Dissertations / Theses on the topic 'Espermatogénesis'

Desde el punto de vista metodológico esta tesis aporta, primero una mejora en la técnica de fusión heteróloga de ovocitos de hámster con esperma humano mediante el uso de ionóforo lo que mejora el proceso de capacitación espermática. En segundo lugar el uso de vinblastina, como agente antimitótico, es un hecho relevante que mejora sustancialmente la calidad de la extensión cromosómica y en consecuencia incrementa el número de complementos cromosómicos de mejor morfología para ser estudiados. Una tercera mejora importante ha consistido en un método original para el pintado de cromosomas enteros. Permite distinguir los complementos cromosómicos de ovocito de hámster de los complementos de pronúcleo masculino humano. Además, usando sondas de ADN marcadas con fluorescencia, específicas para los cromosomas preseleccionados, se han estudiado cromosomas humanos específicos. Esta aproximación metodológica mejorada hace posible estudiar con éxito la segregación meiótica en portadores de reorganizaciones cromosómicas equilibradas. Uno de ellos es la reorganización cromosómica compleja, 46, XY, -2, + der (2) t (2; 11) (q13; q23), - 11, + der (11) t (11; 22) (q23; q11.2), - 22, + der (22) t (2; 22) (q13; q11.2). Se analizaron un total de 208 complementos de esperma. La frecuencia de esperma que lleva una complemento normal o un complemento equilibrado era sustancialmente más baja que la frecuencia de espermatozoides desequilibrada siendo de 13,5% vs 86,5%, respectivamente, incluyendo 30 modos diferentes de segregación de ambos 4: 2 y 5: 1. Los resultados obtenidos en este estudio son compatibles con la formación, durante el proceso sináptico, de una figura hexavalente compleja que implica los cromosomas 2, 11 y 22. El comportamiento y la segregación de esta figura compleja explicarían la alta frecuencia (86,5%) de complementos desequilibrados observado en este portador. También se ha estudiado la segregación cromosómica de varios portadores de reorganizaciones cromosómicas. Tres portadores de translocacion recíproca (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) y un portador de inversión pericéntrica 47, XY, inv (7) (p13q36). En los portadores de translocaciones equilibradas se observaron todas los modos de segregación (alternante, adyacente-1, adyacente-2 y 3:1). No se ha observado relación entre la no disyunción de los cromosomas homólogos y las características particulares de la figura de emparejamiento, con la incidencia de eventos de recombinación meiótica en las regiones intersticiales de la estructura tetravalente. Además, en el caso del portador de la translocación recíproca 46XY, t (5; 7) (q21;q32) hay evidencia de un efecto intercromosómico, incremento de la frecuencia de aneuploidía en cromosomas no implicados en la translocación, con respecto a las muestras control. En cuanto a los portadores de inversiones pericéntricas analizados, el estudio de segregación cromosómica, proporciona una clara evidencia de una relación entre la incidencia de los productos de recombinación meiótica y la proporción entre el tamaño del segmento invertido respecto del tamaño total del cromosoma (tamaño en Mpb), más que con la longitud del fragmento invertido. Finalmente, cabe destacar la aplicabilidad de los resultados para desarrollar el conocimiento necesario para proporcionar un consejo genético apropiado a los portadores de reorganización cromosómicas equilibradas.
From the methodological point of view this thesis it provides, first the improvement of the heterologous fusion technique of hamster oocyte with human sperm by using ionophore improving the sperm capacitation process. Secondly using vinblastine, as antimitotic agent, improves the chromosomal morphology quality substantially, and consequently the number of complements good enough that can be studied increases. A third important improvement is an original method for painting whole chromosomes using FISH. It allows to distinguish both chromosomal complements, hamster oocyte chromosomes and human pronuclear male chromosomes. Moreover, using DNA probes labelled with fluorescence, specific to the preselected chromosomes, selected human chromosomes have been studied. This improved methodological approach enables study successfully meiotic segregation in carriers of balanced chromosomal rearrangements. One of them is the carrier of a complex chromosome rearrangement, 46,XY,-2, +der(2)t(2;11)(q13; q23),-11,+der(11)t(11;22)(q23;q11.2),-22, +der(22)t(2;22)(q13; q11.2). A total of 208 sperm complements were analyzed. The frequency of sperm carrying a normal or a balanced complement was substantially less frequent than the frequency of unbalanced sperm (13.5% vs 86.5% respectively) including 30 different segregation modes of both 4:2 and 5:1. The results obtained in this study are compatible with the formation, during the synaptic process, of a complex hexavalent figure involving chromosomes 2, 11, and 22. The behaviour and segregation of this complex figure would explain the high frequency (86.5%) of unbalanced complements observed in this carrier. Moreover sperm chromosome segregation studies in several carriers of balanced chromosome rearrangement are also performed: the following three reciprocal translocations (46, XY t (5; 7) (q21; q31), 46, XY, t (9; 17) (q12; p12) 46, XY, t (9; 17p13; q21.3) and the pericentric inversion 47, XY, inv (7) (p13q36). In the balanced translocation carriers the frequencies of alternate, adjacent-1, adjacent-2 and 3:1 segregation were detected. No relationship between the non-disjunction of homologous chromosomes and particular characteristics of the pairing figure such as the incidence of meiotic recombination events in the interstitial regions of tetravalent structure has been observed. Moreover, in the case of the carrier of t(9;17)(q12;p12) reciprocal translocation, evidence of an interchromosomal effect were observed, increased aneuploidy frequencies for chromosomes not involved in the translocation, in respect of control samples. Taking into account, the pericentric inversions carriers analysed, the chromosome segregation study provides a clear evidence of a relationship between the incidence of meiotic recombination products and the percentage of the inverted chromosome segment more tan with the length (size in Mpb) of the inverted chromosome segment. Finally, is worth noting the applicability of the results to develop the necessary knowledge, for proper genetic counselling to male carriers of balanced chromosomal rearrangements.

Este trabajo estudia el ambiente de la matriz extracelular (ECM) y su implicación en la respuesta inmunitaria y espermatogénesis de la dorada. Especie muy útil como modelo experimental en el estudio de las interacciones entre los sistemas inmunitario y reproductor por sus características biológicas de reproducción estacional, involución testicular y reversión sexual. Los resultados demostraron que el colágeno y sus péptidos derivados pueden actuar como señales de daño (DAMPs), modulando de forma específica la respuesta inmunitaria innata y los procesos de inflamación inicial en fagocitos profesionales y fibroblastos de dorada. Asimismo, las fuertes correlaciones entre moléculas relacionadas con la ECM, en condiciones fisiológicas y durante el desarrollo, son moduladas en granulocitos acidófilos como parte de la respuesta inflamatoria ante DAMPs y moléculas derivadas de patógenos. Finalmente, se encontró que además de la integrina beta 1a que se expresa constitutivamente, en dorada existe la isoforma ITGB1b que se expresa principalmente en testículo y durante la espermatogénesis. Estos hallazgos aportan al conocimiento sobre el ambiente de la ECM como un entorno complejo, coordinado y multifuncional, con posibles aplicaciones prácticas a futuro en el campo de la regeneración y remodelación tisular.
This work studies the extracellular matrix (ECM) environment and their implications in the immune response and spermatogenesis in gilthead seabream. This is a useful model to study interactions between immune and reproductive systems, considering its biological characteristics, such as seasonal breeding, testicular involution and sexual reversion. The results showed collagen and its derived peptides as able to act as damage signals (DAMPs), modulating in a specific form the innate immune response and the early inflammation processes in seabream professional phagocytes and fibroblasts. In addition, the strong correlations between ECM related molecules, under physiological conditions and during development, are modulated as part of the response against DAMPs and pathogen derived molecules. Finally, we found that in addition to the integrin beta 1a (ITGB1a) which is constitutively expressed, in seabream there is an ITGB1b which is mainly expressed in testis and during spermatogenesis. These findings improve the knowledge about ECM compartment as a complex, coordinated and multifunctional environment, having possible future practical applications in the tissue regeneration and remodelling.

Lepidium meyenii Walp (maca) (Brassicaceae), es empleada tradicionalmente por sus diversas propiedades, entre las que destacan la mejora en el desempeño sexual en humanos, ratas y ratones, además de mejorar la espermatogénesis. Sin embargo, el mecanismo de como la maca influye sobre la espermatogénesis es aún desconocido En el presente estudio, ratones machos de edad adulta fueron tratados con el extracto acuoso de maca, durante periodos de 7, 14 y 21 días; al final de cada tratamiento se midieron los pesos, concentración espermática y se evaluó la expresión de ciclina A1 (Ccna1), citocromo P450 17α-hidroxilasa/17,20-liasa (Cyp17), protamina 2 (Prm2) y la proteína reguladora de esteroidogénesis aguda (StAR), genes involucrados en el proceso de espermatogénesis. En los resultados se observó que la maca incrementó significativamente (p menos 0.05) la concentración espermática en los 3 grupos tratados; además la expresión de los genes Ccna1, Cyp17 y Prm2 no fue afectada significativamente a diferencia de StAR, que muestra una regulación negativa en su expresión en los grupos de 7 y 14 días de tratamiento. Estos resultados sugieren que el mecanismo por el cual la maca incrementa la concentración espermática, no está relacionado al incremento de la actividad meiótica, ni a la síntesis de testosterona, sino mas bien a la respuesta de algún componente con actividad androgénica presente en el extracto acuoso de maca, evidenciado por el efecto negativo sobre la expresión de StAR. Estos resultados revalidan la importancia de maca como potenciador reproductivo, sin el riesgo del incremento de andrógenos, contraindicados para los casos de cáncer de próstata.
Lepidium meyenii Walp. (maca) (Brassicaceae) is widely used as a folk medicine, for the ability to enhance the sexual performance in humans, rats and mice, besides to improve the spermatogenesis. However, the way maca acts on spermatogenesis still unclear. In this study, adult male mice were treated with maca aqueous extract during periods of 7, 14 and 21 days, after each treatment, physiological parameters were measured and the expression of cyclin A1 (Ccna1), cytochrome P450 17α-hydroxylase/17,20-lyase (Cyp17), protamine 2 (Prm2) and steroidogenic acute regulatory protein (StAR) (genes involved in spermatogenesis), were recorded. The results shows that maca increased significantly (p less than 0.05) sperm concentration in the three treatment groups, plus Ccna1, CYP17 and Prm2 expression were not significantly affected, while StAR, shows a negative regulation on their expression in groups of 7 and 14 days of treatment. These results suggest, that the mechanism maca increases sperm concentration is not related to increased meiotic activity, or the synthesis of testosterone, but rather the response of a component with androgenic activity present in the aqueous extract of maca, evidenced by the negative effect on StAR expression. These results re-enact the importance of maca as reproductive enhancer without running the risk of increased androgen contraindicated in cases of prostate cancer.
Tesis

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario
Se estudió la capacidad de dos fuentes de fitoestrógenos para inducir impronta hormonal (hormonal imprinting) en rata Sprague-Dawley macho adulto. Para ello, se administró genisteína (3mg/kg peso vivo), o un extracto etanólico, obtenido a partir de Trifolium pratense cultivar “Pawera”, a ratas en su día 15 y 18 de preñez, las que fueron mantenidas con dieta libre de fitoestrógenos desde una semana antes de la cruza. Se utilizaron los machos de la camada obtenida (F1), los que se mantuvieron con dieta libre de fitoestrógenos durante todo el estudio. Al día 60 de vida, recibieron 17-β-Estradiol (E2) (100 μg/Kg p.v.); en el día 63 se extrajeron los testículos y caudas epididimarias para observar los efectos sobre la morfología, cantidad y viabilidad de los espermatozoides, y para medir el perímetro basal, luminal y alto del túbulo seminífero. Los grupos control recibieron el vehículo de la genisteína o del extracto. Los resultados demostraron que los machos F1 expuestos prenatalmente al extracto o la genisteína y a E2 a los 60 días de edad, presentaron un incremento en el número de espermatozoides presentes en la cauda epididimaria, aumento que fue mayor en los expuestos a genisteína. El perímetro luminal aumentó producto de la impronta con genisteína y no varió frente al tratamiento con E2. Los animales improntados con extracto y tratados con E2, presentaron lúmenes más distendidos. El alto del epitelio seminífero disminuyó debido a la impronta con genisteína o extracto, independiente del tratamiento con E2. No se observaron modificaciones a nivel de perímetro basal del túbulo seminífero, morfología ni viabilidad de los espermatozoides. A la luz de los resultados obtenidos, se propone que crías macho de hembras alimentadas con dietas bajas en fitoestrógenos, podrían ser incapaces de responder a E2 en la vida adulta, y por lo tanto, no aumentarían su número de espermatozoides

La edad influye en el empaquetamiento adecuado de la cromatina espermática haciéndola más vulnerable con el transcurrir del tiempo. Las protaminas son las proteínas nucleares más abundantes en el espermatozoide maduro y empaquetan fuertemente el genoma paterno dentro del núcleo espermático, haciéndolo inaccesible a nucleasas o mutágenos, protegiendo de esta manera al ADN espermático. Ratones con sólo una copia de estos genes son infértiles, lo que demuestra que son esenciales para la función espermática normal. El objetivo de esta tesis fue investigar si existe relación entre la edad masculina y la protaminación espermática a nivel fisiológico y molecular. Se usaron ratones (Mus musculus Linnaeus, 1758) macho de la cepa C57BLACK6 (C57BL6) (20 – 25 g), divididos en dos grupos etarios: ratones de 3-4 meses (Grupo joven: G1) y 18-21 meses (Grupo viejo: G2). Se emplearon espermatozoides obtenidos de la cola del epidídimo para los análisis de movilidad espermática, fragmentación del ADN mediante el ensayo cometa bidimensional y estrés oxidativo mediante TBARS. Se utilizó tejido testicular para evaluar la expresión génica de Prm1, Prm2, Tnp1 y Tnp2, mediante PCR en tiempo real (RT-qPCR). Respecto a las velocidades de movimiento espermático se observó que el G1 presentó mayores valores que G2, en cuanto a MOT (50.63 ± 6.60 % vs 30.38 ± 5.16 %, p<0.05) y MR (24.50 ± 3.04 % vs 13.92 ± 3.02 %, p<0.05), mientras que ME fue mayor en G2 que en G1 (69.31 ± 5.31 % vs 48.38 ± 7.39 %, p<0.05). Respecto a los tipos de desplazamiento de los espermatozoides, se observó que G1 presentó mayores valores que G2 respecto a VAP (67.89 ± 5.68 % vs 52.12 ± 3.38 %, p<0.05) y VSL (43.15 ± 3.47 % vs 30.68 ± 2.45 %, p<0.05). El estrés oxidativo medido con TBARS no presentó diferencias entre el G1 y G2 (132.50 ± 9.64 ng MDA/106 spz vs 135.00 ± 10.81 ng MDA/106 spz; p>0.05). Tampoco se observaron diferencias significativas en la proporción de espermatozoides con ADN fragmentado entre los grupos G1 y G2 (20.51 ± 1.41 % vs 20.11 ± 1.29 %, p>0.05), ni en la cantidad de ADN fragmentado por espermatozoide entre ambos grupos (17.36 ± 0.49 % vs 17.76 ± 0.62 %, p>0.05). La comparación de los niveles de expresión de los genes Prm1, Prm2, Tnp1 y Tnp2 demostró que Prm2 y Tnp1 en el G2 se sobreexpresan observándose una diferencia significativa respecto al G1 (p<0.05), sin embargo, Prm1 y Tnp2 no mostraron diferencias significativas (p>0.05). Si bien el aumento de la edad presentó diferencias significativas con los niveles de expresión Prm2 y Tnp1, esto no sería suficiente para ejercer algún impacto sobre la producción de ROS y el aumento de la fragmentación del ADN espermático, debido quizás al papel protagónico de Prm1 en la protaminación espermática reportado en todas las especies estudiadas hasta la fecha y cuyos niveles de expresión no son alterados en el grupo de ratones viejos. Se concluye que el incremento de la edad no altera la protaminación espermática en ratones.
--- Age has an influence in the proper packaging of sperm chromatin, rendering it more vulnerable as time goes on. Protamines are the most abundant nuclear proteins in the mature spermatozoon and they are responsible for packing the paternal genome inside the sperm cell nucleus, making it inaccessible to nucleases or mutagens, thus protecting it. Mice with only one copy of these genes are infertile, which proves that are essential for normal spermatic function. The aim of this study was to look for a correlation between male age and sperm protamination at molecular and physiological levels. Male mice (Mus musculus Linnaeus, 1758) from C57BLACK6 (C57BL6) strain (20-25g) were used and distributed in two age groups: 3-4 month old mice ("Young" group: G1) and 18-21 month old ("Elderly" group: G2). Spermatozoa obtained from the epididymis tail were employed in sperm motility analysis, DNA fragmentation analysis by bidimensional comet assay, and oxidative stress by TBARS assay. Testicular tissue was used for assess the gene expression of Prm1, Prm2, Tnp1 and Tnp2, by real time PCR (RT-qPCR). When analyzing sperm motility, MOT (50.63 ± 6.60% vs 30.38 ± 5.16 %) and MR (24.50 ± 3.04 % vs 13.92 ± 3.02 %) were higher in G1 compared to G2 (p<0.05). However, ME was higher in G2 compared to G1 (69.31 ± 5.31 % vs 48.38 ± 7.39 %, respectively) (p<0.05). Likewise, when analyzing displacement types in the sperm cells, VAP (67.89 ± 5.68 % vs 52.12 ± 3.38 %, p<0.05) and VSL (43.15 ± 3.47 % vs 30.68 ± 2.45 %, p<0.05) were higher in G1 compared to G2. Oxidative stress levels measured by TBARS did not show any differences between G1 and G2 (132.50 ± 9.64 ng MDA/106 spz vs 135.00 ± 10.81 ng MDA/106 spz; p>0.05). The proportion of sperm cells with fragmented DNA were not significantly different (G1 vs G2, 20.51 ± 1.41 % vs 20.11 ± 1.29 % respectively, p>0.05) and there were also no differences in the percentage of fragmented DNA of those subpopulations (17.36 ± 0.49 % vs 17.76 ± 0.62 %, p>0.05). Gene expression levels of Prm2 and Tnp1 were significantly overexpressed in G2 in comparison to G1 (p<0.05); however, Prm1 and Tnp2 did not show significant differences between both groups (p<0.05). Despite of age had an influence in expression levels of Prm2 and Tnp1, it would not be relevant enough to alter ROS production and sperm DNA fragmentation. It was probably due to the central role of Prm1 in sperm protamination, something widely reported in all studied species to date, which levels were not altered in the elderly group. As a conclusion, increase of age does not alter sperm protamination in mice.
Tesis

Evalúa a la ciclina A1 (CCNA1) cuya expresión ha sido reportada casi exclusivamente en testículos de otros animales incluyendo el hombre y se le atribuye una función crítica en el control del ciclo celular durante la espermatogénesis. Se evalua la expresión del mRNA de CCNA1, mediante RTqPCR, en testículos de alpacas provenientes del Camal Municipal de Huancavelica en edad fértil (n = 35). Estos resultados son correlacionados con parámetros fisiológicos evaluados in vitro. Se encuentra que la expresión de mRNA de CCNA1 en testículos de alpacas con regiones conservadas a nivel nucleotídico. A diferencia de lo que sucede en humanos y otros animales, el mRNA de CCNA1 mostró una baja, pero significativa asociación, con la concentración espermática (p<0.05).
Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La población canina en Chile y el mundo, va en un permanente aumento, generando problemas tanto para los humanos como para los mismos animales. Por esto, existe actualmente gran interés en encontrar métodos eficientes, seguros y económicamente viables para la implementación de programas de control poblacional. Para controlar la población existen diversos mecanismos. Aquellos que pretenden disminuir la natalidad y por consiguiente, frenar el crecimiento, están enfocados en disminuir la reproducción de los individuos. Alternativas que involucran incluyan a los machos son altamente atractivas, por el mayor potencial reproductivo de los mismos, en relación al potencial de las hembras. Entre las diferentes técnicas, la inmunocastración surge como una posible herramienta para lograr estos objetivos, ya que ofrece ventajas en comparación a tratamientos hormonales, químicos, irradiatiavos y a la esterilización quirúrgica. Por lo anteriormente descrito se realizó este estudio, que tuvo como objetivo, visualizar los efectos de una vacuna recombinante contra la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH-I) en la fertilidad canina, mediante la evaluación y observación de cambios en la espermatogénesis, esteroidogénesis y en conductas asociadas a la testosterona, tales como la agresividad, marcaje territorial y libido. Para esto, se inmunizaron 7 perros adultos mestizos con el péptido recombinante GnRX G/Q. Se aplicó una dosis única al día 1 y 21 con 250µg de proteína en 1 ml de adyuvante y al día 425, a dosis única con 500µg de proteína en 1 ml de adyuvante. Se evaluaron las concentraciones de inmunoglobulinas, concentraciones séricas de testosterona y, se realizaron observaciones y estudios conductuales. Además, se realizó un estudio histopatológico de testículo y epidídimo, al final del ensayo. En todos los animales inmunizados con la proteína recombinante GnRXG/Q hubo un aumento en la producción de inmunoglobulinas anti GnRXG/Q a partir del día 60 post vacunación. Además, fue posible observar que existe inmunogenicidad cruzada entre la hormona nativa GnRH-I y la proteína recombinante inoculada. Así mismo, se pudo visualizar una gran variabilidad individual en las respuestas de esteroidogénesis y conductuales. Recomendamos continuar con estudios para estandarizar dosificación y para evaluar la sensibilidad de diferentes kits disponibles para la estimación de las concentraciones plasmáticas o séricas de testosterona. Sin embargo, la inmunización fue capaz de disminuir la actividad espermatogénica y generar alteraciones en testículo y epidídimo de los animales vacunados, en relación al control no tratado. Por lo tanto, creemos que la vacuna creada en el laboratorio BIOVETEC de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile, puede proponerse como una alternativa para el futuro control de la fertilidad e intervenir de manera efectiva en el problema de los caninos como plaga urbana

Des del desenvolupament de la seqüenciació de Sanger l’any 1977, els avenços tecnològics han revolucionat el camp dels òmiques. Els projectes de seqüenciació a gran escala han generat una enorme quantitat de dades que han motivat el desenvolupament d'eines bioinformàtiques per a la integració, organització i interpretació d’aquestes dades. Com que la quantitat de dades de seqüenciació produïdes a tot el món es duplica cada 7 mesos, cal millorar la seva accessibilitat, processament i interpretació. En aquest sentit, l'objectiu principal d'aquest treball és desenvolupar eines bioinformàtiques per a l'anàlisi de les característiques funcionals i estructurals dels genomes. D'una banda, la capacitat d'emmagatzematge i l'accessibilitat de les dades de seqüenciació s'ha convertit en un repte, no només per a les dades brutes, sinó també per als resultats després del processament. Aquest és el cas de la transcriptòmica, una de les òmiques més finançades actualment. Per superar les limitacions actuals sobre les bases de dades existents per als lncRNA de plantes s’ha desenvolupat Green Non-Coding (GreeNC), una de les bases de dades en línia més àmplies del camp que ha inclòs 39 plantes superiors i 6 algues, emmagatzemant d’aquesta manera més de 200,000 lncRNAs. D'altra banda, la disponibilitat d'eines de fàcils d’usar per a permetre l’anàlisi i la gestió de dades de manera eficient a gran escala ajudaria a democratitzar la bioinformàtica. Diversos programes han aparegut recentment per permetre l'anàlisi de dades RNA-seq d'una manera accessible. No obstant això, cap d'ells proporciona una solució d’extrem a extrem. En aquest context, hem aprofitat la computació al núvol per a desenvolupar una plataforma fàcil d'usar anomenada Artificial Intelligence RNA-seq (AIR). AIR és la primera solució d'extrem a extrem per a l'anàlisi de dades RNA-seq que no es limita a espècies model i que no requereix habilitats bioinformàtiques prèvies. Un cop desenvolupat, AIR s’ha validat aprofitant mostres de RNA-seq derivades de cèl·lules germinals espermatogèniques de ratolí produïdes en el nostre grup de recerca. S’ha observat un augment de la prevalença de gens no codificants durant l'espermatogènesi i el silenciament del cromosoma X. També s’han identificat gens diferencialment expressats consistents amb el desenvolupament seqüencial de l’espermatogènesi. Precisament, se sap que el genoma experimenta grans canvis en la seva organització tri-dimensional (3D) del genoma durant l'espermatogènesi. Per caracteritzar aquesta reorganització en 3D s’ha fet servir AIR i altres eines addicionals per a l'anàlisi de dades Hi-C per generar un mapa d’interaccions de la cromatina i de les característiques genòmiques funcionals de la línia germinal masculina del ratolí. Els nostres resultats han revelat patrons no descrits prèviament: (i) l'organització d’escala subcromosòmica es perd durant la profase I; (ii) l'organització d’escala supranucleosòmica es fa difusa durant l'espermatogènesi, especialment en els espermatozous; (iii) esdeveniments específics com l’agrupació de telòmers (bouquet) i la inactivació del cromosoma X han estat observats; (iv) conformacions obertes específiques de cada tipus cel·lular s’han correlacionat amb l'expressió de gens amb funcions rellevants. En general, s’han desenvolupat noves solucions bioinformàtiques per a millorar l'accessibilitat, el processament i la interpretació de les dades òmiques que han permès l’anàlisi de les característiques funcionals i estructurals dels genomes.
Since the development of the Sanger sequencing in 1977, technological advances have revolutionized the -omics field. Large-scale sequencing projects have resulted in the generation of an enormous amount of data that have motivated the development of bioinformatics tools for its integration, organization and interpretation. Due to the fact that the amount of sequencing data produced worldwide doubles every 7 months, there is the need to improve data accessibility, processing and interpretation. In this sense, the main aim of this work is to develop bioinformatics tools for the analysis of the functional and structural characteristics of genomes. On the one hand, storage capacity and accessibility of -omics data has become a challenge, not only for raw data but also for post-processing results. And this is the case for transcriptomics, one of the most funded -omics. In order to overcome current limitations on the existing databases for plant lncRNAs, we developed Green Non-Coding (GreeNC), one of the most comprehensive online databases in the field that included 39 plant species and 6 algae, representing more than 200,000 lncRNAs. On the other hand, the availability of user-friendly tools to ensure feasible large-scale data analysis and management would help to democratize bioinformatics. Several software have recently emerged to allow the analysis of RNA-seq data in an accessible way. However, none of them provides an end-to-end solution. In this context, we took advantage of cloud computing to develop a cloud-based easy-to-use platform called Artificial Intelligence RNA-seq (AIR). AIR is the first end-to-end solution for the analysis of RNA-seq data that is not limited to model species and does not require previous bioinformatics skills. Once developed, we validated AIR taking advantage of RNA-seq samples derived from mouse spermatogenic germ cells produced in our research group. We observed an increase in the prevalence of non-coding genes during spermatogenesis and detected silencing of the X chromosome. We also identified differentially expressed genes that were consistent with the sequential development of spermatogenesis. Precisely, it is known that the genome undergoes large three-dimensional (3D) conformational changes during spermatogenesis. To characterize such 3D re-organization, we made use of AIR and additional tools for Hi-C data analysis to generate an integrative atlas of the chromatin interactions and functional genomic characteristics of the mouse male germ line. Our results revealed previously undescribed patterns: (i) the sub-chromosomal organization scale is lost during prophase I, (ii) the sub-megabase organization scale becomes diffuse along spermatogenesis especially in sperm, (iii) specific events such as the telomere bouquet and the X chromosome inactivation were observed, and (iv) cell-specific open conformations correlated with the expression of genes with relevant functional roles. Overall, we have developed new bioinformatics solutions to enhance accessibility, processing and interpretation of -omics data that permitted the analysis of functional and structural features of genomes.

La terapia celular de células madre pluripotentes o embrionarias utilizada por la medicina regenerativa es un protocolo recientemente aplicado. Estas células, son derivadas de la masa celular interna (MCI) del estadio de blastocisto y son capaces de diferenciarse en todos los linajes celulares del cuerpo. Por otro lado, el tratamiento de enfermedades crónicas como el cáncer requiere de potentes fármacos que, en ocasiones, producen efectos no deseados. Ciclofosfamida (CP) es una droga anticancerígena alquilante que, entre otras cosas, provoca como efecto secundario infertilidad. El objetivo de la presente investigación fue revertir dicho efecto negativo, mediante terapia celular, utilizando células de la MCI al diferenciarse in vivo en células madre germinales (CMG). Se utilizaron blastocistos de ratones albinos Swiss Rockefeller obtenidos a las 90 h post cópula. La MCI fue aislada mediante inmunocirugía y luego trasplantada a los túbulos seminíferos de ratones receptores C57BL, a los que previamente se les disminuyó drásticamente la línea germinal con CP (220mg/kg pc). Los animales receptores fueron mantenidos por 35 días en un bioterio en condición estándar; luego los animales fueron sacrificados por dislocación cervical, se extrajeron los testículos para evidenciar la colonización y diferenciación de la MCI mediante cortes histológicos seriados. La evaluación comprobó colonización intraluminal y presencia de minitúbulos (2%) en el 62.5% de los receptores transplantados. Se demostró que las células de la MCI tienen la capacidad de colonizar túbulos seminíferos de ratones adultos de diferentes cepas. Palabras claves: Colonización intraluminal, Masa Celular interna, Células Madre Pluripotentes, Células Madre Germinales, Minitúbulos.
Cellular therapy with embryonic or pluripotent stem cells used by regenerative medicine is a newly implemented protocol. These cells are derived from the blastocyst stage inner cell mass (ICM) and are capable of differentiating into all the body cell lineages. On the other hand, chronic diseases treatment such as cancer requires powerful drugs that sometimes cause unwanted effects. Cyclophosphamide (CP) is an alkylating anticancer drug that, among other things, causes infertility as a side effect. The aim of this research was reverse this negative effect by cell therapy using ICM to differentiate in vivo to germ stem cell (GSC). Swiss Rockefeller albino mice blastocyst stage embryos obtained 90 hours post coitus were used. The MCI was isolated by immunosurgery and then transplanted to the seminiferous tubules of recipient mice C57BL, which were previously germ line decreased drastically with CP (220mg/kg pc). The recipient animals were kept for 35 days in standard animal room conditions, after the animals were sacrificated by cervical dislocation; testes were removed to show the ICM colonization and differentiation by serial histological sections. The evaluation found the intraluminal colonization and presence of minitubules (2%) in the transplant recipients (62.5%). It is shown that the ICM cells have the ability to colonize seminiferous tubules of adult mice of different strains. Key words: Intraluminal Colonization, Inner Cell Mass, Pluripotent Stem Cells, Germ Stem Cells, Minitúbules.
Tesis

En las inmediaciones de la ciudad de Barcelona existe una zona de polimorfismo robertsoniano (Rb) de ratón doméstico de Europa Occidental (Mus musculus domesticus) que abarca unos 5.000 km2 y se halla rodeada por poblaciones cuyos individuos presentan un cariotipo estándar (St) de 40 cromosomas telocéntricos. En dicha zona se han detectado siete metacéntricos diferentes y animales Rb con números diploides comprendidos entre 27 y 40 cromosomas. El sistema robertsoniano ‘Barcelona’ (SRbB) representa un modelo único dentro del conjunto de las zonas Rb de M. musculus domesticus descritas hasta el momento puesto que carece de una raza cromosómica propia y el conjunto de cromosomas metacéntricos presenta una distribución geográfica clinal escalonada. Si bien al inicio de la presente investigación se disponía de información sobre la estructura de este sistema Rb, la dinámica de dispersión de los metacéntricos era totalmente desconocida. Con el objeto de evaluar posibles cambios en el proceso de fijación de las fusiones Rb y en el grado de aislamiento genético entre poblaciones de individuos con distintas características cariotípicas, se ha efectuado un estudio de la variación espacio-temporal de la estructura del SRbB entre los periodos 1996-2000 y 2008-2010. Asimismo, conociendo previamente la existencia de diferencias en el epitelio seminífero entre individuos St y Rb, se ha estudiado el posible efecto de las translocaciones Rb sobre el grado de muerte celular programada (apoptosis) durante los distintos estadios de la espermatogénesis. Finalmente, se ha investigado la relación entre las fusiones Rb y el tamaño y forma de la cabeza del espermatozoide, aplicando análisis de morfometría geométrica a imágenes obtenidas mediante microscopia electrónica de barrido, así como la existencia de modularidad variacional en dicha estructura. Si bien se detectaron fluctuaciones locales en el grado de fijación de los metacéntricos, la estructura clinal de la zona permaneció relativamente estable a lo largo del periodo considerado. Este resultado indica la presencia de cierto grado de aislamiento genético entre poblaciones diferenciadas cariotípicamente y, por tanto, corrobora la existencia de barreras reproductivas entre ellas. Los animales con números diploides reducidos mostraron un elevado grado de muerte en células germinales, irregularidades en los procesos de recombinación genética y alteraciones morfológicas en espermátidas redondas y en espermatozoides maduros. No obstante, la gran variabilidad detectada entre individuos sugiere que la magnitud de los efectos ocasionados por las fusiones puede variar en función de las características estructurales de los cromosomas implicados en las fusiones y el grado de heterocigosis génica. El análisis morfométrico de la cabeza del espermatozoide reveló diferencias substanciales entre grupos cromosómicos. Concretamente, se apreciaron divergencias en la morfología de las crestas ventrales entre espermatozoides de ejemplares St y Rb, y en la amplitud de la región post-acrosómica entre gametos de animales Rb. Dichas modificaciones podrían estar relacionadas con alteraciones en el proceso de citodiferenciación gamética debidas a las fusiones Rb. Los análisis de modularidad indican que la cabeza del espermatozoide está dividida en tres módulos variacionales que coinciden con la compartimentación citoesquelética de la teca perinuclear. Si bien no se han detectado diferencias en el patrón de modularidad entre grupos cromosómicos, la disminución en los porcentajes de covariación entre pares de módulos en ejemplares Rb indica que las reordenaciones cromosómicas pueden inducir cambios en el mapa fenotípico-genotípico.
A Robertsonian (Rb) polymorphism zone of the western European house mouse (Mus musculus domesticus) is found in the vicinity of the city of Barcelona. This Rb system covers about 5.000 km2 and is surrounded by populations whose individuals show a standard (St) karyotype of 40 telocentric chromosomes. In that area, up to seven different metacentrics and Rb specimens with diploid numbers ranging from 27 to 40 chromosomes have been detected. The ‘Barcelona’ Robertsonian system (BRbS) constitutes a unique model among the whole Rb systems described to date, since it lacks an exclusive chromosomal race and the set of metacentrics are geographically distributed following a staggered clinal pattern. Although information on the structure of the system was available at the beginning of the present research, little was known about the dispersal dynamics of the fusions throughout time. Thus, in order to evaluate possible changes in the fixation rates of the Rb fusions and in the degree of genetic isolation among populations differing in some karyotypic characteristics, a study on the spatio-temporal variation of the structure of the BRbS during the periods 1996-2000 and 2008-2010 has been carried out. Likewise, taking into account the finding of differences in the seminiferous epithelium between St and Rb specimens, the possible effect of Rb fusions on the rate of apoptotic germ cell death has been analyzed in all stages of the spermatogenesis in M. musculus domesticus. Finally, the relationship between the Rb fusions and the shape and size of the sperm head has been tested by applying geometric morphometrics to images obtained through a scanning electron microscope, a technique also applied to evaluate the existence of variational modularity in such sperm structure. Although local fluctuations in the fixation rate of metacentrics were detected, the clinal structure of the zone remained relatively stable over the period considered. This result indicates the existence of certain degree of genetic isolation between populations karyotypically differenciated, which corroborates the existence of reproductive barriers among them. Specimens with low diploid numbers showed a relevant signal of germ cell death, abnormalities in the genetic recombination and morphological alterations both in round spermatids and in mature spermatozoids. However, the great variability detected among individuals suggests that the magnitude of the effects caused by Rb fusions on the seminiferous epithelium may vary depending on the structural characteristics of the chromosomes involved in the fusions and on the degree of genic heterozygosity. Morphometric analysis on the sperm head revealed substantial differences among chromosomal groups. Divergences in the shape of the ventral spurs were detected between sperms from St and Rb specimens, while variation in the post-acrosomal width was also noticed among Rb gametes. These changes might be related to alterations in the gamete morphogenesis promoted by Rb fusions. Modularity analyses indicated that the sperm head is divided into three variational modules that fit with the cytoskeleton compartmentalization of the perinuclear theca. Although no differences in the modularity pattern were found among chromosomal groups, the decrease in the covariation rates between pairs of modules in Rb specimens suggests that Rb fusions might induce changes in the phenotype-genotype map of individuals.

Els cromosomes ocupen regions específiques del nucli anomenades territoris cromosòmics. En cèl·lules somàtiques, el posicionament dels cromosomes està condicionat per la densitat gènica, l’activitat transcripcional i el contingut de guanina-citosina. Aquestes associacions evidencien l’existència d’una relació funcional entre la territorialitat cromosòmica i l’expressió gènica. Disposem de poques dades sobre el posicionament cromosòmic durant l’espermatogènesi. Alguns autors suggereixen que la distribució dels cromosomes en cèl·lules espermatogèniques podria condicionar el correcte desenvolupament de l’espermatogènesi i tenir implicacions en l’expressió gènica de l’embrió. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral va ser establir un model tridimensional de la territorialitat cromosòmica durant les diferents fases del procés de l’espermatogènesi de Mus musculus. Per assolir aquest objectiu es va desenvolupar una metodologia per a l’estudi tridimensional del posicionament cromosòmic en cèl·lules germinals i espermatozoides amb la finalitat de descriure el posicionament i identificar els factors que regulen la territorialitat dels cromosomes en aquests tipus cel·lulars. Es va utilitzar teixit testicular procedent d’individus de la soca C57BL/6J de Mus musculus. La metodologia desenvolupada va consistir en l’aplicació dels següents procediments: i) fixació cel·lular preservant la tridimensionalitat nuclear, ii) hibridació in situ fluorescent de tots els cromosomes de ratolí, iii) captura d’imatges amb microscòpia confocal, iii) identificació cel·lular mitjançant immunofluorescència, iv) anàlisi d’imatges utilitzant el programa Matlab, v) obtenció de dades numèriques i anàlisi estadística. Aquesta metodologia va permetre l’estudi del posicionament de tots els cromosomes del genoma de ratolí en cinc estadis cel·lulars que cobreixen la totalitat del procés espermatogènic: espermatogoni-preleptotè inicial, espermatòcits I a l’estadi de preleptotè mitjà-zigotè, espermatòcits I a l’estadi de paquitè, espermàtides rodones i espermatozoides. Per cada estadi es van obtenir dades del volum de cada cromosoma, la posició dels cromosomes en relació a l’eix centre-perifèria nuclear i les freqüències d’encavalcament entre cromosomes. Els resultats van posar de manifest que el posicionament radial i relatiu dels cromosomes durant l’espermatogènesi és dinàmic i no aleatori. Són nombroses les evidències observades que permeten concloure que els esdeveniments cromosòmics que condueixen a la recombinació meiòtica determinen la dinàmica de posicionament dels cromosomes homòlegs des de l’etapa d’espermatogoni fins a l’etapa de paquitè. En aquest sentit s’ha observat que els cromosomes homòlegs comparteixen el mateix territori cromosòmic en etapes properes a l’inici de la meiosi. A més, l’estructura de bouquet condiciona l’organització territorial del nucli a l’etapa de paquitè en funció de la mida cromosòmica, observant-se els cromosomes més petits preferentment a la part perifèrica del nucli. D’altra banda, l’anàlisi dels resultats indica que l’activitat gènica és un paràmetre que condiciona el posicionament radial dels cromosomes durant tot el procés de l’espermatogènesi. La part interna del nucli presenta una concentració de material genètic superior al valor esperat. A més, els cromosomes amb més quantitat de gens implicats en el procés de l’espermatogènesi o espermiogènesi (en el cas de les espermàtides rodones), mostren més volum cromosòmic a la zona mitja-interna del nucli. Finalment, hem observat que els cromosomes sexuals presenten un posicionament radial dinàmic durant l’espermatogènesi, directament relacionat amb els processos d’inactivació transcripcional que experimenten al llarg del procés. En relació al posicionament relatiu entre cromosomes, els resultats van mostrar que les interaccions entre cromosomes al nucli de les cèl·lules germinals i dels espermatozoides no són aleatòries suggerint implicacions funcionals rellevants. Tot i així, no s’han identificat els factors que determinen aquesta posició relativa a excepció de l’efecte de la mida en l’estadi de paquitè i en les espermàtides rodones. Finalment, també s’ha pogut concloure que el posicionament dels cromosomes respecte l’eix longitudinal del nucli dels espermatozoides no és aleatori suggerint la importància d’un posicionament longitudinal ordenat pels processos d’alliberament i activació del genoma patern desprès de la fecundació.
Chromosomes occupy specific regions of the nucleus called chromosome territories. In somatic cells, the positioning of the chromosomes is conditioned by gene density, transcriptional activity and the guanine-cytosine content. These associations demonstrate the existence of a functional relationship between chromosomal territoriality and gene expression. Little is known about chromosomal positioning during spermatogenesis. Some authors have suggested that the chromosomes distribution in spermatogenic cells could affect spermatogenesis development and have implications for embryo gene expression. The objective of this doctoral thesis was to establish a three-dimensional model of chromosomal territoriality during the different stages of the Mus musculus spermatogenesis. To achieve this objective, we have developed a methodology for performing three-dimensional study of chromosomes positioning in germ cells and spermatozoa with the aim to describe the chromosome positioning, and to identify the factors that regulate the territoriality of the chromosomes in these cell types. Testicular tissue from individuals of C57BL6J Mus musculus strain was used. The methodology developed consisted in the following procedures: i) optimized cell fixation to preserve the three-dimensionality of the nuclei, ii) fluorescence in situ hybridization of all mouse chromosomes, iii) three-dimensional image captures by confocal microscopy, iii) cell identification by immunofluorescence iv) image analysis using Matlab, v) numerical data extraction and statistical analysis. This methodology allowed the study of all chromosomes positioning of the mouse genome in five cellular stages, which cover the whole spermatogenic process: spermatogonia-early preleptotene, spermatocytes I at mid preleptotene-zygotene stages, spermatocytes I at pachytene stage, round spermatids and spermatozoa. For each stage, data of the nuclear volume occupied by each chromosome were obtained, the position of chromosomes according to the central-peripheral nuclear axis and the overlapping frequency between chromosomes. Results showed that radial and relative positioning of chromosomes during spermatogenesis is dynamic and non-random. Several evidences were observed indicating that the chromosomal events that lead to meiotic recombination determine the dynamics of homologue chromosomes position from spermatogonia to pachytene stage. In this sense, it has been observed that homologous chromosomes share the same chromosomal territory in stages near the beginning of meiosis. In addition, the bouquet distribution affects the territoriality organization of the nucleus at pachytene stage in accordance to chromosomal size, being the smallest chromosomes preferably observed in the nucleus periphery. On the other hand, several pieces of data suggest that gene activity is closely associated with the radial positioning of chromosomes throughout the spermatogenesis process. For instance, the nucleus interior presents a higher concentration of genetic material than the expected value. In addition, chromosomes with more number of genes involved spermatogenesis process or spermiogenesis (in the case of round spermatids), show more chromosomal volume in the middle-internal area of ​​the nucleus. Finally, we have observed that sex chromosomes present a dynamic radial positioning during spermatogenesis, directly related to the transcriptional inactivation processes that they experience throughout the process. In relation to the relative positioning between chromosomes, the results showed that the interactions between chromosomes in the nucleus of germ cells and spermatozoa are not random, suggesting relevant functional implications. Even so, it has not been identified any factors that determine the relative position to the exception of the effect chromosome size at pachytene stage and round spermatids. Finally, it has also been concluded that the chromosome positioning in relation to the longitudinal axis of the sperm nucleus is not random, suggesting the importance of an ordered longitudinal positioning for the processes of release and activation of the paternal genome after fertilization.

La importancia de las células madre espermatogoniales (SSC) radica en su capacidad de autorenovación y diferenciación, dando lugar a la espermatogénesis, es por esto que se busca la proliferación In vitro de este tipo de células ya que representan un pequeño porcentaje de la población celular en testículos de machos adultos y poderlas emplear en la preservación de especies. Debido a la problemática reproductiva que presenta la alpaca en sus condiciones naturales, el empleo de SSC de alpaca surge como una alternativa para conservar la genética de individuos de esta especie. En este contexto, el objetivo de este trabajo de investigación fue cultivar células madre espermatogoniales de alpaca en presencia de moléculas como la gelatina y DBA y evaluar cuál de los distintos métodos provee un mayor soporte para la proliferación de las SSC. Se procesaron 12 pares de testículos de alpaca que fueron colectados en el Camal Municipal de Huancavelica (Aprox. 3,600 msnm), seleccionadas según la evaluación de sus parámetros espermáticos (concentración, viabilidad y movilidad espermática). Las suspensiones celulares obtenidas luego del aislamiento fueron purificadas por gradientes de Percoll y se evaluó la población de SSC por medio del marcaje con DBAFITC por Microscopía de Fluorescencia (MF) y Citometría de Flujo (CF), obteniéndose un porcentaje de células madre espermatogoniales post Percoll de 49.68 ± 10.9% y 83.72 ± 8.5% por MF y CF, respectivamente los cuales fueron mucho mayor a sus respectivos iniciales de 22 ± 5.45% (MF) y 46.52 ± 17.84% (CF), siendo esta diferencia estadísticamente significativa por ambas metodologías (p<0.05). Con respecto a la viabilidad celular no se ve afectada por el empleo del Percoll (p>0.05), siendo 94.89 ± 6.73% y 91.33 ± 6.58% antes y después del Percoll, respectivamente. Las células obtenidas antes y después de la purificación fueron cultivadas en placas normales (Grupo control y Grupo Percoll, respectivamente) y en placas cubiertas con gelatina y DBA (Grupo gelatina y Grupo DBA, respectivamente). Durante el monitoreo de los cultivos, la viabilidad celular entre grupos de tratamiento no se vio afectada significativamente (p>0.05), sin embargo, se observó disminución en la viabilidad entre días de cultivo siendo significativamente diferente entre el día 0 y 3 del cultivo para todos los grupos de tratamiento. Además, se observó la formación de colonias de SSC en todos los grupos al día 3 de cultivo, excepto en el Grupo control, donde la formación de estas fue mínima. Sin embargo, estas colonias empezaron a desaparecer al sexto día de cultivo. Luego de 8 días de cultivo se evaluó el porcentaje de SSC entre los distintos tratamientos por MF y CF, obteniéndose un mayor porcentaje de SSC en el Grupo DBA (63.28 ± 5.61% y 66.9 ± 10.34%) y el menor para el Grupo Control (44.48 ± 6.34% y 52.60 ± 23.44%), siendo los porcentajes intermedios para el Grupo Percoll (52.38 ± 5.64% y 57.95 ± 20.2%) y Gelatina (46.36 ± 4.14% y 53.05 ± 17.73%). Siendo el primer porcentaje obtenido por MF y el segundo por CF, se encontró que el Grupo DBA muestra diferencia significativa con respecto a los demás tratamientos por Microscopía de Fluorescencia (p<0.05), sin embargo, por Citometría de Flujo no se encontró diferencia significativa entre tratamientos (p>0.05). Se concluye que el empleo de gradientes de Percoll es un buen método para la purificación de SSC y que el empleo de la lectina DBA puede soportar la proliferación In vitro de SSC de alpaca.
Perú. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Vicerrectorado de Investigación y Posgrado. Programa de Promoción de Tesis de Pregrado. B18100184-PTPGRADO
Tesis

Compara el porcentaje y calidad postdescongelamiento de células madre espermatogoniales (SSC) de alpaca proliferadas y no proliferadas in vitro. Para ello se emplearon biopsias testiculares de 22 animales provenientes del camal municipal de Huancavelica (aproximadamente 22 horas post mortem). Los parámetros espermáticos iniciales (movilidad y concentración) fueron evaluados en cada muestra a partir de espermatozoides epididimarios. Se obtuvieron suspensiones de células testiculares mediante digestiones enzimáticas y se evaluó la concentración y vitalidad de las células, luego, las células testiculares fueron cultivadas in vitro (FP), criopreservadas mediante un protocolo termocontrolado lento, descongeladas y proliferadas (CP), o proliferadas y luego criopreservadas (PC). La evaluación de las células fue realizada mediante citometría de flujo con marcadores específicos para SSC (DBA-FITC) y Flow Cellect mitopotential Red Kit para la calidad celular (Potencial mitocondrial activo y apoptosis). El porcentaje de SSC en las muestras PC fue de 6.3% ± 1.2, el cual fue mayor que el porcentaje de SSC en las muestras CP, que fue de solo 1.5% ± 0.3 (p< 0.05). La calidad de las SSC fue mejor preservada en las PC, que mostró un 72.6% de células con potencial mitocondrial activo (PMA), 7.8 % de células apoptóticas (A) y 8.1% de células en apoptosis temprana (EA), mientras que en las CP el porcentaje de PMA fue de 59.7%, y valores de 21.3% de apoptosis y 11.5 de apoptosis temprana, que difieren significativamente de las PC y las FP. Se concluye que el cultivo de células testiculares de alpaca previo a la criopreservación permite conservar un mayor porcentaje (6,3%± 1.2) de SSC que la criopreservación sin cultivo previo (1.5% ± 0.3); asimismo conserva la calidad de las SSC a diferencia de las células criopreservadas sin cultivo. De esta forma, el presente trabajo constituye un primer reporte en el cual las técnicas de cultivo celular y criopreservación permiten el mantenimiento del porcentaje y la calidad de las SSC de alpaca.
Tesis

La línia germinal conté el passat i el futur d’una espècie, en la qual la informació genètica parental es recombina mitjançant la meiosi i és transmesa a la descendència. Així, entendre com el genoma s’organitza i es regula en l’espai nuclear durant la formació de cèl·lules germinals és essencial per comprendre les bases de la fertilitat i el seu impacte en la diversitat genètica. En cèl·lules somàtiques, el genoma s’organitza en territoris cromosòmics que estan formats per compartiments de cromatina plegats en dominis d’associació topològica (TADs) i bucles d’ADN. No obstant això, es coneix poc sobre l’organització de l’genoma en la línia germinal i com les reorganitzacions cromosòmiques poden modular-la. En aquest context, aquesta tesi té com a objectius: (i) entendre l’organització tridimensional de l’genoma durant l’espermatogènesi de ratolí i la seva relació amb la funció gènica i la localització de proteïnes aïllants (CTCF i cohesines), (ii) investigar les implicacions de les fusions Robertsonianes (Rb) en el plegament del genoma i la recombinació, i (iii) caracteritzar la variabilitat de PRDM9 en poblacions naturals de ratolins Rb, incloent el sistema Rb de Madeira i el de Barcelona (BRbS). Per això, hem combinat anàlisis citològics amb tecnologies de seqüenciació massiva i desenvolupat un protocol de citometria per obtenir poblacions cel·lulars germinals enriquides, incloent espermatogonis, espermatòcits primaris, espermàtides rodones i espermatozoides. Els nostres resultats revelen que l’estructura d’ordre superior del genoma és extremadament dinàmica durant l’espermatogènesi, on els espermatogonis presenten compartiments i TADs que desapareixen durant la meiosi i es restableixen posteriorment en cèl·lules post-meiòtiques. A més, hi ha una correlació entre la transcripció i els compartiments A, amb gens actius específics de tipus cel·lular relacionats amb la progressió de l’espermatogènesi, la fecundació i el desenvolupament embrionari. Addicionalment, hem trobat una correlació entre la localització de cohesines i transcripció activa tant en cèl·lules meiòtiques com post-meiòtiques, suggerint que les cohesines regulen la transcripció. Les fusions Rb reorganitzen la localització espacial dels cromosomes i en espermatòcits primaris, augmenten les interaccions heteròlogues, promovent nous entorns de regulació. En espermàtides rodones, les fusions afegeixen restriccions mecàniques que redueixen les interaccions inter-cromosòmiques. A més, les fusions Rb afecten tant a el nombre com a la distribució cromosòmica dels punts de recombinació, especialment en els metacéntrics fusionats en homozigosi, mentre que la presència de metacéntrics heterozigots asinapsats indueix una heterocromatinizació de la vesícula sexual. La reducció de la recombinació també es detecta en les anàlisis de desequilibri de lligament basats en SNPs, detectant alta divergència genètica en poblacions Rb comparades amb estàndard. Addicionalment, hem caracteritzat una gran variabilitat de PRDM9, sent especialment alta al sistema Rb insular de Madeira en comparació amb el sistema continental BRbS. Aquestes diferències es poden atribuir a la combinació de diferents factors: (i) la història evolutiva de cada sistema Rb, (ii) la prevalença de fusions Rb afectant la diversitat genètica, i en menor grau, (iii) restriccions funcionals meiòtiques (per exemple, asimetria en els hotspot de recombinació). En conjunt, aquesta tesi mostra que la cromatina pateix una remodelació profunda durant l’espermatogènesi específica de tipus cel·lular, en la qual l’activitat transcripcional es correlaciona amb l’estat de la cromatina i la localització de les cohesines. Addicionalment, les fusions Rb alteren l’organització del genoma en la línia germinal, afectant a la recombinació meiòtica i la diversitat genètica.
La línea germinal contiene el pasado y el futuro de una especie, en la que la información genética parental se recombina mediante la meiosis y es transmitida a la descendencia. Así, entender como el genoma se organiza y se regula en el espacio nuclear durante la formación de células germinales es esencial para comprender las bases de la fertilidad y su impacto en la diversidad genética. En células somáticas, el genoma se organiza en territorios cromosómicos que están formados por compartimentos de cromatina plegados en dominios de asociación topológica (TADs) y bucles de ADN. Sin embargo, se conoce poco acerca de la organización del genoma en la línea germinal y como las reorganizaciones cromosómicas pueden modularla. En este contexto, esta tesis tiene como objetivos: (i) entender la organización tridimensional del genoma durante la espermatogénesis de ratón y su relación con la función génica y la localización de proteínas aislantes (CTCF y cohesinas), (ii) investigar las implicaciones de las fusiones Robertsonianas (Rb) en el plegamiento del genoma y la recombinación, y (iii) caracterizar la variabilidad de PRDM9 en poblaciones naturales de ratones Rb, incluyendo el sistema Rb de Madeira y el de Barcelona (BRbS). Por ello, hemos combinado análisis citológicos con tecnologías de secuenciación masiva y desarrollado un protocolo de citometría para obtener poblaciones celulares germinales enriquecidas, incluyendo espermatogonias, espermatocitos primarios, espermátidas redondas y espermatozoides. Nuestros resultados revelan que la estructura de orden superior del genoma es extremadamente dinámica durante la espermatogénesis, donde las espermatogonias presentan compartimentos y TADs que desaparecen durante la meiosis y se reestablecen posteriormente en células post-meióticas. Además, hay una correlación entre la transcripción y los compartimentos A, con genes activos específicos de tipo celular relacionados con la progresión de la espermatogénesis, la fecundación y el desarrollo embrionario. Adicionalmente, hemos hallado una correlación entre la localización de cohesinas y transcripción activa tanto en células meióticas como post-meióticas, sugiriendo que las cohesinas regulan la transcripción. Las fusiones Rb reorganizan la localización espacial de los cromosomas y en espermatocitos primarios, aumentan las interacciones heterólogas, promoviendo nuevos entornos de regulación. En espermátidas redondas, las fusiones añaden restricciones mecánicas que reducen las interacciones inter-cromosómicas. Además, las fusiones Rb afectan tanto al número como a la distribución cromosómica de los puntos de recombinación, especialmente en los metacéntricos fusionados en homocigosis, mientras que la presencia de metacéntricos heterocigotos asinapsados induce una heterocromatinización de la vesícula sexual. La reducción de la recombinación también se detecta en los análisis de desequilibrio de ligamiento basados en SNPs, detectando alta divergencia genética en poblaciones Rb comparadas con estándar. Adicionalmente, hemos caracterizado una gran variabilidad de PRDM9, siendo especialmente alta en el sistema Rb insular de Madeira en comparación con el sistema continental BRbS. Tales diferencias se pueden atribuir a la combinación de distintos factores: (i) la historia evolutiva de cada sistema Rb, (ii) la prevalencia de fusiones Rb afectando a la diversidad genética, y en menor grado, (iii) restricciones funcionales meióticas (por ejemplo, asimetría en los hotspot de recombinación). En conjunto, esta tesis muestra que la cromatina sufre una remodelación profunda durante la espermatogénesis específica del tipo celular, en la que la actividad transcripcional se correlaciona con el estado de la cromatina y la localización de las cohesinas. Adicionalmente, las fusiones Rb alteran la organización del genoma en la línea germinal, afectando a la recombinación meiótica y a la diversidad genética.
The germline holds the past and the future of a species, as parental genetic information is recombined through meiosis and transmitted to the offspring. Thus, understanding how the genome is organized and regulated in the nuclear space during the formation of germ cells is essential to comprehend the bases of fertility and its impact on genetic diversity. In the last twenty years, many studies have shown that in somatic cells, the genome is organized in chromosome territories which are formed by chromatin compartments folded into topological associated domains (TADs) and DNA loops. However, little is known about how the genome is organized in the germline and how chromosomal reorganizations modulate genome architecture. In this context, this thesis aims to: (i) understand the three-dimensional organization of the genome during mouse spermatogenesis and its interplay with gene function and occupancy of insulator proteins (CTCF and cohesins), (ii) investigate the implications of Robertsonian (Rb) fusions in genome folding and meiotic recombination, and (iii) characterize the variability of PRDM9 in natural house mouse populations with Rb fusions: the Madeira Rb system and the Barcelona Rb system (BRbS). We combined cytological analysis with next generation sequencing technologies, and we developed an efficient cell sorting protocol to obtain enriched germ cell fractions including spermatogonia, primary spermatocytes at early and late prophase I, round spermatids and sperm. Our results revealed that the higher-order structure of the genome is extremely dynamic during spermatogenesis, where spermatogonia presents somatic-like compartments and TADs, that disappear during meiosis to be re-established later on in post-meiotic cells. Moreover, transcription correlates with A compartments throughout spermatogenesis, with cell-specific active genes involved in spermatogenesis progression, fertilization and embryonic development. In addition, we found a correlation between cohesin occupancy and active transcription in both meiotic and post-meiotic cells, suggesting a transcription-regulating role of meiotic cohesins. Although germ cells with Rb fusions presented the main features of genome architecture, Rb fusions reorganize the spatial chromosome occupancy. In primary spermatocytes, Rb fusions increase heterologous interactions, promoting the formation of novel regulatory environments. In round spermatids, Rb fusions reduce inter-chromosomal interactions as a result of mechanistic constrains. The cytological data shows that the increase in heterologous interactions is concomitant with the presence of asynapsed heterozygous metacentrics, which induce the full heterochromatinization of the sex body. Furthermore, Rb fusions affect the number and chromosomal distribution of crossovers in primary spermatocytes, especially in the case of fused metacentrics in homozygosis. The reduction in recombination was also observed in the analysis of linkage disequilibrium based on SNP genotyping, which translated into high levels of genetic divergence in Rb populations when compared to standard mice. In addition, our characterization of PRDM9 variability detected an unprecedented variability in natural house mouse populations, being especially high in the insular Madeira Rb system when compared to the continental BRbS. Such differences could be attributed to the combination of different factors: (i) the evolutionary history of each Rb system, (ii) the prevalence of Rb fusions affecting genetic diversity, and to a lesser extent (iii) meiotic functional constrains (i.e., recombination hotspot asymmetry). Taken together, this thesis shows that chromatin undergoes profound remodeling during spermatogenesis in a cell-specific way, where transcriptional activity correlates with the chromatin state and cohesin occupancy. In addition, Rb fusions alter genome organization in the germline, having an impact on meiotic recombination and genetic diversity.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
O imprinting genómico é um mecanismo epigenético, no qual os alelos parentais são expressos diferencialmente, resultando em expressão monoalélica dos genes imprinted. Uma das marcas de imprinting é a metilação do DNA em dinucleótidos CpG, que permite a transcrição ou repressão dos genes. Na linha germinal masculina, as marcas de imprinting herdadas são apagadas e são restabelecidas as marcas paternas. A infertilidade masculina é um problema que afecta muitos casais, podendo ter várias causas. A azoospermia secretora devido a paragem de maturação meiótica é caracterizada pela presença de células germinativas que não completam o desenvolvimento espermatogénico, parando no estadio de espermatócito primário. A paragem de maturação (PM) pode ser completa, sem produção de espermatozóides (PM pura), ou incompleta, com focos de espermatozóides visíveis em bíopsias testiculares (PM não pura). Com este trabalho pretendeu-se estudar, por tratamento com bissulfito de sódio, clonagem molecular e sequenciação de DNA, os perfis de metilação dos genes imprinted H19 e MEST, em pacientes com azoospermia secretora devido a PM meiótica, e comparar estes perfis em espermatócitos primários de PMs puras e não puras. Os resultados obtidos para os espermatócitos primários de PMs puras e PMs não puras sugerem que não existem diferenças entre os dois grupos em termos de metilação dos genes imprinted. No entanto, estes resultados revelam que as células espermatogénicas dos pacientes de ambos os grupos apresentam erros de imprinting tais como alguma desmetilação no gene H19, incluindo o local de ligação-6 da proteína CTCF, e alguma metilação do gene MEST, suportando uma associação entre espermatogénese anormal e ocorrência de erros de imprinting. ABSTRACT: Genomic imprinting is an epigenetic mechanism that leads to the differential expression of parental alleles, resulting in mono-allelic expression of imprinted genes. DNA methylation at CpG dinucleotides is an imprinting mark that allows the transcription or repression of the genes. In the male germ line the heritable imprinting marks are erased and re-established the paternal marks. Male infertility is a problem affecting many couples and may have different causes. Non obstructive azoospermia with meiotic maturation arrest is characterized by the presence of germ cells that do not complete the spermatogenic development, stopping at primary spermatocyte stage. The maturation arrest (MA) may be complete, with no spermatozoa produced (pure MA), or incomplete, with rare spermatozoa in the testis (non pure MA). We studied the methylation status of the imprinted genes H19 and MEST, by sodium bisulphite treatment, molecular cloning and DNA sequencing, in patients with meiotic MA. We also compared the methylation profiles obtained for primary spermatocytes of pure MA with those obtained for non pure MA. The results obtained for primary spermatocytes of pure MA and non pure MA suggests that these groups are not different in terms of methylation of the imprinted genes. However, these results reveal that the spermatogenic cells of the patients of both groups presents imprinting errors such as some demethylation for H19, including the CTCF-binding site 6, and some methylation for MEST, supporting the association between abnormal spermatogenesis and the occurrence of imprinting errors.

La present Tesi recull els estudis que hem realitzat en el període 1994-1998 sobre l'expressió en el gall (Gallus gallus) del gen de la proteïna aB-cristal·lina. En la Introducció hem fet un repàs a les principals característiques d'aquesta proteïna per explicar què ens va induir a estudiar-la amb detall, aturant-nos especialment en les dades que ens han servit per a bastir les nostres hipòtesis. Els Objectius descriuen quines eren les preguntes que vam decidir respondre amb el nostre treball, que es descriu detalladament en I'apartat de Resultats. La Discussió debat una mica el possible significat d'aquests resultats tenint present tot el que s'ha dit en apartats anteriors. La secció de Mètodes és un recull de tots els protocols experimentals usats per obtenir els citats resultats. Finalment, les Conclusions resumeixen les dades que hem considerat més importants del treball realitzat.

Las poliaminas regulan procesos de crecimiento y diferenciación celular, y su desregulación está relacionada con diferentes patologías incluyendo el cáncer. Las antizimas (AZs) de ornitina descarboxilasa (ODC) inhiben tanto su biosíntesis, como su captación, regulando los niveles intracelulares de poliaminas. En esta tesis se ha caracterizado una nueva proteína inhibidora de antizimas (AZIN2) que posee alta homología con ODC y el inhibidor de antizimas previamente conocido (AZIN1). Esta nueva proteína está desprovista de actividad enzimática, pero es capaz de revertir la acción que las tres antizimas conocidas ejercen sobre la actividad ODC y la captación de poliaminas. A diferencia de sus proteínas homólogas, AZIN2 se localiza subcelularmente en el ERGIC, y se expresa específicamente en cerebro y testículo, pero de forma muy abundante en espermátidas y espermatozoides, al igual que AZ3, indicando que estas dos proteínas juegan un importante papel regulando los niveles de poliaminas durante la espermiogénesis.
Polyamines regulate cell growth and differentiation, and the alteration of their homeostasis is related to different diseases, including cancer. Ornithine decarboxylase (ODC) antizymes (AZs) regulate polyamine levels by inhibiting both their biosynthesis and the cellular uptake. In this work, a new ODC paralogue has been characterized as a novel antizyme inhibitor protein that has been named AZIN2. This protein lacks decarboxylating activity, but it is able to reverse the action of any of the three antizymes on ODC activity and polyamine uptake. Unlike its homologue proteins ODC and AZIN1, AZIN2 is located in the ERGIC, and it is specifically expressed in brain and testes. The abundant expression in spermatids and spermatozoa, concomitantly with AZ3, suggests that both proteins may play an important role in regulating polyamine levels during spermiogenesis

Mestrado em Toxicologia e Ecotoxicologia
O cádmio é um contaminante industrial e ambiental que exerce efeitos indesejáveis sobre o sistema vascular de seres humanos e animais. Em resultado da sua acção, podem ocorrer alguns efeitos fisiopatológicos em órgãos-alvo específicos, tais como o testículo e rins. O objectivo do presente trabalho consistiu em estudar os efeitos do CdCl2 na espermatogénese de ratinhos, e em parâmetros de espermatozóides, após um ciclo espermatogénico. A animais machos, com 7 semanas de idade (34,5 g), foi administrada, por via subcutânea, uma injecção com 1,5; 1,65 e 1,75 mg/l de CdCl2, e aguardaram-se 35 dias. O grupo controlo foi injectado com NaCl 0,9%. Após este período, o testículo e epidídimo direito de cada animal foram fixados em solução de Bouin e preparados para observação histológica. Além disso, o diâmetro dos túbulos seminíferos foi avaliado usando modelos deformáveis (SNAKE). A partir da cauda do epidídimo esquerdo foram recolhidos espermatozóides e colocados em meio Tyrode (MT6), para analisar a motilidade, vitalidade, densidade e anomalias morfológicas. Os cortes histológicos dos testículos dos animais expostos ao CdCl2, evidenciaram lesões hemorrágicas ao nível do tecido intertubular. Além disso, observou-se uma redução do diâmetro dos túbulos seminíferos, quando comparados com os do grupo controlo. A motilidade dos espermatozóides sofreu uma redução significativa, e a progressividade diminuiu ca de 25% na dose máxima, face ao controlo. Houve uma diminuição significativa (ca 30%) na vitalidade de espermatozóides. No entanto, após 35 dias, a percentagem de espermatozóides com características normais foi de 66%, em média, em comparação com os respectivos controlos. Em conclusão, o presente estudo revelou que a exposição às diferentes doses de CdCl2 induziu profundas alterações histopatológicas ao nível do testículo e em alguns parâmetros de espermatozóides, mas possibilitou a regeneração desse órgão. ABSTRACT: Cadmium is an industrial and environmental contaminant that exerts undesirable effects on the vascular system in both humans and animals. As a result, some pathophysiologic effects occur in specific target organs, such as testis, and kidneys. The aim of the present work was to study the effects of CdCl2 on mice spermatogenesis, and sperm parameters, after one spermatogenic cycle. Groups of male animals, 7 weeks old (34,5 g), were subcutaneously administered with 1,5; 1,65 e 1,75 mg/l, and kept for 35 days. Controls were injected with NaCl 0,9%. After this period the right testis and epididymis from each animal were fixed in Bouin’s solution and routinely prepared for histological observation. In addition, the diameter of seminiferous tubules was evaluated using deformable models (SNAKE). Sperm were also collected from the left cauda epididymidis into a dish containing modified Tyrode´s medium (MT6) for motility, vitality, density and morphological abnormalities. The histological sections of testis from exposed animals to CdCl2 demonstrated hemorrhagic lesions within the intertubular tissue. In addition, a reduction in the seminiferous tubules diameter was observed, when compared with those from control group. The epididymal motility was significantly reduced, and progressively decreased to ca 25% in higher dose compared to control. There was a significant decline (ca 30%) in the vitality of sperm. However, following 35 days, the percentage of sperm with normal features was in average 66% when compared with respective controls. In conclusion, the present study revealed that exposure to different doses of CdCl2 induced several histopathological changes within testis, and some sperm parameters, but allow partial regeneration of the testis.

En esta tesis doctoral se estudia el efecto de una dieta de restricción calórica de mantenimiento a largo plazo (14 meses), en machos de lubina prepúberes, sobre el inicio y desarrollo de la pubertad. Para ello se consideró el papel que los sistemas kisspeptina/GnRH juegan en el cerebro y la gónada de esta especie en términos reproductivos. Nuestros resultados evidencian que tanto las neuronas que expresan kiss1 y kiss2 como sus receptores se encuentran localizadas en zonas hipofisiotrópicas que regulan procesos relacionados con la reproducción. En particular, las células kiss1 y kiss2 se distribuyen en zonas diferentes y específicas del cerebro, lo que sugiere que estas neuronas ejercen funciones distintas en la lubina. Se postula que kiss1 puede además estar involucrado en el control de los factores ambientales, como el fotoperiodo, ya que tiene una expresión notable en la habénula al igual que kiss1r. Sin embargo, el kiss2r tiene una distribución más amplia desde zonas del telencéfalo hasta el hipotálamo ventral. Asimismo hemos encontrado que neuronas kiss1 presentes en el hipotálamo expresan los receptores de estrógenos de tipo alfa y beta 2. Además, con los estudios de localización de las neuronas gnrh1, hemos descartado la interacción de fibras Gnrh1 en células que expresan kiss2r en el área preóptica. La detección de las proyecciones de fibras de neuronas Kiss sólo fue posible con el anticuerpo anti Kiss2 puesto que lamentablemente el anticuerpo anti Kiss1 no dio resultados. La distribución de fibras Kiss2 se localizan en regiones hipofisiotrópica, desde la región del subpallium y continúan en el área preóptica, neurohipófisis y finalmente en la región del receso lateral del tuber. Los resultados biométricos mostraron que los animales experimentales crecieron menos en peso y talla en comparación a los controles a lo largo de todo el experimento. Cabe mencionar que a pesar de ello, los animales experimentales fueron capaces de desarrollar sus gónadas y madurar. Por el contrario, el contenido de grasa mesentérica fue significativamente menor en los animales experimentales, lo que se relaciona con la restricción de alimento al que este grupo de animales estuvo sometido durante la experiencia. Los análisis hormonales del factor de crecimiento insulínico tipo I (Igf-i) y de leptina confirmaron un descenso en el grupo experimental, lo que se relacionó con la menor tasa de crecimiento en peso y talla en comparación al grupo control. Asimismo, se cree que los niveles bajos de Igf-i podían ser responsables de una tasa reducida de la proliferación celular y un aumento de la apoptosis de células espermatogoniales a nivel gonadal en los animales experimentales. Por otro lado, los niveles plasmáticos de leptina mostraron una relación directa entre el contenido de grasa perivisceral y la concentración sérica de esta hormona, como se ha descrito en mamíferos. Los resultados obtenidos demuestran además que los animales sometidos a restricción nutricional mostraron una regulación al alza de los niveles de expresión de kiss1, kiss2, kiss1r y kiss2r en el cerebro de la lubina, en comparación a los niveles detectados en los controles. Por otra parte, los niveles plasmáticos de Fsh fueron significativamente mayores en los animales experimentales, lo que podría sugerir un mecanismo de retroalimentación positiva en estos animales para llevar a cabo el proceso de espermatogénesis. Más aún, evaluando los niveles de fshr mRNA mediante qRT-PCR comprobamos que su expresión aumentaba considerablemente a nivel gonadal. Por el contrario, los niveles plasmáticos de Lh fueron mayores en los animales controles. En cuanto a los niveles plasmáticos de 11-KT y T, éstos fueron similares entre ambos grupos lo que explicaría el desarrollo gonadal de los animales experimentales y su capacidad de alcanzar la maduración sexual.
In the European sea bass, kiss1-expressing cells were consistently detected in the habenula and, in mature males and females, in the rostral mediobasal hypothalamus. In both sexes, kiss2-expressing cells were consistently detected at the level of the preoptic area, but the main kiss2 mRNA-positive population was observed in the dorsal hypothalamus, mainly above, but also below, the lateral recess of the third ventricle. Specific antibodies has been raised against the preprokiss2, but not the preoprokiss1. The data indicate that kiss2 neurons are mainly located in the hypophysiotropic regions. The expression of kiss1r messengers was more limited to the habenula, the ventral telencephalon and the proximal pars distalis of the pituitary. In the sea bass long-term exposure to maintenance diets alters the rhythm of reproductive and metabolic hormones, delays spermatogenesis and increases the incidence of apoptosis at earlier stages of gametogenesis. Thus, maintenance feed regimes in the experimental group over 14 months (EX) not only strongly decreased growth rates, the mesenteric fat index (MFI), muscle lipid content, and the hepatosomatic index (HIS), but also the gonadosomatic index (GSI), thus delaying testis progression and milt production in comparison to the control (CT). Igf-i plasma levels were high at periods during which spermatogonial proliferation was enhanced, suggesting that Igf-i plays a crucial role during mitotic proliferation. Leptin levels and MFI were reduced in the EX group and its suggested tha leptin might acts as a permissive signal that allows puberty to take place during the reproductive period in male sea bass. Finally, gene expression analysis in the brain of male sea bass exposed to restricted feed diets provided evidence of an overexpression of the kiss1, kiss2, kiss1r and kiss2r genes in the main hypophysiotropic regions of the brain throughout gametogenesis. Similarly, plasma Fsh levels of treated fish, showed an up regulation but specifically during the spermiation period. These results show that kisspeptin system and plasma Fsh levels are strongly modulated by the maintenance diets. Sea bass males were able to get into puberty and achieve spermiation under nutritional restriction, suggesting an adaptive strategy may exist for preserving reproductive function in this species.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
Apesar de décadas de investigação básica na espermatogénese humana, pouco se sabe acerca da proliferação e diferenciação das células germinais humanas em termos quantitativos. Com este trabalho pretendeu-se estudar quantitativamente os efeitos temporais e específicos de cada estadio celular, da Hormona Foliculo Estimulante (FSH) e da testosterona (T) na capacidade proliferativa do epitélio seminífero humano normal sob condições de cultura de órgão. Para tal, fragmentos de túbulos seminíferos humanos foram mantidos em cultura durante 28 dias, usando-se a incorporação da 5- bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) e a sua detecção por imunohistoquímica para aceder à proliferação celular. Os resultados quantitativos deste estudo mostraram uma perda gradual das células germinais meióticas e pós-meióticas ao longo do período de cultura, com uma boa manutenção da arquitectura geral dos túbulos e sem diminuição do número das células de Sertoli. Verificou-se que a taxa de proliferação das espermatogónias A dark era bastante baixa independentemente do suplemento hormonal. A proliferação das espermatogónias A, espermatogónias B e pré-leptótenos, foi máxima durante a primeira semana de cultura atingindo valores mais elevados quando induzida pelas hormonas (FSH e testosterona). Ao final da primeira semana houve diferenciação das espermatogónias e pré-leptótenos em espermatócitos em zigóteno e paquíteno e espermatócitos secundários, promovendo as hormonas uma aceleração da passagem de leptóteno para paquíteno em especial na concentração 50 U/L de FSH e 1μmol/L de testosterona. A FSH + T aumentou a sobrevida das células germinais, estimulou a proliferação das espermatogónias e a diferenciação das células germinais, durante a primeira semana de cultura. Com este estudo, foi possível quantificar pela primeira vez a proliferação e diferenciação das células germinais, utilizando uma metodologia bastante reprodutível e com resultados semelhantes aos in vivo. ABSTRACT: In spite of decades in study of human spermatogenesis almost anything is known about germinal cell proliferation and differentiation in quantitative ways. The aim of this project was to study quantitatively the temporal and stage specific effects of Follicle Stimulating Hormone and testosterone on the proliferative capacity of the normal human seminiferous epithelium under organ culture conditions. Seminiferous tubules fragments were kept in culture during 28 days, and 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) incorporation was used followe by immunohistochemistry detection to achieve cellular proliferation. Quantitative data of this study demonstrated a gradual loss of meiotic and pos-meiotic germinal cells during the culture period, no decrease on Sertoli cells number and a good maintenance of the seminiferous tubules general architecture. The rate of A dark spermatogonia proliferation was very low and was independently of hormonal supplement. Spermatogonia A, spermatogonia B and pre-leptotene spermatocytes proliferation was higher during the first week of culture, and reached its highest values in response to hormonal stimulation. At the end of the first week occurred differentiation of BrdU-labelled pre-leptotene spermatocytes into zygotene and pachytene spermatocytes and the presence of FSH and testosterone promoted an acceleration of leptotene spermatocyte into pachytene spermatocyte, especially when the 50 U/L of FSH and 1μmol/L of testosterone concentration were used. FSH + T increased germ cell survival, spermatogonial proliferation and germinal cell differentiation, during the first week of culture. In this study it was possible to quantify, for the first time germinal cell proliferation and differentiation, using a high reproducible methodology which gave results similar to in vivo conditions.

Mestrado em Biomedicina Molecular
A Doxorubicina (DOX) é um agente antineoplásico de grande eficácia utilizado no tratamento de vários tipos de tumores. No entanto, a sua utilização clínica é limitada devido à sua toxicidade em vários órgãos, com destaque para o coração. Outros órgãos afectados por este fármaco incluem fígado, cérebro, rins e testículos. Algumas estratégias farmacológicas e não farmacológicas têm sido desenvolvidas de forma a contrariar os seus efeitos secundários tóxicos, incluindo suplementação com antioxidantes e, mais recentemente, exercício físico. Assim, o objectivo do presente estudo é avaliar o efeito da actividade física na funcionalidade testicular, bem como no stress oxidativo e apoptose, sugeridos para a acção tóxica da DOX. Trinta e seis ratos macho Sprag-Dawley foram divididos em 6 grupos: salino sedentário (SAL+SED), sedentáros tratados com doses sub-crónicas de DOX – injecções de 2mg.Kg-1 durante sete semanas (DOX+SED), salinos treinados na passadeira durante 12 semanas (SAL+TM), treinados tratados com DOX (DOX+TM), salinos realizando exercício voluntário em roda livre (SAL+FW) e tratados realizando exercício voluntário em roda livre (DOX+FW). Vinte e quatro horas depois da última sessão de exercício, os animais foram sacrificados, os espermatozóides foram obtidos e tratados para estudos de contagem e de motilidade. Os testículos foram recolhidos para posterior análise de marcadores de stress oxidativo (actividade da aconitase, concentrações de substâncias reactivas de ácido tiobarbiturico, malondialdeido (MDA) e de grupos sulfidril (-SH) e sinalização apoptotica (actividades das caspases 3,8 e 9). O tratamento com DOX induziu uma diminuição significativa na contagem e motilidade dos espermatozóides, independentemente da actividade física. Apesar de existir uma tendência para um aumento de MDA e diminuição de –SH com o tratamento com DOX, não foi detectado qualquer efeito significativo nos marcadores de stress oxidativo e apoptose. Não foi observado qualquer efeito do exercício nestes parâmetros. Concluindo, o exercício físico não influenciou o impacto que a DOX teve na funcionalidade testicular. Surpreendentemente, nem a DOX nem o exercício modularam o ambiente redox e a sinalização apoptótica nos testículos, considerando os marcadores analisados.
The anthracycline Doxorubicin (DOX) is a widely used antineoplastic agent against several tumors with high efficacy. However, the clinical use of this drug is limited by its dose-related toxicity in several organs with particular emphasis on the heart. Other organs affected by DOX include liver, brain, kidney and testes. Several pharmacological and non-pharmacological strategies have been designed to antagonize the toxic side effects of DOX, including antioxidant supplementation and, recently, physical exercise. Therefore, the aim of the present study is to analyze the effect of physical exercise in testes function as well as oxidative damage and apoptosis, suggested mechanisms by which DOX exerts its toxic effects. Thirty-six Sprag Dawley male rats were randomly divided into 6 groups as follows: Saline Sedentary (SAL+SED), Sedentary sub-chronically treated with DOX – 2mg.Kg-1 injections for 7 weeks (DOX+SED), Saline endurance treadmill trained for 12 weeks (SAL+TM), trained receiving DOX (DOX+TM), saline voluntary exercised in a free-wheel (SAL+FW) and voluntary exercised receiving DOX (DOX+FW). Twenty-four hours after the last exercise bout, animals were sacrificed; sperm was obtained and treated for counting and motility studies. Testes were harvested for tissues analysis of markers of oxidative stress and damage (aconitase activity, thiobarbituric acid reactive substances, as MDA, and sulfhydryl –SH groups content) and apoptotic signaling (caspases 3,8 and 9 activities). DOX treatment induced significant decrease in sperm count and motility, irrespective of exercise training status. Despite a tendency for MDA increase and –SH decrease with DOX treatment, no significant effect was detected in either markers of oxidative damage or apoptosis. No exercise effect was observed as well. In summary, chronic physical exercise did not influence DOX-induced testes dysfunction. Surprisingly, neither DOX nor exercise modulated testes redox environment and apoptotic signaling, at least seen by the measured markers.

Doutoramento em Biologia
A infertilidade é um problema actual que afecta cerca de 8 a 12% dos casais em idade fértil, sendo 50% dos casos atribuídos ao factor masculino. A exposição ocupacional e/ou ambiental a metais pesados representa uma das suas principais causas. O chumbo, o cádmio e o crómio são metais com elevada utilização industrial e muito persistentes no ambiente, sendo motivo de grande preocupação devido aos seus efeitos na saúde reprodutiva dos trabalhadores e da população em geral. Neste trabalho estudaram-se os efeitos do cloreto de chumbo (PbCl2), cloreto de cádmio (CdCl2) e cromato de potássio (K2CrO4) na fertilidade, usando como modelo ratinhos machos ICR-CD1. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com 74 e 100 mg de PbCl2/kg pc ou com 5 e 10 mg de K2CrO4/kg pc, respectivamente, durante 4 dias consecutivos ou com 1, 2 e 3 mg de CdCl2/kg pc numa única injecção. Nos ensaios com PbCl2 e K2CrO4 os animais foram sacrificados 5 e 35 dias após o início da exposição, enquanto que nos ensaios com CdCl2 os animais foram sacrificados após 24 horas e 35 dias. O cloreto de chumbo não alterou a histologia do testículo nem do epidídimo, mas induziu um aumento da percentagem de células em fase S no testículo. O cloreto de chumbo alterou também alguns parâmetros dos espermatozóides, tais como a motilidade, morfologia e integridade do acrossoma. Contudo, não foram observados efeitos na integridade do DNA ou na estrutura da cromatina. O cloreto de cádmio induziu lesões severas e não reversíveis nos testículos que, após 35 dias, reverteram em necrose testicular. O cloreto de cádmio alterou ainda as subpopulações de células testiculares após 24 horas e induziu IMS no testículo após 35 dias. Em consequência das lesões no testículo, a densidade espermática foi severamente afectada após 35 dias. A exposição ao cloreto de cádmio afectou também a morfologia, a motilidade e a integridade acrossómica nos espermatozóides. O cloreto de cádmio induziu ainda fragmentação do DNA nestas células após 35 dias. O cromato de potássio alterou a morfologia dos espermatozóides e a integridade do acrossoma, sobretudo nos animais sacrificados após 35 dias. Verificou-se ainda uma redução da motilidade dos espermatozóides. Não foram detectados efeitos genotóxicos nos espermatozóides, devido à acção do K2CrO4 nas doses testadas. Dos parâmetros avaliados neste trabalho, destacam-se duas novas abordagens, nomeadamente o programa informático Snakes e a análise do conteúdo em DNA de células de testículo, a partir de material incluído em parafina. O Snakes permitiu fazer medições rigorosas do diâmetro dos tubos seminíferos, enquanto que a fixação de amostras de testículo de ratinhos em formol tamponado e inclusão em parafina resultou numa boa preservação do DNA, possibilitando assim a quantificação das subpopulações de células testiculares por citometria de fluxo. Os resultados obtidos para os diferentes parâmetros testados indicam que a motilidade dos espermatozóides e a integridade do acrossoma sejam parâmetros sensíveis à toxicidade de metais. O acrossoma aparenta ser um dos principais alvos da toxicidade dos metais e cuja reacção acrossómica prematura pode reduzir a capacidade do espermatozóide para fertilizar o oócito. Assim, este trabalho representa uma contribuição para uma melhor compreensão dos efeitos do chumbo, cádmio e crómio na fertilidade masculina.
Infertility is a nowadays major concern that affects about 8 to 12% of the couples and the male factor contributes for about 50% of the cases. Occupational and/or environmental exposure to heavy metals represents one of the major causes of male infertility. Lead, cadmium and chromium are heavy metals widely used in industry and quite persistent in the environment, raising major concerns over the possible effects on the reproductive health of workers and the general population. In the present work, the effects on fertility of lead chloride (PbCl2), cadmium chloride (CdCl2) and potassium chromate (K2CrO4) were studied using male ICR-CD1 mice as a model. Mice were subcutaneously injected with 74 and 100 mg PbCl2/kg bw or 5 and 10 mg K2CrO4 for four consecutive days, or 1, 2 and 3 mg CdCl2 in a single injection. In PbCl2 and K2CrO4 assays, animals were sacrificed 5 and 35 days after the beginning of the experiment, while in CdCl2 assays the animals were sacrificed after 24 hours and 35 days. Lead chloride did not induce histological changes on testis or epididymis, but induced an increase in the percentage of cells on S phase in the testis. Lead chloride also changed sperm parameters such as motility, morphology and acrosome integrity. However, no effects on sperm DNA integrity or chromatin structure were observed. Cadmium chloride induced severe and irreversible lesions on mice testis, which resulted on testicular necrosis after 35 days. Cadmium chloride also changed testicular cell subpopulations after 24 hours and induced microsatellite instability on testis after 35 days. As a consequence of testicular lesions, sperm density was severely affected after 35 days. Cadmium chloride exposure also changed sperm morphology, motility and acrosome integrity. Moreover, this compound also induced sperm DNA fragmentation 35 days after exposure. Potassium chromate changed sperm morphology and acrosome integrity more pronounced on mice sacrificed after 35 days. A decrease on sperm motility was also observed. However, no genotoxic effects were detected on sperm after K2CrO4 exposure. Amongst the array of assays performed in this work, two new approaches were developed and can be highlighted, namely the Snakes software and analysis of DNA content from paraffin embedded testicular samples. Snakes allowed accurate measurements of diameter of seminiferous tubules, while buffered formalin fixation and paraffin embedding of mice testicular samples allowed good DNA preservation, enabling the quantification of testis cells subpopulations by flow cytometry. Taken together the results obtained with the different parameters tested indicate that sperm motility and acrosome integrity are sensitive to metal toxicity. The acrosome appears as a main target to metal toxicity, and its premature reaction may reduce the ability of sperm to fertilize the oocyte. Thus, this work contributes to a better understanding of lead, cadmium and chromium effects on male fertility.

Mestrado em Ensino de Geologia e Biologia
Sabe-se que na espermatogénese humana a apoptose é um mecanismo muito importante na regulação do equilíbrio entre as células de suporte (células de Sertoli) e as células germinativas ao longo do desenvolvimento, existindo também vários trabalhos que indicam um aumento das taxas de apoptose em situações de patologia testicular, como a privação hormonal, a rádioquimioterapia, as lesões obstrutivas (infecções, ausência congénita de canais excretores) e as lesões primárias do epitélio germinal (azoospermia secretora). Destes estudos, porém, nenhum utilizou métodos matematicamente correctos, pelo que os valores são muitas vezes contraditórios. Para resolver essa situação avaliamos por métodos estereológicos a presença de caspase-3 activa em biópsias testiculares de pacientes com espermatogénese conservada (controlos) e com azoospermia obstrutiva (casos). Os resultados demonstram que não existe um aumento global das taxas de apoptose na azoospermia obstrutiva. Na análise por tipo celular, os dados revelaram que na azoospermia obstrutiva as células de Sertoli e as células germinais diplóides são mais atingidas. Especificamente, as células de Sertoli apresentaram taxas superiores de apoptose do que qualquer tipo de célula germinativa, seguidas das espermatogónias, dos espermatócitos primários e dos espermatídeos redondos. Em conclusão, comparamos pela primeira vez, de modo quantitativo rigoroso por métodos estereológicos, as taxas de apoptose no epitélio germinal humano masculino na situação de azoospermia obstrutiva. Em relação aos controlos, os pacientes com azoospermia obstrutiva apresentam um maior atingimento das células germinais diplóides, sobretudo à custa dos espermatócitos primários. ABSTRACT: It is known that apoptosis in human spermatogenesis is a very important mechanism for the regulation of the balance between the support cells (Sertoli cells) and germ cells throughout development. It is quoted in numerous articles that there is a rise in the rates of apoptosis in the presence of testicular pathology, as observed in hormonal deprivation, radio-chemotherapy, obstructive lesions (infections, congenital absence of excretory channels) and primary injuries of the germinal cell layer (secretory azoospermia). However, the reported studies have not used accurate mathematical methods, and so the results are many times contradictory. To solve this situation we used stereological methods to ascertain for the presence of active caspase-3 in testicular biopsies of patients with conserved spermatogenesis (controls) and obstructive azoospermia (cases). Data shows that overall apoptosis in obstructive azoospermia is not increased. Per cell type analysis results indicate that in obstructive azoospermia both Sertoli and diploid germ Cells are by fare more involved. Specifically, Sertoli cells show a higher degree of apoptosis than any other germ cell type, followed by spermatogonia, primary spermatocytes and round spermatids. In conclusion, we compared for the first time, with precise quantitative stereological methods the apoptosis rate in the human male germ cell layer with obstructive azoospermia. When compared to controls, cases with obstructive azoospermia show higher rates of diploid germ cell injury, essentially due to involvement of primary spermatocytes.

O efeito do fumo do tabaco representa um dos maiores desafios mundiais de saúde, devido à sua alta prevalência a nível mundial e à elevada morbilidade e mortalidade resultantes das suas inúmeras complicações. Uma vez que o número de fumadores está a aumentar em todo o mundo, é importante compreender completamente o impacto na reprodução humana e os riscos associados ao fumo do cigarro. O objectivo desta dissertação de mestrado é realizar uma revisão bibliográfica sistemática sobre o impacto do fumo do cigarro na espermatogénese e, consequentemente, na fertilidade masculina, bem como procurar elucidar os mecanismos patofisiológicos que contribuem para este problema. Vários estudos demonstraram que o fumo do tabaco afecta negativamente a espermatogénese, comprometendo assim a fertilidade masculina. Provoca significativas alterações cromossómicas e no ADN dos espermatozóides, sendo a aneuploidia a alteração mais prevalente. É responsável por provocar também alterações no volume e densidade do esperma, bem como na morfologia e mobilidade dos espermatozóides. O fumo do tabaco é ainda capaz de provocar alterações nos níveis e secreções hormonais, alterando também, consequentemente, a espermatogénese. Pode ainda ser responsável pela alteração da normal constituição do fluido seminal. Com base nas publicações existentes é possível concluir que o fumo do cigarro afecta negativamente a qualidade do esperma, por interferência a vários níveis na espermatogénese, acarretando, por isso, consequências nefastas para a fertilidade masculina. Embora estudos em modelos animais tenham demonstrado que o fumo do cigarro é responsável por alterações na espermatogénese e, consequentemente, na fertilidade, estão ainda por elucidar alguns mecanismos patofisiológicos que conduzem a estas alterações. Deste modo torna‐se necessário realizar estudos que visem detalhar as alterações celulares e moleculares na relação tabaco/fertilidade.
The effect of smoking is a major global health challenge, due to its high prevalence worldwide and to the high morbidity and mortality resulting from its many complications. Since the number of smokers is increasing worldwide, it is important to fully understand the impact on human reproduction as well as the smoking associated risks. The objective of this dissertation is to perform a systematic literature review on the impact of smoking on spermatogenesis and, therefore, in male fertility. We also seek to elucidate the pathophysiological mechanisms contributing to this problem. Several studies have shown that tobacco smoke adversely affects spermatogenesis and, consequently, compromises male fertility. It causes significant changes in sperm DNA and chromosomes, being aneuploidy the most prevalent of all. Smoking is also responsible for changes in semen volume and density, as well as in sperm morphology and mobility. Tobacco smoke is also able to cause changes in secretion and hormone levels, consequently affecting spermatogenesis. It may also be responsible for altering the normal formation of seminal fluid. Based on available publications, it can be concluded that smoking adversely affects sperm quality, once it interferes at various levels in spermatogenesis, thus causing adverse effects on male fertility. Although studies in animal models have shown that smoking is responsible for changes in spermatogenesis and, therefore, in fertility, the pathophysiologic mechanisms leading to these changes remain to be elucidated. Thus, it is necessary to conduct studies aimed at detailing the molecular and cellular changes in the relationship tobacco/fertility.

In the last decades estrogens have been regarded as “male hormones” playing an important role controlling male reproductive function. However, the effect of estrogens regulating testicular function and the spermatogenic process it is not fully addressed. Estrogenic actions in target tissues, including testis, are mediated by hormone interaction with the classical estrogens receptors (ER and ER) and also via the membrane G-protein coupled receptor (GPR30/GPER). Ultimately, the estrogens alter the gene expression network in cells and tissues modulating its functioning. Male fertility relies on a successful spermatogenesis, which is dependent from the support of Sertoli cells (SCs), the somatic cells within seminiferous tubules (SeT). Apoptosis is a key event strictly maintaining the appropriate ratio between germ cells and SCs and, thus, it is crucial to maintain the spermatogenic output. It has been suggested that SCs play a crucial role controlling germ cells fate, by secretion of survival and death factors, which act on receptors in germ cells. These include the survival factor desert hedgehog (Dhh), the stem cell factor (SCF) and its receptor the c-kit, as well as the death factors Fas-Ligand (FasL) and Fas-receptor (FasR). It has been shown that estrogens regulate Dhh, SCF, c-kit, FasL and FasR expression in several other tissues. Therefore, we hypothesize that estrogens may influence germ cell survival or death in testicular cells by governing the expression of SCF, c-kit, FasL, FasR. In the present work rat SeT and SCs were cultured in presence or absence of 100nM of 17β-estradiol (E2), and the expression of the aforementioned factors was studied through real-time PCR and Western blot techniques. In addition, in order to start elucidating the molecular mechanisms by which the estrogenic effects are attained, SCs were cultured with E2 0,1nM and with 100nM of each ER specific agonist: G1, DPN and PPT, respectively, agonists for GPER, ERand ER. E2 down-regulated the c-kit expression while increasing expression of its ligand, SCF, both in SeT and SCs. The expression of Fas system, FasR and FasL was also increased in response to E2. No differences were found in Dhh expression between experimental groups. The expression of SCF and FasL in SCs was strongly increased by G1 stimulation indicating the involvement of GPRER. Our results demonstrated that the estrogenic stimulation may modulate germ cell apoptosis in a direct way or through altering germ cell:SCs communication, which could have a profound impact in male fertility, particularly in cases of hyperestrogenism.
Nas últimas décadas os estrogénios têm sido considerados hormonas masculinas, desempenhando um papel importante no controlo das funções reprodutivas masculinas. Contudo, o efeito dos estrogénios na regulação das funções testiculares ainda não está completamente abordado. As ações estrogénicas nos tecidos alvo, entre eles o testículo, são mediadas por interações hormonais com os recetores de estrogénios (ER e ER) clássicos e também através do recetor membranar associado à proteína-G (GPR30/GPER). Por fim, os estrogénios alteram a rede de expressão dos genes nas células e nos tecidos, modulando o seu funcionamento. A fertilidade masculina assenta numa espermatogénese bem sucedida, a qual é dependente do suporte das células de Sertoli (SCs), as células somáticas presentes nos túbulos seminíferos (SeT). A apoptose é o evento chave que mantem o ratio apropriado entre as células germinativas e as SCs e desta forma é crucial para manter a qualidade e quantidade do processo espermatogénico. Tem sido sugerido que as SCs desempenham um papel crucial no controlo do destino das células germinativas através da secreção de fatores de sobrevivência/morte, que atuam nos recetores nas células germinativas. Esses incluem o fator de sobrevivência Desert Hedgehog (Dhh), o Stem Cell Factor (SCF) e o seu receptor (c-kit), assim como os fatores de morte Fas Ligando (FasL) e o seu recetor (FasR). Tem sido demonstrado que os estrogénios regulam a expressão do Dhh, SCF, c-kit, FasL e FasR em diversos tecidos. Portanto colocou-se a hipótese de que os estrogénios podem influenciar a sobrevivência ou morte das células testiculares através do controlo da expressão dos referidos genes. Neste trabalho, SeT e SCs de rato foram colocados em cultura na presença ou ausência de 100nM de 17β-estradiol (E2), e a expressão dos fatores acima-citados foi estuda através das técnicas de Real-Time PCR e Western Blot. Além disso, para elucidar qual o mecanismo molecular pelo qual o efeito dos estrogénios é conseguido, SCs foram colocadas em cultura na presença de 100 nM E2 ou 100nM de agonistas específicos para cada um dos recetores: G1, DPN e PPT, respetivamente, agonistas para o GPER, ERα e ERβ. O E2 diminuiu a expressão do c-kit enquanto por sua vez expressão do seu ligando SCF aumentou. Não houve diferenças na expressão do Dhh entre os diferentes grupos experimentais. A expressão do SCF e do FasL nas SCs foi muito aumentada pela estimulação com G1 indicando o envolvimento do GPER. Os nossos resultados demonstram que a estimulação com estrogénios pode moldar a apoptose das células germinativas tanto de uma forma directa como através da alteração da comunicação entre as SCs e as células germinativas, podendo isto ter um profundo impacto na fertilidade masculina em especial nos casos de hiperesteroidismo.

Spermatogenesis, the process of male gamete (i.e. spermatozoa) production, requires tight hormonal regulation in order to proceed successfully. The importance of androgens (like testosterone and 5α-dihydrotestosterone) to the regulation of spermatogenesis is well recognized. However, more recently, the importance of estrogens (like 17β-estradiol), has also been demonstrated. These sexual steroids act through ligand-activated transcription factors, estrogen receptors α and β (ERα and ERβ) and androgen receptor (AR), respectively. Most actions of these hormones are achieved through the regulation of target genes. The two ERs have different and sometimes opposing effects on the regulation of target genes, and estrogenic action will ultimately depend on interplay between them, when co-expressed in the same cell. The expression of ERα and ERβ in human testis has been strongly debated and a definite answer to whether only ERβ or both ERs are expressed is pivotal to understanding the estrogenic actions in human spermatogenesis. Several splice variants for ERα and ERβ have been described in testis, playing important roles in the regulation of their prototype receptors. In contrast, only one AR variant has been described so far in human testis, although the existence of more variants responsible for regulatory and non-classical actions is highly expected. The definition of the estrogen and androgen regulated transcriptome is of pivotal importance to understand the precise roles of sexual steroid hormones in testis. The main objectives of this thesis were to clarify the expression of ERα and ERβ in human testis, search for alternatively spliced AR variants, and to identify and characterize novel estrogen and androgen regulated genes with a potential importance in the control of spermatogenesis. The results presented herein demonstrate unequivocally that both ERα and ERβ are expressed in human testis, and clarify their cellular distribution. The existence of alternatively spliced testicular AR variants was confirmed with detection of four new AR forms in human testis, two of them conserved along the vertebrate evolutive line indicating a relevant functional importance. Conserning the sex steroid regulated transcriptome, two novel genes were identified, one regulated by estrogens and the other by androgens. Apoptosis inhibitor and modulator of DNA-damage response Aven was identified as a novel estrogen target gene in testis. Its expression was for the first time characterized in human and rat testis, as well as its cellular distribution to Sertoli and germ cells. Perhaps more importantly, it was shown that the expression levels of Aven in human testis are positively correlated with quality of spermatogenesis. Concerning androgen regulated gene, the expression of Regucalcin (RGN) in response to 5α-dihydrotestosterone was characterized, and RGN shown to be expressed by all cells in rat and human testis. Regucalcin is involved in the control of intracellular calcium concentration and regulation of cell proliferation and apoptosis, processes whose regulation is of pivotal importance in the control of spermatogenesis. Estrogens and androgens are well recognized as germ cell survival factors and are known to regulate control mechanisms for testicular apoptosis. Therefore, we believe that both Aven and RGN are involved in mechanisms of germ cell survival, which are controlled by androgens and estrogens. In conclusion, this thesis has contributed to increase the knowledge about estrogenic and androgenic action in testis. The “new actors cast” to the drama that is the hormonal control of spermatogenesis open new storylines in the research of mammalian spermatogenesis and perheaps male fertility.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Industrial e Ambiental
Cilia/flagella are microtubule (MT)-based oraganelle emanating from the surface of many eukaryotic cells. They are involved in a variety of processes including cell motility, fluid flow, and sensing processes. The skeleton of cilium, called axoneme, is templated from the basal body, a modified mature centriole required for centrosome formation. Mutations in human genes disrupting the function or structure of these organelles cause several human disorders, including infertility, ciliopathies, and cancer. In Drosophila melanogaster, cilia are present in the neurons and in the sperm. Defects in these structures and/or in its functions lead to clear phenotypes, such as delayed development, uncoordination and sterility. CEP164, a centrosomal protein, localizes at the distal appendages of the mature centriole. Mutations in CEP164 gene, in humans, cause Nephronophthisis, a ciliopathy that causes organ degeneration. The aim of this work consists of studying the CEP164 role in ciliogenesis and cilia function in sensory neurons and sperm in D. melanogaster. For that, we used two strategies: one involving knock down of CEP164 in neurons and sperm using the Gal4/UAS system, and other the generation of new excition alleles of CEP164 to study the effect of CEP164 in the fruit fly. In D. melanogaster olfactory neurons, CEP164 localizes at the connceting cilia, a transition zone equivalent structure. We observed by RNAi knock down that CEP164 is important for adult fly proper coordination. The cilia structures were affected in those flies, however, the fertility of those males was not affected.
Os cílios/flagelos são organelos constituídos por microtúbulos que emanam da superfície da maioria das células eucariotas. Estes estão envolvidos numa variedade de processos incluindo motilidade celular, movimento de fluidos e mecanismos de perceção de estímulos externos. O esqueleto de um cílio, designado axonema, é determinado por um corpo basal, que consiste num centríolo maduro/mãe modificado necessário para a formação de centrossomas. Mutações em genes humanos que interfiram na função ou estrutura desses organelos causam doenças como infertilidade, ciliopatias e cancro. Em Drosophila melanogaster, os cílios estão presentes nos neurónios e no esperma. Defeitos nestas estruturas e/ou na sua função leva a fenótipos como desenvolvimento tardio, falta de coordenação e esterilidade. A CEP164, uma proteína centrossomal, localiza-se nos apêndices distais do centríolo maduro. Mutações no gene CEP164, em humanos, causam nefronoptise, uma ciliopatia que causa a degeneração dos órgãos. O objectivo deste trabalho consiste no estudo da função da proteína CEP164 na ciliogenese e no papel dos cílios nos neurónios sensoriais e no esperma em D. melanogaster. Para tal, foram utilizadas duas estratégias: uma que envolve a depleção da proteína CEP164 em neurónios e no esperma utilizando o sistema Gal4/UAS, e a outra consistiu na criação de novos alelos de excisão de CEP164 para estudar o efeito desta proteína na mosca da fruta. Nos neurónios olfativos de D. melanogaster, a CEP164 localiza-se na base dos cílios, numa estrutura equivalente á zona de transição dos axonemas. Observou-se através de depleção por RNAi que a CEP164 é importante para a coordenação apropriada na mosca. A estrutura dos cílios foi afectada nessas moscas, contudo a fertilidade dos machos não foi afectada.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
Genistein is one of the most abundant phytoestrogens in soybeans. Because of its chemical similarity to endogenous estrogens, genistein can bind to estrogen receptors (ERs) present in cells and mediate an estrogenic response. Its estrogenic action may potentially interfere with normal functioning of various systems in the human organism, including the reproductive system which is highly regulated by sex hormones. The increasing interest in using genistein for treatment and prevention of diseases such as cancer, osteoporosis, cardiovascular diseases, relief of menopause symptoms, among others. As well as the increasing consumption of soy in Western populations as a substitute for animal protein and its use to produce food for infants are worrisome factors because the effects of phytoestrogens on the human organism are still a matter of intense debate. Animal studies are contradictory and human studies are scarce. The aim of the present study was to evaluate genistein safety on human Sertoli cells (hSCs) in vitro. These cells are pivotal for successful espermatogenesis since they provide nutritional and physical support to sperm germ cells. Biopsies from six patients, with conserved espermatogenesis, were chosen at an infertility clinic and primary cultures of human Sertoli cells were cultured and maintained until reaching confluence. Then they were treated with different genistein concentrations during 24h. Different citotoxicity test were perfomed. No disturbances were found in hSCs treated with genistein. Therefore, we conclude that this compound is not cytotoxic to these cells. Subsequently, the analysis of one of the most relevant metabolic pathways, glycolysis, in these cells was made, which originates pyruvate, that in turn, later, is used for the production of lactate. This substrate is an important energy source for germ cells. However, the absorption and excretion of different metabolites of this pathway, in addition to the enzymatic activity of lactate dehydrogenase, did not show significant variations after exposure of hSCs to genistein. Also genistein influence on oxidative stress rates in hSCs was evaluated, since reactive oxigene species (ROS) production is common during cell metabolism and if not eliminated efficiently it can cause irreversible damage on different cell structures and may even lead to cell death. The results of this study demonstrate that genistein did not influence oxidative stress rates. Alltoghether, we can conclude that no harmfull effects, on the parameters analyzed, were caused by genistein on hSCs. Altough it does not mean that genistein, and other phytoestrogens, are safe for the remaining of the reproductive system more studies regarding this subject are needed for a better understanding of their mechanisms of action.
A genisteína é um dos fitoestrogénios mais abundantes na soja. Devido à sua similaridade química com os estrogénios endógenos, a genisteína pode se ligar aos receptores de estrogénio (ERs) presente nas células e desencadear uma resposta estrogénica. A sua ação estrogénica pode potencialmente interferir com o funcionamento normal de vários sistemas no organismo humano, incluindo o sistema reprodutivo que é altamente regulado pelas hormonas sexuais. Tem-se verificado um crescente interesse em usar genisteína para tratamento e prevenção de doenças como o cancro, osteoporose, doenças cardiovasculares, alívio dos sintomas de menopausa, entre outros. Há ainda um o aumento do consumo de soja em populações ocidentais, como substituto da proteína animal e é usado para produzir alimentos para bebés sendo fatores preocupantes porque os efeitos dos fitoestrogénios no organismo humano ainda estão sob discussão. Por outro lado, estudos animais são contraditórios e estudos humanos são escassos. No presente estudo avaliou-se a ação da genisteína em células de Sertoli humanas (hSCs). Essas células são fundamentais para uma espermatogênese correta, uma vez que proporcionam suporte físico e nutricional às células germinativas. Biópsias de seis pacientes com espermatogênese conservada, foram recolhidas numa clínica de tratamento de fertilidade e culturas primárias de células de Sertoli humanas foram semeadas e mantidas até atingirem confluência. Atingida essa condição, as células foram tratadas com meios contendo diferentes concentrações de genisteína, durante 24h. Foram realizados diversos testes de citotoxicidade. Não foram detectadas alterações nas hSCs tratadas com genisteína. Conclui-se então que este composto não é tóxico para estas células. Posteriormente, efetuou-se a análise de uma das vias metabólicas mais relevantes nestas células, a glicólise, que origina piruvato que posteriormente é utilizado para a produção de lactato. Esse substrato é uma importante fonte energética para células germinativas. No entanto, a absorção e excreção de diferentes metabolitos desta via, além da atividade enzimática da lactato desidrogenase, não mostraram variações significativas após a exposição das hSCs a genisteína. Também se avaliou a influência da genisteína nas taxas de stress oxidativo em hSCs, uma vez que a produção de espécies reactivas de oxigénio é comum durante o metabolismo celular e, quando não são eficientemente eliminadas, podem causar danos irreversíveis em diferentes estruturas celulares podendo até levar à morte celular. Os resultados do presente estudo demonstram que a genisteína não influenciou as taxas de stress oxidativo. Em suma, conclui-se que não foram identificados efeitos nocivos por parte da genisteína sobre os parametros analisados nas hSCs. No entanto, isso não significa que a genisteína, e outros fitoestrogénios, sejam seguros para o resto do sistema reprodutivo. Por esta razão deverão ser efetuados vários estudos no futuro para o esclarecimento mais amplo da sua ação.

Doutoramento em Biologia
NIPP1, for nuclear inhibitor of protein phosphatase 1 (PP1), is a multifunctional scaffold protein that regulates cell signaling, pre-mRNA splicing and transcription by targeting PP1 to specific nuclear substrates. The global deletion of NIPP1 in mice is embryonic lethal at the onset of gastrulation, precluding its functional analysis in adult tissues. This prompted us to generate a tamoxifen-inducible NIPP1 knockout (iKO) mouse model. Unexpectedly, the deletion of NIPP1 was not efficient in the examined organs except for testis. The loss of NIPP1 caused an age-dependent progressive loss of testicular germ cells, culminating in a Sertoli cells-only phenotype. iKO testis showed a decreased proliferation of (un)differentiated spermatogonia and an increased level of apoptosis. Likewise, neonatal iKO testis exhibited an almost complete loss of gonocyte-derived (un)differentiated spermatogonia during the first wave of spermatogenesis. In addition, GFRA1+ progenitor cells isolated from induced iKO testis displayed a reduced proliferation potential. These data suggest that NIPP1 is required for the maintenance of undifferentiated spermatogonia. We also found that the observed phenotype was associated with the deregulation of genes that are implicated in the control of cell proliferation and survival. At the molecular level, the deletion of NIPP1 was associated with the loss of core components of the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2), which affects gene expression through trimethylation of histone H3 at Lys 27. The loss of PRC2 components could be explained by the hyperphosphorylation and degradation of EZH2, the catalytic subunit of the PRC2 complex, resulting in the destabilization of other PRC2 core components. The testis phenotype of the iKOs could be phenocopied by the chemical inhibition of EZH1/2 in organotypic testis cultures. Overall, our study uncovers a key function for PP1-NIPP1 in the regulation of EZH2 phosphorylation and stability, which is essential for the maintenance of germ cells.
NIPP1, inhibidor nuclear da protein phosphatase 1 (PP1), é uma proteina multifuncional que regula a sinalização celular, splicing do pre-mRNA e transcrição mediante o direcionamento da PP1 para substratos nucleares específicos. A deleção global da NIPP1 é letal durante o desenvolvimento embrionário no início da gastrulação, impedindo assim a sua análise funcional em tecidos de adultos. Este facto incitou-nos a gerar um modelo de ratinho knockout induzível (iKO) para a NIPP1. Inesperadamente, a remoção da NIPP1 não foi eficiente na maioria dos órgãos analisados, com exceção do testículo. A deleção da NIPP1 causou uma perda progressiva de células germinativas do testículo dependente da idade, culminando num fenótipo denominado Sertoli cells-only phenotype. O testículo adulto nos ratinhos iKO apresentaram uma diminuição na proliferação das espermatogónias (in)diferenciadas e aumento dos níveis de apoptose. De modo análogo, o testículo dos neonatos exibiu uma perda quase completa das espermatogónias (in)diferenciadas derivadas de gonócitos, durante o primeiro ciclo de espermatogénese. Adicionalmente, culturas celulares enriquecidas em células progenitoras GFRA1+ isoladas do testículo dos ratinhos iKO apresentaram uma diminuição do seu potencial proliferativo. Estes resultados sugerem que a NIPP1 é necessária para a manutenção das espermatogónias indiferenciadas. Demonstrámos também que fenótipo observado está associado à desregulação de genes implicados no controlo da proliferação e viabilidade celular. No que concerne o mecanismo molecular, a deleção da NIPP1 resultou na perda dos componentes centrais do complexo PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2), o que afetou a expressão genética através da trimetilação da histone H3 no resíduo Lys27 (H3K27me3). A perda dos componentes integrantes do complexo PRC2 foi explanada pela hiperfosforilação e degradação da proteína EZH2, o componente catalítico central do complexo PRC2, resultando na subsequente destabilização de outros componentes deste complexo. Em conformidade, o fenótipo foi reproduzido através da inibição química da proteína EZH1/2 em culturas organotípicas de testículos. De modo geral, este estudo revela a importância da fosfatase PP1-NIPP1 para a regulação da fosforilação e estabilização da proteína EZH2, essencial para a manutenção das células germinativas.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Ciências Biológicas e Biomédicas
The objective of this thesis is to evaluate the association between Notch signaling, genital cellular remodeling and reproductive function, in the mouse model. Five experimental chapters are included in this thesis. In experiments 1 and 2, we evaluated transcription and expression patterns of Notch component and effector genes in testis post-natal development, along the spermatogenic cycle and the epididymis. In experiment 3, we evaluated the male reproductive phenotype of in vivo Notch blockade by DAPT. In experiments 4 and 5 we evaluated transcription and expression patterns of Notch component and effector genes in the ovary, oviduct and uterus along the estrous cycle. Results indicate that Notch signaling is active and associated to male and female genital cellular remodeling. In the male, results prompt for a regulatory role of Notch signaling in spermatogonia pool maintenance, onset of spermatogenesis, in the pace of the spermatogenic cycle, germ cell identity, and epididymis spermatozoa maturation. In the female, results prompt for a regulatory role in ovarian follicle and corpus luteum development, and oviduct and uterus epithelial cell turnover and function. Notch signaling is operating in the testis and ovarian cellular interstitium, and in luminal and glandular epithelia of genital tract, probably regulating intercellular communication.
RESUMO - A via de sinalização Notch, remodelação celular genital e a função reprodutiva. - Esta tese avalia a relação entre a via de sinalização Notch, o remodelação celular genital e a função reprodutiva, sendo constituída por cinco capítulo experimentais. Nos dois primeiros, avaliamos o padrão de transcrição e expressão dos componentes e efectores da via Notch no desenvolvimento testicular pós-natal, ao longo do ciclo espermático e no epidídimo. Na experiência 3, avaliamos o fenótipo reprodutivo masculino decorrente do bloqueio in vivo da via Notch por DAPT. Nas experiências 4 e 5 analisamos o padrão de transcrição e de expressão dos componentes e efectores da via Notch no ovário, oviduto e no útero ao longo do ciclo éstrico. Os resultados indicam que a via Notch está activa e associada à remodelação genital masculino e feminino. No macho, os resultados apontam-lhe um papel regulador na manutenção do pool de espermatogónias, no início da espermatogénese, na coordenação do ciclo espermático, na identidade celular germinal, e na maturação espermática. Na fêmea, os resultados apontam para um papel regulador no desenvolvimento folicular e do corpo lúteo, e na função e ciclicidade do oviduto e útero. A via Notch opera no interstício celular do testículo e do ovário, e no epitélio luminal e glandular do tracto reprodutivo, regulando a comunicação intercelular.

A infertilidade constitui um problema grave na sociedade moderna, e o aumento da sua prevalência surge da interação complexa entre um conjunto de fatores sociais, comportamentais e biológicos. Um em cada 6 casais tem dificuldades em conceber uma gestação, e em cerca de 50% dos casais afetados o fator masculino constitui agente causal, quer primário quer associado a condições femininas. Considerando a fertilidade masculina, é um facto que a incidência de espermatogénese irregular está a aumentar devido a fatores ambientais e relacionados com o estilo de vida. De entre estes fatores, destaca-se o crescente uso de telemóveis, cujo número de utilizadores continua a aumentar a nível global. O aumento exponencial na utilização de telemóveis é acompanhado por uma preocupação crescente em relação aos seus possíveis efeitos prejudiciais na saúde humana. Vários autores defendem que a radiação eletromagnética emitida pelos telemóveis, e respetivas antenas, pode prejudicar a fertilidade. O sistema reprodutor masculino é altamente complexo e sensível a fatores intrínsecos e extrínsecos, e a radiação eletromagnética emitida pelos telemóveis pode ter efeitos nefastos na espermatogénese, reduzindo a fertilidade masculina. O objetivo da presente tese é realizar uma revisão sistemática da literatura sobre os mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos efeitos das radiações eletromagnéticas emitidas pelos telemóveis na estrutura e função testicular, através da análise de estudos realizados em modelos humanos e animais. Nos estudos em humanos baseados na comparação dos parâmetros do esperma entre homens que usam telemóvel e homens que não usam, destacaram-se a redução na mobilidade (principalmente nos espermatozoides rapidamente progressivos), e a alteração da morfologia. Nos estudos em humanos assentes na confrontação dos parâmetros do esperma entre amostras expostas às radiações eletromagnéticas dos telemóveis e amostras de controlo, ambas provenientes do mesmo indivíduo, evidenciaram-se a diminuição na mobilidade, a quebra na viabilidade e o aumento na produção de espécies reativas de oxigénio. Nos estudos em animais sobressaíram a diminuição da mobilidade, o decréscimo na concentração do esperma e o incremento na geração de espécies reativas de oxigénio. No cômputo dos estudos em modelos humanos e modelos animais, destaca-se a mobilidade dos espermatozoides, que constituiu a característica negativamente afetada de forma mais consistente pelas radiações eletromagnéticas dos telemóveis. Mais estudos devem ser realizados, e estes devem reunir entre si uma maior homogeneidade, de forma que os dados obtidos sejam mais consistentes e fiáveis, no intuito de revelar a real influência das radiações eletromagnéticas dos telemóveis na fertilidade masculina.
Infertility is a serious problem in modern society, and the increase in its prevalence arises from the complex interaction between a range of social, behavioral and biological factors. One in six couples has difficulty to conceive, and in about 50% of affected couples the male factor is the causal agent, either primary or associated with female conditions. Considering male fertility, it is a fact that the incidence of irregular spermatogenesis is increasing due to environmental and lifestyle related factors. Among these factors stands out the growing use of mobile phones whose number of users continues to increase globally. The exponential increase in mobile phone use is accompanied by a growing concern over its possible adverse effects on human health. Several authors argue that electromagnetic radiation emitted by mobile phones and their antennas, can impair fertility. The male reproductive system is highly complex and sensitive to intrinsic and extrinsic factors, and electromagnetic radiation emitted by mobile phones can have deleterious effects on spermatogenesis, reducing male fertility. The aim of this study is to conduct a systematic literature review on the pathophysiological mechanisms involved in the effects of electromagnetic radiation emitted by mobile phones in testicular structure and function, through analysis of studies in human and animal models. In human studies based on a comparison of sperm parameters between men that use mobile phone and men who do not use, the main alterations were the decreased mobility (especially in rapidly progressive spermatozoa) and the altered morphology. In human studies based on a comparison of sperm parameters between sperm samples exposed to electromagnetic radiation from mobile phones and control samples, both from the same individual, the main alterations were the decreased mobility, the declined viability and the increased production of reactive oxygen species. In animal studies the main alterations were the decreased mobility, the decreased sperm concentration and the increased generation of reactive oxygen species. Considering all human and animal studies, sperm mobility was the most consistently affected parameter by the mobile phone electromagnetic radiation. More studies are needed, and these should be more homogeneous to obtained more consistent and reliable data, in order to reveal the real influence of mobile phone electromagnetic radiation on male fertility.

Mestrado em Biomedicina Molecular
The lamina-associated polypeptide 1 (LAP1) is a type II transmembrane protein of the inner nuclear membrane encoded by the human gene TOR1AIP1. LAP1 is involved in maintaining the nuclear envelope structure and appears be involved in the positioning of lamins and chromatin. In the nuclear envelope, LAP1 is suggested to exist as a complex with A-type and B-type lamins, torsins and emerin. The presence of such complexes suggests that LAP1 may cooperate functionally with these proteins in tissues where they play a critical role. Therefore, the identification of LAP1 binding partners and the signalling pathways where LAP1 participates, is crucial for a better understanding of LAP1 functions. The work described in this thesis addresses novel human LAP1 associated proteins found through bioinformatic tools. Public databases allowed for the discovery of the LAP1 interactome, which was manually curated, identifying several functionally relevant proteins. Subsequently, the integration of multiple bioinformatic tools established novel functions to LAP1 such as DNA damage response and telomere association. In conjunction, bioinformatic results also reinforced the association of LAP1 with mitosis, and the already identified role of LAP1 in nuclear morphology. Interestingly, this association of LAP1 with the regulation of the nuclear envelope structure and mitosis progression, shares functional elements with spermatogenesis. Therefore, this work additionally described the localization of LAP1 and some of its interactors throughout the spermatogenic cycle, in mouse and human testis. The results established that the activity of LAP1 during the mouse spermatogenic cycle is most evident from stage VIII until the end of spermiogenesis, which is characteristic of manchette development. Concomitantly, some LAP1 interactors studied in this work share a similar localization, namely, PP1γ2, Lamin B1 and Lamin A/C. The results obtained from the study of LAP1 throughout different periods of the male reproductive system attributed potential new biological functions to LAP1. Thereby, this work can be the foundation of future studies regarding LAP1 and the regulation of multiple cellular processes and disease conditions.
A proteína 1 associada com a lâmina (LAP1), codificada pelo gene humano TOR1AIP1, encontra-se localizada na membrana interna do núcleo. Funcionalmente a LAP1 está associada à manutenção da estrutura do envelope nuclear e ao posicionamento da lâmina e da cromatina. No envelope nuclear a LAP1 forma complexos com várias proteínas, nomeadamente lâminas tipo A e B, torsinas e emerina. A atividade destes complexos sugere a existência de uma função cooperativa entre a LAP1 e as proteínas nomeadas anteriormente, que será essencial, particularmente nos tecidos em que a sua expressão é substancial. Assim, a identificação de novos interactores da LAP1 e das suas respetivas vias de sinalização, será crucial para identificar e compreender as funções biológicas desta proteína. Ao longo deste trabalho foram utilizadas ferramentas bioinformáticas que possibilitaram a descoberta de novas proteínas associadas com a LAP1. Em primeiro lugar, o interactoma da LAP1 foi estabelecido através do acesso a bases de dados públicas, procedendo-se posteriormente à análise manual de cada uma destas interações. De seguida, a integração de múltiplas ferramentas bioinformáticas possibilitou a determinação de novas funções associadas à LAP1, designadamente a resposta a danos no DNA e a interação com os telómeros. Simultaneamente, os resultados bioinformáticos reforçaram a participação da LAP1 no processo de mitose e a intervenção desta proteína na manutenção da morfologia nuclear. Em particular, a função da LAP1 na regulação da mitose e da estrutura do envelope nuclear parece ter semelhanças com processo de espermatogénese. Assim, ao longo deste trabalho foi também estudada a distribuição da LAP1 ao longo deste processo de diferenciação, assim como de alguns dos seus conhecidos interactores, no testículo de ratinho e de humano. Em ratinho, foi possível determinar que a atividade da LAP1 durante a espermatogénese é mais significativa desde a fase VIII até ao fim da espermiogénese, sendo característica do desenvolvimento da manchete. Concomitantemente, alguns dos interactores avaliados possuem uma localização análoga à da LAP1, nomeadamente, as lâminas B1 e A/C, e a proteína serina/treonina fosfatase 1γ2 (PP1γ2). Os resultados obtidos após o estudo da LAP1 ao longo do sistema reprodutor masculino possibilitaram a atribuição de novas e potenciais funções biológicas à LAP1. Assim, este trabalho poderá servir de ponto de partida para estudo futuros da LAP1 e da sua função na regulação de múltiplos processos celulares e doenças.

Mestrado em Biomedicina Molecular
The Amyloid precursor protein (APP) and Tau protein are related to histopathological hallmarks of Alzheimer’s disease, a progressive and complex neurodegenerative disease. APP is a type 1 integral transmembrane glycoprotein. There are two predominant proteolytic processing pathways of APP, the nonamyloidogenic pathway, and the amyloidogenic pathway. Tau is one of the microtubule-associated proteins, and its binding affinity for microtubules is regulated by phosphorylation of serine and threonine residues. APP and Tau protein expression has also been reported in the testis. However, their function and posttranslational modifications in the testis have not been established. Thus, we analyzed the expression of these two proteins and their phosphorylation patterns during spermatogenesis using wild-type mice and rats as models. Through immunohistochemistry we revealed that APP, Tau protein, Serine/Threonine Protein Phosphatase (PP) 1α and PP1γ are expressed throughout spermatogenesis. APP and Tau are phosphorylated during meiosis. In contrast to total-APP localization, phosphorylated APP at Thr668 was specially localized in spermatocyte nuclei. These results suggest that phosphorylation of APP and Tau protein contribute to spermatogenesis, especially in meiosis. However, further research is required to validate our results and unravel the specific function of APP and Tau protein during spermatogenesis and meiosis.
A proteína precursora de amilóide (PPA) e a proteína Tau estão relacionadas com os marcos histológicos da doença de Alzheimer, uma doença neurodegenerativa progressiva e complexa. A PPA é uma glicoproteína integral transmembranar que tem duas predominantes vias de processamento proteolítico, a via não-amiloidogénica e a via amiloidogénica. A proteína Tau encontra-se associada aos microtúbulos, sendo a afinidade dessa ligação regulada pela fosforilação de resíduos de serina e treonina. A expressão da PPA e da proteína Tau também já foi reportada no testículo. No entanto, ainda não foram estabelecidas as suas funções e modificações pós-traducionais neste tecido. Assim, analisamos a expressão destas duas proteínas e o seu padrão de fosforilação durante a espermatogénese usando como modelos murganhos e ratos wild-type. Através de imuno-histoquímica revelamos que a PPA, a proteína Tau, a proteína serina/treonina fosfatase (PP) 1α e a PP1γ são expressas em toda a espermatogénese. Fosforilação da PPA e da proteína Tau foi detetada durante a meiose. Em contraste com a localização da PPA-total, a PPA fosforilada na treonina 668 está especialmente localizada no núcleo dos espermatócitos. Estes resultados sugerem que a fosforilação da PPA e da proteína Tau contribui para a espermatogénese, especialmente na meiose. No entanto, são necessários estudos futuros para validar os nossos resultados e desvendar a função específica da PPA e da proteína Tau durante a espermatogénese e na meiose.

Tese de Douoramento em Ciências Veterinárias. Especialidade de Produção Animal
The established association between polymorphisms of prnp prion gene and susceptibility to scrapie disease in sheep prompted the development of breeding programmes aimed at increasing the natural resistance to scrapie in the European Union. In order to study the possible undesirable consequences from the widespread selection for the prnp genotype on ovine genetic diversity and reproduction, we primarily focused our investigation in the ovine prnd gene which encodes a prion-like protein designated as Doppel that maps to the same chromosomal region as prnp, but is mainly expressed in testis. When prnd is overexpressed in the nervous tissue, Doppel is neurotoxic and causes neurodegenerative disease. We genotyped 460 animals (207 female and 253 male) from 8 Portuguese sheep breeds (Bordaleira entre Douro e Minho, Churra Badana, C. Galega Mirandesa, C. Mondegueira, Merino da Beira-Baixa, M. Branco, Saloia e Serra da Estrela), for prnp and prnd and established a parallel between a polymorphism in the prnd gene (78G>A) and scrapie susceptibility. We also identified an association between prnd polymorphisms and fertility traits. Upholding the emphasis on ovine reproduction, recombinant Doppel (rDpl) was supplemented in different concentrations to ram spermatozoa during the capacitation process. Regardless of dosage, rDpl improved sperm individual motility and vigour, and enhanced in vitro spermatozoa fertilizing ability. In addition, we determined by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy the three-dimensional structure of the N-terminal (1-30) ovine Doppel (OvDpl) peptide, encompassing the 78G>A polymorphism and the entire signal peptide sequence. The new solved three-dimensional structure was subsequently used to construct molecular models with the M-domain of the signal recognition particle subunit (SRP54M). Simultaneously, we were able to obtain soluble mature Dpl protein through the co-expression with the SUMO chaperone. Finally, we developed a new polyclonal antibody (APPA) demonstrating for the first time that the recently discovered ovine prnt gene is a translated protein-coding gene and not a pseudogene, and identified through immunofluorescence and immunohistochemistry the location pattern of the encoded protein Prt in ram testis along spermatogenesis and in ejaculated spermatozoa. These results guided us to our last work, where data obtained through Prt blockage pointed to a physiological role for Prt in ovine fertilization (possibly through an interaction with zona pellucida proteins), reinforcing the importance of prion-like genes and proteins in the ovine reproductive physiology.
RESUMO - Estudo do efeito de genes e proteínas do tipo priónico na susceptibilidade ao tremor epizoótico e na fertilidade de ovinos - A relação estabelecida entre os polimorfismos do gene priónico (prnp) e a susceptibilidade ao tremor epizoótico determinou o desenvolvimento de programas de seleção, visando aumentar a resistência a esta doença no efetivo ovino de países da União Europeia. A fim de estudar as eventuais consequências indesejáveis por parte da seleção generalizada para o genótipo prnp ao nível da diversidade genética e das características reprodutivas dos ovinos, centrámos inicialmente o nosso trabalho no gene prnd, que codifica uma proteína do tipo priónico designada por Doppel. Este gene localiza-se na mesma região cromossómica do gene prnp, mas a sua expressão fisiológica ocorre maioritariamente no testículo, ao contrário do gene prnp cuja expressão apresenta maior afinidade para o sistema nervoso. De facto, a proteína Doppel apresenta características de neurotoxicidade quando a sua sobrexpressão é induzida no tecido nervoso. No nosso estudo, começámos por genotipar 460 ovinos (207 fêmeas e 253 machos) de 8 raças (Bordaleira entre Douro e Minho, Churra Badana, C. Galega Mirandesa, C. Mondegueira, Merino da Beira-Baixa, M. Branco, Saloia e Serra da Estrela), ao nível dos genes prnp e prnd, estabelecendo posteriormente uma associação entre um polimorfismo no gene prnd (78G>A) e a susceptibilidade ao tremor epizoótico. Foi igualmente possível identificar uma associação entre os polimorfismos detetados no gene prnd e certos parâmetros reprodutivos dos ovinos. Posteriormente, quando adicionámos doses crescentes de proteína Doppel recombinante (rDpl) ao meio de capacitação de espermatozoides de carneiro verificámos uma melhoria na motilidade individual e vigor dos espermatozoides, assim como na sua capacidade de fertilização in vitro. Foi igualmente possível determinar por espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) a estrutura tridimensional da região N-terminal (1-30) da proteína Doppel ovina (OvDpl), permitindo caracterizar melhor uma região que abarca o referido polimorfismo e a sequência integral do péptido de sinal desta proteína. Esta nova estrutura foi posteriormente utilizada em estudos bioinformáticos de docking com o domínio M da proteína de reconhecimento do sinal (SPR54M). Simultaneamente, fazendo uso das propriedades de chaperone da proteína SUMO, foi possível expressar a proteína Dpl ovina na forma solúvel. Finalmente foi desenvolvido um novo anticorpo policlonal demonstrando pela primeira vez que o gene prnt é um gene funcional, tendo sido possível identificar através de técnicas de imunofluorescência e imunohistoquímica, o padrão de localização da proteína Prt ovina em células germinativas no decurso da espermatogênese, e em espermatozoides ejaculados. De forma a complementar os dados obtidos foi realizado o bloqueio da Prt ovina durante a fertilização in vitro, sendo assim possível obter indicadores que apontam para um papel de relevo por parte desta proteína ao nível da fase inicial da fertilização (eventualmente ao nível da ligação dos espermatozoides à zona pelúcida), reafirmando assim a importância das proteínas do tipo priónico na fisiologia reprodutiva dos ovinos.
This work was co-funded by Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (Project CIISA, Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa) and Fundação para a Ciência e a Tecnologia (POCTI/CVT/57148/2004 and PTDC/CVT/098607/2008).

Desde sempre que a responsabilidade na contracepção e planeamento familiar tem recaído no elemento feminino do casal. No entanto, a partilha de responsabilidades no seio do casal é cada vez mais equitativa, e o homem desempenha nos dias de hoje um papel activo no controlo da natalidade. É deste modo de fundamental importância encontrar alternativas para os métodos contraceptivos masculinos existentes. Um estudo de 2005 revelou que cerca de 60 % dos homens na Alemanha, Espanha, Brasil e México desejam usar um novo método contraceptivo masculino e, um outro realizado na Inglaterra demonstrou que 80% dos homens colocam uma hipotética pílula masculina no topo das suas preferências no que concerne à contracepção. Nos últimos dez anos, têm surgido numerosos estudos de investigação na tentativa de compreender a fisiologia da espermatogénese, bem como alguns trabalhos epidemiológicos, cujo objectivo é encontrar métodos eficazes que permitam anular a formação do espermatozóide, e atingir a contracepção desejada de forma eficaz, reversível e segura. Com recurso a livros de texto de referência na área da biologia celular e da biologia e fisiologia da reprodução, assim como em artigos de revistas científicas da especialidade, a presente monografia sintetiza a informação existente sobre os últimos avanços no campo da contracepção masculina. Fornece uma base para a compreensão de todo o processo que leva a formação do espermatozóide e enfatiza as investigações mais promissoras ao nível dos locais de possível intervenção no processo. Nas espermatogónias a presença do factor neutrofílico derivado de uma linha da célula da glia é crucial na proliferação mitótica, e a sua descoberta ao nível do testículo humano vem trazer perspectivas interessantes para o desenvolvimento de um método que permita bloquear numa etapa muito precoce o processo de espermatogénese. No que toca às células de Sertoli as junções de oclusão são de particular interesse pois em conjunto formam a barreira hematotesticular, a zona que protege as células germinativas de qualquer agressão externa e interna. Os análogos da Lonidamina e o péptido de ocludina permitem quebrar essa barreira. Ao nível de actuação no epidímio a proteína eppin parece ser a mais promissora, dada a sua extrema importância na manutenção da fertilidade. No espermatozóide as possibilidades existentes vão de encontro às alterações estruturais do mesmo. A Planta Ruta Graveolens liofilizada e o Reversible Inhibition of Sperm Under Guidance permitem, respectivamente, alterar a mobilidade e desintegrar o espermatozóide. Na ejaculação, pode-se intervir ao nível da contractilidade do músculo liso das estruturas envolvidas no transporte e emissão do espermatozóide. A tansolusina afecta esse sistema levando a disfunções ejaculatórias. A nível hormonal existem estudos promissores com a combinação Dianogest com Decanoato de Testosterona, e a molécula (S)-N-(4-ciaano-3-trifluorometil-phenil)-3-(3-fluoro,4-clorofeenoxi)-2-hidroxi-2-metilpropanamida (que revelam eficácia, reversibilidade e poucos efeitos adversos) nos mamíferos. Comenta de igual forma os trabalhos epidemiológicos mais recentes na área da contracepção masculina. São apresentados os trabalhos existentes que demonstram a aplicabilidade prática das combinações de etonogestrel com Undecanoato de Testosterona e testosterona com acetato de medroxiprogesterona, e a utilização isolada de 7α-Methyl-19-Nortestosterona. Apesar de todos eles terem aspectos positivos e negativos, o estudo feito com a combinação de testosterona com acetato de medroxiprogesterona é o mais promissor pois revela reprodutibilidade (foi testada a capacidade de fertilização por parte do homem), eficácia (índice de falha entre 0-8%) e reversibilidade (contagens de espermatozóides acima dos 20 milhões/ml). No fim concluímos que apesar do avanço no conhecimento da espermatogénese e identificação de possíveis alvos de actuação para alcançar a contracepção masculina, muito mais há a fazer para atingir um método contraceptivo reversível, eficaz e seguro.
The concern with contraception and family planning has been over the years a responsibility of the feminine element of the couple. However, the sharing of responsibilities within a couple is actually more equitable, and men play nowadays an active role in birth control. Therefore, it is of fundamental importance to find out alternatives for the existing male contraceptive methods. A 2005 study found that approximately 60% of men in Germany, Spain, Brazil and Mexico want to use a new male contraceptive method. Another report conducted in England showed that 80% of men pose a hypothetical male pill on top of their preferences with regard to contraception. Over the past decade, there have been numerous research studies in an attempt to understand the physiology of spermatogenesis, as well as some epidemiological studies, whose aim to find effective methods that allow nullify the formation of sperm, and achieve the desired contraception effectively and reversibly. Using reference textbooks of biology and cellular biology and physiology of reproduction, as well as articles in scientific journals specialized in the area, this monograph summarizes the available information on the latest advances in male contraception. It provides the basis for the understanding of the process that leads to the formation of sperm, and emphasizes the most promising investigations envisaging the sites of possible intervention in order to achieve contraception. The glial cell line-derived neurotrophic factor is a crucial molecule in the mitotic proliferation of spermatogonia and its discovery in human testis has brought interesting perspectives for the development of a method allowing disruption of spermatogenesis at earlier steps. With regard to Sertoli cell, tight junctions are of particular interest because together they form the testis barrier, the structure that protects the germ cells of any external aggression and internal. Analogues of lonidamine and occludin peptide help to break this barrier. At the level of epididymis the eppin protein is the most promising, as it was shown its extreme importance maintaining fertility. The possibilities in the sperm will meet essential actions on structural changes. The lyophilized Ruta Graveolens and Reversible Inhibition of Sperm Under Guidance allows to change sperm mobility and cell structural integrity,respectively. Concerning ejaculation, interventions can be considered on smooth muscle contractility of structures involved in sperm transport and emission. . The tansolusin affect this system leading to ejaculatory dysfunction. Studies manipulating hormonal levels are promising and the combination of Dianogest with Testosterone Decanoate, and the molecule (S)-N-(4-cyano-3-trifluoromethyl-phenyl)-3-(3-fluoro, 4- chlorophenoxy)-2-hydroxy-2-methyl-propanamide shows effectiveness, reversibility, and few adverse effects in mammals. Recent epidemiological studies in the field of male contraception also are commented. These studies demonstrate the practical applicability of the combinations of etonogestrel and testosterone with Testosterone Undecanoate, with medroxyprogesterone acetate, and the isolated use of 7α-Methyl-19-Nortestosterone. Although they all have positive and negative aspects, the use of the testosterone and medroxyprogesterone acetate combination is the most promising one since it shows reproducibility (we tested the ability of fertilization by the male), efficacy (failure rate between 0 -8%) and reversibility (sperm counts above 20 million / ml). In conclusion, despite the advances deepening our knowledge of spermatogenic process, and the identification of new possible intervention targets , much more has be done in order to achieve a reversible, safe and effective contraceptive method.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular
O objetivo do presente trabalho é apresentar os resultados clínicos e embriológicos de pacientes com microdeleções no cromossoma Y, tratados por injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), através do uso de espermatozoides testiculares a fresco (TESE) ou criopreservados e descongelados (TESE-C), e através do uso de espermatozoides do ejaculado (EJAC). A originalidade deste trabalho reside nas comparações efetuadas entre os diferentes tipos de microdeleções no cromossoma Y (AZFa, AZFb e AZFc) e os tratamentos efetuados, com os detalhes dos resultados demográficos, de estimulação, embriológicos, clínicos e dos recém-nascidos (NB). Dos 128 pacientes com microdeleções no cromossoma Y, 18 realizaram ICSI com espermatozoides do ejaculado e 65 realizaram TESE. Houve 51 ciclos de tratamentos TESE e 43 ciclos de tratamento TESE-C, com nascimento de 19 NB (2 em AZFa/TESE-C; 12 Em AZFc/TESE; 5 em AZFc/TESE-C).Dos 29 ciclos EJAC houve nascimento de 8 NB (em AZFc). Nos ciclos TESE e EJAC não houve diferenças significativas nos parâmetros clínicos e embriológicos. Nos ciclos TESE-C, houve uma taxa de maturação de ovócitos, taxa de clivagem embrionária e média do número de embriões transferidos significativamente mais baixa em AZFb, uma média do número de ovócitos mais alta e uma taxa de fertilização mais baixa em AZFc. Em conclusão, embora os pacientes com microdeleção AZFc apresentem uma alta taxa de recuperação de espermatozóides e resultados clínicos aceitáveis, casos com microdeleções AZFa e AZFb apresentaram um prognóstico pobre. Devido à hereditariedade das microdeleções relatada, os pacientes devem ser informados acerca das consequências da infertilidade no recém-nascido e da possibilidade de utilizarem o diagnóstico genético de pré-implantação para a seleção do sexo feminino.
The aim of the present work was to present the outcomes of patients with Y-chromosome microdeletions treated by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), either using fresh (TESE) or frozen-thawed (TESE-C) testicular sperm, and ejaculated sperm (EJAC). The originality of this work resides in the comparisons between the different types of Y-microdeletions (AZFa, AZFb, AZFc) and treatments, with detailed demographic, stimulation, embryological, clinical and newborn (NB) outcomes. Of 128 patients with Y-microdeletions, 18 performed ICSI with ejaculated sperm and 65 went for TESE. There were 51 TESE treatment cycles and 43 TESE-C treatment cycles, with birth of 19 NB (2 in AZFa/TESE-C; 12 in AZFc/TESE; 5 in AZFc/TESE-C). Of the 29 EJAC cycles there was birth of 8 NB (in AZFc). In TESE and EJAC cycles there were no significant differences in embryological and clinical parameters. In TESE-C cycles, there was a significant lower oocyte maturity rate, embryo cleavage rate and mean number of embryos transferred in AZFb, and a higher mean number of oocytes and lower fertilization rate in AZFc. In conclusion, although patients with AZFc microdeletions presented a high testicular sperm recovery rate and acceptable clinical outcomes, cases with AZFa and AZFb microdeletions presented a poor prognosis. Due to the reported heredity of microdeletions, patients should be informed about the infertile consequences on the newborn and the possibility of using preimplantation genetic diagnosis for female sex selection.

Dissertação de Mestrado, Engenharia Zootécnica, 9 de Julho de 2013, Universidade dos Açores.
O presente trabalho teve como objectivo testar o efeito de 3 curvas de congelaçao diferentes sobre a integridade do acrossoma da célula espermática de caprinos. A colheita de sémen foi realizada nos Serviços de Desenvolvimento Agrário da Ilha Terceira (SDAT), tendo sido utilizados 3 bodes (2 de raça Saanen e 1 de raça Alpina) com mais de 2 anos de idade. As recolhas (3 por cada animal) foram efectuadas durante o mês de Fevereiro de 2012, em 3 sessões espaçadas de aproximadamente 5 dias, seguindo um desenho factorial de medições repetidas. As recolhas foram sempre efectuadas pela manhã, com inicio por volta das 08:00 horas e em cada período de colheita os bodes alternavam aleatoriamente. A colheita do sémen foi obtida com vagina artificial, após treino dos bodes, utilizando uma fêmea com cio induzido. A indução artificial do cio foi conseguida com uma injecção intramuscular de 250 μg de benzoato de estradiol diluído em 2 ml de óleo mineral, aplicada 24 a 48 horas antes do momento necessário, seguida de uma nova injecção passadas 24 horas na dose de 100 μg de modo a garantir o prolongamento do cio pelas próximas 24 horas. No laboratório procedeu-se à avaliação de características seminais como o volume, a concentração espermática e a mobilidade massal. De seguida efectuou-se a contagem dos espermatozóides vivos e mortos por citometria de fluxo e procedeu-se à congelação do sémen segundo as 3 curvas, que diferiam nas rampas de arrefecimento. As temperaturas das diferentes curvas foram iguais, variando apenas a temperatura de arrefecimento na segunda rampa (Curva A = 25 ºC/min, Curva B = 35 ºC/min e Curva C = 45 ºC/min). Para testar a influência das referidas curvas sobre a integridade do acrossoma recorreu-se novamente ao citómetro e determinou-se a percentagem de espermatozóides vivos e mortos e com o acrossoma intacto ou danificado. As diferentes curvas não influenciaram significativamente a taxa de mortalidade dos espermatozóides com acrossoma intacto (11,6 ± 0,63 % spz Curva A, 11,36 ± 0,63 % spz Curva B e 10,37 ± 0,63 % spz Curva C) ou danificado (68,78 ± 1,39 % spz Curva A, 70,54 ± 1,39 % spz Curva B e 70,96 ± 1,39 % spz Curva C). No entanto observou-se um efeito significativo dos bodes e dias de colheita nos quatro parâmetros estudados - percentagem de espermatozóides vivos com o acrossoma intacto (VAI) ou danificado (VAD) e percentagem de espermatozóides mortos com o acrossoma intacto (MAI) ou danificado (MAD). Relativamente à percentagem de espermatozóides VAI o bode 1 apresentou valores 50% inferiores aos bodes 2 e 3 (P<0.001) e o dia de colheita afectou substancialmente este parâmetro (25,33 ± 0,66 % spz dia colheita 1, 18,40 ± 0,66 % spz dia colheita 2 e 11,31 ± 0,91 % spz dia colheita 3; P<0.01). A percentagem de espermatozóides VAD diferiu significativamente entre o animal 1 e 2 (P=0,016) e entre os dias de colheita 1 e 3 (P=0,032). No que se refere à percentagem de espermatozóides mortos, os factores animal e dia de colheita também afectaram significativamente os resultados. O bode 1 diferiu significativamentedos dos restantes na percentagem de espermatozóides MAI. Também para este parâmetro, os dias de colheita 2 e 3 revelaram-se significativamente diferentes (P=0,042). Na percentagem de espermatozóides MAD o bode 1 diferiu dos bodes 2 e 3 (P<0,001). Neste parâmetro verificaram-se diferenças significativas entre o dia 1 e os dias 2 (P=0,003) e 3 (P<0,001). Os resultados deste ensaio permitiram concluir que as 3 curvas de congelação estudadas não influenciaram significativamente as taxas de mortalidade dos espermatozóides do sémen de caprino, sugerindo que qualquer delas se revelou eficaz na congelação de sémen desta espécie. Verificou-se no entanto uma variação significativa, quer entre animais quer entre dias de colheita, reafirmando estes factores como bastante influenciadores da variabilidade frequentemente observada das capacidades fertilizantes do sémen congelado de caprino.
ABSTRACT: This study was aimed to test the effect of 3 different freezing curves on the acrosome integrity of male goat sperm cell . The semen collection was performed at the Departments of Agrarian Development of Terceira Island (SDAT), using 3 bucks (2 Saanen and 1 Alpine breed) aged more than 2 years . Collections (3 per animal) were carried out during February 2012 in three sessions with 5 day-intervals, following a factorial experimental design with repeated measures. The collections were always made in the mornings, starting at around 08: 00 hours and during each collection period the bucks alternated randomly. The semen was collected with an artificial vagina after the bucks had been trained, with a female induced in heat. The artificial induction of heat was achieved with an intramuscular injection of 250 μg of oestradiol benzoate dissolved in 2 ml of mineral oil applied 24 to 48 hours prior to be necessary, followed by a further injection applied 24 hours after, at a dose of 100 μg in order to ensure the continuation of the heat for the next 24 hours. In the laboratory, took place the evaluation of seminal characteristics like volume, sperm concentration and massal mobility. After the counting of live and dead sperm by flow cytometry, the procedures followed with the freezing of semen according to the three curves, which differed in ramp cooling. The temperatures of the different curves were similar, varying only in the temperature of the second cooling ramp (Curve A = 25 ° C / min, Curve B = 35 ° C / min and Curve C = 45 ° C / min). To test the influence of the curves on the acrosome integrity the cytometer was used again to determine the percentage of live and dead spermatozoa and the acrosome integrety. The different curves did not influence the mortality rate of sperm with intact acrosome (11,6 ± 0,63 % spz Curve A, 11,36 ± 0,63 % spz Curve B e 10,37 ± 0,63 % spz Curve C) or damagedo (68,78 ± 1,39 % spz Curve A, 70,54 ± 1,39 % spz Curva B e 70,96 ± 1,39 % spz Curva C). However there was a significant effect of bucks and collection days in the four parameters studied - percentage of live sperm with intact (VAI) or damaged (VAD) acrosome and percentage of dead sperm with intact (MAI) or damaged (MAD) acrosome. Concerning the percentage of VAI sperm male goat 1 showed values 50% lower than goats 2 and 3 (P <0.001) and collection day substantially affected this parameter (25.33 ± 0.66% SPZ collection day 1, 18.40 ± 0.66% SPZ collection day 2 and 11.31 ± 0.91% SPZ collection day 3; P <0.01). The percentage of sperm VAD differed significantly between animals 1 and 2 (P = 0.016) and between collection days 1 and 3 (P = 0.032). Regarding the percentage of dead spermatozoa, animal and collection day factors also significantly affected the results. Buck 1significantelly differed in the percentage of MAI spermatozoa. Also for this parameter, the collection days 2 and 3 were significantly different (P = 0.042). In percentage of the MAD spermatozoa buck 1 differed from bucks 2 and 3 (P <0.001). In this parameter, there were significant differences between day 1 and day 2 (P = 0.003) and 3 (P <0.001). The results of this experiment showed that the 3 freezing curves studied did not significantly influence the mortality rates of male goat spermatozoa , suggesting that any of them proved effective in freezing semen of this species. There was however a significant variation between animals and between collection days, confirming these as very influencing factors of the variability commonly observed in the fertilization ability of male goat semen.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Humana e Ambiente). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013
Background: Mouse spermatogonial stem cell transplantation (SSCT) has become an established research model to study the testicular germ cell line. By performing SSCT in mice, donor spermatogenesis can be re-established in the seminiferous tubules of an otherwise infertile recipient. Transplanted males are able to produce fertile offspring after spontaneous mating. Therefore, SSCT is a promising fertility preservation technique for prepubertal boys who are exposed to gonadotoxic treatments, leading to infertility. Compared to the increasing reports illustrating the effectiveness of SSCT in reproductive terms, only a few studies addressed safety issues. Before accepting SSCT as a clinical strategy, all potential safety concerns need to be carefully evaluated. In the present project we investigated whether epigenetic modifications occur in the correct way during early embryogenesis and during spermatogenesis in offspring. Material & Methods: We evaluated the general methylation level, using immunohistochemistry for 5-methylcytosin (5-MC), in pre-implantation embryos of different stages (2-cell, 4-cell, multi-cell, morula and blastocyst) from GFP- transplanted mice with GFP+ testicular donor cells. We also analyzed the acetylation of H4K8. Stainings for 5-MC, DNMT3a, H4K5ac and H4K8ac were also performed on testicular tissue from live born GFP+ male offspring of transplanted mice. Results: Unfortunately, no GFP+ embryos could be obtained from the transplanted males. The GFP+ offspring showed a correct pattern for H4K5ac and H4K8ac in the spermatids, but some abnormalities were seen in the spermatocytes. No major differences were indicated for DNMT3a and 5-MC compared to fertile adult controls. Conclusion: No major abnormalities on epigenetic level were observed, and the ones observed do not seem to cause anything severe. Anyway, it is still necessary to repeat the embryo experiment to check possible epigenetic problems during embryo development. Therefore, even though SSCT has potential as a clinical application, more research is required before becoming a fertility preservation technique.
Quinze anos após a sua introdução, o transplante de células espermatogoniais estaminais (SSCT) no rato tornou-se um modelo de investigação estabelecido para o estudo e manipulação da linhagem germinativa das células testiculares. Através do SSCT em ratos, a espermatogénese de um dador é reestabelecida nos túbulos seminíferos de um receptor infértil. Machos transplantados são capazes de produzir descendência após acasalamento espontâneo, e também foi demonstrada fertilidade nos descendentes. Portanto SSCT é uma técnica promissora para a preservação da fertilidade de rapazes que ainda não atingiram a puberdade e que são expostos a tratamentos gonadotóxicos que provocaram uma eventual infertilidade. No entanto, apesar das evidências que ilustram a eficácia do SSCT em termos reprodutivos, apenas alguns estudos abordam questões de segurança ao nível de modificações da linha germinativa, como, por exemplo, aberrações cromossómicas, alterações no imprinting e modificações epigenéticas. Por isso, antes do SSCT ser aceite como estratégia clínica, todos os potenciais problemas devem ser verificados e avaliados. Neste projecto, vamos investigar se algumas modificações epigenéticas ocorrem ou não de forma correcta durante a embriogénese e durante a espermatogénese dos descendentes de ratos transplantados. Foi avaliado o nível de metilação geral, fazendo himuno-histoquímica para o 5-metilcitosina (5-MC), em embriões de diferentes estádios de desenvolvimento embrionário (2-células, 4-células, multi-células, morula e blastocisto) de ratos GFP- transplantados com células testiculares de uma dador GFP+. Também foi avaliada a aceptilação da H4K8. Colorações para 5-MC, DNMT3a, H4K5ac e H4K8ac foram realizadas em tecido testicular de descendência GFP+ nascida dos ratos transplantados. Infelizmente não se conseguiram obter embriões GFP+ a partir dos machos transplantados. A prole GFP+ nascida mostrou um padrão correto para a aceptilação da H4K5 e da H4K8 nos espermatídios, mas algumas alterações foram observadas nos espermatócitos. Não foram detectadas grandes diferenças para o DNMT3a e a 5-MC em relação aos controlos adultos férteis. Ou seja, não foram observadas grandes alterações ao nível epigenético, e as observadas parecem não causar nada de grave. De qualquer forma, ainda é necessário repetir a experiência ao nível do desenvolvimento embrionário para se verificar possíveis problemas epigenéticos durante o desenvolvimento do embrião. Portanto, embora SSCT tenha um grande potencial para a aplicação clínica, é necessária mais investigação antes de se tornar uma técnica de preservação da fertilidade.

Regucalcin (RGN) is a highly-conserved calcium (Ca2+)-binding protein, which was initially identified in the rat liver, playing a role in intracellular Ca2+ homeostasis. Over the last years, RGN was identified in several non-reproductive and reproductive tissues and, due to its modulation of Ca2+ levels, and regulation of Ca2+-dependent and -independent enzymes, the panoply of RGN known functions has been widening. RGN has thus also been involved in the regulation of intracellular signaling pathways, oxidative stress and metabolism, as well as important biological processes such as cell proliferation and apoptosis. RGN is encoded by the Rgn gene, identified as an androgen-target gene broadly expressed in all testicular cell types, which for the first linked RGN with male reproduction. More recently, transgenic rats overexpressing RGN (Tg-RGN) have been shown to display increased sperm viability with lower incidence of tail defects, as well as resistance to oxidative stress and to chemical- or radiation-induced apoptosis. Despite the different evidences supporting the beneficial role of RGN in spermatogenesis, the molecular players underlying its actions are not yet known. The present study aimed to identify the pathways and molecular players underlying the cytoprotective actions of RGN in spermatogenesis. For this purpose, the testicular transcriptome of Tg-RGN rats compared to wild-type (Wt) rats was analyzed using an RNA sequencing approach (RNA-seq). Differentially expressed genes were clustered according to their expression pattern, gene ontology (GO) and pathway enrichment analysis. A total of 1064 genes were differentially expressed in the Tg-RGN rats with higher enrichment scores found for GO terms for biological processes such as ion transport or meiotic cell cycle. The obtained information was then filtered considering fold-change, expression level and the potential relevance for spermatogenesis, and 10 genes were selected for real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qPCR) validation of the RNA-seq results. Atp10b, Orai1, Sfrp2 and Tnni1 genes were validated as being up-regulated genes in the testis of Tg-RGN rats, whereas Fign and Sycp1 genes were down-regulated, which suggests their likely role as RGN partners in modulating spermatogenesis. Afterwards, the expression of the 10 selected genes in different types of testicular cells was investigated. For this purpose, a cell line with spermatogonia stem cell characteristics (GC-6spg cells) and primary Sertoli Cells (SCs) isolated from Wt rats were used. Gene expression was assessed by reverse transcription PCR (RT-PCR). All differentially expressed genes, with the exception of Atp10b, were expressed in SCs; Eng, Fign, Orai1, Star, Sycp1 and Tnni1 genes were also detected in GC-6spg cells. Overall, the findings obtained in the present thesis gave a new insight into the molecular mechanisms behind RGN’ actions in the testes and provided the basis for future research exploring and deepening the knowledge about the role of RGN in the regulation of spermatogenesis and male (in)fertility.
A regucalcina (RGN) é uma proteína de ligação ao cálcio (Ca2+) altamente conservada, a qual foi inicialmente identificada no fígado de rato, desempenhando um papel na homeostase do Ca2+ intracelular. Nos últimos anos, a RGN foi identificada em vários tecidos não reprodutivos e reprodutivos e, devido à sua capacidade de modular os níveis de Ca2+, e de regular a atividade de enzimas independentes e dependentes de Ca2+, a panóplia de funções conhecidas da RGN foi sendo alargada. A RGN foi assim sendo envolvida também na regulação da sinalização intracelular, stress oxidativo e metabolismo, assim como em processos biológicos importantes, como proliferação e apoptose. A RGN é codificada pelo gene Rgn, que foi identificado como um gene alvo dos androgénios, o qual é amplamente expresso em todos os tipos de células testiculares, o que pela primeira vez relacionou a RGN com a reprodução masculina. Mais recentemente, foi demonstrado que ratos transgénicos que sobreexpressam a RGN (Tg-RGN) apresentam maior viabilidade espermática, com menor incidência de defeitos na cauda, resistência ao stress oxidativo e apoptose induzida por produtos químicos ou radiação. Apesar das diferentes evidências que suportam o papel benéfico do RGN na espermatogénese, os agentes moleculares subjacentes às suas ações ainda não são conhecidos. O presente estudo teve como objetivo identificar as vias e os agentes moleculares subjacentes às ações citoprotetoras da RGN na espermatogénese. Com este propósito, foi analisado o transcriptoma testicular de ratos Tg-RGN comparativamente com ratos wild-type (Wt) usando uma abordagem de sequenciamento de RNA (RNA-seq). Os genes diferencialmente expressos foram agrupados de acordo com o seu padrão de expressão, ontologia genética (GO) e análises de enriquecimento. Um total de 1064 genes foram diferencialmente expressos em ratos Tg-RGN, tendo-se encontrado os maiores scores de enriquecimento para termos GO de processos biológicos como transporte de iões ou ciclo celular meiótico. A informação obtida foi então filtrada considerando o fold-change, o nível de expressão e a potencial relevância para a espermatogénese, e foram selecionados 10 genes para validação dos resultados do RNA-seq por reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). Os genes Atp10b, Orai1, Sfrp2 e Tnni1 foram validados como sendo regulados positivamente nos testículos de ratos Tg-RGN, enquanto os genes Fign e Sycp1 foram regulados negativamente, o que sugere o seu provável papel como parceiros da RGN na modulação da espermatogénese. Posteriormente, procedeu-se à análise da expressão dos 10 genes selecionados em diferentes tipos de células testiculares. Com este intuito, utilizou-se uma linha celular com características de células estaminais espermatogoniais (células GC-6spg), e células de Sertoli (SCs) primárias isoladas de ratos Wt. A expressão génica foi avaliada por transcrição reversa por PCR (RT-PCR). Todos os genes diferencialmente expressos, com exceção do Atp10b, foram expressos em SCs; os genes Eng, Fign, Orai1, Star, Sycp1 e Tnni1 foram também detetados nas células GC-6spg. No geral, os resultados obtidos na presente tese deram uma nova visão sobre os mecanismos moleculares por detrás das ações da RGN nos testículos, e forneceram a base para investigação futura no sentido de explorar e aprofundar o conhecimento sobre o papel da RGN na regulação da espermatogénese e na (in)fertilidade masculina.

Dissertação de mestrado, Aquacultura, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2015
The over-exploitation of European eel (Anguilla anguilla) has been damaging natural stocks of wild populations, creating the need of improvement in the captive breeding techniques. A better understanding of the reproductive cycle of the European eel is necessary, in order to create independence from natural environment. In the present study, the sexual maturation of male eels was induced by human chronic gonadotropin (hCG), with the purpose of sexually mature eel males in captivity. Biomarkers were used to check the quality of fresh and cryopreserved sperm. Computer-assisted sperm analysis (CASA) was used to analyze the quality parameters of sperm. Tests as the Luminometric Methylation Assay (LUMA) and analysis of the progestin receptors (2 nuclear and 5 membrane receptors), using the polymerase chain reaction (qPCR), were conducted to verify the capability of these analyses, to become new markers of quality, both for the sperm and gametogenesis process. It was found that the methylation using LUMA techniques revealed not to be a good biomarker of sperm quality of European eel. Also, 3 of the expressed receptors (mPRalpha, mPRAL1 and mPRAL2) are potential molecular markers of sperm quality and gametogenesis due to their expression profile on the testis. With these tools is expected to help the development of aquaculture industry of European eel.
A exploração excessiva de enguia Europeia (Anguilla anguilla) tem vindo a danificar os stocks naturais das populações selvagens, criando a necessidade de melhorar as de técnicas de reprodução em cativeiro. Visto que todas as enguias criadas em cativeiro são originárias do meio natural. Uma melhor compreensão do ciclo de reprodução da enguia Europeia é necessária, para deste modo se criar a independência da indústria do meio natural. No presente estudo, a maturação sexual de enguias macho foi induzida através da gonadotrofina crónica humana (hCG), com a finalidade de maturar os machos em cativeiro. Biomarcadores foram utilizados para verificar a qualidade do material fresco e posteriormente criopreservado. O Computer-assisted sperm analysis (CASA), foi utilizado para verificar parâmetros de qualidade e testes como o Luminometric Methylation Assay (LUMA) e analises aos recetores de progestina (2 recetores nucleares e 5 de membrana), utilizando a reação em cadeia de polimerase em tempo real (qPCR), foram realizados para verificar a potencialidade destas mesmas análises, como novos biomarcadores. Tanto para verificar a qualidade do esperma como para o processo de gametogénese. Verificou-se que o LUMA não é um bom marcador de qualidade do esperma da enguia Europeia e que 3 dos recetores expressos (mPRalpha, mPRAL1 e mPRAL2) são potenciais marcadores moleculares de qualidade do esperma e da gametogénese. Com estas ferramentas espera-se ajudar o desenvolvimento da indústria da aquacultura da enguia Europeia.
FA1205: AQUAGAMETE

Dissertação de Mestrado em Ambiente, Saúde e Segurança.
O principal objetivo deste estudo consistiu em avaliar os efeitos da exposição crónica a diferentes práticas agrícolas (agricultura convencional e orgânica) sobre o sistema reprodutor masculino, particularmente em termos de dano testicular. Três grupos de 12 machos da espécie Mus musculus, pertencentes a populações naturais dos locais de estudo, foram capturados vivos para posterior avaliação do dano testicular e determinação das doses hepáticas de metais essenciais e traço, entre os quais Se, Pb, Hg e Cd. O primeiro grupo foi capturado numa exploração agrícola convencional na qual os solos são frequentemente tratados com agroquímicos. O segundo grupo foi capturado numa exploração orgânica certificada, em que o tratamento dos solos está limitado a fertilizantes orgânicos. O terceiro grupo (controlo) foi capturado numa reserva natural cujos solos nunca foram utilizados para fins agrícolas. Após eutanização, os testículos de cada indivíduo foram extraídos, fixados e processados para análise histológica, enquanto o resíduo seco dos fígados foi sujeito à quantificação de metais traço. A avaliação do dano testicular foi levada a cabo através da análise da densidade volumétrica relativa de diferentes estágios celulares espermatogénicos, de espaço intersticial e espaço luminal, juntamente com uma avaliação qualitativa do dano nos túbulos seminíferos e com a quantificação de células espermatogénicas em apoptose (TUNNEL assay). A proporção de espaço intersticial foi significativamente superior nos ratos de ambas as explorações em relação ao grupo controlo, sendo superior no grupo da exploração convencional, enquanto a proporção de espermátides tardias e espermatozoides foi significativamente inferior neste mesmo grupo, o qual não só apresentou um número significativamente superior de túbulos seminíferos desprovidos de espermatozoides e com evidências de dano estrutural, mas também uma quantidade significativamente superior de células apoptóticas, em comparação com os outros dois grupos. Estes resultados sugerem que ambas as práticas agrícolas, especialmente a agricultura convencional, originam dano testicular em ratos que se encontram naturalmente e cronicamente expostos a ambientes agrícolas enriquecidos em metais traço, confirmando a adequação da espécie Mus musculus como bioindicadora dos potenciais efeitos e consequentes riscos para a fertilidade masculina de agricultores continuamente expostos a esses ambientes.
ABSTRACT: The main goal of this study was to assess the effects of chronic exposure to different agricultural practices (conventional and organic farming) on male reproductive disruption, particularly testicular damage. Three groups of 12 male specimens of Mus musculus, each belonging to natural occurring populations in the studied sites, were captured alive for later evaluation of testicular damage and determination of the internal hepatic doses of essential and trace metals, like Se, Pb, Hg, and Cd. The first group was captured in a conventional farm in which soils are frequently treated with agrochemicals. The second group was captured in a certified organic farm, where soil treatments are limited to organic fertilizers and the third group (control) was captured in a natural reserve forest that was never used for farming. After euthanization, each mice had its liver and testicles extracted. The testicles were fixed and processed for posterior histological analysis, while the liver was oven dried for further quantification of trace metals. Testicular damage was assessed by studying the relative volumetric density of different spermatogenic stages, of interstitial space and luminal space, the seminiferous tubules injury (based on qualitative scores), and by quantifying apoptotic spermatogenic cells in the seminiferous tubules (by TUNNEL assay). The proportion of interstitial space was significantly higher in the seminiferous tubules of mice from both farming sites in relation to control group, being greater in the conventional farming group. The proportion of late spermatids and sperm cells was significantly decreased in mice from the conventional farming group, which not only revealed a significantly increased amount of seminiferous tubules lacking sperm cells and with evidence of structural damage, but also a significantly increased amount of spermatogenic cells undergoing apoptosis, in comparison with the other two groups. These results suggest that both farming practices, especially conventional farming, enhance testicular damage in mice that are naturally and chronically exposed to trace metal enriched farming environments, confirming Mus musculus as an appropriate bioindicator of the potential effects and resulting risks for male fertility of farmers continually exposed to the same environments.

Sertoli cells cells play a key role on the establishment of an adequate luminal environment in the seminiferous tubules of the male reproductive tract. The secretion of the seminiferous tubular fluid (STF), as well as, the control of the pH of this fluid is crucial for male fertility. Sertoli cells express various types of ion membrane transporters that are directly involved on the movement basic and acidic particles across the membrane. Among them, is Na+/H+ exchanger (NHE3), which belongs to the Na+/H+ exchanger family, one of the most relevant epithelial ion transporter families, catalyzes the electroneutral transport of extracellular Na+ for intracellular H+. Several authors have provided confirmation that estrogens and androgens play an important role in male fertility, and regulate fluid transport on the male reproductive tract. On the other hand, as germ cells are unable to use glucose for their energy metabolism (Sertoli cells metabolize glucose and the majority of it is converted to lactate, which is preferentially used by developing germ cells). There is a growing awareness that androgens and estrogens have general metabolic roles that reach far beyond reproductive processes. Thus, is important to understand the role of the sex steroids in expression of NHE3 in Sertoli cells, as wells as, its modulation in metabolism of these “nurse” cells. For this purpose, primary Sertoli cell cultures were prepared from 20 days-old rats in serum-free medium supplemented with insulin, transferrin and selenium supplement (ITS medium) and divided in 7 experimental groups, being subjected to hormonal treatment during 50 hours. The groups were: E2 (17β-estradiol); dihydrotestosterone (DHT); ICI 182,720 (ICI); flutamide (Flut); ICI/ E2; Flut/DHT and control. The hormonal concentration was 100nM for all groups, except control group, which was not treated. The presence of NHE3 in Sertoli cells was confirmed by RT-PCR and western blot analysis. NHE3 was semi-quantified by RT-PCR for all experimental groups, there have been no significant differences when compared to control group. As for, analysis of the metabolites secretion or consumption by Sertoli cell culture, it was recovered 250 μL of the culture medium at 5h,15h, 25, 35h and 50h, after beginning treatment, for hydrogen nuclear magnetic resonance spectra analysis. The results obtained showed that glucose consumption was significantly higher in DHT-treated Sertoli cells after 50 hours than in control conditions or E2-treated cells. Unexpectedly, DHT-treated cells produced less lactate than those treated with E2 or in control conditions. This may be due to several factors such as to a decrease in cellular production of lactate, to a delay in lactate transport to extracellular medium or even to lactate utilization as substrate by DHT-treated cells. In pyruvate consumption there were no significant changes with hormonal treatment, however alanine production was higher in E2-treated cells. In summary, this study demonstrates that sex steroids do not exert significant effects in NHE3 expression by Sertoli cells. It is likely that control of intracellular pH of the Sertoli cells and luminal acidification in seminiferous tubules do not depend on directly of estrogen and androgen actions mediated by its receptors. In other hand, DHT increases glucose consumption in Sertoli cells and E2 increase alanine production. Thus, sex steroids seem to play an important role in modulation of Sertoli cells metabolism.

Spermatogenesis is the intricate and coordinated process by which thousands of spermatozoa are produced daily within the male gonad. In addition, mammalian testis also serves as an endocrine organ, producing the sex steroid hormones needed for normal spermatogenesis and development of male phenotype. Over the years, estrogens have emerged as important regulators of male reproductive function, but their role in spermatogenesis has remained a matter of controversy. There are reports indicating that estrogens are survival factors for germ cells, while other strong evidences associated their actions with testicular apoptosis and diminution of germ cell number. Furthermore, the molecular targets underpinning the survival or apoptotic effects of estrogens in mammalian testis remain to be fully elucidated. Regucalcin (RGN) is a calcium (Ca2+)‐binding protein playing an important role in the maintenance of intracellular Ca2+ homeostasis, for which a role in spermatogenesis has been suggested. RGN was identified in male reproductive tract tissues, being described as an estrogen‐target gene in rat and human prostate cells, and as an androgen‐target gene in the testis. However, the effect of estrogens controlling the expression levels of RGN in the testis is entirely unknown. Noteworthy, it has been indicated the role of RGN in the control of cell survival and apoptosis, and its antioxidant properties also have been reported. Although a tight control of apoptosis and oxidative stress are of the paramount importance for proper testis function, the role of RGN in testicular physiology has not deserved attention yet. Sperm undergo maturation acquiring progressive motility and the capacity to fertilize oocyte only during passage through the epididymis. Although a gradient of Ca2+ along the epididymis has been described, its effects on epididymal function remain poorly explored. The main objective of this thesis is to disclose the relationship between estrogens and apoptosis of germ cells, including the regulatory effects of these sex steroid hormones on the testicular expression of RGN. Secondly, the role of RGN in regulating apoptosis and oxidative stress in the testis, as well as, in sperm maturation in epididymis will be explored. A 100 nM dose of 17β‐estradiol (E2), mimicking the elevated concentrations of estrogens found in the testis of infertile patients, induced apoptosis of germ cells and decreased cell proliferation, which was accompanied by disrupted expression of the SCF/c‐kit system. E2‐ stimulation also increased RGN expression, suggesting that the augmented expression of this protein may be a mechanism to counteract E2‐induced apoptosis. Concerning the function of RGN in modulation of apoptosis in the testis, it was shown that RGN plays a pivotal role rescuing cells from apoptosis induced by noxious stimuli. Moreover, RGN overexpression led to increased protection against oxidative stress in the testis, which further confirmed the cytoprotective role of RGN. The results presented herein also demonstrated the importance of maintaining Ca2+ levels in the epididymal lumen and supported a role for RGN in sperm maturation. In conclusion, the present thesis demonstrated that elevated concentrations of estrogens may unbalance the expression of SCF/c‐kit system leading to depletion of germ cells due to augmented apoptosis and decreased proliferation, which has contributed to understand the molecular basis of hyperestrogenism related male infertility. These findings also provided a rationale to explain the successful use of aromatase inhibitors to treat male infertility, and suggested that manipulation of c‐kit and RGN levels may be a possible mechanism to preserve germ cell integrity and fertility. Thus, the action of estrogens and RGN on testis physiology and sperm function has emerged as “a matter of life and death”.

A infertilidade é uma condição que actualmente afecta 15% dos casais em todo o mundo, com tendência para aumentar, sendo que cerca de 50% dos casos são atribuídos ao parceiro masculino. Como é sabido, a espermatogénese é extremamente influenciada por estímulos externos, e a incidência crescente de distúrbios reprodutivos aumentou a preocupação em torno dos disruptores endócrinos (EDs). A exposição a estes químicos pode causar disfunções ou anormalidades dos órgãos reprodutivos, conduzindo à infertilidade. Um dos EDs, conhecido por ser ubíquo no meio ambiente é o bisfenol A (BPA). Este é um dos químicos mais produzidos a nível mundial (produção anual superior a 3 milhões de toneladas), sendo utilizado em larga escala na produção de plásticos de policarbonato e resinas. Encontra-se em biberões, garrafas de água, revestimentos de recipientes alimentares, selantes dentários, entre outras aplicações. Como resultado, há uma exposição generalizada da população ao BPA. O presente trabalho teve como objectivo realizar uma revisão sistemática da literatura sobre os mecanismos fisiopatológicos envolvidos nos efeitos do BPA na estrutura e função testicular. As principais conclusões encontradas foram que a exposição ao BPA induz stress oxidativo e apoptose excessiva, tem efeitos transgeracionais, e efeitos mutagénicos nas células germinativas masculinas, diminui a síntese de androgénios, pode actuar como agonista estrogénico, interfere com o eixo hipotalâmico-pituitária-gonadal, e induz perturbações nas proteínas de junção das células de Sertoli, pondo em risco a fertilidade masculina. Os estudos em humanos mostraram que a exposição ao BPA estava associada a alterações dos níveis hormonais nos homens, diminuição da qualidade do esperma, e aumento da lesão do ácido desoxirribonucleico do esperma. Foi também demonstrado que a exposição ao BPA no local de trabalho eleva o risco de disfunção sexual masculina, que se traduz por uma redução da libido, dificuldade na erecção e na ejaculação, e reduzida satisfação com a vida sexual. No entanto, são necessários mais estudos para obtenção de dados mais consistentes, revelando assim, a real influência da exposição ao BPA na fertilidade masculina. Tendo em conta o exposto neste trabalho, é aconselhável a tomada de medidas, que visem a substituição do BPA por componentes inócuos para a saúde humana, assim como a restrição da sua utilização com regras bem definidas sobre os níveis de exposição.
Infertility is a condition that currently affects 15% of couples worldwide, with tendency to increase, and approximately 50% of the cases are attributed to the male partner. As it is known, the spermatogenesis is extremely influenced by external stimuli, and the increasing incidence of reproductive disorders has raised concern about the role of endocrine disrupters (EDs). The exposure to these chemicals can cause dysfunctions or abnormalities of the reproductive organs, leading to infertility. One of the EDs, known to be ubiquitous in the environment is bisphenol A (BPA). This is one of the most produced chemicals in the world (more than three million tonnes of it are produced each year), being used extensively in the production of polycarbonate plastics and resins. It is found in baby bottles, water bottles, linings of food containers, dental sealants, among other applications. As a result, there is a widespread exposure of the people to the BPA. This study aimed to perform a systematic literature review about the pathophysiological mechanisms involved in the effects of BPA on testicular structure and function. The main conclusions founded were that exposure to BPA induces oxidative stress and excessive apoptosis, has transgenerational effects, and mutagenic effects in male germ cells, decreases the synthesis of androgens, can act as an estrogen agonist, interferes with the hypothalamic-pituitary-gonadal axis, and induces perturbations in Sertoli cell junctional proteins, endangering male fertility. The studies in humans have shown that exposure to BPA was associated with alterations in hormone levels in men, decreased sperm quality, and increased deoxyribonucleic acid damage in sperm. It was also shown that BPA exposure in the workplace increases the risk of male sexual dysfunction, which translates into a reduction of libido, difficulty in erection and ejaculation, and reduced satisfaction with sex life. However, further studies are needed to obtain more consistent data, revealing this way, the real influence of BPA exposure on male fertility. Taking into account what it was exposed in this work, it is advisable to take measures, aimed at replacing the BPA by harmless components to human health, as well as the restriction of its use with well-defined rules about the exposure levels.

Metabolic diseases, such as obesity, stand as one of the greatest challenges of the 21st century. Obesity in reproductive-age men has risen and is expected to continue to increase. In an inverse direction, fertility is decreasing in those men and it largely contributes for the high demand of fertility treatment by couples in modern societies. The male factor alone or in combination with female factor is present in 1/3 of the couples seeking for fertility treatment. In fact, sperm parameters are on a downward spiral during the last decades reaching worrying levels. In overweight and obese individuals, there is a hormonal dysfunction, particularly in leptin levels that are heavily increased. Besides the well-described functions at the hypothalamic level, leptin acts in several peripheral tissues. Although leptin has been on spotlight since its discovery, its effects in the male reproductive tract, particularly on Sertoli cells (SCs), remain unknown. More recently, leptin has shown the ability to modulate mitochondrial dynamics, biogenesis and functioning in several cellular systems, including cancer cells. Herein, we studied the effects of leptin in the proliferation and metabolic activity of rat Sertoli cells (rSCs). We also evaluated the effects of leptin in mitochondria physiology, particularly in the levels of mitochondrial complexes, messenger RNA (mRNA) levels of mitochondrial biogenesis markers and mitochondrial membrane potential. For comparative purposes, and taking in consideration previous results from the group, we also studied the effects of leptin in mRNA levels of mitochondrial biogenesis markers and mitochondrial complexes in human Sertoli cells (hSCs). Our results suggest that leptin modulates the metabolic activity and mitochondrial function in rSCs after exposure to a concentration of 50 ng/mL, which mimics a concentration found in morbidly obese men. These findings suggest that high concentrations of leptin, such as those found in morbidly obese individuals, modulate mitochondrial function in rSCs, which could represent a novel mechanism through which leptin contributes to obesity-induced subfertility or infertility in males. Interestingly, leptin exposure had no effect in several aspects of mitochondria physiology, such as mRNA levels of mitochondrial biogenesis markers and levels of mitochondrial complexes which further indicates that leptin seems to affect mitochondrial function. In hSCs, the mRNA levels of Sirtuin 1 (SIRT1) presented changes in the group treated with 50 ng/mL of leptin. Protein levels of mitochondrial complex II presented changes in the groups treated with 5 and 50 ng/mL of leptin while in rSCs no differences were observed. Thus, rSCs and hSCs seem to be differently affected by leptin exposure. These differences, particularly in SIRT1 mRNA levels, are species-dependent and may represent a novel mechanism through which leptin affects the metabolic control of spermatogenesis and thus, with implications in hSCs.
As doenças metabólicas, entre elas a obesidade, são um dos grandes desafios do século XXI. A incidência da obesidade em indivíduos do sexo masculino em idade reprodutiva tem vindo a aumentar, e as previsões indicam que esta tendência se irá manter. Na direção oposta está o decréscimo dos parâmetros de fertilidade destes indivíduos, o que se tem vindo a refletir no aumento da recorrência de casais a clínicas de fertilidade. O fator masculino de forma isolada ou em conjunto com o fator feminino está presente em um terço dos casais que procuram tratamentos de fertilidade. Desta forma, não é surpreendente a queda abrupta dos parâmetros espermáticos que se tem vindo a verificar nas últimas décadas, atingindo valores preocupantes. Os indivíduos com excesso de peso e obesos apresentam uma disfunção hormonal, relacionada principalmente com a presença de valores elevados de leptina. Além das funções já descritas a nível hipotalâmico, esta hormona apresenta diversas funções em tecidos periféricos. No entanto, apesar de já ter sido descoberta há duas décadas, os seus efeitos no trato reprodutor masculino, principalmente nas células de Sertoli, continuam por desvendar. Recentemente, diversos estudos demonstraram a capacidade da leptina de modular as dinâmicas mitocondriais, incluindo a sua biogénese e funcionamento em vários sistemas celulares, incluindo células cancerígenas. Neste trabalho, estudamos o efeito da leptina na proliferação e atividade metabólica das células de Sertoli de rato. Também avaliamos os efeitos da leptina na fisiologia mitocondrial, particularmente nos níveis dos complexos mitocondriais, níveis de ARN mensageiro (mRNA) de genes envolvidos na biogénese mitocondrial e o potencial mitocondrial de membrana. Para efeitos comparativos, e tendo em conta resultados prévios do nosso grupo, também avaliamos os efeitos da leptina nos níveis de mRNA de genes envolvidos na biogénese mitocondrial e nos níveis dos complexos mitocondriais em células de Sertoli humanas. Os nossos resultados indicam que a leptina modula a atividade metabólica e função mitocondrial nas células de Sertoli de rato na concentração de 50 ng/mL, uma concentração que está presente em indivíduos com obesidade mórbida. Estes resultados sugerem que altas concentrações de leptina, como esta que é encontrada nestes indivíduos, modula a função mitocondrial nas células de Sertoli de rato o que pode representar um mecanismo novo através do qual a leptina contribui para a subfertilidade e infertilidade induzida pela obesidade em indivíduos do sexo masculino. No entanto, a exposição à leptina não teve efeito em vários parâmetros da fisiologia mitocondrial. Os níveis de mRNA de genes envolvidos na biogénese mitocondrial e os níveis dos complexos mitocondriais não apresentaram alterações, o que fortalece a hipótese de que a leptina modula a função mitocondrial e não a sua fisiologia. Nas células de Sertoli humanas, os níveis de mRNA da Sirtuina 1 (SIRT1) apresentaram alterações no grupo exposto a uma concentração de 50 ng/mL de leptina. Os níveis proteicos do complexo mitocondrial II também apresentaram alterações no grupo exposto às concentrações de 5 e 50 ng/mL, ao passo que nas células de Sertoli de rato isto não se verificou, o que indica que existem respostas à leptina nas células de Sertoli que são dependentes da espécie. Estas diferenças, principalmente nos níveis de mRNA da SIRT1, podem representar um mecanismo novo através do qual a leptina afeta o controlo metabólico da espermatogénese, com possíveis consequências nas células de Sertoli humanas.

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2018
A infertilidade afeta cerca de 10 a 15% dos casais em idade fértil, dos quais uma parte não encontra na Procriação Medicamente Assistida (PMA) uma solução eficaz, o que põe em evidência a necessidade de serem encontradas novas abordagens terapêuticas. Neste contexto, surgiu a gametogénese in vitro (GIV), enquanto uma técnica inovadora que promete criar gâmetas totalmente fora do corpo humano, a partir de células estaminais pluripotentes. Para além de permitir obter gâmetas com a mesma informação genética do indivíduo infértil, várias outras vantagens tornam este conceito potencialmente aliciante. Este trabalho pretendeu rever a literatura acerca deste tema, de forma a compreender o estado da arte e a aplicabilidade clínica da GIV. Nos últimos anos, alguns progressos foram conseguidos, nomeadamente a recriação in vitro da oogénese e da espermatogénese em ratinhos, com posterior obtenção de descendência saudável e fértil. Em modelo humano também foi demonstrada a obtenção de células haploides, cuja fertilização não foi testada. Apesar destas conquistas, o perfil de segurança dos protocolos é uma preocupação e muitas limitações permanecem por ultrapassar. Deste modo, adivinha-se ainda um longo caminho a percorrer antes que a GIV possa chegar à clínica.
Infertility affects about 10 to 15% of couples of reproductive age and some do not find an effective solution through Assisted Reproductive Technology, which highlights the need to find new therapeutic approaches. Considering this scenario, in vitro gametogenesis (IVG) appears as an innovative technique that might permit the creation of gametes outside the human body, using pluripotent stem cells. Besides the generation of gametes with the same genetic information of the infertile patient, several other advantages make this concept potentially attractive. This work aimed to review the literature on this subject, in order to understand the state of the art and the clinical applicability of IVG. In the last decade, some progress has been accomplished, in particular the in vitro recreation of both oogenesis and spermatogenesis in mice, with the subsequent generation of healthy and fertile offspring. In the human model, the derivation of haploid cells was also demonstrated, however these cells’ fertilization capacity wasn’t tested. Despite these recent achievements, the security profile of protocols is a concern and many limitations need to be overcome. Thus, one can guess a long way to go before IVG can reach the clinic.

Diabetes mellitus (DM) is a pandemic metabolic disease that affects an enormous amount of males at a very early age. It is a leading cause of morbidity and mortality, in both developed and in developing countries. Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is responsible for the vast majority of DM cases. It comprises individuals who present insulin resistance and relative insulin deficiency. Unlike type 1 diabetes mellitus (T1DM), the main triggering factor of T2DM seems to be the new lifestyle of modern societies rather than genetic factors. The process of production of viable spermatozoa is strictly regulated and dependent of several factors. Any alterations in this process may result in fertility problems in the male. The developing germ cells are dependent on the metabolic cooperation established with the Sertoli cells (SCs), being reliant on the lactate produced by these testicular somatic cells, as energy source. Of the various antidiabetics available in the market, a number of them have a direct action in the individual metabolic homeodynamics. However, its mechanisms of action are different and vary dependent on several factors (e.g. tissue or target cells). In this work, we evaluated the effect of two antidiabetic drugs, pioglitazone and metformin, in human Sertoli cell metabolism (hSCs). Our results suggest that, like metformin, pioglitazone may be a suitable antidiabetic drug for young men and those in reproductive age. These novel findings suggest a possible protective role of pioglitazone to male reproductive function.
A diabetes mellitus (DM) é uma doença metabólica que está a atingir proporções pandémicas, afetando um elevado número de homens numa idade muito jovem. É uma das principais causas de morbilidade e mortalidade em países desenvolvidos e em desenvolvimento. A diabetes mellitus tipo 2 (T2DM) é responsável pela grande maioria de casos de DM. Compreende indivíduos que apresentam resistência à insulina e uma relativa deficiência na secreção de insulina. Ao contrário da diabetes mellitus tipo 1 (T1DM), o principal fator para o desenvolvimento da doença parece ser o estilo de vida das sociedades modernas em vez de fatores genéticos. O processo de produção de espermatozóides viáveis é altamente regulado, dependente de diversos fatores, e qualquer alteração pode resultar em problemas de fertilidade no homem. Entre outros aspectos, as células germinativas são dependentes da cooperação metabólica que estabelecem com as células de Sertoli (SCs), que mostrou ser essencial para a ocorrência da espermatogénese. Dos diferentes antidiabéticos disponíveis no mercado, vários têm uma ação na homeodinâmica metabólica do indivíduo. Contudo, os seus mecanismos de ação são distintos e variam dependendo de diversos fatores (p. ex. tecido ou células alvo). Neste trabalho, avaliámos o efeito de dois antidiabéticos, a pioglitazona e a metformina, no metabolismo de células de Sertoli humanas (hSCs). Os nossos resultados sugerem que, tal como a metformina, a pioglitazona é um antidiabético adequado para homens em idade reprodutiva. Para além disso, os resultados obtidos neste trabalho levam-nos a sugerir um possível papel protetor da pioglitazona na função reprodutiva masculina.

As células de Sertoli (SCs) possuem a capacidade fenomenal de fornecerem fatores de crescimento e nutrientes às células da linha germinativa. Apesar de consumirem vários tipos de substratos, incluindo aminoácidos como a glutamina, as SCs preferencialmente metabolizam glucose. Ao fazê-lo, estas células produzem grandes quantidades de lactato, aquele que é considerado pela maioria dos autores, o substrato preferencial das células germinativas. A Regucalcina (RGN) é uma proteína de ligação ao cálcio expressa nas SCs e que estudos anteriores associaram à regulação do metabolismo celular. Neste trabalho, avaliou-se a metabolização de glucose e glutamina nas SCs de ratos transgénicos que sobre expressam regucalcina (Tg-RGN) e dos seus homólogos wild-type (Wt). Dos testículos destes animais procedeu-se ao isolamento de SCs primárias, que foram mantidas em cultura durante 24 horas. No final deste período experimental foram analisados vários parâmetros metabólicos, tais como a expressão proteica e atividade de vários intervenientes na glicólise e glutaminólise. Observou-se que, apesar de consumirem menos glucose, as SCs dos animais Tg-RGN produzem e exportam mais lactato. Estas observações foram concomitantes com o aumento da expressão de alanina aminotransferase e com o aumento da taxa de consumo/oxidação de glutamina, o que sugere a existência de vias alternativas à glucose a contribuirde forma significativa para o aumento da produção de lactato nas SCs dos ratos Tg-RGN. Os resultados obtidos demonstram um metabolismo distinto das SCs entre ratos Wt e Tg-RGN, o que alarga o espectro das possíveis funções da RGN ao nível da espermatogénese. Para além disso, as observações registadas demonstram a enorme plasticidade do metabolismo das SCs, uma característica que pode ser de extrema relevância no contexto da fertilidade masculina.
Sertoli cells (SCs) possess the outstanding capability to provide the germ line with growth factors and nutrients. Despite consuming several types of substrate, including amino acids such as glutamine, SCs preferentially metabolize glucose. By doing so, SCs produce high amounts of lactate, the substrate considered by most authors as the preferred of germ cells. Regucalcin (RGN) is a calcium binding protein expressed in the SCs that has been previously associated to the regulation of cell metabolism. On this dissertation we have evaluated glucose and glutamine handling in the SCs of transgenic rats overexpressing regucalcin (Tg-RGN) and their wild-type (Wt) homologous. Primary SCs were isolated from adult Wt and Tg-RGN animals and maintained in culture for 24 hours. Afterwards, several metabolic parameters, such as the protein expression of several metabolic intervenients, were analysed. We have observed that, despite consuming less glucose, the SCs of Tg-RGN animals produce and export more lactate. These observations were underpinned by increased expression of alanine transaminase and augmented rates of glutamine consumption/oxidation, which suggests the existence of alternative routes to glucose that significantly contribute to the available lactate pool in the SCs of Tg-RGN rats. The results obtained clearly present a completely distinct metabolic profile between the SCs of Tg-RGN and Wt animals, which widens the roles that RGN is likely to play in the control of spermatogenesis. Moreover, the registered observations display the enormous plasticity of SCs’ metabolism, a capacity that might be of extreme relevance in the context of male fertility.

Spermatogenesis is the complex biological process that transforms spermatogonial stem cells into spermatozoa, and, thus, is the basis of male fertility. It takes place in the seminiferous tubules (SeT) and is highly dependent on the metabolic cooperation established between the somatic Sertoli cells (SCs) and germ cells. SCs are known as the metabolic stores supplying germ cells with adequate amounts of energy substrates. Despite consuming several subtracts, including amino acids like glutamine, SCs prioritize the metabolization of glucose with the production of lactate, the preferred substrate of germ cells. It is widely known that oxidative stress (OS) adversely affects spermatogenesis, disrupting the development of germ cells, and interfering with sperm function, as well as disturbing cell metabolism. Tert-Butyl hydroperoxide (TBHP) is a well-known OS inducer in the testis. Also, TBHP metabolic action have been suggested. It was identified as a regulator of the pentose phosphate pathway. However, the impact of TBHP in testicular metabolism remains unknown. Regucalcin (RGN) is a calcium (Ca2+) -binding protein that has been associated with the control of cell proliferation, apoptosis, OS and metabolism. Recently, our research group have demonstrated that RGN overexpression modulates glucose and glutamine handling by SCs by regulating the expression of several transporters and enzymes involved in glycolysis and glutaminolysis. Furthermore, the protective role of RGN for the germ cell population upon exposure to damaging factors has been suggested. So, is tis liable to hypothesize that RGN may have a similar behavior against TBHP actions disrupting testicular metabolism. In the present dissertation, the impact of TBHP on testicular glucose and glutamine metabolism and the influence of RGN in attenuating its effects were evaluated. Isolated SeT from adult wild-type (Wt) and transgenic rats overexpressing regucalcin (Tg-RGN) were maintained in culture for 24 hours in the presence or absence of TBHP (250 µM). After that, the expression and activity of several regulators of glycolytic metabolism and glutaminolysis were analysed. The results obtained showed an increase in the intracellular content of glucose and lactate in the SeT of both Wt and Tg-RGN animals treated with TBHP. The altered glycolytic profile in response to TBHP was underpinned by the altered expression of glucose transporters in both Wt and Tg-RGN, and increased lactate dehydrogenase activity in the Tg-RGN rats. Moreover, TBHP altered alanine transferase expression and glutaminolysis though the effects differed between Wt and Tg-RGN animals. In turn, RGN overexpression suppressed the glycolytic metabolism in SeT, regardless of TBHP treatment. The present study is the first evidence that TBHP is a potent testicular metabolic disruptor. Furthermore, RGN action was identified as a possible protective mechanism against the damaging effects of TBHP. These findings also emphasize the role of RGN as a metabolic regulator in spermatogenesis, which could have importance in the context of male (in)fertility. Finally, the outcomes achieved herein support further research work to deep clarify the relationship between OS, metabolic alterations and the RGN actions in the SeT.
A espermatogénese é o processo biológico complexo que transforma as células estaminais espermatogoniais em espermatozoides, sendo, por esse motivo, a base da fertilidade masculina. Este processo ocorre nos túbulos seminíferos (SeT) e é altamente dependente da cooperação metabólica estabelecida entre as células somáticas, as células de Sertoli (SCs), e as células germinativas. As SCs são conhecidas por serem as reservas metabólicas que fornecem as quantidades adequadas de substratos energéticos às células germinativas. Apesar de consumirem diversos substratos, incluindo aminoácidos como a glutamina, as SCs metabolizam preferencialmente glucose produzindo lactato, sendo este último o substrato de eleição das células germinativas. É amplamente reconhecido que o stresse oxidativo (OS) afeta adversamente a espermatogénese, desregulando o desenvolvimento das células germinativas, e interferindo com a função espermática, assim como perturbando o metabolismo celular. Sabe-se que o hidroperóxido de tert-butilo (TBHP) é um indutor de OS ao nível testicular. Para além disso, foi sugerida uma ação metabólica para este composto, tendo sido identificado como um regulador da via das pentoses-fosfato. No entanto, o impacto do TBHP no metabolismo testicular permanece desconhecido. A regucalcina (RGN) é uma proteína de ligação ao cálcio (Ca2+) que tem vindo a ser associada ao controlo da proliferação celular, apoptose, OS e metabolismo. Recentemente, o nosso grupo de investigação demonstrou que a sobre-expressão de RGN modula a metabolização da glucose e da glutamina nas SCs através da regulação da expressão de vários transportadores e enzimas envolvidos na glicólise e na glutaminólise. Além disso, o papel protetor da RGN para a população de células germinativas quando expostas a fatores nocivos tem vindo a ser sugerido. Desta forma, é sensato levantar a hipótese que a RGN possa ter um comportamento semelhante contra as ações desreguladoras do TBHP no metabolismo testicular. Na presente dissertação foi avaliado o impacto do TBHP no metabolismo testicular da glucose e da glutamina, bem como a influência da RGN na atenuação dos seus efeitos. Para tal, procedeu-se ao isolamento de SeT de ratos transgénicos que sobre-expressam a RGN (Tg-RGN) adultos e dos seus homólogos selvagens (Wt), os quais foram mantidos em cultura durante 24 horas na presença ou ausência de TBHP (250 µM). Posteriormente, a expressão e a atividade de diversos reguladores do metabolismo glicolítico e da glutaminólise foram analisados. Os resultados obtidos mostraram um aumento no conteúdo intracelular de glucose e de lactato nos SeT quer dos animais Wt quer dos animais Tg-RGN tratados com TBHP. O perfil glicolítico alterado em resposta ao TBHP foi sustentado pela expressão alterada de transportadores de glucose nos animais Wt e Tg-RGN, e pelo aumento da atividade da lactato desidrogenase nos ratos Tg-RGN. Além disso, o TBHP alterou a expressão de alanina transferase e a glutaminólise, embora os efeitos tenham diferido entre os animais Wt e Tg-RGN. Por sua vez, a sobre-expressão da RGN suprimiu o metabolismo glicolítico nos SeT, independentemente da exposição ao TBHP. O presente estudo é a primeira evidência que o TBHP é um potente desregulador metabólico testicular. Para além disso, a ação da RGN foi apontada como um possível mecanismo protetor contra os efeitos nocivos do TBHP, enfatizando o papel da RGN como um regulador metabólico na espermatogénese, o que poderá ter importância no contexto da (in)fertilidade masculina. Por fim, as observações aqui alcançadas servem de suporte a trabalho de investigação futuro para clarificar profundamente a relação entre OS, alterações metabólicas e as ações da RGN nos SeT.