Dissertations / Theses on the topic 'Fièvre à virus'

L'écosystème des mares temporaires du Ferlo situé au nord du Sénégal est favorable à la circulation de zoonoses à transmission vectorielle telles que la fièvre de la vallée du Rift ou la fièvre West Nile. L'objectif de nos travaux était d'objectiver les risques sanitaires engendrés par la fréquentation de ce milieu par les populations humaines et animales ainsi que d'identifier les facteurs de risque environnementaux de leur transmission afin de proposer des mesures de lutte et de surveillance adaptées. La fièvre West Nile et la fièvre du Rift sont enzootiques dans la région de Barkedji (Ferlo). La circulation virale intervient en fin de saison pluvieuse et le risque de transmission est spatiallement hétérogène pour la FVR. Les processus qui permettent l'endémisation - le maintien des virus dans le milieu d'une année sur l'autre - demeurent inconnus. Outre la nécessité de mettre en place un système de surveillance pour la FWN sur le territoire sénégalais et de renforcer le système existant pour la FVR, notre travail a permis de formuler des questions de recherche fondamentales pour la lutte contre ces maladies : quels sont les outils et les méthodes à mettre au point pour pouvoir extrapoler les résulats à d'autres territoires ou à d'autres pathologies? Quel peut être l'apport de la télédétection et de la modélisation dans cette problématique? La prévision des zones et des périodes d'émergence des zoonoses vectorielles et des maladies oiseaux-portés ainsi que les méthodes de lutte à mettre en place font partie des grandes préoccupations sanitaires des prochaines décennies. Les modèles proposés par la FWN et la FVR dans le Ferlo pourraient apporter des éléments de réponse pour faire face au défi que proposent ces pathologies.

Le virus de la fièvre catarrhale ovine (Bluetongue virus, BTV) est un orbivirus de la famille des Reoviridae. Il comprend 24 sérotypes et il est responsable d’une maladie hémorragique transmise par des insectes chez les ruminants, qui génère des pertes économiques importantes dans le monde entier. La sévérité de la maladie et la durée de la virémie varient entre sérotypes et hôtes du BTV. La réponse innée pourrait être impliquée dans la sensibilité de l’hôte à l’infection mais elle est très peu connue. Pour aborder l’étude de cette réponse innée chez l’hôte, nous avons étudié la dissémination du BTV et la production d’interféron (IFN) de type I dans la lymphe afférente chez le mouton juste après administration intra-cutanée. Nous avons montré que le BTV migre associée aux cellules dendritiques conventionnelles (cDC) de la lymphe afférente. Tous les sérotypes étudiés de BTV s’expriment et produisent des particules infectieuses dans les cDC, indépendamment de l’atténuation virale. L’expression du BTV favorise la survie des cDC et conduit à une augmentation d’expression du CD80, du CD86 et d’ARN messagers codant pour l’IL12, IL1β et IL6. Les cDC infectées par le BTV induisent la prolifération de lymphocytes immuns T CD4pos et CD8pos et la production d’IFN. Le BTV utilise donc les cDC pour sa première étape de dissémination lymphatique sans altérer leurs fonctions immunes, ce qui suggère une adaptation optimale du virus à sa première cible cellulaire. Par ailleurs, l’injection intra-cutanée de BTV induit la production d’IFN de type I dans la lymphe en 2 pics (à 24 h et à 5-6 jours après inoculation) en parallèle de la dissémination virale. Seules les cellules dendritiques plasmacytoides (pDC) - à la différence des cDC lymphatiques - sont capables de produire de l’IFN de type I en réponse au BTV, indépendamment du sérotype et la réplication virale ou de l’acidification endosomale. Globalement ces approches suggèrent l’hypothèse selon laquelle la réplication du BTV et/ou les réponses des cDC et pDC au BTV pourraient être impliquées dans la susceptibilité individuelle au virus
Bluetongue virus (BTV), an orbivirus of the reoviridae family comprises 24 serotypes and is responsible for an insect transmitted hemorrhagic disease in ruminants that generates important economic losses all over the world. The severity of the BTV induced syndrome as well as the duration of viraemia greatly varies between BTV serotypes and hosts. The innate response to the virus could be involved in host sensitivity and has not been studied. We investigated the first steps of BTV dissemination and type I IFN response in the afferent lymphatic in sheep, right after intra-cutaneous delivery of the virus. We showed that BTV initially migrates in the skin draining lymph mainly associated to conventional dendritic cells (cDC). Lymph cDC supported BTV RNA, protein and infectious virus production of several serotypes, independently of viral attenuation. BTV expression in cDC did not impair their survival but rather favored it. Interaction of BTV with cDC preparation resulted in an increased expression of CD80 and CD86 as well as an increase in IL12, IL1b and IL6 mRNA expression. Finally lymph cDC cultured with BTV triggered stimulation of specific CD4 and CD8 T cell proliferation as well as IFNg production. BTV thus utilizes cDC for its first lymph dissemination step in the host without altering their classical immune function of antigen presentation, reflecting an optimal adaptation of the virus to its first cell target. Besides, we found that type I IFN is detectable in 2 peaks (24 hours and day 5 - 6) in afferent lymph in parallel to the viral dissemination. Only lymph plasmacytoid (pDC) and not cDC were producing type I IFN (IFNa) to BTV, independently on viral serotype, on viral replication and on endosomal acidification. Collectively these finding suggest the hypothesis that BTV replication in cDC and/or cDC and pDC responses might be involved in inter-individual susceptibility to BTV

La fièvre hémorragique à virus Ebola est une maladie qui constitue une menace pour les populations d'Afrique Centrale, notamment en milieu rural forestier. Au Gabon et en République du Congo, où 7 épidémies ont sévit entre 1994 et 2005, elle y est devenue un problème de santé publique. Cette zoonose émerge chez l'homme lors d'un contact direct avec un animal contaminé, une carcasse ou un vecteur du virus. L'émergence est directement liée aux pratiques ancestrales des lieux (chasse, cueillette, etc. ). La contamination inter humaine a lieu lors d'un contact direct avec les fluides corporels d'un malade. Elle s'effectue en premier lieu au sein des familles des victimes, lors des soins prodigués aux malades et ceux donnés aux morts lors des cérémonies funéraires. Nous tentons dans les premiers temps de cette étude de comprendre, en nous appuyant sur le concept de pathocénose, en quels termes l'émergence virale éclaire sur les liens existants entre les hommes et les virus. Lors de telles épidémies la médecine d'urgence « s'associe » au système de santé national dont l'emprunte territoriale est localement faible. Plusieurs types d'offres de soins antérieurs (traditionnels) ou postérieurs (clinique religieuses) se surimpose au modèle de santé biomédical représenté par les cases de santé et centres médicaux. Les médicaments manquent, les personnels de santé ne se rendent pas toujours sur les lieux de leur affectation. Au quotidien, les recours aux soins des populations apparaît pluriel. Lors d'une épidémie d'Ebola, en raison de son taux de mortalité (jusqu'à 80%) et de sa contagiosité élevés, la logique des malades sembles plus liée à une errance thérapeutique, conditionnée par la recherche des soins et de la causalité du malheur. La multiplicité des acteurs présents lors de la crise exacerbe l'anomie créée par la maladie et met en exergue un rapport de force, de violence, qui n'est parfois que l'expression de la contestation des plus démunis
The Ebola hemorrhagic viral fever is a disease which constitutes a threat for the populations of Central Africa, in particular in rural forester areas. In the Gabon and Republic of Congo (7 epidemics between 1994 and 2005) it became a problem of public health? This zoonos appears at the man's during a direct contact with a contaminated animal, a carcass or a vector of the Ebola virus. The emergence is directly connected, in these enclosed villages, to the ancestral practices of places (hunting, picking, etc. ). The contamination takes place during a direct contact with the physical fluids of a patient. It's made first of all within the families of the victims, during the care lavished on the patients and during those given to the deaths during ceremonies funeral. Firstly, with pathocenosis' concept help, we try in this study to understand in which terms the viral emergence lights us on existing links between people and virus. The amplified rôle of hospital's care confirms the inmportance of the risk in this structure and th panic perception of the world opinion. The North carries a particular interest there. There is no epidemic of Ebola which is accompanied with the procession of international institution. This procession « joins » to the national health system of which takes it territorial is low locally. Several types of care's offers exist with the biomedical model of health represented by « house of health » and health centers. During an epidemic of Ebola, because of his high mortality rate (ut to 80%) and of its contagiousness, the logic of the patient seems more connected to a therapeutic wandering, conditioned by the search for the care and for the causality of the misfortune. In the absence of vaccine, the treatment against Eobla remains symptomatic. The multiplicity of the present actors during the crisis aggravates the anomie created by the disease and highlights a balance of powers, violence, wich is sometimes only the expression of the contesting of the most deprived

La Fièvre de la Vallée du Rift (VFVR) est une arbovirose zoonotique affectant principalement les ruminants et les humains. Son éco-épidémiologie complexe implique de nombreuses espèces de vecteurs, d'hôtes et de voies de transmission. Ainsi, différents mécanismes de transmission et d'émergence sont impliqués dans la circulation du virus de la FVR (VFVR) et ceux-ci dans des écosystèmes contrastés d'Afrique, de la Péninsule Arabique et des îles du sud-ouest de l'Océan Indien, dont l'île de Madagascar.Par sa superficie, sa grande diversité éco-climatique et sa faune et flore endémique, Madagascar est considérée comme une île continent. On y retrouve, en effet, des écosystèmes variés plus ou moins favorables aux moustiques : semi-arides dans le sud-ouest, humides et froids sur les hautes terres centrales, per-humide dans l'est et humides et chaud dans le nord-ouest. Madagascar a été affectée par deux épidémies de FVR en 1990-91 puis 2008-09. Une étude menée lors de la dernière épidémie a montré que le virus avait largement diffusé dans l'île de façon hétérogène.Compte tenu de la complexité des mécanismes de transmission de la FVR et de la diversité des écosystèmes de Madagascar, nous avons supposé que cette hétérogénéité spatiale était due à des mécanismes de transmission et d'émergence qui variaient en fonction des écosystèmes de l'île. Ainsi, le premier objectif de ce travail de thèse étaient de déterminer les mécanismes et les dynamiques de transmission de la FVR inhérents aux différents écosystèmes de Madagascar. Le second objectif a été d'identifier les mécanismes d'émergence de la FVR à Madagascar et de déterminer s'il sera possible, et nécessaire, de prédire cette émergence à l'échelle des écosystèmes.Dans le cadre de ce travail de thèse deux enquêtes sérologiques nationales, l'une bovine (2008) et l'autre humaine (2011-13) ont, premièrement, été analysées par un modèle linéaire mixte généralisé afin d'identifier les facteurs environnementaux et comportementaux favorables à la circulation du virus chez les bovins et les humains. Deuxièmement, deux enquêtes sérologiques bovines, l'une réalisée en 2008 et l'autre en 2014, ont été analysées pour reconstruire la dynamique de transmission de la FVR dans les différents écosystèmes de l'île. Cette reconstruction a été réalisée à partir de données de séroprévalence et d'âge inclues dans un modèle Bayésien hiérarchique pour estimer la force d'infection annuelle de 1992 à 2014. Enfin, afin de faire le lien biologique avec les résultats des travaux menés à une échelle nationale et de décrire les mécanismes de transmission à une échelle fine, des enquêtes longitudinales entomologiques et sérologiques ont été réalisées entre 2015 et 2016 dans un écosystème à risque. Et ceci, afin de décrire la transmission saisonnière du VFVR chez les ruminants associée à la dynamique de transmission des vecteurs potentiels.Nos résultats ont montré que la région du nord-ouest de l'île est une région à risque de transmission. D'une part, elle est constituée d'environnements associant une forte densité de bovins à des zones humides, inondables et irriguées, favorables aux espèces d'Anopheles et Culex. D'autre part, le VFVR semble avoir circulé de façon relativement intense lors de la période inter-épizootique de 1992 à 2007, puis sa transmission a soudainement augmenté en 2007-2008, ce qui est concomitant avec l'apparition des foyers de FVR en 2008. Pour finir, 6 ans après l'épidémie de FVR à Madagascar, le virus semble toujours circuler à bas bruit dans la région. Cette circulation étant probablement due à une transmission vectorielle favorisée par l'abondance de vecteurs potentiels dans la région.Les résultats de ces différents travaux nous ont permis de présenter des hypothèses de transmission dans les différents écosystèmes de l'île et ainsi de proposer des stratégies de surveillance, de prévention et de lutte contre la FVR adaptées au contexte de Madagascar
Rift Valley fever (RVF) is a zoonotic vector-borne disease affecting ruminants and humans. Its complex eco-epidemiology involves several species of vectors, hosts and transmission routes. These particularities allowed the circulation of RVF virus (RVFV) in a variety of ecosystems involving different transmission and emergence mechanisms. Indeed, the RVFV has affected contrasted eco-regions in Africa, Arabian Peninsula and South-West Indian Ocean islands, including Madagascar.Madagascar is considered as a continent island due to its ecological diversity and its endemicity level of the flora and the fauna. In particular, the variation of the Malagasy ecosystems (semi-arid in the south, humid and cold in the highlands, humid and warm in the north-west and per-humid in the east) has an impact in their presence and /or the relative abundance of some mosquito species. Madagascar was heavily affected by RVF in 1990-91 and 2008-2009, with evidence of a large and heterogeneous spread of the disease.Thus considering the diversity of RVF eco-epidemiological cycles and the variety of Malagasy ecosystems, we hypothesized that, in Madagascar, the mechanisms of transmission would be different according to these ecosystems. Therefore, the first objective of this thesis was to understand the mechanisms and the dynamics of transmission of RVFV in the different ecosystems. The second objective was to determine the mechanisms of emergence of RVFV and if it would be necessary and possible to predict the emergence of RVFV outbreaks according to the ecosystems.Firstly, we analyzed both cattle and human serological data performed at the national level using generalized linear mixed models to identify the environmental and behavioral factors associated with RVF transmission in both cattle and human. Secondly, we reconstructed the dynamic of transmission of RVF in the different Malagasy ecosystems. Seroprevalence data of cattle of known age were fitted using Bayesian hierarchical models to estimate the annual force of infection from 1992 to 2014. Thirdly, to understand the biological process link to the mechanisms of transmission at the national scale, we investigated the fine scale mechanisms of transmission of RVFV in pilot area of an at-risk region. We, thus, performed both longitudinal entomological and serological surveys between 2015 and 2016, in order to describe the seasonal transmission of RVFV among ruminants and its association with the dynamics of RVFV potential vectors.Our results showed that the northwestern part of Madagascar is an at-risk region for RVFV transmission. On one hand, it is characterized by high cattle densities associated with humid, floodplain and irrigated areas suitable for RVFV potential vector like Anopheles and Culex species. On the other hand, RVFV had probably circulated intensively in the region during the 1992-2007 inter-epizootic period and its transmission increased suddenly in 2007-08, almost concomitantly with the first outbreaks recorded in 2008. Finally, RVFV was still circulated in the northwestern region at low level, 6 years after the last epidemic. This circulation is likely due to vectorial transmission favoring by the abundance of several potential vectors of RVFV in this pilot region.Finally, our better understanding of the mechanisms of transmission of RVFV throughout Madagascar allowed us to propose hypothesis of transmission in different ecosystems of Madagascar and consequently refine strategies for RVF surveillance and prevention

Pour elucider le processus d'emergence du vfvr, nous avons mis au point des outils permettant d'ameliorer sa detection pendant la phase d'emergence et de mieux comprendre la distribution et les modalites de sa dispersion. Pour ameliorer la detection precoce du virus, un outil de diagnostic par rt-pcr ciblant la region codante de la proteine nss sur le segment s a ete mis au point et valide sur un lot de 297 serums preleves lors de l'epidemie de mauritanie en 1998. Ainsi, nous avons montre que la rt-pcr lorsqu'elle est utilisee en parallele avec la detection des anticorps igm peut etre un outil precieux de diagnostic quasiment equivalent a l'isolement viral qui est le diagnostic de reference. Afin de mieux comprendre comment le virus circule et evolue dans la nature, nous avons analyse la variabilite et la phylogenie moleculaires du vfvr a partir d'un echantillon de souches isolees sur une longue periode a partir d'hotes, d'origines geographiques et de contextes epidemiologiques differents. L'analyse des sequences des trois segments l, m et s du genome viral a permis de montrer que les souches du vfvr peuvent etre regroupees en trois lignees majeures (afrique de l'ouest, afrique centrale-orientale et egypte) correspondant a des variants geographiques et de mieux comprendre leur circulation entre les differentes regions africaines. Ainsi, les discordances de la topologie des arbres phylogenetiques correspondant aux differents segments du genome viral nous a conduit a l'hypothese d'un echange genetique par le reassortiment entre les souches de differentes lignees. Cette hypothese a ete confirmee grace a une analyse statistique et phylogenetique des donnees. L'analyse des reassortants a permis de mettre en evidence des echanges entre les zones endemiques de l'afrique occidentale et centrale-orientale et renforce l'idee de l'existence d'un cycle selvatique du vfvr. De plus, l'existence du reassortiment dans la nature souleve la question de l'utilisation des vaccins attenues en zone endemiques pour la fvr et les risques de reversion vers la virulence. Grace a ces des deux outils, nous avons pu etudier deux epidemies recentes de la fvr au kenya (1997-98) et en mauritanie (1998) et proposer une approche globale pour l'elucidation du processus d'emergence du virus.

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (VFHCC) est un Nairovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae, responsable d’une maladie hémorragique sévère chez l’Homme, associée à des symptômes non spécifiques et à une forte mortalité. La transmission se fait par morsure de tique ou par contact direct avec des fluides corporels contaminés. N’ayant ni vaccin ni traitement spécifique, un apport de connaissances sur les interactions cellulaires VFHCC-hôte ainsi que sur les mécanismes développés en réponse à l’infection est nécessaire.Nous avons tout d’abord étudié le potentiel antiviral de molécules sur la réplication du VFHCC. La chloroquine et la chlorpromazine ont été identifiées et inhibent efficacement la réplication virale avec une protection induite chez la souris contre l’infection, en particulier en combinaison avec la ribavirine.De nombreux virus sont connus pour être ciblés par, ou pour détourner la voie de l’autophagie. Nous avons regardé si l’infection par le VFHCC était associée à une modulation de l’autophagie et si la réplication virale était impactée par l’activité autophagique. L’étude de cellules hépatocytaires et épithéliales a montré une mobilisation massive du LC3, principal marqueur des vésicules autophagiques, par le VHFCC. Celle-ci reflète une induction du flux autophagique d’un nouveau type, n’impliquant pas les voies classiques de recrutement du LC3. La réplication virale n’est pas directement modulée par cette autophagie atypique mais des effets indirects sont à étudier. La plupart de ces observations ont été montrées pour le Nairovirus Dugbe avec cependant une cinétique différente.Le dernier axe étudié porte sur l’analyse de l’impact des IFITMs, facteurs de restriction virale connu pour interférer avec les processus de fusion membranaire, sur la réplication du virus Dugbe. L’étude a révélé une inhibition de la réplication virale par certains IFITMs.Des études supplémentaires portant sur l’interaction virus-cellule hôte et les mécanismes moléculaires associés sont nécessaires pour mieux comprendre la physiopathologie induite par le VFHCC et mettre au point de nouvelles stratégies thérapeutiques
Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV) belongs to Nairovirus genus and to Bunyaviridae family. It is responsible for a severe hemorrhagic disease in humans, associated with non-specific symptoms and high lethality. Transmission is made by tick’s bite or by direct contact with contaminated body fluids. Since no vaccines or treatments are available, there is a need to accumulate knowledge on all aspects of CCHFV-host cell interaction as well as on response mechanisms that are taking place during infection.We first investigated pharmacological ways to interfere with CCHFV replication. Chloroquine and chlorpromazine (known modulators of some viral infections) were efficiently inhibiting viral replication and induce a protection in mice against CCHFV infection, particularly in the presence of ribavirin. Since several viruses are targeted by, or take advantage of, the autophagy response of infected cells, we explored whether CCHFV infection was associated with modulation of autophagy and whether virus replication was impacted by the autophagic activity of infected cells. By using hepatocytes and epithelial cells, we found that CCHFV induced a massive mobilization of the major marker of autophagic vesicles LC3. This mobilization reflected an induced autophagy flux and was of a novel type since known pathways of LC3 recruitment were not involved. The replication of CCHFV was indeed not directly modulated by this atypical form of autophagy but indirect effects remain to be studied. Most of these observations were found to be valid for the related, Dugbe virus (DUGV) with however, a distinct kinetic.Finally, we analyzed whether DUGV was sensitive to the IFITMs, restriction factors that can interfere with membrane fusion processes. Studies revealed that DUGV replication could be inhibited by some IFITMs. Additional studies on virus host-cell interactions and their associated molecular mechanisms should help to better understand the physiopathology induced by CCHFV and to devise therapeutic strategies

La souche vaccinale 17D du virus de la fièvre jaune (FJ) est utilisée pour développer de nouveaux vaccins, tels que les virus ChimeriVaxTM-Dengue, contre la dengue (DEN). Nous avons souhaité caractériser l'atténuation du virus 17D et de ces chimères en terme d'interaction avec les cellules hôtes. Les virus FJ et DEN sauvages étant potentiellement hépatotropes chez l'homme, nous avons étudié in vitro sur une lignée hépatique HepG2, et in vivo chez le singe, l'hépatotropisme des virus 17D et ChimeriVaxTM-DEN par rapport aux souches sauvages. Les résultats révèlent l'importance des études in vivo pour juger du caractère atténué d'un virus. L'étude in vitro montre que les virus ChimeriVaxTM-DEN ont un comportement et des propriétés différentes de leurs virus parentaux. Cependant, l'étude in vivo confirme leur atténuation en terme d'hépatotropisme, semblable à celle du virus 17D, et complète les études menées jusqu'alors pour l'évaluation de ces candidats vaccins, actuellement en essai clinique

Les formes sévères de l’infection par les virus de la fièvre jaune (YFV) et de la dengue (DENV) sont caractérisées par une atteinte du foie, plus sévère lors d’une infection YFV. L’objectif de cette thèse est de comparer les infections de YFV et DENV dans un modèle d’hépatocytes humains dérivés de cellules souches (iHeps) afin d’identifier des facteurs à l’origine de cette différence de pathogenèse. Dans un premier temps, nous avons comparé le tropisme de YFV aux 4 sérotypes de DENV dans notre modèle hépatique établi en monocouche cellulaire. Nous avons observé une faible propagation de DENV dans les iHeps par rapport YFV. Les mêmes observations ont été faites dans des hépatocytes primaires. L’utilisation de souches chimériques 17D/DENV a permis de mettre en évidence que cette faible propagation serait liée à une faible efficacité d’entrée de DENV dans les hépatocytes. Nous avons également étudié l’infection dans des sphéroïdes iHeps, métaboliquement plus actifs que les iHeps 2D. Une infection productive a été observée uniquement avec YFV. Ce résultat pourrait s’expliquer par la faible accessibilité des cellules à l’intérieur des sphéroïdes. Dans un 2ème temps, nous avons étudié les réponses cellulaires induites dans les iHeps 2D après infection par les différents virus en utilisant une approche RNAseq. Les résultats préliminaires suggèrent un lien entre le taux de réplication et le nombre de gènes activés. La réponse interféron est plus précocement détectée dans le cas de YFV, mais l’infection par DENV induit un plus grand nombre de gènes. De plus, DENV-1 et DENV-4 induisent une augmentation d’expression de certains gènes impliqués dans la présentation d’antigène comme HLA-E et TAP-2, alors que YFV diminue l’expression de certains gènes de chimiokines et molécules d’adhésion. L’analyse préliminaire des voies liées au métabolisme hépatique révèle une inhibition de la voie de la coagulation dans le cas de l’infection par YFV, qui n’est pas observée lors de l’infection par DENV. Des observations similaires ont été décrites in vivo, au niveau protéique, confirmant la pertinence du modèle iHeps
Severe forms of infection with yellow fever virus (YFV) and dengue virus (DENV) are characterized by liver damage, with more severe symptoms observed during YFV infection. The aim of this thesis is to compare YFV and DENV infections in a model of human hepatocytes derived from stem cells (iHeps) in order to identify factors that could explain their difference in pathogenesis.First, we compared YFV tropism to the four DENV serotypes in 2D iHeps. We observed a low spread of DENV compared to YFV in both iHeps and primary hepatocytes. By using chimeric 17D/DENV strains, we demonstrate that this low propagation is linked to a low DENV entry efficiency in hepatocytes. We also studied infection in iHeps spheroids, metabolically closer to primary cells than 2D iHeps. A productive infection was observed with YFV only. The low accessibility of cells inside the spheroids could explained this result. Second, we studied cellular responses induced following infection by different viruses in 2D iHeps using an RNAseq approach. Preliminary results suggest a link between replication rate and the number of activated genes. The interferon response is detected earlier following YFV infection, but DENV induces a greater number of genes implicated in this pathway. Moreover, DENV-1 and DENV-4 up-regulate some genes involved in antigen presentation such as HLA-E and TAP-2, while YFV down-regulates genes encoding chemokines and adhesion molecules. Preliminary analysis of hepatic metabolism pathways reveals inhibition of the coagulation pathway induced by YFV infection, which is not observed during DENV infection. Similar observations have been described in vivo, at the protein level, confirming the relevance of the iHeps model

La fièvre hémorragique à virus Ebola (FHVE) est due à un virus à ARN non segmenté de polarité négative de l’ordre des Mononégavirales. Il compose avec le virus de Marburg la famille des Filoviridae. Il existe 4 espèces Ebolavirus réparties géographiquement : Zaïre en Afrique centrale, Soudan en Afrique de l’Est, Côte d’Ivoire en Afrique de l’Ouest et Reston en Asie. Ebolavirus zaïre, apparu en 1976 en République Démocratique du Congo, est l’espèce la plus létale pour l’homme (jusqu’à 88% de mortalité) et a été à l’origine de plusieurs vagues d’épidémies depuis sa ré-émergence en 1995. Les flambées épidémiques de 2001 à 2005 sont caractérisées par de multiples chaînes épidémiques indépendantes et des épizooties concomitantes dans les populations de grands singes (gorilles et chimpanzés). L’amplification et le séquençage du gène viral de la glycoprotéine (GP) ont été effectués à partir de prélèvements obtenus lors des deux dernières épidémies humaines de 2003 et 2005, ainsi que sur des échantillons de carcasses animales trouvées à partir de 2001 dans la forêt de la région Gabon-Congo. Un deuxième gène viral codant la nucléoprotéine (NP) a été amplifié et séquencé à partir de prélèvements obtenus pendant les épidémies humaines survenues depuis 2001 et de prélèvements animaux. L’analyse phylogénétique basée sur le gène codant la GP montre la séparation des souches virales en deux lignées génétiques fortement soutenues. Cette séparation est confirmée par l’existence de signatures moléculaires spécifiques aux séquences de chaque lignée, ainsi que par le calcul des distances génétiques entre les séquences. Les analyses effectuées sur le gène de la NP donnent les mêmes résultats. Cependant, la topologie des souches humaines obtenues entre 2001 et 2003 diffère entre les arbres basés sur la GP et la NP. Les résultats indiquent l’existence de deux lignées phylogénétiques et supposent un événement de recombinaison entre les souches des deux lignées. L’estimation de l’âge des ancêtres communs les plus récents indique que la séparation des deux lignées se serait produite avant la première apparition de la FHVE, vers 1975 (1971 calculé sur la NP). L’événement de recombinaison est daté par cette méthode entre 1998-1999
The virus Ebola, a negative non segmented RNA virus, is responsible for an hemorrhagic fever disease. Together with the Marburg virus, they compose the Filoviridae family (order Mononegavirales). Ebolavirus is geographically divided into 4 species: Zaire in Central Africa, Sudan in East Africa, Ivory Coast in West Africa, and Reston in Asia. Zaire ebolavirus, first appeared in 1976 in the Democratic Republic of Congo, has the highest mortality rate in humans (up to 88%) and has caused several outbreaks since its re-emergence in 1995. Outbreaks from 2001 to 2005 are characterized by multiple independent epidemic chains and large concomitant outbreaks in chimpanzee and gorillas. The viral glycoprotein (GP) gene was amplified and sequenced from samples obtained during the two last human outbreaks in 2003 and 2005 and samples from great apes carcasses found in the forest of the Gabon-Congo area since 2001. A second viral gene coding the nucleoprotein (NP) was amplified and sequenced from animal samples and human outbreaks since 2001. Phylogenetic analysis based on the GP gene showed the separation of Zaire ebolavirus strains into two genetic lineages. This separation is supported by molecular signatures specific to sequences of each lineage, and by genetic distances between sequences. Analysis based on the NP genes give the same results. However, the topology of human strains recovered between 2001 and 2003 is different in both trees. Results show the existence of two phylogenetic lineages and suggest a recombination event between strains of these lineages.The estimation of the age of the most recent common ancestor tracks back the separation of the lineages before the first appearance of Ebolavirus, up to 1975 (1971 estimated on the NP gene). With this method, the recombination event is dated to 1998-1999

Problématique : Les fièvres hémorragiques virales (FHV) sont caractérisées de maladies à mortalité rapide parce que causant la mort dans 50% à 90% des cas cliniquement diagnostiqués (Hewlett et Hewlett, 2005). Le virus Ébola a sévi en 2014 en Afrique faisant plus de 28.607 cas et 11.289 décès. Le virus de Lassa infecte chaque année 100 000 à 300 000 personnes en Afrique de l’Ouest et en tue plus de 5000. La République du Bénin a connu entre 2014 et 2018 quatre épidémies confirmées de FHV Lassa et s’est inscrit sur la liste des pays endémiques à la maladie Lassa. Au total 43 décès, dont 5 agents de santé (un médecin et 4 prestataires de soins) sur 93 personnes infectées ont été enregistrés. Chaque flambée épidémique déclenche une crise de panique dans la population et au sein des agents de santé. But : Cette étude qualitative vise à explorer la pratique infirmière en contexte d’épidémie de FHV Lassa au Bénin afin de mieux comprendre les raisons qui expliquent les fortes létalités enregistrées dans la population et dans le rang des agents de santé. Cadre de référence : Le cadre de référence de l’étude intègre trois éléments : la théorie des soins centrés sur la personne de McCormack et McCance (2015), le cadre de soins fondamentaux de Kitson, Robertson‐Malt et Conroy (2013) et les guides des mesures de prévention et de contrôle des FHV de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS, 2014b) et du Centre de Prevention et de Contrôle et des infections (CDC, 2014). Méthode : Dans le cadre de cette recherche, un devis qualitatif de type d’étude de cas multiple est utilisé avec une approche exploratoire, descriptive et explicative. Trois techniques sont utilisées pour la collecte des données, il s’agit de l’entrevue (type narratif), de l’exploration documentaire et de l’observation. Au total cinq groupes de participants sont recrutés : les survivants patients (n= 4), les survivants patients soignants (n= 2), les prestataires de soins infirmiers et obstétricaux (n= 6), les témoins n’ayant pas administré de soins (n=13), les agents formés pour la prévention et la prise en charge des cas de FHV (n= 6) et les autorités et partenaires impliqués dans la gestion des épidémies (n=7). Résultats : Les cinq thèmes issus du cadre de référence ayant servi de thématiques pour la collecte des données ont servi de base pour l’analyse grâce à la méthode d’analyse de Ritchie, Lewis, Nicholls et Ormston (2013). Ces thématiques sont les suivantes : prérequis, environnement de soin, prestation de soin, la satisfaction au soin et les mesures de prévention et de contrôle des FHV. Les résultats ont mis en relief les facteurs qui expliquent les forts taux de létalité enregistrés durant les épidémies, les contraintes auxquelles les infirmières béninoises sont confrontées pendant l’offre des soins en contexte d’épidémie de FHV Lassa et le rôle autonome qu’elles jouent dans cet environnement de soin à haut risque. Discussion : Cette étude a permis d’explorer les soins infirmiers en contexte d’épidémie mortelle et les conditions d’exercice des infirmières dans les formations sanitaires étudiées. Les résultats empiriques ont fourni des informations pertinentes pouvant servir de guides pour la préparation et l’amélioration de la prise en charge infirmière des cas de FHV Lassa. À cet effet, un modèle de prise en charge centré sur le patient atteint de fièvre Lassa a été proposé pour servir d’outil de travail aux infirmières béninoises et d’Afrique.
Problématique : Les fièvres hémorragiques virales (FHV) sont caractérisées de maladies à mortalité rapide parce que causant la mort dans 50% à 90% des cas cliniquement diagnostiqués (Hewlett et Hewlett, 2005). Le virus Ébola a sévi en 2014 en Afrique faisant plus de 28.607 cas et 11.289 décès. Le virus de Lassa infecte chaque année 100 000 à 300 000 personnes en Afrique de l’Ouest et en tue plus de 5000. La République du Bénin a connu entre 2014 et 2018 quatre épidémies confirmées de FHV Lassa et s’est inscrit sur la liste des pays endémiques à la maladie Lassa. Au total 43 décès, dont 5 agents de santé (un médecin et 4 prestataires de soins) sur 93 personnes infectées ont été enregistrés. Chaque flambée épidémique déclenche une crise de panique dans la population et au sein des agents de santé. But : Cette étude qualitative vise à explorer la pratique infirmière en contexte d’épidémie de FHV Lassa au Bénin afin de mieux comprendre les raisons qui expliquent les fortes létalités enregistrées dans la population et dans le rang des agents de santé. Cadre de référence : Le cadre de référence de l’étude intègre trois éléments : la théorie des soins centrés sur la personne de McCormack et McCance (2015), le cadre de soins fondamentaux de Kitson, Robertson‐Malt et Conroy (2013) et les guides des mesures de prévention et de contrôle des FHV de l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS, 2014b) et du Centre de Prevention et de Contrôle et des infections (CDC, 2014). Méthode : Dans le cadre de cette recherche, un devis qualitatif de type d’étude de cas multiple est utilisé avec une approche exploratoire, descriptive et explicative. Trois techniques sont utilisées pour la collecte des données, il s’agit de l’entrevue (type narratif), de l’exploration documentaire et de l’observation. Au total cinq groupes de participants sont recrutés : les survivants patients (n= 4), les survivants patients soignants (n= 2), les prestataires de soins infirmiers et obstétricaux (n= 6), les témoins n’ayant pas administré de soins (n=13), les agents formés pour la prévention et la prise en charge des cas de FHV (n= 6) et les autorités et partenaires impliqués dans la gestion des épidémies (n=7). Résultats : Les cinq thèmes issus du cadre de référence ayant servi de thématiques pour la collecte des données ont servi de base pour l’analyse grâce à la méthode d’analyse de Ritchie, Lewis, Nicholls et Ormston (2013). Ces thématiques sont les suivantes : prérequis, environnement de soin, prestation de soin, la satisfaction au soin et les mesures de prévention et de contrôle des FHV. Les résultats ont mis en relief les facteurs qui expliquent les forts taux de létalité enregistrés durant les épidémies, les contraintes auxquelles les infirmières béninoises sont confrontées pendant l’offre des soins en contexte d’épidémie de FHV Lassa et le rôle autonome qu’elles jouent dans cet environnement de soin à haut risque. Discussion : Cette étude a permis d’explorer les soins infirmiers en contexte d’épidémie mortelle et les conditions d’exercice des infirmières dans les formations sanitaires étudiées. Les résultats empiriques ont fourni des informations pertinentes pouvant servir de guides pour la préparation et l’amélioration de la prise en charge infirmière des cas de FHV Lassa. À cet effet, un modèle de prise en charge centré sur le patient atteint de fièvre Lassa a été proposé pour servir d’outil de travail aux infirmières béninoises et d’Afrique.
Problematic: VHF are characterized as quick lethal fatal diseases because they cause death in 50% to 90% of clinically diagnosed cases (Hewlett & Hewlett, 2005). The Ebola virus struck Africa in 2014, causing more than 28,607 cases and 11,289 deaths. The Lassa virus infects 100,000 to 300,000 people in West Africa every year and kills more than 5,000 one. Between 2014 and 2018, the Republic of Benin experienced four confirmed outbreak cases of Lassa VHF and was recorded on the list of endemic countries to Lassa disease. A total of 43 deaths, including 5 health workers (one doctor and 4 health care providers) out of 93 infected persons were recorded. Each outbreak case triggers a panic attack in the population and among health workers. Purpose: This qualitative study aims to explore nursing practice in the context of the Lassa VHF epidemic in Benin in order to understand more the reasons explaining the high mortality rate among the population and among health workers. Framework: The study framework incorporates three elements: McCormack and McCance's theory of person-centred care (2015), Kitson, Robertson-Malt and Conroy's basic care framework (2013) and World Health Organization's (OMS, 2014b) and Centers for Disease Control and Prevention's guides (CDC, 2014) to VHF prevention and control measures. Method: In this research, a qualitative estimate type of multiple case study is used with an exploratory, descriptive and explanatory approach. Three techniques are used for data collection: interviewing (narrative type), document exploration and observation. A total of five groups of participants were recruited: patient survivors (n=4), caregiver survivors (n=2), nursing and obstetrical care providers (n=6), non-caregiver controls (n=13), trained agents for the prevention and management of VHF cases (n=6) and authorities and partners involved in epidemic management (n=7). Results: The five topics from the reference terms that served as themes for data collection served as the basis for the analysis using Ritchie, Lewis, Nicholls and Ormston's (2013) analysis method. These themes are: prerequisites, care environment, care provision, case satisfaction and measures to prevent and control VHF. The results highlighted the factors that explain the high case-fatality rates during epidemics, the constraints faced by Beninese nurses during the provision of care in the context of a Lassa HSF epidemic and the autonomous role they play in this high-risk care environment. Discussion: This study enabled to explore nursing care in the context of a fatal epidemic and the conditions of practice of nurses in the health facilities studied. The empirical results provided relevant informations that can be used as guideline for the preparation and improvement of nursing management of Lassa VHF cases. To this end, a model of management focused on the Lassa fever patient has been proposed as a working tool for nurses in Benin and Africa.
Problematic: VHF are characterized as quick lethal fatal diseases because they cause death in 50% to 90% of clinically diagnosed cases (Hewlett & Hewlett, 2005). The Ebola virus struck Africa in 2014, causing more than 28,607 cases and 11,289 deaths. The Lassa virus infects 100,000 to 300,000 people in West Africa every year and kills more than 5,000 one. Between 2014 and 2018, the Republic of Benin experienced four confirmed outbreak cases of Lassa VHF and was recorded on the list of endemic countries to Lassa disease. A total of 43 deaths, including 5 health workers (one doctor and 4 health care providers) out of 93 infected persons were recorded. Each outbreak case triggers a panic attack in the population and among health workers. Purpose: This qualitative study aims to explore nursing practice in the context of the Lassa VHF epidemic in Benin in order to understand more the reasons explaining the high mortality rate among the population and among health workers. Framework: The study framework incorporates three elements: McCormack and McCance's theory of person-centred care (2015), Kitson, Robertson-Malt and Conroy's basic care framework (2013) and World Health Organization's (OMS, 2014b) and Centers for Disease Control and Prevention's guides (CDC, 2014) to VHF prevention and control measures. Method: In this research, a qualitative estimate type of multiple case study is used with an exploratory, descriptive and explanatory approach. Three techniques are used for data collection: interviewing (narrative type), document exploration and observation. A total of five groups of participants were recruited: patient survivors (n=4), caregiver survivors (n=2), nursing and obstetrical care providers (n=6), non-caregiver controls (n=13), trained agents for the prevention and management of VHF cases (n=6) and authorities and partners involved in epidemic management (n=7). Results: The five topics from the reference terms that served as themes for data collection served as the basis for the analysis using Ritchie, Lewis, Nicholls and Ormston's (2013) analysis method. These themes are: prerequisites, care environment, care provision, case satisfaction and measures to prevent and control VHF. The results highlighted the factors that explain the high case-fatality rates during epidemics, the constraints faced by Beninese nurses during the provision of care in the context of a Lassa HSF epidemic and the autonomous role they play in this high-risk care environment. Discussion: This study enabled to explore nursing care in the context of a fatal epidemic and the conditions of practice of nurses in the health facilities studied. The empirical results provided relevant informations that can be used as guideline for the preparation and improvement of nursing management of Lassa VHF cases. To this end, a model of management focused on the Lassa fever patient has been proposed as a working tool for nurses in Benin and Africa.

Les virus enveloppés entrent dans les cellules par fusion membranaire, mécanisme qui permet la libération de leur génome dans le cytosol de leur hôte. Le virus de la fièvre jaune est le virus de référence des Flavivirus, famille de virus enveloppés à ARN simple brin de polarité positive. Malgré un vaccin efficace fondé sur une souche atténuée (17D), ce virus cause encore à l'heure actuelle 200 000 contaminations et 30 000 morts chaque année dans les régions subtropicales d'Afrique et d'Amérique du Sud. La protéine d'enveloppe E est impliquée dans deux phénomènes précoces du cycle viral, la liaison au récepteur et la fusion membranaire. C'est pourquoi cette protéine est une cible majeure pour le développement de nouveaux antiviraux et que nous avons cherché à déterminer sa structure cristallographique. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires de l'atténuation du vaccin, nous avons travaillé avec la souche vaccinale 17D-204 et la souche sauvage parentale Asibi. En effet, ces deux souches ne diffèrent que par 12 mutations dans la protéine d'enveloppe, et nous désirions comparer les structures de ces deux protéines. Alors que nous attendions à ne produire que la protéine d'enveloppe, nous avons pu purifier et cristalliser le complexe immature constitué de pr (ectodomaine soluble résultant du clivage de prM en pr +M par la furine) et de l'ectodomaine de E, des souches 17D-204 et Asibi. Après dissociation du complexe, nous avons donc pu caractériser les constantes d'affinités, les déterminants thermodynamiques et fonctionnels de ce complexe. Dans leur ensemble, ces données ouvriront de I nouvelles perspectives dans le développement d'inhibiteur de la fusion membranaire des Flavivirus
Enveloped viruses enter cells by membrane fusion, a mechanism that allows the release in the cytoplasm of the infected cell of their genome. Yellow fever virus is the reference virus for Flavivirus, family of enveloped positive single strand RNA viruses. In spite of an efficient vaccine based on an attenuated strain (17D), this virus still causes 200,000 infections per year with 30,000 deaths, mainly in African and South American subtropical areas. Envelope protein E plays a role in two early phenomena of virus cycle, acting during virus entry for receptor recognition and binding, and during membrane fusion. This is the reason why this protein is the main target for the development of new antivirals. We were so interested in determining the crystal structure of this major pathogen antigen. Wild-type Asibi strain and vaccinal 17D-204 strain only differ one of the other by 32 mutations in the whole polyprotein, 12 of them within E protein. To better I understand molecular mechanisms of the vaccine attenuation, we crystallized both proteins from the wild-type and vaccinal strains. With our expression System, we were expecting to produce only the envelope E protein, as it was experienced for other Flaviviruses. But surprisingly, we co-purified and co-crystallized the immature complex of the virus, consisting in pr result of the cleavage of prM as pr + M by the furin) and E, for both Asibi and 17D-204 strains. After dissociation of the complex, we successfully determined affinity I constants, thermodynamical and functionnal characteristics of the complex. Overall, these results can lead to the development of new fusion inhibitors against Flavivirus

De nombreuses arboviroses ont émergé ou ré-émergé dans les dernières décennies. L’approfondissement des connaissances des mécanismes de transmission de ces virus par leurs vecteurs est nécessaire pour le développement de nouveaux outils de prévention et de défense. Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié la réplication et la dissémination de deux souches du virus de la fièvre jaune (YFV) chez le moustique Aedes aegypti. Nous avons montré que la réplication de la souche vaccinale YFV-17D n’était pas efficace dans l’intestin moyen, par rapport à celle de l’isolat clinique YFV-Dakar. Les virus qui ont réussi à surmonter la barrière d’infection de l’intestin moyen ne se propagent pas aux organes secondaires. Les virus injectés dans le thorax des moustiques se répliquent dans les organes secondaires et les tissus associés à l’intestin moyen, ce qui suggère que, pendant l’infection naturelle, le blocage de la réplication du virus YFV-17D se produit au niveau de la membrane basale des cellules épithéliales de l’intestin moyen. L’analyse par séquençage de nouvelle génération a révélé que le génome de la souche YFV-Dakar présentait une diversité plus grande que celle de la souche vaccinale; un trait qui pourrait contribuer à sa capacité à infecter et à se disséminer efficacement dans le vecteur. Dans une deuxième partie, nous avons analysé les réponses de l’intestin moyen aux infections par YFV-17D et YFV-Dakar par des techniques de transcriptomique et de protéomique, dans le but d’identifier des éléments cellulaires impliqués dans la réponse différentielle aux deux virus. Seize candidats ont été choisis pour une analyse approfondie dans des cellules d’Ae. aegypti. Malheureusement, aucun de ces candidats ne semblent affecter la réplication virale. Nous pensons que le très faible taux d’infection des cellules de l’intestin moyen ne nous a pas permis d’identifier de candidats potentiels
Recent decades have seen emergence or re-emergence of many arboviral diseases. Increasing the knowledge underlying the mechanisms of transmission of these viruses by their vectors is necessary for the development of new tools for prevention and defense. In the first part of this work, we explored the replication and the dissemination of two strains of yellow fever virus (YFV) in Aedes aegypti. We showed that the replication of the vaccine strain YFV-17D was not efficient in Aedes aegypti midgut, as compared to the one of the clinical isolate YFV-Dakar. Viruses that managed to overcome the midgut infection barrier failed to disseminate to secondary organs. Viruses injected into the mosquitoes’s thorax succeeded in replicating into secondary organs and midgut associated tissues, suggesting that, during natural infection, the block for YFV-17D replication occursat the basal membrane of midgut epithelial cells. Next Generation Sequencing analysis revealed that YFV-Dakargenome exhibited a greater diversity than the one of the vaccine strain ; a trait that may contribute to its ability to infect and disseminate efficiently in Ae. aegypti. In the second part, we analyzed the midgut responses to YFV17D and YFV-Dakar infection using both RNA-Seq and proteomics approaches. The aim was to identify cellular components involved in the differential response to both viruses. Sixteen candidates were chosen for an in-depthanalysis in Ae. aegypti cells. Unfortunately, none of these candidates seemed to affect viral replication. We believe that the low infection rate of the midgut cells did not allow us to identify potential candidates

Le virus Ebola, responsable d'une fièvre hémorragique virale létale et le virus de la variole, agent étiologique de la variole, sont des armes biologiques potentielles. Il n'existe pas de traitement ou de prophylaxie autorisés contre le virus Ebola, quelques candidats vaccins étant en cours de développement. Concernant la variole, des vaccins dits de première génération (virus de la vaccine) ont permis l'éradication de la maladie cependant ils sont à l'origine de complications post-vaccinales parfois sévères alors que des vaccins plus récents dits de troisième génération, non-réplicatifs, ont été développés pour leur innocuité mais restent faiblement immunogènes. Nous avons récemment développé plusieurs vecteurs viraux de type virus de la vaccine (VACV) par délétion d'un certain nombre de facteurs de virulence. Nous avons évalué leur innocuité, leur immunogénicité et leur efficacité en tant que candidats vaccins antivarioliques chez la souris puis utilisé l'un de ces vecteurs pour développer un candidat vaccin bivalent antivariolique et anti-virus Ebola. Ces virus de la vaccine délétés sont réplicatifs mais fortement atténués. Ils induisent une réponse en anticorps neutralisants spécifiques anti-vaccine similaire à celle induite par le vaccin antivariolique de première génération et induisent des réponses immunitaires cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques suffisantes pour protéger l'animal d'un challenge létal de cowpoxvirus en intranasal, simulant une infection par le virus de la variole. Le virus délété le plus immunogène et le plus sûr, nommé MVL, a été utilisé pour construire un vecteur viral codant pour la glycoprotéine du virus Ebola (EGP). Le gène entier d'EGP ou une forme chimérique d'EGP (fusion entre l'ectodomaine d'EGP et le domaine transmembranaire de la glycoprotéine B5 du VACV) ont été clonés dans le génome du vecteur viral. Ces deux vecteurs produisent des virus ayant incorporé EGP dans leur enveloppe. Ces deux candidats vaccins recombinants induisent de fortes réponses humorales spécifiques anti-EGP et anti-vaccine chez la souris immunocompétente. En conclusion, nous avons développé plusieurs candidats vaccins antivarioliques aussi immunogènes et efficaces que le vaccin historique et avec une atténuation similaire aux vaccins de troisième génération. L'un de ces candidats (MVL) a été utilisé comme vecteur viral pour exprimer la glycoprotéine hétérologue EGP, contre laquelle il induit une réponse immunitaire humorale forte

Le virus de la fièvre catarrhale ovine (Bluetongue virus, BTV) est l’agent étiologique de la maladie du même nom, une arbovirose non contagieuse transmise aux ruminants domestiques et sauvages par l’intermédiaire de morsures de moucherons hématophages du genre Culicoides. Il existe actuellement 27 sérotypes décrits de BTV à travers le monde qui se distinguent par les pathologies qu’ils induisent et leur capacité à infecter et se propager chez leur(s) hôte(s) mammifère(s). Le premier objectif de mon projet de thèse visait à identifier les interactions cellulaires spécifiques des sérotypes 8 et 27 pour identifier des facteurs de pathogénicité/virulence et/ou de franchissement de barrière d’espèces. Pour atteindre cet objectif, l’ensemble des protéines virales du BTV a été criblé par la méthode du double-hybride en levure contre deux banques d’ADN complémentaires, l’une d’origine bovine et l’autre d’origine culicoïde. A l’issue de 70 cribles, une centaine de nouvelles interactions virus-hôtes a été mise en évidence et révèle un enrichissement pour quatre processus cellulaires : l’épissage des ARNm, les ribosomes, la SUMOylation et l’apoptose. Cette étude nous a ainsi permis de réaliser le premier interactome pour le BTV qui se poursuit au travers de multiples validations biochimiques et fonctionnelles des interactions identifiées. En parallèle de ce travail de protéomique, le second objectif de mon projet de thèse a été de déterminer l’impact du BTV sur la voie MAPK/ERK, une voie cellulaire essentielle à la prolifération et différenciation cellulaire et classiquement modulée lors d’infections virales. En plus de son rôle antagoniste sur la voie des interférons de type I, nous avons démontré la capacité de la protéine NS3 de BTV à activer la voie MAPK/ERK. En effet, nous avons démontré que NS3 a la capacité d’augmenter le niveau de phosphorylation des protéines kinases ERK1/2 mais également du facteur de traduction eIF4E. Cette fonction, qui semble être spécifique au BTV par rapport aux autres orbivirus, implique l’interaction de NS3 avec la protéine cellulaire BRAF, une protéine MAP3 kinase jouant un rôle majeur dans l’activation de la voie MAPK/ERK. L’activation cette voie par NS3 pourrait être un mécanisme de détournement de la traduction cellulaire au profit de celle du virus mais aussi constituer un élément de réponse pour expliquer l’hyper-inflammation observée dans le cas d’une infection par ce virus
Bluetongue virus (BTV) is the etiological agent of the bluetongue (BT) disease, a non-contagious arbovirus that affects a wide range of wild and domestic ruminants. It is transmitted by blood-feeding midges of the genus Culicoides. There are currently 27 serotypes described of BTV in the world that are distinguished by their differences in term of pathology/virulence and their capacity to infect and disseminate in their mammalian host(s). The first objective of my thesis project was to identify specific cellular interactions of serotype 8 and 27 to reveal new factors of pathogenicity/virulence and/or cross species barrier. To reach this goal, all the proteins encoded by BTV were used as baits to screen, by a high-throughput yeast two-hybrid (Y2H) approach, two complementary DNA libraries originating from hosts naturally infected by BTV : Culicoides and cattle. Therefore, 70 screens were performed to identify a hundred of new virus-host interactions and reveal an enrichment for four cellular processes : mRNA splicing, ribosomes, SUMOylation and apoptosis. This study allowed us to build the first interactome of BTV which continues through multiple biochemical and functional validations of the identified interactions. In parallel to this proteomics work, my second objective was to determine the impact of BTV on the MAPK/ERK pathway, a cellular pathway essential for cell proliferation and differentiation usually modulated during viral infections. In addition to its antagonist role on the type I interferon pathway, we have demonstrated the ability of BTV-NS3 to activate the MAPK/ERK pathway. Indeed, we have demonstrated that NS3 has the ability to increase the level of phosphorylation of ERK1/2 protein and the eIF4E translation factor. This function, which seems to be specific to BTV compared to other orbiviruses, involves the interaction of NS3 with BRAF cellular protein, a MAP3 kinase protein that plays a major role in the regulation of the MAPK/ERK pathway. These results could provide a better understanding of the molecular basis underlying the hijacking of the translation machinery to support virus replication but also constitute a hypothesis to explain the hyperinflammation observed in the BTV infection context

La fièvre catarrhale ovine est une maladie hémorragique sévère chez les ruminants, transmise par des moucherons, les Culicoides. L'agent étiologique de cette maladie est le virus de la langue bleue, pour Bluetongue virus (BTV) en anglais. C'est un virus à ARN double brin (ARNdb), appartenant au genre Orbivirus au sein de la famille des Reoviridae. Depuis longtemps, il a été montré que le BTV induit la production d'interféron. Cependant les récepteurs cellulaires et la voie de signalisation impliqués dans cette production restent inconnus. Le but de ce projet est de les identifier et d'évaluer la capacité du BTV à moduler la synthèse de l'IFN de type I (IFN-i), comme le font de nombreux virus. Comme attendu, en réponse à une infection par le BTV, des cellules épithéliales ou endothéliales humaines et bovines ont montré une forte production d'IFNβ. Cette production s'est révélée dépendante de la réplication virale et induite par les ARN hélicases, RIG-I et MDA5. Ces ARN hélicases peuvent activer la synthèse d'IFN-I en présence d'ARNdb du BTV dans un modèle de cellules humaines. Cette réponse antivirale entraîne le contrôle de la réplication du BTV. De plus, nous avons montré que le BTV de sérotype 8 (BTV-8) peut bloquer la voie IFN-I et que la protéine non-structurale NS3 est impliquée dans ce mécanisme. NS3 inhibe spécifiquement la production des transcrits activée par la voie de synthèse de l'IFN-I. L'action de NS3 pourrait intervenir entre MAVS et le complexe TBK1/IKKε dans la voie des RIG-like re��cepteurs mais son mécanisme d'action reste à déterminer
Bluetongue disease is a severe hemorragic disease in ruminant, transmitted by midges from the genus Culicoides. Bluetongue virus (BTV) is the etiologic agent of the disease. This double stranded RNA (dsRNA) virus is an Orbivirus, belonging to the Reoviridae family. It has been reported for a long time that BTV infection induces interferon production. However the cellular sensors and signaling pathways involved in this process remain unknown. The aim of this project is to identify them and to evaluate the capacity of BTV to modulate type I IFN (IFN-I) synthesis, as other viruses do. As expected, in response to BTV infection, human and bovine cells showed a strong production of IFN[3. This production is dependent on viral replication and mediated through the RNA helicases, RIG-I or MDA5. These RNA helicases can activate IFNO production by sensing the dsRNA of BTV in a human cellular model. This antiviral response leads to the control of BTV replication. Furthermore, we found that BTV serotype 8 (BTV-8) can dampen the IFN-I pathway and that the non structural protein 3 (NS3) is involved in this process. NS3 specifically inhibits the transcripts production activated by the IFN-I production pathway. NS3 seems to target a protein involved in the RIG¬like receptor (RLR) pathway between MAVS and TBKVIKKe complex, but its mechanism of action remains to determine

Les poxvirus sont considérés comme des vecteurs vaccinaux de choix. Parmi eux le virus myxomateux (MYXV) prototype du genre leporipoxvirus a été positivement évalué chez différentes espèces animales, excepté les ruminants. Dans ce travail, nous avons évalué la souche atténuée SG33 du MYXV en tant que vecteur vaccinal non réplicatif chez les moutons. Dans un premier temps, nous avons étudié les interactions entre le SG33 et les cellules dendritiques (DC). Nous avons montré in vitro que le SG33 est capable d'infecter les DC, et préférentiellement la sous-population de DC de type Langerhans. Bien que le cycle de réplication du SG33 soit abortif, l'expression du transgène dans ces cellules a été démontrée. Après maturation, les DC ovines restent sensibles au SG33 mais entrent en apoptose dans les huit heures qui suivent l'infection. In fine, l'analyse du profil d'expression génique des DC infectées, montre que la majorité des gènes surexprimés est impliquée dans la réponse inflammatoire, la réponse immune et les voies de signalisation des interférons de type I. Par la suite, l'efficacité du SG33 comme vecteur vaccinal chez le mouton a été démontrée en utilisant comme modèle d'épreuve une souche hypervirulente du virus de la bluetongue (BTV). Des moutons ont été immunisés avec du SG33 exprimant la protéine VP2 associée ou non à la protéine VP5 du BTV. Seule l'immunisation avec le SG33 exprimant VP2 a permis d'induire une protection clinique et virologique contre une inoculation d'épreuve avec le BTV homologue. La protection est corrélée à la présence d'anticorps neutralisants chez les moutons avant inoculation d'épreuve. Les niveaux de VP2 produite par les 2 virus recombinants seraient à l'origine de la différence de protection observée. Finalement, la protéine VP7 étant responsable d'une protection croisée partielle entre sérotypes du BTV, nous avons montré que l'inoculation intradermique de SG33 exprimant VP7 à des moutons, induisait l'apparition d'une réponse humorale et cellulaire CD4+ spécifique de VP7. Toutefois, cette réponse immunitaire ne s'est pas révélée protectrice lors d'une inoculation d'épreuve hétérologue. Ces résultats indiquent que le MYXV est capable d'induire une réponse immune adaptative efficace, conduisant à une protection significative contre une inoculation d'épreuve sévère, faisant de ce virus, un vecteur prometteur pour la vaccination des ruminants
Poxviruses are deemed as vaccine vectors of choice. Among them, the myxoma virus (MYXV), the prototype of the Leporipoxvirus genus has proved its efficacy in different animal species but not in ruminants. In this work, we evaluated SG33, an attenuated strain of MYXV as a non-replicative vaccine vector in sheep. In a first study, we examined interactions between SG33 and ovine dendritic cells. We showed in vitro that SG33 infect ovine dendritic cells (DC) mainly the subpopulation of Langerhans-type. Expression of the recombinant antigen was demonstrated although the cycle of SG33 replication was abortive. After maturation, the ovine DC remained susceptible to MYXV, although apoptosis occured within eight hours after infection. Finally, analysis of the gene expression profile of infected DC highlighted that most overexpressed genes are involved in the inflammatory and immune responses, and the signaling pathways of type I interferon. Subsequently, the final demonstration of the SG33 efficacy as a vaccine vector in sheep was carried out using as challenge experiment. We used a highly virulent bluetongue virus challenge model to test protection of sheep previously immunised with SG33 expressing the major VP2 protein antigen of BTV, associated or not with the VP5 protein. We showed that only two immunisations with SG33 expressing VP2 alone elicited a significant clinical and virological protection in sheep against the homologous BTV challenge. Protection was mainly correlated with the presence of neutralising antibodies in sheep before challenge. Differences of VP2 expression between the two SG33 recombinant viruses may explain the differences of protection observed in this study. Finally, since VP7 protein of BTV was suggested to induce cross protective immunity between BTV serotypes, we showed that intradermal inoculation of sheep with SG33 expressing the VP7 protein, can generate an humoral and a CD4+ cellular immune response specific to VP7. However, this immune response did not provide protection against an heterologous BTV challenge. Taken together, these results indicate that MYXV is able to induce an effective adaptive immune response in sheep, leading to significant protection against a severe challenge, making this virus a promising vector for vaccination of ruminants

L'étude du cycle du virus de l'hépatite C ( VHC) et la découverte de nouveaux traitements antiviraux ont été entravés par l'absence de systèmes cellulaires permettant la multiplication efficace du virus. Ce constat a motivé la première partie de nos travaux. Nous avons évalué l'adsorption et la multiplication du VHC dans cinq lignées cellulaires. Les cellules Vero (rein de singe) et AP61 (moustique) ont permis la détection de l'ARN viral pendant 28 jours et la réalisation de 4 passages viraux successifs. Le système cellulaire Vero , associé à une technique originale de quantification des ARN viraux par RT-PCR en temps réel a permis l'étude de l'adsorption de CHC. Ce travail a révélé le rôle des glycosaminoglycanes cellulaires dans l'adsorption du VHC mais aussi de deux autres Flaviviridae, les virus de la dengue et de la fièvre jaune utilisés, en parallèle, comme modèle et étudiés à l'aide d'une techique de titrage viral en culture de cellules. Le rôle important du récepteur des lipoproéines de faible densité (LDL) dans l'adsorption du VHC a été confirmé (inhibition de la fixation virale par les LDL et des anticorps anti-recepteurs des LDL). Les techniques développées dans cette étude pourraient être utilisées pour le criblage de molécules inhibant l'adsorption cellulaire des Flaviviridae
The study of Hepatitis C virus ( HCV) cycle and the discovery of new therapy have been hampered by the lack efficient virus culture systems. We assessed adsorption and replication of HCV on five cell lines. Monkey Vero cells and mosquito AP61 cells were selected for their ability to blind and replicate HCV and to support 4 virus passages. HCV adsorption was studies using Vero cells and quantification of virus RNA by a real time RT-PCR method. This work showed that cellular glycosaminoglycans were involved in HCV adsorption. These molecules were shown to have an important role in the binding of tow other Flaviviridea , Dengue virus and Yellow fever virus which were studies in parralel, as models, by virus titration in cell culture. The important role of low density lipoprotein (LDL) receptor in HCV adsporption was confirmed ( the viral binding was inhibited by LDL and anti-LDL receptor antibody). The methods descripted in this study might be screening of molecules inhibiting Flaviviridae cell-adsorption

Le virus de la fièvre de la vallée du Rift (VFVR) est un arbovirus infectant aussi bien l’Homme que les animaux. Pour identifier le tropisme tissulaire du VFVR et ses cellules cibles, nous avons infecté des souris Ifnar1-/- avec des virus recombinants. Nous avons visualisé l’infection d’organes cibles connus mais aussi d’autres organes comme le pancréas. Les analyses histologiques ont révélé que les macrophages infiltrant les tissus, comme ceux présents autour du pancréas, sont infectés. Nous avons alors étudié les cellules hématopoïétiques et confirmé l’infection des macrophages, cellules dendritiques et granulocytes. Pour déterminer l’importance de l’infection de ces cellules, nous avons induit la déplétion des cellules phagocytaires chez des souris Ifnar1-/- avant de les infecter. Cela a affecté la diffusion et/ou le confinement de l’infection virale. Nos résultats confirment l’importance des monocytes/macrophages et des cellules dendritiques au cours de l’infection par le VFVR

Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (RVFV) est un arbovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae et au genre Phlebovirus. Il est transmis par les moustiques et infecte l'homme et les ruminants. De graves épidémies/épizooties ont eu lieu en Afrique et le virus circule maintenant en Arabie Saoudite ainsi qu'au Yémen. Le génome viral est composé de trois segments d'ARN simple brin: les segments L. M sont de polarité négative et le segment S utilise une stratégie ambisens. Bien que le cycle viral ait heu dans le cytoplasme, la protéine NSs (256 acides aminés, 31 kDa), codée par le segment S, a une localisation nucléaire où elle forme des filaments. NSs est un facteur de pathogenèse du virus qui inhibe la synthèse des ARNm du gène codant pour l'IFN bêta sans perturber pour autant l'enhanceosome (NF-KB, IRF3 et ATF2/cjun). Pour comprendre les mécanismes par lesquels NSs inhibe la réponse anti-virale, nous avons recherché ses partenaires cellulaires. Nous avons montré que l'infection par le VFVR a pour conséquences : i) une rapide diminution de la synthèse des ARN cellulaires parallèle à la décroissance de la concentration du facteur de transcription TFIIH, ii) l'inhibition du recrutement de CBP et de l'acétylation des histones au niveau du promoteur IFNp et iii) la protéolyse de STAT1. Par les techniques du double hybride, d'immunoprécipitations de protéines ou de la chromatine et en microscopie confocale, nous avons démontré que chacun des événements est lié aux interactions de la protéine NSs avec respectivement - la sous unité p44 du TFIIH, la sous unité SAP30 de certains co-répresseurs dont Sin3 et N-coR et la protéine Socs 1 présente dans une E3 ligase : ces différents partenaires de NSs sont présents dans les filaments nucléaires. NSs en interagissant avec p44 empêche la néo-formation du TFIIH. NSs, via SAP30 et son association avec le facteur de transcription YY1, stabilise des co-répresseurs responsables de la déacétylation des histones et empêche l'interaction entre CBP et YY1 au niveau du promoteur IFNp. Enfin NSs provoque l'accumulation de Socs 1 qui recrute un complexe E3 ligase CBCSo' responsable de la dégradation de STAT1 inhibant l'induction par l'IFNy. Ainsi la protéine multifonctionnelle NSs inhibe par trois mécanismes indépendants la réponse anti-virale de l'hôte
The Rift Valley fever virus is a phlebovirus of the Bunyaviridae family transmitted by mosquitoes and affecting cattle, sheep, goats and humans. It causes many dramatic epidémies and epizootics in Africa and recently it was introduced in Yemen and in Saudi Arabia with a high mortality rate. The viral genome is composed of three segments of RNA: the L and M segments are of negative polarity and encode respectively for the RNA polymerase RNA dependent and the precursor of envelope glycoproteins. The S segment utilises an ambisense strategy and codes for the nucleoprotein N and the non structural protein NSs. Although the viral cycle is cytoplasmic, the NSs protein (256 amino acids, 31 kDa) is nuclear and forms filament. Moreover, it was shown that NSs is the major pathogenicity factor, inhibiting IFN beta messenger RNA synthesis but do not disturb the formation of the enhanceosome (NF-KB, IRF3 and ATF2/cjun). We found that infection by RVFV leads to i) a rapid and drastic suppression of host cellular RNA synthesis that parallels a decrease of the TFIIH transcription factor concentration, ii) an inhibition of CBP recruitment and histones acetylation on IFNp promoter and iii) STAT1 proteolysis. Using yeast two hybrid System, immunoprecipitations, Chips and confocal microscopy, we further demonstrated that each event is linked to the association of the nonstructural viral NSs protein with respectively the TFIIH subunit p44, co-repressors subunit SAP30 and Socs 1 in the nuclear filaments. NSs prevents the assembly of newly synthesized TFIIH subunits. NSs, through the interaction between SAP30 and YY1 transcription factor, stabilizes co-repressors like N-coR or Sin3 responsible of histones deacetylation on IFNp promoter and preventing the association between CBP and YY1. Finally NSs provokes Socs 1 accumulation and, through a Socs 1 containing-E3 ligase complex, it degrades STAT1 and inhibes induction by IFNy. These observations shed light on the mechanisms utilized by RVFV to evade the host response

Le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (VFHCC) est un virus transmis par des tiques, appartenant au genre Nairovirus de la famille des Bunyaviridae. Il est réparti sur plus d’une trentaine de pays de plusieurs continents : Europe, Asie et Afrique ; avec une mortalité moyenne estimée de 30%. Le VFHCC peut causer à l’homme une maladie hémorragique très sévère et parmi divers symptômes, il peut induire une inflammation aigüe et des lésions hépatiques. Les phagocytes mononucléaires, les hépatocytes et les cellules endothéliales ont été décrits comme étant des cellules cibles lors d’études cliniques et post-mortem ainsi que lors d’études en modèle murin. Nous avons analysé, lors d’étude in vitro, la réponse cellulaire de cellules présentatrices de l’antigène (CPAs) et d’hépatocytes humains. Afin de mieux comprendre la pathogenèse du VFHCC, nous avons comparé la réponse de ces cellules avec celle du virus Dugbe (DUGV), un nairovirus génétiquement le plus proche de VFHCC considéré comme faiblement pathogénique. Finalement, afin améliorer la détection de DUGV in vitro et lors d’études épidémiologiques de terrain, nous avons développé un test moléculaire en temps réel pour détecter et quantifier DUGV.Nous avons observé que le VFHCC induisait une réponse inflammatoire chez les CPAs, en revanche, DUGV induisait une réponse plus forte, ce qui suggère que VFHCC induirait une inhibition sélective de certains médiateurs de la réponse pro-inflammatoire. Lors de l’infection in vitro des hépatocytes par le VFHCC, nous avons observé que le virus induisait du stress du RE, l’activation de l’IL-8 un médiateur pro-inflammatoire, et la modulation des deux voies pro-apoptotiques. Quand nous avons comparé cette réponse à celle induite par DUGV nous avons trouvé que la différence majeure était l’absence d’apoptose. Ces différences pourraient, en partie, expliquer le rôle du foie dans la pathogenèse induite par le VFHCC
Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (CCHFV) is a widely distributed tick-borne member of the Nairovirus genus (Bunyaviridae) inducing an average mortality rate of 30% in humans. CCHFV induces a severe hemorrhagic disease in infected patients that includes, among other bleeding symptoms, acute inflammation and liver lesions. The mononuclear phagocytes, the hepatocytes and the endothelial cells were described to be the main target cells in both human clinical studies and animal model in vivo studies.We analysed the in vitro cellular response of host antigen presenting cells (APC) and hepatocytes. Then, to better elucidate the pathogenesis of CCHFV, we compared the response of these cells after infection with Dugbe virus (DUGV), a mild pathogenic virus genetically close to CCHFV. In order to improve DUGV detection in vitro and in field studies, we also developed a molecular real-time quantitative tool to detect and quantify DUGV.We found that CCHFV induced an inflammatory response in both APCs tested; however DUGV induced a higher cytokine/chemokine response in these target cells than CCHFV. Our results suggest that CCHFV was able to selectively inhibit the activation of some inflammatory mediators in the in vitro infection and that CCHFV/DUGV cellular response differences could be relevant in pathogenesis. On the other hand, when we in vitro infected hepatocytes with CCHFV, we observed that it was able to induce ER-stress, activate IL-8 secretion and modulate both mitochondrial and death receptor pathways of apoptosis. When we compared this cellular response with that induced by DUGV, we found that the most striking difference was the absence of apoptosis. These differences could, in part, explain the role of the liver in the pathogenesis induced by CCHFV

Les cellules dendritiques (DCs) sont divisées en DCs plasmacytoides (pDCs) spécialisées dans la production d’IFN et type I (IFN-α/β) et DCs conventionnelles (cDCs) spécialisées dans la présentation antigénique. Les cDCs dans la peau sont les premières cibles du virus Bluetongue (BTV), qui est transmis par piqure d’insecte et induit un syndrome hémorragique chez les ruminants. Le but de la thèse est d’étudier les mécanismes d’activation des DCs par le BTV et le rôle des DCs dans la pathogenèse du virus, par des études in vitro et in vivo. J’ai montré qu’in vitro les pDCs et les cDCs peuvent répliquer le BTV mais seules les pDCs produisent de l’IFN-α/β, indépendamment de la réplication virale. L’induction d’ IFN-α/β dépend de l’acidification endosomale, de la molécule adaptive MyD88 mais pas de l’activation du TLR7/8. De plus la phosphorylation de la PKR et de la MAPK-SPAK/JNK dans les pDCs sont nécessaires à l’induction IFN-α/β en réponse au BTV. In vivo lors de l’infection par le BTV chez le mouton, les DCs s’accumulent dans les organes lymphatiques. Le profil d’expression génique lors d’infection varie selon les types de DCs et leur localisation. Une analyse fonctionnelle de l’expression génique indique que les pDCs du sang, mais pas celles des ganglions lymphatiques, présentent une signature pro-inflammatoire et inductrice d’atteintes vasculaires. Les cDCs des ganglions lymphatiques et de la rate présentent l’activation de gènes indiquant leur maturation avec une fonction anti-inflammatoire. Ces résultats suggèrent que les DCs, par leur rôle dans la physiopathologie d’infections à virus hémorragiques, pourraient être des cibles thérapeutiques contre ces infections
Dendritic cells are divided in 2 major subsets, the plasmacytoid DC (pDC) subset that produces large amount of type I IFN (IFN-α/β) in infections, and the conventional DC (cDC) subset that is the most potent antigen presenting cell type. Skin cDCs are the first targets of Bluetongue virus (BTV), a vector-borne virus that induces hemorrhagic fever in ruminants. The aim of this thesis is to investigate the mechanism of DCs activation by BTV and the role of DCs in the pathogenesis of BTV. I showed in vitro, that pDCs and cDCs can replicate BTV but that only pDCs produce IFN-α/β, partially independently of viral replication. IFN-α/β induction by BTV in pDCs depended on endosomal acidification, on MyD88 recruitment but not on TLR7/8 activation. Moreover PKR and MAPK-SPAK/JNK phosphorylations were mandatory for IFN-α/β induction by BTV in pDCs. In vivo during BTV infection, DCs accumulated in lymphoid organs. The gene expression profiles during infection depended on the DCs type and their localization. A functional gene expression analysis implicated blood pDCs but not lymph node pDCs in the inflammation and hemodynamic disorder. Lymph node and spleen cDCs presented a gene profile with activation of the maturation pathway associated to anti-inflammatory and/or regulatory functions. The implication of DCs in hemorrhagic virus infections suggests that they could be interesting targets for therapeutic interventions to combat these infections

Le Virus du Nil Occidental (VNO) et le Virus de la Fièvre de la Vallée du Rift (VFVR) sont deux arbovirus transmis par le moustique Culex pipiens comprenant deux biotypes: pipiens et molestus. Au cours de ce projet, nous avons évalué la circulation du VNO au Liban dans des populations de moustiques, des humains, des chevaux et des poulets. Nous avons aussi évalué la compétence vectorielle des populations locales de Cx. pipiens à transmettre le VNO et le VFVR.Des moustiques ont été récoltés et testés pour la présence d’un gène spécifique du VNO. En plus, des sérums humains, de chevaux et de poulets ont été analysés pour rechercher des anticorps spécifiques par ELISA puis confirmés par neutralisation. En outre, des spécimens de Cx. pipiens ont été infectés avec la lignée 1 du VNO ou la souche de VFVR Clone 13. Ensuite, les taux d’infection, de dissémination et de transmission ont été déterminés à différents jours après infection des moustiques. La compétence vectorielle a été comparée entre les différents biotypes.Les résultats entomologiques ont révélé que Cx. pipiens est dominant (87.2%). Tous les moustiques analysés étaient négatifs pour le VNO. Les taux de séroprévalence étaient de 1.01% et 1.98% parmi les humains et les chevaux respectivement. De plus, Cx. pipiens s’est révélé bien plus compétent pour transmettre le VNO que le VFVR. Le biotype molestus est capable de transmettre le VNO plus tôt que celui de pipiens. Cette étude présente des preuves sur une faible circulation du VNO au Liban. Cx. pipiens s’est révélé compétent pour assurer cette transmission. Ainsi, il est essentiel d'établir des programmes de surveillance pour prévenir les éventuelles épidémies
West Nile virus (WNV) and Rift Valley Fever virus (RVFV) are two emerging arboviruses that have never been reported in Lebanon. They can be transmitted by Culex pipiens mosquito species including two biotypes: pipiens and molestus. During this project, we assessed the circulation of WNV among mosquitoes, human, horse and chicken populations in Lebanon. Moreover, we evaluated, under experimental conditions, the capacity of local Cx. pipiens biotypes to transmit both viruses.Adult mosquitoes were collected, identified and tested to detect WNV RNA. Besides, human, horse and chicken blood samples were collected and screened for WNV antibodies using an in-house ELISA and then confirmed by neutralization assay. Moreover, local Cx. pipiens specimens were experimentally infected with WNV lineage 1 or RVFV Clone 13 strain. The viral infection, dissemination and transmission were then estimated at different days post infection.The vector competence was compared between Cx. pipiens biotypes.Entomological results revealed that 87.2% of collected adult mosquitoes were Cx. pipiens. Screened mosquitoes were negative for WNV. Seroprevalence rates were 1.01% and 1.98% among humans and horses respectively. Besides, local Cx. pipiens were highly competent for WNV transmission and to a lesser extent to RVFV. The molestus biotype was able to transmit WNV earlier than pipiens biotype.The present study provides new evidence of a low circulation of WNV among human and horses in Lebanon. Cx. pipiens is the suspected vector and is experimentally competent to ensure transmission. Therefore, there is a need to establish surveillance program to predict and prevent potential outbreaks

Le virus Lassa entraine une fièvre hémorragique endémique en Afrique de l’Ouest et représente un problème de santé publique. Les connaissances sur la pathogénèse et les réponses immunitaires associées à la maladie sont partielles. Nous avons suivi les paramètres pathologiques, virologiques et immunologiques associés aux infections létales et non létales du LASV chez le singe cynomolgus. Le tableau clinique a été caractérisé par une dépression, une anorexie, une perte de poids et une asthénie chez les animaux survivants, tandis que ces mêmes symptômes ont été accompagnés de fièvre, de difficultés respiratoires et d’épistaxis chez les animaux infectés par une dose létale. Seuls ces derniers ont montré une perturbation des paramètres de coagulation, une rhabdomyolyse et une hausse des marqueurs de lésions rénales. Nous avons observé un tropisme radicalement différent en fonction de la sévérité de la maladie, avec une dissémination virale dans les organes plus importante et plus rapide chez les animaux décédés, la présence de particules infectieuses plus nombreuses et des modifications anatomopathologiques plus sévères. Une réponse immunitaire innée et adaptative précoce et puissante a été associée avec le contrôle de l’infection et la survie tandis que les infections fatales ont été caractérisées par une réponse inflammatoire ressemblant au choc septique, une défaillance de la réponse immunitaire ainsi qu’une réplication virale incontrôlée. Cette étude permet d’améliorer nos connaissances de la pathogénèse de la fièvre de Lassa et d’apporter des marqueurs d’infection prédictifs de la maladie
Lassa virus causes a hemorrhagic fever endemic in West Africa and represents a threat for civilians. The pathogenesis and the immune responses associated with the disease are poorly understood. We followed pathological, virological and immunological parameters associated with fatal and non-fatal Lassa virus infection in the cynomolgus monkey. The clinical picture was characterized by depression, anorexia, weight loss and asthenia in survivors whereas the same symptoms were supported by fever, respiratory difficulties and epistaxis in animals infected with the lethal dose. Only fatalities have shown coagulation parameters dysfunction, rhabdomyolysis and an increase of renal function markers. We observed a different viral tropism in a function of the disease severity, with viral dissemination in organs that was more important and faster in fatalities, the appearance of numerous infectious particles number and more severe pathologic changes. Early and robust innate and adaptive immune response has been associated with the control of infection and recovery whereas fatal infections were characterized by a sepsis like inflammatory response, defective immune response as well as uncontrolled viral replication. This study sheds light on the pathogenesis of Lassa fever and reveals infection markers predictive of the disease outcome

Transmis par les moustiques, le virus de la fièvre de la vallée du Rift (vFVR) est un virus zoonotique qui affecte principalement les ruminants en Afrique et conduit à des pertes économiques importantes. Il n’existe actuellement pas de traitements et les seuls vaccins disponibles sont à usage vétérinaire. Le développement de nouveaux vaccins plus sûrs contre le vFVR est une priorité de l’OMS en raison du risque d’émergence de cet arbovirus dans d’autres continents. Dans cette étude, nous avons développé une vaccination à ADN optimisée contre le vFVR qui consiste à administrer par voie cutanée un plasmide codant pour l’ectodomaine de la glycoprotéine de surface Gn du vFVR (eGn) en présence d’un plasmide adjuvant codant le GM-CSF et combinée avec une électroporation. De plus, nous avons également optimisé la vaccination à ADN en l’associant à la stratégie de ciblage des cellules dendritiques (DCs) via un plasmide qui code des fragments d’anticorps scFv fusionnés avec l’eGn dirigés contre les récepteurs DEC205 et CD11c exprimés à la surface des DCs. Les vaccins ont été testés chez le mouton, hôte naturel du virus et dans le modèle murin pour étudier les mécanismes de protection. Dans nos deux modèles d’études, l’immunisation par le plasmide codant l’eGn confère une meilleure protection après une épreuve virale ainsi qu’une forte production d’anticorps non neutralisants par rapport au ciblage des DCs. En revanche, le ciblage d’eGn vers des récepteurs de DCs protège partiellement contre une épreuve virale et induit une immunogénicité différente dans les deux espèces. Nous avons confirmé le rôle protecteur de ces anticorps anti-eGn par un transfert passif dans le modèle murin et le mécanisme d’action de ces anticorps protecteurs reste encore à être déterminé. Notre étude montre pour la première fois la protection par un vaccin à ADN contre le vFVR chez le mouton
The Rift valley fever virus (RVFV) is a mosquito-borne virus that mainly affect ruminants in Africa, resulting in economic burden. There is currently no treatment and only vaccine for veterinary use against the RVFV are available. The development of new and safer vaccine is urgently needed due to the risk of introduction of this arbovirus to other continents. In the present work, we developed an optimized DNA vaccination against RVFV using a plasmid encoding the ectodomain of surface glycoprotein Gn (eGn) of RVFV into the skin with plasmid adjuvant encoding GM-CSF and electroporation in sheep. We further optimized the DNA vaccination using dendritic cell targeting strategy with a plasmid encoding a single chain fragment variable (scFv) fused with eGn directed to two DC receptors, DEC205 and CD11c. The efficacy of the vaccines were tested in the sheep, the natural host and in the mouse model to investigate the mechanism of protection. In both models non-targeted eGn vaccine confer a better clinical protection and higher non-neutralizing antibody production than DC-targeted vaccine. However, in both models eGn targeting to DEC205 differentially affected the immune response and induced a partial protection after a challenge. We further demonstrated that non-neutralizing antibodies induced by native eGn protect mice by passive transfer. The mechanism mediated by these antibodies remains to be investigated. Overall, this work indicates the proof of concept that DNA vaccine can confer protection against the RVFV in the sheep

La Fièvre Hémorragique Virale (FHV) Ebola est une maladie infectieuse émergente qui sévit par flambées épidémiques. Depuis sa première manifestation en 1976, plusieurs études menées ont donné lieu à diverses spéculations sur la nature du réservoir de ce virus qui n’a été lié que tout récemment aux trois espèces de chauve-souris frugivores Hypsignathus monstrosus, Epomops franqueti et Myonycteris torquata. Toutefois, bien que le réservoir semble désormais connu, la chaîne de transmission de l’infection ainsi que les conditions naturelles d’émergence des épidémies restent non élucidées. Par ailleurs, présentement, on ne dispose pas encore d’un vaccin contre le virus Ebola bien que des avancées considérables aient été accomplies dernièrement dans les recherches à ce sujet. Entre 1994 et 2005, 8 épidémies de FHV Ebola ont sévi au Gabon et au Congo. Trois observations principales nous permettent de considérer la FHV Ebola comme étant un phénomène lié aux variations des conditions environnementales : le virus se manifeste particulièrement dans la même région "Nord-est Gabon / Cuvette-Ouest Congo" ; on constate une périodicité saisonnière d'apparition des épidémies dans cette région (généralement durant la période de transition "saison sèche / saison de pluies") ; les espèces de gorilles et chimpanzés chez lesquelles on a observé de fortes mortalités de populations avant et pendant les épidémies humaines s’avèrent particulièrement affectées. Même dans le cas où on disposerait très prochainement d’un traitement efficace ou un vaccin, la prédiction, la prévention et le contrôle rapide des épidémies demeurent une priorité majeure en santé publique. C'est dans cette optique qu'une étude sur les interactions possibles entre "conditions environnementales" et "apparition des épidémies" a été envisagée. Pour cela, il a été préconisé une approche géographique au moyen d'outils de télédétection spatiale et de Systèmes d'Information Géographique (SIG). Le travail réalisé a consisté à étudier la dynamique spatiale et temporelle de différents paramètres du milieu (relief, hydrographie, végétation, etc. ). L’étude visait, d'une part, à caractériser le milieu naturel de la région des épidémies, d'autre part, à identifier des indicateurs environnementaux pouvant être liés aux processus de déclanchement des épidémies. Les résultats obtenus montrent que la région d'épidémies se caractérise par un terrain globalement plat situé en altitude, par des pluies abondantes et par un réseau hydrographique dense et ramifié. L'ensemble rend le milieu particulièrement humide donnant lieu à une végétation dense avec une flore spécifique. L'écosystème est donc inféodé à des conditions d'humidité élevée. Dans ce contexte, le paramètre "humidité du milieu" s'avère alors jouer un rôle central dans le fonctionnement de l'écosystème. Il commande de manière cruciale les interactions entre l'homme, la forêt et les animaux. Or ces interactions sont nécessairement à la base des échanges intra et interspécifique impliqués dans la circulation du virus. Nous pensons donc que ce paramètre est lié aux processus écologiques étant à l’origine du déclenchement des épidémies de fièvre Ebola au Gabon et au Congo. Enfin, cette étude ouvre des perspectives sur l’utilisation des images satellitaires dans la détermination d’un seuil de risque d’apparition des épidémies. Un suivi de l'évolution temporelle de l'humidité du milieu pourrait être envisagé sur la base des pistes suggérées par l’étude des variations de la rétrodiffusion radar et de l'indice NDVI. Le but serait d’arriver à déterminer et caractériser un ou des indices révélateurs de l’état des conditions d’humidité dans le milieu. Toute valeur dépassant un seuil déterminé pourra constituer une alerte pour les autorités sanitaires des pays concernés
The Ebola hemorrhagic viral fever is an emerging infectious disease that occurs in the form of rapid outbreaks. Since its first event in 1976, several studies have given rises to various speculations about the nature of its natural reservoir of the virus, which has recently been linked to three species of fruit bats: Hypsignathus monstrosus, Epomops franqueti and Myonycteris torquata. However, although the reservoir seems now to be known, the infection transmission chain and the natural conditions of the epidemics emergence remain none elucidated. In addition, until now, we do not have a vaccine against the Ebola virus although considerable progresses have been accomplished in this way by researchers. Between 1994 and 2005, eight Ebola epidemics occurred in Gabon and Congo. Three main observations permitted us to consider that the Ebola fever is a phenomenon linked to environmental conditions : the virus caused epidemics in the same region “Northeastern of Gabon - West basin of Congo”; the epidemics showed a certain seasonality pattern, since it often occurred during the dry to rainy season transition period ; human epidemics occurred simultaneously or after great mortalities affected populations of gorillas and chimpanzees. Even though an effective treatment or a vaccine would be available in a very close future, prediction, prevention and rapid control of epidemics would remain a major priority in public health. With this in mind, a study was considered about the possible interactions between “the environmental conditions” and “the epidemics emergence”, using a geographical approach with remote sensing and GIS tools. This work has consisted on studying the spatial and temporal dynamics of environmental parameters, as for example, topography, hydrology, vegetation, and so on, in the epidemics area. This study has two main objectives: to characterize the natural environment of the epidemics area and to identify environmental indicators that may be linked to the ecological processes leading to the epidemics. It was shown that the epidemics region has generally a flat topography and it is located in high and pluvial lands, presenting a dense hydrographic network. This results on a very wet environment marked by dense vegetation with specific flora. The ecosystem is therefore subservient to high humidity conditions. In this context, the "environment humidity" is then playing a central role in the ecosystem functioning. This role consists on modulating crucial interactions between humans, forest and animals, which constitute the essential basis of the exchanges involved in the natural virus life cycle. We therefore conclude that "environment humidity" is a propriety closely linked to ecological processes that are at the origin of Ebola fever outbreaks in Gabon and Congo. Finally, the results of this study offer positive perspectives on the use of satellite imagery in determining a threshold of risk of epidemics. The temporal evolution of moisture in environment can be followed, firstly, through changes in the vegetation index NDVI and, secondly, through changes in the radar backscattering. Any value exceeding the critical threshold defined would constitute a warning signal from which the health authorities of the concerned countries could implement awareness and prevention actions

La Fièvre Catarrhale Ovine est une arbovirose due à un Orbivirus touchant les ruminants. Récemment, une épizootie majeure, notamment due au sérotype 8 du virus (BTV-8), a touché les ruminants Européens. Ce sérotype a présenté plusieurs particularités telles que le spectre d’hôte original, et la transmission transplacentaire. L’impact de l’infection par le BTV-8 chez le caprin a été étudiée dans ce travail d’un point de vue clinique, virologique, hématologique et sérologique, et notamment pour ce dernier aspect à travers le développement de deux outils sérologiques. L’impact d’une infection maternelle sur le fœtus a également été étudié.Ces travaux ont confirmé que l’impact de l’infection par le BTV-8 chez les caprins est modéré, tant d’un point de vue clinique que d’un point de vue hématologique. Ce travail a également permis de faire ressortir plusieurs connaissances nouvelles: un impact modéré sur les comptages leucocytaires ; une transmission transplacentaire du virus lors d’infection en milieu de gestation ; une détection du virus dans la semence ; une possible transmission « directe », non vectorielle.Ces 3 dernières constatations n’avaient jusqu’alors pas été rapportées dans la littérature chez les caprins, mais avaient été observées chez les ovins et les bovins. Ceci confirme que, même si les caprins sont des animaux sensibles mais que l’impact clinique est limité, la plupart des caractéristiques faisant la spécificité de l’infection par la souche européenne du BTV-8 peuvent également être retrouvées dans cette espèce. Néanmoins, l’absence de description de ces particularités dans des conditions d’infection naturelle ne permet pas de conclure quant à leur impact sur le terrain.Des outils sérologiques ont été également développés afin d’étudier les propriétés antigéniques des protéines virales chez le caprin. La production des protéines recombinantes NS1, NS3, VP7 et VP2 en système baculovirus, et de la protéine NS2 en système E. coli, ont permis l’obtention de protéines recombinantes. Ces 5 protéines recombinantes ont permis le développement de tests sérologiques permettant d’étudier leurs propriétés antigéniques et la cinétique d’apparition des anticorps après vaccination ou/et infection par le BTV-8 chez le caprin.Dans un premier temps, des tests ELISA indirect NS1, NS2, NS3, VP7 et VP2 ont été développés, et la capacité des tests ELISA NS et VP7 à permettre une différenciation entre les animaux infectés et vaccinés a été évaluée. Cependant, des anticorps anti-NS2 et NS3 ont été détectés dans les sérums d’animaux vaccinés et une faible réponse obtenue en ELISA NS1 chez les animaux infectés rend difficile l’utilisation d’un test ELISA DIVA basé sur ces 3 protéines non structurales. Enfin, une réponse en anticorps anti-VP2 est détectée par le test ELISA VP2 après vaccination et après épreuve virulente, suggérant une détection d’anticorps spécifiques de type par ce test.Dans un second temps, un test Luminex multiplex, basé sur l’utilisation des protéines VP7 et VP2 a été développé. Le Luminex VP7 présente une très bonne corrélation avec l’ELISA VP7 lorsque les sérums d’animaux infectés sont testés, avec une aire sous la courbe de 0,987. Les performances de ce test paraissent cependant modérées lorsque des sérums issus d’animaux ayant reçu une unique injection vaccinale sont testés. Le Luminex VP2 présente des performances également excellentes, avec une aire sous la courbe de 0,978. Les VPP et VPN ont été calculées pour des prévalences très faibles (0,5%, correspondant à la prévalence devant être détectée par le screening sérologique d’animaux sentinelles) : la VPP est alors très faible mais la VPN est très élevée (99,99% pour VP7, 99,95% pour VP2). Le test Luminex multiplex développé, caractérisé par une VPN très élevée, permet d’exclure avec confiance la présence du BTV-8 dans une région indemne lors de résultat négatif, correspondant parfaitement aux objectifs assignés
Bluetongue is an infectious non contagious arbovirosis caused by Bluetongue virus (BTV), belonging to the genus Orbivirus. Recently, a major epizooty, due to BTV-8, was encountered in European ruminants. This serotype presented several original features such as an original host spectrum and transplacental transmission. This work consisted in studying the impact of BTV-8 infection in goats from a clinical, virological, haematological and serological (after development of two new serological tests) point of view, because of the lack of knowledge in this specie. The impact on foetuses of infection during gestation was also studied.The different animal studies realised confirmed that the BTV-8 infection has a moderate impact in goats from a clinical and haematological point of view. These studies led to obtain new information about BTV-8 impact: moderate impact on leucocytes counts; transplacental transmission of the virus when infection occurs in mid-pregnancy; detection of BTV-8 in bucks’ semen; direct, non vectorial transmission. The last 3 results had never been described in goats with BTV-8 before but had been encountered in sheep and cattle: it proves that, even if goats are susceptible to the infection but are less affected by the virus, most of feature of BTV-8 North European strain can also be encountered in this specie. However, these features have not been described in natural conditions, making impossible to conclude on their impact in the field.In a second part of this thesis, serological tool have been developed in order to study antigenic properties of viral proteins in goats. Recombinant proteins NS1, NS3, VP7 and VP2 were produced in baculovirus system, while NS2 was produced in E. coli system. These recombinant proteins were used to develop serological test in order to study antigenic properties and the kinetic of antibodies response against this 5 proteins after vaccination against and infection by BTV-8 in goats.In a first part, indirect ELISA NS1, NS2, NS3, VP7 and VP2 were developed, and the opportunity to develop DIVA ELISA test using NS and VP ELISA was evaluated. However, detection of antibodies against NS2 and NS3 in vaccinated animals, and the difficulties to detect antibodies against NS1 in infected animals led us to conclude that a DIVA ELISA test using non-structural proteins was difficult. Finally, it was possible to detect antibodies against VP2 in infected and vaccinated animals using our VP2 ELISA, suggesting a detection of antibodies specific of serotype by this test.In a second part, a multiplex Luminex test, using VP7 and VP2, was developed. This test has, for VP7 detection, a strong correlation with cELISA VP7, with an area under the curve of 0.987. Luminex VP7 performance is moderate when sera from goats having only one vaccine administration were tested. Concerning Luminex VP2, test performance are also excellent with an area under the curve of 0.978. When a prevalence of 0.5% was applied (prevalence that should be detected by serological screening in Europe), de predictive negative value was very high (99.99% for Luminex VP7; 99.95% for Luminex VP2). The Luminex test developed, with a very high PNV, can exclude with a high level of confidence the presence of BTV-8 in a free-area

La fièvre aphteuse (FMD pour Foot-and-mouth disease en anglais) est une maladie très contagieuse touchant les animaux biongulés. Elle provoque des dégâts économiques considérables sur toute la surface du globe. La fièvre aphteuse est provoquée par un virus, le FMDV. Il s'agit d'un virus à ARN simple brin, de polarité positive appartenant au genre Aphtovirus dans la famille Picornaviridae. Ce virus se réplique et se propage dans l'hôte très rapidement. Dans les zones infectées, les deux principales stratégies de contrôle utilisées sont l'abattage systématique des animaux infectés et la vaccination. A l'inverse, les vaccins ne sont pas utilisés dans les zones sans FMDV, mais l'apparition d'une épidémie nécessite des stratégies pour arrêter ou au moins limiter la diffusion du virus. Actuellement, les vaccins inactivés sont les vaccins les plus utilisés pour prévenir la maladie. Cependant, ils requièrent une production à grande échelle du virus, et malgré les mesures mises en place (laboratoire sécurisé, etc), des épidémies ont été provoquées par le passé du fait de la fuite de virus FMDV. De plus, il est difficile de distinguer les animaux infectés des vaccinés (DIVA). Il est donc nécessaire de développer de nouveaux vaccins. Au cours de l'infection, la polyprotéine du virus est clivée par des protéases virales en précurseurs structural (P1) et non structuraux (P2 et P3). La protéase 3C est responsable de la majorité des clivages ; ainsi, le précurseur P1 est clivé par la 3C en trois protéines structurales, VP1, VP3 et VP0, formant le protomère de FMDV, l'unité de base de la capside virale. La protéine VP1 joue des rôles importants dans l'attachement, la protection et le sérotypage. Du fait de la présence d'un site antigénique linéaire suffisant à la protection par production d'anticorps neutralisants, VP1 est considérée comme la protéine la plus immunogénique du virus. Dans cette étude, nous avons développé un nouveau vaccin contre la FMD, basé sur l'adénovirus canin de type 2 (Cav2). L'évaluation du transfert de gène médié par Cav2 chez le porc et le bétail in vitro montre des résultats prometteurs pour le développement de vaccins pour ces espèces, notamment l'expression des antigènes de FMDV par les candidats vaccins Cav2-FMDV. L'immunogénicité de ces candidats vaccins a été montrée chez les modèles murins et cobayes. De plus, des résultats encourageants ont été observés chez le cobaye, suggérant que la réponse immunitaire élicitée par les vecteurs recombinants pouvait conduire à une protection partielle des animaux après épreuve. Cependant, une optimisation de l'immunisation doit être faite dans le but de confirmer ces résultats. Ce type de vaccin peut de plus être utilisé comme vaccin marqueur, car il ne contient aucune protéine non structurale
Foot-and-mouth disease (FMD) is a highly contagious and economically devastating disease affecting cloven-hoofed livestock worldwide. Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is the causative agent of FMD and one of the most infectious known animal viruses. FMDV is a positive-sense, single-stranded RNA virus belonging to the Aphthovirus genus in the Picornaviridae family. FMDV replicates and spreads in the host extremely rapidly. Slaughter and vaccination are the two major strategies used to control FMD in infected countries. In FMDV-free countries, vaccines are not used, and once the disease breaks out in these areas, strategies are required to stop or at least slow the spread of the virus. Currently, inactivated vaccines are by far the most commonly used vaccines to prevent FMD. Such vaccines, however, require large-scale production of virus, and despite the use of bio-safety facilities, vaccine production has led to inadvertent virus release and FMDV outbreak. Another limitation of inactivated vaccines is the difficulty in distinguishing between infected and vaccinated animals (DIVA). Therefore, improved vaccines need to be developed.During infection, the FMDV polyprotein is cleaved into structural (P1) and non-structural (P2 and P3) precursors by a viral protease. The non-structural 3C protein is the protease that is responsible for most of the maturation events. The P1 precursor is processed by 3C protease into three structural proteins, VP1, VP3 and VP0, forming the FMDV protomer. The VP1 protein plays important roles in attachment, protective immunity and serotype specificity. VP1 is considered to be the major immunogenic protein, as it contains a linear antigenic site that is able to induce neutralizing antibodies that suffice to protect animals against the disease.In this project, we developed a novel vaccine against FMD, based on canine adenovirus type 2 (Cav2). In vitro evaluation of Cav2 mediated gene transfer in pigs and cattle showed that the Cav2 vector holds promise for the development of vaccines for pigs and cattle. Study of these recombinant viruses indicated that Cav2-FMDV supported expression of FMDV capsid proteins in vitro. The immunogenicity of these recombinant viruses was evidenced in mouse and guinea pig models, and encouraging results in guinea pigs suggested that the immune response elicited against FMD by recombinant virus could afford partial protection against FMDV challenge. In the future, immunization with Cav2-derived vector should be optimized to confirm these preliminary results. This type of vaccine, when designed to express capsid but not non-structural proteins of FMDV, can serve as a marker vaccine against FMD

Depuis une décennie, GBF1 a émergé comme étant un facteur cellulaire essentiel à la réplication de plusieurs virus à ARN de polarité positive (ARN(+)), issus de différentes familles. GBF1 est un facteur d’échange nucléotidique de petites protéines G de la famille Arf, connu pour son action régulatrice des étapes précoces de la voie de sécrétion. En étudiant le virus de l’hépatite C (VHC) comme virus modèle, nous avons montré que le rôle de GBF1 dans la réplication virale est distinct de sa fonction régulatrice de la voie de sécrétion. En effet,GBF1 participe à la réplication du VHC par l’intermédiaire de la paire Arf4 et Arf5, alors que c’est la paire Arf1et Arf4 qui est impliquée dans la voie sécrétion. Pour déterminer si ce mécanisme d’action est conservé parmi les virus à ARN(+), nous avons d’abord montré que GBF1 est impliquée dans l’infection par le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus sindbis (SINV), le coronavirus 229E humain (HCoV-229E) et le coxsackievirus B4(CVB4). Puis, nos résultats indiquent que les infections YFV, SINV et HCoV-229E dépendent, tout comme le VHC, des protéines Arf4 et Arf5. Toutefois, le YFV et le SINV utiliseraient également une autre paire d’Arf,Arf1 et Arf4, lors de leur cycle viral. Par ailleurs, l’infection par le coxsackievirus B4 (CVB4) est dépendante de GBF1 mais ne semble pas dépendre des protéines Arf. Bien que GBF1 soit un facteur crucial pour la réplication des virus ARN(+), son mécanisme d’action ne semble donc pas être conservé.La paire Arf4-Arf5 semble impliquée dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Cependant, ces deux Arf ont été très peu étudiées, contrairement à la protéine Arf1. Nous faisons l’hypothèse que la paire Arf4-Arf5 agit en régulant une série d’effecteurs spécifiques qui sont importants pour la réplication virale. Nos résultats montrent que la déplétion simultanée de Arf4 et de Arf5 perturbe la morphologie de l’appareil de Golgi, qui devient condensé, et des gouttelettes lipidiques (GL), qui s’accumulent et grossissent en périphérie cellulaire.Toutefois, une analyse lipidomique de cellules déplétées de Arf4 et Arf5 montre une composition lipidique inchangée, ce qui suggère un effet sur la morphologie des GL et non pas sur le métabolisme des lipides. Une analyse transcriptomique nous a permis de mettre en évidence une série de protéines, dont l’expression est modulée, suite à la déplétion de Arf4 et Arf5. Nous avons évalué l’implication potentielle de certaines d’entre elles dans l’infection du VHC, mais aucune ne s’est révélée importante pour ce virus. En conclusion, nos résultats ont permis de mettre en évidence de nouvelles fonctions de GBF1, médiées par la paire de protéines Arf4 et Arf5. Arf4 et Arf5 sont impliquées dans la régulation de la morphologie de l’appareil de Golgi et des GL ainsi que dans la réplication de plusieurs virus à ARN(+). Il reste à évaluer si ces fonctions sont indépendantes les unes des autres ou liées entre elles et quels effecteurs spécifiques elles font intervenir
GBF1 has recently emerged as a cellular factor essential for the replication of single-stranded positive-sense RNA ((+)RNA) viruses from different families. GBF1 is a guanine-nucleotide exchange factor of small G proteins of the Arf family, known to regulate the early secretory pathway. By studying the hepatitis C virus (HCV) as a model, we have shown that the role of GBF1 in viral replication is distinct from its regulatoryfunction of the sercretory pathway. Indeed, GBF1 function in HCV replication is mediated by Arf4 and Arf5,whereas another pair, Arf1 and Arf4, mediates the regulation of the secretion. To determine if this mechanism ofaction is conserved among (+)RNA viruses, we showed that GBF1 is involved in yellow fever virus (YFV),sindbis virus (SINV), human coronavirus 229E (HCoV-229E) and coxsackievirus B4 (CVB4) infection. Our results indicate that YFV, SINV and HCoV-229E infections are Arf4 and Arf5 dependent, as we previouslyshowed for HCV. However, YFV and SINV would also use another Arf pair, Arf1 and Arf4, during their lifecycle. In addition, CVB4 infection depends on GBF1, but doesn’t seem to depend on any Arf. Although GBF1 is required for (+)RNA viruses replication, its mechanism of action appears not to be conserved.The Arf4-Arf5 pair appears to be involved in the replication of several (+)RNA viruses. However, these twoproteins have been poorly studied so far, contrary to Arf1. Our hypothesis is that the Arf4-Arf5 pair regulatesspecific effectors involved in viral replication. Our results indicate that Arf4 and Arf5 simultaneous depletionalters the morphology of the Golgi apparatus, which becomes condense, and of lipid droplets (LD), whichaccumulate and grow bigger at the cell periphery. However, a lipidomic analysis of Arf4 and Arf5 depleted cellsdisplayed an unaltered lipid composition, which suggests a morphologic impact on LD, rather than a disruptionof the lipid metabolism. A transcriptomic analysis identified proteins up- or down-regulated after Arf4 and Arf5 depletion. We assessed the function of some of these proteins in HCV replication, but none of them proved implicated.In conclusion, our results hightlighed new GBF1 functions, mediated by the pair Arf4-Arf5. Arf4 and Arf5 are involved in regulating the morphology of Golgi complex and of LDs, as well as the replication of (+) RNA viruses. It remains to assess if these functions are independent or related to each other, and which specific effectors they use

Ce mémoire présente les études que nous avons réalisées sur deux nairovirus, le virus Hazara et le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (CCHFV). Nous avons utilisé le réplicon du virus de la forêt de Semliki pour induire un mécanisme de résistance dérivée du pathogène contre le virus Hazara dans les cellules de tiques. Nous avons montré que cette résistance est liée à un phénomène d'interférence par ARN, induit dans les cellules de tiques et nous avons détecté deux marqueurs de l'interférence, une activité ribonucléasique et des ARN de 21-24 nucléotides (siRNA) spécifiques. Nous avons également mis au point un système original de gène rapporteur permettant l'induction de l'interférence par ARN dans des cellules de tiques pour étudier des suppresseurs viraux. Dans la dernière partie, nous avons abordé les méthodes de diagnostic de l'infection par le CCHFV. Nous avons mis au point deux nouvelles méthodes de diagnostic d'une infection. L'une repose sur l'utilisation d'un antigène recombinant et l'autre sur la quantification en temps réel des acides nucléiques viraux. Nous avons validé l'efficacité de l'antigène recombinant pour la détection d'anticorps spécifiques dans des sérums de patients et d'animaux d'Iran et nous avons montré que cette méthode est aussi sensible et spécifique que celle utilisant un antigène natif inactivé produit dans des cellules infectées
This manuscript presents the different studies that we have conducted on two nairoviruses, Hazara virus and Crimean-Congo haemorrhagic fever virus (CCHFV). We have used recombinant Semliki forest virus replicon to induce and study a pathogen-derived resistance against Hazara virus in tick cells. We showed that the resistance is directly linked to a phenomenon associated with RNA interference induced in the tick cells and we have detected two markers of this interference: a specific ribonucleasic activity and specific siRNAs. We have then set up an original system using a reporter gene to induce RNA inference in tick cells and to study of viral suppressors of RNA interference. In the last part of our work, we have developed tools to diagnose the CCHFV infection. We have set up two methods to diagnostic an infection, based on the use of a recombinant antigen or on the real-time quantification of viral nucleic acids. We have validated the recombinant antigen to detect specific antibodies against CCHFV in human and animal sera from Iran and we showed that this recombinant antigen is as sensitive and specific as a native antigen produced in infected cell cultures

Avec plus de 20% de morts annuels dus aux maladies infectieuses, celles-ci restent un sujet majeur de santé publique. Des maladies d’origine virale (ré)émergent suite aux changements environnementaux, climatiques et sociétaux : le virus Ebola, la Dengue ou, plus récemment, le virus Zika. Dans ce contexte, il est donc aujourd’hui crucial de développer des vaccins efficaces et sûrs contre les infections virales émergentes. Ce projet de thèse vise à mettre en place une nouvelle stratégie de production de vaccins vivants atténués ciblant les virus à ARN en travaillant sur le virus de la fièvre jaune (genre Flavivirus). Après une analyse génomique qui a permis d’approfondir une technique de modification des virus appelée « ré-encodage », des mutants de la fièvre jaune ont été produits puis caractérisés in vitro et in vivo. En parallèle, un modèle rongeur de la fièvre jaune a été développé et a permis de tester in vivo à la fois l’innocuité et l’efficacité vaccinale des virus ré-encodés
Despite recent considerable improvements, infectious diseases remain a major issue for public health, with an estimated 20% of annual deaths caused by infections. Among them, viral diseases (re)emerge following environmental, climatic and societal changes: Ebola, Dengue and Zika viruses have recently been the object of special attention. The development of safe and efficient vaccines against emerging viruses is a major challenge for global public health. This thesis work is in line with this issue. Using the yellow fever virus (YFV, genus Flavivirus) as a model, we tried to define new strategies for the design of live-attenuated vaccines for viral infections prevention. After a genomic analysis that allowed to go further into a procedure for virus modification named “re-encoding”, we generated and characterised both in vitro and in vivo mutant strains of YFV. In parallel, a rodent model was set up to test in vivo both the safety and the protective efficiency of the re-encoded viruses

Nous avons étudié les caractéristiques intrinsèques du virus de la fièvre jaune dans les cellules de vertébrés et d'insectes. Ce virus se multiplie dans les citernes ergastoplasmiques des cellules, mais ne bourgeonne pas. Il est excrété par la cellule avec un maximum situé à la 40e heure. Nous avons trouvé dans le virion un ARN monocaténaire, positif, ne possédant pas d'extrémité polyadénylée et un enveloppe virale contenant une glycoprotéine majeure. Les différentes classes d'ARN viraux que nous avons définies dans les cellules correspondent à l'ARN génomique (40 S), à la forme réplicative bicaténaire (20 S) et aux intermédiaires de réplication (26 S). Nous avons trouvé sur les polysomes qu'un ARN messager viral de taille génomique. La technique de précipitation radioimmunologique permet d'observer sept protéines virales dans les cellules infectées. Trois d'entre elles sont glycosylées et se fixent sur la concanavaline A. L'incorporation de sucres radiactifs et l'action de la tunicamycine sur les synthèses des chaînes polyosidiques ont montré que le système de glycosylation est différent d'une protéine à l'autre et différent aussi suivant que la cellule hôte est issue de vertébrés ou de moustiques. Nous avons étudié des souches de virus amaril provenant de zones géographiques différentes et isolées dans des conditions épidémiologiques variées : l'ARN génomique analysé par la méthode des empreintes d'oligonucléotides T1 et les glycoprotéines virales caractérisées en gel de polyacrylamide ou leur pouvoir antigénique testé à l'aide d'anticorps monoclonaux (immunoprécipitation, séroneutralisation, ELISA) ont servi de marqueurs génétiques et immunochimiques pour cette étude comparative. Ces marqueurs ont permis de classer les virus en variants géographiques nommés topotypes. La virulence de ces souches de virus pour la souris a été étudiée. Les souches sud-américaines tuent la souris lorsqu'elles sont inoculées par voie intrapéritonéale alors que les souches africaines ne sont pas pathogènes par cette voie. Nos résultats apportent un support moléculaire nécessaire aux enquêtes épidémiologiques et orientent les études ultérieures sur le clonage et le séquençage du gène codant pour la glycoprotéine d'enveloppe des virus de la fièvre jaune.

Les fièvres hémorragiques à virus Lassa (LASV) et Ebola (EBOV) représentent un important problème de santé publique en Afrique. Les réponses immunes et la pathogenèse associées à ces maladies sont peu connues. Les cellules NK ont un rôle important dans la réponse immune innée par leurs propriétés cytotoxiques, mais également dans l'induction des réponses adaptatives par leur production de cytokines et leurs interactions avec les cellules dendritiques (DC) et les macrophages. Ce projet s'attache à comprendre le rôle des cellules NK dans le contrôle de la réplication virale et dans l'induction des réponses immunitaires au cours de ces infections. Un modèle in vitro de coculture de cellules NK humaines avec des DC et macrophages autologues a été développé. L'activation des cellules NK et leurs fonctions ont été analysées après l'infection par LASV et EBOV. Par ailleurs, les réponses des cellules NK en réponse à LASV ont été comparées avec celles induites lors de l'infection par le virus Mopeia (MOPV), très proche de LASV mais non pathogène pour l'homme. Les macrophages, mais pas les DC, infectés par LASV ou MOPV induisent l'activation et l'augmentation des capacités cytotoxiques des cellules NK. Toutefois, les cellules NK ne sont pas capables de lyser les cellules infectées et ne produisent pas d'IFN-γ. Les cellules NK s'activent et sont capables de lyser les cellules infectées en présence de macrophages mais également de DC infectés par des LASV mutants. Cependant, les IFN de type I sécrétés en grande quantité en réponse à ces virus ne sont pas impliqués dans l'activation des cellules NK. L'infection par EBOV n'induit qu'une très faible activation des cellules NK en présence de DC ou macrophages et ne conduit pas à la sécrétion de cytokines, ni à la modification du potentiel cytotoxique.Ces résultats permettent d'améliorer la compréhension des réponses immunes et des mécanismes de pathogenèse mis en place lors des fièvres hémorragiques Lassa et Ebola.

Etude de la réplication intracellulaire et de la persistance de Coxiella burnetii, agent pathogène de la fièvre QCoxiella burnetii est la bactérie responsable de la fièvre Q, une maladie considérée comme l’une des zoonoses réémergentes les plus préoccupantes en Europe. C. burnetii infecte les humains par inhalation d’aérosols contaminés, causant des épidémies avec de lourdes conséquences économiques et sanitaires. A la suite de l’invasion, C. burnetii détourne les fonctions de la cellule hôte pour inhiber la réponse immunitaire innée et générer une niche réplicative appelée CCV (Coxiella-containing vacuole) d’une composition protéique et lipidique unique. Mon projet de thèse se focalise sur l’étude des interactions hôte/pathogène permettant la persistance et la réplication intracellulaire de C. burnetii.Tout d’abord, nous avons démontré comment la protéine effectrice bactérienne NopA inhibe la réponse immunitaire innée des cellules infectées. Les résultats obtenus au cours de ma thèse ont montré que NopA interagit avec Ran et déséquilibre son gradient nucléocytoplasmique, perturbant ainsi l’importation nucléaire de protéines eucaryotes et l’expression de cytokines pro-inflammatoires. En parallèle, le rôle du métabolisme des lipides dans la biogenèse de la CCV a été étudié. En utilisant un large éventail de sondes liant les lipides et de la microscopie confocale, la signature lipidique des CCVs a été mise en évidence, révélant que le PI(4)P et le LBPA sont activement recrutés à la CCV par C. burnetii au cours de l’infection. La coprécipitation des protéines de C. burnetii avec des lipides eucaryotes a ensuite conduit à l’identification de candidats effecteurs liant les lipides. Parmi ceux-ci, CBU0635 pourrait être une phosphatase des lipides qui détourne la voie sécrétoire vers la CCV tandis que CBU2007 manipule le métabolisme de l’acide lysobisphosphatidique pour recruter la machinerie ESCRT et bloquer la biogenèse des corps vésiculaires. Ces résultats permettent donc une meilleure compréhension des stratégies de réplication et de persistance de C. burnetii et pourraient à terme être utilisés dans le développement de nouveaux antimicrobiens et dans l’utilisation à des fins thérapeutiques de protéines de C. burnetii
Intracellular replication and persistence strategies of the Q fever pathogenCoxiella burnetiiCoxiella burnetii is the causative agent of human Q Fever, considered as one of the most relevant re- emerging zoonosis in Europe. C. burnetii infects humans through the inhalation of contaminated aerosols, causing epidemics with serious economic and health consequences. Following internalisation, C. burnetii subverts host cell functions to inhibit the innate immune response and generate a replicative niche called CCV (Coxiella-containing vacuole) characterised by a unique protein and lipid composition. My thesis project focuses on the study of the host/pathogen interactions underlying the persistence and intracellular replication of C. burnetii.First, the function of the effector protein NopA was discovered showing how this protein inhibits the innate immune response in infected cells. The results obtained during my PhD have shown that NopA interacts with Ran and triggers an imbalance in its nucleocytoplasmic gradient, thereby perturbing the nuclear import of eukaryotic proteins and the expression of pro-inflammatory cytokines. In parallel, the role of lipid metabolism in the establishment of the CCV was investigated. By using a wide array of lipid probes and confocal microscopy, the lipid signature of CCVs was determined and revealed that PI(4)P and LBPA are actively subverted by C. burnetii during infection. Lipid pulldown assays then led to the identification of C. burnetii candidate effector proteins interacting with host cell lipids. One of them, CBU0635, is a putative phosphoinositide phosphatase that diverts the secretory pathway to the forming Coxiella- containing vacuole while CBU2007 manipulates lysobisphosphatidic acid metabolism to recruit the ESCRT machinery and block the biogenesis of multivesicular bodies. These results help to better understand intracellular replication and persistence strategies of C. burnetii and could allow the development of new antimicrobials and the therapeutic repurposing of C. burnetii proteins

La Fièvre catarrhale ovine (FCO) est une arbovirose émergente en Europe depuis la fin desannées 90. Elle affecte principalement les ruminants par la piqûre de petits moucheronshématophages, les Culicoides (Diptera : Ceratopogonidae). Pendant l’été 2006, l’introductiondu sérotype 8 de la FCO, dans la région de Maastricht (Pays-Bas) a rapidement diffusé dansles Ardennes, générant de lourdes pertes pour les éleveurs de bovins et d’ovins. Cesévènements interrogent sur la capacité des Culicoides de la région paléarctique à transmettrela FCO. Ils révèlent la nécessité de mieux connaître la biologie de ces diptères.Nous avons développé successivement dans ce travail, trois axes de recherche qui se sontappuyés sur un travail de terrain réalisé principalement au sein de deux élevages situés dansles Ardennes françaises.Dans un premier temps, nous avons réalisé une expérimentation de gorgement de Culicoidesde captures et d’émergences, provenant des Ardennes, sur petits ruminants virémiques pour leBTV8. A l’issue des expérimentations, une femelle gorgée de l’espèce Culicoides obsoletus apondu et a été retrouvée faiblement positive lors de la recherche du génome du virus de laFCO. Les résultats obtenus ainsi que les difficultés rencontrées lors de la réalisation de cetype d’expérimentation sont discutés.Le deuxième travail exposé s’est intéressé au comportement trophique des Culicoides parl’étude de l’origine du repas sanguin de femelles de Culicoides piégées dans des biotopesvariés. A cette fin, nous avons utilisé des marqueurs moléculaires pour amplifier l’ADN devertébré présent dans les estomacs de femelles gorgées. Ces analyses ont permis de mettre enévidence que des espèces appartenant aux complexes Obsoletus, Pulicaris, ou encore,Culicoides dewulfi, avaient un spectre d’hôte large. Certaines d’entre elles peuvent se gorger àla fois sur les ruminants domestiques et sur la faune sauvage. De plus, ce type d’étuderenseigne sur l’écologie des différentes espèces de Culicoides.Enfin, nous présentons les résultats d’une étude faunistique fondée sur des captures avec despièges lumineux, mais aussi, des prélèvements de boue pour la recherche des gîtes larvaires.Les résultats de piégeages entre les deux exploitations ont été comparés, notamment en termesde biodiversité, et sont discutés en regard des différences de pratiques d’élevage entre lesdeux exploitations choisies d’une part, et la mise en évidence des gîtes larvaires d’autre part.De nombreuses espèces de Culicoides ont émergé au laboratoire à partir des prélèvements deboues, qui ont été caractérisés macroscopiquement. Les gîtes larvaires de C. obsoletus, peuconnus jusqu’alors, ont été mis en évidence dans les deux fermes. Ils ont fait l’objet d’un suivisur plusieurs mois.L’ensemble de ces études contribue à la meilleure connaissance des Culicoides présents dansles Ardennes et de leur biologie, elles permettent de rendre compte des espèces qui semblenttrès inféodées à l’élevage de bovins, et celles qui sont plus ubiquistes. Certains travauxprésentés pourraient être poursuivis pour mettre en évidence les espèces ou populations deCulicoides plutôt sylvatiques, et pour mettre en place de nouvelles expérimentations sur lacompétence et la capacité vectorielle des Culicoides
Since the late 90’s, Bluetongue disease (BT) can be considered as an emerging arbovirose inEurope. This disease is mainly transmitted to ruminants by the bites of minute size midges,the Culicoides (Diptera: Ceratopogonidae), also known as biting midges. An outbreak of BTserotype 8 occurred during summer 2006, in the region of Maastricht (Netherlands) andspread quickly to the Ardennes region. The epizooty lead to severe losses in cattle and sheepholdings. These events highlighted the lack of knowledge on the vectorial capacity ofpaleartic Culicoides species, and more generally on their biology.Three approaches are successively treated in this document. They are all based on field workconducted mainly in two holdings located in the Ardennes region.First, an experiment to assess oral susceptibility of Culicoides to Bluetongue virus (BTV) 8was undertaken. Field collected and emerging Culicoides coming from the Ardennes wereengorged on viremic small ruminants. At the end of the experiments, one Culicoides obsoletusfemale was found bloodfed and laid eggs. She was tested for BTV and was found weaklypositive for BTV genome. This result and the difficulties met during the experiment havebeen discussed.The second study focused on the bloodmeal origin of engorged females of Culicoides. Thesewere collected by light traps set in different kinds of environment. Molecular markers wereused in order to amplify the DNA of vertebrates present in the stomach of bloodfed females.Some of the species processed belonging to the Obsoletus or the Pulicaris complex, andCulicoides dewulfi fed on a wide variety of hosts, including domestic ruminants and wildanimals. Moreover, this kind of study brings information on the ecology of different speciesof Culicoides.Finally, a faunistic survey is presented. It was achieved through light trap collections ofmidges and also thanks to the sampling of potential breeding sites. Biodiversity in thecollection of midges captured by light traps between the two holdings were compared.Differences observed are discussed taking into account the differences in breeding practicesbetween the two holdings and the breeding sites investigations. Numerous species ofCulicoides emerged in the laboratory from soil samples which were macroscopicallydescribed. Breeding sites of C. obsoletus, which were not well documentated in the literature,were found in both farms. These were monitored over some months.This work contributes to a better knowledge of the Culicoides present in the Ardennes andtheir biology. It highlights the species which are closely related to the cattle holdingenvironment, and those which are ubiquist. Some of these studies could be continued in orderto highlight the species more related to the forested areas, and to set new experiments onvectorial competence and capacity

La fièvre jaune est une pathologie virale humaine causée par un flavivirus, le virus de la fièvre jaune et transmise par des vecteurs arthropodes. Les formes sévères, parfois mortelles, sont caractérisées par une atteinte systémique aigüe qui affecte le foie. Bien que la vaccination existe depuis près de 80 ans, des recensements réguliers d'épidémies sont encore faits. Les vaccins à base d'une souche vivante atténuée YF 17D présentent d'excellents taux de séroconversion et sont notamment caractérisés par une forte diminution de l'hépatotropisme. Néanmoins les mécanismes associés à la pathogénèse hépatique sont encore mal compris et pourraient être une aide aux développements vaccinaux contre d'autres flavivirus ou virus hépatiques. L'étude développée ici s'est inscrite dans la problématique de la représentativité des modèles cellulaires hépatiques utilisés. Afin de répondre aux pertes métaboliques et immunitaires reportées dans plusieurs modèles, nous nous sommes orientés vers des modèles organotypiques associant plusieurs populations cellulaires hépatiques et un microenvironnement caractéristique. Les modulations induites par les souches vaccinales ou sauvages du virus de la fièvre jaune ont été évaluées par une approche transcriptomique globale utilisant la technologie RNASeq et des méthodes d'analyse définies. Nos résultats montrent une plus forte permissivité des modèles cellulaires à la souche atténuée YF 17D par rapport à la souche sauvage YF Asibi. Cette observation est associée pour la souche atténuée à l'établissement précoce d'une réponse antivirale complète impliquant une détection rapide des formes réplicatives du virus, la mise en place des réponses aux IFNs de type I et de type III, la clairance virale et un contrôle des métabolismes cellulaires et hépatiques. De son côté la souche sauvage présente un délai important dans l'établissement de ces réponses amenant à de potentiels mécanismes alternatifs de la clairance virale et de dérégulations métaboliques. Ces données mettent en exergue les interactions étroites qui existent entre les systèmes immunitaires et métaboliques au niveau du foie. Nous suggérons que la forte réponse antivirale induite par la souche atténuée pourrait contribuer à la rupture de la tolérance hépatique et à l'efficacité in vivo de la souche vaccinale. En outre, la cinétique des réponses immunitaires, en combinaison avec la charge virale, peuvent déterminer l'équilibre entre la récupération et l'immunopathologie après l'infection par le virus sauvage
Yellow fever is a human disease caused by a flavivirus, the yellow fever virus, transmitted by arthropod vectors. Severe forms, sometimes fatal, are characterized by acute systemic disease that affects the liver. Despite an effective vaccine being available for nearly 80 years, epizootic circulation occurs and results in periodic outbreaks in endemic regions and among travelers. Vaccines based on a live attenuated strain YF 17D exhibit excellent seroconversion rate and are characterized by a strong decrease in hepatotropism. However the mechanisms involved in liver pathogenesis are poorly understood and could be helpful for future vaccine development against other flaviviruses or hepatitis viruses.There is a need to develop liver cellular model better reflecting the in vivo liver microenvironment. In this work, we used new 3D models combining several liver cell populations to evaluate immune and metabolic responses induced by yellow fever viruses. Modulations induced by both vaccine and wild-type strains were evaluated by a global transcriptomic approach using RNA-Seq technology and well-defined analysis methods. Our results show a greater permissivity of cellular models to YF 17D strain compared to the wild type YF Asibi. In addition, YF 17D infection leads to an early establishment of a complete antiviral response involving rapid detection of replicating forms of the virus, development of a strong type I and type III IFN responses, initiation of viral clearance and modulation of cellular and liver metabolism. Wild-type strain presents a significant delay in the establishment of these responses leading to potential alternative mechanisms for viral clearance and metabolic dysregulation. These data highlight the close interactions between the immune and metabolic systems in the liver.We suggest that the strong antiviral response induced by attenuated strain could contribute to the breakdown of liver tolerance and in vivo efficacy of the vaccine strain. In addition, the kinetics of immune responses, in combination with viral load, can determine the balance between the recovery and immunopathology after infection with wild type virus

Le virus de la fièvre de la vallée du Rift appartient à la famille des Bunyaviridae et est le prototype du genre Phlebovirus. C'est un arbovirus, transmis à l'homme et au bétail par des moustiques, est à l'origine de nombreuses épizooties/épidémies. Le génome à ARN monocaténaire est fragmenté en trois segments : Large (L), Médium (M) et Small (S). Les segments L et M sont de polarité négative alors que le segment S adopte une stratégie de codage ambisens. La région 5' du brin génomique contient l'ORF de la protéine Non Structurale S (NSs) tandis que la région 5' du brin antigénomique comprend l'ORF de la Nucléoprotéine (N). Les deux ORFs sont séparées par une région intergénique de 82 nucléotides riche en nucléotides C (dans le sens génomique). La polymérase virale initie la transcription des ARNm par le mécanisme de capture de coiffe. Les ARNm viraux ainsi produits sont tous subgénomiques et ne sont pas polyadénylés à leur extrémité 3'. Ainsi, la transcriptase reconnait des signaux de terminaison de la transcription et arrête la synthèse des ARNm avant d'atteindre l'extrémité 5 de chaque matrice. Ces travaux identifient le site de terminaison des ARNm N et NSs respectivement au sein de l'IGR du segment S. Ils mettent aussi en évidence le rôle du motif 5'-GCUGC-3' qui doit être précédé d'une séquence riche en nucléotides C (ou G) dans la terminaison de la transcription des ARNm N et NSs. Il s'avère que, dans'cette séquence, le nombre et certaines positions des nucléotides C (ou G) sont essentiels pour que la polymérase reconnaisse le motif 5'-GCUGC-3 ' comme un signal de terminaison de la transcription
The Rift Valley Fever Virus (RVFV) belongs to the Bunyaviridae family and is the prototype of the genus Phlebovirus. RVFV is an arbovirus transmitted by mosquitoes to humans and livestock that causes dramatic epidemies and epizootics. The RVFV genome comprises two segments of negative-sens RNA, designated Large (L), Medium (M) and, as a special feature for Phlebovirus es, the S segment has an ambisense polarity. The genome S serves as a template for N gene transcription. The antigenome S serves as a template for NSs gene transcription. A C-rich intergenic région (IGR) separates the two ORFs. The polymérase initiates transcription by the cap snatching mechanism. All of the viral mRNAs are subgenomic molecules and do not possess 3' poly(A) tails. This means that the transcriptase recognises termination signals and stops the transcription before the 5' end of each viral template. The present study determined the 3 ' termini of the N and NSs mRNAs in the IGR of the S segment. It also suggested the importance of the pentanucleotide séquence 5'-GCUGC-3' which must be associated to a rich C or G sequence for the N and NSs transcription terminations. The number and the positions of the nucleotides C (or G) are essential in this sequence for the pentanucleotide recognition like a transcription termination signal

Le Virus de la Fièvre de la Vallée du Rift (VFVR) est un virus appartenant à la famille des Bunyaviridae et au genre Phlebovinis. Cet arbovirus, transmis par les moustiques, infecte l'homme et les ruminants et est à l'origine de nombreuses épidémies/épizooties. Le segment S utilise une stratégie ambisens afin de coder la nucléoprotéine N ainsi que la protéine non structurale NSs. Bien que le cycle viral soit exclusivement cytoplasmique, NSs forme des filaments nucléaires. Cette protéine est à l'origine d'au moins deux mécanismes délétères lors de l'infection de cellules de mammifère. En interagissant avec la sous-unité p44 du facteur général de transcription TFIIH, NSs induit progressivement l'inhibition de la transcription générale. De plus, nos résultats mettent en évidence la fonction d'antagoniste de l'interféron P (IFN(3) de cette protéine. Cette dernière interagit avec les protéines cellulaires SAP30, appartenant aux co-répresseurs, et le facteur de transcription YY1. Ces interactions sont à l'origine de l'inhibition de l'expression de l'IFNp. Contrairement à ce qui est observé chez le mammifère, l'infection de cellules de moustique semble asymptomatique. Afin de déterminer les événements moléculaires à l'origine de ce contraste frappant, nous avons étudié l'infection de cellules de moustique et montré la conservation des interactions entre NSs et les orthologues de p44 et de SAP30 dans ces cellules. Dans les cellules d'arthropode, le mécanisme d'inhibition transcriptionnelle est semblable à celui observé dans les cellules murines. Toutefois, la protéine NSs est progressivement éliminée, ce qui entraîne la levée de l'inhibition délétère
The Rift Valley Fever Virus (RVFV) is an arbovirus transmitted by mosquitoes to humans and livestock that causes dramatic epidemies and epizootics. As a member of the Phlebovirus genus of the Bunyaviridae family, the short segment (S) of its genome has an ambisens coding strategy for the nucleoprotein N and the non structural protein NSs. The later present an unusual localization to the nucleus, where it forms filamentous structures in mammalian cells. Through the interaction with several cellular factors, the NSs protein can be considered as a virulent factor. Interaction of NSs with p44, a subunit of the general transcription factor TFIIH, induces a progressive inhibition of the cellular RNA synthesis. NSs is also responsible of a specific inhibition of the interferon (3 (IFN(3) pathway when interacting with SAP30 and the transcription factor YY1, both required for the cell antiviral response. Contrary to mammals, the infection of mosquito cells by the RVFV remains asymptomatic. As the filamentous structure in the nucleus vanishes early after infection of mosquito cells, we analyzed the interaction of the NSs protein with the mosquito orthologs of the p44 and SAP30. A transient shutoff of the transcription is associated when NSs is present in the nucleus of mosquito cells, whereas the cleafance of NSs correlates with RNA synthesis restoration. These findings highlight the role of the NSs protein for differential pathogenesis observed between arthropod and mammal

La réponse antivirale innée constitue la première réaction d’une cellule à une infection virale. Il s’agit d’une réponse rapide, transitoire, non-spécifique, ubiquitaire qui a été conservée sous différentes formes au cours de l’évolution. La synthèse d’interféron β (IFNβ) joue un rôle essentiel dans l’établissement de la réponse antivirale innée chez les vertébrés. L’expression du gène Ifnb1 codant pour l’IFNβ est finement régulée au niveau transcriptionnel, ce qui permet de passer de la répression de son expression en absence d’infection à son activation après infection par un virus. Bien qu’une forte et rapide expression d’IFNβ soit bénéfique lors d’une infection virale, une expression anormale d’IFNβ peut entrainer des troubles physiologiques importants (réactions auto-immunes, dérégulations inflammatoires). En s’intéressant plus particulièrement à la séquence promotrice du gène Ifnb1, codant pour l’IFNβ, nous avons identifié deux sites de liaison potentiels pour les facteurs de la famille des TCFs (T-Cell Factor). En présence de β-caténine nucléaire, les complexes TCF/β-caténine se forment au niveau des sites de liaison aux TCFs et recrutent des complexes co-activateurs de la transcription. Dans une première partie de ce travail, nous avons étudié le rôle des complexes TCF/β-caténine dans la régulation de l’expression d’Ifnb1 aussi bien en absence que suite à une infection virale. Nous avons ensuite montré que ce mécanisme était fonctionnel car il permettait aux cellules traitées par un inhibiteur de GSK3 (qui induit une accumulation de β-caténine) de mieux se protéger contre l’effet cytopathique induit par le VSV. Lors de l’étude des fonctions biologiques ciblées par le Virus de la Fièvre de la Vallée du Rift (VFVR) auquel j’ai participé, il est apparu que cet arbovirus hautement pathogène ciblait via sa protéine non-structurale NSs, les promoteurs de gènes codant pour des nombreux acteurs de la voie Wnt/β-caténine et de l’adhésion cellulaire. Dans une deuxième partie de ce travail, j’ai analysé l’effet d’une infection par la souche pathogène (+NSs) ou non-pathogène (-NSs) du VFVR sur le taux de β-caténine et la présence de celle-ci au niveau des jonctions adhérentes. Les résultats obtenus montrent que l’infection par la souche pathogène de VFVR entraine une diminution du taux global de β-caténine ex et in vivo ainsi que la redistribution de celle-ci en dehors des jonctions adhérentes, couplée à une très forte désorganisation du cytosquelette d’actine de la cellule infectée. Cette perturbation du réseau d’actine est corrélée à la dérégulation de l’expression de certains gènes codant pour des protéines affectant la morphologie cellulaire
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Les Flavivirus neuropathogènes, tels que le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), le virus West Nile (WNV), le virus de la fièvre jaune (YFV) et le virus Zika (ZIKV) causent des maladies neurologiques. Ces maladies sont dues à une infection des cellules du système nerveux central (CNS) par ces virus. Le CNS est un organe privilégié, isolé des agents pathogènes par une barrière entre le sang et le cerveau, appelée barrière hémato-encéphalique (BBB). Les Flavivirus neuropathogènes capables de traverser cette BBB afin d’atteindre leurs cellules cibles, localisées dans le CNS, sont neuroinvasifs. Le but de cette étude est de comprendre les mécanismes cellulaires permettant aux Flavivirus de traverser la BBB et les effets de l’infection par les virus ZIKV et WNV des cellules du CNS sur le développement de celles-ci.Le YFV est un virus hépatotrope, infectant majoritairement le foie et les reins. Deux vaccins vivants atténués dirigés contre le YFV, le vaccin FNV (pour French Neurotropic Virus) et le vaccin 17D, ont été obtenus empiriquement par passages successifs de souches virulentes de YFV sur cerveaux de souriceaux. Ces vaccins ne causent plus de maladies touchant les reins et le foie, mais peuvent parfois causer des encéphalites post-vaccinales. Ces cas d’encéphalites démontrent que ces souches vaccinales sont devenues neurovirulentes mais aussi neuroinvasives car les virus ont pu franchir la BBB. A cause d’une incidence trop élevée d’encéphalites post-vaccinales par rapport au vaccin 17D, le vaccin FNV a été retiré du marché dans les années 1980.Le JEV est un virus neurotrope, causant des encéphalites graves en Asie du Sud-Est. A ce jour, il existe un vaccin vivant atténué, le JEV SA14-14-2, obtenu empiriquement par passages successifs d’une souche virulente sur cellules de hamster. Ce vaccin est moins neurovirulent et moins neuroinvasif que les souches virulentes de JEV en modèle de souris, et protège contre des infections humaines par le JEV. Cependant, des cas d’encéphalites ont été rapportés après injection de ce vaccin. Il apparait donc que, dans certains cas, la souche vaccinale JEV SA14-14-2 est capable de traverser la BBB et d’infecter les cellules neuronales. Les dernières épidémies à virus ZIKV en Polynésie Française et en Amérique du Sud ont induit une augmentation de cas de malformations congénitales dans les zones touchées. Cela a soulevé de nouvelles questions quant à la capacité d’un Flavivirus à provoquer des malformations congénitales du CNS. Dans cette étude, nous avons identifié les mécanismes cellulaires permettant aux Flavivirus de traverser la BBB et les effets de l’infection par les virus ZIKV et WNV des cellules du CNS sur le développement de celles-ci.Nous avons utilisé deux systèmes in vitro permettant d’étudier le développement du CNS et la neuroinvasion des Flavivirus. Un premier système consiste en l’infection de coupes de cerveaux d’embryon de souris. En utilisant ce système, nous avons montré que le ZIKV a un tropisme préférentiel pour les cellules progénitrices de neurones, alors que le WNV a un tropisme préférentiel pour les neurones. Nous avons également montré que l’infection des progéniteurs neuronaux par le ZIKV induit un arrêt de la mitose cellulaire, alors que l’infection par le WNV n’a aucun effet sur la mitose. L’étude sur l’effet apoptotique de l’infection par les deux virus WNV et ZIKV n’a montré aucune différence entre les deux virus à des temps précoces d’infection.Un deuxième système a été mis au point pour l’étude de la neuroinvasion par les Flavivirus neuropathogènes. Ce système est composé de cellules endothéliales hCMEC/D3 pouvant former des jonctions serrées. Ces cellules ont été cultivées sur filtres d’insert de puits de culture cellulaire Transwell, placés au-dessus de cellules neuronales humaines. A l’aide de ce système, nous avons comparé la capacité à traverser la BBB de plusieurs Flavivirus
Neuropathogenic Flaviviruses, such as Japanese encephalitis virus (JEV), West Nile virus (WNV), yellow fever virus (YFV) and Zika virus (ZIKV), cause neurological diseases. These diseases are due to viral infection of central nervous system (CNS) cells. The CNS is a privileged organ, isolated from pathogenic agents by a barrier between the blood and the barrier, called the blood-brain barrier (BBB). Neuropathogenic Flaviviruses which can cross this BBB in order to reach their target cells in the CNS, are neuroinvasive. This study aims at understanding the cellular mechanisms by which YFV and JEV Flaviviruses cross the BBB and the effects of viral infection by WNV and ZIKV of the CNS cells during neocortex development.YFV is a hepatrotopic virus, which mostly infects the liver and the kidneys. The two live-attenuated vaccines against YFV, the FNV (for French Neurotropic Virus) vaccine and the 17D vaccine, were obtained empirically by several passages in suckling mouse brain of YFV virulent strains. These vaccines do not cause any disease targeting the liver or the kidneys, but can sometimes cause post-vaccine encephalitis. These encephalitis cases suggest that the vaccine strains have become neurovirulent and neuroinvasive. Due to high risks of post-vaccine encephalitis, the FNV vaccine use was discontinued in the 1980s.JEV is a neurotropic virus, causing acute encephalitis in South East Asia. To date, there is a live-attenuated vaccine against JEV, the JEV SA14-14-2 vaccine, which was obtained empirically by several passages in primary hamster kidney cells. This vaccine is less neurovirulent and less neuroinvasive than JEV virulent strains in mouse model, and it protects against JEV infections. However, some cases of post-vaccine encephalitis were reported. It thus seems that, in some cases, the vaccine strain JEV SA14-14-2 is able to cross the BBB and infect neuronal cells.The recent ZIKV epidemics in French Polynesia and South America were linked to an increase in the number of congenital malformations, rising questions regarding the capacity of a Flavivirus to induce CNS congenital malformations.In this study, we have identified cellular mechanisms involved in Flavivirus neuroinvasion and studied the effect of ZIKV and WNV infection of neuronal cells under development.To study CNS development, we have infected mouse embryos brain slices. We were able to show that ZIKV has a preferential tropism for neuronal progenitors, whereas WNV has a preferential tropism for neuronal cells. We also show that infection of neuronal progenitors by ZIKV impairs the cell life cycle, whereas no effect on the cell life cycle was observed for WNV-infected cells. Studies on apoptosis induction did not show any difference between both viruses at early time points of infection.To study Flavivirus neuroinvasion, we have used an in vitro model of BBB composed of human endothelial hCMEC/D3 cells that can form tight junctions. These cells were cultivated on Transwell inserts and placed above human neuronal cells. Using this system, we show that YFV FNV cross the BBB more efficiently than YFV 17D, suggesting that YFV FNV is more neuroinvasive than YFV 17D. This observation can explain the higher post-vaccine encephalitis risks associated with YFV FNV vaccine compared to YFV 17D vaccine. We also confirmed that JEV SA14-14-2 vaccine strain is less neuroinvasive than JEV RP9.We also examined how JEV crosses the BBB and the endothelial cell response following JEV treatment. We show that both JEV RP9 and SA14-14-2 are able to cross the BBB without infecting its endothelial cells and without disrupting the BBB. Preliminary results suggest that JEV RP9, but not JEV SA14-14-2, crosses the BBB by dynamin-dependant transcytosis. Transcriptomic analysis of endothelial cells treated by either virus show slight, but significant, differences in regulation of genes implicated in several pathways associated with CNS diseases

Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift (VFVR) est un arbovirus appartenant à la famille des Bunyaviridae, genre Phlebovirus. Présent en Afrique, il est transmis par les moustiques et infecte l'homme et les ruminants. Le génome viral est composé de trois segments d'ARN simple brin de polarité négative: le segmente L code pour une ARN polymérase ARN dépendante, M pour le précurseur des glycoprotéines d'enveloppe et S pour la nucléoprotéine N et la protéine non structurale NSs. Un système de génétique inverse pour le VFVR a été établi en utilisant des protéines produites par des virus de la vaccine recombinants (Lopez et al. 1995). Ce model a démontré que les protéines L et N sont nécessaires et suffisantes pour transcrire un minigénome mimant un ARN S viral contenant le gène rapporteur CAT en orientation antisens flanqué des séquences non codantes du segment S mais l'efficacité de transcription était faible. Nous avons développé un système de minigénome complet basé sur la transfection de plasmides. Les protéines virales sont exprimées par l'ARN polymérase T7. Les minigénomes LCAT, MCAT et SCAT mimant les trois segments viraux L, M et S sont synthétisés par des plasmides sous le contrôle de l'ARN polymérase I cellulaire. Dans ces conditions, les minigénomes sont transcrits et répliqués. La terminaison de la transcription des ARNm est également similaire à celles des ARNm viraux. L'efficacité de transcription du minigénome L est supérieure à celle de S et de M. Nous avons mis en évidence que la force de transcription des promoteurs déterminée avec les minigénomes joue un rôle important dans la régulation du taux de synthèse des ARN viraux dans les cellules infectées
The Rift Valley fever virus (RVFV) is a phlebovirus of the"BunyaviridaëJarnlly present in Africa and transmitted by mosquitoes and affecting cattle and humans. The viral genome is composed of three segments of RNA of negative polarity: the L segment codes for a RNA polymerase RNA dependent, the M segment for the glycoproteins precursor and the S segment for the nucleoprotein N and the non structural protein NSs. A reverse genetics System for the RVFV was developped using recombinant vaccinia viruses expressing viral proteins (Lopez et al. 1995). This model showed the N and L proteins are necessary and sufficient to transcribe a minigenome mimicking a viral S segment containing the CAT reporter gene in the non coding orientation and flanked by the non coding regions of the S segment. We developed a complete minigenome System for the RVFV based on transfection of plasmids. Viral proteins are expressed under T7 polymerase control. LCAT, MCAT and SCAT minigenomes, mimicking the three viral segments L, M and S, are synthetized with plasmids under the cellular RNA polymerase I control and are transcribed and replicated. The termination of mRNA transcription was also similar to viral one. Transcription efficiency of the LCAT minigenome was stronger than the S one and the M one. We showed that promoters strength determined with this System play an important role in levels of viral RNAs produced during cellular infection

Les phlébovirus présentent sont présents dans toutes les régions du globe. Certains phlébovirus transmis par phlébotomes provoquent une maladie fébrile et des infections du système nerveux central. Depuis, de plus en plus de données montrent que la péninsule des Balkans joue un rôle majeur dans l'émergence de maladies à transmission vectorielle. Au début de ce travail, on comptait un nombre très limité de phlébovirus identifiés et isolés dans cette région. Une étude intégrée et transdisciplinaire en vue d'un inventaire des virus circulant dans pays des Balkans. (i) Un total de 3,850 phlébotomes sont été recueillis dans sept pays des Balkans en 2014 et 2015. Ils ont été testés pour la présence d'ARN viral et inoculé sur des cellules VERO afin d'isoler le virus détecté; (ii) des études de séroprévalence utilisant des tests de neutralisation ont été effectuées sur des échantillons de bovins et de moutons pour évaluer à deux agents pathogènes humains : le virus Toscana (TOSV) et le virus Sandfly fever Sicilian virus (SFSV). Nos résultats se composent de (i) la découverte et le séquençage de 3 nouveaux phlébovirus appartenant à 2 espèces différentes, (ii) la première identification du genotype B de TOSV en Croatie, (iii) la preuve de la co-circulation de deux genotypes (B et C) de TOSV, (iv) des taux d'anticorps neutralisants qui sont beaucoup plus élevés chez les bovins et les moutons pour le SFSV que pour TOSV. En conclusion, les résultats obtenus au cours de ce travail démontrent qu’es les Balkans représentent une zone de très importante activité pour les phlebovirus et donc mérite une surveillance particulière à cause du risque d’émergence et de dissémination
Phleboviruses have a worldwide distribution. In the areas where sand flies are present, some of the sandfly-borne phleboviruses cause febrile illness and central nervous system infections. Sandfly fever was first reported in the Balkan Peninsula at the end of the 19th century. Since there is accumulating data showing that the Balkan peninsula plays a major role in the emergence of vector-borne diseases. At the outset of this work, a very limited number of phleboviruses had been identified and isolated in this region. To fill this gap, an integrated and transdisciplinary study was designed aiming at an inventory of viruses circulating in Balkans and associated seroprevalence studies using domestic animals: (i) a total of 3,850 sandflies were collected in seven Balkan countries (Albania, Bosnia-Herzegovina, Croatia, Kosovo, Montenegro, Republic of Macedonia and Serbia) in 2014 and 2015. They were tested for the presence of viral RNA and inoculated on VERO cell for virus isolation; (ii) seroprevalence studies using neutralisation tests were performed on cattle and sheep samples to assess the level of exposure to two human pathogens, Toscana virus (TOSV) and Sandfly fever Sicilian virus (SFSV). Our results consist of (i) the discovery and sequencing of 3 novel phleboviruses belonging to 2 different species, (ii) the identification for the first time of TOSV lineage B in Croatia, (iii) evidence of co-circulation of two lineages (Lineage B and C) of TOSV, (iv) rates of neutralising antibodies that are much higher in cattle and sheep for SFSV than for TOSV. Together the findings obtained during this work demonstrate that the Balkan area is a hot spot for phleboviruses

La première partie de mon travail a consisté (i) en une étude génomique des souches de TOSV avec séquençage de 10 nouvelles souches afin i) d’enrichir les données disponibles dans Genbank (au début de ce travail, 6 séquences complètes); (ii) d’utiliser les 16 séquences complètes pour définir et évaluer le premier système de typage par technique de RT-q PCR en temps réel afin de discriminer les souches de LA et de LB. Dans la deuxième partie de ce projet, on s’est intéressée à des études structurales et fonctionnelles de la nucléoproteine (N) de TOSV afin d’élucider le mécanisme d’encapsidation d’ARN virale. La N est une protéine de 28 KD, sont rôle majeur est l’encapsidation de l’ARN génomique et sert en tant que co-facteur de la transciption/replication de TOSV. Les études crystallographique de la protéine N , du complexe protéique (N-ARN) ont été déterminé par Olal D et al 2014 au moment que nous avons obtenu la diffraction de crystal de la N sans ARN à 3,7 Å (code PDB: 5FVA). Ces études montrent la protéine N ainsi le complexe (N-ARN) en forme d’un anneau hexamèrique fermé alors encapside l'ARN dans une organisation filamenteux. Nous avons donc décidé de combiner ces résultats avec des études structurales complémentaires en solution , telles que la microscopie électronique (EM) et des études de « Diffusion des rayons X aux petits angles »(SAXS) pour de proposer un modèle décrivant correctement le mécanisme d'encapsidation en solution . Le protéine N se comporte principalement en pentamère déformé et ouvert, qui met en lumière la façon dont nucléoprotéine peut être organisée en filaments
The first part of my work consisted (i) of genomic sequencing of 10 TOSV strains to increase the total number of complete sequences (at the outset, 6 complete sequences were accessible in Genbank). (ii) to use the 16 sequences to design and evaluated the first lineage-specific real-time RT-PCR assay (Lisp-TOSV) to discriminate between strains of lineages A and B Complete sequencing of the 10 strains was achieved. The second part of this project was dedicated for structural and functional studies of the TOSV N protein in order to decipher viral RNA encapsidation. TOSV Nucleoprotein (N) is a protein of 28 KD, is encapsidating the viral RNA genome and serves as a co-factor the RNA trancription/replication. The crystal structures of TOSV N protein , and the complex N-RNA were already determined (Olal D and al; 2014) while we just obtained diffracting crystal of the N free RNA at 3,7 Å (PDB code : 5FVA ). Crystallographic structures show an hexameric rings whereas N encapsidates the RNA in a filamentous organization. We therefore decided to combine these results with complementary studies, such as electron microscopy (EM) and samll angle X-ray scattering to build a low resolution structure model in solution describing properly the encapsidation mechanism. The N behaves mainly as an opened, deformed pentamer that shed light on how the N can be organized in filaments

Circulation des Phlébovirus en Turquie, l'Iran et l'Algérie a été étudiée. L'isolement, la caractérisation génomique, les relations phylogénétiques de six virus ont été présentées: le virus Adana (ADAV), deux souches de virus Toros (TORV), le virus Zerdali (ZERV) de la Turquie; le virus Dashli (DASHV) de l'Iran; le virus Toscana (TOSV) d'Algérie. Cette étude a commencé avec la collection de 38,131 phlébotomes de la nature. La méthode de séquençage de nouvelle génération (NGS) à haut débit nous à été utilisée pour l’analyse des génomes complet des virus isoles. En conclusion, cette étude a d'importantes contributions sur phlébovirus négligées. Voici quelques-unes des contributions significatives; (i) ZERV et TORV qui sont étroitement apparentés au virus Tehran (THEV) et le virus Corfou (CFUV), respectivement, ont été isolés depuis 56 et 30 ans des premiers isolements de THEV et CFUV, respectivement, (ii) Détection du virus ADAV un animal domestique et sur quelques sérums humain par test de neutralisation. Ce virus ADAV constitue avec le virus le virus (SALV), le virus Arbia (ARBV), et le virus (ADRV) le groupe Salehabad. Seul le virus ADRV a été détectée dans le liquide cérébro-spinal auparavant landais que avec les autres, aucune preuve pathogène n’a été détectée, (iii) Nous avons découvert la plus récente circulation phlébovirus en Iran après 56 années, (iv) TOSV a été isolé en Algérie pour la première fois et la circulation a été confirmée par séropositivités dans le sérum humain
Sandfly-borne phlebovirus circulation in Turkey, Iran, and Algeria was investigated. The isolation, genomic characterization, phylogenetic relationships of 6 viruses was presented: Adana virus (ADAV), two strains of Toros virus (TORV), Zerdali virus (ZERV) from Turkey; Dashli virus (DASHV) from Iran; Toscana virus (TOSV) from Algeria. This study has begun with the collection of 38,131 sandflies from nature. The well established, high-throughput methodology was applied for the discovery of viruses including PCR tools and cell culture methods. Next generation sequencing (NGS) technology facilitated to perform complete genome analysis of the isolated viruses. In conclusion, this study has contributions to the neglected sandfly-borne phlebovirus group and filled some gaps about the circulation of these agents in Turkey, Iran, and Algeria. Following are some significant contributions; (i) ZERV and TORV which are closely related to Tehran virus (THEV) and Corfou virus (CFUV), respectively were isolated after 56 and 30 years of the first isolations of THEV and CFUV, respectively, (ii) There was no evidence of the pathogenicity of Salehabad virus (SALV) and Arbia virus (ARBV) except the detection of Adria virus (ADRV) in CSF until ADAV which belongs to the Salehabad serocomplex was detected in domestic animal and very few human sera by neutralization assay, (iii) We have discovered the most recent sandfly-borne phlebovirus circulation in Iran after 56 years, (iv) TOSV was isolated in Algeria for the first time and circulation was confirmed by seropositivities in human sera