Dissertations / Theses on the topic 'Fàrmac'

Posar al mercat un nou fàrmac és un procés molt llarg i costós i que comporta un risc econòmic important per una empresa farmacèutica. En canvi, el desenvolupament d'un procediment millorat per a la producció d'un fàrmac ja conegut, un cop ha passat a ser genèric, és molt menys arriscat i genera propietat industrial valuosa i una possibilitat de negoci. El desenvolupament d’una nova ruta implica fomentar la innovació i la millora continuada en els processos de fabricació augmentant la competitivitat en els plans de producció, el que exigeix un coneixement exhaustiu i científic dels processos de fabricació. L’objectiu del present Projecte, en col·laboració amb Esteve Química, és el desenvolupament de rutes sintètiques potencialment patentables i industrialitzables d'un antivíric d’interès (o bé d'un intermedi avançat d'aquest) i d’un producte utilitzat per a malalties d’insuficiència cardíaca que es trobin ja en el mercat o en fases clíniques molt avançades. A la primera part d’aquest treball l’objectiu ha estat el desenvolupament de rutes sintètiques per a l’obtenció d’un fragment present en alguns antivírics. Es van explorar fins a sis rutes diferents per a arribar a l’estructura d’interès. S’ha trobat una aproximació sense precedents basada en la doble alquilació estereoselectiva de les imines de glicinats en condicions de transferència de fase. Hem aconseguit arribar a l’estructura desitjada amb un rendiment global del 29%. Tot i els bons resultats obtinguts, la síntesi desenvolupada no és clarament competitiva respecte a la alternativa descrita a la bibliografia, ja que, tot i que té millors rendiments i conté etapes fàcilment millorables en els processos d'escalat, els materials de partida resulten ser més cars. A la segona part d’aquest treball s’ha afrontat l’objectiu d’obtenir un compost utilitzat en el tractament de la insuficiència cardíaca, utilitzant una amida derivada de la pseudoefedrina com a etapa clau de la síntesi. Vam arribar a l’estructura d’interès en 5 etapes i amb un rendiment global del 14%, però la etapa clau del procés donà resultats irregulars i excessos diastereomèrics discrets. Aquests resultats podrien ser millorables, si es dugués a terme un estudi més exhaustiu de la reacció d’alquilació. La síntesi proposada per aquest compost és nova i patentable i probablement competitiva respecte als resultats que hi han descrits fins al moment a la bibliografia. En general, doncs, es pot dir que, en les dues parts d’aquests treball s’ha arribat als productes desitjats, a través de nous processos, amb rendiments del rang dels descrits a la bibliografia. Tot i això, la viabilitat industrial no està assegurada i són necessaris estudis més profunds i l’optimització d’algunes etapes.
The aim of this project, in collaboration with Esteve Química is the development of potentially patentable and industrializable synthetic routes to an antiviral (or an advanced intermediate of it) and a drug used for diseases of heart failure. Both compounds are already on the market or in very advanced clinical stages. In the first part of this work the aim has been the development of synthetic routes to get a fragment present in some antivirals or an advanced intermediate thereof. We explored up to six different routes to afford the structure of interest. The more interesting has been an approach based on unprecedented stereoselective double alkylation of N-(diphenylmethylene)glycine tert-butyl ester under phase transfer conditions. We managed to reach the desired structure with a global yield of 29%. Despite the good results, this approach seems not competitive with report to the previous method described in the literature because, although it has better yields and contains easily improved stages in the scaling processes, the starting materials are more expensive. In the second part of this work we have faced the goal of obtaining a compound used in the treatment of heart failure, based on an alkylation reaction with a pseudoephedrine derivative amide as a key step of the synthesis. We got the structure of interest in five stages and an overal yield of 14%, but the key stage of the process gave erratic results and discrete diastereomeric excesses . These results could be improved if it carried out an exhaustive study of the alkylation reaction. Thus, the synthesis proposed would probably be competitive with respect to the results that have so far described in the literature. In general, we can say that in the two parts of this work has reached the desired products through new processes, yields range from those described in the literature. However, the industrial viability is not assured and deeper studies and some optimization stages are needed.

L'objectiu principal d'aquesta Tesi doctoral ha estat l’obtenció d’una via alternativa a les existents per a l'obtenció d'un intermedi clau, 1, en la síntesi d'un fàrmac anticoagulant. La nova via havia de ser novedosa i patentable per tal de poder obtenir el producte industrialment. Així doncs inicialment es va fer una cerca bibliogràfica per tal de conèixer els precedents sintètics existents i a partir d'aquests es van proposar una sèrie d’objectius més concrets: una primera aproximació per tal de sintetitzar el ciclohexà central de 1, una altra basada en una reacció de iodolactamització per tal de tenir un dels nitrògens del sistema cis-diamino ja introduït i una tercera basada en una aziridina com a intermedi clau tenint en aquest cas tambè ja un dels nitrògens presents en la molècula. La primera aproximació es basava en una reacció Diels-Alder com a etapa clau per a formar el ciclohexà central de la molècula objectiu. Tot i arribar a un intermedi força avançat, no es va poder arribar a producte final i es va haver de descartar aquesta aproximació. La segona via que es va provar consistia en una reacció de iodolactamització com a etapa clau seguida de la formació del derivat de Boc. A partir d’aquest intermedi es van proposar vàries alternatives per a substituir l’àtom de iode i introduir el segon nitrogen a la molècula, ja fos directament amb amoníac per exemple, o a travès d’un equivalent sintètic del grup amina com podia ser l’azida o bè el grup ftalimida. Tambè es va provar de formar intermedis tipus urea amb isocianats i introduïr així el segon nitrogen de l’anell de sis baules intramolecularment. Malauradament cap d’elles va permetre arribar a obtenir el producte objectiu 1 així que es va passar a estudiar la darrera aproximació. La tercera via proposada passava per un intermedi clau aziridínic que es formava per reacció d’una olefina amb una sulfamida amb catàlisi de rodi. Desprès de provar la reacció principal a partir de diferents substrats, es va trobar un intermedi de tipus lactona inesperat però que va ser clau en aquesta aproximació. Seguint una sèrie de reaccions senzilles partint de la lactona es va arribar a obtenir 1. Així doncs es va assolir l’objectiu d’obtenir una via per tal d’obtenir 1. Malaurdament degut a una reivindicació d’una patent que protegeix l’últim intermedi de la síntesi i la transformació d’aquest a 1, no serà possible sintetitzar industrialment 1 seguint aquest nou procès obtingut. Tot i això, es va decidir seguir les reaccions de l’aproximació que havia permès obtenir 1, però variant el grup dimetilamida per altres grups alternatius. Es va pensar en formar èsters activats amb el 2,2,2-trifluoroetanol, el fenol i la N,N- dietilhidroxilamina. Aquesta estratègia permetria arribar a obtenir la molècula objectiu però sense infringir la patent ja que, en la darrera etapa, seria on s’introduiria el grup dimetilamida de manera que no es passaria per l’intermedi reivindicat. Malauradament, amb cap dels grups alternatius utilitzats es va aconseguir arribar a l’objectiu degut a la formació d’ intermedis tipus aziridina, els quals no es van poder transformar a la sulfamida bicíclica desitjada de cinc baules.
The main objective of this Thesis was to obtain a novel and alternative route to the existing key intermediate 1 in the synthesis of an anticoagulant drug. The new approach had to be innovative and patentable in order to produce the product industrially. First of all, we searched in the literature the existing synthetic precedents and from these we proposed a series of more specific objectives: a first approach to synthesize the central cyclohexane, another based on a iodolactamization reaction, having one of the nitrogens in the cis-diamino system already introduced, and a third approach based on aziridine as a key intermediate, in this case it has also already one of the nitrogens present in the molecule. The first approach was based on a Diels-Alder reaction as a key step to form the central cyclohexane target molecule. Despite reaching an advanced intermediate, this approach failed to reach the final product and had to discard it. The second route that was tested had a iodolactamization reaction as a key step and followed the synthesis of the Boc derivative of this product . From this intermediate we proposed several alternatives to replace the iodine atom and introduce the second nitrogen in the molecule, either directly with ammonia for example, or through a synthetic equivalent of the amino group for example with an azide or a phthalimide group. We also tried to form an urea intermediate with isocyanate and thus insert the second nitrogen in the six member ring intramolecularly. Unfortunately none of the methods allowed us to arrive at the desired product so we kept on studying the latest approach. The third proposed route passes through a key aziridine intermediate that was formed by the reaction of an olefin with a sulfamide using rhodium catalysts. After testing the main reaction from different substrates, we found a lactone intermediate which was key in this approach. Following a series of simple reactions starting from the lactone we get the objective molecule 1. The main objective was achieved, unfortunately, due to a claim of a patent that protects the last intermediate synthesis and transformation of this to 1, it will not be possible to synthesize 1 industrially following this new process. However, we decided to follow the reactions of the approach that had yielded 1, but varying the dimethylamide group to other alternative groups. We thought about forming activated esters with 2,2,2-trifluoroethanol, phenol and N,N- diethylhydroxylamine. This strategy would reach the target molecule obtained without infringing the patent because it was in the last stage, where it would introduce the dimethylamide group so the route would not pass through the intermediate claimed.

Els sistemes de separació mitjançant membranes han guanyat importància com a tècniques de separació enantiomèrica. S'han investigat distintes configuracions de membranes.
Per a la separació enantiomèrica de SR-propranolol, fàrmac usat per al tractament d'algunes anomalies cardiovasculars, s'han estudiat diferents transportadors selectius: N-alquil-hidroxiprolines i dialquil tartrats en membranes líquides, i el norbornadiè com a polímer quiral. Malgrat tots aquest sistemes mostraven resultats prometedors, cap d'ells ha estat investigat detalladament.
La finalitat d'aquesta tesi ha consistit a desenvolupar i caracteritzar diferents sistemes de membrana per a la separació del fàrmac SR-propranolol. S'han investigat quatre sistemes distints de membranes: membranes líquides suportades (SLM), membranes compòsit activades (ACM), membranes activades quirals (CAM) i membranes basades en polisulfona quiral (CPS). En la majoria dels casos s'ha emprat com a transportador selectiu l'N-hexadecil-L-hidroxiprolina (HHP).
L'estudi i la caracterització de cada sistema s'ha dut a terme mitjançant tècniques microscòpiques i experiments de transport usant quatre mòduls de membrana diferents: una cel·la de diàlisi, un mòdul micro espiral , un mòdul que permet el modelatge del transport i un mòdul de filtració frontal.
L'estudi del sistema de SLM va permetre elucidar els dos mecanismes de transport implicats en aquest sistema de separació, així com discriminar els principals paràmetres que governen (en termes de flux i selectivitat) el comportament del sistema de membranes. En condicions òptimes de treball (fase de càrrega ajustada a pH 8 i concentració de transportador de C/A = 3) es va detectar un excés enantiomèric del 5.6%.
Les membranes compòsit activades, formades per una capa porosa de polisulfona pel·liculada sobre un paper no teixit, i una capa densa superficial de poliamida, foren caracteritzades mitjançant distintes tècniques: microscòpia de força atòmica, transport de soluts, mesures d'angle de contacte, ressonància electrònica d'espí, i microscòpia electrònica d'escombratge. L'ús d'aquestes tècniques complementàries va permetre obtenir informació de la morfologia interna i superficial de les membranes, i alhora va confirmar la presència de transportador a l'interior de les membranes. Tot i així, al ser aplicades per a la separació enantiomèrica de propranolol no es va observar transport enantioselectiu.
Les CAM, formades per un capa porosa de polisulfona pel·liculada sobre un paper no teixit, si que van permetre el transport enantioselectiu del fàrmac d'estudi. En aquest cas es va estudiar la influència sobre el sistema de la concentració de transportador selectiu en la membrana i del valor de pH de la solució receptora. L'estudi va revelar la relació entre el flux i la enantioselectivitat i va contribuir a proposar les preferències d'afinitat del transportador vers ambdós enantiòmers del fàrmac propranolol. Els bons resultats van esperonar el desenvolupament d'un nou sistema de membranes CAM emprant didodeciltartrat com a transportador selectiu. La comparació dels dos sistemes de CAM es va dur a terme mitjançant el modelatge del transport ambdós enantiòmers implicats. Els resultats mostraren que el segon sistema posseeix millors propietats per al transport enantioselectiu de propranolol.
Per últim es van investigar les membranes basades en polisulfona quiral, que contenen el selector quiral enllaçat covalentment a la matriu polimèrica. La polisulfona fou derivatitzada seguint dues rutes sintètiques distintes, i van obtenir-se dos productes diferents: CPSA i CPSB. Ara bé, sols la CPSA va resultar adequada com a polímer. Les membranes obtingudes a partir de CPSA van ser caracteritzades. L'aplicació d'aquest tipus de membranes van donar lloc a resultats prometedors tan pel que fa al flux com a la enantioselectivitat, i van permetre confirmar la major afinitat del selector per a l'enantiòmer S-propranolol. En aquest cas, quan es va incorporant la quantitat més gran possible de transportador en la membrana es va obtenir un factor de separació de 1,1a les 96h d'experimentació.
Membrane systems have been gaining importance as enatioseparation techniques.
Various membrane configurations, have been proposed to attain enantioseparation. Liquid membrane processes were firstly proposed, however they exhibit a rapid selectivity decrease with operating time and show low stability and short lifetime when tested under industrial separation conditions. Therefore, solid polymeric membranes have also been developed.
For the case of SR-propranolol, a β-blocking drug used for treating certain cardiovascular anomalies different enantioselective carriers have been studied. N-n-alkyl-hydroxyprolines, and dialkyl tartrate were used in liquid membrane configurations, and norbornadiene was considered as chiral polymer. Although all these membrane systems showed promising results, none of them was investigated in detail.
The purpose of the present work was the characterisation and development of membrane systems for the enantioselective separation of SR-propranolol. Four different membrane systems, based in supported liquid membranes (SLM), activated composite membranes (ACM), chiral activated membranes (CAM) and chiral polysulfone (CPS) membranes, have been investigated. In most of them, N-hexadecyl-L-hydroxyproline (HHP) was applied as chiral carrier.
The study and characterization of each membrane type was carried out using microscopy techniques and transport experiments. The latest were conducted with four different membrane modules: a dialysis cell, a micro spiral module, a module capable of well-defining hydrodynamics conditions for transport modelling and a dead-end filtration module.
The study of SLM, permitted the elucidation of the two transport mechanisms involved in these separation systems and allowed discriminating the principal parameters governing the performance of the membrane system, either in terms of flux as in terms of selectivity. Under operating conditions showing the best performance results (feed at pH 8, and carrier concentration up to C/A = 3) a 5.6% of enantiomeric excess was reached.
Activated composite membranes (ACM) consisted of a porous polysulfone support casted on a none-woven fabric, with a top dense polyamide layer. ACM were characterized by different techniques, such as atomic force microscopy, solute transport, contact angle measurements, electron spin resonance, and scanning electron microscopy. The use of all these complementary techniques provided an extensive and concise description of ACM internal and surface morphology, together with the confirmation of the presence of the chiral carrier inside the membranes. However, when applied to the enantioseparation of propranolol enantioselectivity was not observed.
CAM consisted in a porous polysulfone film, also casted on a non-woven fabric. This membrane type permitted the enantioselective transport of propranolol across the membranes. In that case, the influence of carrier concentration in the membrane as well as the striping phase pH were studied. These studies revealed the relationship between transport rate and enantioselectivity and contributed to propose the affinity preferences of the carrier by the two enantiomers. The good results obtained, motivated the development of another CAM system containing the chiral carrier didodecyltartrate. The comparison of the two equivalent systems was carried out by conveniently modelling the transport of both propranolol enantiomers. Results showed that the last system possesses better properties for the enantioseparation of propranolol.
The last type of polymeric membranes assayed were based in chiral polysulfones CPS, containing the chiral carrier covalently bonded to the polysulfone polymeric structure. PS was chiraly derivatised following two different sysnthetic routes, and two corresponding chiral polysulfones were obtained, namely CPSA and CPSB. However when preparing the membranes, only CPSA was suitable as polymer. CPS membranes, obtained from CPSA were prepared and characterised. The application of these polymeric membranes showed promising results regarding both the transport rate and enantioselectivity, and confirmed the higher affinity of the carrier by the S-propranolol enantiomer. In that case, with membranes containing the highest CPSA amount, a separation factor of 1.1 was encountered at 96h of experiment.

Donat el gran volum de fàrmacs que es produeixen, cal preguntar-se què és el que els passa un cop són consumits. Avui dia sabem que els medicaments (o, més concretament, els seus principis actius) són excretats pel cos dʼuna forma inalterada o alterada en major o menor mesura segons la naturalesa química del fàrmac. Aquests medicaments, un cop excretats pel cos, van a parar a les aigües residuals i dʼaquí a les plantes de tractament dʼaigües residuals (PTAR, estacions de depuración dʼaigües residuals, EDAR) abans de ser retornats al medi ambient. És en aquest punt on comença la problemàtica ambiental dels fàrmacs, ja que si bé una part dʼells són degradats, la resta sortiran de les PTAR inalterats per anar a parar al medi ambient. Així, sʼaniran incorporant als diferents compartiments ambientals (aire, aigua, sòl, sediments, sòlids en suspensió, etc.) i per tant representen un possible risc ambiental. El Parlament Europeu estableix els requisits que ha de complir un medicament per poder ésser comercialitzat en qualsevol estat membre de la Unió Europea. Un dels requisits és el de desenvolupar una avaluació del risc ambiental (ARA) que ens permeti caracteritzar el risc dʼuna substància per al medi ambient. El present estudi sʼemmarca en el desenvolupament i lʼaplicació de models de predicción per ajudar en la realització dʼun ARA. Els models desenvolupats els basem en el model de fugacitats descrit per Mackay al 1979 i, a tall dʼexemple, els apliquem als fàrmacs més consumits a lʼestat español. El desenvolupament i lʼaplicació dʼaquest model té dues parts ben diferenciades, una és la part química, en que realitzem tot el desenvolupament matemàtic del model, nʼavaluem la sensibilitat i el validem amb dades experimentals. La segona part consisteix en un análisis documental del procés de recerca dʼinformació seguit, creació dʼun directori de recursos dʼinformació per a químics, discussió de les eines actuals i futures per a la cerca dʼinformaicó química i finalmente, en el desenvolupament dʼuna aplicació informàtica que permet la utilització dʼaquest model per que sigui utilitzat per la industria química alhora de realitzar una avaluació del risc ambiental dʼun contaminant químic. Les conclusions que treiem dʼaquest treball són que els fàrmacs no sʼeliminen completament a les PTAR sinó que van a parar al medi ambient en concentracions que poden produir efectes nocius sobre animals i plantes. De lʼaplicació del ModelS als fàrmacs hem vist que aquestes concentracions no depenen només del consum que seʼn fa: durant lʼanàlisi dels resultats, hem mostrat que alguns fàrmacs (clarithromycin, clopidogrel i sertraline), tot i no estar entre els fàrmacs més consumits, es troben en concentracions elevades al medi ambient. També hem vist que les concentracions dels fàrmacs als diferents compartiments ambientals prenen uns valors de rang que varien, entre les centenes de ng/L quan es tracta dʼaigües properes a PTAR i unes poques unitats de ng/L en les aigües allunyades de les poblacions. Els valors de concentració més grans sʼobtenen per a les concentracions estimades en àmbit local (PECLocal), les dades de les quals sʼhan mesurat a pocs quilòmetres riu avall de fonts emissores (com les PTAR). En aquests casos, les concentracions es troben al voltant dels cent ng/L, i concretament, pels fàrmacs més consumits a lʼestat espanyol com són paracetamol, ibuprofen naproxen, iopromide, erythromycin, diclofenac i ranitidine les concentracions són superiors a 100ng/L. Proposem, doncs, com a sortida dels resultats del present estudi emprar el programa desenvolupat aquí per aplicar el Model, per ajudar-la a dissenyar fàrmacs més benignes per al medi ambient i en concordança amb la directiva vigent. Hem vist que la ciència de la documentació està estretament lligada a qualsevol procés de cerca dʼinformació científica. Que cada cop existeixen més eines que ens permeten fer cerques més acurades dʼinformació, més ràpides i que milloren la Nostra comunicació amb la comunitat científica, i que, per tant, cal que ens mantinguem informats sobre els nous avenços en la cerca dʼinformació.
Due to the high volume of drugs produced in the World, we have to ask ourselves: What happened to drugs when they are consumed? Nowadays we know that medicaments (or more precisely, their active ingredient) are excreted by our body unaltered or in altered forms according to its Chemical nature. Those drugs, alter being excreted by our body, arrive to waste water effluents and from there to waste water treatment plants (WWTP) before being returned to the environment. Is in this point when starts the environmental problematic of drugs, because, even one part of them are degraded in WWTP, the rest will exit the WWTP and will be deposited in the different compartments of the environment. That fact represents a potential risk for the environment. The European Parliament establishes the requirements for a medicament that have to be studied before being commercialized in the European union. One of these requirements is to develop an Environmental Risk Evaluation (ERE), to determine the potential risk of a chemical substance in the environment. This work is focussed in the development and application of prediction models that can help people to perform an ERE. Developed models are based on fugacity models described by MacKay on 1979, and we will use them to the most consumed drugs in the Spanish state. Development and application of this model has to well define parts, in one hand we have the chemistry part, in where we realize all the mathematic development, where we evaluate the sensibility of the model and where we validate the model with experimental data. And, in the other hand, we have realized an analysis of the information research process followed, we have created a directory of information resources for chemists, we have discussed existing and future tools to search information on chemistry and finally we have developed an informaticsʼ application that using the model described could be used by the pharmaceutics industry to realize an ERE of a chemical pollutant. The conclusions that we can extract from this work are that drugs are not eliminated completely in WWTP and they enter the environment and there they can harm animals and plants. From the application of the model to most consumed drugs in Spain we can see that drugs concentrations in environment are not directly related to its consumptions, for example the drugs clarithromycin, clopidogrel and sertraline, that they are present in high concentrations in the environment are not highly consumed. Also we have seen that drugsʼ concentrations in the different ambient compartments take rang values between hundreds of ng/L when they are in waters near to WWTPʼs to few ng/L when they are far from highly populated areas. Biggest concentration values are obtained by the predicted local concentrations (PEC Local), where we consider waters that are few kilometres from WWTPʼs. In this cases concentrations are around 100 ng/L, and in concrete, for most consumed drugs in Spain paracetamol, ibuprofen naproxen, iopromide, erythromycin, diclofenac and ranitidine concentrations are higher than 100ng/L. We recommend the industry to use the program developed in the present work for the design of new chemical compounds more benign to environment and in accordance to European directives. We have also seen that information science is closely related to any scientific research project. Tools to increase our search possibilities are increasing day by day and it is very useful to be updated of new information science discoveries to improve our research performance.

L’ABTL0812 és un derivat lipídic amb activitat antitumoral llicenciat per la companyia biofarmacèutica Ability Pharmaceuticals. En estudis preliminars es va observar que l’ABTL0812 indueix citotoxicitat en un ampli espectre de cèl·lules tumorals humanes i una inhibició del creixement de tumors xenografts derivats de cèl·lules tumorals humanes, propietats que han motivat el seu desenvolupament pre-clínic. A l’actualitat, l’ABTL0812 es troba en Fase Clínica 2 en pacients amb càncer de pulmó escamós i d’endometri avançat (identificador ClinicalTrials.gov: NCT03366480). El nostre laboratori està implicat en caracteritzar el seu mecanisme d’acció antitumoral, utilitzant com a model les cèl·lules MiaPaca2 (adenocarcinoma pancreàtic) i A549 (adenocarcinoma de pulmó). Estudis previs realitzats al laboratori mostren que l’ABTL0812 activa els receptors PPAR i PPAR, que medien en la inducció de mort dependent d’autofàgia sense induir l’aparició de trets típicament apoptòtics. En aquesta Tesi Doctoral, mitjançant assajos de gen reporter luciferasa, quantificació de mRNA per RT-qPCR i assaig d’immunoblot, demostrem que l’activació dels receptors PPAR/ indueix l’activació transcripcional de la pseudoquinasa TRIB3. Una vegada sobre-expressada, TRIB3 uneix Akt i impedeix la seva activació per les quinases activadores PDK1 i mTORC2. Com a conseqüència d’això, s’inhibeix el complex mTORC1. Tanmateix, s’ha constatat que la inhibició del complex mTORC1 a les cèl·lules tumorals humanes MiaPaca2 i A549 no és suficient per induir una autofàgia robusta anàloga a l’observada per l’ABTL0812. Aquest fet va motivar l’estudi sobre si l’estrès reticular podia estar relacionat amb la sobre-expressió de TRIB3 i la mort cel·lular mediada per autofàgia induïdes per l’ABTL0812, tal com s’ha proposat per altres composts anti-tumorals com el tetrahidrocannabinol. En aquest treball hem observat que l’ABTL0812 indueix dilatació del reticle endoplasmàtic i la sobre-expressió dels marcadors d’estrès reticular BiP, ATF4 i CHOP. En conjunt, aquests resultats demostren la inducció d’estrès reticular per part de l’ABTL0812. El bloqueig farmacològic de l’estrès reticular mostra preliminarment que l’estrès reticular media en la citotoxicitat induïda per l’ABTL0812. D‘interès, s’ha posat a punt la quantificació dels nivells de mRNA plasmàtics dels marcador d’estrès reticular CHOP i TRIB3, tant en mostres de sang total com a PBMCs purificades, i s’ha constatat que augmenten en els pacients humans en resposta al tractament amb ABTL0812. En l’actualitat, aquests biomarcadors farmacodinàmics s’estan utilitzant a la Fase Clínica 2. L’anàlisi per espectrometria de masses de l’esfingolipidoma de cèl·lules tumorals ha permès observar que l’ABTL0812 indueix l’acumulació de dihidroceramides de cadena llarga, sense alterar els nivells de ceramides. Aquest esdeveniment s’explica pel fet que la incubació amb ABTL0812 resulta en la inhibició de l’enzim desaturasa-1 (Des-1) a la cèl·lula tumoral. Des-1 és l’últim enzim de la via de síntesi de novo de ceramides (catalitza el pas de dihidroceramides a ceramides) i la seva inhibició resulta en l’acumulació de dihidroceramides de cadena llarga, de manera anàloga a la mostrada per l’inhibidor específic de Des-1 GT11. D’interès, el tractament de les cèl·lules tumorals amb la dihidroceramida de cadena curta dideuterada d2c8DhCer (que provoca un augment dels nivells cel·lulars de dihidroceramides) resulta en la inducció d’estrès reticular, autofàgia i citotoxicitat a les cèl·lules tumorals MiaPaca2 i A549, tal com fa l’ABTL0812. L’estudi preliminar dels processos executors de la mort cel·lular induïda per l’ABTL0812 mostra que aquest compost altera la funció mitocondrial (depleció dràstica d’ATP cel·lular) i activa la via canònica de mitofàgia PINK1/parkina/ubiquitina. A més a més, l’ABTL0812 promou l’alliberació citosòlica de catepsines lisosomals, suggerint la inducció de permeabilització de membrana lisosomal (LMP) que explicaria la mort per necrosi observada a les cèl·lules tumorals. Finalment, aquesta Tesi proposa que l’ABTL0812 actuaria de forma paral·lela a través de dos eixos. Per un costat, activaria els receptors PPAR/, que indueixen la sobre-expressió de TRIB3 i la subseqüent inhibició d’Akt i del complex mTORC1. Per l’altre costat, l’ABTL0812 inhibiria l’enzim Des-1, provocant una acumulació de dihidroceramides de cadena llarga i l’activació d’estrès reticular. Ambdós eixos del mecanisme sinergitzen en l’activació d’autofàgia robusta i mort cel·lular, com demostra el tractament combinat amb l’inhibidor específic de mTORC1 Everolimus i l’inhibidor específic de Des-1 GT11.
ABTL0812 is a polyunsaturated fatty acid derivative with antitumoral activity licensed by the biopharmaceutical company Ability Pharmaceuticals. ABTL0812 shows cytotoxicity in a wide panel of human tumor cell lines and induces tumor growth inhibition in human tumor cell-derived xenografts. This have encouraged its pre-clinical and clinical development. ABTL0812 recently started Phase 2 Clinical trials in patients with advanced endometrial cancer and squamous NSCLC, as a first line of treatment in combination with paclitaxel and carboplatin (ClinicalTrials.gov: NCT03366480). Our laboratory is involved in the characterization of ABTL0812’s antitumoral mechanism of action, using MiPaca2 (pancreatic adenocarcinoma) and A549 (lung adenocarcinoma) cell lines as models. Previous studies carried out in our laboratory uncovered that in cells ABTL0812 activates peroxisome proliferator-activated receptors PPAR/ receptors, inducing autophagy-mediated cancer cell death without activating apoptosis. Here, by using gene reporter luciferase assay, qRT-PCR mRNA quantification and immunoblot analysis, we show that ABTL0812 activates PPAR-mediated transcription of Tribbles 3 (TRIB3) pseudokinase. Over-expressed TRIB3 then binds and inhibits Akt, preventing its activation by PDK1 and mTORC2 upstream kinases, resulting in inhibition of the oncogenic Akt/mTORC1 axis. However, we found that mTORC1 inhibition is not enough to induce robust autophagy in MiaPaca2 and A549 cell lines, as it does ABTL0812. Thus, we investigated whether endoplasmic reticulum (ER) stress could also account for ABTL0812-induced TRIB3 overexpression, as it has been proposed for other antitumoral drugs such as tetrahydrocannabinol. We found ABTL0812 induces endoplasmic reticulum dilatation and over-expression of the endoplasmic reticulum stress markers BiP, ATF4 and CHOP (both mRNA and protein levels), indicating that ABTL0812 induces ER stress in these tumor cells. We also show preliminary pharmacological data suggesting that ER stress has a role in mediating ABTL0812-induced cytotoxicity. Remarkably, we have optimized a protocol for the quantification of TRIB3 and CHOP mRNAs (qRT-PCR) in blood and purified PBMCs from patients enrolled in Clinical Phase 2. We describe increased levels of CHOP and TRIB3 mRNAs in response to ABTL0812 treatment. Furthermore, we have proposed and optimized RT quantification of the ER stress genes TRIB3 and CHOP as reliable pharmacodynamic biomarkers for the ongoing Phase 2 Clinical trials. Given the role of sphingolipids in initiating the ER stress, we undertook a comprehensive mass-spec analysis of cellular sphingolipids to show that ABTL0812 induces long-chain dihydroceramides accumulation without affecting ceramide levels. In cells, dihydroceramides are converted into ceramides by the desaturase-1 (Des-1) enzyme. Enzymatic analysis demonstrated that ABTL0812 treatment results in inhibition of Des-1 activity in vitro and in cellular assays, provoking an accumulation of long-chain dihydroceramides, analogously to that induced by Des-1 specific inhibitor GT11. Interestingly, we show that treatment with the dideuterated short-chain dihydroceramide d2c8DhCer (which induces an increase of cellular dihydroceramides) results in endoplasmic reticulum stress, autophagy and cytotoxicity in MiaPaca2 and A549 cell lines. Preliminary characterization of ABTL0812-induced cell death shows that this compound alters mitochondrial function (induces a drastic depletion of cellular ATP) and it activates the canonic mitophagy pathway PINK1/parkin/ubiquitin. Furthermore, ABTL0812 induces cytosolic release lysosomal cathepsin B, suggesting a lysosomal membrane permeabilization (LMP) that would explain the necrotic cell death observed in tumor cells. Finally, this work proposes that ABTL0812 exerts its antitumoral activity acting simultaneously on two axes. On one hand, ABTL0812 activates PPAR/ receptors, which induce TRIB3 over-expression and the subsequent Akt and mTORC1 inhibition. On the other hand, ABTL0812 inhibits Des-1 enzyme, resulting in accumulation of long-chain dihydroceramides and the subsequent activation of ER stress. Both axes synergize to activate a robust autophagy which ultimately leads to lysosomal membrane permeabilization and necrosis. In agreement with this, we show that the inhibition of mTORC1 (Everolimus) synergizes with Des-1 inhibition (GT11) to promote autophagy and cytotoxicity.

En la present tesi s'han realitzat estudis estructurals de DNA. L'obectiu era l'estudi detallat de les interaccions del DNA amb fàrmacs intercalants i amb metalls de transició.
Tant els fàrmacs intercalants com els metalls de transició poden afectar a les propietats i a l'estructura del DNA. Això es pot utilitzar en àmbits mèdics com per exemple en la millora de les propietats dels fàrmacs anticancerígens, antibiòtics, etc. Referent als metalls de transició es coneixen interaccions específiques d'aquests amb el DNA que també poden ser molt útils en dissenyar noves estructures de DNA (1).
Els estudis s'han realitzat emprant sobretot la cristal·lografia de raigs X, tècnica que permet realitzar un estudi estructural molt detallat. Per tal de complementar els estudis cristal·logràfics, s'han utilitzat també altres tècniques com són el footprinting, fluorescència o mesures de viscositat. Aquestes donen informació sobre els fàrmacs que es volen utilitzar.
S'han estudiat sistemes aromàtics derivats de l'acridina i de l'antraquinona que tenen units diferents substituents, principalment aminoàcids. S'ha comprovat, però, que en general aquests fàrmacs no són específics per a una determinada seqüència.
Els estudis de cristal·lització han demostrat aquesta inespecificitat dels fàrmacs. S'han fet assajos amb dotze oligonucleòtids diferents. Aquests contenen passos CG (pas típic on s'intercalen els fàrmacs en estructures ja descrites) i passos AA/TT. Es coneix només una estructura on el fàrmac es troba intercalat en un pas com aquest (2), i s'ha intentat induir un altre cop aquesta intercalació amb altres oligonucleòtids.
S'han fet molts assajos de cristal·lització per obtenir complexos DNA-fàrmac i s'han resolt, finalment, cinc estructures amb quatre oligonucleòtids diferents. D'aquestes cinc estructures només dues han presentat fàrmac intercalat.
El decàmer d(CGCAATTGCG) s'ha cristal·litzat en el grup espacial I212121 formant una estructura isomòrfica a la mateixa seqüència descrita per Spink (3). Aquest decàmer s'ha descrit en un total de cinc estructures diferents i en quatre grups espacials. Això ha permès realitzar un estudi comparatiu de totes elles, analitzant d'una banda les diferències i de l'altra els efectes de les diferents condicions de cristal·lització emprades.
S'ha resolt també la primera estructura de B-DNA, la seqüència d(GAATTCG), amb una simetria cúbica. És el primer cop que es cristal·litza aquesta seqüència i el grup espacial és I23. El tret més important de l'estructura són les grans cavitats de dissolvent que presenta, només el 24% del cristall està ocupat per àtoms de DNA. L'estructura s'ha resolt pel mètode de MAD utilitzant l'ió Ni2+ com a àtom pesat.
La primera estructura del decàmer d(CAATTAATTG) s'ha descrit a una resolució de 2.8 Å. Aquesta ha cristal·litzat en el grup espacial P3221 i és isomòrfica a un grup d'estructures de seqüències diferents (4). El fet de contenir un 80% de bases A i T ha suggerit fer un estudi conformacional del decàmer.
Totes les estructures s'han cristal·litzat en presència dels ions Ni2+ o Co2+, els quals formen gairebé sempre interaccions específiques amb els N7 de les guanines. Aquests ions tenen en general un paper molt important a l'hora d'estabilitzar el cristall ja que sovint ajuden a unir dues columnes de dúplexs a través de guanines terminals que es desaparellen. També s'han detectat altres ions com el Ba2+ o el Na+.
In the present thesis we have carried out structural studies on DNA. The main purpose was the determination in a detailed way of the interactions between DNA and intercalating drugs as well as with transition metals.
Both, intercalating drugs and transition metals, can influence the properties and structure of DNA. This characteristic can be used in order to improve the therapeutic applications of the drugs. On the other hand, specific interactions between DNA and transition metals are known, and they can be used to design new structures of DNA (1).
The main technique used has been X-ray crystallography, which allows studying structures in great detail, but also other techniques have been used as for example footprinting, fluorescence or viscosity assays. These techniques can give information about the drugs, they can predict whether a drug is going to intercalate in the DNA and also if they are specific for a particular sequence.
The drugs used are aromatic systems, anthraquinone and acridine derivatives with different substituents covalently linked, most of them amino acids. Our studies confirm that in general, the drugs used have no sequence specificity.
Crystallographic studies also show that drugs are not specific because in most of the structures solved, the drug could not be detected. Twelve different oligonucleotides, between six and twelve base pairs, have been tested. Those contain CG steps (typical intercalating step) and AA/TT steps. There is only one structure known in the literature where a drug intercalates in an AA/TT step (2) and we have been trying to induce this intercalation again with different oligonucleotides.
Many crystallisation assays have been done in order to obtain DNA-drug complexes and finally, five different structures with four different olignucleotides have been solved. Only two of these structures contain the intercalated drug, this is the sequence d(CGTACG) that has been crystallized with two different drugs, an acridine and an anthraquinone derivative.
The decamer d(CGCAATTGCG) has been crystallised in the space group I212121, showing an isomorphic structure of the same sequence previously described by Spink (3). This decamer has been crystallised as five different structures in four different space groups. All these structures allowed a comparative study between all of them, analysing the differences and the effect of the crystallisation conditions.
The first structure of a B-DNA with a cubic symmetry has also been solved with the sequence d(GAATTCG). It is the first time this sequence has been crystallised and the most important feature of this structure are the great cavities of solvent contained in each cell, only 24% of the crystal is occupied by DNA atoms.
Also the first structure of the decamer d(CAATTAATTG) has been solved in the space group P3221. The fact that contains a large quantity of A and T bases (80%) suggested analysing in detail the conformation of the decamer. There is a group of isomorphic structures with different sequences already described in the literature (4).
All five structures have been crystallised in the presence of Co2+ or Ni2+ ions. Both ions normally form specific interactions with the N7 atoms of guanines and they have a very imortant role in the stabilisation of the crystals. Other ions such Ba2+ and Na+ have also been detected in the structures.

Con el objetivo de contener el gasto farmacéutico, una de las recomendaciones de las Administraciones Sanitarias es la utilización de fármacos genéricos. Su principal ventaja es un menor coste, debido al ahorro en investigación. Sin embargo, pequeñas diferencias con respecto a su innovador podrían ir asociadas a una serie efectos negativos, que en el caso de la epilepsia podrían tener importantes repercusiones clínicas (crisis epilépticas, pérdida de trabajo/carnet de conducir,…). Sobre la utilización de genéricos en epilepsia, disponemos de múltiples series de casos sobre descompensaciones o aparición de efectos adversos y encuestas, pero apenas disponemos de estudios que permitan extraer conclusiones sobre su total intercambiabilidad. Objetivos: Comparar los niveles plasmáticos, respuesta clínica, efectos adversos y costes en pacientes en tratamiento con valproico endovenoso genérica frente a valproico endovenoso innovador, en pacientes en la práctica clínica habitual (pacientes hospitalizados con administraciones múltiples, polimedicación y diferentes comorbilidades). Material y método: Estudio retrospectivo observacional en el que se compararon 2 periodos: Periodo 1: 2003-2006 tratamiento con Depakine® (innovador). Periodo 2: 2007-2010 tratamiento con Ácido valproico G.E.S EFG® (genérico). Resultados: Se incluyeron 49 pacientes en el grupo innovador y 103 en el grupo genérico. Objetivo 1: No se encontraron diferencias en las concentraciones entre los 2 grupos (38.58 vs. 38.75 mcg/mL). En la estratificación por dosis, con la dosis de 1200 mg/día, el grupo innovador presentó concentraciones superiores al grupo genérico (51.06 mcg/mL vs. 34.76 mcg/mL, p=0.025). Objetivo 2: Inicialmente, la frecuencia de crisis fue similar en ambos grupos (38.8% vs. 41.7%). Posteriormente, el grupo innovador presentó una tendencia a un mayor control de las crisis (83.7% vs 68.9%, p=0.075). En el análisis multivariado, el diagnostico de status epilepticus fue el único factor de riesgo significativo de presentar crisis (OR: 4.9 (1.94-12.4)). Objetivo 3: La aparición de efectos adversos no se relacionó con la concentración plasmática de valproico, pero sí con la duración del tratamiento (11 vs. 5 días, p=0.009). No se observó diferencias en la aparición de efectos adversos entre ambos grupos. Objetivo 4: El coste de tratamiento con valproico fue superior en el grupo innovador (241.72 vs 98.79 €, p=0.0001). Sin embargo en los pacientes con presencia de crisis no se observaron diferencias (134.05 vs. 143.23 €). Conclusiones: Objetivo 1: Sólo una tercera parte de los pacientes monitorizados presentaron niveles terapéuticos (50-100 mcg/mL). En general, no se observaron diferencias en las concentraciones medias de valproico entre ambos grupos. Sin embargo, en la estratificación por dosis, con la dosis de 1200 mg/día, el grupo innovador presentó concentraciones superiores al grupo genérico. Objetivo 2: En el grupo innovador se observó una tendencia a un mayor control de las crisis durante el tratamiento. No obstante, el análisis estadístico posterior (multivariado) descartó que el uso de una u otra formulación sea responsable de diferencias en el control de las crisis, y únicamente el diagnóstico de status epilepticus (de mayor incidencia en el grupo genérico pero sin significación estadística) fue la única causa que se pudo determinar como predictor de peor control de crisis. Objetivo 3: La aparición de algún efecto adverso no se relacionó con la concentración plasmática de VPA. Tras descartar factores confusores, la utilización de la presentación genérica no pudo relacionarse con una incidencia y/o perfil de efectos adversos diferentes. Objetivo 4: El cambio de VPA IV innovador a genérico supuso una disminución media de 7.50 €/día, traduciéndose en un ahorro de casi 150 €/tratamiento. Sin embargo, la utilización de VPA IV genérico sólo es menos costosa en los pacientes libres de crisis, ya que en los pacientes no controlados, se pierde la diferencia entre ambos grupos.
In order to maximize cost savings, health care systems recommend the use of generic drugs. Its main advantage is lower cost, due to savings in research. However, small variations in bioavailability among generic drugs and brand-name drugs in epilepsy may be associated with negative effects with significant clinical changes (loss of seizure control, loss of jobs / driving license). There are multiple cases series with loss seizure control or adverse events, but there are few studies to draw conclusions about its total interchangeability in antiepileptic drugs. Objectives: To compare drug concentrations, seizure control, adverse effects and costs in patients treated with intravenous valproic generic among patients treated intravenous brand-name valproic in the target patient population (patients hospitalized with multiple administrations, different comorbidities and polytherapy). Methods: Retrospective observational study in which we compared two periods: Period 1: 2003-2006 patients receiving “Depakine” ® (brand-name). Period 2: 2007-2010 patients receiving “Ácido valproico GES EFG” ® (generic). Results: We included 49 patients in the brand-name group and 103 in the generic group. Objective 1: There were not differences in drug concentrations between the 2 groups (38.58 vs. 38.75 mcg / mL.). On stratification by dose, with the dose of 1200 mg/day, low drug concentrations were detected in the generic group (51.06 mcg / mL vs. 34.76 mcg / mL, p = 0.025). Objective 2: Baseline seizure frequency was similar in both groups (38.8% vs. 41.7 %). Subsequently, the brand-name group had a trend toward significance better seizure control (83.7% vs. 68.9%, p = 0.075). On multivariable analysis, the diagnosis of status epilepticus was found to be associated as a risk factor predictive of seizures (OR: 4.9 (1.94-12.4)). Objective 3: There was no relationship between adverse effects and drug concentration. Longer treatment was associated with an increase in adverse effects (11 vs. 5 days, p = 0.009.). There were no differences of adverse effects between the two groups. Objective 4: The cost of valproico treatment was higher in the brand-name group (241.72 vs. € 98.79, p = 0.0001). However, there were no differences in cost in patients with seizures (134.05 vs. € 143.23). Conclusions: Objective 1: Only one third of the monitored patients had therapeutic levels (50-100 mcg/mL). In general, there were not differences in mean valproico drug concentrations between both groups. However, with the dose of 1200 mg/day, the generic group had lower concentrations than brand-name group. Objective 2: The brand-name group had a trend for better control seizure. On multivariable analysis, the diagnosis of status epilepticus was associated with loss seizure control (higher incidence in the generic group with non-significant). Objective 3: There was no relationship between adverse effects and drug concentration. After discarding confounding factors, the use of generic could not relate to a different profile of adverse effects. Objective 4: Generic prescription decreased cost 7.50 €/day, resulting in a savings of almost 150 €/treatment. However, the use of generic VPA IV is a only less expensive in seizure-free patients.

ANTECEDENTS: Les reaccions adverses són freqüents en el curs dels tractaments amb fàrmacs, però només un baix nombre són degudes a un mecanisme d’hipersensibilitat. Malgrat això, un important percentatge d’individus amb reaccions adverses són considerats sospitosos d’haver presentat una reacció al·lèrgica, i per tant, derivats a un servei d’Al·lergologia per a estudi. HIPÒTESI: Si es realitzés una història clínica acurada d’aquestes reaccions i es tinguessin en compte els possibles efectes adversos de causa no immunitària, el percentatge de pacients derivats per a estudi seria inferior. Aquest sobrediagnòstic contribueix a l’ús de tractaments menys eficaços, incideix en la qualitat de vida dels pacients i incrementa el cost econòmic dels serveis sanitaris, ja sigui per la utilització de fàrmacs més cars o per la necessitat de fer estudis diagnòstics. OBJECTIU: Descriure la prevalença de reaccions al·lèrgiques a fàrmacs dels pacients derivats a la Unitat d'Al·lergologia de l’HUB per estudi d'al·lèrgia a fàrmacs, caracteritzar a aquests pacients i avaluar la rendibilitat i el cost de l’estudi diagnòstic. MATERIAL I MÈTODES: Estudi prospectiu en el que els pacients inclosos es van visitar a la Unitat d’Al·lergologia de l’HUB per haver presentat reaccions sospitoses d’al·lèrgia a fàrmacs. Es van avaluar dades clínico-epidemiològiques, fàrmacs implicats, la qualitat de vida mitjançant un qüestionari de qualitat de vida específic per a fàrmacs i els resultats de les proves diagnòstiques. Un any després de l’estudi es va fer una enquesta telefònica per conèixer l’ adhesió del pacient a les recomanacions post-estudi diagnòstic. Les dades es van enregistrar a una base de dades específica per al posterior anàlisi estadístic i avaluació. L’anàlisi multivariada es va valorar calculant les odds ratio (OR) i els intervals de confiança (IC) del 95%. RESULTATS: Es van incloure 1003 pacients (683 dones) amb mitjana d’edat de 49,98 anys (14-90) i es van dur a terme 1122 estudis diagnòstics. Es va confirmar l’al·lèrgia a fàrmacs en 396 pacients (39,5%): a AINE en un 59,3% (235 pacients), als antibiòtics β-lactàmics en un 20,7% (82 pacients), als antibiòtics no β-lactàmics en un 4,8% (19 pacients), als medis de contrast iodat en un 2,8% (11 pacients), als anestèsics locals en un 0,5% (2 pacients) i a altres fàrmacs en un 11,9% (47 pacients). Van resultar factors de risc associats a ser al·lèrgic a fàrmacs l’antecedent d’atòpia (OR:1,54 (1,03-2,31)), la clínica d’anafilaxi (OR:401,43 (93,27-1727,21)), la clínica només cutània (OR:5,26 (3,41-8,1)) i haver acudit al servei d’Urgències després d’haver presentat la reacció (OR:1,77 (1,2-2,59)). Es va dur a terme el qüestionari de qualitat de vida en 75 pacients. La puntuació mitjana va ser de 32±10 punts sobre 75 punts. Els pacients amb hipersensibilitat no immunitària a AINE van mostrar una pitjor qualitat de vida que els pacients amb hipersensibilitat immunitària. No es van observar diferències a la resta de grups. L’enquesta telefònica es va fer a 322 pacients. 106 de 116 pacients van tolerar el fàrmac indicat a l’informe i 188 pacients no el va tornar a prendre: 124 no l’havien precisat; 47 no l’havien pres per por; 14 continuaven referint tenir al·lèrgia i 3 pacients (1,6%), per altres motius. El cost total dels 1122 estudis diagnòstics va ser de 664.519,9 euros (€) i el cost mig dels estudis diagnòstics per pacient va ser superior en el grup dels pacients no al·lèrgics (727,1 € vs 563,6 €). CONCLUSIONS: Un 39,5% dels pacients derivats per estudi van ser diagnosticats d’al·lèrgia a fàrmacs. Els fàrmacs més freqüentment implicats a les reaccions van ser els AINE i els antibiòtics β-lactàmics. Prop d’un 20% dels pacients enquestats no van acceptar el diagnòstic i no van prendre els fàrmacs recomanats als informes. Els estudis d’al·lèrgia a fàrmacs impliquen uns costos no menyspreables per al sistema sanitari, sobretot en cas que els pacients no siguin al·lèrgics, per tant seria recomanable fer una història clínica acurada abans de derivar a un pacient per estudi.
INTRODUCTION: Adverse drug reactions (ADR) are frequent in the course of treatments, but only 6-10% of them are due to allergy. Despite their prevalence, there are no comprehensive surveys that evaluate the results of diagnostic studies. AIM OF THE STUDY: To describe the prevalence of allergic drug reactions in patients referred to the Allergy Department for drug allergy studies. To evaluate these patients, the drugs involved in the reactions, the usefulness and the cost of these diagnostic studies. METHODS: We conducted a prospective study in patients referred both from primary health centers and from patients admitted in the hospital who had experienced a suspected allergic drug reaction. We evaluated clinical and epidemiological data, the drugs implicated in the reactions and the results of the final diagnosis. One year after the study, we performed a telephone survey in order to know the usefulness of the diagnostic study based on the final report given to the patient. In this report we indicated those drugs that, according to the study, the patient had tolerated and thus could be administered in future if needed. The data were recorded in a specific database for statistical analysis and evaluation. Multivariate analysis was assessed by calculating the odds ratio (OR) and the confidence intervals (CI) 95%. RESULTS: We studied 1003 patients (683 female) with mean age 49.98 years old (14-90) and we carried out 1122 diagnostic studies. Drug allergy was confirmed in 396 patients (39.5%) and the drugs more frequently implicated were NSAID in 59.3% and β-lactam antibiotics in 20.7%. In the remaining subjects (60.5%) drug allergy was discarded. One year after the study, 322 patients were asked about tolerability of the drug indicated at the end of the study. 106 of 116 patients had tolerated the recommended drug and in 188 the drug was not administered: 124 patients because it was not necessary, 47 patients due to fear and 14 patients still considered themselves allergic despite their negative results (19%). The average cost of diagnostic studies per patient was higher in non-allergic patients (727.1 € vs 563.6 €). CONCLUSION. The 39.5% of the patients referred to study for drug reactions were diagnosed as having allergy and the drugs more frequently implicated were NSAID and β-lactam antibiotics. A high percentage of the patients surveyed did not accept the results. Allergy drug studies involve significant costs for the health system, especially if the patients are not allergic, so it is necessary to take a careful medical history before referring patients to the allergy services.

D'un grup de pacients que presentin la mateixa malaltia, fins i tot en cas que en tots ells es pogués comprovar que la intensiat del procés és la mateixa, no tots responen amb igual intensitat a un fàrmac administrat a la mateixa dosi, per la mateixa via i amb el mateix interval d'administració. Tenir en compte la variabilitat de resposta quan s'admimstra un fàrmac és un del prerequisits de l'ús racional de medicaments. Amb l'augment del nombre de fàrmacs emprats en terapèutica s'ha enregistrat un increment en la incidència de reaccions adverses. Per tal de disnnnuir-les al mínim i aconseguir una resposta terapèutica òptima cal conèixer quins són els factors que influeixen en la relació dosi/resposta i individualitzar la dosi quan això sigui possible. L'important desenvolupament de les tècnlques de determinació dels nivells plasmàtics de fàrmacs ha permès saber que els processos farmacocinètics constitueixen la principal font de variabilitat intenndividual en la resposta als medicaments, i entre aquests el més important des d'un punt de vista quantitatiu és el metabolisme. Les causes més importants de variabilitat en la capacitat de metabolisme dels xenobiòtics són els factors ambientals i els genètics. Fa uns 30 anys que es coneix que la capacitat d'acetilació està sotmesa a polimorfisme genètic, més recentment s'han descrit polimorfismes de metabolisme d'altres vies, generalment hidroxilatives. En aquest sentit el present treball es composa de tres apartats:
1) Determinació de la capaciat de metabolisme de la Isoniazida (fenotip acetilador) en una mostra de 126 individus sans. La distribució de freqüències de la relació entre el fàrmac i el seu principal metabòlit en orina, es comporta de forma bimodal, diferenciant-se una subpoblació d'individus amb una baixa formació de metabòlit (acetiladors lents) que representa un 65,1 de la mostra estudiada. El 34,9 restant està format per individus amb una major capacitat de metabolisme (acetiladors ràpids). No sembla existir cap influència de factors com Tedat, sexe, consum de tabac, cafè i alcohol en e1 fenotip acetilador.
2) Determinació de la capacitat de metabolisme de la debrlsoquina (fenotip hidroxilador) en una mostra de 156 voluntaris sans. La distribució de freqüències de la relació entre aquest fàrmac i el seu principal metabòlit és de tipus bimodal. Un 4,5 del individus estudiats metabolitzen de forma defectuosa la debrisoquina (hidroxiladors pobres) i un 95,5 ho fan de forma normal (hidroxiladors extensos). Tampoc existeix cap influència de l'edat, sexe, i hàbits tòxics en la manifestació d'aquest fenotip.
3) L'acció neurotòxica d'alguns xenobiòtic sembla ser un dels factors etiopatogènics de la malaltia de Parkinson. Els individus amb una baixa capacitat metabòlica (detoxificant) podrien tenir un major risc de patir parklnsonisme o malaltia de Parkinson . Alguns fàrmacs (neurolèptics) i substàncies ambientals (MPTP) que poden produir parkinsonisme es metabolitzen per via hidroxilativa. En base a aquesta hipòtesi es va determinar el fenotip hidroxilador de la debrisoquina en una mostra de 54 pacients diagnosticats de Parkinson, amb la finalitat d'estudiar si en aquest tipus de pacients hi ha una major incidència de metabolitzadors pobres. No s'han detectat diferèncles entre els percentatges d'hidroxiladors pobres de les dues mostres analitzades (individus sans 4,5, parkinsomans 3,7), el que demostra que no sembla existir relació entre la capacitat de metabolitzar la debrisoquina i la malaltia de Parkinson.
Not all patients in a group suffering from the same illness respond in the same degree to a drug administered in the same dose, by the same route and the same interval even when the intensity of the process were proven to be the same. Taking into account the variability of response when administering a drug is one of the prerequisites for a rational use of drugs. With the increase in the number of drugs prescribed in therapeutics, an increase in the incidence of adverse drug reactions has been recorded. In order to reduce such reactions and achieve an optimal therapeutic response , the factors that influence the dose/response ratio have to be known and the dose has to be individualized whenever possible. The dramatic development of techniques for the determination of plasmatic levels of drugs has revealed that pharmacokinetic processes are the main cause of interindividual variability in response to drugs and that metabolism is quantitatively the most important of these processes. The main cause of variability in the capacity to metabolize xenobiotics are the environmental and the genetic factors. The capacity to acetytate has been known to be subject to genetic polymorphism for about 30 years. More recently, metabolic polymorphisms of other pathways, usually hydroxylative, have been described. This research deals with acetylator and hydroxylator phenotypes. It is composed of tree parts:

1) Determination of the rate of metabolism of isoniazid (acetilator phenotype) in a sample of 126 healthy individuals. The frequency distribution of the urinary drug/metabolite ratio reveals a bimodal pattern: 65.1 of the sample population shown a low formation of the metabolite (slow acetilators), while the remaining 34.9 have a higher capacity to metabolize (fast acetilators). Factors such as age, sex and tobacco, cofee or alcohol intake do not seem to influence this phenotype.
2) Determination of the rate of metabolism of debrisoquine (hydroxylator phenotype) in a sample of 156 healthy volunteers. The frequency distribution of the urinary drug/metabolite ratio again showns a bimodal pattern: 4.5 of the sample population are defective metabolizers of debrisoquine (poor hydroxylators), while 95.5 are normal metabolizers (extensive hydroxylators). Age ,sex and toxic habits do not seem to influence the manifestation of this phenotype, either.
3) The neurotoxic action of some xenobiotics appears to be one of the aetiopathogenic factors causing the appearance of Parkinson's disease. Individuals with a low metabolic rate migth be more exposed to developing Parkinsonism or Parkinson's disease. Some neuroleptic drugs and some environmental substances (MPTP) which may produce Parkinsonism are metabolized by hydroxylation. According to this hypothesis, the hydroxylator phenotype of debrisoquine was determined in a sample of 54 patients with diagnosed Parkinson's disease in order to ascertain if a higher incidence of poor metabolizers is found among this kind of patients. No significant difference in the percentage of poor hydroxylators has been recorded between the two analyzed sample populations (4.5 in healthy individuals, 3.7 in Parkinson patients), which proves that no relationship seems to exist between the capacity to metabolize debrisoquine and Parkinson's disease.

La cromatografia líquida micel·lar (MLC) ha estat aplicada amb èxit a la monitorització de fàrmacs. La MLC és un mode de la cromatografia líquida en fase inversa (RPLC) que conté micel·les, generalment de dodecil sulfat sòdic, que actuen com a modificadors de la fase mòbil, i un solvent orgànic o alcohol de cadena curta, que millora l'eficàcia i permet controlar la força eluent i la selectivitat de la fase mòbil. Les fases mòbils micel·lars, en comparació amb les aquó-orgàniques, tenen l'avantatge de permetre l'injecció directa de mostres biològiques (sèrum, orina, saliva, suor, etc.), i a més són més ecològiques, barates i estables. L'objectiu fonamental de la monitorització dels fàrmacs consisteix en millorar l'assistència terapèutica del pacient, tant en patologies agudes com en les cròniques, i això es du a terme mitjançant l'ajust de la dosi del fàrmac en funció de les concentracions plàsmiques, de manera que puga combinar la màxima eficiència del fàrmac i el mínim risc de toxicitat. També la monitorització és útil en la determinació de paràmetres químics i farmacològics, tals com el temps de vida mitja i d'altres. Els grups de substàncies amb els que s'han dut aquests tipus d'estudis han estat el dels antiarrítmics, antiepilèptics, antidepressius tricíclics, anàlgèsics, broncodilatadors i drogues d'abús, que inclouen a les amfetamines, barbiturats, benzodiazepines i opiacis.

The potential of natural products in general, and marine natural products in particular, as pharmacological entities has been widely demonstrated in recent years. Marine benthic ecosystems contain an extraordinary range of diverse organisms that possess bioactive natural compounds, which are commonly used as defensive or protective chemical mechanisms. These effective defensive strategies are based on secondary metabolites that are crucial for the species survival. The pharmacological properties of these unique chemical compounds constitute an interesting and emerging hot research line, based upon exploiting them for the development of new drugs. The evolution, biodiversity, and specific environmental conditions found in marine ecosystems, such as Antarctica and the Mediterranean Sea, make them an amazing source of potential therapeutic agents. Interestingly, some of these natural products are capable to modulate protein functions in pathogenesis-related pathways. The process of discovery and development of new drugs, for instance small molecules, with the aforementioned capacity to modulate protein functions, is a tedious procedure that requires economic resources and time. To reduce these drawbacks, computer-aided drug design (CADD) has emerged as one of the most effective methods. A rapid exploration of the chemical space can be done with computational methods, and they are very interesting and useful complementary approaches to experimental methods. CADD techniques can be applied in different steps of the drug discovery pipeline, and also, can cover several phases of this pipeline. To that end, several objectives have been set and reached in this thesis: 1. To find possible therapeutic activities and to establish the capability to modulate protein functions in pathogenesis-related pathways from marine molecules by using different CADD tools and techniques: I. Improve the drug discovery pipeline by the elucidation of the possible therapeutic potential of a set of marine molecules against a list of targets related to different pathologies. II. Elucidation of different pharmacophoric features of marine compounds and a precise in silico binding study, highlighting the power of CADD techniques, and reporting the inhibitory activity of different natural products and indole scaffold derivatives as GSK3β, CK1δ, DYRK1A, and CLK1 inhibitors. III. Computational study and an experimental validation of meridianins and lignarenones as possible ATP and/or substrate inhibitors of GSK3β. The main conclusions of this thesis are that marine molecules can be used as therapeutic agents against protein kinases related to the AD, and the exemplification of CADD potential applied to marine drug discovery.
El potencial dels productes naturals en general, i els productes naturals marins en particular, com a entitats farmacològiques ha quedat demostrat al llarg dels últims anys. Els ecosistemes bentònics marins contenen una extraordinària diversitat d'organismes que posseeixen compostos naturals bioactius, que utilitzen com mecanismes químics defensius i de protecció. Aquestes efectives estratègies defensives es basen en metabòlits secundaris, crucials per a la supervivència de les espècies. Tenint en compte les propietats farmacològiques d'aquests compostos químics únics, utilitzar-los per al desenvolupament de nous fàrmacs constitueix una línia interessant de recerca emergent. L'evolució, la biodiversitat i les condicions específiques que es troben en els ecosistemes marins, com ara l'Antàrtida i el mar Mediterrani, els converteixen en una font increïble de possibles agents terapèutics, capaços de modular funcions de proteïnes involucrades en determinades patologies. El procés de descobriment i desenvolupament de nous fàrmacs, per exemple, molècules petites, és un procediment tediós que requereix de recursos econòmics i de temps. Per reduir aquests inconvenients, el disseny de fàrmacs assistit per ordinador (DFAO) ha sorgit com un dels mètodes principals i més eficaços. Es pot fer una exploració ràpida de l'espai químic amb mètodes computacionals i a més, són aproximacions complementàries als mètodes experimentals molt interessants i útils. Les tècniques de DFAO es poden aplicar en diferents passos del procés de descobriment de fàrmacs, i també, poden cobrir diverses fases d'aquest pipeline. Amb aquesta finalitat, es varen establir diversos objectius en aquesta tesi: 1. Dilucidar la possible activitat terapèutica i la capacitat per modular les funcions de proteïnes que estan relacionades amb una determinada patologia de les molècules marines mitjançant l'ús de diferents eines i tècniques de DFAO: I. millorar el pipeline de descobriment de fàrmacs mitjançant l'elucidació del possible potencial terapèutic d'un conjunt de molècules marines enfront d'una llista de dianes relacionades amb diferents patologies. II. Dilucidació de les diferents característiques farmacofóriques dels compostos marins i en un precís estudi d’unió in silico, destacant el poder de les tècniques de DFAO, i avaluar l'activitat inhibidora de diferents productes naturals i derivats d’esquelets indòlics com inhibidors de GSK3β, CK1δ, DYRK1A i CLK1. III. Estudi computacional i validació experimental de meridianines i lignarenones com a possibles inhibidors de GSK3β mitjançant la unió a la cavitat de l'ATP i/o del substrat. En relació amb aquests objectius, les conclusions principals d'aquesta tesi són, que les molècules marines poden ser utilitzades com a agents terapèutics contra proteïnes quinases relacionades amb la malaltia d’Alzheimer, i l'exemplificació del potencial de les tècniques de DFAO aplicat al descobriment de fàrmacs marins.

Els 2-amino-1,2,3,4-tetrahidro-1-naftols poden considerar-se com anàlegs cíclics semirígids de les ariletanolamines adrenèrgiques, de les que deriven per incorporació de dos àtoms de carboni entre l'anell aromàtic i la posició alfa respecte a l'àtom de nitrogen.

En el cas de la noradrenalina, o dels seus derivats N-alquilats, la modificació pot donar lloc a dos tipus d'estructures isòmeres no equivalents, segons quina sigui la posició "orto" de l'anell aromàtic que intervé en la formació del nou anell.

Existeixen alguns precedents bibliogràfics de l'aplicació d'aquesta modificació a ariletanolarnines. Aixi, quan es va aplicar a la noradrenalina, o als seus derivats, s'obtingué, en un cas, un producte amb els hidroxils fenòlics situats en les posicions 6 i 7 que va resultar inactiu com a agonista beta-adrenèrgic. En canvi, els productes hidroxilats sobre les posicions 5 i 6 resultaren potents conl
agonistes beta-adrenèrgics. Aquests productes estan mancats d'activitat alfa-adrenèrgica. En tots els casos es va veure que els productes d'estereoquímica "trans" eren molt més actius que els "eis".

Per tal de determinar la importància de la posició dels grups hidroxil fenòlics per la interacció amb els receptors adrenèrgics, hem aplicat l'anterior modificació a fàrmacs agonistes monofenòlics, com són l'octopanlina i el metaraminol. Amb la síntesi i posterior assaig farrnacològic dels productes "1" a "6" pretenem trobar alguna relació que ens permeti deduir quina serà la disposició adoptada per l'anell aromàtic de la noradrenalina o de la isoprenalina en la interacció amb els receptors alfa i beta, respectivament.

En tots els casos s'ha partit de la tetralona amb la substitució adient, obtinguda segons els mètodes ja descrits a la bibliografia. En una primera fase es va procedir a introduir l'àtom de nitrógeno; per fer-ho es disposava de dos mètodes diferents. El primer d'ells consisteix en la transposició denominada de Neber de l'O-tosilat d'oxima de la cetona de partida en medi alcalí d'etòxld potàssic. Després de la hidròlisi de l'azirina que resulta amb àcid clorhídric s'obté una alfa-aminocetona protegida en forma d'hidroclorur. L'altre mètode per a la introducció del nitrogen consisteix en la reacció de la cetona de partida amb un nitrit orgànic en rnedi alcalí de "t"-butòxid potàssic. Així s'obté una oximinocetona.

Posteriorment es realitzen les modificacions funcionals convenients fins arribar als aminoalcohols desitjats. Els compostos isopropilats sobre el grup amino s'otingueren per tractament de l'amina primària amb acetona i posterior reducció amb borohidrur sòdic. Els productes finals de tipus fenòlic s'obtingueren per desprotecció dels èters benzílics per hidrogenòlisi en medi neutre a 200 psi de pressió d'hidrogen.

La determinació de la configuració dels compostos es va realitzar en base a les dades de RMN. Quant a la conformació dels de l'estudi dels valors de constants d'acoblament protons de la zona alifàtica de la molècula es dedueix que el grup hidroxil es disposa pseudoequatorial i el grup amina equatorial. Aquesta disposició per als grups OH/NH permet l'establiment d'un pont d'hidrogen que estabilitza la conformació. La conformació coincideix amb l'obtinguda a partir d'estudis de difracció de raigs X per la isoprenalina.

Com que no s'ha establert inequivocament si ariletanolamines i ariloxipropanolamines interaccionen de la mateixa manera amb el receptor beta, com a segon objectiu de la Tesi es dissenyen les estructures "41" i "42", combinación molecular del prenalterol (ariloxipropanolamina) amb el rimiterol (ariletanolamina) per tal d'estudiar si ambdós tipus de molècules estan sotmesos a les mateixes relacions estructura-activitat.

RESULTATS D'ACTIVITAT FARMACOLÒGI('iA

Els compostos "32" i "33" s'assajaren com a alfa i beta adrenèrgics en aorta, aurícula esquerra i tràquea de cobai, respectivament. Amb anterioritat als assaigs es reserpinitzaren els animals per evitar el possible efecte indrecte tant de partons com productes problema. Els valors d"activitat obtinguts semblen indicar que el neurotransmissor, la noradrenalina, adoptaria una conformació que disposés un dels hidroxils fenòlics oposat respecte al benzílic en interactuar el receptor beta. Per la interacción amb el receptor alfa, l'anell aromàtic del neurotransmissor hauria de girar 180°. Quant als productes assajats, assenyalen el guany en selectivitat que suposa la pèrdua de l'hidroxil en posició 6 respecte a productes dienòlics ja descrits en la bibliografia. El producte que pot presentar un interès més gran és el "33ª2, que podria constItuir-se en nou cap de sèrie per a l'obtenció de broncodilatadors exempts d'acció sobre el cor.

Pel que fa als productes "41" i "42" s'assajaren només com a beta-adrenèrgics. Dels resultats sembla deduir-se que la modificació molecular és vàlida per.a les ariletanolamines, com el rimiterol, i que els comunica selectivitat beta-2, no és aplicable a les ariloxipropanolamines.

D'altra banda, amb la síntesi de productes en què el grup hidroxil ocupa diferents posicions en l'anell aromàtic, es pretenia veure si la posició d'aquest és tan important com per als compostos de tipus aminotetrahidronaftol. Si Comparem les activitats dels compostos "eritro-41" i "eritro-42" s'observa la pèrdua d'activitat per canvi de posición del grup, però a més de ser poc significativa té caracter contrari al dels altres compostos en què l'important és l'hidroxil en "meta" respecte a la cadena. Per tant podem afirmar que l'anell aromàtic en ariletanolamines i ariloxipropanolamines agonistes no juga el mateix paper a l'hora d'interactuar amb el receptor beta.

El transplantament renal ha suposat una millora significativa de la qualitat de vida dels pacients amb dany renal crònic. Tot i això, l’empelt acaba perdent funcionalitat i es desenvolupa una patologia anomenada nefropatia crònica de l'empelt (CAN). Les causes d’aquesta patologia poden ser el rebuig immunològic de l’empelt renal o d’altres lesions com les causades per la isquèmia-reperfusió pròpies del procés quirúrgic o les degudes al propi tractament immunosupressor amb fàrmacs anticalcineuríncs (CNIs), Ciclosporina A (CsA) o FK-506. Els mètodes de mesura de la funció renal tradicionals com ara els nivells de creatinina en sèrum i la taxa de filtració glomerular, no permeten fer un diagnòstic de disfunció renal a l’inici i precís que permeti distingir el dany causat per factors immunològics dels no immunològics, com per exemple la nefrotoxicitat per fàrmacs CNIs. Per aquest motiu, l’objectiu d’aquesta tesi és la identificació de proteïnes diferencialment secretades per cèl•lules tubulars humanes en cultiu sotmeses a diferents noxes en condicions subtòxiques (CsA, FK506, Rapamicina i Staurosporina). La hipòtesi de treball és que, potencialment, aquestes proteïnes podrien ser detectades en sang i orina de pacient trasplantats i ser útils com a biomarcadors primerencs específics de la nefrotoxicitat causada per fàrmacs CNIs. S'han obtingut mapes proteòmics de les proteïnes secretades (secretomes) en cada condició subtòxica i s’han determinat les proteïnes diferencialment secretades en cada cas. Entre les proteïnes específicament secretades per CsA i/o FK-506 hem analitzat la vàlua de dues d’elles com a biomarcador de dany renal per CNIs: Plasminogen activator-inhibitor-1 (PAI-1), diferencialment secretada per CsA, i Fascina-1, secretada per efecte d’ambdós fàrmacs CNIs. La mesura dels nivells de PAI-1 en sang i orina de pacients trasplantats de ronyó no ha resultat ser útil per detectar dany renal per fàrmacs CNIs. En canvi, hem observat que l’aparició de Fascina-1 en orina de pacients trasplantats de ronyó i de pulmó sembla indicar disfunció renal precoç produïda per fàrmacs CNIs. També, hem detectat Fascina-1 en exosomes urinaris de pacients trasplantats de ronyó fet que permet explicar l’aparició d’una proteïna dels citoesquelet al medi extracel•lular. Els resultats obtinguts suggereixen que l’alliberació al medi de Fascina-1 induïda per fàrmacs CNIs és depenent de l’activació de la proteïna quinasa C.
Renal transplantation has led to a significant improvement in the quality of life of patients with chronic kidney disease. However, over the years the graft loses functionality and develops a pathology called Chronic Allograft Nephropathy (CAN). The causes of this condition can be immune rejection of the graft or other injuries such as those caused by ischemia-reperfusion resulting from the surgical procedure itself or due to the Calcineurin Inhibitor (CNI) immunosuppressive treatment with Cyclosporine A (CsA) or FK-506. The traditional methods of measurement of renal function such as serum levels of creatinine and glomerular filtration rate, do not allow a diagnosis of renal dysfunction at the beginning and accurate enough to distinguish between the damage caused by immunological and non immunological factors such as CNI induced nephrotoxicity. For this reason, the aim of this thesis is the identification of proteins differentially secreted by human tubular cells in culture under different noxious treatments (CsA, FK506, Rapamycin and Staurosporine) at sublethal conditions. The working hypothesis is that, potentially, these proteins could be detected in blood or urine of transplanted patients and be useful as specific biomarkers of early nephrotoxicity caused by CNIs. Proteomic maps were obtained of secreted proteins (secretome) in each sublethal condition and differentially secreted proteins were determined in each case. Among the proteins specifically secreted by CsA and/or FK-506 we have analyzed the value of two of them as a biomarker of CNI induced kidney damage: Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), differentially secreted by CsA, and Fascin-1, secreted by the effect of both CNI drugs. Measuring the levels of PAI-1 in blood and urine of kidney transplant patients has not proved useful for detecting CNI induced nephrotoxicity. However, we found that the appearance of Fascin-1 in urine of kidney and lung transplanted patients could be indicating early renal dysfunction caused by CNIs. Moreover, we found Fascin-1 in urinary exosomes from kidney transplanted patients. This fact helps explaining why a cytoskeleton derived protein appears in the extracellular medium. The obtained results suggest that the release into the environment of Fascin-1 induced by CNIs is dependent on the activation of Protein kinase C.

Els fàrmacs veterinaris són utilitzats per tractar i prevenir malalties en els animals de producció, ja que és imprescindible disposar d’unes condicions salubres per als animals i així assegurar un subministrament de carn de qualitat amb garanties de seguretat. Ara bé, l’ús, que en alguns casos s’ha convertit en abús d’aquestes substàncies, ha portat a una creixent preocupació per part de la societat deguda a la possible presència d’aquests compostos en els productes d’origen animal destinats al consum humà i els possibles efectes adversos que aquests puguin provocar en la salut dels consumidors. Per aquest motiu i responent a la demanda de la població, tan la Unió Europea (per als països que hi pertanyen) com les autoritats responsables dels diferents països, han establert legislació on es fixen els límits màxims de residu (MRLs) permesos en els diferents teixits animals. Això obliga a disposar de mètodes analítics sensibles i selectius que permetin determinar aquests compostos amb garanties de seguretat. En aquest context, la cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses ha esdevingut la tècnica per excel·lència per a l’anàlisi de fàrmacs veterinaris ateses la seva sensibilitat que permet la detecció de baixes concentracions de residus de matrius alimentàries i la seva capacitat de caracteritzar compostos químics i identificar substàncies desconegudes. La present tesi s’ha centrat en el desenvolupament de metodologia analítica per a la determinació de fàrmacs veterinaris antiparasitaris, concretament els pertanyents a les famílies dels anticoccidials i les benzimidazoles en aliments i aigües. Amb l’objectiu de posar a punt mètodes altament sensibles, selectius i ràpids, els mètodes desenvolupats s’han basat majoritàriament en la cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses en tàndem (MS/MS) emprant columnes cromatogràfiques de partícules de rebliment de nova tecnologia (partícules sub-2 µm i de nucli sòlid) per tal de millorar l’eficàcia i la resolució; així mateix, els tractaments de mostra aplicats s’han basat principalment en estratègies d’extracció en fase sòlida i QuEChERS per tal de minimitzar la manipulació de la mostra i el temps emprat en aquesta etapa de l’anàlisi. La fase estacionaria generalment emprada per a la separació cromatogràfica d’aquests compostos ha estat l’octadecilsilà si bé l’anàlisi d’ampròlium, un anticoccidial catiònic, ha requerit d’una fase estacionària de tipus HILIC per a la seva separació. Alternativament es presenta un mètode basat en l’electroforesi capil·lar de zona i pre- concentració in-line de la mostra mitjançant el mètode FASI per a la determinació d’aquest mateix compost en ous. Finalment, per primer cop s’ha avaluat l’aplicabilitat d’una tècnica d’anàlisi directa, el Direct analysis in real time (DART), acoblada a l’espectrometria de masses d’alta resolució (Orbitrap) per a la determinació de coccidiostats en pinsos i benzimidazoles en llet posant de manifest que aquesta és una tècnica adequada per a la determinació d’aquests compostos, especialment les benzimidazoles, amb l’avantatge de proporcionar resultats quantitatius en qüestió de segons. Paral·lelament a l’establiment i validació de les condicions òptimes per a cadascun dels mètodes d’anàlisi desenvolupats, aquesta tesi planteja un estudi exhaustiu del comportament dels compostos estudiats en espectrometria de masses, tan des del punt de vista de la ionització, emprant diferents fonts API compatibles amb l’acoblament a la cromatografia de líquids, com pel que fa referència a la fragmentació dels mateixos emprant diversos tipus d’analitzadors de masses. Això ha permès evidenciar que l’electrosprai és la font d’ionització més adequada per a l’anàlisi de coccidiostats, observant-se la formació d’adductes amb sodi de forma predominant en la ionització dels polièters ionòfors. Ara bé, l’anàlisi del toltrazuril i els seus metabòlits ha requerit la utilització de l’APCI ja que l’ió generat en la font d’electrosprai no és suficientment estable com per poder ser sotmès a una etapa d’espectrometria de masses en tàndem. Aquesta mateixa font, l’APCI, es proposa per a l’anàlisi de benzimidazoles per ser la única capaç d’ionitzar tota la família de compostos estudiats. Els efectes matriu han estat avaluats en tot moment i fins i tot se n’ha tret profit de l’efecte d’enhancement observat durant l’anàlisi d’ampròlium, millorant així la sensibilitat del mètode. L’establiment de les rutes de fragmentació ha permès determinar les transicions més sensibles i selectives per tal de poder ser utilitzades com a ions diagnòstic dels mètodes d’anàlisi LC-MS/MS. Així mateix, la utilització de l’espectrometria de masses d’alta resolució i relativa alta resolució mitjançant la utilització d’analitzadors de tipus Orbitrap i de triple quadrupol de quadrupols hiperbòlics respectivament, ha estat també avaluada per a la millora de la selectivitat i sensibilitat dels mètodes desenvolupats i la identificació d’estructures moleculars desconegudes.

L'esquizofrènia és un trastorn cerebral crònic, greu i incapacitant que afecta l'1% de la població i s'expressa en funcions mentals anormals i alteracions en el comportament. La causa de l'esquizofrènia és desconeguda, ara bé, la vulnerabilitat de patir aquesta malaltia psiquiàtrica està clarament relacionada amb factors genètics. Existeixen evidències que suggereixen que aquest trastorn es relaciona amb una activitat i connectivitat alterada de l'escorça prefrontal (EPF) i àrees relacionades anatòmicament i funcional com el tàlem i els nuclis del mesencèfal (nuclis del rafe-NR, locus coeruleus-LC i l'àrea tegmental ventral-ATV). S'han elaborat nombroses hipòtesis sobre l'etiologia de l'esquizofrènia que inclouen una hiperactivació de la neurotransmissió dopaminèrgica i una hipofunció glutamatèrgica. Ara bé, recentment s'ha suggerit que la hipofunció del receptor NMDA pot originar un excés compensatori d'alliberació de glutamat i incrementar l'activitat de les neurones piramidals de l'EPF. Endemés, en models de desconnexió neonatal de l'hipocamp s'ha observat una més elevada activitat excitadora de dopamina sobre neurones piramidals corticals.

En la present Tesi Doctoral hem caracteritzat el paper que exerceixen receptors corticals excitadors i inhibitoris sobre l'activitat del circuit EPF-NR, i hem estudiat l'acció dels fàrmacs antipsicòtics sobre aquests receptors per tal de conèixer millor les bases neurobiològiques de la seva acció terapèutica.

L'EPF medial (EPFm) expressa abundantment receptors serotoninèrgics 5-HT1A (inhibitoris) i 5-HT2A (excitadors). Els nostres treballs han mostrat que l'activació farmacològica d'aquests receptors corticals modula de manera oposada l'alliberació local de 5-HT mitjançant canvis en l'excitabilitat de les neurones piramidals que coexpressen àmpliament ambdós receptors i que projecten als nuclis serotoninèrgics. Antecents del grup mostren que l'administració de DOI (al.lucinogen, agonista 5-HT2A/2C) incrementa la freqüència de descàrrega de les neurones piramidals i l'alliberació cortical de serotonina (5-HT), activació circuit EPFm-NR. Així hem estudiat l'alliberació de 5-HT cortical, mitjançant la tècnica de microdiàlisi intracerebral in vivo, com a mesura indirecta de l'activitat de les neurones piramidals.

Hem descrit també que l'estimulació dels receptors excitadors adrenèrgics 1 corticals incrementa l'alliberació local i al NDR de 5-HT, possiblement a través del mateix mecanisme que l'activació dels receptors 5-HT2A (estimulació de les vies excitadores descendents cap al NDR). De la mateixa manera, l'augment de la neurotransmissió glutamatèrgica a l'EPFm, mitjançant i) l'aplicació local de S-AMPA, ii) la desinhibició de les aferències glutamatèrgiques talàmiques o bé iii) l'administració sistèmica d'antagonistes glutamatèrgics dels receptors NMDA, estimula l'alliberació de 5-HT a l'EPF, fet que és probablement degut a una major activitat de les neurones piramidals que projecten al NDR i al conseqüent increment de l'activitat serotoninèrgica. Amdós efectes (adrenèrgic-1 i glutamatèrgic) són revertits pel bloqueig de receptors adrenèrgics 1 i 5-HT2A.

Endemés hem observat que l'estimulació del receptor 5-HT1A a l'EPFm reverteix l'increment de l' alliberació local de 5-HT induït per l'agonista 5-HT2A/2C DOI, l'agonista adrenèrgic 1 cirazolina i S-AMPA. La implicació dels receptors 5-HT1A postsinàptics a EPFm en aquesta inhibició es fa palesa perquè i) és comuna a cinc agonistes diferents, ii) és revertida per la inactivació prèvia i el bloqueig dels receptors 5-HT1A, i iii) està totalment absent en ratolins genoanul·lats d' aquest receptor.

Finalment, hem descrit que els fàrmacs antipsicòtics reverteixen l'increment de l'alliberació de 5-HT a l'EPFm induït per l' estimulació de receptors excitadors corticals. Aquesta acció és possiblement deguda a la seva capacitat de bloquejar in vivo els receptors 1 adrenèrgics (típics i atípics) i 5-HT2A (atípics) pels quals presenten una elevada afinitat. Aquestes dades suggereixen que els fàrmacs antipsicòtics exercirien en part la seva acció terapèutica disminuint una possible hiperactivitat de les neurones de l'EPF. Ara bé, la incapacitat de l'haloperidol de bloquejar l'efecte dels antagonistes NMDA indica possiblement diferències d'acció entre antipsicòtics típics i atípics sobre les neurones corticals.
The prefrontal cortex (PFC) plays a crucial role in higher brain functions which are altered in schizophrenic patients. Pyramidal neurons in medial PFC (mPFC) integrate excitatory inputs from cortex and thalamus, and modulatory inputs from brainstem aminergic nuclei like raphe nuclei (RN). In turn, mPFC controls the activity of raphe serotonergic neurons. Previous reports showed that the stimulation of prefrontal 5-HT2A or AMPA receptors increases pyramidal and serotonergic cell firing, and 5-hydroxytryptamine (5-HT) release in mPFC. We use 5-HT release (microdialysis technique) as an indirect measure of pyramidal activity.

In this Doctoral Thesis we have examined the role of cortical excitatory and inhibitory receptors in the mPFC-RN circuit, which has been implicated in schizophrenia. Given the similar laminar distribution of 5-HT2A receptors and a1-adrenoceptors in mPFC and their excitatory action on pyramidal neuron activity, we tested the hypothesis that a1-adrenoceptors might also modulate 5-HT release. Antipsychotics exhibit high affinity for receptors expressed in pyramidal neurons such as 5-HT2A and a1-adrenoceptors. Therefore, we have also examined the effects of antipsychotics, as well as selective antagonists for these receptors, on the increased mPFC 5-HT release induced by cirazoline (a1-adrenoceptor agonist), DOI (5-HT2A/2C agonist), and the increase in glutamatergic transmission.

The results showed that the stimulation of prefrontal a1-adrenoceptors and the increase in mPFC glutamatergic transmission (exogenous stimulation of AMPA receptors, disinhibition of thalamic afferents to mPFC or acute administration of NMDA antagonists) activate pyramidal afferents to ascending serotonergic neurons (measured as an increase in 5-HT release in RN and mPFC) possibly in a manner similar to that observed for 5-HT2A receptors. This effect was reversed by antipsychotics and antagonists of excitatory receptors located in pyramidal neurons.
The PFC contains high density of serotonin 5-HT1A (inhibitory) and 5-HT2A (excitatory) receptors. Likewise, we report that the activation of cortical 5-HT1A receptors reverse the increase in local 5-HT release induced by cirazoline, DOI and S-AMPA.

Finally, our results suggest that antipsychotics may exert their therapeutic action by reducing the increased excitability of prefrontal pyramidal neurons. The effect of classical antipsychotics may involve blockade of a1-adrenoceptors, whereas that of atypical may also involve blockade of 5-HT2A receptors.

Els nucleòsids poden ser modificats estructuralment amb l'objectiu de generar compostos farmacològicament actius en el tractament de tumors sòlids i malalties limfoproliferatives. Aquests fàrmacs són internalitzats a través dels transportadors de nucleòsids, pel que la dotació de transportadors en les cèl.lules tumorals pot determinar la seva acció citotòxica. En base a aquestes dades l'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat analitzar el paper dels transportadors de nucleòsids en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids, especialment en el tractament de malalties limfoproliferatives. La primera part de l'estudi va suposar la caracterització cinètica dels transportadors presents en la línia cel.lular derivada de leucèmia pro-limfocítica JVM-2, així com dels transportadors responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid fludarabina. Posteriorment, l'estudi es va estendre a la determinació dels nivells d'ARNm, proteïna i activitat dels transportadors de nucleòsids presents en cèl.lules de pacients de leucèmia limfàtica crònica. Paral.lelament, es va mesurar la seva sensibilitat a la fludarabina amb l'objectiu de determinar si existia algun tipus de correlació entre el transport i la citotoxicitat. Les dades obtingudes van demostrar que els nivells de proteïna d'hENT2 podien ser predictius de la sensibilitat a la fludarabina en la leucèmia limfàtica crònica. Per complementar els resultats obtinguts, es va realitzar un estudi equivalent amb línies cel.lulars derivades de limfoma de mantell, amb l'objectiu de comprovar el paper diferencial dels transportadors de nucleòsids equilibratius en la sensibilitat a anàlegs de nucleòsids en funció del tipus de malaltia i del fàrmac administrat. En aquest cas, va ser el transportador hENT1 el que es correlacionava amb la sensibilitat a la gemcitabina. Així doncs, atenent al paper que juguen els transportadors equilibratius en la sensibilitat a fàrmacs derivats de nucleòsids es va avaluar el paper del transportador hENT1 en la resposta transcripcional associada a la teràpia amb fluoropirimidines mitjançant la utilització de microarrays d'ADN. Com a model es va utilitzar la línia cel.lular derivada de tumor de mama MCF7, pel que inicialment es va realitzar una caracterització dels transportadors de nucleòsids presents en la línia, així com de les isoformes responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid 5'-desoxi-5-fluorouridina. L'avaluació del paper d'hENT1 es va realitzar mitjançant la inhibició farmacològica de la seva activitat amb NBTI. Els canvis d'expressió gènica obtinguts mitjançant els experiments de microarrays d'ADN van demostrar que la inhibició d'hENT1 bloqueja total o parcialment els canvis transcripcionals associats a l'acció del 5'-DFUR. Per tant, els resultats obtinguts demostren que els transportadors de nucleòsids equilibratius juguen un paper important en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids.
ROLE OF EQUILIBRATIVE NUCLEOSIDE TRANSPORTERS IN SENSITIVITY TO ANTINEOPLASIC DRUGS

Nucleoside-derivatives are currently used in the treatment of tumours and hematological malignancies. Although intracellular events involved in the pharmacological action of these compounds have been extensively studied, the role of plasma membrane transporters in nucleoside-derived drug bioavailability and action in cancer cells has not been comprehensively addressed. We examined the expression patterns and activity of nucleoside transporters in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) patients and correlated them with in vitro fludarabine cytotoxicity. Among the known plasma membrane transporters, we observed a significant correlation between fludarabine uptake via ENT carriers and ex vivo sensitivity of CLL cells to fludarabine. Moreover, western blot results suggested a role of hENT2 in fludarabine responsiveness in CLL patients. A similar study was performed using mantle cell lymphoma (MCL) cells. In this case we found a significant correlation between protein and mRNA levels of hENT1, drug uptake and sensitivity to gemcitabine. Finally, we addressed the question of whether equilibrative nucleoside transporters contribute to the transcriptomic response associated with nucleoside-derived drug therapy. For this reason, we used a pharmacogenomic approach to determine which are the intracellular targets of 5'-DFUR action in breast cancer cell line MCF7 and how inhibition of hENT1 function contributes to the transcriptomic response. The study identified selected gene targets of 5'-DFUR action in a breast cancer cell model, and highlighted the relevant role hENT1-mediated drug uptake plays in drug action. Therefore, the results obtained further support that equilibrative nucleoside transporters are implicated in the therapeutic response to nucleoside analogues.

S'han estudiat els efectes de dos fàrmacs intercalants al DNA, Daunorubicina (usat com antitumoral) i Criptolepina (amb elevada citotoxicitat i usat com antimalàric), en el llevat "S.cerevisiae".

Ambdues molècules s'uneixen al DNA però amb diferent preferència de seqüència: mentre que la Daunorubicina reconeix preferentment regions 5'(A/T)CG3', la Criptolepina s'uneix a 5'GG3'. S'han descrit nombroses regions reguladores riques en aquest tipu de seqüències, pel que ambdós fàrmacs podrien competir amb factors de transcripció nuclears, modificant l'expressió gènica.

Els principals objectius del nostre estudi foren:

1.Determinar l'efecte citotòxic dels dos fàrmacs en diferents soques de S.cerevisiae: BY4741, BY4741-delta-erg6 (soca amb major permeabilitat de la membrana plasmàtica als fàrmacs), BY4741-delta-rad52 (soca amb un gen de la maquinària de reparació delecionat):
- En primer lloc, s'analitzaren els efectes sobre el creixement cel·lular de les soques tractades amb diferents concentracions de cada molècula, tant amb glucosa com galactosa com a fonts de carboni. Els nostres resultats. Els nostres resultats demostren que la permeabilitat de la membrana és necessària per aconseguir la concentració de Daunorubicina que desencadena el seu efecte citotòxic. En canvi, la maquinària de reparació del dany al DNA pot ser una diana potencial de la Criptolepina.

- Mitjançant una anàlisi semiquantitativa de l'expressió d'alguns dels principals gens del metabolisme de la galactosa, es va observar un efecte diferencial dels fàrmacs, ja que el factor regulador dels gens de la galactosa presenta en la seva seqüència consens, la diana per a la Daunorubicina i no per a la Criptolepina. Aquest solapament de seqüència explica el patró repressor induït per la Daunorubicina, però no per a la Criptolepina, resultat que està d'acord amb el major efecte citotòxic de la Daunorubicina en cèl·lules crescudes en galactosa.
2.Avaluar la resposta transcripcional a nivell global de cada intercalant en la soca BY4741-delta-erg6, utilitzant la glucosa com a font de carboni.

- Mitjançant l'ús de microarrays, es va identificar els perfils d'expressió gènica diferencial per a cadascun dels tractaments (Daunorubicina o Criptolepina), en funció de la concentració i del temps. A partir d'aquests experiments es va confirmar que l'efecte de la Daunorubicina sobre la transcripció és pronunciat, mentre que els canvis observats per a la criptolepina són lleus.

- A partir dels resultats obtinguts, es van classificar els gens en diferents categories funcionals i es varen validar els resultats obtinguts per RT-PCR a temps real. Es va observar que tot i que la Daunorubicina reprimeix l'expressió dels gens glicolítics, la criptolepina està associada principalment a la inducció dels gens de resposta a estrès. D'una manera menys significativa, la Criptolepina altera també la transcripció de gens implicats en el transport del ferro i de gens mitocondrials.

- Mitjançant un estudi in silico, es va confirmar que les variacions en els perfils d'expressió gènica es deuen a un efecte directe dels fàrmacs sobre els factors de transcripció que regulen aquests gens, degut a que competeixen per les mateixes dianes d'unió al DNA.

A partir de la identificació dels mecanismes d'acció de cada fàrmac en S.cerevisiae, els nostres resultats plantegen noves vies en el disseny de nous fàrmacs antitumorals i antiparasitaris.
The main objective of this thesis is to analyse the effects of two DNA interacting drugs, Daunorubicin (used as antitumoral) and Cryptolepine (with elevated cytotoxicity and used as an antimalarian) in Saccharomyces cerevisiae. Both drugs intercalate in CG rich regions, the preferent sequence for Daunorubicin being 5'(A/T)CG3' and for Cryptolepine being 5'GG3'. These sites are common in consensus sequences of transcription factors and the competition of drugs for those sites can alter gene expresion.
First, we evaluated the effects in cellular proliferation in yeast strains of different genetic backgrounds (related to membrane permeability and DNA lesion repair), in glucose and galactose as carbon source. We observed that permeability of plasma membrane is necessary in order to reach a citotoxic concentration of Daunorubicin. On the other hand, the DNA repair machinery seems to be a potential target of Cryptolepine.
By a semiquantitative analysis of expression of GAL genes, we observed a differential effect of both drugs. Daunorubicin caused a decrease in GAL genes expression while Cryptolepine did not. This can be due to the fact that the main regulatory protein of galactose metabolism has the preferent binding site for Daunorubicin in the consensus sequences.
The effect of Daunorubicin and Cryptolepine on yeast transcriptome was studied in the most permeable yeast strain using glucose as carbon source. Using microarrays, we identified different gene expression patterns for each drug. Genome wide results were grouped into functional categories and confirmed by real time RT-PCR. We observed that Daunorubicin downregulates glycolytic genes and Cryptolepine induces a stress response and decreases the transcriptional levels of specific genes related to iron transport (siderophores) and mitochondrial genes.
We used in silico assays to correlate the expression patterns induced by both drugs with a direct effect in the regulatory proteins involved in the transcription of these genes. Results confirm different action mechanisms for each intercalating drug tested. Daunorubicin may alter the regulatory complex Gcr1p-Gcr2p responsible of upregulation of glycolytic genes, and Cryptolepine may induce a pleiotropic effect.
Overall, these results can raise new approaches in the development of new antitumour and antiparasit drugs.

Les drogues d'abús i els fàrmacs estan considerats com contaminants d'interès emergent en el medi aquàtic, és a dir, són substàncies que no estan incloses en els programes habituals de control i monitorització d'aigües, tot i que s'ha demostrat la seva presència en el medi ambient. Donat que aquests contaminants són possibles candidats a ésser regulats en futures legislacions, l'objectiu d'aquesta memòria ha estat desenvolupar metodologies d'anàlisi a nivells traça per poder quantificar la seva presència en el medi aquàtic i conèixer el seu comportament al llarg dels tractaments, tant en les plantes depuradores com en les potabilitzadores. S'han desenvolupat metodologies d'anàlisi per drogues d'abús i fàrmacs, basades en l'extracció en fase sòlida i determinació per cromatografia de líquids acoblada a l'espectrometria de masses en tàndem. En tots els casos s'han trobat límits de quantificació, que permeten la detecció d'aquests contaminants en les tres matrius aquoses a nivells de ng/L. S'han analitzat les drogues d'abús en aigües residuals, a les entrades i sortides de les depuradores. Les eliminacions calculades a partir de les concentracions trobades van indicar que els tractaments aplicats no són suficientment efectius per eliminar completament aquests contaminants, i per tant es poden trobar en les aigües superficials on s'aboquen les aigües depurades. S'ha estudiat la presència de drogues i fàrmacs en les aigües superficials. En concret, l'aigua del riu Llobregat al llarg de tota la conca i exhaustivament a l'entrada de la planta potabilitzadora de Sant Joan Despí. Els estudis han demostrat que aquests contaminants es troben en l'aigua superficial en concentracions més baixes que a la sortida de les depuradores i que són susceptibles d'entrar a la planta potabilitzadora. Tanmateix, han permès tenir localitzats els punts més contaminats del riu per aquests tipus de compostos i veure que segueixen un comportament estacional, trobant les màximes concentracions a l'hivern i a la tardor. En aquest treball s’ha estudiat també la presència de drogues d’abús i fàrmacs en les aigües potables, tant a la sortida de la potabilitzadora de Sant Joan Despí com en aixetes de consumidors de les principals ciutats espanyoles i d’altres països europeus, sud-americans i del Japó. La conclusió és que alguns contaminants (p.ex. cafeïna, nicotina, benziolecgonina, ibuprofè) poden arribar a les aixetes dels consumidors encara que a nivells de traça (pocs ng(L). Un cop vist que les drogues d’abús i fàrmacs es poden trobar en les tres matrius d’aigua, es va portar a terme un estudi sobre el tractament avançat en aigua residual basat en membranes d’osmosi inversa, per a l’eliminació de les drogues d’abús, arribant a la conclusió que és molt més efectiu que els tractaments convencionals més comuns utilitzats avui en dia. A més es va provar que l’efectivitat amb tres membranes diferents és similar, de manera que es va triar la membrana que requeria menys energia pel seu funcionament. Així mateix s’ha estudiat com els tractaments que s’apliquen en la potabilitzadora de Sant Joan Despí eliminen els fàrmacs i les drogues d’abús. Els resultats obtinguts demostren que s’aconsegueixen bones eliminacions pràcticament per tots els compostos estudiats, tant amb el tractament convencional (que inclou ozonització i filtració per carbó) com amb el tractament avançat (que inclou membranes d’ultrafiltració i osmosi inversa), tot i que aquest darrer les millora fins a un 15% per compostos com la nicotina.
Drugs of abuse and pharmaceuticals are considered contaminants of emerging concern in the aquatic environment. Given that these contaminants are potential candidates to be regulated in future legislations, the objective of this thesis has been devoted to develop a methodology for their analysis at trace levels; to quantify its presence in the aquatic environment as well as to improve the knowledge of their behaviour in different types of water treatments plants. Analytical methods for drugs of abuse and pharmaceuticals, based on solid phase extraction and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry have been developed. In all cases, the quantification limits achieved, allowed the detection of contaminants at trace levels (ng/L). Drugs of abuse in influents and effluents of wastewaters treatment plants (WWTP) were analyzed. Results showed that the applied treatments are not enough effective and these pollutants can reach surface waters. The presence of drugs and pharmaceuticals in surface waters were studied in Llobregat river and their basin and at the intake of the drinking water treatment plant (DWTP) in Sant Joan Despi. Results showed that these compounds are present in surface waters at lower concentrations than in effluents of WWTPs and therefore they can enter to the DWTP. Moreover, it has also allowed to keep track of the most polluted river points, and to verify that they follow a seasonal pattern, with the highest concentrations in winter and autumn. This work has also studied the presence of drugs of abuse and pharmaceuticals in treated waters from the DWTP and from tap waters of main Spanish cities and other countries. The principal conclusion is that few of these contaminants (i.e. caffeine, nicotine, benzoilecgonine, ibuprofen) can reach tap waters at trace levels (few ng/L). A study on the advanced wastewater treatment based on reverse osmosis membranes showed that it is much more effective than conventional treatments commonly used in most WWTPs. No significant differences between the three kinds of membranes tested was observed and the membranes which requires less energy is proposed. Likewise, studies of how tratments applied in DWTPs of Sant Joan Despí eliminated pharmaceuticals and drugs of abuse were carried out. Good eliminations for almost all studied compounds in the conventional treatment (using ozonation and carbon filtration) as in advanced tratment (with ultrafiltration and reverse osmosis membranes) were achevied, although with the latter the elimination is improved up to 15% for compounds such as nicotine.

L’objectiu del present treball ha consistit en l’obtenció i caracterització d’hidrogels i materials porosos d’àcid hialurònic (HA) entrecreuat amb butanediol diglicidil èter (BDDE) per a ser utilitzats com a sistemes d’alliberament controlat de fàrmacs. La selecció de l’HA per a l’obtenció dels materials ha sigut motivada per les propietats fisicoquímiques, la biocompatibilitat i la biodegradibilitat. S’han obtingut hidrogels amb l’entrecreuament en solució de l’HA amb el BDDE, i materials porosos amb una estructura ordenada mitjançant l’entrecreuament de l’HA amb el BDDE en medis compartimentalitzats. Per a l’obtenció dels materials porosos d’HA s’han utilitzat emulsions altament concentrades (HIPEs). S’han preparat hidrogels d’HA amb diferents graus d’entrecreuament. La caracterització d’aquests ha permès conèixer la seva capacitat d’inflament, les seves propietats reològiques, i la seva resistència davant l’enzim hialuronidasa en funció del seu grau d’entrecreuament. S’han estudiat les propietats d’alliberament dels hidrogels d’HA mitjançant la incorporació d’un fàrmac lipòfil model, el ketoprofè (KP, que és un fàrmac antiinflamatori no esteroïdal). Els resultats obtinguts han permès observar i quantificar la influència del grau d’inflament i del grau d’entrecreuament dels hidrogels en l’alliberament del KP. També s’han preparat associacions iòniques amb el KP per tal d’augmentar la solubilitat d’aquest en aigua i afavorir la incorporació a formulacions hidròfiles. S’han preparat líquids iònics mitjançant l’associació del KP amb l’1- butil-3-metilimidazoli, [Bmim][KP], i tensioactius cataniònics mitjançant la seva associació amb tensioactius biocompatibles derivats de sucres, el N-Dodecilamino-1-deoxiglucitol (GHyd ) i el 12 N-Dodecilamino-1-deoxilactitol (LHyd ). Els resultats de l’alliberament obtinguts amb el 12 [Bmim][KP] han mostrat com, malgrat l’augment de solubilitat en aigua, les propietats d’alliberament del KP no es veuen modificades. En canvi, els estudis d’alliberament realitzats amb el tensioactiu cataniònic LHyd /KP han demostrat com l’associació del KP amb el LHyd 12 12 augmenta l’alliberament del KP. Aquest augment es pot atribuir al fort increment en la solubilitat del KP quan aquest forma el tensioactiu cataniònic. A més, els estudis fisicoquímics realitzats amb el tensioactiu cataniònic LHyd /KP han demostrat la formació de vesícules per a 12 concentracions superiors a 1.1mM en aigua. Els estudis d’alliberament realitzats amb les vesícules de LHyd /KP mostren un retard en l’alliberament associat a la grandària de les 12 vesícules que en dificulten la seva difusió. S’han obtingut escumes sòlides d’HA mitjançant la incorporació d’HA i el seu entrecreuament amb el BDDE a la fase contínua de HIPEs obtingudes per un mètode d’alta energia a 25°C amb el sistema aigua/ Cremophor CH 455 / Miglyol 812. Les escumes sòlides obtingudes són 2 principalment macroporoses (pors > 300 nm) amb una superfície específica entre 23-43 m /g. S’han preparat també, partícules d’HA mitjançant la incorporació d’HA i l’entrecreuament amb el BDDE a la fase dispersa de HIPEs obtingudes per un mètode d’alta energia a 25°C amb el sistema aigua/ Cremophor WO 7/ parafina líquida. S’ha observat la coincidència entre la mida de les partícules obtingudes i les gotes de les HIPEs de partida. Finalment, s’han seleccionat les escumes sòlides d’HA per a estudiar l’alliberament del KP i tensioactiu cataniònic LHyd /KP. Aquests estudis han mostrat un alliberament molt més sostingut del KP i del 12 LHyd /KP respecte al perfil farmacocinètic obtingut amb els hidrogels. Aquest fenomen pot ser 12 degut a la presència de pors molt petits a les escumes sòlides que en dificultarien la seva difusió. A més, per a temps superiors a les tres hores s’ha observat una cinètica d’ordre zero. En conclusió, els resultats obtinguts tant en la caracterització com en les propietats d’alliberament dels hidrogels i de les escumes sòlides d’HA mostren que aquests nous materials són adequats per a l’alliberament controlat de fàrmacs i el seu us en implants.
The objectives of the present work were the obtention and characterization of materials based on hyaluronic acid (HA) crosslinked with butanediol diglycidyl ether (BDDE) to be applied as controlled drug delivery systems. The selection of HA to obtain these materials was motivated by their physicochemical properties, biocompatibility and biodegradability. Hydrogels were obtained by crosslinking HA with BDDE in bulk, and porous materials by crosslinking HA with BDDE into compartmentalized media. To obtain the porous materials, highly concentrated emulsions (HIPEs) were used as templates. HA hydrogels with different crosslinking degree were prepared. Their characterization show that swelling capacity, rheological properties and resistance against hyaluronidase depend on crosslinking degree. The release properties of HA hydrogels using a lipophilic model drug, ketoprofen (KP), were studied. The results show the influence of the swelling and the crosslinking degree in the release of KP. To increase the solubility of KP, an ionic liquid, [Bmim][KP], and catanionic surfactants, GHyd12/KP and LHyd12/KP, were prepared. The release of [Bmim][KP] shows no differences regarding to that obtained with KP. However, the studies performed with LHyd12/KP, show an increased release when the catanionic surfactant is in the monomeric form, and a sustained release when vesicles are formed. HA solid foams obtained by crosslinking HA with BDDE in the continuous phase of HIPEs show macroporosity (porous > 300 nm) and a specific surface area between 23- 2 43 m /g. Particles based on HA were obtained by crosslinking HA with BDDE in the dispersed phase of HIPEs. The sizes of the obtained particles are similar to emulsion droplets. The release studies with KP and LHyd12/KP using HA solid foams show a more sustained release regarding to the pharmacokinetic profile obtained with hydrogels. This phenomenon may be due to the presence of small pores in the solid foams that difficult its diffusion. In addition, for periods exceeding three hours, zero- order kinetics were obtained using these materials. In conclusion, the results obtained in the characterization and the release properties of hydrogels and solid foams based on HA show that these new materials are suitable to be used for controlled drug delivery as implants.

En la actualitat, la gran majoria de les noves entitats químiques emergents, són entitats químiques amb una permeabilitat acceptable però amb una absorció molt limitada degut a la seva baixa solubilitat (Classe II segons BCS). Per aquest motiu, la investigació i el desenvolupament de noves entitats químiques ha avançat en l’estudi i la selecció de formulacions basades en solucions i suspensions sòlides. Aquestes formulacions s’aconsegueixen quan el principi actiu es presenta en forma de solució ò suspensió molecular englobat en un excipient o bé una mescla d’excipients vehiculitzants. Això pot ésser molt avantatjós alhora de millorar la solubilitat del principi actiu. Aquesta tesi doctoral, fruit de la col•laboració entre varies disciplines, per tal d’aconseguir formulacions viables i millorades que continguin molècules de Classe II (segons BCS), es centra en els aspectes galènics d’aquest estudi, la metodologia emprada per destriar i caracteritzar formulacions viables, el canvi d’escala, la producció de mostres per a estudis “in vivo” i la transformació final de totes aquestes tasques de pre-formulació inicial en l’elaboració de formes farmacèutiques. En els estudis experimentals duts a terme s’ha realitzat un cribratge ràpid de formulacions binàries i ternàries per l’estudi de solucions i suspensions sòlides mitjançant tècniques innovadores i eficients. S’ha comprovat que les tècniques de cribatge ràpid a escala de laboratori emprant la premsa per fusió i el “solvent casting” són viables i representatives, de forma qualitativa, dels resultats que s’obtenen per tècniques d’extrusió per fusió i fins hi tot dels resultats “in vivo”. La tècnica de “solvent casting” miniaturitzat permet, de forma eficient, solventar el repte d’analitzar una combinatòria molt elevada de mostres per trobar possibles formulacions candidates. S’ha demostrat també, la viabilitat industrial de les formulacions obtingudes en el cribratge, així s’han ratificat la relació dels resultats, a nivell qualitatiu, de l’estudi del cribratge amb els estudis “in vivo” Posteriorment s’han emprat els resultats d’aquest cribratge per l’elaboració de formes farmacèutiques que permetin l’administració oral de fàrmacs poc solubles de forma estable, segura i eficaç. L’estudi extens del capítol 2 ha demostrat la viabilitat de l’elaboració de formes farmacèutiques, tant d’alliberació immediata com controlada, que continguin solucions o suspensions sòlides, tant de tipus sòlid com semisòlid, que han demostrat una millora de la solubilitat del principi actiu.
At present, the vast majority of new chemical entities emerging have acceptable permeability but a very limited absorption due to its low solubility (according to BCS Class 2). For this reason, research and development of new chemical entities has advanced the study and selection of formulations based on solid solutions and solid suspensions. These formulations are obtained when the active ingredient is in the form of a solution or a suspension embedded molecularly into an excipient or mixture of excipients. This can be extremely advantageous to improve the solubility of the active ingredient. This thesis is the result of collaboration between various disciplines, to achieve viable and improved formulations containing class 2 molecules (as BCS), and focuses on formulation aspects of this study, the methodology used to screen and characterize viable formulations, the scale-up, manufacturing of samples for “in vivo" studies and finally moving these concepts to the development of dosage forms. In the experimental studies, rapid screening of binary and ternary formulations for the study of solid solutions and suspensions using innovative and efficient techniques were carried out. It has been proven that the rapid screening techniques at laboratory scale using the melt press and "solvent casting" are viable and representative, qualitatively, of the results obtained by extrusion techniques. We also demonstrated the feasibility of industrial formulations obtained in the screening, and have confirmed the relation of the results, qualitatively; to the "in vivo" studies. Subsequently the results of the screening were the basis for the development of dosage forms that allowed oral administration of low solubility drugs that were proven stable.

La lipodistròfia és un canvi en la distribució del greix corporal. És un efecte advers freqüent en pacients amb infecció pel VIH i s’ha relacionat amb els fàrmacs antiretrovirals, el propi VIH i una susceptibilitat genètica. Aquesta tesis analitza l’efecte de 3 molècules i els seus determinants genètics en l’etiopatogènia de la lipodistròfia associada al VIH en un estudi de casos i controls. Es determina l’expressió d’aquestes molècules en el teixit adipós de pacients VIH amb i sense lipodistròfia i controls no VIH. La interleukina-6 està hiperexpressada en el teixit adipós de pacients VIH, la seva variant genètica -174 G>C no s’ha relacionat amb la lipodistròfia. L’expressió de Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) està disminuïda en pacients amb lipodistròfia, però no s’ha trobat una associació amb el polimorfisme Pro12Ala. La lipina está hiperexpressada en el teixit adipos de pacients VIH i existeix una associació amb la sensibilitat a la insulina.
La lipodistrofia es un cambio en la distribución de la grasa corporal. Es un efecto adverso frecuente en pacientes con infección por VIH relacionado con los fármacos antiretrovirales, el propio VIH y una susceptibilidad genética. Esta tesis analiza el efecto de 3 moléculas y sus determinantes genéticos en la etiopatogenia de la lipodistrofia asociada al VIH en un estudio de casos y controles. Se determina la expresión de estas moléculas en tejido adiposo de pacientes VIH con y sin lipodistrofia y controles no VIH. La interleukina-6 está hiperexpresada en el tejido adiposo de pacientes VIH, su variante genética -174 G>C no se ha relacionado con lipodistrofia. La expresión de Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) está disminuida en pacientes con lipodistrofia, pero no se encontró una asociación con el polimorfismo Pro12Ala. La lipina está hiperexpresada en el tejido adiposo de pacientes VIH y existe una asociación con la sensibilidad a la insulina.
Lipodystrophy is a body fat redistribution condition. It is a common long term adverse effect in HIV-infected patients associated with antiretroviral drugs, HIV itself and genetic susceptibility. This doctoral thesis analyzes the effect of 3 molecules and their genetic variants in the pathogenesis of HIV-associated lipodystrophy in a case-control study. Expression (messanger RNA; mRNA) of these molecules in abdominal adipose tissue of HIV participants with and without lipodystrophy and in healthy controls was determined. Interleukin-6 mRNA was higher in adipose tissue of HIV-infected patients compared with healthy controls; its genetic variant -174 G>C was not associated with lipodystrophy. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR-γ) mRNA was decreased in patients with lipodystrophy, but no association between lipodystrophy and Pro12Ala polymorphism was found. Lipin was hiperexpressed in adipose tissue of HIV-infected patients; there was a positve association with insulin sensitivity and negative association with proinflammatory cytokines.

En la societat actual, els fàrmacs són imprescindibles per a millorar la qualitat de vida de les persones però la seva activitat biològica inherent a la seva naturalesa genera una creixent preocupació pels possibles efectes als ecosistemes. Els fàrmacs poden arribar al medi aquàtic i produir una exposició crònica d'organismes, els quals poden resultar afectats. Molts estudis conclouen que per una avaluació més completa és necessari tenir en compte les possibles transformacions que pateixen aquests compostos al medi ambient ja que els productes resultants poden retenir l’activitat biològica del pare o tenir efectes toxicològics superiors al compost original. En el desenvolupament d’aquests tesi s’han estudiat les principals transformacions dels fàrmacs al medi aquàtic, incloent processos biòtics i abiòtics. Aquests estudis s’han realitzat mitjançant metodologies basades en la cromatografia de líquids acoblada a l’espectrometria de masses d’alta resolució (LC-HRMS). Actualment, els espectròmetres de nova generació, han superat les limitacions tradicionals d’aquesta tècnica per a l’anàlisi quantitatiu, oferint linealitats i sensibilitats similars als instruments de triple quadrupol. Evidentment, les prestacions que ens ofereix aquesta tècnica per a l’elucidació estructural de compostos també la fa idònia per a aquestes finalitats. En els darrers anys s’han desenvolupat noves estratègies mitjançant instrumentació HRMS híbrida. Aquests mètodes permeten l’anàlisi dirigit de compostos coneguts, l’escombratge de compostos sospitosos a partir de bases de dades i fins i tot l’anàlisi no dirigit de compostos desconeguts. Moltes d’aquestes capacitats han estat utilitzades per a detectar i identificar els TPs dels diferents processos estudiats en aquesta tesi. Al capítol 3 s’ha avaluat l’efecte de la llum del sol sobre els fàrmacs, considerat el principal mecanisme de transformació abiòtic. Concretament s’ha avaluat les reaccions de foto-transformació dels inhibidors de la fosfodiesterasa V mitjançant simulacions a escala laboratori. La avaluació conjunta de les rutes de degradació del sildenafil i els seus anàlegs ens ha permès determinar un patró de fragmentació comú i identificar els TPs principals pels diferents compostos. Finalment, s’han analitzat mostres ambientals per a detectar els TPs identificats. Aquest estudi a significat la primera detecció de dos TPs del SDF i/o dels seus anàlegs al medi ambient. Per tal d’estudiar també els processos de biodegradació causats per microorganismes, s’han determinat els principals TPs per biodegradació de sulfonamides a escala laboratori. En aquesta ocasió la identificació dels TPs es va utilitzar per a poder realitzar un estudi quantitatiu dels mecanismes de resistència bacteriana a les sulfonamides. Els resultats constaten que a altes concentracions el paper de la degradació de les sulfonamides és més important, mentre que a baixes concentracions la adaptació dels bacteris mitjançant la propagació de gens resistents als antibiòtics cobra protagonisme. Al capítol 4 s’ha avaluat l’exposició de fàrmacs als organismes aquàtics mitjançant la identificació de metabòlits. En primer lloc s’han identificat els metabòlits de l’Ibuprofè i la carbamazepina mitjançant la injecció intraperitoneal a llenguados. La comparació de mostres control i mostres tractades i l’estudi dels patrons de fragmentació ha permès proposar les identitats dels metabòlits. Aquesta aproximació a permès identificar temptativament 13 metabòlits de l’ibuprofè i 11 de la carbamazepina. A continuació s’han identificat els metabòlits de l’ibuprofè en plantes aquàtiques (Lemna Gibba). En total s’han identificat 11 metabòlits de l’ibuprofè. Aquests estudis han permès demostrar la variabilitat en el metabolisme en diferents organismes i com això fa més complexa la seva avaluació, ja que un compost pot resultar inofensiu per a una espècie i molt tòxic per a una altre. Finalment, s’ha estudiat el metabolisme dels fàrmacs en peixos salvatges mitjançant un mostreig al riu Llobregat. Inicialment s’ha realitzat un escombratge dirigit de més de 2000 contaminants orgànics. Això ens ha permès detectar més de 12 productes farmacèutics dels 150 que contenia la llista. Dels fàrmacs detectats s’han seleccionat 6 fàrmacs i a través d’un software de predicció de metabòlits s’ha generat una base de dades de 150 metabòlits. Amb aquesta llista s’ha realitzat un escombratge de sospitosos permeten la detecció d’un gran nombre de candidats dels que mitjançant l’estudi dels patrons de fragmentació s’ha proposat les seves estructures.
In this thesis, the main transformations of drugs in the aquatic environment have been studied, including biotic and abiotic processes. These studies have been performed using liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry (LC-HRMS).The different approaches by LC-HRMS in environmental samples have been reviewed in chapter 1. In chapter 3 the phototransformation reactions of phosphodiesterase V inhibitors have been studied through laboratory-scale simulations. Through these studies, common fragmentation pattern and the major TPs were identified. Finally, this study reported the first detection of two TPs of SDF and/or its analogues in the environment. Chapter 3 also shows a study of biodegradation of sulfonamides and the identification of main TPs at laboratory scale. The results show that at high concentrations the role of sulphonamide degradation is more important, while at low concentrations the adaptation of bacteria through the propagation of antibiotic resistant genes is more relevant. In chapter 4, the exposure of different aquatic organisms and their different metabolism was evaluated. Laboratory-scale studies have been performed to determine the metabolites of ibuprofen in plant and fish. With these approaches, 13 metabolites of ibuprofen and 11 metabolites of carbamazepine have been tentatively identified in bile of treated fish and 11 metabolites of ibuprofen in aquatic plants. These studies have demonstrated the variability of different aquatic organisms for the biotransformation of IBU. Finally, target screening of more than 2000 organic pollutants was carried out in wild fish. This approach allowed us to detect 12 pharmaceuticals out of the 150 contained in this list. Then, a database of more than 150 metabolites corresponding to the transformations of six of these drugs, through metabolite prediction software, has been generated. Suspect screening approach has been carried out for the detection and identification of pharmaceutical metabolites.

El mieloma múltiple (MM) encara és una malaltia incurable. Tot i això, el seu maneig ha canviat considerablement en les dues darreres dècades per l’aparició de quatre noves famílies de fàrmacs: els inhibidors del proteasoma (IP) com el bortezomib, els anomenats immunomoduladors (IMID) com la talidomida i la lenalidomida i darrerament els anticossos monoclonals i els limfòcits T amb receptors quimèrics d’antigen (CAR T). Aquests fàrmacs han demostrat eficàcia en combinació amb corticoides i amb alquilants, els agents utilitzats tradicionalment per al tractament del MM, o associats entre ells i actualment tenen indicació en el tractament de la recaiguda i de primera línia en diferents combinacions. Bortezomib, talidomida i lenalidomida s’han incorporat plenament a la pràctica assistencial sense que deixessin d’anar-se aprovant noves combinacions cada vegada d’eficàcia major. En aquest context s’han dut a terme dos estudis retrospectius per avaluat l’impacte de la seqüenciació en el moment d’administrar els nous fàrmacs i els factors que podien preveure una resposta subòptima a esquemes amb alternatives més eficaces. Per garantir l’absència de biaix de selecció en les cohorts s’ha partit del registre de pacients amb MM del Servei d’Hematologia Clínica de l’Hospital Germans Trias i Pujol i de l’Institut Català d’Oncologia. S’han revisat i registrat totes les dades epidemiològiques, biològiques, de tractament i resposta de tots els pacients i s’han comparat mitjançant estadístics paramètrics i no paramètrics per garantir la comparabilitat entre cohorts. S’han utilitzat les definicions de consens de l’International Myeloma Working Group (IMWG) per definir les variables principals. En el primer treball s’ha comparat la supervivència entre pacients tractats inicialment amb poliquimioterapia i a la recidiva amb IP o IMIDs (89 pacients), i pacients tractats amb IP o IMIDs incoporats a la primera línia (65 pacients). En les nostres cohorts, la incorporació d’IMIDs i IP al tractament de primera línia en pacients fins a 70 anys aporta una major supervivència que el tractament amb poliquimioteràpia seguit de tractament amb IMIDs i IP en el moment de la progressió o recaiguda. En el segon treball ens hem centrat en caracteritzar els pacients que podrien beneficiar-se més de la combinació de lenalidomida i dexametasona en la recaiguda, perquè tot i ser una combinació amb alternatives més eficaces el seu ús actual no és menyspreable. S’ha analitzat la cinètica de resposta al primer cicle i altres covariables de 227 pacients per determinar-ne l’impacte sobre la durada de la resposta i la supervivència global (SG). En la nostra cohort, l’assoliment d’una resposta parcial al primer cicle és la variable que s’associa a major supervivència lliure de progressió (SLP) i s’han identificat altres covariables amb impacte sobre la SLP, com l’antecedent d’una gammapatia monoclonal de significat incert (GMSI).
Multiple myeloma is still an incurable disease. However, its treatment has changed considerably in the last two decades due to the emergence of four new drug families: proteasome inhibitors such as bortezomib, immunomodulators such as thalidomide and lenalidomide and lately monoclonal antibodies and CAR T-cells. These drugs have proven to be effective in combination with corticosteroids and alkylating agents, the agents traditionally used for the treatment of the MM, or associated with each other. Bortezomib, thalidomide and lenalidomide have been fully incorporated into everyday clinical practice, for MM first line treatment and treatment at relapse, whilst other new combinations have been approved due to their increased efficiency. In this context, two retrospective studies have been carried out. The fist one, to evaluate the impact of treatment sequencing patterns regarding new drugs and the second one to study those factors that could predict a suboptimal response to schemes with more efficient alternatives. All patients treated with MM in a consortium of three tertiary hospitals (Institut Català d’Oncologia) were registered at the time of starting therapy. To avoid selection bias, our studies were based in these registries. All epidemiological, biological, treatment and response data for all patients have been reviewed, recorded and compared using parametric and non-parametric statistics to ensure comparability between cohorts. The consensus definitions of the International Myeloma Working Group have been used to define the main variables. In the first study, survival was compared between patients initially treated with conventional chemotherapy induction regimens and at relapse with IP or IMIDs (89 patients), and patients treated with IP or IMIDs upfront (65 patients). In our cohorts, the incorporation of IMIDs and IPs to first-line treatment in patients up to 70 years of age contributes to a greater survival than the treatment with conventional chemotherapy followed by treatment with IMIDs and IP at the time of progression or relapse. Although some drug combinations have prove to be more efficient than lenalidomide and dexamethasone is still used. Our second study is focused on the characterization of patients who could benefit most from the combination of lenalidomide and dexamethasone at relapse. The kinetics of response to the first cycle and other covariates of 227 patients have been analyzed to determine the impact on response duration and overall survival. In our cohort, the achievement of a partial response after the first cycle is independently associated with a higher progression free survival. A prior history of monoclonal gammopathy of undetermined significance has also shown impact on progression free survival.

INTRODUCCIÓ: La tuberculosi continua essent un greu problema de salut pública arreu del món. El risc del nen de desenvolupar la malaltia tuberculosa després de la infecció primària i la gravetat de la pròpia malaltia, són més altes que en l’adult. L’adherència correcta al tractament antituberculós és fonamental pel control de la infecció latent i de la malaltia. L'adherència és el grau en què el pacient compleix amb el tractament prescrit i les instruccions donades pels professionals de salut. El problema rau en que els tractaments antituberculosos són diaris i a llarg termini, i sovint amb dosificacions complexes (nombre de comprimits, requisits de dejuni, toxicitat...), això pot conduir a una adherència sub-òptima, la qual cosa provoca que la malaltia no es curi, que la infecció tuberculosa latent pugui progressar a malaltia o que augmenti el desenvolupament de resistències als fàrmacs. OBJECTIUS: Avaluar l'eficàcia de quatre noves intervencions d'infermeria sobre l'adherència al tractament antituberculós en una cohort pediàtrica (<18 anys) i identificar els factors de risc d'incompliment terapèutic. MÈTODES: Estudi quasi-experimental que consta de dues fases. Els resultats obtinguts en la Fase 1, retrospectiva (2011-2013), es van comparar amb els de la Fase 2, prospectiva amb intervenció (2015-2016). L’estudi es va dur a terme a l’Hospital de Sant Joan de Déu, Barcelona, centre de referència per a la tuberculosi pediàtrica a Espanya (NCT03230409). Després de la fase 1, es varen implementar 4 intervencions dirigides per infermeres, les quals constaven de dues intervencions educatives (entrega d’informació escrita en la llengua materna del nen/família i una trucada telefònica de seguiment) i dues intervencions de monitorització (el test d'Eidus-Hamilton i un qüestionari de seguiment), totes elles realitzades exclusivament per les infermeres de l’estudi. RESULTATS: Es varen incloure un total de 359 pacients que havien rebut tractament amb fàrmacs antituberculosos per un contacte estret amb un pacient amb tuberculós (quimioprofilaxi primària) o per infecció tuberculosa latent (quimioprofilaxi secundària) o per ser tractats de malaltia tuberculosa (n = 261, Fase 1; n = 98, Fase 2 ). L'adherència al tractament antituberculós va augmentar del 74,7% en la Fase 1 al 87,8% en la Fase 2 (p = 0,014), després de la implementació de les intervencions dirigides per infermeres. En la fase 1, el compliment del tractament va ser pitjor entre els pacients tractats per infecció tuberculosa latent, en comparació amb els tractats per tuberculosi activa o per quimioprofilaxi primària. La toxicitat i les barreres culturals i lingüístiques, també es van identificar com a predictors d’adherència sub-òptima. En la Fase 2, la no adherència només es va associar amb el fet d’haver nascut a l'estranger i amb l'origen immigrant de les famílies. CONCLUSIONS: Les intervencions dirigides per infermeres semblen ser útils per augmentar l'adherència al tractament antituberculós en nens i adolescents en un entorn de poca endèmia tuberculosa. Les variables relacionades amb la població immigrada continuen essent factors de risc importants per a una adherència sub-òptima als fàrmacs antituberculosos.
INTRODUCTION: Tuberculosis remains a public health problem worldwide. The risk of developing tuberculosis after primary infection and its severity are higher in children than in adults. Proper adherence to anti-tuberculosis treatment is critical for latent infection and disease control. Adherence refers to the degree to which the patient complies with the prescribed treatment and the instructions given by healthcare professionals. The problem lies in the fact that these are long-term daily treatments with complex dosage (number of tablets, fasting requirements, toxicity, etc.), that often leads to sub-optimal adherence, which can result in the disease not being cured and the development of resistance AIMS: To evaluate the efficacy of four new nursing interventions on the adherence to anti-tuberculosis treatment in a pediatric cohort (<18 years) and to identify the risk factors for non-compliance. METHODS: Quasi-experimental study; Phase 1, retrospective (2011-2013), was compared with Phase 2, prospective with intervention (2015-2016), at Hospital de Sant Joan de Déu, Barcelona, a referral center for pediatric tuberculosis in Spain (NCT03230409). After Phase 1, 4 nurse-led interventions were implemented, including two educational interventions (written information in the child’s/families’ mother tongue and follow-up telephone calls) and two monitoring interventions (Eidus-Hamilton test and follow-up questionnaire), exclusively carried out by study nurses. RESULTS: A total of 359 patients who received anti-tuberculosis drugs after close contact with a smear-positive patient (primary chemoprophylaxis) or were treated for latent tuberculosis infection or tuberculosis disease were included (n=261, Phase 1; n=98, Phase 2). Adherence to anti-tuberculosis treatment increased from 74.7% in Phase 1 to 87.8% in Phase 2 (p=0.014), after the implementation of the nurse-led interventions. In phase 1, completion of treatment was worse among patients treated for latent infection, compared with those treated for active tuberculosis or receiving primary chemoprophylaxis. Toxicity and cultural and language barriers were also identified as predictors of non-adherence. In Phase 2, non-adherence was only associated with being born abroad and with foreign origin families. CONCLUSIONS: Nurse-led interventions seem useful in increasing adherence to anti-tuberculosis treatment in children and adolescents in a low-endemic setting. Immigrant-related variables remained major risk factors for sub-optimal adherence to anti-tuberculosis drugs.

Les nano-emulsions són emulsions amb una mida de gota molt petita i uniforme, generalment, en l'interval comprés entre els 20 i els 200nm. La seva mida característica fa que tinguin una elevada estabilitat cinètica, enfront la sedimentació o el cremat, i els confereix un aspecte transparent o translúcid. Aquest tipus de dispersions col·loïdals requereixen d'energia per a la seva formació, que pot provenir de fonts externes com ara homogeneïtzadors d'alta pressió, ultrasons, etc. (els anomenats mètodes d'emulsificació d'alta energia o de dispersió), o bé, de fonts internes, a partir de l'energia química del sistema (mètodes d'emulsificació de baixa energia o de condensació).
En la present tesi doctoral s'ha estudiat la formació de nano-emulsions de fase externa aquosa amb un elevat contingut en aigua mitjançant mètodes d'emulsificació de baixa energia adequades per la solubilització de fàrmacs pràcticament insolubles en aigua.
S'han format nano-emulsions O/W amb una mida de gota molt petita i uniforme (des de 14 fins a 70nm) mitjançant mètodes de baixa energia en sistemes aigua/tensioactiu(s) no iònic(s)/component(s) oliós(os) biocompatibles i adequats per a la seva utilització com a vehicles per a l'alliberació de principis actius. Tot i que s'han format nano-emulsions mitjançant diferents mètodes de baixa energia, el mètode òptim per a l'obtenció d'una mida de gota mínima per als sistemes estudiats ha estat l'addició d'aigua de manera successiva a mescles oli/tensioactiu mitjançant una agitació suau a 70ºC.
S'ha relacionat els estudis de comportament fàsic amb la mida de gota de les nano-emulsions obtingudes en els diferents sistemes estudiats. D'aquesta manera, les nano-emulsions dels sistemes aigua/Cremophor EL/Miglyol 812, aigua/Cremophor EL/Miglyol 812:oli de ricí 1:1, aigua/Cremophor EL/oli de ricí i aigua/Solutol HS15/Miglyol 812, en els quals s'ha identificat una fase de cristall líquid laminar en equilibri, tenen una mida de gota més petita que les obtingudes en els sistemes on no apareix aquest tipus de fase (aigua/Cremophor EL:Synperonic F68 1:1/Miglyol 812 i aigua/ aigua/Cremophor EL:polietilenglicol 400 1:1/Miglyol 812. Les transicions de fases amb la presència de cristall líquid laminar durant el procés d'emulsificació són un factor important per l'obtenció de nano-emulsions de mida de gota petita i uniforme.
Les nano-emulsions obtingudes presenten una elevada estabilitat cinètica. La mida de gota no ha excedit els 100nm durant el temps d'estudi experimental (superior a un any per a la majoria de sistemes estudiats). En cap de les nano-emulsions s'ha observat separació de fases durant l'estudi d'estabilitat cinètica.
S'han solubilitzat concentracions terapèutiques de lidocaïna i flurbiprofè, principis actius pràcticament insolubles en aigua, en nano-emulsions O/W amb un 90% d'aigua i diferents relacions oli/tensioactiu.
L'adequació de les nano-emulsions obtingudes com a vehicles per a l'administració de principis actius per via transdèrmica s'ha estudiat mitjançant la idoneïtat in vivo per ser aplicades sobre la pell i la permeació in vitro d'un principi actiu liposoluble, lidocaïna, solubilitzat en les nano-emulsions.
La determinació de la pèrdua transepidèrmica d'aigua i la mesura del canvi de color de la pell han posat de manifest que les nano-emulsions dels sistemes aigua/Cremophor EL/Miglyol 812 i aigua/Solutol HS15/Miglyol 812 no destrueixen l'estructura de la capa còrnia ni produeixen eritemes, de manera que, probablement, no alteren la integritat de la funció de barrera la pell.

Les velocitats de permeació, 80 a 149 micrograms/cm2h i de temps de latència de 0,17 a 0,69h obtinguts per la lidocaïna solubilitzada en les nano-emulsions dels sistemes aigua/Cremophor EL/Miglyol 812 i aigua/Solutol HS15/Miglyol 812 són molt inferiors a les obtingudes amb una formulació comercialitzada d'hidroclorur de lidocaïna.
Nano-emulsions are a type of emulsions with uniform and extremely small droplet size, in the range 20-200nm. Due to their characteristic size, nano-emulsions are optically transparent or translucent and they have high kinetic stability against creaming or sedimentation. As they are non-equilibrium systems, energy is required for their formation. The emulsification methods using mechanical energy are called high-energy or dispersion emulsification methods and those which use the chemical energy stored in the components are named low-energy or condensation emulsification methods.
The objectives of the present doctoral thesis have been to study nano-emulsion formation with biocompatible components using low-energy emulsification methods suitable for the solubilization of non-water soluble drugs.
O/W nano-emulsions with very small droplet sizes (from 14 to 70nm) have been formed in water/non-ionic surfactant/oil systems by using low-energy emulsification methods. The lowest droplet sizes and polydispersity indexes have been obtained by the emulsification method consisting of stepwise addition of water at 70ºC.
Phase transitions during emulsification involving one lamellar liquid crystalline phase seem to be a key factor to obtain nano-emulsions with a small and uniform droplet size.
Nano-emulsions show high kinetic stability: no phase separation occurred during the experimental study time (more than one year for the greater part of formulations). Moreover, droplet sizes of nano-emulsions have not exceeded 100nm during the kinetic stability study.
Solubilization of therapeutic concentrations of practically non-water soluble drugs, lidocaine and flurbiprofene, has been achieved in O/W nano-emulsions with 90 wt% of water content and different O/S ratios.
To assess the suitability of nano-emulsions as vehicles for transdermal delivery of drugs in vivo acceptability studies of formulations to be applied on the skin and in vitro permeation studies have been carried out. Stratum corneum structure has not been affected and erythema doesn't appear after application of nano-emulsions in vivo. In vitro delivery of lidocaine across the skin has been efficient with a short lag-time suggesting a potentially useful pharmaceutical application for these novel formulations.

En la present memòria es presenten diferents estratègies analítiques basades en MLC per a la determinació de antirretrovirals i antivirals usats en la terapia HAART (prescrita contra la SIDA) en mostres de plasma i sèrum. En primer lloc, es proposà un mètode general capaç de detectar en sèrum els tretze farmacs més habituals en HAART: aciclovir, didanosina, ganciclovir, estavudina, zidovudina, abacavir, lamivudina, nevirapina, valaciclovir, zalcitabina, efavirenz, indinavir i ritonavir. Així doncs, es pot aplicar com a mètode de cribat per a identificar els medicaments que ha ingerit un determinat pacient. Posteriorment, es desenvoluparen cinc mètodes analítics, centrant-se en la quantificació simultànea dels tres o quatre antirretrovirals que formen cada un dels cinc tractaments HAART més prescrits: HAART1 (lamivudina + zidovudina + efavirenz), HAART2 (estavudina + lamivudina + efavirenz), HAART3 (lamivudina + tenofovir + efavirenz) en sèrum, HAART4 (abacavir + lamivudina + raltegravir) i HAART5 (darunavir + ritonavir + emtricitabine + tenofovir), en plasma. En tots els cassos s'utilitzen columnes apolars C18 com a fases estacionàries i dissolucions del tensiactiu docecil sulfat sòdic (SDS) per damunt de la concentració micel¿lar crítica, tamponades amb fosfat, i circulant en mode isocràtic a 1 mL/min, com a fase mòbil. Tanmateix, a tots els cassos la detecció es va realitzar per absorció UV-Visible.

La Tesi Doctoral que porta per títol, "Diferents estratègies per augmentar la sensibilitat en electroforesi capil·lar. Aplicació a la determinació de fàrmacs antiinflamatoris", s'ha basat en el desenvolupament de diferents estratègies per a disminuir els límits de detecció (LODs) de l'electroforesi capil·lar (CE) a la determinació de fàrmacs antiinflamatoris. Les estratègies desenvolupades s'han basat en la injecció d'un gran volum de mostra en el capil·lar mitjançant l'aplicació de tècniques de preconcentració tant electroforètiques com cromatogràfiques, i en l'ús de l'espectrometria de masses (MS) com a sistema de detecció per augmentar la capacitat de detecció dels analits.
La present Tesi Doctoral s'ha centrat en la determinació de fàrmacs antiinflamatoris no esteroïdals (NSAIDs) en el medi ambient aquàtic a baixos nivells de concentració. L'interès a la determinació d'aquests ha augmentat molt darrerament degut al seu elevat consum tant en espècies humanes com en animals. Aquests fàrmacs arriben a les estacions de tractament d'aigües residuals (EDAR) a través de diferents procedències, i posteriorment aquests poden entrar en el medi ambient aquàtic degut a la seva gran estabilitat.

Diferents estudis han demostrat la determinació d'aquests fàrmacs a nivells de baixos ng·L-1 en les aigües superficials. Aquests estudis s'han realitzat principalment tant per cromatografia de gasos (GC) com per cromatografia de líquids (HPLC) emprant l'MS com a sistema de detecció. L'CE també ha estat emprada per la determinació d'aquests fàrmacs, però la seva aplicació principal ha estat en l'anàlisi de mostres biològiques.

Tot i els grans avantatges que proporciona la tècnica d'CE, aquesta presenta una baixa sensibilitat que limita la determinació d'analits a baixos nivells de concentració. Aquest fet és degut com a conseqüència del petit volum de mostra que es pot injectar en el capil·lar i del petit camí òptic que tenen els capil·lars que sutilitzen. Amb l'objectiu de millorar la sensibilitat de la tècnica i
d'ampliar la seva aplicabilitat en altres camps, com el mediambiental, el desenvolupament de diferents estratègies per a disminuir els LODs són molt importants i són objecte d'estudi de diferents grups d'investigació.

En la present Tesi Doctoral s'han aplicat i comparat diferents tècniques de preconcentració electroforètiques per la determinació d'aquests fàrmacs en els diferents modes electroforètics, com l'electroforesi capil·lar per zones (CZE), la cromatografia capil·lar de microemulsió electrocinètica (MEEKC) i la cromatografia capil·lar micel·lar electrocinètica (MEKC). La majoria d'aquestes tècniques s'han basat en la supressió del flux electroosmòtic (EOF) per eliminar la matriu de la mostra del capil·lar desprès d'haver injectat un gran volum de mostra. L'avantatge d'addicionar un supressor de l'EOF al medi electrolític és que aplicant un sol voltatge negatiu es duu consecutivament la preconcentració i la separació electroforètica.

L'aplicació d'una tècnica de preconcentració cromatogràfica, basada en l'acoblament in-line entre l'extracció en fase sòlida (SPE) i l'CE, també s'ha aplicat a la determinació de NSAIDs en una mostra d'aigua. El gran potencial de les tècniques de preconcentració tant electroforètiques com cromatogràfiques és que ha permès la determinació d'aquests fàrmacs a nivells de ng·L-1. Aquests resultats s'han obtingut emprant prèviament la tècnica d'SPE off-line per preconcentrar els analits i netejar la matriu de la mostra.

Una altra estratègia emprada per la determinació de NSAIDs en el medi ambient aquàtic ha estat l'ús de l'MS com a sistema de detecció. Aquest acoblament permet la confirmació i la identificació dels diferents analits que puguin estar presents en una mostra. D'aquesta manera, ha estat possible la determinació dels fàrmacs en estudi en aigües superficials i la identificació d'aquests en les aigües procedents de diferents estacions EDAR. En aquest cas s'han emprat com a tècniques de pretractament la tècnica d'SPE off-line, i la combinació de l'extracció líquid-líquid (LLE) i l'SPE off-line, respectivament.
The entitled Doctoral Thesis, "Diferents estratègies per augmentar la sensibilitat en electroforesi capil·lar. Aplicació a la determinació de fàrmacs antiinflamatoris", has been based on the development of different strategies to decrease the limits of detection (LODs) in capillary electrophoresis (CE) to determine anti-inflammatory drugs. The developed strategies have been based on injecting a large volume of sample into the capillary by application electrophoretic and chromatographic preconcentration techniques, and using the mass spectrometry (MS) as the detection system to increase the detection capacity of the analytes.
This Doctoral Thesis has been centred on the determination of nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) in the aquatic environment at low concentration levels. In the last years, the interest to determine them has considerably grown due to the high consume in humans and in animals. These drugs arrive in the sewage treatment plants (STPs) by different source, and subsequently these can entry into the aquatic environment due to its high stability.
Different studies have demonstrated the determination of these drugs at low ng·L-1 levels in surface waters. These studies have principally carried out by gas chromatography (GC) and liquid chromatography (HPLC) by using mass spectrometry as the detection system. CE has also been used to determine these drugs, but its principal application has been for the analysis of biological samples.

Although the high advantages that presents the technique, this shows a low sensitivity that overcomes the determination of analytes at low concentration levels. This is a consequence of the low amount of sample that can be injected into the capillary and the small path length. With the aim of improving the sensitivity and extending the CE applicability in others fields, such as the
environmental, then the development of different strategies to decrease the LODs are very important and these are object of studying of different research groups.

In this Doctoral Thesis have been applied and compared different electrophoretic preconcentration techniques to determine these drugs in the different electrophoretic modes, such as capillary zones electrophoresis (CZE), microemulsion electrokinetic capillary chromatography (MEEKC) and micellar electrokinetic capillary chromatography (MEKC). Frequently, in these preconcentration techniques the sample matrix has been removed from the capillary by suppressing the electroosmotic flow (EOF). The advantage of adding an EOF suppressor in the electrophoretic medium is that the preconcentration and the electrophoretic separation can consecutively be performed by applying an only negative voltage.

The application of a chromatographic preconcentration technique, based on the in-line coupling between solid phase extraction (SPE) and CE, has also been applied to determine NSAIDs in water samples. The high potential of the electrophoretic and the chromatographic preconcentracion techniques, is that allow to determine these drugs at ng·L-1 levels. These results have been obtained by using the technique off-line SPE to preconcentrate the analytes and to clean-up the sample matrix before the application of the preconcentration technique.

Other strategy used to determine NSAIDs in the aquatic environment at low levels has been the use of MS as the detection system. This coupling allows confirming and identifying the presence of the analytes in the sample. So, it has been possible the determination of the studied drugs in surface waters and their identification in the STPs. In this study, the technique off-line SPE and the combination of liquid-liquid extraction (LLE) and off-line SPE off-line, respectively, have been used as the sample pretreatment technique.

L'olomoucina i la roscovitina són dos inhibidors de les cinases dependents de ciclines (CDKs) que actuen competint pel lloc d'unió de l'ATP. Presenten una alta especificitat "invitro"davant de la CDK1, 2, 5, 7, 9 i les ERKs. Aquest perfil inhibidor els confereix unes amplies perspectives en la teràpia antitumoral.En aquest treball, hem mostrat que la línia neuroblàstica de les SH-SY5Y i la promielocítica de les HL60, morien apoptòticament en resposta a ambdós fàrmacs. Una caracterització més extensa del procés, va evidenciar que la sobre expressió de Bcl-2 o Bcl-XL no conferien resistència. En canvi, la inhibició general de les caspases amb z-VAD-fmk, frenava parcialment la mort. En conseqüència, vam hipotetitzar que ens trobàvem davant d'una via extrínseca d'apoptosi, dependent de l'activació de la caspasa 8 (CASP8) o de la caspasa 10 (CASP10). Tanmateix, les CASP8/10 no s'expressen a les SH-SY5Y ja que els seus gens han estat metilats, i és més, no vam observar que es reexpressessin en resposta a l'olomoucina o la roscovitina. En conclusió, la implicació al nostre paradigma experimental d'una via extrínseca canònica d'apoptosi va ser descartada. D'altra banda, la inhibició de la síntesi de proteïnes protegia les SH-SY5Y de l'apoptosi. Curiosament, vam observar l'existència de sinergisme de rescat entre el z-VAD-fmk i ,per exemple, la cicloheximida, fet que suggeria l'existència de diferents vies apoptòtiques en diferents subpoblacions del cultiu cel·lular. La manca de toxicitat del tractament amb PD98059 o UO126, dos inhibidors de la via Erk1/2, anava en contra de que la inhibició de Erk1/Erk2 fos la causa de l'apoptosi. És més, el tractament amb olomoucina i roscovitina induïa la fosforilació i subseqüent activació de les Erk1/2. Sorprenentment, al nostre model, l'isoolomoucina, un isòmer inactiu de l'olomoucina, causava els mateixos efectes sobre les ERKs. Basant-nos en els resultats d'iso-olomoucina, vam concloure que la fosforilació de les ERKs i la seua subseqüent activació, no estaven implicats en els fenòmens d'apoptosi, proliferació i diferenciació. Finalment, vam mostrar que les SH-SY5Y diferenciades esdevenien resistents a l'olomoucina i a la roscovitina, fet que recolzava el paper de la inhibició de les CDKs en tant que esdeveniment iniciador de la cascada apoptòtica. D'altra banda, l'olomoucina i la roscovitina són cada cop més estudiats en el context de la teràpia combinatòria enfront del càncer. Als nostres treballs, hem utilitzat la R-roscovitina, un dels dos estereoisòmers de la roscovitina. La combinació amb el docetaxel (DTX) no era sinèrgica induint mort. En canvi, la R-roscovitina sensibilitzava les SH-SY5Y a l'apoptosi induïda per la nutlina-3, un nou i prometedor f-armac inductor de la via p53.
La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad"in vitro"ante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilación génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi´o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3.
Olomoucine and roscovitine are two ATP-competing inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKs) displaying a promising profile as anticancer agents. They exhibit "in vitro"selectivity against CDK1, 2, 5, 7, 9 and ERKs. In this work, we have showed that SH-SY5Y neuroblastoma and HL-60 promielocytic cell lines died by apoptosis in response to both drugs. An extensive characterization of the process in SH-SY5Y cells has shown that neither Bcl-2 nor Bcl-XL overexpression conferred any resistance to both drugs. However, a partial protective effect was detected when cells were treated with a general inhibitor of caspases (z-VAD-fmk). Therefore, the involvement of an extrinsic pathway mediated by Caspase 8 (CASP8) or Caspase 10 (CASP10) could be hypothesised. CASP8/10 are known not to be expressed in SH-SY5Y because of gene silencing and we have found no re-expression was induced by either olomoucine or roscovitine. In conclusion, a canonical extrinsic pathway has been discarded in SH-SY5Y cells facing these drugs. On the other hand, protein synthesis inhibitors protected SH-SY5Y cells from apoptosis.Interestingly, a synergism in cell protection was observed between z-VAD-fmk and, for instance cycloheximide. This suggested different apoptotic pathways occurring in distinct subpopulations of the cell culture. No lethality was found when cells were treated with either PD98059 or UO126 drugs, two inhibitors of the Erk1/2 pathway, thus discarding, this inhibition as the cause of apoptosis. Furthermore, olomoucine and roscovitine induced the phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 proteins.Interestingly, iso-olomoucine, an inactive isomer of olomoucine, caused the same effect in our cell model.Therefore, no correlation existed between Erk1/2 phosphorylation and CDK inhibition. Based mainly on the iso-olomoucine results, we concluded that phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 were not involved in apoptosis, proliferation and differentiation of the cells. Finally, we show that differentiated SH-SY5Y cells became resistant to either olomoucine or roscovitina, thus providing support for CDK inhibition as the initiating event of these apoptotic processes. Olomoucine and roscovitine are being increasingly studied in the context of combinatorial therapy for cancer. In our studies, we have also used R-roscovitine, the right stereoisomer of roscovitine. No synergism was found when combined with docetaxel (DTX). On the contrary, R-roscovitine sensitized SH-SY5Y cells to nutlin-3 induced apoptosis, being nutlin-3 a new promising inductor of the p53 functions.
Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d´ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site d'union de l'ATP. Son profil inhibiteur est tr-es prometteur dans le traitement du cancer. Présentent une grande spécificité "in vitro"face aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d´emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de l'apoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication d'une voie extrinsèque d'apoptose qui d´ependait de l'activation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m´ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche l'expression de ces protéines et, plus encore, l'olomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, l'apoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. D'un autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de l'apoptose. De manière surprenante, on avait observé l'existence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide.Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque d'effets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie d'Erk1/2, avait écarté l'inhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de l'apoptose.Plus encore, l'olomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation d'Erk1/Erk2. De manière surprenante, l'iso-olomoucine, un isomère inactif de l'olomoucine, induisait aussi la phosphorylation et l'activation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation d'Erk1/Erk2 et son activation, n'avait pas un corr´elat avec l'apoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à l'olomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que l'inhibition des CDKs avait un role dans le d´eclenchement de l'apoptose. Alternativement, l'olomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th´erapie combinatoire face au cancer.J'ai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, l'un des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) n'avait pas des effets l´etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.

L'olomoucina i la roscovitina són dos inhibidors de les cinases dependents de ciclines (CDKs) que actuen competint pel lloc d'unió de l'ATP. Presenten una alta especificitat "invitro"davant de la CDK1, 2, 5, 7, 9 i les ERKs. Aquest perfil inhibidor els confereix unes amplies perspectives en la teràpia antitumoral.
En aquest treball, hem mostrat que la línia neuroblàstica de les SH-SY5Y i la promielocítica de les HL60, morien apoptòticament en resposta a ambdós fàrmacs. Una caracterització més extensa del procés, va evidenciar que la sobre expressió de Bcl-2 o Bcl-XL no conferien resistència. En canvi, la inhibició general de les caspases amb z-VAD-fmk, frenava parcialment la mort. En conseqüència, vam hipotetitzar que ens trobàvem davant d'una via extrínseca d'apoptosi, dependent de l'activació de la caspasa 8 (CASP8) o de la caspasa 10 (CASP10). Tanmateix, les CASP8/10 no s'expressen a les SH-SY5Y ja que els seus gens han estat metilats, i és més, no vam observar que es reexpressessin en resposta a l'olomoucina o la roscovitina. En conclusió, la implicació al nostre paradigma experimental d'una via extrínseca canònica d'apoptosi va ser descartada. D'altra banda, la inhibició de la síntesi de proteïnes protegia les SH-SY5Y de l'apoptosi. Curiosament, vam observar l'existència de sinergisme de rescat entre el z-VAD-fmk i ,per exemple, la cicloheximida, fet que suggeria l'existència de diferents vies apoptòtiques en diferents subpoblacions del cultiu cel·lular. La manca de toxicitat del tractament amb PD98059 o UO126, dos inhibidors de la via Erk1/2, anava en contra de que la inhibició de Erk1/Erk2 fos la causa de l'apoptosi. És més, el tractament amb olomoucina i roscovitina induïa la fosforilació i subseqüent activació de les Erk1/2. Sorprenentment, al nostre model, l'isoolomoucina, un isòmer inactiu de l'olomoucina, causava els mateixos efectes sobre les ERKs. Basant-nos en els resultats d'iso-olomoucina, vam concloure que la fosforilació de les ERKs i la seua subseqüent activació, no estaven implicats en els fenòmens d'apoptosi, proliferació i diferenciació. Finalment, vam mostrar que les SH-SY5Y diferenciades esdevenien resistents a l'olomoucina i a la roscovitina, fet que recolzava el paper de la inhibició de les CDKs en tant que esdeveniment iniciador de la cascada apoptòtica. D'altra banda, l'olomoucina i la roscovitina són cada cop més estudiats en el context de la teràpia combinatòria enfront del càncer. Als nostres treballs, hem utilitzat la R-roscovitina, un dels dos estereoisòmers de la roscovitina. La combinació amb el docetaxel (DTX) no era sinèrgica induint mort. En canvi, la R-roscovitina sensibilitzava les SH-SY5Y a l'apoptosi induïda per la nutlina-3, un nou i prometedor f-armac inductor de la via p53.
La olomoucina y la roscovitina son dos inhibidores de las cinasas dependientes de ciclinas (CDKs) cuyo mecanismo de acción es competir con el ATP por la unión a la enzima. Presentan una alta selectividad
"in vitro"ante la CDK1, 2, 5, 7, 9 y las ERKs. Este perfil inhibidor les confiere amplias perspectivas en la terapia antitumoral. En este trabajo, hemos mostrado que la línea de las SH-SY5Y, derivada de neuroblastoma, y la de las HL-60, derivada de una leucemia promielocítica, morían apoptoticamente en respuesta a ambos fármacos. Una caracterización más amplia del proceso apoptótico, evidenció que la expresión forzada de Bcl-2 o de Bcl-XL no conferían resistencia ante ninguna de nuestras drogas. En cambio, sí se hacían parcialmente más resistentes cuando eran tratadas con un inhibidor general de las caspasas (z-VAD-fmk). En consecuencia, nuestra hipótesis fue que nos hallábamos ante una apoptosis por vía extrínseca iniciada por la caspasa 8 (CASP8) y/o la caspasa 10 (CASP10). Curiosamente, dichas caspasas no se expresan en las SH-SY5Y debido a un proceso de metilación génica, y pudimos ver que el tratamiento tampoco inducía su reexpresión. En conclusión, descartamos que las SH-SY5Y iniciasen una vía extrínseca canónica en respuesta a nuestras drogas. Por otro lado, la inhibición de la síntesis proteica en nuestro modelo frenaba la apoptosis. Es más, el z-VAD-fmk junto con, por ejemplo, la cicloheximida, presentaban un sinergismo en el rescate. Esto sugería la coexistencia en nuestro cultivo de distintas subpoblaciones capaces de iniciar diferentes vías apoptóticas. El tratamiento con PD98059 o UO126, dos inhibidores de la via de Erk1/2, se mostró inocuo a la hora de inducir muerte, por lo cual descartamos que la inhibición de Erk1/2 fuera la responsable de la apoptosis. Sorprendentemente, el estudio del estado de fosforilación de Erk1/2, nos permitió constatar que éstas se activaban en respuesta a la olomoucina y la roscovitina. Más sorprende aún, resultó el hecho que la iso-olomoucina, un isómero inactivo de la olomoucina, causara los mismos efectos sobre Erk1/2. Esto nos permitió afirmar que no existía correlación entre la fosforilación de Erk1/2 y la inhibición de las CDKs. En base principalmente a los resultados de la iso-olomoucina, pudimos afirmar que la fosforilación de las ERKs y su subsiguiente activación, no se correlacionaban con la apoptosis, proliferación y diferenciación celular. Finalmente, evidenciamos que las SH-SY5Y diferenciadas se volvían resistentes a la olomoucina y a la roscovitina, hecho a favor de que la inhibición de las CDKs fuera el evento iniciador de la cascada apoptótica. Alternativamente, la olomoucina y la roscovitina están siendo cada vez más estudiadas en el contexto de la terapia combinatoria frente al cáncer. En nuestros experimentos, utilizamos también la R-roscovitina, uno de los dos estereoisómeros de la roscovitina. En su combinación con el docetaxel (DTX), no observamos sinergismo. El caso contrario sucedi´o cuando fue administrada junto a la nutlina-3, un nuevo y prometedor inductor de p53. Vimos como la R-roscovitina sensibilizaba las SH-SY5Y a la apoptosis inducida por la nutlina-3.
Olomoucine and roscovitine are two ATP-competing inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKs) displaying a promising profile as anticancer agents. They exhibit "in vitro"selectivity against CDK1, 2, 5, 7, 9 and ERKs. In this work, we have showed that SH-SY5Y neuroblastoma and HL-60 promielocytic cell lines died by apoptosis in response to both drugs. An extensive characterization of the process in SH-SY5Y cells has shown that neither Bcl-2 nor Bcl-XL overexpression conferred any resistance to both drugs. However, a partial protective effect was detected when cells were treated with a general inhibitor of caspases (z-VAD-fmk). Therefore, the involvement of an extrinsic pathway mediated by Caspase 8 (CASP8) or Caspase 10 (CASP10) could be hypothesised. CASP8/10 are known not to be expressed in SH-SY5Y because of gene silencing and we have found no re-expression was induced by either olomoucine or roscovitine. In conclusion, a canonical extrinsic pathway has been discarded in SH-SY5Y cells facing these drugs. On the other hand, protein synthesis inhibitors protected SH-SY5Y cells from apoptosis.
Interestingly, a synergism in cell protection was observed between z-VAD-fmk and, for instance cycloheximide. This suggested different apoptotic pathways occurring in distinct subpopulations of the cell culture. No lethality was found when cells were treated with either PD98059 or UO126 drugs, two inhibitors of the Erk1/2 pathway, thus discarding, this inhibition as the cause of apoptosis. Furthermore, olomoucine and roscovitine induced the phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 proteins.
Interestingly, iso-olomoucine, an inactive isomer of olomoucine, caused the same effect in our cell model.
Therefore, no correlation existed between Erk1/2 phosphorylation and CDK inhibition. Based mainly on the iso-olomoucine results, we concluded that phosphorylation and subsequent activation of Erk1/2 were not involved in apoptosis, proliferation and differentiation of the cells. Finally, we show that differentiated SH-SY5Y cells became resistant to either olomoucine or roscovitina, thus providing support for CDK inhibition as the initiating event of these apoptotic processes. Olomoucine and roscovitine are being increasingly studied in the context of combinatorial therapy for cancer. In our studies, we have also used R-roscovitine, the right stereoisomer of roscovitine. No synergism was found when combined with docetaxel (DTX). On the contrary, R-roscovitine sensitized SH-SY5Y cells to nutlin-3 induced apoptosis, being nutlin-3 a new promising inductor of the p53 functions.
Lólomoucine et la roscovitine sont deux inhibiteurs des kinases d´ependantes de cyclines (CDKs) qui agissent par inhibition competitive via le site d'union de l'ATP. Son profil inhibiteur est tr-es prometteur dans le traitement du cancer. Présentent une grande spécificité "in vitro"face aux CDK1, 2, 5, 7, 9 e aux ERKs. Dans ce travail, nous avons d´emontré que la lignée neuroblastique SH-SY5Y et la promyélocitique HL-60, mouraient apoptotiquement en réponse àces drogues. Une plus large caractérisation de l'apoptose dans les SH-SY5Y a mis enévidence que la surexpression de Bcl-2 ou de Bcl-XL ne se traduisait par une augmentation de la résistance au traitement. Cependant, le traitement avec un inhibiteur général des caspases (z-VAD-fmk) présentaient des effets protecteurs partiels. Au vu de ces résultats, notre hypothèse reposait sur límplication d'une voie extrinsèque d'apoptose qui d´ependait de l'activation de la caspase 8 (CASP8) ou de la caspase 10 (CASP10). Néanmoins, la m´ethylation des gènes des CASP8 et 10 dans les SH-SY5Y empèche l'expression de ces protéines et, plus encore, l'olomoucine et la roscovitine nínduiraient pas la réexpression de ces caspases. En conclusion, l'apoptose par une voie extrinsèque classique pouvait ètreécartée dans notre paradigme expérimental. D'un autre coté, les inhibiteurs de la synthèse des protéines protégeaient les SH-SY5Y de l'apoptose. De manière surprenante, on avait observé l'existence de synergie dans la protection avec z-VAD-fmk et, par exemple, le cycloheximide.
Ce fait suggérait la présence de différents sous-poupulations cellulaires dans les SH-SY5Y qui engageaient des voies apoptotiques distinctes. Le manque d'effets toxiques du PD98059 or UO126, deux inhibiteurs de la voie d'Erk1/2, avait écarté l'inhibition de Erk1/Erk2 comme la responsable de l'apoptose.
Plus encore, l'olomoucine et la roscovitine induisaient la phosphorylation et subséquente activation d'Erk1/Erk2. De manière surprenante, l'iso-olomoucine, un isomère inactif de l'olomoucine, induisait aussi la phosphorylation et l'activation dans notre modèle cellulaire. Sur base de ces résultats, nous avons conclu que la phosphorylation d'Erk1/Erk2 et son activation, n'avait pas un corr´elat avec l'apoptose, la prolifération et la différentiation cellulaire. Finalement, nous avons mis en évidence que les SH-SY5Y différentiées devenaient résistantes à l'olomoucine ou à la roscovitine. Ce fait suggérait que l'inhibition des CDKs avait un role dans le d´eclenchement de l'apoptose. Alternativement, l'olomoucine et la roscovitine sont de plus en plus étudiées dans le contexte de la th´erapie combinatoire face au cancer.
J'ai utilisé la R-roscovitine dans nos expériences, l'un des deux stéréoisomères de la roscovitine. La combinaison avec le docétaxel (DTX) n'avait pas des effets l´etaux synergiques, en revanche la R-roscovitine sensibilisait les SH-SY5Y à lápoptose par la nutline-3, un nouvel agent inducteur de la voie p53.

El melanoma és una neoplàsia maligna derivada dels melanòcits que, un cop disseminada, desenvolupa una gran resistència a la quimioteràpia i s’associa amb un mal pronòstic. Al voltant del 50% dels melanomes porten la mutació BRAFV600E. Els inhibidors de la quinasa BRAF, com el Vemurafenib, redueixen la càrrega tumoral en el melanoma disseminat. No obstant això, la resistència adquirida es produeix molt sovint i els tumors comencen a progressar sota el tractament. En estudis anteriors, hem demostrat que els canals de calci tipus T (TTCCs) estan sobreexpressats en cèl·lules de melanoma i tenen un paper important en la progressió tumoral. A més, hem descrit que els inhibidors farmacològics dels TTCCs (Mibefradil i Pimozide) redueixen la proliferació i desregulen l'autofàgia induint apoptosi. En la secció de resultats previs, hem analitzat el paper de l'autofàgia durant la migració i invasió en el melanoma. El TTCC Cav3.1 i la proteïna LC3II estan altament expressats en els melanomes BRAFV600E en comparació amb les línies cel·lulars o biòpsies que presenten la mutació NRASQ61. Per altra banda, hem constatat que el bloqueig farmacològic o el silenciament gènic dels TTCCs i la Cloroquina, inhibeixen el flux autofàgic i dificulten les capacitats d'invasió i migració cel·lulars, específicament en cèl·lules de melanoma amb la mutació BRAFV600E. Atès que Snail1 és un factor de transcripció amb un paper important en la motilitat i la invasió de les cèl·lules de melanoma, hem demostrat que Snail1 està fortament expressat en les línies cel·lulars i en biòpsies de melanoma BRAFV600E i la seva expressió disminueix quan l'autofàgia està bloquejada. En la primera part del treball, hem investigat l'impacte de la inhibició dels TTCCs en melanomes BRAFV600E resistents a Vemurafenib. Els resultats indiquen que els nivells de TTCC Cav3.1 estan incrementats en totes les línies cel·lulars resistents a Vemurafenib i en biòpsies de melanoma humà en comparació amb les seves parentals corresponents. A més, tant en les cèl·lules resistents com en les biòpsies, s’han observat nivells proteics de LC3 superiors, resultant en un augment de l'autofàgia basal. Particularment, l’inhibidor dels TTCCs, Mibefradil, indueix apoptosi i disminueix les taxes de migració i invasió mitjançant el bloqueig de l'autofàgia també en les cèl·lules resistents in vitro i en xenografts de ratolins in vivo. Per altra banda, la teràpia combinada (Vem + Mib) redueix o manté la viabilitat cel·lular i les taxes de migració i invasió segons l'estat funcional de PTEN. Així doncs, quan PTEN no és funcional, s’observa un retràs en la inducció de mort i la inhibició de la migració cel·lular amb la teràpia combinada en les línies resistents a Vemurafenib. Finalment, l'exposició combinada de Mibefradil i Vemurafanib impedeix el desenvolupament de línies de melanoma BRAFV600E resistents a inhibidors de BRAF. En conjunt, els nostres resultats suggereixen que els TTCCs podrien ser dianes terapèutiques vàlides en melanomes ja resistents a Vemurafenib i obren la porta a explorar la inhibició dels TTCCs com estratègia per evitar l’adquisició de resistències a aquest inhibidor de BRAF. En la segona part d’aquest treball, hem avaluat el potencial terapèutic de l’anticòs neutralitzant de M-CSF durant l'adquisició de resistència de les cèl·lules de melanoma BRAFV600E mitjançant l’ús de medis condicionats. El secretoma dels medis de cultius de cèl·lules resistents a Vemurafenib indueix resistència al tractament i modula el fenotip de les cèl·lules parentals. A més, hem observat que el secretoma de les cèl·lules resistents presenta un increment de la secreció de citoquines pro-tumorals, entre les que s’inclou M-CSF, la qual promou l'adquisició de resistència en melanomes BRAFV600E amb PTEN no funcional (knockout o mutació). Per altra banda, el plasma de ratolins amb tumors subcutanis de cèl·lules resistents, indueix un fenotip de resistència a les cèl·lules parentals in vitro. En conseqüència, la neutralització de la citoquina M-CSF, mitjançant l’anticòs monoclonal, inhibeix l’adquisició del fenotip de resistència en les cèl·lules de melanoma BRAFV600E amb PTEN no funcional.
El melanoma es una neoplasia maligna derivada de los melanocitos que, una vez diseminada, desarrolla una gran resistencia a la quimioterapia y se asocia con un mal pronóstico. Alrededor del 50% de los melanomas llevan la mutación BRAFV600E. Los inhibidores de la quinasa BRAF, como Vemurafenib, reducen la carga tumoral en el melanoma diseminado. Sin embargo, la adquisición de resistencia se produce muy a menudo y los tumores comienzan a progresar bajo el tratamiento. En estudios anteriores, hemos demostrado que los canales de calcio tipo T (TTCCs) están sobreexpresados en células de melanoma y tienen un papel importante en la progresión tumoral. Además, hemos descrito que los inhibidores farmacológicos de los TTCCs (Mibefradil y Pimozide) reducen la proliferación y desregulan la autofagia induciendo apoptosis. En la sección de resultados previos, hemos analizado el papel de la autofagia durante la migración e invasión en el melanoma. El TTCC Cav3.1 y la proteína LC3II están altamente expresados en los melanomas BRAFV600E en comparación con las líneas o biopsias que presentan la mutación NRASQ61. El bloqueo farmacológico o el silenciamiento génico de los TTCCs y la Cloroquina, inhiben el flujo autofágico y dificultan las capacidades de migración e invasión, específicamente en células de melanoma BRAFV600E. Dado que Snail1 tiene un papel importante en la motilidad y la invasión de las células de melanoma, hemos demostrado que Snail1 está fuertemente expresado en las líneas celulares y biopsias de melanoma BRAFV600E y su expresión disminuye cuando la autofagia está bloqueada. En la primera parte del trabajo, hemos investigado el impacto de la inhibición de los TTCCs en melanomas BRAFV600E resistentes a Vemurafenib. Los resultados indican que los niveles de TTCC Cav3.1 están incrementados en todas las líneas celulares resistentes a Vemurafenib y en biopsias de melanoma humano en comparación con sus parentales correspondientes. Además, tanto en las células resistentes como en las biopsias, se observaron niveles proteicos de LC3 superiores, resultando en un aumento de la autofagia basal. Particularmente, el inhibidor de los TTCCs, Mibefradil, induce apoptosis y disminuye las tasas de migración mediante el bloqueo de la autofagia también en las células resistentes in vitro y en xenografts de ratones in vivo. Por otra parte, la terapia combinada (Vem + Mib) reduce o mantiene la viabilidad celular y las tasas de migración e invasión según el estado funcional de PTEN. Así pues, cuando PTEN no es funcional, se observa un retraso en la inducción de muerte y la inhibición de la migración celular con la terapia combinada en las líneas resistentes a Vemurafenib. Finalmente, el Mibefradil inhibe la adquisición de resistencia en las células de melanoma BRAFV600E en combinación con Vemurafenib. En conjunto, nuestros resultados sugieren que los TTCCs podrían ser dianas terapéuticas válidas en melanomas ya resistentes a Vemurafenib y abren la puerta a explorar la inhibición de los TTCCs como estrategia para evitar la adquisición de resistencias a este inhibidor de BRAF. En la segunda parte, hemos evaluado el potencial terapéutico del anticuerpo neutralizante de M-CSF durante la adquisición de resistencia de las células de melanoma BRAFV600E mediante el uso de medios condicionados. El secretoma de los cultivos celulares de células resistentes a Vemurafenib induce resistencia al tratamiento y modula el fenotipo de las células parentales. Además, hemos observado que el secretoma de las células resistentes presenta un incremento de la secreción de citoquinas pro-tumorales entre las que se incluye M-CSF, que promueve la adquisición de resistencia en melanomas BRAFV600E con PTEN no funcional (knockout o mutación). Además, el plasma de ratones con tumores subcutáneos de células resistentes, induce un fenotipo de resistencia a las células parentales in vitro. En consecuencia, la neutralización de M-CSF, mediante el anticuerpo monoclonal, inhibe la adquisición del fenotipo de resistencia en las células de melanoma BRAFV600E con PTEN no funcional.
Melanoma is a malignant neoplasia derived from melanocytes that once disseminated becomes highly resistant to chemotherapy and is associated with poor prognosis. Around 50% of melanomas carry the BRAFV600E mutation. Targeting BRAF mutant kinase by inhibitors, such as Vemurafenib, reduce tumor burden in disseminated melanoma. However, acquired resistance very frequently develops and tumors begin to progress under treatment. In previous studies, we have reported that T-type calcium channels (TTCCs) are overexpressed in melanoma cells and play an important role in melanoma progression. Importantly, TTCC pharmacological blockers (Mibefradil and Pimozide) reduce proliferation and deregulate autophagy leading to apoptosis. Therefore, in the previous results section, we analyzed the role of autophagy during migration and invasion processes of melanoma cells. TTCCs Cav3.1 and LC3II protein are highly expressed in BRAFV600E both in cell lines and biopsies compared to NRASQ61 mutant melanomas. Pharmacological blockade or gene silencing of TTCCs and Chloroquine, inhibit the autophagic flux and impair the migration and invasion capabilities, specifically in BRAFV600E melanoma cells. Because of Snail1 plays an important role in motility and invasion of melanoma cells, we showed that Snail1 is strongly expressed in BRAFV600E melanoma cells and patient biopsies, and its expression decreases when autophagy is blocked. In the first part of this work, we investigated the impact of inhibiting TTCCs in Vemurafenib resistant BRAFV600E melanomas. The results indicate that TTCC Cav3.1 is highly expressed in all Vemurafenib resistant melanoma cell lines and human melanoma biopsies compared to their parental counterparts. Besides, in Vemurafenib resistent cells or biopsies, we observed higher LC3 protein levels, in turn, increased autophagy. Particularly, TTCC blocker, Mibefradil, induces apoptosis and impaires migration rates while inhibiting autophagy in Vemurafenib resistent cells cells in vitro and in mouse xenografts in vivo. In addition, combination therapy (Vem+Mib) reduced or restored cell viability and migration/invasion rates depending on PTEN status. Therefore, when PTEN is non-functional, there is a delay in the death induction and an inhibition of cell migration in combination therapy in Vemurafenib resistant cell lines. Finally, Mibefradil inhibits the acquisition of resistance in BRAFV600E melanoma cells in combination with Vemurafenib. Taken together, our results suggest TTCCs as targetable in Vemurafenib resistant BRAFV600E melanomas and open the possibility to explore TTCC inhibition as a tool to avoid the acquisition of resistance to this BRAF inhibitor. In the second part of the present word, we have evaluated the therapeutic potential of M-CSF neutralizing antibody during resistance acquisition to BRAFi of BRAFV600Emelanoma cells by conditioned media. First, supernatant of cell cultures from resistant melanomas induces therapy resistance and modulates the phenotype of parental cells. Furthermore, we have observed that Vemurafenib resistant secretoma presents an increase of pro-tumor cytokines secretion, including M-CSF that promotes the acquisition of resistance in BRAFV600E melanomas with loss of PTEN (knockout o mutation). On the other hand, plasma mice from subcutaneous tumors of resistant cells induce a resistant phenotype in cultured parental cells. Consequently, M-CSF neutralization by monoclonal antibody inhibits resistance development in BRAFV600E melanomas with non-functional PTEN.

Calcineurina (Cn), l'única serina treonina fosfatasa dependent de Ca2+ i calmodulina identificada fins al moment, és un enzim clau en la regulació de diverses vies de senyalització cel·lular, entre elles, l'activació limfocitària. Actualment, els protocols d'immunosupressió inclouen l'ús de fàrmacs anticalcineurínics, CsA i FK506, però la seva administració continuada comporta l'aparició de greus efectes secundaris. En els darrers anys s'han descrit diversos inhibidors endògens de Cn, entre ells la família de les calcipressines o regulators of calcineurin (RCAN), que en humans consta de tres membres RCAN1, RCAN2 i RCAN3. Fins al moment de realitzar aquest treball s'havia descrit que RCAN1 interacciona i inhibeix l'activitat fosfatasa de Cn respecte la família de factors de transcripció NFAT a diversos teixits, però no s'havia estudiat a limfòcits T humans. Per això, es va analitzar la interacció de les proteïnes RCAN1 i RCAN3 amb Cn a limfòcits T, així com avaluar el potencial immunosupressor de dites interaccions respecte a la via de senyalització Cn-NFAT.
Els resultats obtinguts han mostrat que els transcrits RCAN1-1 i RCAN3-1,2,3,4,5 s'expressen a nivell basal en línies cel·lulars de limfòcits T humans, Jurkat i Hut78, mentre que el transcrit RCAN1-4, no. A més, l'expressió gènica de RCAN1-4 depén d'un senyal de Ca2+-Cn, mentre que l'expressió dels altres dos transcrits analitzats, no. Mitjançant experiments de co-immunoprecipitació s'ha demostrat que en cèl·lules Jurkat, la interacció RCAN1-1-Cn te lloc de manera endògena i mitjançant assaigs de pull down s'han identificat els dos motius de RCAN1-1 implicats, el motiu CIC i el motiu PxIxxT. En el cas de RCAN3-2, s'ha descrit per primer cop que aquesta proteïna sobreexpressada interacciona amb Cn i que ho fa únicament a través del seu corresponent motiu CIC. Assaigs funcionals in vivo han mostrat que únicament el motiu CIC de les RCAN és el responsable directe de la inhibició de la via de senyalització Cn-NFAT. Com a conseqüència, en cèl·lules Jurkat, s'ha demostrat el potencial immunosupressor del motiu CIC de les RCAN respecte l'expressió gènica de diverses citoquines dependents de NFAT. L'acotament del motiu CIC de les RCAN ha permès identificar una seqüència de 21 aminoàcids, a la qual s'ha anomenat C18, i que correspon a la regió mínima de les RCAN capaç d'inhibir la via de senyalització Cn-NFAT.
Les interaccions C18-RCAN1-Cn i C18-RCAN3-Cn han estat posades a punt i caracteritzades in vitro mitjançant anisotropia de fluorescència. A més, s'ha demostrat que les proteïnes RCAN i NFAT s'interfereixen en la seva interacció amb Cn i que probablement les interaccions C18-RCAN1-Cn i C18-RCAN3-Cn no impliquen la participació directa del centre actiu de Cn. En conjunt, aquests resultats suggereixen que l'efecte immunosupressor de les RCAN seria més específic que el que promouen els fàrmacs inhibidors de Cn, CsA i FK506, utilitzats actualment. Amb la finalitat d'identificar noves molècules amb potencial immunosupressor es van realitzar diversos cribratges utilitzant quimioteques combinatòries que disruptin la interacció C18-RCAN1-Cn. A partir d'aquests experiments s'han identificat quatre hexapèptids i un producte denominat IDI3A que desplacen de manera dosi-dependent la interacció analitzada. L'avaluació funcional del producte IDI3A ha demostrat que aquest inhibeix in vivo la via de senyalització Cn-NFAT i que per tant, te cert efecte immunosupressor. Aquestes dades indiquen que, tant els pèptids C18 de les RCAN com l'assaig in vitro que s'ha dissenyat, constitueixen dues noves eines útils en la cerca de molècules amb potencial immunosupressor.
Calcineurin (Cn), a calcium and calmodulin dependent serine-threonine protein phosphatase, is a key enzyme involved in many cellular processes, including T cell activation. Activated Cn dephosphorylates many substrates, among them the nuclear factor of activated T cells (NFAT) transcription factors, inducing their translocation to the nucleus. There, NFAT are key components of the cytokine gene expression stimulation that triggers T cell activation. Current immunosuppressive protocols include the administration of CsA and FK506, but their continuous use has been correlated with severe side effects. Recently, several Cn endogenous inhibitors have been described, including the protein family of Cn regulators (RCAN, previously known as calcipressins or DSCR1). In the present study it has been characterized the RCAN1 and RCAN3 interaction with Cn in human T lymphocytes. Moreover, it has been evaluated the functional consequence of these interactions towards the Cn-NFAT signalling pathway in vivo.
It has been shown that RCAN1-1 interacts endogenously with Cn in T cells and such interaction takes place through two independent RCAN1-1 sequences, the CIC and the PxIxxT motifs. Moreover, it has been described for the first time that RCAN3-2 binds to Cn and this interaction occurs only through the RCAN3-2 CIC motif. In vivo functional assays have shown that the RCAN CIC motif is the unique direct responsible for the inhibition of the Cn-NFAT signalling pathway. In human T cells, the RCAN CIC motif inhibits NFAT-dependent cytokine gene expression confirming its immunosuppressive effect.
Moreover, it has been identified the minimal RCAN-derived sequence spanning 21 amino acids, which is part of the RCAN CIC motif, that retains the ability of inhibiting the Cn-NFAT signaling in vivo. Peptides spanning this sequence from RCAN1 and RCAN3, have allowed to study the binding mechanism of RCAN proteins to Cn. In vitro, these RCAN-derived peptides bind to Cn with high affinity and selectively inhibit the interaction of Cn with NFAT. Indeed, by screening chemical and peptide libraries, four hexapeptides and a product called IDI3A that modulates the RCAN-Cn interaction in vitro have been identified. In addition, it has also been demonstrated that the IDI3A product inhibits the Cn-NFAT signaling pathway in vivo.

A great deal of efforts has been made to improve and expand pharmacological testing and optimisation of drug candidates during the discovery process. However, we are yet to understand fully why drugs require certain levels of affinity for their mechanism of action targets to exert their therapeutic effect. In parallel, the mechanistic understanding of the endogenous metabolome has been demonstrated to have incredible implications in drug discovery, being potentially one of the pillars of precision medicine. Endogenous metabolites are small molecules evolutionally optimised to interact in an appropriate way with its native protein with a specific level of affinity. This Thesis provides evidences that the level of affinity required by a drug to interact with its primary target and produce a therapeutic effect is related to the affinity of the native endogenous metabolite for that target. In addition, this Thesis also highlights the implications that the human endogenous metabolome could have to assess a more realistic drug polypharmacology landscape and the risk of safety events linked to it. Finally, an analysis of natural compound pharmacology on the perspective of the endogenous metabolome is also performed. All results indicate that understanding the role of the human metabolome and its implications on drug bioactivity could offer a new useful perspective in drug efficacy and safety
S’han realitzat grans esforços per millorar i ampliar l’avaluació farmacològica i l’optimització de les molècules candidates durant el procés de descobriment de fàrmacs. Tot i això, encara no es coneix amb exactitud per què els fàrmacs necessiten certs nivells d’afinitat amb les seves dianes d’acció per tal de produir l’efecte terapèutic buscat. Paral·lelament, s’ha demostrat que la comprensió del metaboloma endogen té grans implicacions en el descobriment de nous fàrmacs i és potencialment un pilar de la medicina de precisió. Els metabòlits endògens són molècules petites optimitzades evolutivament per interaccionar de forma apropiada amb la seva proteïna nativa amb un nivell d’afinitat específic. Aquesta Tesi aporta evidències que l’afinitat necessària per tal que un fàrmac interaccioni amb la seva diana primària i produeixi un efecte terapèutic concret està relacionada amb l’afinitat del metabòlit endogen natiu amb aquesta mateixa diana. A més, aquesta Tesi també posa de manifest les implicacions que pot tenir el metaboloma endogen humà per tal d’avaluar, de forma més realista, la polifarmacologia dels fàrmacs i els seus efectes secundaris associats. Finalment, també s’ha realitzat una anàlisi de la farmacologia dels compostos naturals incorporant la informació del metaboloma endogen. Tots aquests resultats indiquen que entendre el rol del metaboloma humà i les seves implicacions en la bioactivitat dels fàrmacs pot oferir una perspectiva nova i útil per a millorar l'eficàcia i la seguretat dels fàrmacs.

Actualment no existeix cap medicament aprovat pel tractament de la Síndrome de l’Ovari Poliquístic (PCOS), un dels desordres endocrins més freqüent en dones en edat reproductiva, amb una prevalença creixent i que es caracteritza per tenir una fisiopatologia complexa amb interacció de múltiples factors. La comunitat científica ha posat de manifest la necessitat d’incrementar la recerca de nous tractaments dirigits a la normalització del component endocrino-metabòlic causant de la síndrome, els quals suposarien un canvi de paradigma en el tractament de la PCOS i permetrien reduir les complicacions derivades i per tant, l’impacte socioeconòmic d’aquesta síndrome. L’ús en combinació de dos fàrmacs sensibilitzants a la insulina i un fàrmac antiandrogènic ha demostrat, en la darrera dècada, ser una aproximació terapèutica molt prometedora capaç de millorar la simptomatologia de la PCOS a través de la reducció del greix hepato-visceral. Aprofitant l’evidència disponible, i l’interès creixent en PCOS, es proposa desenvolupar un nou medicament basat en la combinació de 3 principis actius coneguts i elaborar un pla de desenvolupament viable i òptim pel seu registre com a medicament a Europa (EU) i Estats Units (EUA). El desenvolupament farmacèutic basat en la qualitat des del disseny i centrat en la combinació a dosis fixes dels tres principis actius (50mg espironolactona, 7,5mg pioglitazona, 850mg metformina; SPIOMET) ha permès desenvolupar una formulació viable i estable del nou medicament SPIOMET en forma de comprimits d’administració oral, amb una biodisponibilitat comparable als productes de referència individuals existents. El pla de desenvolupament clínic proposat s’ha basat en l’agrupació de l’evidència disponible de l’ús dels tres fàrmacs administrats individualment per PCOS com a base principal de l’evidència clínica de SPIOMET i s’ha contrastat en un procés d’assessorament científic amb les agències del medicament Europea (EMA) i Americana (FDA). El pla clínic resultant inclou una seqüència d’estudis de Fase I, II i III que haurien de permetre demostrar la seguretat i l’eficàcia de SPIOMET amb un balanç benefici-risc favorable per la futura autorització del nou medicament per PCOS a EU i EUA. En conjunt, el pla de desenvolupament global elaborat per aquest projecte, gràcies al racional científic i regulatori que el suporta, podria ser més accelerat i amb una inversió menor que altres productes innovadors per noves indicacions, en un escenari en què no es produïssin resultats tècnics inesperats ni canvis imprevistos de regulació, i amb un ús adequat dels recursos. Això transforma SPIOMET en un projecte diferencial i molt atractiu.
Actualmente no existe ningún medicamento aprobado para el tratamiento del Síndrome del Ovario Poliquístico (PCOS), uno de los desórdenes endocrinos más frecuentes en mujeres en edad reproductiva, con una prevalencia creciente y caracterizado por tener una fisiopatología compleja con interacción de múltiples factores. La comunidad científica ha destacado la necesidad de incrementar la investigación de nuevos tratamientos dirigidos a la normalización del componente endocrino-metabólico causante del síndrome, los cuales supondrían un cambio de paradigma en el tratamiento del PCOS y permitirían reducir las complicaciones derivadas y, por tanto, el impacto socioeconómico de este síndrome. El uso en combinación de dos fármacos sensibilizantes a la insulina y un fármaco antiandrogénico ha demostrado, en la última década, ser una aproximación terapéutica muy prometedora capaz de mejorar la sintomatología de PCOS a través de la reducción de la grasa hepato-visceral. Aprovechando la evidencia disponible, y el interés creciente en PCOS, se propone desarrollar un nuevo medicamento basado en la combinación de tres principios activos conocidos y elaborar un plan de desarrollo viable y óptimo para su registro como medicamento en Europa (EU) y Estados Unidos (EUA). El desarrollo farmacéutico basado en la calidad desde el diseño y centrado en la combinación a dosis fijas de los tres principios activos (50mg espironolactona, 7,5mg pioglitazona, 850mg metformina; SPIOMET) ha permitido desarrollar una formulación viable y estable del nuevo medicamento SPIOMET en forma de comprimidos de administración oral, con una biodisponibilidad comparable a los productos de referencia individuales existentes. El plan de desarrollo clínico propuesto se ha basado en la agrupación de la evidencia disponible del uso de los tres fármacos administrados individualmente para PCOS como base principal de la evidencia clínica de SPIOMET y se ha contrastado en un proceso de asesoramiento científico con las agencias del medicamento Europea (EMA) y Americana (FDA). El plan clínico resultante incluye una secuencia de estudios de Fase I, II y III que deberían permitir demostrar la seguridad y la eficacia de SPIOMET con un balance beneficio-riesgo favorable para la futura autorización del nuevo medicamento para PCOS en EU y EUA. En conjunto, el plan de desarrollo global elaborado en este proyecto, gracias al racional científico y regulatorio que lo soporta, podría ser más acelerado y con una inversión menor que otros productos innovadores para nuevas indicaciones, en un escenario en que no se produjeran resultados técnicos inesperados ni cambios imprevistos de regulación y con un uso adecuado de los recursos. Esto transforma SPIOMET en un proyecto diferencial y muy atractivo.
There is currently no drug approved specifically for the treatment of Polycystic Ovary Syndrome (PCOS), one of the most common endocrine disorder of reproductive-aged women, with a growing prevalence and characterized by complex pathophysiology with an interplay of multiple factors. The scientific community has highlighted the need to increase the research for new treatments aimed primarily at normalizing the endocrine-metabolic features underlying the syndrome, this would represent a new paradigm in the treatment of PCOS that would reduce the known long-term morbidities, and therefore the socioeconomic impact of this syndrome. The use in combination of two insulin sensitizing drugs and an antiandrogenic drug has shown in the last decade to be promising therapeutic approach able to improve PCOS symptomatology through the reduction of hepato-visceral fat. Taking advantage of the available evidence, and the growing interest in PCOS, it is proposed to develop a new fixed-dose combination drug of the three known active ingredients and to design a viable and optimal development plan for a new drug application in Europe (EU) and United States of America (USA). The pharmaceutical development based on quality by design and focused on the fixed dose combination of the three active ingredients (50mg spironolactone, 7.5mg pioglitazone, 850mg metformin; SPIOMET) has enabled the development of a viable and stable formulation of the new SPIOMET tablets for oral administration, with a comparable bioavailability to the existing individual reference products. The proposed clinical development plan has been based on the available evidence of the use of the three drugs administered as individual products or co-administered in PCOS as the main basis of the clinical evidence of SPIOMET and has been submitted in a scientific advice with European (EMA) and American (FDA) drug agencies. The resulting clinical plan includes a sequence of Phase I, II and III studies that should allow to demonstrate the safety and the effectiveness of SPIOMET with a favorable risk-benefit ratio for the future authorization of the new PCOS treatment in EU and USA. Overall, thanks to the scientific and regulatory rational supporting the project, the development plan designed could be more accelerated and with less investment than other innovative products for new indications, in a scenario that no unexpected technical results or unforeseen changes in regulation occurred and with a proper use of the resources. This turns SPIOMET into a differential and very attractive project.

Se ha llevado a cabo la síntesis y evaluación farmacológica de dos nuevas familias de inhibidores de acetilcolinesterasa de sitio de unión dual, los heterodímeros huprina-tacrina y los heterodímeros donepezilo-tacrina. Los ensayos farmacológicos han puesto de manifiesto que estos compuestos poseen una afinidad y potencia inhibidora extraordinariamente aumentadas respecto a los compuestos modelo, hecho que los presenta como interesantes candidatos a fármacos anti-Alzheimer. Paralelamente, como consecuencia de unos resultados inesperados obtenidos en el contexto de la síntesis de los heterodímeros donepezilo-tacrina, se han llevado a cabo unos estudios adicionales basados en la síntesis, purificación y caracterización de diversos compuestos espiropolicíclicos complejos de esteroquímica relativa perfectamente definida, obtenidos por reacción multicomponente indanona y aldehídos como productos de partida, orientados a profundizar en el efecto de la substitución en el curso de la reacción, y de paso, con la ayuda a métodos químico-teóricos, dirigidos a proponer un mecanismo definitivo para esta interesante reacción.

Els productes naturals són de gran importància en els sistemes de prevenció i de cura de les dolences i malalties de l'ésser humà. Així, un 50% dels fàrmacs actuals estan basats en productes naturals i un 80% de la població mundial depèn, encara avui, de la medicina tradicional. El procés de desenvolupament d'un nou fàrmac a partir d'un producte natural és llarg i complex. Les millores introduïdes recentment i de forma generalitzada a cadascuna de les etapes del procés han suposat una renovació de l'interès de la indústria farmacèutica per nous compostos naturals bioactius.

La síntesi química té un paper rellevant en el procés de desenvolupament d'un nou fàrmac: la síntesi química del producte bioactiu permet assegurar la identitat del compost, així com assegurar la producció a gran escala per permetre la realització dels assaigs clínics i donar resposta a les demandes del mercat farmacèutic. La introducció de la química en fase sòlida ha estat una de les millores més importants en l'àrea de la síntesi química, permetent una exploració sintètica més ràpida i eficaç. Aquest canvi ha estat rellevant en la síntesi de pèptids i oligonucleòtids i, especialment determinant, en l'obtenció de depsipèptids cíclics produïts per microorganismes i d'interessant activitat i interès com a nous fàrmacs. Així, en la present tesi s'ha treballat en el desenvolupament de noves síntesis en fase sòlida de dos depsipèptids cíclics: la sirengotoxina i la tiocoralina, amb la finalitat de contribuir en la seva aplicació terapèutica.

La sirengotoxina és un lipononadepsipèptid cíclic produït per una bactèria patògena dels arbres cítrics que ha mostrat una interessant activitat contra el paràsit de la Leishmania. En aquest projecte de fàrmac s'ha dissenyat un pèptid anàleg al pèptid natural que conserva els mateixos elements estructurals i la configuració de la cadena peptídico. S'ha obtingut mitjançant una estratègia compatible amb la síntesi del producte natural. En aquesta síntesi s'ha resolt l'obtenció de l'aminoàcid no proteïnogènic així com la seva correcta inserció a la cadena.
La tiocoralina és un pèptid bicíclic simètric produït per un microorganisme marí aïllat del corall tou i que presenta una potent activitat com a antitumoral. En aquest projecte s'ha desenvolupat la síntesi d'un anàleg del pèptid natural mitjançant l'aproximació en fase sòlida. En aquest cas, també s'ha resolt la síntesi de dos aminoàcids no proteïnogènics, dues N-metil cisteïnes.

Finalment, s'han aïllat nous agents antitumorals d'esponges marines recol·lectades a les costes australianes amb la finalitat d'obtenir nous projectes de fàrmacs així com per ampliar els coneixements en el procés de desenvolupament d'un nou fàrmac.
"Natural Products as a source of new drugs: cyclic depsipeptides synthesis on solid-phase and isolation of antitumoral compounds from marine sponges"

TEXT:

Natural Products play an important role in the prevention and therapeutic system for human healthy. 50% of drugs in the market are based on natural products and 80% of world depends still from traditional medicine. The drug development process from natural sources is a long and complex way. Recently, several improvements in each step of this process have been determinant for a reinterest from pharmaceutical companies in these kinds of compounds.
The chemical synthesis has a relevant role in the drug development process: it allows assuring about identity of compounds, obtaining the bioactive compound in large scale to develop the clinical trial and satisfy the pharmaceutical market demands. The introduction of solid-phase chemistry has been one of the most important improvements in chemical synthesis area because it allows a rapid and efficient exploration about strategic synthetic routes. It has been wide used in peptides and oligonucleotides synthesis and especially useful in cyclic depsipeptides produced by marine microorganism. In the present thesis, is described the development of solid-phase synthesis for two new cyclic depsipeptides, syrengotoxin and thiocoraline with the aim to contribute in its medical use.
Syrengotoxin is a cyclic lipononadepsipeptide produced by a pathogen bacterium that shows interesting activity against Leishmania parasite. In this project, it has been designed a analogue peptide which preserve all structural features and the configuration of peptide chain respect natural peptide. The defined synthesis is compatible with syrengotoxin synthesis. It has been developed the non-natural amino acids presents in natural compound and its correct incorporation in the peptide chain.
The thiocoraline is a symmetric biclyclic peptide which is produced by a marine microorganism and presents a potent activity as an antitumoral drug. In this project, it has been developed a solid-phase synthesis of a more resistant in plasma analogue. In this case it has been resolved the N-methyl non natural amino acids synthesis that are also present in natural compound.
Lastly, it has been isolated new antitumoral compounds from marine sponges collected from south-east Australian coasts which the aim to obtain new drugs and improve the knowledge about drug development from natural sources.

The demographic shift toward an aging population is increasing the burden of public health. On average, a person of 70 years can combine the intake of up to seven medications. The administration of multiple drugs at the same time is known as polypharmacy. The often unnecessary use of more drugs that would be strictly necessary is the cause of many problems for the patient such as drug interactions, serious side effects, and lack of adherence to treatment. The increasing use of polypharmacy leads to an increase in morbidity and mortality. The national health agencies are clearly interested in the reduction of polypharmacy, given the enormous cost of associated side effects and consequent hospitalizations. To try to deepen some of the most important aspects associated with the practice of polypharmacy, this thesis focused on three main lines of research: on the one hand, the identification, extraction and storage of relevant data in polypharmacy, which led to to the construction of two databases, Drug Metabolites database (DMdb) and Drug-Drug Interactions database (DDIdb); on the other hand, the exploitation of the collected data for the development of models that allow to anticipate possible secondary effects; and finally, the analysis and review of the different polypharmacy approach strategies in various countries as an approach to a coordinated strategy proposal in the face of this increasingly important challenge for the health management of aging populations.
El canvi demogràfic cap a una població envellida està augmentant la carga de la salut publica. De mitja, una persona de 70 anys pot arribar a combinar la ingesta de fins a set medicaments. El consum de diversos fàrmacs al mateix temps es coneix com a polifarmàcia. L'ús, normalment innecessari, de més medicaments de què seria estrictament necessaris és la causa de molts problemes pel pacient com interaccions farmacològiques, efectes secundaris greus i falta d'adherència al tractament. L'augment de l'ús de la polifarmàcia comporta l'augment de la morbiditat i mortalitat. Les agències nacionals de salut estan clarament interessades en la reducció de la polifarmàcia, donat l'enorme cost que suposen els efectes secundaris associats i les hospitalitzacions. Per intentar profunditzar en alguns dels expectes més importants associats a la pràctica de la polifarmàcia, la present tesi es va focalitzar en tres línies d'investigació principals: per una part la identificació, extracció i emmagatzematge de dades rellevants en polifarmàcia, el que va donar lloc a la construcció de dos bases de dades, Drug Metabolites Database (Dmdb) i Drug-Drug Interactions Database (DDIdb): per una altre part, l'explotació de les dades recollides pel desenvolupament de models que permetin anticipar possibles efectes secundaris, i finalment les anàlisis i revisió de les diferents estratègies d'abordatge de la polifarmàcia en diversos països, com a aproximació a una proposta d'estratègia coordinada davant d'aquest repte d'augment importància per la gestió en salut de poblacions cada dia més envellides.

La present Tesi Doctoral comprén vuit estudis científics que investiguen la genètica i el funcionalisme mitocondrial en les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (CMSP) de diferents grups de pacients infectats pel VIH. L'objectiu d'aquests estudis és determinar els efectes tòxics que els antiretrovirals (ARVs) i la pròpia infecció pel VIH poden exercir "in vivo" sobre els mitocondris d'aquest tipus cel·lular. A la introducció es reflecteix la capacitat destructora del VIH sobre les cèl·lules del sistema immunològic, i la capacitat supressora dels ARVs sobre el VIH. Igualment, es fa constar la importància de la biologia mitocondrial per a la viabilitat de qualsevol tipus cel·lular amb metabolisme oxidatiu, el significat i la repercussió clínica que una alteració mitocondrial pot suposar en l'organisme humà. La interacció d'aquests tres factors (VIH, ARVs i mitocondris) pot comprometre la funció mitocondrial i magnificar la susceptibilitat d'aquests orgànuls generadors d'energia a patir qualsevol tipus d'alteració que, en últim terme, es pot manifestar clínicament. Durant els últims 10 anys, la teràpia antiretroviral de gran activitat (TARGA) contra la infecció pel VIH ha aportat grans beneficis als individus infectats, però l'administració crònica del TARGA ha generat l'aparició d'una sèrie d'efectes adversos greus, com per exemple miopatia, polineuropatia, pancreatitis, hiperlactatèmia, acidosi làctica i lipodistròfia (LD), els quals s'han relacionat amb un origen patogènic associat a una disfunció mitocondrial. Les greus conseqüències que poden tenir aquests efectes adversos poden motivar l'abandonament del tractament ARV i conduir al fracàs terapèutic. D'aquí deriva la importància vital de determinar els possibles mecanismes fisiopatològics d'aquestes alteracions, que permetin el control dels efectes secundaris associats al TARGA. Dels estudis presentats deriven les següents conclusions: 1) Els pacients en tractament ARV que han desenvolupat LD presenten alteracions mitocondrials en les CMSP, que s'expressen principalment com a depleció de l'ADN mitocondrial (ADNmt) i disminució de l'activitat enzimàtica dels complexos proteics del sistema de fosforilació oxidativa (sistema OXPHOS) que estan parcialment codificats per l'ADNmt 2) Les alteracions mitocondrials en les CMSP dels pacients VIH positius amb LD no implica disminució important de la capacitat oxidativa mitocondrial en aquest tipus cel·lular 3) La toxicitat mitocondrial dels ARVs és detectable en les CMSP dels pacients VIH positius que reben TARGA en una fase asimptomàtica, abans de que apareixin manifestacions clíniques d'algun efecte secundari greu associat al TARGA 4) L'afectació mitocondrial de les CMSP pels ARVs es manifesta de manera diferent i amb intensitat variable segons la combinació d'ARVs administrada 5) La depleció d'ADNmt present en les CMSP de pacients asimptomàtics que reben TARGA no és utilitzable como a únic marcador de detecció precoç dels efectes secundaris, ja que no sempre implica alteració de la funció oxidativa mitocondrial 6) Existeixen mecanismes cel·lulars compensatoris previs al desenvolupament de la simptomatologia clínica de la toxicitat mitocondrial, que permeten que els pacients asimptomàtics puguin mantenir un contingut normal de les subunitats proteiques que conformen els complexos enzimàtics del sistema OXPHOS i conservar la funció oxidativa mitocondrial inalterada malgrat presentar certa depleció de l'ADNmt 7) La pròpia infecció pel VIH produeix una alteració mitocondrial generalitzada en les CMSP, probablement mediada per mecanismes apoptòtics 8) La pròpia infecció pel VIH indueix l'activació de mecanismes apoptòtics al múscul esquelètic, els quals en aquest teixit no es veuen incrementats addicionalment per l'administració del TARGA ni pel desenvolupament de la LD.

La present Tesi Doctoral comprén vuit estudis científics que investiguen la genètica i el funcionalisme mitocondrial en les cèl·lules mononuclears de sang perifèrica (CMSP) de diferents grups de pacients infectats pel VIH. L'objectiu d'aquests estudis és determinar els efectes tòxics que els antiretrovirals (ARVs) i la pròpia infecció pel VIH poden exercir "in vivo" sobre els mitocondris d'aquest tipus cel·lular. A la introducció es reflecteix la capacitat destructora del VIH sobre les cèl·lules del sistema immunològic, i la capacitat supressora dels ARVs sobre el VIH. Igualment, es fa constar la importància de la biologia mitocondrial per a la viabilitat de qualsevol tipus cel·lular amb metabolisme oxidatiu, el significat i la repercussió clínica que una alteració mitocondrial pot suposar en l'organisme humà. La interacció d'aquests tres factors (VIH, ARVs i mitocondris) pot comprometre la funció mitocondrial i magnificar la susceptibilitat d'aquests orgànuls generadors d'energia a patir qualsevol tipus d'alteració que, en últim terme, es pot manifestar clínicament. Durant els últims 10 anys, la teràpia antiretroviral de gran activitat (TARGA) contra la infecció pel VIH ha aportat grans beneficis als individus infectats, però l'administració crònica del TARGA ha generat l'aparició d'una sèrie d'efectes adversos greus, com per exemple miopatia, polineuropatia, pancreatitis, hiperlactatèmia, acidosi làctica i lipodistròfia (LD), els quals s'han relacionat amb un origen patogènic associat a una disfunció mitocondrial. Les greus conseqüències que poden tenir aquests efectes adversos poden motivar l'abandonament del tractament ARV i conduir al fracàs terapèutic. D'aquí deriva la importància vital de determinar els possibles mecanismes fisiopatològics d'aquestes alteracions, que permetin el control dels efectes secundaris associats al TARGA. Dels estudis presentats deriven les següents conclusions: 1) Els pacients en tractament ARV que han desenvolupat LD presenten alteracions mitocondrials en les CMSP, que s'expressen principalment com a depleció de l'ADN mitocondrial (ADNmt) i disminució de l'activitat enzimàtica dels complexos proteics del sistema de fosforilació oxidativa (sistema OXPHOS) que estan parcialment codificats per l'ADNmt 2) Les alteracions mitocondrials en les CMSP dels pacients VIH positius amb LD no implica disminució important de la capacitat oxidativa mitocondrial en aquest tipus cel·lular 3) La toxicitat mitocondrial dels ARVs és detectable en les CMSP dels pacients VIH positius que reben TARGA en una fase asimptomàtica, abans de que apareixin manifestacions clíniques d'algun efecte secundari greu associat al TARGA 4) L'afectació mitocondrial de les CMSP pels ARVs es manifesta de manera diferent i amb intensitat variable segons la combinació d'ARVs administrada 5) La depleció d'ADNmt present en les CMSP de pacients asimptomàtics que reben TARGA no és utilitzable como a únic marcador de detecció precoç dels efectes secundaris, ja que no sempre implica alteració de la funció oxidativa mitocondrial 6) Existeixen mecanismes cel·lulars compensatoris previs al desenvolupament de la simptomatologia clínica de la toxicitat mitocondrial, que permeten que els pacients asimptomàtics puguin mantenir un contingut normal de les subunitats proteiques que conformen els complexos enzimàtics del sistema OXPHOS i conservar la funció oxidativa mitocondrial inalterada malgrat presentar certa depleció de l'ADNmt 7) La pròpia infecció pel VIH produeix una alteració mitocondrial generalitzada en les CMSP, probablement mediada per mecanismes apoptòtics 8) La pròpia infecció pel VIH indueix l'activació de mecanismes apoptòtics al múscul esquelètic, els quals en aquest teixit no es veuen incrementats addicionalment per l'administració del TARGA ni pel desenvolupament de la LD.

L’ús d’agents hipometilants (AHM) és eficaç en el tractament dels pacients amb síndromes mielodisplàstiques (SMD) d’alt risc i leucèmia aguda mieloide (LAM) que no són candidats a quimioteràpia intensiva o trasplantament al·logènic. Tanmateix, les taxes de resposta al tractament amb AHM són baixes i és necessari trobar biomarcadors pronòstics i predictius de la resposta al tractament. La caracterització genètica i epigenètica és important no només per a entendre la biologia d’aquestes entitats sinó també des d’un punt de vista clínic per a definir millor el diagnòstic, pronòstic i seleccionar el tractament de la forma més personalitzada possible. En aquesta tesi s’aborda l’estudi de les SMD d’alt risc i les LAMs tant des del punt de vista genètic com epigenètic. En la primera part del treball es caracteritza genèticament 39 pacients diagnosticats de SMD d’alt risc o LAMs inclosos en el protocol CETLAM SMD-2009 tractats homogèniament amb azacitidina (AZA)(al diagnòstic i al seguiment). Aquesta caracterització genètica es va fer mitjançant seqüenciació massiva de nova generació (NGS) utilitzant un panell costumitzat de 83 gens relacionats amb patologia mieloide. El 95% dels pacients presentaven almenys una mutació i els gens més freqüentment alterats van ser: TP53 (49%), DNMT3A (21%) i SRSF2 (18%); seguits de TET2 (15%) i U2AF1 (15%). Tot i que la cohort analitzada en aquesta tesi està formada per pacients d’alt risc (segons IPSS o IPSS-R), vam poder observar que determinats marcadors moleculars, com ara mutacions en TP53 i SRSF2, eren capaços de subclassificar els pacients en diferents grups pronòstics. La taxa de resposta va ser del 55%, però no vam poder correlacionar la presència de mutacions en TET2 i TP53 amb la resposta a AZA. Els pacients amb LAMs presentaven més mutacions que els pacients amb SMD d’alt risc i la mitjana de mutacions va augmentar a la recaiguda, donant suport a la idea que en estadis avançats de la malaltia hi ha una major complexitat genòmica. Per tant, els nostres resultats indicarien que la detecció d’anomalies genètiques en aquest grup de pacients, amb un comportament clínic heterogeni, pot ser d’utilitat tant a l’hora de perfilar el pronòstic com pel seguiment de la malaltia. En la segona part del treball es van estudiar els perfils de metilació global de l’ADN de 75 pacients amb SMD d’alt risc i LAMs al diagnòstic i durant el tractament. En aquest protocol, els pacients rebien AZA o tractament intensiu segons l’edat, les comorbiditats i la citogenètica. Al diagnòstic, l’anàlisi no supervisat, no va detectar cap patró de metilació global que permetés diferenciar els pacients segons subtipus citològic, citogenètic o de resposta al tractament. Però aplicant la tècnica del combined rank vam ser capaços de determinar un perfil de metilació al diagnòstic definit per 200 sondes capaç de separar els pacients responedors dels pacients no responedors al tractament amb AZA. Estudiant les mostres al seguiment vam confirmar que AZA disminueix la metilació global de l’ADN, però a la nostra cohort el grau de desmetilació no es va correlacionar amb el tipus de resposta. La signatura de metilació definida al diagnòstic no va ser d’utilitat en les mostres tractades per determinar un patró de metilació predictiu de progressió o recaiguda. En conclusió, l’alteració dels patrons de metilació de l’ADN al diagnòstic, en un subconjunt d’illes CpG determinat, pot servir de biomarcador per predir la resposta a AZA, i per tant, creiem que l’estudi d’aquest mecanisme epigenètic pot contribuir a la detecció de gens i vies de senyalització implicats en la malaltia, així com ajudar a identificar nous marcadors pronòstics i de resposta al tractament.
El uso de agentes hipometilants (AHM), es eficaz en el tratamiento de los pacientes con síndromes mielodisplásicos (SMD) de alto riesgo y leucemia aguda mieloide (LAM) que no son candidatos a quimioterapia intensiva o trasplante alogénico. Sin embargo, las tasas de respuesta al tratamiento con AHM son bajas y es necesario encontrar biomarcadores pronósticos y predictivos de la respuesta al tratamiento. La caracterización genética y epigenética es importante no sólo para entender la biología de estas entidades sino también desde un punto de vista clínico para definir mejor el diagnóstico, pronóstico y seleccionar el tratamiento de la forma más personalizada posible. En esta tesis se aborda el estudio de las SMD de alto riesgo y las LAMs tanto desde el punto de vista genético como epigenético. En la primera parte del trabajo se caracteriza genéticamente 39 pacientes diagnosticados de los SMD de alto riesgo o LAMs incluidos en el protocolo CETLAM SMD-2009 tratados homogéneamente con azacitidina (AZA) (al diagnóstico y seguimiento). Esta caracterización genética se realizó mediante secuenciación masiva de nueva generación (NGS) utilizando un panel costumizado de 83 genes relacionados con patología mieloide. El 95% de los pacientes presentaban al menos una mutación y los genes más frecuentemente alterados fueron: TP53 (49%), DNMT3A (21%) y SRSF2 (18%); seguidos de TET2 (15%) y U2AF1 (15%). Aunque la cohorte analizada en esta tesis está formada por pacientes de alto riesgo (según IPSS o IPSS-R), pudimos observar que determinados marcadores moleculares, tales como mutaciones en TP53 y SRSF2, eran capaces de subclasificar los pacientes en diferentes grupos pronósticos. La tasa de respuesta fue del 55%, pero no pudimos correlacionar la presencia de mutaciones en TET2 y TP53 con la respuesta a AZA. Los pacientes con LAMs presentaban más mutaciones que los pacientes con SMD de alto riesgo y la media de mutaciones aumentó a la recaída, apoyando la idea de que en estadios avanzados de la enfermedad hay una mayor complejidad genómica. Por lo tanto, nuestros resultados indicarían que la detección de anomalías genéticas en este grupo de pacientes, con un comportamiento clínico heterogéneo, puede ser de utilidad tanto a la hora de perfilar el pronóstico como para el seguimiento de la enfermedad. En la segunda parte del trabajo se estudió los perfiles de metilación global del ADN de 75 pacientes con SMD de alto riesgo y LAMs al diagnóstico y durante el tratamiento. En este protocolo, los pacientes recibían AZA o tratamiento intensivo según la edad, las comorbilidades y la citogenética. Al diagnóstico, el análisis no supervisado, no detectó ningún patrón de metilación global que permitiera diferenciar a los pacientes según subtipos citológico, citogenético o de respuesta al tratamiento. Pero aplicando la técnica del combined rank fuimos capaces de determinar un perfil de metilación al diagnóstico, definido por 200 sondas, capaz de separar los pacientes respondedores de los pacientes no respondedores al tratamiento con AZA. Estudiando las muestras al seguimiento confirmamos que AZA disminuye la metilación global del ADN, pero en nuestra cohorte, el grado de desmetilación no se correlacionó con el tipo de respuesta. La firma de metilación definida el diagnóstico no fue de utilidad en las muestras tratadas para determinar un patrón de metilación predictivo de progresión o recaída. En conclusión, la alteración de los patrones de metilación del ADN al diagnóstico, en un subconjunto de islas CpG determinado, puede servir de biomarcador para predecir la respuesta a AZA, y por tanto, creemos que el estudio de este mecanismo epigenético puede contribuir a la detección de genes y vías de señalización implicados en la enfermedad, así como ayudar a identificar nuevos marcadores pronósticos y de respuesta al tratamiento.
Hypomethylating agents (HMA) are known to be effective in the treatment of high-risk myelodysplastic syndromes (MDS) and acute myeloid leukaemia (AML) patients who are not suitable for intensive chemotherapy or allogeneic transplantation. However, treatment response rates to HMA are low and it is an urgent need to find prognostic and predictive biomarkers of treatment response. The genetic and epigenetic characterization of MDS and secondary AML (sAML) is important not only to understand the biology of these diseases but also from a clinical point of view to better define the diagnosis, prognosis and select the treatment in the most possible personalized way. This thesis addresses the study of high-risk MDS and sAML from both, genetic and epigenetic point of view. The first part of the work is focused on genetically characterizing a group of 39 patients with MDS and sAML included in the CETLAM SMD-2009 protocol, who have been homogeneously treated with azacitidine (AZA) (at diagnosis and follow-up). This characterization has been done by next generation sequencing (NGS) using a custom panel of 83 genes related to myeloid pathology. It was observed that 95% of patients presented at least one mutation, that the most frequently altered genes were TP53 (49%), DNMT3A (21%) and SRSF2 (18%); followed by TET2 (15%) and U2AF1 (15%). Although the entire cohort analysed in this thesis consists of high-risk patients (according to IPSS or IPSS-R), we were able to observe that certain molecular markers, such as mutations in TP53 and SRSF2, were able to subclassify patients in different prognostic groups. Response rate was 55% but we could not correlate the presence of TET2 and TP53 mutations with AZA response. Patients with sAML presented more variants than patients with high-risk MDS, and the average of mutations increased at relapse, supporting the idea that in advanced stages of the disease there is a greater genomic complexity. These results confirm that mutation analysis can add prognostic value to high-risk MDS and sAML patients, not only at diagnosis but also at follow-up. The second part of the work addresses the disease from an epigenetic point of view, performing global methylation analysis of 75 patients with high risk MDS and sAML, at diagnosis and during treatment, who were included in CETLAM MDS 2009 protocol. In this protocol, patients received AZA or intensive treatment according to age, comorbidities and cytogenetics. At diagnosis, the unsupervised analysis showed that global methylation pattern didn’t allowed us to differentiate patients according to the cytological or cytogenetic subtype, or treatment response. But when the combined rank analysis was used, we were able to determine a methylation profile at diagnosis defined by 200 probes capable to differentiate patients who responded to AZA treatment from those who did not. Studying follow-up samples, allowed us to confirm that AZA decreases global DNA methylation, but in our cohort the degree of methylation decrease did not correlate with the type of response. The methylation signature detected at diagnosis was not useful in treated samples to determine a methylation pattern predictive of progression or relapse. In conclusion, altered DNA methylation patterns at diagnosis, in a subset of determined CpGs, may serve as a biomarker to predict AZA response, and therefore, we believe that the study of this epigenetic mechanism may contribute to the detection of genes and signalling pathways involved in the disease, as well as may help to identify new prognostic and treatment response markers.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicina

La importància de la quiralitat és ben coneguda principalment en relació al fet que la major part dels productes bioactius naturals són quirals i que les seves propietats fisiològiques i farmacològiques depenen del seu reconeixement per part de macromolècules diana quirals, les quals interaccionaran només amb l'enantiòmer del producte bioactiu d'una configuració absoluta determinada.
Anàlogament, en el cas de fàrmacs quirals se solen observar diferències importants d'activitat entre els dos enantiòmers. L'enantiòmer més actiu d'un fàrmac quiral es denomina eutòmer i el menys actiu distòmer.

Així, la legislació farmacèutica internacional és cada cop més restrictiva respecte a l'ús de fàrmacs com a barreges racèmiques. Realment, la utilització de fàrmacs enantiopurs és actualment un requisit fonamental per a pràcticament totes les indústries farmacèutiques. Així doncs, el desenvolupament de nous mètodes sintètics per obtenir compostos enantiopurs s'ha convertit en un punt clau per a la indústria farmacèutica.

La síntesi asimètrica constitueix una de les principals estratègies per tenir accés a compostos enantiopurs, utilitzant auxiliars, reactius o catalitzadors quirals.

Tenint en compte els excel·lents resultats dels auxiliars quirals (R)- i (S)-2a en reaccions de desracemització, resolució cinètica dinàmica en la reacció d'ALFA-haloèsters amb diversos nucleòfils i en reaccions de Diels-Alder asimètriques ens vam plantejar:

1. Posar a punt un procediment per obtenir noves pantolactames en forma racèmica, a partir de les quals es podrien preparar els corresponents enantiòmers pel procediment descrit per a (R)- i (S)-2a.

2. L'aplicació de l'(R)- o (S)-N-fenilpantolactama, (R)- o (S)-2a o d'alguna de les noves pantolactames en noves reaccions de desracemització d'àcids carboxílics alfa,alfa-disubstituïts com a etapes clau per a la síntesi en forma enantiopura de compostos amb potencial activitat farmacològica o de fàrmacs establerts com àcids alfa-aril-gamma-aminobutírics anàlegs del GABA (àcid gamma-aminobutíric) o l'antiepilèptic levetiracetam.

3. L'aplicació de l'(R)- o (S)-N-fenilpantolactama, (R)- o (S)-2a, o d'alguna de les noves pantolactames a addicions de Michael diastereoselectives amb acceptors contenint l'auxiliar quiral, com a etapa clau per a la síntesi dels dos enantiòmers del fàrmac baclofè.

4. L'aplicació de l'(R)- o (S)-N-fenilpantolactama, (R)- o (S)-2a, o d'alguna de les noves pantolactames a cicloaddicions 1,3-dipolars diastereoselectives amb dipolaròfils contenint l'auxiliar quiral, com a etapa clau per a la síntesi en forma enantiopura d'N,O-psiconucleòsids amb potencial activitat antivírica.
We have developed two alternative one-pot procedures for the preparation of N-substituted pantolactams in low to medium yields starting from pantolactone and primary amines under acid catalysis. In one procedure the reaction is performed in a pressure reactor at 250 ºC for 4h, while in the other one the reaction takes place in minutes under microwave irradiation.
alpha-aryl-substituted GABA derivatives (R)- and (S)-23, 26 and 27 of potential biological interest have been prepared in enantiopure form (ee > 99%) from the readily available methyl arylacetates 16, 31 and 37, through a seven-step synthetic sequence, involving as the key step the deracemization of cyano acids ()-18, 33 and 39 using (R)- or (S)-N-phenylpantolactam as chiral auxiliaries. In sharp contrast with the reported absolute lack of efficiency of (R)-pantolactone as chiral auxiliary in the deracemization of this kind of cyano acids, the use of (R)- and (S)-N-phenylpantolactam led to the corresponding pantolactam esters in almost quantitative yields, with high levels of diastereoselectivity (dr up to 93:7), and with predictable sense of asymmetric induction. Moreover, pantolactam esters in hihgly diastereoenriched form (dr > 98:2 or 97:3) were obtained by column chromatography of the diastereoenriched crude materials resulting from the deracemization reactions. Hydrolysis of these esters under essentially nonracemizing conditions, followed by recrystallization of the resulting crude cyano acids or their cyclohexylammonium salts, and subsequent reisolation of the carboxylic acids in the last cases, led to enantiopure alpha-aryl-beta-cyano acids (R)- and (S)-18, 33 and 39, which were transformed in good yields into the N-Boc-alpha-aryl-substituted GABA derivatives (R)- and (S)-23, 26 and 27 through a standard procedure.
We have developed a synthesis of levetiracetam by deracemization of racemic 2-bromobutyric acid 50 to the (R)-enantiomer with (S)-N-phenylpantolactam, followed by nucleophilic substitution with the sodium salt of 2-pyrrolidinone to give (S)-2-(2-oxopyrrolidin-1-yl)butyric acid, a known precursor of levetiracetam. The key points of the synthesis are: (1) the good diastereomeric ratio (9:1) in the esterification of ()-50 with the chiral auxiliary and the easy purification of the main diastereomer by column chromatography, (2) the LiOH/H2O2 hydrolysis of the diastereopure ester to give acid (R)-50 without racemization and (3) the SN2 transformation of (R)-50 to the immediate acid precursor of levetiracetam. This sequence has also been applied to the preparation of the enantiomer of levetiracetam.
(R)- and (S)-baclofen hydrochloride have been prepared in enantiopure form (>99% ee) from the readily available racemic nitro acid (±)-71, through a three-step synthetic sequence, involving the resolution of the above acid via diastereomeric esters derived from the chiral auxiliaries (R)- and (S)-N-phenylpantolactam, (R)- and (S)-2a, followed by hydrolysis and hydrogenation (Ra-Ni) of the nitro group. The chiral auxiliaries were conveniently recovered in enantiopure form after the hydrolysis step.
Finally, we have developed a synthesis of N,O-psiconucleosides involving as the key step the 1,3-dipolar cycloaddition of phenylnitrone and methyl phenyltioacrilate. The key points are: (1) esterification with the resolution agent, (R)- and (S)-N-phenylpantolactam, (R)- and (S)-2a , (2) nucleosidation with timine and 5-fluoruracile as nucleobases and the efficiently column cromatography to led the corresponding esters of pantolactam in diasteropure form (dr > 98:2), (3) reduction of transesterification products with Vitride and recovery of (R)- and (S)-N-phenylpantolactam with high yield and in enantiopure form (ee > 99%).

En los últimos años ha habido un incremento en la aparición de nuevas enfermedades infecciosas y en la reemergencia de otras que se consideraban ya controladas. La situación actual es preocupante porque muchos de estos nuevos agentes patógenos causan enfermedades graves. En muchas de estas infecciones, la resistencia a los fármacos se está convirtiendo en uno de los obstáculos principales para su control, con la aparición de cepas multiresistentes a los antibióticos normalmente utilizados. ¿Cuales son las claves para el éxito de estas bacterias patógenas? Para responder esta pregunta, se realizan estudios sobre los mecanismos por los cuales los microorganismos causan la enfermedad, es decir, la patogénesis. Pero también existen cuestiones importantes sobre la evolución de la patogénesis de estos microorganismos que continúan siendo una incógnita: ¿cuales son los factores que determinan la emergencia de un nuevo patógeno?, ¿cuando se desarrollan determinados clones patógenos?, ¿porqué cepas no patógenas presentan genes asociados a la virulencia?

Los estudios de genética de poblaciones contribuyen a este conocimiento, proporcionando información sobre la estructura poblacional y la naturaleza de la variación genética que existe en las poblaciones naturales ya que la cantidad de variación genética de una población es un parámetro fundamental, debido a que determina el potencial evolutivo de ésta. Los cortos períodos de generación de la mayoría de las bacterias y el enorme tamaño de sus poblaciones, hace que los cambios evolutivos sean muy rápidos. La dinámica de aparición y selección de mutantes o la importancia relativa de la mutación y de la recombinación en estas poblaciones, son efectos esenciales para comprender los cambios epidemiológicos que se producen en ellas.

Estudiar las poblaciones bacterianas también nos permite caracterizar las cepas de las especies patógenas; pero también es importante comprender las relaciones genéticas existentes entre cepas patógenas, causantes de la enfermedad, y cepas no patógenas de una misma especie bacteriana. La comparación entre ambas poblaciones puede ayudarnos a explicar los orígenes de las cepas patógenas e identificar las diferencias genéticas entre las dos. Se ha observado que, generalmente, se da una asociación aparente entre determinados clones de la bacteria, que se encuentran en pequeña proporción, y el desarrollo de una enfermedad; por tanto, esto sugiere que hay una menor diversidad en las cepas patógenas que en las de vida "libre". Estas observaciones han sugerido que la mayoría de las bacterias presentan una estructura poblacional clonal.

Más recientemente, el aumento del número de bacterias estudiadas y la aplicación de técnicas moleculares, han dado lugar a la observación de que la estructura clonal de las poblaciones se puede "romper" por acción de la recombinación genética, aunque su papel no es igual en todas las especies bacterianas.

La transferencia horizontal de genes tiene una gran relevancia en la epidemiología de las enfermedades causadas por bacterias patógenas. Se ha observado una marcada diferencia en el grado de recombinación entre cepas patógenas y cepas no patógenas, aunque no se conocen las causas. La adquisición de material extracromosómico tiene consecuencias importantes en la evolución de las bacterias, tanto a corto plazo, por la distribución horizontal de genes de resistencia, como a largo plazo, por la adquisición de nuevos determinantes de virulencia o propiedades metabólicas que puedan producir un cambio significativo en la patogenicidad o que afecten al hábitat ecológico donde residen. Por tanto, la variación genotípica en las poblaciones de los microorganismos patógenos, plantea importantes dificultades en el control de les enfermedades infecciosas (emergencia de nuevas cepas patógenas, aparición de poblaciones de bacterias resistentes a los antibióticos, dificultades asociadas a la obtención de vacunas contra microorganismos antigénicamente diversos o variantes).

P. aeruginosa es una bacteria Gram negativa y cosmopolita, y es una de las principales causas de infecciones en cáncer, transplantes, quemados y en pacientes con fibrosis cística. Estas infecciones son muy difíciles de erradicar ya que este microorganismo presenta una elevada resistencia intrínseca a múltiples antibióticos, lo que lo hace responsable de infecciones nosocomiales de difícil tratamiento y de elevada morbi-mortalidad. En los últimos años se ha observado un incremento progresivo en la incidencia de cepas resistentes a diversos antibióticos de última generación como por ejemplo el imipenem y de cepas que presentan una sensibilidad disminuida simultáneamente a diversos grupos de antibióticos como penicilinas, cefalosporinas con actividad anti-pseudomónica, quinolonas y aminoglicósidos, situación que ha agravado notablemente la dificultad terapéutica que habitualmente comportan las infecciones causadas por este patógeno.

¿Tienen las cepas patógenas que viven en el interior de los hospitales alguna relación genética con las cepas que viven libremente en el entorno de éstos? ¿Qué mecanismos de resistencia han utilizado estas cepas patógenas para "evadir" la acción de los antimicrobianos utilizados contra ellas? En este trabajo hemos tratado de hacer una aproximación a la respuesta de estas preguntas, centrándonos en las poblaciones de Pseudomonas aeruginosa del hospital de Bellvitge y su entorno.

La línea principal de investigación de nuestro grupo de trabajo se centra en los mecanismos moleculares de extensión de los caracteres de resistencia de las bacterias Gram negativas a los agentes antimicrobianos. La presente tesis se inscribe en el núcleo de la actividad del grupo.

Se ha pretendido explorar las relaciones existentes entre aislamientos clínicos y ambientales de Pseudomonas aeruginosa en relación a la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.

Este objetivo de carácter general se puede subdividir en los siguientes apartados:

1. Aislar cepas ambientales y seleccionar cepas clínicas aisladas en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Bellvitge.

2. Determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de los distintos aislamientos y comparar las posibles diferencias de susceptibilidad entre los grupos.

3. Explorar la contribución de las propiedades de la membrana externa a los perfiles de susceptibilidad a los antimicrobianos.

4. Analizar la variabilidad fenotípica y genotípica de los aislados en base a la información obtenida de metodologías moleculares como: perfiles electroforéticos de las proteínas de la membrana externa (OMPs), electroforesis en campo pulsante (PFGE) y amplificación de fragmentos de DNA con cebadores aleatorios (RAPD).

5. Elaborar un modelo aproximativo de la estructura de las poblaciones de P. aeruginosa en el ambiente "Hospital Universitario de Bellvitge" (Hospital y entorno).

6. Estudiar la eventual presencia de integrones en los dos grupos de bacterias y determinar los genes que incorporan.

7. Estudiar las mutaciones de la proteína OprD y su relación con la resistencia a los antibióticos en las cepas estudiadas.

8. Realizar una aproximación al modelo estructural de la proteína OprD.

Las conclusiones obtenidas después de llevar a cabo los experimentos para la consecución de los diversos obtenidos, son las siguientes:

1. Las cepas clínicas son más resistentes a los antibióticos que las cepas ambientales, debido a la fuerte presión que existe en el entorno hospitalario, y que favorece a las cepas que desarrollan mecanismos para evadir la acción de diferentes antimicrobianos. Estas diferencias en la susceptibilidad sugieren, además, cierto grado de aislamiento ecológico entre las dos poblaciones, ya que las cepas clínicas se encontrarían en un hábitat, que presenta una elevada presión selectiva por parte de los antibióticos y desinfectantes, y en cambio las cepas ambientales estarían en otro hábitat separado donde esta presión no existe.


2. Técnicas que miden la variabilidad fenotípica y genotípica como las proteínas totales (PT), proteínas de membrana externa (OMPs), la electroforesis de campo pulsante (PFGE) y la amplificación de polimorfismos de DNA al azar (RAPD) utilizando el primer 208, confirman la distancia entre los aislados de los dos orígenes.

3. El conjunto de los resultados nos sugiere que la población de P. aeruginosa en nuestro entorno (Hospital de Bellvitge y alrededores), podría ser una población clonal epidémica, en la cual todas las cepas provienen de una población ambiental muy diversa, y de la que un clon ha emergido para dar lugar a la población clínica que, una vez establecida, vuelve a diversificarse.

4. La ausencia/presencia de la proteína OprD en la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa, no explica totalmente los patrones de resistencia/susceptibilidad observados en las cepas investigadas.

5. La existencia de cepas sensibles al imipenem que no presentan OprD en sus membranas externas, sugiere la presencia de otro mecanismo secundario de entrada del imipenem a las células, independiente de OprD.

6. A falta de un modelo estructural basado en la cristalización, nuestro modelo tridimensional de la proteína OprD confirma las predicciones, anteriormente realizadas, de la estructura del heterómero del que está constituido esta porina.

Els fàrmacs constitueixen un grup gran, important i divers, de compostos químics dissenyats per a causar efectes terapèutics sobre la salut principalment humana, però també animal. Per la seva composició, són bioactius i difícils de degradar encara que presentin una dosi mínima. La seva varietat estructural, de composició i efectes és enorme i mentre que alguns d'ells són eliminats completament a les depuradores, d'altres romanen inalterats o parcialment transformats. A més a més, malgrat ser estrictament regulats per assajos clínics abans de la seva distribució al mercat, no existeixen restriccions específiques per al seu alliberament en el medi ambient, i encara manca un mètode de quantificació estàndard per a detectar-los. Cal implementar tecnologies alternatives en les depuradores per a eliminar aquests principis actius de l'aigua abans de ser abocats al medi ambient. Un possible tractament és l'ús de fongs ligninolítics per a degradar aquests compostos. En relació amb aquest tractament, el fong T. versicolor, membre del grup de fongs de podridura blanca, ha estat àmpliament estudiat en l'eliminació de molts fàrmacs en aigües residuals i condicions no estèrils. Tanmateix, encara hi ha diverses qüestions a resoldre d’entre les quals en destaquen: els compostos recalcitrants, la generació de productes de transformació i colls d'ampolla operacionals. Es consideren recalcitrants aquells fàrmacs que romanen inalterats a causa de la seva estructura estable durant els tractaments d’eliminació. En el cas dels tractaments amb fongs, aquesta estabilitat depèn principalment de factors com el mecanisme de degradació, directament afectat pel metabolisme de les espècies de fong emprades. Per tal de descobrir candidats potencials per a l'eliminació i biodegradació de compostos recalcitrants es va realitzar un experiment de cribatge entre 6 espècies diferents de fongs. Espècies poc estudiades, com ara S. rugosoannulata i G. luteofolius, van permetre obtenir importants eliminacions vinculades amb processos de biodegradació. També es va estudiar l'eliminació de fàrmacs tenint en compte els diferents mecanismes de biodegradació i sorció en cultius submergits. Pel que fa a la sorció, les anàlisis dels fàrmacs presents en la fase líquida i en la biomassa del fong mostren resultats semblants respecte de la sorció estimada a partir de controls amb biomassa de fong inactivats per calor. S'ha demostrat que 6 dies no és temps suficient per al fong per a poder degradar els contaminants adsorbits. Pel que fa a la generació de productes de transformació a partir dels compostos principals, es van identificar o-desmethylvenlafaxine i n-desmethylvenlafaxine com els dos principals productes de transformació biològica generats durant la degradació del compost recalcitrant venlafaxina. D'altra banda, els productes de transformació generats pel fong P. ostreatus en la degradació de diclofenac i ketoprofè coincideixen amb les molècules generades per T. versicolor en el mateix tipus de tractament, segons els seus perfils de ressonància magnètica nuclear. A més a més, estudis sobre dos dels principals mecanismes enzimàtics dels fongs, van demostrar que l'enzim extracel·lular lacasa està implicat en la degradació de compostos recalcitrants com l'atenolol, mentre que el complex enzimàtic intracel·lular citocrom P450 intervé en l’eliminació de diclofenac. Els colls d'ampolla operacionals com la competència de la microbiota nativa pels nutrients en els bioreactors fúngics provoquen diversos problemes en l’aplicació del tractament en continu. Per a prevenir la proliferació de bacteris, es va avaluar la implementació d'un biofiltre de sorra per a la reducció de la càrrega bacteriana en aigües residuals d'hospital. Malgrat aconseguir certa reducció bacteriana, aquest pretractament no va permetre reduir prou la càrrega bacteriana d’entrada del reactor amb el fong. En canvi, la microbiota nativa present en el biofiltre de sorra va ser capaç d’eliminar concentracions de l’antibiòtic ciprofloxacina i l'analgèsic ibuprofè. Això va motivar l’anàlisi molecular mitjançant electroforesi en gel de gradient desnaturalitzant (DGGE) per tal d’analitzar els canvis que es produïen en la microbiota com a conseqüència de l’exposició continuada a fàrmacs i quines poblacions microbianes eren candidats potencials responsables de l’eliminació dels fàrmacs en qüestió. Un altre dels problemes operatius a tractar en reactors amb T. versicolor va ser la necessitat de proveir de carboni el reactor per una banda, i del control del pH per l’altra. En aquesta tesi, P. ostreatus i S. rugosoannulata han demostrat poder-se autoproveir de carboni a partir d'aigües residuals amb alts valors de demanda química d'oxigen (DQO), evitant així la necessitat del seu subministrament. A més a més, S. rugosoannulata també va poder reduir el pH de les aigües residuals hospitalàries al seu nivell òptim i, per tant, va mostrar trets prometedors de cara a la seva futura plena implementació en reactors.
Los fármacos son un grupo grande, importante y diverso, de compuestos químicos diseñados para causar efectos terapéuticos sobre la salud principalmente humana, pero también animal. Por su composición, son bioactivos y difíciles de degradar aunque presenten una dosis mínima. Su variedad estructural, de composición y efectos es enorme y mientras que algunos de ellos son eliminados completamente en las depuradoras, otros permanecen inalterados o parcialmente transformados. Además, a pesar de ser estrictamente regulados por ensayos clínicos antes de su distribución en el mercado, no existen restricciones específicas para su liberación en el medio ambiente, y aún falta un método de cuantificación estándar para detectarlos. Hay que implementar tecnologías alternativas en las depuradoras para eliminar estos principios activos del agua antes de ser vertidos al medio ambiente. Un posible tratamiento es el uso de hongos ligninolíticos. En relación con este tratamiento, el hongo T. versicolor, perteneciente al grupo de hongos de podredura blanca, ha sido ampliamente estudiado en la eliminación de muchos principios activos farmacéuticos en aguas residuales y condiciones no estériles. Sin embargo, aún hay varias cuestiones a resolver entre las cuales destacan: los compuestos recalcitrantes, la generación de productos de transformación y cuellos de botella operacionales. Se consideran recalcitrantes aquellos fármacos que permanecen inalterados debido a su estructura estable durante los tratamientos de eliminación. En el caso de los tratamientos con hongos, esta estabilidad depende principalmente de factores como el mecanismo de degradación, directamente relacionado con el metabolismo de las especies de hongo empleadas. En ese sentido se realizó un experimento de cribado entre 6 especies diferentes de hongos para descubrir candidatos potenciales para tratar compuestos recalcitrantes. Especies hasta ahora poco estudiadas, como S. rugosoannulata y G. luteofolius, proporcionaron importantes eliminaciones, vinculadas a procesos de biodegradación. También se estudió la eliminación de fármacos teniendo en cuenta los diferentes mecanismos de biodegradación y sorción en cultivos sumergidos. En cuanto a la sorción, los análisis de los fármacos presentes en la fase líquida y en la biomasa del hongo muestran resultados similares respecto a la sorción estimada a partir de controles con biomasa de hongo inactivada por el calor. Se ha demostrado que 6 días no es tiempo suficiente para que el hongo pueda degradar los contaminantes adsorbidos. En cuanto a la generación de productos de transformación a partir de compuestos principales, se identificaron o-desmethylvenlafaxine y n-desmethylvenlafaxine como los dos principales productos de transformación biológica generados durante la degradación del compuesto recalcitrante venlafaxina. Por otra parte, los productos de transformación generados por el hongo P. ostreatus en la degradación de diclofenaco y ketoprofeno coinciden con las moléculas generadas por T. versicolor en el mismo tratamiento, según sus perfiles de resonancia magnética nuclear. Además, estudios sobre dos de los principales mecanismos enzimáticos de los hongos, demostraron que enzima extracelular lacasa está implicada en la degradación de compuestos recalcitrantes como el atenolol, mientras que el complejo enzimático intracelular citocromo P450 interviene en la eliminación de diclofenaco. Los cuellos de botella operacionales como la contaminación microbiana y la competencia por los nutrientes en los biorreactores fúngicos provocan varios problemas en el mantenimiento de los mismos. Para prevenir la proliferación de bacterias se evaluó la implementación de un biofiltro de arena para la reducción de la carga bacteriana en aguas residuales de hospital. A pesar de conseguir cierta reducción bacteriana, este pretratamiento no permitió reducir suficientemente la carga bacteriana de entrada del reactor con el hongo. En cambio, la microbiota nativa presente en el biofiltro de arena fue capaz de eliminar concentraciones del antibiótico ciprofloxacina y el analgésico ibuprofeno. Esto motivó el análisis molecular mediante electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) para analizar los cambios que se producían en la microbiota como consecuencia de la exposición continuada a fármacos y que poblaciones microbianas eran candidatos potenciales responsables de la elimincación de dichos fármacos. Otro de los problemas operativos a tratar en reactores con T. versicolor es la necesidad de proveer el reactor de carbono por un lado, y del control del pH por el otro. En esta tesis, P. ostreatus y S. rugosoannulata han demostrado poderse autoproveer de carbono a partir de aguas residuales con altos valores de demanda química de oxígeno (DQO), evitando así la necesidad de su suministro. Además, S. rugosoannulata también pudo reducir el pH de las aguas residuales hospitalarias a su nivel óptimo y, por tanto, mostró rasgos prometedores para su futura implementación completa en reactores.
Pharmaceutical active compounds are an important, large and diverse group of chemical compounds designed to cause therapeutic effects on health, mainly human but also animal. Because of their composition, they are bioactive and difficult to be degraded even when present at a minimal dose. Their variety of structure, composition and effects is huge, while some of them are completely removed at wastewater treatment plants, others are only partially or non-removed. Furthermore, despite of being strictly regulated by clinical trials before their market distribution, specific restrictions for their release in the environment are almost non-existent, and there is not a standard quantification method yet. Regarding this situation, there is a need to implement alternative technologies in wastewater treatment plants to remove pharmaceuticals from water before entering the environment. One possible treatment is the use of ligninolytic fungi to degrade these compounds. In relation with this approach, the white-rot fungus T. versicolor has been widely studied in the removal of many pharmaceutical active compounds in wastewater under non-sterile conditions. However, there are still several questions to tackle: recalcitrant compounds unable to be degraded, the generation of transformation products, and operational bottlenecks can be highlighted among many other. Certain pharmaceuticals are considered recalcitrant due to its stable structure when treated for their removal. In fungal treatment, this stability depends mainly on factors such as the degradation mechanism, which is directly affected by the metabolism of the fungal species. A screening experiment among 6 different species of fungi attempted to discover new candidates in the removal and biodegradation of recalcitrant compounds. Scarcely studied species such as S. rugosoannulata and G. luteofolius obtained considerable removals linked to biodegradation processes. The removal of pharmaceutical active compounds has also been studied in terms of biodegradation and sorption mechanisms in submerged cultures. Regarding sorption processes, the analyses of the pharmaceutical active compounds present in liquid phase and in fungal biomass showed similar results respect to the sorption estimated by heat killed control biomass. It has been proven that 6 days is generally insufficient time for fungal biomass to degrade the adsorbed contaminants. Concerning the generation of transformation products from parental compounds, odesmethylvenlafaxine and n-desmethylvenlafaxine were identified as the two main biological transformation products generated during the degradation of the recalcitrant compound venlafaxine. On the other hand, transformation products generated by the fungus P. ostreatus in the degradation of diclofenac and ketoprofen coincide with the molecules generated by T. versicolor in the same treatment according to their nuclear magnetic resonance profiles. Besides, studies on two main fungal enzymatic mechanisms showed that the extracellular enzyme laccase is involved in the degradation of recalcitrant compounds such as atenolol, whereas the intracellular enzymatic complex cytochrome P450 is involved in diclofenac transformation. Operational bottlenecks, such as microbial competition by native microbiota for nutrients in fungal bioreactors, cause several problems in applying continuous treatment. In order to prevent bacteria proliferation, the implementation of a biosand filter for the reduction of a high bacterial load in hospital wastewater was evaluated. This pretreatment was not able to achieve enough reduction in bacterial load of the fungal reactor’s inlet. Instead, the native microbiota present in the biosand filter was able to remove spiked concentrations of the antibiotic ciprofloxacin and the analgesic ibuprofen. This opened the way for a molecular biology study with denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) to analyse which changes in the microbiota could entail the presence of potential candidates for pharmaceutical removal and which could be those microorganisms. Other operational issues to be tackled in T. versicolor reactors were the need for carbon supply and the pH control. In this thesis, P. ostreatus and S. rugosoannulata have proven able to self-obtain its carbon source from wastewaters achieving high chemical oxygen demand (COD) reductions, avoiding the need for carbon supply. Besides, S. rugosoannulata was also able to lower the pH of hospital wastewaters to its optimal, and hence showing promising features to its full implementation in reactors.

1.- Antecedents L’augment de l’esperança de vida ha produït un augment de la prevalença de la malalties cròniques i per tant de la multimorbilitat. La multimorbiditat porta com conseqüència la polimedicació. Davant el nou escenari epidemiològic en el nostre país, es considera necessari avaluar la magnitud d’aquest fenomen en les persones majors de 65 anys. 2.- Objectius L’objectiu d’aquesta tesi és aprofundir en el coneixement i l’epidemiologia de la multimorbiditat en les persones majors de 65 concretament en 1) identificar els patrons de multimorbiditat al llarg d’un període de sis anys, 2) comparar la taxa de mortalitat per cada patró i 3) descriure els fàrmacs prescrits així com identificar els patrons de fàrmacs. 3.- Mètodes Estudi de cohorts, amb anàlisi transversal per cada any d’estudi, amb informació de la historia clínica informatitzada dels centres d’atenció primària en la població entre 65 i 94 anys de Barcelona, entre els anys 2009-2014. El criteri d’inclusió va ser que les persones tinguessin 65-94 anys al 2009, almenys una visita en el període d’estudi, registre a l’historia clínica de mínim dues malalties cròniques i que no s’haguessin traslladat a una altra ciutat o a un altre proveïdor de servei de salut que no fos gestionat per l’Institut Català de la Salut, durant el període d’estudi. Les variables independents incloses van ser: els diagnòstics de malalties, els fàrmacs retirats de les oficines de farmàcia; i les variables dependents considerades: l’índex de deprivació socioeconòmica MEDEA, el sexe i el grup d’edat (65-79 anys i ≥ 80 anys). Per la mostra analitzada es va dur a terme un anàlisi descriptiu. Els patrons de multimorbiditat i de fàrmacs van ser identificats aplicant dues tècniques: 1) anàlisi de correspondència múltiple i 2) clusterització amb k-means. Es va calcular la taxa de mortalitat estandarditzada (TME). La supervivència va ser analitzada amb l’estimació de la Regressió de Cox (hazard ratio i interval de confiança) i els resultats es van ajustar per edat, índex de deprivació, número de malalties i fàrmacs. L’anàlisi per respondre els tres objectius generals van ser estratificats per edat i sexe. 4.- Resultat La mostra va constar de 190.108 pacients multimòrbida (92,2% de la població) on la majoria van ser dones (59,8%). La mitjana de malalties cròniques va ser de 7 (rang interquartil 5-10). Les malalties cròniques més freqüents van ser malalties cardiovasculars, metabòliques i relacionades amb l’edat. La prevalença de les malalties cròniques va ser estable al llarg dels sis anys d’estudi. Es van obtenir sis patrons de multimorbiditat per cada grup d’edat i sexe, sent el patró “No específic” el que va concentrar major població i caracteritzant-se per estar format de malalties amb prevalença alta però sense cap sistema anatòmic sobrerrepresentat. Els 5 altres patrons, per cada grup, es van anomenar: Cardiovascular, Endocrí-metabòlic, Múscul-esquelètic, Digestiu (dones)/Digestiu-respiratori (homes) i Neuro-psiquiàtric. El patró Múscul-esquelètic va ser el de menor TME, mentre que el patró amb major TME va ser el Cardiovascular per a les dones i el Digestiu-respiratori pels homes. Una elevada prescripció de fàrmacs i la deprivació socioeconòmica es van associar a un augment de mortalitat. Al 2009, aproximadament la meitat dels pacients rebien 5 o més fàrmacs de manera crònica. Es van obtenir sis patrons de fàrmacs per cada grup d’edat i sexe, el “No específic” i 5 altres que combinen els següents sistemes anatòmics (òrgan o sistema en el qual actua el fàrmac): alimentari i metabòlic, sanguini/hematopoètic, cardiovascular cutani/dermatològic, múscul-esquelètic, sistema nerviós, respiratori i d’òrgans dels sentits. 5.- Conclusions La multimorbiditat està present en la majoria de la població major de 65 anys de Barcelona. Amb les tècniques de clustering de k-means s’han identificat sis patrons de multimorbiditat per cada estrat, observant la seva estabilitat en el període analitzat. La taxa de mortalitat va variar en funció dels patrons de multimorbiditat i del sexe. El consum de 5 o més fàrmacs i el fet de viure en àrees socioeconòmicament desfavorides també es va associar a una major mortalitat. S’han identificat sis patrons de fàrmacs que responen als patrons de multimorbiditat.
1.- Background An increased in life expectancy is linked with an increases in the prevalence and coexistence of multiple chronic diseases, therefore a rise in multimorbidity and polimedication. Facing the new epidemiological scenario in our country, is needed an evaluation on the magnitude of this phenomenon in the elderly population. 2.- Aim of the study The aim of this thesis is getting in depth in the knowledge and epidemiology of multiborbidity in people over 65 years old, in particular 1) identifying multimorbidity patterns throughout six years, 2) comparing mortality rates per each multimorbidity pattern and 3) describing drug prescription and identifying medication patterns 3.- Methods Cohort study with yearly cross-sectional analysis using electronical health records of primary care centres in people 65-94 years from Barcelona during 2009-2014 period. The inclusion criteria were 65-94 years of age in 2009 and at least one visit in the primary health centre during the study period, and electronical health record of minimum two chronic diseases and no moved or otherwise sought care outside the Catalan Health Institute system. Variables included per each person were the following: number of different diseases (chronic diseases) and drug consumption as independent variables; MEDEA deprivation Index, sex and age group (65-79 years and ≥ 80 years) as dependent variables. For the sample included it was carried out a descriptive analyses. Multimorbidity and medication patterns were identified applying two techniques: 1) multiple correspondence analysis 2) k-means clustering. Mortality rates were estimated. Surveillance was analysed estimating Cox regression (hazard ratio and confidential interval) and results were adjusted by age group, deprivation index, diseases and drug numbers. All data was stratified by sex and age group. 4.- Results The sample sized was 190,108 patients with multimorbidity (92.2% of the initial sample) and 59.8% were women. The mean number of chronic diseases were 7 (interquartile range 5-10). The most frequent chronic diseases were cardiovascular, metabolic and age related diseases. Chronic diseases prevalence was stable throughout the period analysed. Six multimorbidity patters were obtained per each age and sex group, being the Non-specific pattern the one with a highest amount of sample and characterized by prevalent diseases but not overrepresented in the pattern. The other 5 patterns were labelled: Cardiovascular, Endocrin-metabolic, Musculoskeletal, Digestive/Digestive-respiratory and Neuropsychiatric. Musculoskeletal pattern was the one with a lowest mortality rate while Digestive-respiratory patterns for men and Cardiovascular pattern for women were those with a higher risk of death. High drug consumption and living in deprivate areas were also associated with a higher rate of death. In 2009, almost half of the sample were prescribed 5 or more drugs. Six medication patterns were obtained per each age and sex group, the Non-specific pattern and 5 other encompassing different anatomical systems (organs or systems where the drug acts): alimentary tract and metabolism, blood, cardiovascular, dermatological, musculo-skeletal, neurological, respiratory, and sensory organ. 5.- Conclusion Multimorbidity was present in almost all population over 65 years in Barcelona. It was identified six multimorbidity patterns, per each age and sex group, using k-means technique, observing their stability during the studied period. Death rate varied in accordance with multimorbidity pattern and sex. The consumption of 5 or more drugs, as well as living in deprivate areas, were associated with a higher death rate. It was identified six medication patterns corresponding with multimorbidity pattern previously defined.

The tumor necrosis factor (TNF) acts as a potent inducer of inflammation in autoimmune diseases like Crohn disease and ulcerative colitis. Current available treatments are based on TNF inhibition such as infliximab and adalimumab. These drugs are very effective in inducing and maintaining remission. However, there is a high proportion of patients that lose their initial response over time. Recently, some studies have used therapeutic anti-TNF monitoring tools in order to adjust treatments according to each patient. We have conducted a prospective multicenter study to determine the usefulness of therapeutic anti-TNF monitoring in patients with Crohn disease or ulcerative colitis in two centers with a different degree of specialization. The results have allowed us to assess the clinical and economic impact of therapeutic anti-TNF monitoring in each center. Moreover, they have let us to determine which variables might influence the pharmacokinetics of these anti-TNF drugs
El factor de necrosi tumoral (TNF) actua com un potent inductor de la inflamació en la malaltia de Crohn (MC) i colitis ulcerosa (CU). Pel tractament d’aquestes malalties existeixen fàrmacs anti-TNF com Infliximab i Adalimumab, medicaments efectius per induir i mantenir la remissió encara que una alta proporció de pacients deixen de respondre al llarg del temps. Darrerament, alguns estudis han començat a utilitzar l’eina de la determinació de nivells de fàrmac per ajustar les pautes de tractament en funció de cada pacient. Durant aquesta tesi doctoral hem realitzat un estudi pilot multicèntric prospectiu per determinar la utilitat del monitoratge farmacocinètic de fàrmacs anti-TNF en pacients amb MC o CU en dos centres amb diferent grau d’especialització. Els resultats ens han permès determinar l’impacte clínic i econòmic que representa el monitoratge farmacocinètic de fàrmacs anti-TNF a cada hospital i determinar les variables que afecten a la farmacocinètica d’aquests fàrmacs

L'escorça prefrontal (EPF) és necessària per dur a terme funcions cerebrals superiors com la presa de decisions, la memòria de treball o l'atenció. S'han descrit diferents alteracions anatòmiques i funcionals en aquesta regió cerebral en malalties psiquiàtriques com l'esquizofrènia i la depressió.

El receptor 5-HT(1A) té una funcionalitat dual actuant com a autoreceptor en les dendrites i el soma de les neurones serotoninèrgiques i com a heteroreceptor en àrees postsinàptiques com l'EPF i l'hipocamp. Ha estat implicat en la fisiopatologia de diferents malalties psiquiàtriques, entre elles, l'esquizofrènia o la depressió. Per aquest motiu la modulació del receptor 5-HT(1A) sembla ser una possible diana terapèutica per aquest tipus de trastorns.

Els objectius de la present tesi són estudiar els efectes d'agonistes del receptor 5-HT(1A) (clàssics -8-OH-DPAT- i de nou desenvolupament -F15599, F13640) sobre l'activitat de l'EPF tant a nivell neuronal com poblacional i caracteritzar les subpoblacions de receptors implicades en els efectes provocats per aquests agonistes. A més, caracteritzar en models animals un nou antagonista del receptor 5-HT(1A) (DU 125530) per validar la seva possible aplicació per la potenciació del tractament antidepressiu.

Per dur a terme els objectius plantejats es van utilitzar tècniques electrofisiològiques de registre extracel·lular unitari i registres del potencial de camp en animal anestesiat a més d'estudis de microdiàlisi intracerebral.

Les conclusions obtingudes en la present tesi són:

1. Agonistes del receptor 5-HT(1A) amb diferent estructura química provoquen majoritàriament, però amb patrons de resposta distintius, excitacions de les neurones piramidals d'EPF mitjançant un mecanisme depenent de circuit que implica les interneurones GABAèrgiques de la mateixa EPF. Aquesta excitació podria facilitar la neurotransmissió dels nuclis aminèrgics mesencefàlics a aquesta àrea i afavorir l'activitat de l'EPF en tasques com la memòria de treball.

2. Els diferents agonistes 5-HT(1A) emprats en la present tesi (8-OH-DPAT, F15599 i F13640) inhibeixen les neurones serotoninèrgiques del nucli del rafe dorsal però actuen amb diferent potència relativa sobre els heteroreceptors 5-HT(1A) postsinàptics vs. els autoreceptors presinàptics. Així, dels tres fàrmacs testats, l'F15599 mostra un perfil novedós amb una acció preferent sobre els heteroreceptors corticals comparat amb l'F13640 i la 8-OH-DPAT. L'eficàcia de l'F15599 en models animals de depressió i dèficits cognitius el fa interessant per al tractament de malalties psiquiàtriques, evitant els efectes secundaris produïts per activació de l'autoreceptor.

3. El DU 125530 és un antagonista del receptor 5-HT(1A) molt potent en models animals, capaç d'antagonitzar tant respostes a nivell d'autoreceptor com a nivell d'heteroreceptor postsinàptic. Aquest fàrmac permet potenciar l'augment de serotonina produït per antagonistes selectius de la recaptació de serotonina però també bloqueja els heteroreceptors 5-HT(1A) postsinàptics. Així, l'augment de funció serotoninèrgica produït pel bloqueig dels autoreceptors sembla que no es tradueix en un major efecte antidepressiu possiblement degut al bloqueig dels receptors 5-HT(1A) postsinàptics.

4. A part de les diferències regionals en la funcionalitat del receptor 5-HT(1A) ja conegudes, la present tesi planteja possibles diferències a nivell cel∙lular entre subpoblacions de receptors 5-HT(1A) situats en tipus neuronals diferents (piramidals vs. GABAèrgiques i vs. serotoninèrgiques). El disseny de fàrmacs amb capacitat d'actuar preferentment sobre els receptors situats en tipus cel·lulars determinats podria ser una estratègia interessant pel tractament de malalties psiquiàtriques.
The 5-HT(1A) receptor is an inhibitory receptor acting as autoreceptor in serotonergic neurons and as heteroreceptor at postsynaptic areas such as the prefrontal cortex (PFC). The PFC has shown to be a key area for cognitive processes such as working memory or attention and is altered in different psychiatric disorders, such as schizophrenia and depression. Moreover, the 5-HT(1A) receptor seems to be involved in the physiopathology and etiology of psychiatric disorders, suggesting that the modulation of this receptor could be an interesting strategy for the treatment of schizophrenia and depression.
This thesis is based in the hypothesis that proposes that psychoactive drugs modulate cortico-mesencephalic circuitries involving PFC and mesencephalic monoaminergic nuclei. Specifically, 5-HT(1A) receptors of PFC may have a key role in this modulation. Under this hypothesis, the general aim of the thesis was to study the effects of 5-HT(1A) agonists and antagonists on the unitary and population activity of PFC and raphe nuclei.
To carry out this work, we performed single unit and local field potential recordings as well as intracerebral microdialysis studies in anaesthetized animals.
The main conclusions of this study are:
- 5-HT(1A) agonists cause mainly excitations on PFC pyramidal neurons through a mechanism involving PFC GABAergic interneurons. This excitation could facilitate monoaminergic neurotransmission to PFC and favor PFC activity in cognitive tasks.
- Different 5-HT(1A) agonists display different relative potency modulating the activity of PFC vs. raphe neurons. Whereas classical agonists act preferentially on serotonergic neurons, F15599 can modulate preferentially the activity of PFC pyramidal neurons, showing interesting characteristics for the treatment of depression and cognitive/negative symptoms in schizophrenic patients.
- Despite DU125530 is a potent 5-HT(1A) antagonist in animal models, antagonizing effects at presynaptic and postsynaptic levels and potentiating the increase of serotonin induced by SSRIs, it's not able to improve antidepressant treatment when administered with fluoxetine to depressed patients.
- Besides the regional differences in 5-HT(1A) receptor functionality already known, the thesis suggests possible differences at the cellular level among 5-HT(1A) receptors of different cell types. Designing drugs targeting preferentially specific cell types could be an interesting strategy for the treatment of psychiatric disorders.

Treball 1: Caracterització de les diferents alteracions de FLT3 en LLA i LMA en una sèrie de pacients pediàtrics: incidència, impacte pronòstic i correlació amb altres variables clínico-biològiques En aquest treball s’analitza l’estat mutacional i nivell d’expressió en mostres de 204 pacients pediàtrics afectes de diferents subtipus de leucèmia aguda (LLA-B: 144; LLA-T: 23; LMA: 36 i una MPAL), uniformement tractats en el nostre centre segons protocols de la Sociedad Española de Hematología y Oncología Pediátricas (SEHOP). A més de la caracterització de l’estat de FLT3 també vam analitzar la correlació amb altres variables clínico-biològiques i l’impacte pronòstic de la sobreexpressió de FLT3. En la nostra sèrie de pacients el número de mutacions de FLT3 va ser escàs. Vàrem observar que l’expressió de FLT3 es correlacionava amb el llinatge de la leucèmia i el subtipus genètic; així, els pacients amb LLA-MLL+ són els que mostraren una expressió més elevada. En el cas de les LLA-B la sobreexpressió s’associava significativament a l’edat (lactants), leucocitosi i reordenament MLL. Cal destacar que la sobreexpressió de FLT3 no va mostrar una importància pronòstica (SG ni SLE) en els pacients amb LLA-B, LLA-T ni LMA. Nogensmenys, sí que vàrem demostrar un impacte pronòstic d’altres factors ja descrits clàssicament com l’edat, la hiperleucocitosi, l’afectació del SNC, la categorització en subgrups de risc genètic, la presència del reordenament de MLL i la presència de MRM al final d’inducció. Treball 2: Correlació de FLT3 amb el transport intracel·lular de citarabina per hENT1. Impacte de diferents inhibidors de FLT3 sobre el transport i efectivitat de la citarabina Es tracta d’un treball on s’analitza la relació funcional entre el receptor FLT3 i els principals transportadors d’anàlegs de nucleòsids en mostres de 50 pacients pediàtrics amb diferents subtipus de leucèmia aguda (LLA-B: 44; LLA-T: 2; LMA: 4), uniformement tractats segons protocols de la Sociedad Española de Hematología y Oncología Pediátricas (SEHOP), en el cas de les LLA: SHOP-LAL-99, 05, 13 i en el cas de les LMA SHOP-LAM-00 & 07. Descrivim la correlació positiva entre FLT3 i hENT1 a nivell genòmic, proteic i funcional, és a dir, com FLT3 modula el transport de citarabina a l’interior de la cèl·lula. A més, demostrem com la inhibició de FLT3 mitjançant fàrmacs inhibidors (PKC402, AC220) disminueix significativament el transport de citarabina, posant de manifest que l’ordre com s’administren aquests fàrmacs és important i pot tenir efectes sobre la seva eficàcia.
FLT3 abnormalities are negative prognostic markers in acute leukemia. Infant leukemias are a subgroup with frequent MLL (KMT2A) rearrangements, FLT3 overexpression and high sensitivity to cytarabine, but dismal prognosis. Cytarabine is transported into cells by Human Equilibrative Nucleoside Transporter-1 (hENT1, SLC29A1), but the mechanisms that regulate hENT1 in acute leukemia have been scarcely studied. We explored the expression and functional link between FLT3 and main cytarabine transporters in 50 pediatric patients diagnosed with acute lymphoblastic leukemia and MLL rearrangement (ALL-MLL+) and other subtypes of leukemia, and in leukemia cell lines. A significant positive correlation was found between FLT3 and hENT1 expression in patients. Cytarabine uptake into cells was mediated mainly by hENT1, hENT2 and hCNT1. hENT1-mediated uptake of cytarabine was transiently abolished by the FLT3 inhibitor PKC412, and this effect was associated with decreased hENT1 mRNA and protein levels. Noticeably, the cytotoxicity of cytarabine was lower when cells were first exposed to FLT3 inhibitors (PKC412 or AC220), probably due to decreased hENT1 activity, but we observed a higher cytotoxic effect if FLT3 inhibitors were administered after cytarabine. FLT3 regulates hENT1 activity and thereby affects cytarabine cytotoxicity. The sequence of administration of cytarabine and FLT3 inhibitors is important to maintain their efficacy.

INTRODUCCIÓN: La heparina no fraccionada (HNF) se utiliza en el tratamiento del ictus desde varias décadas como fármaco anticoagulante. Los ensayos clínicos aleatorizados no han demostrado eficacia de este tratamiento, por lo que se desaconseja su uso. Sin embargo estos estudios tienen numerosas limitaciones como un excesivo retraso en el inicio del tratamiento, la vía de administración del fármaco y la falta de monitorización. En los últimos años se han descrito numerosas propiedades antiinflamatorias de la HNF que podrían ser beneficiosas en la isquemia cerebral aguda. OBJETIVOS: establecer un modelo animal de tratamiento continuo con HNF que permita mantener una heparinemia dentro de los márgenes terapéuticos deseados y determinar si la HNF administrada de la manera adecuada es neuroprotectora en un modelo de isquemia-reperfusión cerebral focal en rata, estudiar si hay mecanismos antiinflamatorios involucrados en este efecto neuroprotector, analizar marcadores séricos de inflamación en pacientes con ictus para determinar si existe un efecto antiinflamatorio al usar HNF y desarrollar un ensayo clínico aleatorizado comparando la HNF con la aspirina en el tratamiento del ictus isquémico agudo para evaluar la superioridad de este tratamiento. MÉTODOS Y RESULTADOS: Evaluamos la farmacocinética de la HNF en diferentes grupos de rata mediante reactivos cromógenos y encontramos que la dosis que mantenía una heparinemia constante de 0.3 a 0.6 U/mL fue un bolus de 200 U/kg seguido de una perfusión intraperitoneal de 70 U/kg/h. Mediante la técnica de oclusión endoluminal de la arteria cerebral media determinamos que la HNF iniciada a las 3 horas de la isquemia reducía el volumen de infarto cerebral en un 46% respecto al grupo control. Este efecto neuroprotector se acompañó de una elevación de los niveles plasmáticos de IL-10, de una mayor expresión de hemooxigenasa-1, y de una menor expresión de VCAM-1. En pacientes con isquemia cerebral agudo, encontramos una mayor respuesta de fase aguda (leucocitos totales, porcentaje de polimorfonucleares y velocidad de sedimentación globular) en los tratados con aspirina que en los que recibieron HNF. La reacción de fase aguda fue menor que presentaban una recuperación completa al alta. Además se demostró una asociación positiva entre el uso de HNF y la recuperación completa, sobre todo en el ictus no lacunar. En otro estudio el aumento de VCAM-1 sérica a las 48 horas se asoció de forma independiente con una peor recuperación a los 6 meses. Los niveles de VCAM-1 sérica fueron 1.24 veces mayores en los pacientes tratados con aspirina. Por último, realizamos un ensayo aleatorizado, el estudio RAPID, comparando la eficacia de la aspirina y de la HNF en el ictus isquémico no lacunar de menos de 12 horas de evolución. El estudio se cerró prematuramente con 67 pacientes incluidos. La HNF demostró un perfil de seguridad igual al de la aspirina. CONCLUSIONES: La HNF administrado de forma adecuada es neuroprotectora en el modelo de isquemia-reperfusión cerebral focal de rata, ya que reduce en un 46% el volumen de infarto. La acción neuroprotectora de la HNF está mediada por mecanismos antiinflamatorios, como el incremento de la IL-10 plasmática, el aumento de la expresión de la hemooxigenasa-1 y la inhibición de la inducción de la VCAM-1. En pacientes con ictus tratados con HNF se observa una menor respuesta de fase aguda y niveles séricos más bajos de VCAM-1. Esta disminución de marcadores inflamatorios se asoció con una mejor recuperación funcional.
La medicina basada en la evidencia no tiene, en estos momentos, datos suficientes para evaluar la eficacia y seguridad del tratamiento con HNF en las primeras 12 horas tras un ictus isquémico no lacunar. No obstante, el estudio RAPID aporta que el perfil de seguridad de la HNF puede ser similar al de la aspirina y una mayor eficacia en la prevención de recurrencias tempranas.

Esta tesis doctoral presenta los resultados de la aplicación de varias técnicas computacionales al complejo campo del desarrollo de fármacos, particularmente en GPCRs, una de las familias más importantes de proteínas de membrana. La tesis está organizada en las siguientes secciones: introducción, métodos, objetivos, resultados y conclusiones. Introducción: incluye los fundamentos de biología molecular de los receptores de membrana acoplados a proteínas G.; clasificación, estructura, farmacología, señalización y activación. Métodos: describe las técnicas computaciones usadas en la tesis. Objetivos: describe los objetivos propuestos en el desarrollo de la tesis. Resultados: En esta sección se presentan los resultados obtenidos. En primer lugar se contextualice todo el trabajo hecho, se listan las contribuciones y se exponen resumidamente los diferentes resultados obtenidos. La siguientes subsecciones describen el trabajo realizado en los diferentes proyectos de manera detallada. Proyectos: LigandFinder Esta aplicación web proporciona una interfaz de fácil uso para realizar “virtual screening” rápido para encontrar nuevos compuestos similares a un set de compuestos de estructura conocida. Explora el espacio químico de una base de datos con más de 20 millones de compuestos. Hasta donde llega nuestro conocimiento, LigandFinder es la primera aplicación web de “virtual screening” capaz de usar varios ligandos como input. Estudio de los aminoácidos con azufre En este trabajo se estudian las interacciones de los aminoácidos con azufre en las proteínas de membrana. Las interacciones de estos aminoácidos entre ellos y con otros aminoácidos se extraen de una base de datos con estructuras refinadas, se agrupan, y se calcula la energía de interacción de las estructuras representativas usando cálculos químico cuánticos de alto nivel. GPCR-SAS Esta aplicación web se aprovecha de la similaridad estructural de las regiones transmembrana de la familia de las GPCRs para realizar cálculos estadísticos de las posiciones de secuencia o los motivos dentro de las hélices transmembrana. Es posible realizar estos cálculos en las clases A, B, C y F. Los cálculos estadísticos disponibles incluyen el cálculo de la conservación de una posición/posiciones/rango de posiciones, entropía, coevolución (covarianza) y correlación. Adicionalmente, hay la posibilidad de obtener una representación bidimensional de la conservación (snakeplot). La entrada extracelular otorga selectividad a los antogonistas de 5-HT7 con comportamiento antidepresivo en vivo. Este trabajo resalta la importancia de la poco conservada parte extracelular de los receptores de serotonina en la selectividad de sus ligandos. Se describe el modo de unión de un antagonista selectivo de 5-HT7 con comportamiento antidepresivo.
This thesis present the results of various computational techniques applied to the complex world of drug development with a particular focus to its application to one of the most important membrane protein family, the GPCRs. The thesis is organized in the following sections: introduction, methods, objectives, results and conclusion. Introduction: covers the fundamentals of G-protein coupled receptors molecular biology; classification, structure, pharmacology, signaling and activation. Methods: describes the computational techniques used in the thesis. Results: In this section, the results obtained are presented. A first paragraph contextualizes all the work done, describing its objectives, stating the contribution of the author; moreover a brief introduction of each part of the results paragraphs. The following subsections contain a detailed explanation of all projects done in this thesis. Projects: LigandFinder This web application provides a user-friendly way to perform fast virtual screening to find new compounds similar to a set of compounds of known structure. It explores the chemical space of a database with more than 20M compounds. To our knowledge, LigandFinder is the first virtual screening web application able to use several ligands as input. Sulfur-containing amino acids study In this work the interactions of sulfur-containing amino acids (cysteine and methionine) in membrane proteins are studied. A refined crystal structures database is screened in order to find interactions of sulfur-containing residues with themselves and other residues. These interactions are clustered, and the interaction energy of representative structures is calculated through high-level quantum chemical calculations. GPCR-SAS This web application takes advantage of the structural similarity among GPCRs’ transmembrane regions to perform statistical analysis of sequence positions or motifs within the transmembrane helices of GPCR A, B, C, and F classes. GPCRSAS provides different types of analysis such as position/positions/range of positions conservation, entropy, co-evolutionary (co-variance) and correlation analysis. Additionally, there is the possibility of drawing a snakeplot representation with conservation information. The extracellular entrance provides selectivity to 5-HT7 receptor antagonists with antidepressant –like behavior in vivo This work highlights the importance of the low conserved extracellular part of the serotonin receptors in ligand selectivity. The binding mode of a selective 5HT7 receptor antagonist with antidepressant activity is described, opening the way for a new generation of antidepressant drugs.

Antecedents: El procés de desenvolupament d'un fàrmac des del descobriment a la comercialització és una seqüència complexa que es pot perllongar més de deu anys. La duració, taxa de fracassos i les fites varien molt depenent del tipus de fàrmac i la seva indicació. Hipòtesis: Durant el desenvolupament de noves entitat moleculars (NEM) pel tractament tòpic de malalties dermatològiques inflamatòries (MDI), l'establiment d'un pla de desenvolupament clínic utilitzant dissenys d'estudis de Prova de Concepte (PdC) eficients portarà a obtenir dades robustes i concloents en un curt període de temps, amb mínims requeriments de dades no-clíniques i clíniques, minimitzant l'exposició al producte en investigació dels subjectes en assajos clínics, assegurant la seva seguretat. Objectiu: Identificar l'aproximació més eficient per explorar l'activitat clínica d'una NEM pel tractament tòpic de les MDI en quant a fiabilitat dels resultats, requeriments de dades no-clíniques i clíniques i subjectes exposats, temps per obtenir dades d'activitat i inversió requerida. Mètodes: S'ha dut a terme una revisió de guies regulatòries de la ICH, l'EMA i la FDA i dels informes d'avaluació públics de productes tòpics dermatològics per tal d'identificar els objectius d'un pla de desenvolupament exploratori i els estudis no-clínics i clínics requerits per a iniciar els estudis de PdC. Es va dur a terme una revisió d'assajos clínics publicats de productes dermatològics tòpics en dermatitis atòpica (DA) i psoriasis publicats durant el període de gener 2003-desembre 2013, per tal de descriure els estudis utilitzats per obtenir una PdC en termes de disseny, nombre de subjectes, duració i tipus de variables i identificar els dissenys de PdC més rellevants en DA i psoriasis. Per cada tipus de disseny identificat s'ha proposat un pla de desenvolupament amb recomanacions, estimant costos i duració, comparant les diferents aproximacions. Resultats: Hi ha molt poca informació sobre com planificar el desenvolupament d'una NEM pel tractament de la DA i la psoriasis per la via tòpica malgrat les diferencies respecte dels productes per via sistèmica en termes de exposició sistèmica i seguretat podrien impactar en els plans de desenvolupament. S'han revisat un total de 59 estudis en DA i 40 en psoriasis i s'han identificat 3 tipus d'estudis principals con a rellevants per a avaluar l'activitat d'un producte aplicat per via tòpica: Estudi aleatoritzat, paral·lel inter-subjecte, Estudi aleatoritzat paral·lel intra-subjecte i estudis farmacodinàmics. Per la DA, s'han proposat dos escenaris, amb els dissenys inter-subjecte i intra-subjecte com a PdC i per la psoriasis s'ha proposat un tercer escenari amb un estudi de placa com a PdC. Després de tenir en compte totes les dades prèvies requerides en cadascun dels escenaris i les seves característiques, s'ha proposat un escenari implementant un estudi intra-subjecte per la DA i un amb un estudi de placa per la psoriasis com les aproximacions més eficients en terme de costos i temps fins a obtenir una prova d'activitat clínica d'una NEM especialment quan es tracta d'un nou mecanisme d'acció. Conclusions: El disseny del estudi de PdC s'hauria d'establir molt aviat quan es planeja el desenvolupament ja que impactarà en tot el pla de desenvolupament. Algunes de les aproximacions s'han identificat com a més eficients, encara que hi ha diferents factors que poden influenciar. Una guia regulatòria amb els requeriments generals pel desenvolupament de productes tòpics dermatològics seria útil per ajustar la quantitat de proves no-clíniques i clíniques de forma que garantissin la seguretat dels subjectes exposats durant els assajos clínics al mateix temps que evitaria l'ús excessiu de recursos, facilitant el desenvolupament, fent-lo més eficient i predictible.
Background: The process of developing a drug from discovery to the market is a complex sequence of milestones that may take more than ten years. The duration, rate of failures and milestones vary greatly depending on the type of drug and the indication. Hypothesis: During the development of new molecular entities (NME) aimed for the topical treatment of inflammatory dermatological diseases (IDD), setting up an exploratory clinical development plan objective using efficient proof of concept (PoC) study designs, leads to obtaining robust and conclusive data in a short period of time, with minimal requirements of non-clinical and clinical data and minimizing the exposure of subjects participating in clinical trials to the investigational product, thus ensuring their safety. Objective: To identify the most efficient approach to explore the clinical activity of a NME for the topical treatment of IDD in terms of reliability of the results, non-clinical and clinical data requirements and in terms of exposed subjects, time to obtain activity data and investment required. Methods: A systematic review of regulatory guidelines issued by the ICH, EMA and FDA, as well as public assessment reports of topical dermatological products was done to identify the objectives of an exploratory development, and non-clinical and clinical studies required to initiate PoC studies. A systematic review of clinical trials of topical dermatological products in Aropic Eczema (AE) and Psoriasis published in the period January 2003-December 2013, to describe the type of designs used to obtain a PoC in terms of designs, number of patients, duration, type of variables and identify the most relevant clinical trial designs for PoC in AE and/or psoriasis was performed and for each type of design identified, a development plan with recommendations was proposed, estimating costs and duration and comparing the different approaches. Results: There is little information on how to plan the development of a NME for the treatment of AE or psoriasis by the topical route despite differences with respect to systemically administered products in terms of systemic exposure and safety issues may impact development plans. A total of 59 studies in AE and 40 in psoriasis were summarized and 3 main types of studies identified as relevant to assess the activity of a product applied topically on the skin: Randomized, parallel inter-subject study, Randomized, parallel, intra-subject comparison and Pharmacodynamic studies. For AE, two scenarios were proposed, where inter-subject and intra-subject studies were the PoC designs and for psoriasis a third scenario was proposed with a psoriasis plaque test as a PoC. After accounting for all previous data needed in each of the scenarios, and the particular features of development, an scenario implementing an intra-subject design for AE and with a psoriasis plaque test for psoriasis were proposed as the most efficient in terms of time and costs till a proof of clinical activity of a NME especially when it has a new mechanism of action. Conclusions: The design of the PoC study should be established early when planning the development as it will impact on the whole plan. Some approaches have been identified as more efficient although this may be influenced by different factors. A general regulatory guidance for early stage development requirements specific for topical dermatological products would be useful to adjust the amount of non-clinical testing to an extent that guaranties the safety of subjects exposed during clinical trials at the same time that avoids excessive use of resources, easing the development process and making it more efficient and predictable.