Academic literature on the topic 'Flödescytometri'

Introduktion: Lymfocyter är celler som ingår i immunförsvar mot patogener och kan delas in i T- och B-lymfocyter. Lymfom är solida neoplasier som framför allt kan drabba lymfocyterna och olika lymfom uttrycker olika immunofenotyper. Flödescytometri är en mycket effektiv teknik för att särskilja olika lymfom. Tekniken kan differentiera celler i en vätskeström genom att dessa bestrålas med monokromatiskt ljus av olika våglängder. Ljusbrytningen framåt och 90° åt sidan ger information om cellernas storlek respektive innehåll, medan fluorokromkonjugerade antikroppar identifierar immunofenotyperna på cellerna. Fluorokromer exciterar ljus av en viss våglängd och emitterar ljus av en längre våglängd. Studien syftade till att applicera flödescytometern FACSCanto II:s tredje laser, så att fler fluorokromer ska kunna användas vid antikroppsbaserad lymfomdiagnostik. Material och metod: Provmaterialet var lymfkörtlar och benmärg. Åtta patientfall med lymfomfrågeställning i anamnesen, samt ett normalblod som kontroll, analyserades med LST:s antikroppsreagens parallellt med befintlig antikroppsreagens. De instrument-inställningar som behövdes gjordes under två dagar under handledning av en applikationsspecialist från företaget BD Biosciences. Resultat: De nya fluorokromerna separerade lymfocytpopulationerna bra i diagrammen. Det kunde inte påvisas någon signifikant skillnad mellan LST- och den befintliga antikroppsreagensen. Diskussion och slutsats: Antalet prover kan ha varit lite för lågt för de statistiska slutsatser som dragits. Resultatet verkar ändå lovande för klinisk applicering av den tidigare oanvända lasern hos FACSCanto II. LST-rörets antikroppsreagens saknade några viktiga CD-markörer samt innehöll CD-markörer som upplevdes som överflödiga. LST-rörets fördelar mot nackdelar kommer ändå att övervägas vidare och kan bli aktuell på klinisk patologi i Kalmar.

Ett vanligt återkommande problem inom pappersindustrin är fläckar på den färdiga produkten. BillerudKorsnäs Gävle har genom undersökningar kommit fram till att en del fläckar som just nu uppkommer till stor del består av Alkyl keten dimer, AKD. AKD är ett lim som tillsätts i mälden för att öka hydrofobiciteten hos pappret eller kartongen. AKD partikeln skyddas av ett hölje bestående av katjonisk polymer för att partikeln lättare ska fästa på träfibrerna i processen. Om detta hölje blir instabilt ökar risken för bildning av agglomerat och en sämre retention på pappersmaskinen vilket i sin tur kan orsaka fläckar på den färdiga kartongen. Detta arbete för att undersöka stabiliteten hos AKD har därför gjorts.   För att undersöka stabiliteten hos AKD har olika processparametrars inverkan på AKD partikelns stabilitet undersökts. Tester gjordes på två olika AKD och de processparametrar som testats i detta arbete är temperatur, pH och salthalt. Även prover från processen har tagits ut för att undersöka om rena AKD prover kan relateras till processen. Proverna undersöktes i en flödescytometer för att detektera graden av hydrofobicitet hos partiklarna i proverna.   Resultaten visade att det testade temperaturspannet inte påverkade stabiliteten hos AKD partikeln nämnvärt. Försöken där pH förändrades kunde påvisa påverkan hos stabiliteten. Detta innebär att AKD i processen påverkas, och att uppkomsten av fläckar i kartongen delvis kan bero på instabiliteten hos AKD partikeln vid förändring av pH i processen. Stabiliteten hos ett utspätt prov påverkades inte nämnvärt under ett tidsintervall på 60 dagar.
A recurring problem in the paper industry is spots on the finished product. Through previous studies, Billerudkorsnäs Gävle has detected one of the sources of these stains to be Alkyl keten dimer (AKD). AKD is a glue that is added to the ground pulp to increase the hydrophobicity of the paper or cardboard. The AKD particle is protected by a cationic polymer to make it easier for the particle to attach to the fibers in the process. If the polymer becomes instable, the risk of the AKD particles forming agglomerate increases and the retention in the paper machine decrease, which can lead to stains on the finished cardboard. This work with the aim of investigation of the stability of AKD has therefore been done.   To investigate the stability of AKD, the impact of different process parameters on the AKD particle has been studied. Test has been done with two different AKD, and the process parameters tested in this work were temperature, pH and salinity. Samples from the process has also been studied to investigate if the pure AKD samples could be related to the process. All the samples were analyzed in a flow cytometry to detect the degree of hydrophobicity of the particles in the samples.   The result showed that the tested temperature range did not affect the stability of the AKD particles. The experiments where the pH were changed showed that the stability of the particles were affected. This means that AKD in the process is affected, and that the appearance of stains in the carton may partly be due to the instability of the AKD particle in changing the pH of the process. The stability of a diluted sample was not significantly affected over a 60 day time interval.

HPA1a är ett antigen på trombocytytan som kan orsaka alloimmunisering, såsom neonatal alloimmun trombocytopeni och post-transfusion purpura, vilket kan ge svåra blödningssymptom. I fall med antikroppar mot HPA1a måste kompatibla trombocyter finnas tillgängliga. Syftet med studien var att etablera en flödescytometrisk screeningmetod för fenotypning av HPA1a antigen på trombocyter samt att finna HPA1a negativa blodgivare. Före flödescytometrisk analys poolades två till fem blodprover samman till ett prov och vid förekomst av HPA1a negativa trombocyter i poolen analyserades proverna individuellt. Fluorokrommärkta anti-humana antikroppar mot CD42a och CD61 användes för att särskilja HPA1a negativa trombocyter från HPA1a positiva. Totalt fenotypades 177 blodprover varav sju (4%) typades som HPA1a negativa. Av de sju fynden genotypades fyra vid ett externt laboratorium vilket bekräftade att de var HPA1a negativa. Flödescytometrisk screening av HPA1a är snabb, pålitlig och lämplig för storskalig screening. För att fastställa prevalensen av HPA1a negativa individer behöver mer omfattande studier utföras där en större population ingår. Att ha flera HPA1a negativa blodgivare registrerade ger möjligheten att hjälpa patienter i andra regioner.
HPA1a is an antigen on the platelet surface that can cause alloimmunization, such as neonatal alloimmune thrombocytopenia and post transfusion purpura, which can cause severe bleeding symptoms. In case of antibodies against HPA1a, compatible platelets must be available. The purpose of the study was to establish a flow cytometric screening method for phenotyping HPA1a antigen on platelets and to find HPA1a negative donors. Before the flow cytometric analysis, two to five blood samples were pooled into one sample and in the presence of HPA1a negative platelets in the pool, the samples were analyzed individually. Fluorochrome –labeled anti-human antibodies to CD42a and CD61 were used to distinguish HPA1a negative platelets from HPA1a positive. A total of 177 blood samples were phenotyped, of which 7 (4%) were HPA1a negative. Of the seven findings, four samples were genotyped at an external laboratory confirming that they were HPA1a negative. Flow cytometric screening of HPA1a is fast, reliable and suitable for large scale screening. In order to determine the prevalence of HPA1a negative individuals, more extensive studies need to be performed involving a larger population. By having many registered HPA1a negative donors, it can provide opportunities to help patients in other regions.

Vid blodgivning donerar blodgivare blod frivilligt. Blodet kan sedan användas inom sjukvården för exempelvis blodtransfusion, vilket kräver blodprodukter kompatibla med patienten. Förekomst av leukocyter i blodprodukter medför en ökad risk för febrila transfusionsreaktioner hos transfunderade patienter. Därför krävs det att vid framställning leukocytreducera blodprodukter och utföra kvalitetskontroll. Med analysen B-leukocytpartikelkoncentration (LPK) kan totalantalet leukocyter i helblod beräknas. Flödescytometri är en metod som kan analysera optiska och fluorescerande egenskaper hos exempelvis celler i en suspension, vilket kan användas för att kvantifiera cellantal. BD Leucocount™-Kit (BD Biosciences) är avsett för flödescytometrisk analys av antalet kvarvarande leukocyter i leukocytreducerade blodprodukter. Vid framställning av blodprodukter ska helblodspåsen vila vid rumstemperatur i minst 3 timmar efter blodgivning. I Falun används antingen ett dagsprogram där produktion sker samma dag som blodgivningen, eller ett övernattningsprogram där produktion sker dagen därpå. Prover från 505 kontrollerade erytrocytenheter, samlade i Falun, har påvisat en skillnad i leukocytkoncentration beroende på vilket program som använts. Anledningen till att erytrocytenheternas leukocytinnehåll skiljer sig är inte känt. Syftet med denna studie är därav att undersöka om vilotiden har någon effekt på leukocytkoncentrationen i helblodspåsar. LPK varierade mellan helblodspåsarna. Ett ökande leukocytantal observerades över tid i majoriteten av helblodspåsar, inklusive medelvärde. Däremot kunde inte hypotesprövning påvisa statistisk signifikans. Hypotesen om att leukocytantalet ökar över tid går emot grundläggande hematologi. Utifrån resultaten i denna studie kan inte hypotesen bevisas. Vidare studier bör genomföras.
During blood donation, blood donors donate blood voluntarily. The blood can then be used in healthcare for, for example, blood transfusions, which requires blood products compatible with the patient. The presence of leukocytes in blood products increases the risk of febrile transfusion reactions in transfused patients. Therefore, leukocyte-reduction in blood products is necessary during production. Each blood center must perform quality control on produced blood products. With the analysis B-leukocyte particle concentration (LPK), the total number of leukocytes in whole blood can be calculated. Flow cytometry is a method that can analyze the optical and fluorescent properties of, for example, cells in a suspension, which can be used to quantify cell numbers. The BD Leucocount™-Kit (BD Biosciences) is intended for flow cytometric analysis of the number of leukocytes remaining in leukocyte-reduced blood products. When producing blood products, the whole blood bag should rest at room temperature for at least three hours after the donation. In Falun, either a day program is used where production takes place on the same day as the blood was donated, or an overnight program where production takes place the next day. Samples from 505 controlled erythrocyte units, collected in Falun, have shown a difference in leukocyte concentration depending on the program used. The reason why the leukocyte content of erythrocyte units differs is not known. The purpose of this study is therefore to investigate whether the resting period has any effect on the leukocyte concentration in whole blood bags. The LPK varied between the whole blood bags. An increasing leukocyte count was observed over time in most of the whole blood bags. However, hypothesis testing did not show statistical significance. The hypothesis that leukocyte counts increase goes against basic hematology. Based on the results of this study, the hypothesis cannot be proven. Further studies should be conducted.

Vårdförbundet tilldelade Leo Svahn stipendium 2021 för bästa kandidatuppsats inom biomedicinsk laboratorievetenskap.

Introduction: Hemostasis is a complex system in the body that maintains blood flow and prevents bleeding. Patients with platelet disorders are at the risk of mucocutaneous bleedings and at Clinical chemistry in Linköping platelet function is measured with flow cytometry. The platelet response to various agonists is measured with fluorescently labeled platelet antibodies. The aim of this study was to evaluate the stability of the frozen reagents used for platelet function testing. Further the durability of platelet antibodies after freezing and freeze-drying was tested.   Method: Platelet antibodies were prepared for freezing/freeze-drying in buffer and were analyzed at three different occasions using blood from 2 to 3 individuals with flow cytometry. Agonists and blood were added on the day of analysis. The reagent stability test was evaluated statistically using one-way ANOVA with Bonferronis post-hoc test. Results: The slight drop in percent positive platelets and median fluorescence intensity (MFI) seen over time in the reagent stability test was not statistically significant (p>0,05). All platelet antibodies could be used after freezing/freeze-drying. The results are showing a declining trend, especially for MFI values. Conclusion: The frozen reagents used for platelet function testing is stabile up to 36 months. The results from the freeze-drying/freezing indicate that all platelet antibodies keep some activity but that some are more sensitive than others. Some antibodies could not be evaluated due to concentration of agonist in the sample being too low to induce activation. Due to individual variations further studies with more participants and more agonists in their optimal concentrations are needed.
Bakgrund: Hemostas är ett komplext system i kroppen som upprätthåller blodflödet och förhindrar blödning. Mukokutana blödningar kan uppstå hos patienter som har problem i den primära hemostasen vilket kan bero på trombocydefekter. På Klinisk kemi i Linköping mäts trombocytfunktion med flödescytometri. Trombocyterna aktiveras med olika agonister och svaret på stimuli mäts genom detektion av fluoroforkonjugerade antikroppar. Syftet med denna studie var att utvärdera långtidsstabiliteten av de frysta reagens som används för trombocytfunktionsutredningen, att testa om nya trombocytantikroppar klarar att frysas och att utvärdera reagensens hållbarhet för frystorkning. Metod: Antikroppar frystorkades/frystes i buffert och analyserades vid tre tillfällen med blod från 2 till 3 personer med flödescytometri. Agonist och blod tillsattes på analysdagen. Långtidsstabilitetstestet utvärderades statistiskt med  one-way ANOVA med Bonferronis post-hoc test. Resultat: En svag nedgång över tid i procent positiva trombocyter och MFI i långtidsstabilitetstestet var inte statistiskt signifikant (p>0,05). Alla antikroppar gav signal efter frysning och frystorkning. Främst för MFI syns en nedåtgående trend över tid. Slutsats: Reagenset för trombocytfunktionsutredningen är stabilt upp till 36 månader. Resultat från frystorkningen tyder på att alla antikroppar klarar att frystorkas/frysas men vissa är känsligare än andra. Vissa antikroppar kunde inte utvärderas p.g.a. för låg agonistkoncentration för att inducera aktivering. Ytterligare försök måste göras med fler individer och fler agonister i optimal koncentration p.g.a. individuella skillnader i svar för agonister. Frystorkningsprocessen kan optimeras.

Under vissa omständigheter kan bakterier kan ta sig in i blodbanan där de kan orsaka allvarliga infektioner (bakteriemi). Metoden som används för identifiering och resistensbestämning av bakterier i blododlingar kräver minst 16 timmars inkubation. Fram tills en resistensbestämning utförts kan empirisk antibiotikabehandling användas, men med ökande resistensutbredning blir det alltmer osäkert om denna behandling är verksam. Nyligen har en lappdiffusionsmetod för resistensbestämning direkt från blododling validerats, som kan läsas av efter 4, 6 och/eller 8 timmars inkubation. Det finns även publicerade arbeten där flödescytometriassisterad resistensbestämning används, men då krävs att bakterierna finns i tillräckligt hög koncentration, befinner sig i tillväxtfas och finns som renkultur. Syftet med examensarbetet var att optimera hantering av blododlingsflaskor så att bakterier från blododlingsflaskorna kunde isoleras med tillräcklig kvalitet och koncentration för att kunna utföra resistensbestämning med flödescytometri. Upprening av bakterierna utfördes med olika tvättbuffertar och sedan utfördes resistensbestämning med flödescytometri och  referensmetoden buljongspädning. Resultaten från uppreningen visade att sterilt vatten och Tween20 gynnade bakteriernas återhämtningsförmåga mest. Resistensbestämning utfördes med Klebsiella pneumoniae ATCC700603,  K. pneumoniae CCUG56233 och K. pneumoniae ATCC13882, som tvättats med sterilt vatten och Tween20. För CCUG56233 skiljde 1 spädningssteg i koncentrationsskalan mellan metoderna. ATCC-isolaten erhöll likartade MIC-värden (minimum inhibitory concentration) vid alla analyser men där fanns en skillnad på 2 spädningssteg mellan buljongspädning och analys med flödescytometri. Detta kan förklaras av skillnaden i inkubationstid mellan metoderna. Slutsatsen som kan dras är därför att resultaten från de två metoderna vid resistensbestämning är likartade och att sterilt vatten är mest lämpligt att använda vid upprening av bakterier. Fler undersökningar bör dock utföras.

Flödescytometrisk analys av DNA-ploiditeten används vid diagnostisering av endometriecancer. DNA-ploidi reflekterar cellcykeln och avgör om tumörens cellpopulationen är diploid eller aneuploid, där aneuploiditet förknippas med sämre prognos. Vid analys av paraffininbäddat vävnadsmaterial används avparaffineringsmedlet xylen, vars toxiska egenskaper försämrar arbetsmiljön på laboratoriet. Den har en stark och obehaglig lukt som kan orsaka illamående och yrsel. Syftet med studien var att undersöka om xylen kan ersättas med xylensubstitutet Tissue Clear, ett isoparaffinskt kolväte som är mindre toxiskt. Studien omfattade paraffininbäddad humanvävnad från endometrioid carcinom (n=20), både diploid (n=15) och aneuploid (n=5) vävnad, som avparaffinerades med xylen respektive Tissue Clear innan DNA-ploidi utfördes. Eventuella skillnader inom de flödescytometriska parametrarna % CV-diploid, % S-fas, % debris och DI-aneuploid undersöktes och vid statistisk analys kunde ingen signifikant skillnad ses på samtliga parametrar. Eftersom analysen utförs sällan i rutin är antalet prover i studien relativt stor, trots att detta kan anses vara en liten kvantitet. Av dessa var endast 25 % av proverna aneuploida. Att en patient uppvisar aneuploiditet är ovanligt och därför ansågs även denna mängd som tillräckligt stor. Studien visar att avparaffinering med Tissue Clear är ekvivalent med xylen och därmed kan Tissue Clear ersätta xylen oavsett om vävnaden är diploid eller aneuploid.
DNA ploidy is used for endometrial cancer diagnosis. It reflects the cell cycle and determines whether the cell population in tumors is diploid or aneuploid. When analyzing paraffin embedded tissues xylene can be used for deparaffinization, whose toxicity impairs the laboratory´s work environment. Its strong and unpleasant smell can cause nausea and dizziness. The aim of this study was to investigate if xylene can be replaced with Tissue Clear, an isoparaffinic hydrocarbon that is less toxic. The study included paraffin embedded human tissues from endometrioid carcinoma (n=20), both diploid (n=15) and aneuploid (n=5), deparaffinized with xylene or Tissue Clear before DNA ploidy was performed. Potential differences between the parameters % CV-diploid, % S-phase, % debris and DI-aneuploid were statistically examined and showed no significant differences. The sample amount in this study might be considered low, though it is relatively high since the analysis is rarely performed routinely. Among these only 25 % were aneuploid. Patients showing aneuploidy is rare and the amount was therefore considered to be sufficient as well. The study shows that deparaffinization with Tissue Clear generates equivalent results as for xylene and can thereby replace xylene regardless if the tissue is diploid or aneuploid.

Prostate cancer is one of the most common cancer types worldwide. However, current diagnostic approaches and treatments are invasive and unspecific. Prostate-specific membrane antigen (PSMA) is an ideal biomarker for prostate cancer and can act as a target for therapeutic or diagnostic agents. Previous attempts to develop an affibody with affinity towards PSMA have been unsuccessful, therefore this thesis aimed at making the affibody selections against PSMA more efficient. In this thesis HEK293 cells expressing a modified version of PSMA containing a 3C protease cleavage site were generated, to enable extraction of the extracellular domain of PSMA during the selections. However, further analyses must be performed to determine if the extracellular domain can be successfully cleaved off. To develop an affibody that can be used both in vitro and in vivo, selections will be carried out against recombinant PSMA as well. The recombinant PSMA was previously produced incorporating an Avi tag for site-specific biotinylation and immobilization for the selections. To biotinylate the recombinant PSMA, the enzyme BirA that catalyzes the biotinylation of the Avi tag, was produced. A protein yield of 8.95 mg/liter culture was obtained and the site-specific biotinylation was highly efficient. To evaluate the proposed affibody selection strategy the next step is to determine if cleavage of the PSMA expressed on the HEK293 cells is possible, optimize the cleavage conditions and to start initial selections using the generated HEK293 cells and the produced BirA enzyme.
Prostatacancer är en av de mest förekommande cancertyperna över hela världen. Nuvarande diagnostiska metoder och terapeutiska behandlingar är dock invasiva och ospecifika. Prostataspecifikt membranantigen (PSMA) är en idealisk biomarkör för prostatacancer och kan agera som en målmolekyl för terapeutiska eller diagnostiska ändamål. Tidigare försök att utveckla en affibody med affinitet mot PSMA har inte lyckats, därför var målet med detta examensarbete att effektivisera selekteringen av affibodies mot PSMA. I detta projekt har HEK293 celler som uttrycker en modifierad version av PSMA, innehållande ett 3C-proteas- klyvningsställe, genererats för att möjliggöra extraktion av den extracellulära domänen av PSMA under selekteringen. Ytterligare analyser måste dock utföras för att avgöra om den extracellulära domänen kan klyvas av. För att utveckla en affibody som kan användas både in vitro och in vivo kommer selekteringen att utföras även mot rekombinant PSMA. Rekombinant PSMA har producerats tidigare med en Avi tag för specifik biotinylering och immobilisering under selekteringen. För att biotinylera det rekombinanta PSMA producerades enzymet BirA, som katalyserar biotinyleringen av en Avi tag. Ett proteinutbyte av 8,95 mg/liter kultur erhölls och den specifika biotinyleringen var effektiv. För att utvärdera den föreslagna strategin för selektering av affibodies är nästa steg att avgöra om klyvning av PSMA uttryckt av HEK293 cellerna är möjlig, optimera klyvningsförhållandena och starta initiala selektioner med de genererade HEK293-cellerna och det producerade BirA-enzymet.

Flödescytometrisk cellsortering möjliggör att ur ett större cellmaterial separera en subpopulation celler för vidare analyser. Uppkomst av cytostatikaresistens beror på olika faktorer men där överuttryck av P-gp spelar stor roll. P-gp transporterar aktivt ut cytostatika ur cellen. I studier på AML-celler har man flödescytometriskt påvisat att JC-1 ackumulering speglar P-gp aktivitet. Därmed kan cytostatikaresistenta celler identifieras och sorteras.

Bröstcancer är den svenska kvinnans vanligaste cancerform där cytostatika ofta ingår i den postoperativa behandlingen. Trots att många patienter svarar på första behandlingen drabbas många ändå av återfall. Problematik med cytostatikaresistens är då vanligt förekommande.

Syftet med denna studie var att sätta upp en metod för att flödescytometrisk cellsortera avseende olika JC-1 ackumulering och därmed olika cytostatikakänslighet.

I studien användes färskt brösttumörmaterial och två subcellinjer av leukemicellinjen HL-60. HL-60 S som är känslig för cytostatika och HL-60 R5 som är resistent vid odling med 5 µM doxorubicin.

Resultaten visade att starkare fluorescensintensitet erhölls vid inkubation och förvaring i JC-1 jämfört med att efter JC-1 inkubation förvara cellerna i D-PBS. Det var möjligt att inkubera ett större antal celler med JC-1 i cellodlingsflaska. Resultaten visar dock att flödescytometrisk sortering kraftigt påverkade viabiliteten hos HL-60 S + R5 där endast två tredjedelar av cellerna var viabla efter sorteringen. Preparering av brösttumörmaterial med Medicon medförde att en betydande andel celler dog och materialet i studien var inte tillräckligt för cellsortering. Att cellsortera kräver kunskap och erfarenhet och det är av vikt att prepareringsmetoden och sorteringsinställningarna optimeras på det material som ska användas i studien.