloride ([Chol]Cl) ≈ choline dihydrogencitrate ([Chol][DHCit]) ≤ 1-ethyl-3-methylimidazolium chloride ([C2mim]Cl) < 1-dodecyl chloride -3-methylimidazolium ([C12mim]Cl). Thus, it was possible to validate the initially recognized heuristic rules, and to recognise that the toxicity [C12mim]Cl is comparatively higher, which may pose environmental concern. In a second stage of the study, the oxidative stress response of Daphnia magna to exposure to each of the 4 selected ILs was studied. This response was evaluated through the quantification of 2-thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), which signal membrane oxidative damage, as well as through the quantification of the activity of enzymes with a relevant role in the elimination of reactive oxygen species (ROS) - glutathione reductase (GR) and the biotransformation enzyme, glutathione S-transferase (GST). The results show an increase in the activity of GR following exposure to [C12mim] Cl, suggesting that this IL has a potential as an inducer of oxidative stress. These results validate at the sub-cellular level only the heuristic rule denoting an increase in toxicity with the increase of the cation alkyl chain.<br>PTDC/ATP-EAM/5331/2014<br>Mestrado em Biologia Aplicada

Dissertação de Mestrado em Química apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia<br>A degenerescência macular da idade (DMI) é uma doença degenerativa da mácula da retina, e que leva à perda progressiva da visão central em idades mais avançadas. A fase mais avançada da doença pode ser dividida em dois tipos, a forma seca e a forma neovascular. A forma seca é caracterizada pela atrofia geográfica do epitélio pigmentado da retina (RPE), enquanto que a forma neovascular ou húmida é caracterizada por neovascularização coroideia (CNV) e, em alguns casos, pelo descolamento do RPE e fibrose sub-retiniana. Atualmente, a terapêutica de primeira linha da DMI húmida são os fármacos anti-angiogénicos. Injeções intravítreas de anti-VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) são indicadas para inibir a proliferação de novos vasos coróide. Em certos casos, contudo, esta abordagem terapêutica com anti-VEGF não é capaz de prevenir a progressão da doença e apresenta muitos efeitos adversos. Em alguns casos, a terapia fotodinâmica (PDT) é usada em combinação com a terapia anti-VEGF. O uso de PDT tem como objetivo a destruição seletiva dos novos vasos anómalos da coróide que podem proliferar e penetrar na membrana de Bruch. No entanto, até ao momento, não existe nenhum tratamento capaz de prevenir ou tratar a fibrose sub-retiniana.O principal objetivo deste estudo foi avaliar a citotoxicidade induzida por PDT utilizando dois fotossensibilizadores (PSs) glico-conjugados: H2TPPF16(SGlc)4 e ZnTPPF16(SGlc)4). Como modelo de estudo utilizou-se a linha celular ARPE-19 (com morfologia mesenquimal fusiforme e expressão de α-SMA e galectina-1). Para avaliar a eficácia dos dois PSs, foram realizados estudos in vitro para determinar a sua captação pelas células, a produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e a sua toxicidade no escuro e após fotoativação.Ambos os glico-conjugados foram captados pelas células ARPE-19. A presença de proteínas com domínios de reconhecimento de carbohidratos e afinidade para galactosídeos, como a galectina-1, e a presença de um metal na estrutura da porfirina podem influenciar a captação destes PSs. Na verdade, o ZnTPPF16(SGlc)4 apresentou uma captação celular ligeiramente superior ao H2TPPF16(SGlc)4. Os níveis de ROS após PDT foram superiores com o ZnTPPF16(SGlc)4 do que com o H2TPPF16(SGlc)4. Ambos os PSs demonstraram eficácia na indução de fototoxicidade em células ARPE-19. Os resultados obtidos suportam a ideia de que a PDT com glico-porfirinas pode ser uma abordagem terapêutica promissora para atenuar a formação de fibrose sub-retiniana e, eventualmente CNV, o que requer um estudo mais detalhado.<br>Age-related macular degeneration (AMD) is a retinal degenerative disease that affects the central portion of the retina, called the macula, being responsible for central vision loss. AMD can progress to two advanced stages, dry and wet. Advanced dry AMD is characterized by geographic atrophy of the retinal pigment epithelium (RPE). Wet or neovascular AMD is characterized by choroidal neovascularization (CNV) and, in some cases, RPE detachment occurs and is accompanied by subretinal fibrosis formation. Nowadays, anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) therapy has been the first choice for neovascular AMD in order to inhibit CNV. However, in a high proportion of patients with AMD, this therapy is not able to stop the progression of the disease and it has several associated adverse effects. In some cases, photodynamic therapy (PDT) is used in combination with anti-VEGF therapy. The main purpose of PDT is the destruction of the abnormal vessels originated in the choroid that invade the overlying RPE monolayer and neuronal retina. However, to the best of our knowledge, any applied treatment to date can prevent or treat subretinal fibrosis.The main purpose of this study was to assess the cytotoxicity on ARPE-19 cells (with a mesenchymal spindle-shaped morphology, expressing α-SMA and galectin-1) after PDT with glyco-conjugates (H2TPPF16(SGlc)4) and zinc-porphyrin conjugated with four glucose molecules (ZnTPPF16(SGlc)4). To evaluate the efficacy of the two photosensitizers (PSs), in vitro studies were performed to determine the cellular uptake, reactive oxygen species (ROS) production and their toxicity in darkness and after photoactivation.Both glyco-conjugates were shown uptake by ARPE-19 cells. The presence of sugar-binding proteins in ARPE-19 cells, such as galectin 1, may influence the PSs uptake. The presence of a metal in the porphyrin can also interfere with the uptake. In fact, ZnTPPF16(SGlc)4 showed a slight higher cellular uptake than H2TPPF16(SGlc)4. The levels of ROS after PDT were higher in ZnTPPF16(SGlc)4 than in H2TPPF16(SGlc)4. Both PSs were non-toxic until activation by light. Both PS demonstrated high efficacy in inducing phototoxicity in ARPE-19 cells. The obtained results support the idea that PDT with glyco-porphyrins can be a promising therapeutic option to attenuate subretinal fibrosis formation and eventually CNV, which deserves a more detailed study.

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina<br>Bladder cancer is the tenth most common and the thirteenth deadliest cancer worldwide. There are gaps in the development of new therapies for bladder cancer since drugs available in clinical use do not have the desired efficacy and show considerable side effects. The medical use of Cold Atmospheric Plasma is a promising area since, this physical state of matter, can have significant antitumor effects, with cell destruction rates of over 90%, sparing normal tissue. Cold Atmospheric Plasma is a partially ionized gas produced at a temperature below 40°C, and therefore does not induce thermal injury. Its mechanisms of action are mainly due to reactive oxygen and nitrogen species that are generated during the interaction with the tumor tissue. However, other components should not be disregarded, such as the presence of charged particles, UV radiation, and the electromagnetic field. The main objective of this work was to determine the efficacy of Cold Atmospheric Plasma treatment against bladder cancer. An electronic device able to generate a high voltage discharge was designed by our group to produce Cold Atmospheric Plasma. Two bladder cancer cell lines, HT-1376 (grade III) and TCCSUP (grade IV) were used. Both cell lines were submitted to Cold Atmospheric Plasma treatment, 2 mm above the surface of the cell culture medium, during short periods of time (15, 30, 60, 90, and 120 seconds). 24, 48, and 72 hours after treatment, metabolic activity was assessed by MTT assay and protein content by SRB assay, which gives us indirect information about cell proliferation. 2, 6, and 24 hours after treatment, reactive oxygen and nitrogen species, as well as antioxidant defenses, were measured. Also, 24 hours after treatment, the viability and cell death profile, the cell cycle, and the mitochondrial membrane potential were evaluated. Additionally, the effect of Cold Atmospheric Plasma was evaluated ex vivo, in bladder tumor samples 24, 48, and 72 hours after treatment.After Cold Atmospheric Plasma treatment, cell proliferation decreased in both cell lines depending on the exposure time, however, TCCSUP cell line has shown to be more sensitive to the therapy. Regarding the viability and cell death profile, both cell lines demonstrated a decrease in viable cells and an increase in the apoptotic and necrotic populations, being necrosis the most prevalent type of cell death for the longest exposure time. In both cell lines, it was observed a cell cycle arrest in S phase, as well as a depolarization of the mitochondrial membrane depending on the exposure time. In terms of oxidative stress for both cell lines, results demonstrate an increased intracellular content of radical superoxide and a decreased intracellular content of peroxides, while no differences were observed in GSH levels. In the bladder tumor samples, it was observed an increase in necrotic cells and reduction of cellular cohesion after Cold Atmospheric Plasma treatment.The results obtained demonstrate that Cold Atmospheric Plasma has an antiproliferative effect even after short periods of exposure. The imbalance of oxidative stress and the depolarization of the mitochondrial membrane observed plays a key role in cell death caused by Cold Atmospheric Plasma treatment. For the first time, the effects of Cold Atmospheric Plasma treatment were demonstrated on two bladder cancer cell lines with different molecular characteristics and belonging to different stages of the disease, as well as its potential as a future therapeutic approach for bladder cancer. The higher sensitivity of the higher-grade cell line to Cold Atmospheric Plasma treatment was also observed. These outcomes encourage further studies, where the influence of other reactive oxygen and nitrogen species on the Cold Atmospheric Plasma mechanism of action should be assessed, as well as the effects of Cold Atmospheric Plasma on normal bladder cells. Nonetheless, this study reveals that intravesical therapy with Cold Atmospheric Plasma could represent a promising therapeutic approach against Bladder Cancer.<br>O cancro da bexiga é o décimo cancro com maior incidência e o décimo terceiro com maior mortalidade em todo o mundo. Atualmente, existem lacunas no desenvolvimento de novas terapias para o cancro da bexiga. Além disso, os medicamentos disponíveis na prática clínica não têm a eficácia desejada e apresentam efeitos adversos. A utilização médica do Plasma Frio Atmosférico é uma área promissora uma vez que, este estado físico da matéria, pode ter efeitos anti-tumorais significativos, com taxas de morte celular superiores a 90%, poupando o tecido normal. O Plasma Frio Atmosférico é um gás parcialmente ionizado produzido a uma temperatura abaixo de 40°C, razão pela qual não induz lesão térmica. Os mecanismos de ação assentam, principalmente, na produção de espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio que se formam durante a interação com o tecido tumoral. No entanto, outros componentes não devem ser desconsiderados, como a presença de partículas carregadas, da radiação UV e do campo eletromagnético. O principal objetivo deste trabalho foi determinar a eficácia do Plasma Frio Atmosférico no tratamento do cancro de bexiga.O nosso grupo de investigação desenvolveu um novo dispositivo eletrónico capaz de gerar uma descarga de alta tensão para produzir Plasma Frio Atmosférico. Neste trabalho, foram utilizadas duas linhas celulares de cancro da bexiga, a linha HT 1376 (grau III) e a linha TCCSUP (grau IV). Ambas as linhas celulares foram submetidas ao tratamento com Plasma Frio Atmosférico, 2 mm acima da superfície do meio de cultura celular, durante curtos períodos de tempo (15, 30, 60, 90 e 120 segundos). A atividade metabólica foi avaliada pelo ensaio de MTT e o conteúdo de proteico pelo ensaio de SRB, 24, 48 e 72 horas após o tratamento, o que nos dá informação indireta acerca da proliferação celular. As espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio, bem como as defesas antioxidantes foram avaliadas 2, 6 e 24 horas após o tratamento. A viabilidade e o perfil de morte celular, o ciclo celular e o potencial da membrana mitocondrial foram também avaliados 24 horas após o tratamento. Além disso, o efeito do Plasma Frio Atmosférico foi avaliado ex vivo, em amostras de tumor de bexiga 24, 48 e 72 horas após o tratamento.Após o tratamento com Plasma Frio Atmosférico, a proliferação celular diminuiu em ambas as linhas celulares dependendo do tempo de exposição, no entanto a linha celular TCCSUP demonstrou ser mais sensível ao tratamento. Em relação ao perfil de viabilidade e de morte celular, ambas as linhas celulares demonstraram uma diminuição da viabilidade celular e um aumento da morte celular por apoptose e por necrose, sendo a necrose o tipo de morte celular predominante para o tempo de exposição mais longo. Em ambas as linhas celulares, foi observado um bloqueio do ciclo celular na fase S, bem como despolarização da membrana mitocondrial, ambos dependentes do tempo de exposição. Em termos de stresse oxidativo para ambas as linhas celulares, os resultados demonstram um aumento do conteúdo intracelular de radical superóxido e uma diminuição do conteúdo intracelular de peróxidos, enquanto que não se observaram diferenças no conteúdo intracelular de GSH. Nas amostras de tumor de bexiga, observou-se um aumento das células em necrose e redução da coesão celular, após tratamento com Plasma Frio Atmosférico. Os resultados obtidos demonstram que o Plasma Frio Atmosférico possui um efeito anti proliferativo mesmo após curtos períodos de exposição. O stresse oxidativo e a despolarização da membrana mitocondrial desempenham papel fundamental na morte celular induzida pelo Plasma Frio Atmosférico. Pela primeira vez, foram demonstrados os efeitos do tratamento com Plasma Frio Atmosférico em duas linhas celulares de cancro da bexiga com diferentes características moleculares e pertencentes a diferentes estádios da doença, bem como o seu potencial como futura abordagem terapêutica para o cancro da bexiga. Observou-se, também, a maior sensibilidade da linha celular de grau mais elevado ao tratamento com Plasma Frio Atmosférico. Estes resultados encorajam e reforçam a necessidade de novos estudos, nos quais a influência de outras espécies reativas de oxigénio e de nitrogénio no mecanismo de ação do Plasma Frio Atmosférico devem ser avaliadas, bem como os seus efeitos em células normais da bexiga. Adicionalmente, este estudo revela que a terapia intravesical com Plasma Frio Atmosférico pode representar uma abordagem terapêutica promissora para o cancro de bexiga.

Os espermatozóides são particularmente vulneráveis às espécies reativas de oxigénio nas diferentes fases do processo reprodutivo (maturação, capacitação, hiperativação, reação acrossomal). Por esta razão, este trabalho teve como objetivo o estudo do efeito de um inovador antioxidante dirigido às mitocôndrias (AntiOxBEN2) na função espermática e no desenvolvimento embrionário in vitro bovino. Este antioxidante foi adicionado ao meio de capacitação espermática (CAP), durante o processo de swim-up, e ao meio de fertilização (FERT), durante a co-incubação dos oócitos maturados com o sémen capacitado, nas concentrações de 0 (controlo), 1 e 10 μM. Foram assim constituídos 7 grupos: (1): CAPcontrolo x FERTcontrolo; (2): CAPcontrolo x FERT1; (3): CAPcontrolo x FERT10; (4): CAP1 x FERTcontrolo; (5): CAP1 x FERT1; (6): CAP10 x FERTcontrolo; (7): CAP10 x FERT 10. Após o swim-up foi avaliada a motilidade espermática (CASA e análise visual), a vitalidade (eosina-negrosina), o potencial de membrana mitocondrial (JC1) e o metabolismo basal (Seahorse Xfe96) dos espermatozoides. Foi igualmente avaliado o desenvolvimento e a qualidade dos embriões produzidos. O grupo CAP1 x FERT1 apresentou a maior taxa de clivagem, comparativamente ao grupo controlo (p<0.04). Foi identificado um efeito positivo do AntiOxBEN2 no potencial de membrana mitocondrial (p≤0.003) e, consequentemente, na qualidade espermática, enquanto que a concentração mais elevada prejudicou a motilidade progressiva e o número de embriões produzidos. Os resultados demonstraram um efeito benéfico do AntiOxBEN2 (na concentração de 1 μM) nos processos de capacitação espermática e na fertilização, melhorando o desenvolvimento embrionário.<br>Sperm cells are particularly vulnerable to reactive oxygen species at different stages of the reproductive process (maturation, capacitation, hyperactivation and acrosomal reaction). For this reason, our objective was to study the effect of a novel mitochondrial-directed antioxidant, AntiOxBEN2, on bovine sperm function and in vitro embryo development. This antioxidant was added to the semen capacitation medium (CAP), during the swim-up, and to the fertilization medium (FERT) during the co-incubation of matured oocytes and capacitated spermatozoa, in concentrations of 0 (control), 1 and 10 μM. Thus, 7 groups were constituted: (1): CAPcontrol x FERTcontrol; (2): CAPcontrol x FERT1; (3): CAPcontrol x FERT10; (4): CAP1 x FERTcontrol; (5): CAP1 x FERT1; (6): CAP10 x FERTcontrol; (7): CAP10 x FERT 10. After the swim-up, sperm motility (CASA and visual analysis), vitality (eosin-nigrosin), mitochondrial membrane potential (JC1) and basal metabolism (Seahorse Xfe96) were evaluated. Embryonic development and quality of produced embryos were assessed. Higher cleavage rate was obtained in CAP1 x FERT1 compared to control (p<0.04). A positive effect of AntiOxBEN2 on the mitochondrial membrane potential (p≤0.003) and, consequently, on the sperm quality was identified, although the highest dose impaired progressive motility and the number of produced embryos. The results demonstrate a beneficial effect of AntiOxBEN2 (1 μM) on sperm capacitation and fertilization processes, thus improving embryonic development.

A senescência apresenta-se como um processo metabolicamente ativo, desencadeado por múltiplos fatores, limitando o tempo de vida, uma vez que quando a célula entra em processo de senescência perde irreversivelmente a capacidade de proliferar. As bactérias eram consideradas microrganismos potencialmente imortais devido à sua reprodução assexuada por fissão binária. Contudo, estudo realizados quer com bactérias que sofrem divisão assimétrica (Caulobacter crescentus), quer com bactérias onde a divisão é aparentemente simétrica (Escherichia coli), demonstram que os seus constituintes celulares não são aleatoriamente distribuídos pelas duas células-filha, havendo uma segregação assimétrica de danos celulares e fatores de envelhecimento. A análise dos mecanismos moleculares subjacentes à degeneração celular bacteriana revela semelhanças interessantes com o processo de envelhecimento de organismos superiores.<br>Senescence presents itself as a metabolically active process, triggered by multiple factors, limiting the life time, since when the cell enters in senescence, it looses irreversibly the capacity to proliferate. Bacteria were considered potentially immortal organisms due to their asexual reproduction by binary fission. However, studies using either bacteria with asymmetric fission (Caulobacter crescentus), either bacteria where the division is apparently symmetric (Escherichia call), showed that their cellular constituents are not randomly distributed between the two daughter cells, and that there is an asymmetric segregation of cell damage and aging factors. The analysis of the molecular mechanisms underlying bacterial cell degeneration reveals interesting similarities with the aging process of higher organisms.

RESUMO: A ocorrência de neoplasias malignas é considerada um dos principais problemas de saúde pública ao nível mundial, sendo a segunda causa de morte em países desenvolvidos. Nos últimos 10 anos, os avanços na terapêutica utilizada no tratamento do cancro veio aumentar a taxa de sobrevivência dos doentes oncológicos. Infelizmente, a doença metastática é ainda a principal responsável pela mortalidade e morbilidade associadas à doença. Em 2000, Hanahan e Weinberg publicaram a sistematização das principais características da transformação maligna em seis categorias: autossuficiência para a produção de sinais ativadores da proliferação celular, insensibilidade para fatores inibidores da proliferação, capacidade replicativa ilimitada, capacidade de estimulação da angiogénese, capacidade de bloquear mecanismos desencadeadores de processos de morte celular e capacidade de invasão dos tecidos e de metastização noutros órgãos. Uma década mais tarde, surgiram duas novas categorias que vieram a revelar-se essenciais para a progressão tumoral, a reprogramação metabólica das células tumorais e a capacidade de evasão à ação do sistema imunitário. Durante a progressão tumoral, a formação de novos vasos sanguíneos é essencial para a oxigenação e suplementação de nutrientes às células tumorais, que consequentemente impulsiona a sobrevivência das células malignas e o crescimento tumoral, bem como o processo de metastização. Estudos na área da angiogénese tumoral demonstraram que contrariamente ao que acontece com os vasos sanguíneos normais, os vasos tumorais são frágeis e permeáveis, o que por sua vez favorece a extravasão de células tumorais para a corrente sanguínea e posteriormente a metastização, além de comprometer a entrega dos agentes quimioterápicos. Nos últimos anos, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas anti-angiogénicas tem vindo a revelar uma baixa eficácia no tratamento de doentes oncológicos, sugerindo que os mecanismos subjacentes à angiogénese tumoral ainda não são totalmente conhecidos. Para além disso, os novos estudos indicam que estratégias que normalizam a vasculatura tumoral, em vez de a destruir, facilitam a chegada dos fármacos ao tumor, aumentando assim a sua eficácia. É de salientar ainda que a contribuição de células progenitoras endoteliais (EPCs) para o sucesso da angiogénese tumoral tem sido desvalorizada, em parte devido à inexistência de marcadores específicos que leva à má caracterização dessas células, o que impede e identificação de subtipos celulares que atuam como EPCs. Durante a tumorigénese, a remodelação metabólica das células tumorais promove a geração de um microambiente pró-oxidante que atua como um estímulo proangiogénico responsável pela ativação das células endoteliais (ECs), que se traduz na passagem das ECs de um estado de quiescência para uma fase proliferativa. O microambiente tumoral pró-oxidante também afeta mecanismos que atuam nas células malignas, tais como a ferroptose que tem como mecanismo subjacente a formação de peróxidos lipídicos devido à acumulação de espécies-reativas de oxigénio (ROS). Embora este processo tenha sido inicialmente descrito como um mecanismo de morte celular dependente de ferro, atualmente já é assumido também como responsável pela regulação de processos biológicos e fisiopatológicos. Ao nível molecular a ferroptose pode ser ativada pela angiopoietina 4 (ANGPTL4), uma molécula a jusante da via TAZANGPTL4-NOX2. Por sua vez, a ativação desta via induz ferroptose através da geração de radicais superóxidos. Além da sua relevância na promoção da ferroptose, a ANGPTL4 também é um conhecido estimulador da angiogénese, o que sugere uma conexão entre o a ferroptose e a angiogénese. Nos últimos anos, o b-bloqueador não seletivo Propranolol que é frequentemente prescrito para o tratamento de doenças cardiovasculares, hipertensão e enxaquecas, foi adaptado para o tratamento de tumores vasculares, como hemangiomas e cavernomas. Ao nível molecular sabe-se que o Propranolol tem a capacidade de interferir com a angiogénese através da diminuição dos níveis do fator de crescimento vascular (VEGF) e do fator de crescimento de fibroblasto (FGF). Recentemente, o Propranolol foi descrito como inibidor da ANGPTL4 em células de hemangioma e como tendo a capacidade inibitória da ferroptose. Porém, atualmente ainda é desconhecido o mecanismo exato pelo qual o Propranolol atua nas ECs e afeta a angiogénese. Alguns estudos retrospetivos em doentes com carcinoma da mama demonstram que a administração de Propranolol para outros fins terapêuticos correlacionam-se com um melhor prognóstico da doença oncológica. Os efeitos anti-angiogénicos do Propranolol em tumores vasculares, aliado aos estudos retrospetivos em doentes oncológicos, levam-nos a acreditar que o benefício da aplicação do Propranolol no tratamento do cancro poderá estar relacionado com a sua interferência com a angiogénese. Os avanços ao nível dos tratamentos na área da oncologia têm vindo a aumentar a sobrevida dos doentes, porém, o uso destas terapêuticas está associado a toxicidade aguda e crónica. As novas evidências demonstram que a utilização de terapêuticas dirigidas às células tumorais poderão aumentar a especificidade dos tratamentos, diminuindo a toxicidade em células normais. Com os avanços científicos, o desenvolvimento de estratégias focadas em promover simultaneamente a morte celular de células tumorais e a normalização da vasculatura permitirá um aumento da eficácia do tratamento e uma diminuição dos efeitos adversos. Na presente tese, o principal objetivo é investigar se os monócitos podem atuar como EPCs e se o stress oxidativo promove a ativação das ECs através de um mecanismo semelhante à ferroptose, que poderá ser revertido pela ação anti-angiogénica do Propranolol. Assim, para avaliar a capacidade dos monócitos em diferenciar em ECs utilizámos monócitos isolados a partir de sangue periférico de dadores de sangue saudáveis e para e o estudo do mecanismo subjacente à ação do Propranolol e da ferroptose utilizámos ECs isoladas da veia do cordão umbilical humano (HUVECs) que foram expostas a Erastina, um ativador da ferroptose, na ausência e na presença de Propranolol. No 1º capítulo de resultados experimentais desta tese foi demonstrado, em vários contextos biológicos, que os monócitos expostos a um estímulo pro-angiogénico diferenciam em ECs e incorporam os vasos sanguíneos. A angiogénese tumoral foi um dos fenómenos explorados que provou a capacidade de incorporação dos monócitos nos vasos e comprovou-se também que as ROS é um estímulo que promove a diferenciação de monócitos em ECs. No 2º capítulo de resultados foi verificado que o Propranolol inibe as propriedades angiogénicas das ECs, como a proliferação, migração e capacidade in vitro e ex vivo de formar estruturas que mimetizam vasos sanguíneos in vivo. Numa criança com cavernomas cerebrais, também é responsável pela diminuição dos níveis de células do sangue que apresentam em simultâneo marcadores de monócitos e de ECs (CD14+ /CD31+) e os níveis de VEGF no soro de sangue periférico. Estes resultados sugerem que o Propranolol inibe a ativação de ECs e a mobilização de célulasCD14+/CD31+ que promovem a expansão dos cavernomas cerebrais. No 3º capítulo foi demonstrado que para além do efeito conhecido das ROS na promoção da angiogénese, a ativação não letal da ferroptose pela geração de peróxidos lipídicos, induzidos pela exposição à Erastina, também contribui para a ativação de ECs, com promoção da proliferação, da migração e da formação de estruturas semelhantes a vasos. Durante este processo existe um aumento das ROS, depleção do glutatião (GSH), inibição da importação de cist(e)ína e a acumulação de peróxidos lipídicos, que contribuem para a ferroptose. Além disso, a exposição de ECs a Erastina promove um aumento de lacunas nas junções aderentes da caderina endotelial vascular (VE-Cad) e a adesão de células cancerígenas ao endotélio pelo aumento da expressão de selectinas (ICAM e VCAM), favorecendo também a migração transendotelial de células cancerígenas. A ativação da ferroptose em ECs mimetiza as características dos vasos tumorais, indicando que este mecanismo também pode promover a angiogénese tumoral. Ainda neste contexto, observou-se que as propriedades antioxidantes e antiangiogénicas do Propranolol mediadas pela produção de sulfureto de hidrogénio (H2S) revertem o efeito do mecanismo semelhante à ferroptose na ativação de ECs, reforçando a sua utilidade como fármaco anti-angiogénico. Por um lado, foi provado que o Propranolol tem a capacidade de inibir a ativação de ECs e a formação de estruturas que mimetizam vasos, características estas potenciadas pelo mecanismo semelhante à ferroptose. Por outro lado, o Propranolol induz a normalização das estruturas vasculares já formadas, eventualmente favorecendo uma maior eficiência na distribuição de agentes quimioterápicos. No 4º capítulo de resultados, foi explorada uma estratégia terapêutica utilizando as propriedades antioxidantes do Propranolol seletivas para ECs juntamente com a utilização de nanopartículas dendriméricas que encapsuladas com seleno-crisina (SeChry@PUREG4) com propriedades oxidantes. Esta estratégia promoveu a geração de stress oxidativo e consequente morte das células cancerígenas, enquanto que nas ECs o efeito protetor do Propranolol reverteu a geração de ROS e a permeabilidade das estruturas endoteliais pela diminuição de lacunas nas junções aderentes de VE-cad. De um modo geral este projeto permitiu expandir o conhecimento dos mecanismos envolvidos no controlo da angiogénese tumoral e desvendou a contribuição dos monócitos como EPCs, bem como a sua contribuição para formação da vasculatura tumoral. Além disso, foi reforçada a utilização do Propranolol como um fármaco antiangiogénico e a sua combinação com SeChry@PUREG4 no contexto de uma nova estratégia terapêutica duplamente dirigida às células malignas e às ECs.<br>ABSTRACT: Cancer is one of the most burden diseases worldwide and every year millions of people around the world are diagnosed and eventually die from it. In the past 10 years, an increment in the efficacy of cancer treatment reduced the overall mortality from cancer. However, the metastatic disease and resistance to treatments are still largely responsible for cancer patients mortality and morbidity. Advances in cancer research have shed a light on the biology of cancer, pointing out that it cannot be studied only from a cancer cell point of view but the involvement of other non-cancerous cells during tumorigenesis should also be considered. For example, the contribution of endothelial cells (ECs) underlying tumor angiogenesis has revealed to be pivotal for cancer cell survival, tumor growth and metastatic spread. The formation of tumor neovessels, supporting the delivery of oxygen and nutrients to the tumor is prompted by the generation of a pro-angiogenic and a pro-oxidant tumor microenvironment (TME). However, contrarily to normal vessels, the tumor vasculature is composed by a fragile and permeable vascular network, that enables cancer cell intravasation, tumor metastasis and compromises the delivery of chemotherapeutic agents and consequently their efficacy. For the past years, the development of strategies using anti-angiogenic drugs has tried to hinder tumor growth by disrupting the blood supply to tumors. However, recent evidence shows that instead of destroying tumor neovessels, the restoration of its normalization would increase the penetration of therapeutic agents to the tumor, improving their efficacy. Those evidence allied to the fact that the clinical results of anti-angiogenic agents have been disappointing, indicates that the mechanisms underlying tumor angiogenesis remain to be fully understood. For instance, the contribution of endothelial progenitor cells (EPCs) to tumor angiogenesis may be undervalued in part because, so far, the absence of specific markers to characterize EPCs may lead to the underestimated capacity of other cell subtypes in acting as EPCs. As mentioned above, the pro-oxidant TME is known as an active player in the activation of the angiogenic switch. Furthermore, the role of reactive oxygen species (ROS)-dependent mechanisms, such as ferroptosis, recently described as a promoter of cellular phenomena beyond cell death; on the regulation of angiogenesis has not been explored so far. Propranolol, a b-blocker, has shown efficacy in the treatment of vascular tumors, as hemangiomas and cavernomas although, the precise mechanism(s) by which it interferes with angiogenesis remains to be clarified. Recently, Propranolol has been pointed out has having anti-ferroptotic properties and its use correlates with better prognosis of cancer patients and fewer metastasis. The present thesis proposed to clarify that monocytes can act as EPCs and that a ferroptosis-like mechanism sustains the EC activation and further angiogenic switch, being possibly reverted by the anti-angiogenic effect of Propranolol. We disclosed that monocytes are EPCs that upon a pro-angiogenic stimuli, differentiate into ECs and incorporate blood vessels. In a cancer scenario, monocytes contribute to cancer progression, in part by promoting the formation of the tumor neovasculature. As mentioned, and since the generation of a pro-oxidant TME favors angiogenesis, herein we observed that ROS push monocytes to differentiate into ECs, which in turn favor tumor neovasculature formation. The potential of translation of these data into the clinical context can be supported by the effect of Propranolol administration in a child with cerebral cavernous malformation (CCM). In fact, Propranolol administration decreased the levels of circulating cells expressing monocytic and ECs markers (CD14+ /CD31+ ), and VEGF levels in the peripheral blood, indicating that Propranolol impairs the recruitment of CD14+ /CD31+ monocytes to the vascular lesion. In addition to the already described relevance of ROS in the promotion of angiogenesis, we describe that ROS-induced lipid peroxides generation induced by Erastin, at a non-lethal level, promotes ECs proliferation and migration and accounts for vessel-like structures formation. The stimulation of these ECs features where accompanied by ferroptosis hallmarks, which includes increased ROS generation, glutathione (GSH) depletion, abrogation of cyst(e)ine import and lipid peroxides accumulation. These alterations were accompanied by the generation of a leakier ECs monolayer, presenting increased intercellular junctional gaps in VE-Cadherin (VE-Cad) adherens junctions that facilitates the transendothelial cancer cells migration. The increased levels of selectins (ICAM and VCAM) were also observed, promoting cancer cells adhesion to ECs. The antioxidant and anti-ferroptotic Propranolol properties, mediated by the generation of hydrogen sulfide (H2S), reverted the Erastin-induced ECs hyperactivation. Interestingly, since we observed that the antioxidant properties of Propranolol mediated by H2S generation are EC-specific, we unraveled a putative antitumor and anti-angiogenic strategy using the pro-oxidant dendrimeric nanoparticles loaded with selenium chrysin (SeChry@PUREG4) in combination with Propranolol. This strategy allowed the increase in oxidative stress induced-cancer cells death, potentiated by the action of Propranolol, while its protective effect in ECs avoided the generation of oxidative stress, which in turn impairs the generation of a leakier vascular structure and cancer cells extravasation. Together, our results indicate that monocytes are EPCs that contribute to tumor angiogenesis and that a ferroptosis-like mechanism promotes the hyperactivation of ECs and the angiogenic switch with leakier vessel-like structures, which recapitulates the formation of the unstable tumor neovasculature that favors cancer cell’s dissemination and metastasis. Moreover, a new therapeutic strategy was proposed, joining the antiangiogenic and anti-tumor effects of Propranolol and the pro-oxidant effect of SeChry@PUREG4, tackling cancer cells and stabilizing tumor neovessels, in order to impair metastasis and improve drug delivery.