Dissertations / Theses on the topic 'Fonctions régulatrices'

Les échanges avec le microbiote intestinal sont indispensables au développement du système immunitaire et à l’homéostasie intestinale. Les bactéries produisent des molécules perçues par les cellules épithéliales de l’intestin qui mettent à l’épreuve en permanence notre immunité. En réponse, ces cellules sécrètent des facteurs immuno-régulateurs qui contribuent à la tolérance intestinale mais dont les mécanismes sont encore peu compris. Nous nous sommes intéressés à la régulation par les bactéries des gènes TGFb1 et IDO1 et à l’activation du facteur de transcription NFκB, indépendamment des TLR. Pour mieux caractériser ses échanges, nous avons étudié les activités de bactéries commensales sur des lignées de cellules épithéliales intestinales humaines. Nous avons démontré que les acides à chaînes courtes, en particulier le butyrate présent dans les surnageants bactériens des Clostridiales et des Fusobacterium, est un puissant modulateur de TGFb1 et d’IDO1 par ses propriétés inhibitrices d’histone déacétylase. Le butyrate active la transcription de TGFb1 par un mécanisme dépendant du facteur de transcription SP1. En outre, le butyrate inhibe la transcription d’IDO1 par deux mécanismes distincts, l’un ciblant la voie STAT1/IFNγ et le second agissant indépendamment de l’IFNγ. Enfin, certaines bactéries intestinales activent NFκB, indépendamment des acides gras à chaînes courtes, des TLR et de MYD88. Une partie de ces bactéries stimulent la voie NOD1 tandis que d’autres utilisent la voie ALPK1-TIFA-TRAF6, jusqu'à présent activée uniquement par des pathogènes. Ce travail met en valeur le rôle des cellules épithéliales dans la régulation de la symbiose hôte-microbiote
Exchange with the gut microbiota are key for immune system development and host intestinal homeostasis. Bacterial molecules sensed by epithelial cells in the intestine are challenging permanently the host immune system. In response, epithelial cells secrete numerous immuno-regulator factors favouring gut tolerance. However, the molecular mechanisms involved in these processes, remain poorly understand. We studied bacterial-dependent regulation of TGFB1 and IDO1 genes as well as the TLR independent activation of the NFκB pathway, in epithelial cells. We screened the activities of a hundred of gut bacterial species on human epithelial cell lines. We showed that short chain fatty acids, and specially butyrate secreted by Clostridiales and Fusobacterium, were potent modulators of TGFb1 and IDO1 via their histone deacetylase inhibition properties. Butyrate upregulated TGFB1 by a mechanism dependent of the SP1 transcription factor. Moreover, butyrate inhibited IDO1 by two distinct mechanisms, by down-regulating the STAT1/IFNγ pathway and by preventing IDO1 expression independently of IFNγ. Eventually, we described that specific group of gut bacteria activated NFκB in a short-chain fatty acids, TLR and MYD88 independent manner. Interestingly, some Gram+ bacteria stimulated NFκB via the NOD1 pathway. Furthermore, we identified for the first time in a non-pathogenic context, commensal bacteria promoting NFκB by the newly discovered ALPK1-TIFA-TRAF6 axis. Overall, our work support the specific functions of the intestinal epithelial cells in the regulation of the host-microbiote symbiosis

Le traitement de l’obésité est devenu un problème majeur de santé publique aussi bien dans les pays industrialisés que dans les pays en voie de développement. La leptine est une hormone clé dans le contrôle de l’homéostasie énergétique et glucidique en agissant au niveau du noyau arqué de l’hypothalamus (ARC). La résistance à la leptine au niveau de ce noyau hypothalamique contribue au développement de l’obésité. Par conséquent, prévenir son installation et lever cette résistance constitue un enjeu thérapeutique majeur. Notre laboratoire à récemment mis en évidence que la protéine Endospanine 1 est un régulateur négatif des fonctions du récepteur de la leptine (OB-R). En effet, cette protéine, exprimée à partir du même gène qu’OB-R, est capable d’interagir avec ce récepteur et de le retenir dans le compartiment intracellulaire. L’extinction d’Endospanine 1 spécifiquement au niveau de l’ARC prévient l’installation d’une obésité induite par un régime gras. Ces données démontrent donc, in vivo, l’importance de cette protéine dans la régulation des fonctions d’OB-R. Suite a ces résultats prometteurs, l’objectif premier de ma thèse a été d’approfondir nos connaissances sur le rôle joué, in vitro et in vivo, par Endospanine 1, ainsi que par son homologue Endospanine 2, dans la régulation des fonctions d’OB-R. Le second objectif de ce travail de thèse a été d’identifier de nouveaux composés capables de sensibiliser la réponse à la leptine chez les individus obèses. Ce travail a permis de montré que des souris rendues obèses par un régime gras présentaient une surexpression d’Endospanine 1 dans l’ARC suggérant ainsi une potentielle implication de cette protéine dans le développement de la résistance à la leptine. D’autre part, nous avons démontré que l’extinction d’Endospanine 1, dans l’ARC, permet de prévenir l’installation d’une obésité et de la corriger chez des souris obèses et conduit à une altération de la sécrétion d’insuline par le pancréas. Cet effet double sur le poids corporel et sur la glycémie pourrait être expliqué par l’effet différentiel de l’extinction d’Endospanine 1 sur l’activation des voies STAT3 et PI3K/AKT. En effet, en absence d’Endospanine 1 la voie STAT3 est suractivée tandis que la voie PI3K est inhibée. De façon surprenante, l’extinction d’Endospanine 2, second membre de la famille des Endospanines, inhibe de façon drastique l’activation de la voie STAT3 suggérant que ces protéines pourraient jouer des rôles différents dans la régulation des fonctions d’OB-R. Ce travail a également permis de décrire, pour la première fois, les conséquences d’une déficience en Endospanine 1 chez l’Homme. Nos données suggèrent qu’Endospanine 1 ne régule pas les fonctions d’autres protéines, définissant ainsi Endospanine 1 comme une cible thérapeutique hautement spécifique dans la correction de la signalisation leptine.La dernière partie de cette étude a consisté en l’identification de nouveaux composés capables d’activer OB-R ou d’augmenter son expression de surface. Deux tests de criblages ont permis d’identifier de telles molécules. Après validation et caractérisation, de tels composés pourraient être utilisés comme outils thérapeutique afin de restaurer la sensibilité à la leptine perdue chez les individus obèses
Obesity is one of the greatest current public health challenges, not only in industrialized countries but also in developing countries. The hypothalamic arcuate nucleus (ARC) is a major integration centre for energy and glucose homeostasis that responds to peripheral hormones such as leptin. Resistance to leptin in the ARC is an important component of obesity development and its prevention or reversal represents a major therapeutic goal. Our laboratory recently described endospanin 1 as a negative regulator of the leptin receptor (OB-R) that by interacting with OB-R retains the receptor inside the cell. Interestingly, both proteins are expressed from the same promoter. Silencing of endospanin 1 in the ARC prevented the development of diet-induced obesity demonstrating the importance of this protein on OB-R in vivo function.Based on these encouraging findings the first aim of this thesis was to extend our understanding of the in vitro and in vivo role of endospanin 1 and its homologue, endospanin 2, on OB-R function. The second aim consisted in the identification of chemical compounds able to sensitize the leptin response in obese patients. We show here that endospanin 1 is up-regulated in the ARC of obese mice suggesting a potential contribution of this protein to the development of leptin resistance. Its silencing in the ARC of naïve and obese mice reverses obesity development and impairs pancreatic insulin secretion. This dual effect correlates with the differential effect of endospanin 1 on OB-R signaling, inhibition of the STAT3 pathway and activation of the AKT pathway. Intriguingly, endospanin 2, the second member of the endospanin family, promotes efficient STAT3 activation suggesting differential roles of both endospanins on OB-R function.We characterized an obese patient carrying a homozygous deletion in the chromosomal 1p31.3 region coding for endospanin 1. This is the first report defining the consequences of endospanin 1-deficiency in humans. Our data suggest that endospanin 1 has no major OB-R-independent functions thus defining endospanin 1 as an attractive and highly specific therapeutic target for the improvement of impaired leptin signaling.In the last part of the thesis two screening assays were developed to identify compounds that either activate OB-R or promote its cell surface expression. Primary screens were successfully performed for both assays and positive hits identified. Validated hits might be useful to resensitize the impaired leptin response in obese patients

Les cellules iNKT ont des propriétés régulatrices qui suscitent un intérêt particulier en immunopathologie. Mon travail de thèse a eu pour objectif de mesurer l'impact du défaut des cellules iNKT de la souris NOD dans deux situations auto-immunes : 1) le diabète de type 1, une maladie développée spontanément par la souris NOD dans laquelle nous avons montré que les cellules iNKT, tout en constituant des cibles thérapeutiques sous l'impulsion de leur ligand a-GalCer n'ont pas d'activité protectrice spontanée; 2) l'hépatite induite par la ConA, dont la moindre susceptibilité chez la souris NOD a révélé le caractère dominant du rôle délétère de la production d'IL-4 assurée surtout par les cellules iNKT spléniques et non hépatiques et qui est directement potentialisée par l'IL-12, une cytokine qui exacerbe la maladie. En conclusion, notre travail ouvre une nouvelle voie thérapeutique tout en illustrant le caractère ambivalent « mi ange, mi démon » des cellules iNKT en situation auto-immune.

L’expression des immunoglobulines (Ig) par les cellules B est dictée par de multiples remaniements géniques appelées recombinaisons V(D)J, commutation de classe (CSR) et hypermutation somatique (SHM). Tous ces événements sont contrôlés par des éléments cis-régulateurs notamment au locus IgH. Les mieux décrits sont la région intronique Eµ et ses régions d’attachement à la matrice nucléaire MARsEµ et la région régulatrice en 3’ du locus IgH (3’RR), constituée de 4 éléments activateurs (hs3a ; hs1,2 ; hs3b ; hs4) et possédant une structure quasi-palindromique très conservée. Afin d’étudier ces régions régulatrices, nous avons analysé plusieurs modèles murins présentant la délétion de la totalité de la région Eµ, des MARsEµ, et de diverses parties de la 3’RR. Ces modèles ont mis au jour des fonctions insoupçonnées de ces régions régulatrices, à divers stades du développement B. Au delà de son rôle régulateur des réarrangements précoces de DH vers JH, nous avons précisé la fenêtre d’action de région Eµ et son rôle sur la transcription et l’expression de la chaîne lourde µ du stade pré-B jusqu’au stade B transitionnel. L’activateur Eµ module en effet l’expression du pré-BCR et du BCR et par conséquent conditionne l’orientation des cellules B matures vers les compartiments de la zone marginale et folliculaire. Notre étude indique également que Eµ n’influence pas le choix des segments VH au cours de la recombinaison VDJ. Nous montrons que les régions MARsEµ, sont impliquées dans le ciblage des gènes d’Ig par l’hypermutation somatique. Le mode d’action de ces régions MARsEµ reste à définir mais nous décrivons qu’il est découplé de la transcription et qu’il affecte également des loci situés sur des chromosomes différents : loci codant les chaînes légères d’Ig (Ig) et loci des cibles illégitimes de AID (Bcl6 et Cd83).Une étude comparant un nouveau modèle murin déficient pour la région quasi-palindromique 3’IgH (de hs3a à hs3b) à deux autres modèles de notre laboratoire (3’RR KO et hs3b-hs4 KO) nous a permis d’identifier deux modules fonctionnels complémentaires dans la région 3’RR. Le module distal (hs4) impliqué dans la régulation de l’expression de la chaîne lourde du stade B immature au stade B naïf et le module proximal (de hs3a à hs3b) nécessaire aux stades matures pour la SHM et la CSR vers la majorité des isotypes après activation, mais également pour la synthèse des anticorps par les plasmocytes
Immunoglobulin (Ig) gene expression in B cells depends on multiple genetic rearrangements named V(D)J recombination, class switch recombination (CSR) and somatic hypermutation (SHM). These events are controlled by cis-regulatory elements which are, especially numerous within the IgH locus. Major IgH regulatory elements are Eµ composed of a core enhancer flanked by nuclear matrix attachment regions MARsEµ and the regulatory region located at the 3’end of the locus (3’RR), composed of 4 enhancers (hs3a; hs1-2; hs3b; hs4) harbouring a highly conserved quasi-palindromic structure. To study these regulatory regions, we analyzed multiple mice models carrying endogenous deletions of either the entire Eµ region, MARsEµ only or various parts of the 3’RR. These models revealed unsuspected functions for all IgH regulatory regions, at various stages of B cell development. Beyond its role to control accessibility prior DH to JH rearrangements, we identified the window of activity for Eµ region and its particular role on transcription and expression of the µ heavy chain from pre-B to the transitional stages. Indeed, the Eµ enhancer modulates pre-BCR and BCR expression and consequently modulates the mature B cell fate toward marginal zone and follicular compartments. Our study also indicated that the absence of Eµ has no effect on VH segment usage during V to DJ recombination. We also showed that MARsEµ are implicated in the targeting of Ig genes by SHM. The mechanism by which MARsEµ enhances SHM remains to be clarified but we showed that the process does not depend on transcription. Surprisingly MARsEµ also modulates SHM occuring on genes located on different chromosomes: the Ig light chain loci (Igκ) and AID off-targets loci (Bcl6 and Cd83).In a study comparing a new mouse model devoid of the 3’ IgH quasi-palindromic region (hs3a to hs3b) to previous relevant models available in our laboratory (3’RR KO and hs3b-hs4 KO), we identified two complementary functional modules within the 3’RR. The distal module (hs4), which regulates Ig heavy chain expression (and therefore BCR expression) from the immature to mature naïve B cell stages and the proximal module (hs3a to hs3b and its quasi-palindromic structure) required at mature stages for SHM, CSR to most isotypes in activated B cells, and antibody production in plasma cells

Nous avons analysé chez le rat l'influence des différentes populations de cellules dendritiques (DC) sur la prolifération et l'activité suppressive des cellules T régulatrices naturelles (Treg) in vitro. Les populations de DC sont purifiées à partir de la rate et séparées en: DC CD 103+ CD45R- CD4+ (DC CD4+), les DC CD103+ CD45R- CD4- (DC CD4-) et les DC CD 103- CD45R+ CD4+ ou DC plasmacytoides (pDC). Nos résultats montrent que les trois sous- populations de DC matures induisent une forte prolifération des cellules TCD4+CD25- allogéniques mais que, contrairement aux DC dites conventionnelles (DC CD4+ et DC CD4-), les pDC matures stimulées via TLR7 ou 9 induisent en absence d'IL-2 exogène une forte prolifération des cellules TCD4+CD25+FOXP-3+ (Treg), réputées hypoprolifératives in vitro. Cette prolifération est indépendante de l'IL-2, nécessite un contact cellulaire et est partiellement dépendante de CD86. Les populations de DC ont également un impact différent sur l'activité suppressive des Treg in vitro. En présence de DC conventionnelles matures, les Treg suppriment fortement la prolifération et la production d'IL-2 et d'IFN-γ par les cellules T effectrices alors qu'en présence de pDC, les Treg suppriment la production d'IL-2 mais pas la prolifération ni la production d'IFN-γ des cellules T effectrices. Nos résultats indiquent que l'anergie et la fonction suppressive des Treg sont différentiellement contrôlées par les sous- populations de DC et suggèrent un rôle des pDC dans le contrôle des Treg in vivo
We have analysed in the rat the influence of different dendritic cell (DC) subsets on the proliferation and the suppressive activity of naturally occurring T regulatory cells (Treg) in vitro. DC subsets were purified from spleen and separated as: CD103+CD45R-CD4+ (CD4+ DC), CD103+CD45R-CD4- (CD4- DC) and CD103-CD45R+CD4+ or plasmacytoid DC (pDC). Our results show that the three mature DC subsets tested induced a strong proliferation of allogenic CD4+CD25-' Tcell but that, unlike conventional DC subsets (CD4- DC and CD4+ DC), mature pDC stimulated with TLR7 or 9 induce, in the absence of exogenous IL-2, a robust proliferative response of CD4+CD25+FOXP-3+ T cells (Treg), which are reputed hypoproliferative in vitro. Expansion of Treg by pDC is IL-2 independent, requires cell contact and is partially CD86-dependent. DC subsets also differentially control the suppressive activity of Treg in vitro. In the presence of conventional DC, Treg strongly suppress proliferation of, as well as IL-2 and IFN-γ production by effector T cells, whereas in the presence of pDC, Treg suppress IL-2 production by effector T cells but not their prolifeation and IFN-γ production. Our results indicate that anergy and suppressive activity of Treg are differentially controlled by DC subsets and suggest a role for pDC in the control of Treg in vivo

Afin de développer de nouvelles stratégies de prévention du rejet de greffe, il est important d'identifier les mécanismes et les effecteurs de l'activation endothéliale. Dans ce but, nous avons cherché à poursuivre la caractérisation des fonctions de la protéine adaptatrice Lnk (SH2B3) dans la signalisation des cellules endothéliales (CE) vasculaires. Nous montrons que l'absence de Lnk inhibe la transduction du signal médié par la β1 intégrine dans les CE. Au contraire, la surexpression de Lnk entraîne une augmentation du nombre des adhésions focales, qui s'accompagne d'une phosphorylation importante des protéines FAK et paxilline. D'un point de vue fonctionnel, l'expression soutenue de Lnk favorise l'adhésion et l'étalement des CE alors que la migration et l'apoptose par anoïkis sont diminuées. Nous avons également identifié l'α-parvine comme étant une cible moléculaire de Lnk et noté que son inhibition est responsable d'une baisse de la motilité des CE. L'ensemble de ces résultats a mis en évidence l'implication de Lnk dans les processus cellulaires associés à la signalisation des intégrines. Par ailleurs, nous avons étudié la possibilité d'une application à la xénotransplantation des fonctions anti-inflammatoires de Lnk. Nous avons montré que la surexpression de la protéine Lnk humaine dans des CE porcines, inhibe l'expression de VCAM-1 induite par le TNFα et protège les cellules de la mort cellulaire par anoïkis et de l'apoptose médiée par le TNFα. Ces résultats révèlent le rôle de Lnk dans la cytoprotection des CE. L'ensemble de ces travaux présente de nouvelles fonctions régulatrices pour Lnk et ouvre des perspectives à la prévention du rejet de xénogreffe
In order to develop new strategies for preventing graft rejection, it is important to identify mechanisms and actors of endothelial activation. To this aim, we have characterized Lnk (SH2B3) protein functions in vascular endothelial cells (EC) signaling. We showed that Lnk suppression inhibits β1 integrin-mediated signal transduction in EC. By contrast, Lnk overexpression increases the number of focal adhesions and induces the phosphorylation of both FAK and paxillin proteins. Functionally, sustained Lnk expression dramatically increases EC adhesion and spreading, whereas EC migration and apoptosis induced by anoïkis are decreased. Lnk reduces the expression of α-parvine protein that we identified as the molecular target impairing EC migration. Collectively, our results demonstrate the involvement of the adaptor Lnk in integrin-mediated signaling and functions. In addition, we have studied the potential application of anti-inflammatory effects of Lnk to xenotranplantation. We showed that Lnk overexpression down-regulated VCAM-1 expression mediated by TNFα and protects cells from death by anoïkis and TNFα-mediated apoptosis. These findings reveal a role for Lnk as a cytoprotective molecule. All together, this study presents new regulatory functions for Lnk and additional insights in the prevention of rejection

Les thérapies anti-tumorales se sont considérablement améliorées au cours de la dernière décennie. Toutefois, les traitements utilisés actuellement rencontrent d'importantes limitations, notamment dans le cas de cancers métastatiques, révélant l'urgence de développer de nouvelles approches. Ainsi, l'immunothérapie par transfert adoptif de cellules T représente une approche innovante particulièrement prometteuse. Son principe s'appuie sur l'injection de cellules T autologues spécifiques d'antigènes tumoraux, préalablement manipulées et amplifiées ex vivo, chez des patients rendus lymphopéniques par chimiothérapie et/ou radiothérapie. Toutefois, même si l'état lymphopénique est induit par ces 2 protocoles de conditionnements, leurs effets sur l'environnement de l'hôte ainsi que sur le devenir des cellules T greffées étaient, jusqu'à nos travaux, mal connus. Par le biais de modèles murins, nous avons pu démontrer que le devenir des cellules T diffère après transfert dans des souris irradiées ou traitées par chimiothérapie (Bu/Cy). Ainsi, après transfert dans des animaux irradiés, on observe une prolifération préférentielle des cellules T CD8, dépendante de l'IL-7, est observée alors qu'un transfert chez des souris traitées Bu/Cy se traduit par une prolifération rapide, indépendante de l'IL-7, des cellules T CD4. De plus, ces comportements sont associés à d'importantes modifications de l'environnement généré chez l'hôte. Plus spécifiquement, nous avons démontré, dans les organes lymphoïdes secondaires, que la localisation et la représentation des différentes sous-populations de cellules dendritiques présentes étaient différentiellement modulées par le type de conditionnement utilisé. Par ailleurs, l'élimination spécifique des cellules CD11c+ chez des souris traitées Bu/Cy était accompagnée d'une inhibition importante de la prolifération rapide des cellules T CD4 greffées. L'ensemble de nos travaux montrent que les traitements lymphopéniques génèrent des environnements distincts capables de moduler le devenir des cellules T greffées.Durant ma thèse, nous avons également abordé de façon originale un aspect novateur de l'environnement en étudiant le rôle potentiel des nutriments comme régulateurs métaboliques des fonctions effectrices des cellules T. La glutamine est l'acide aminé le plus abondant du plasma, pouvant contribuer aux besoins bionénergétiques et biosynthétiques des cellules T en prolifération. Nous avons démontré dans nos travaux qu'une carence en glutamine lors de l'activation de cellules T CD4 par leur TCR entrainait un délai dans l'activation de la voie mTOR, une réduction de la production intracellulaire d'ATP aux temps précoces et se traduisait par une diminution de la prolifération. De plus, ces conditions étaient associées à une augmentation de la conversion de cellules CD4 T naïves, via TGFβ, en cellules régulatrices Foxp3+ , y compris en condition de polarization Th1. Par contre, la carence en glutamine n'a pas inhibé la différenciation Th2. Les cellules T Foxp3+ ainsi générées en condition limitante de glutamine présentaient in vivo des fonctions suppressives aussi efficaces que celles des cellules régulatrices nTregs. En effet, elles ont la capacité de bloquer l'induction de la colite provoquée par la greffe de cellules T effectrices dans des souris Rag2-/- . Nos travaux démontrent ainsi que l'environnement métabolique peut être un régulateur clé de la différenciation des cellules T CD4. L'ensemble de mes travaux de thèse ont mis en évidence de nouveaux paramètres capables de potentiellement modifier la survie et la réactivité des cellules T greffées
Anti-tumor therapies have improved significantly over the decade. However, the currently used treatments have important limitations, notably for metastatic cancers, and the development of new approaches is therefore a high priority. Adoptive T cell therapy (ACT) represents an innovative strategy that has shown much promise. This therapy is based on the infusion of tumor-specific T cells, which have been manipulated and expanded ex vivo, into patients who have been rendered lymphopenic by chemotherapy and/or irradiation. It is interesting to note that while lymphodepletion is attained by the vast majority of conditioning regimens, the effects of these protocols on the host environment and potentially, on the destiny of adoptively-transferred T cells had not been elucidated prior to the studies which we initiated. Using a murine model, we found that the fate of adoptively-transferred T cells differs markedly in mice rendered lymphopenic by sub-lethal irradiation as compared to a busulfan/cyclophosphamide (Bu/Cy) chemotherapy regimen. Irradiation-mediated lymphopenia resulted in a skewed IL-7-dependent proliferation of donor CD8+ T cells, whereas Bu/Cy treatment led to an increased IL-7-independent, rapid CD4+ T cell proliferation. These alterations in T cell proliferation were associated with striking changes in the host microenvironment. More specifically, we demonstrated that the proportion and localization of different dendritic cell (DC) subsets in lymphoid organs were differentially affected by the type of conditioning. Furthermore, we found that these DC controlled the rapid donor CD4+ T cell division detected in Bu/Cy-treated mice as depletion of CD11c+ DC inhibited this proliferation. Altogether, our studies demonstrate that lymphopenic regimens generate distinct host environments which modulate the fate of adoptively-transferred T cells. Durind my PhD, we also investigated an original and novel aspect of the microenvironement by studying the potential role of nutrients as metabolic regulators of T cell effector function. Glutamine is the most abundant amino acid in the plasma and contributes to the bioenergetic and biosynthetic requirements of proliferating T cells. Here, we demonstrated that activation of CD4+ T cells under glutamine-deprived conditions results in a delayed mTOR activation with reduced early ATP production and decreased proliferation. Moreover, these conditions resulted in the conversion of naïve CD4+ T cells into Foxp3+ regulatory T cells (Tregs). This de novo Treg differentiation occurred even under Th1-polarizing conditions and was TGFβ-dependent. Interestingly, glutamine deprivation did not inhibit Th2 differentiation. Importantly, these converted Foxp3+ T cells showed enhanced in vivo persistence and were highly suppressive, completely protecting Rag-deficient mice from the development of autoimmune inflammatory bowel disease as efficiently as natural-occuring Tregs. Thus, our data reveal the external metabolic environment to be a key regulator of a CD4 T lymphocyte's differentiation. Altogether, the data generated during my PhD provide new insights into the identification of parameters that can potentially alter the survival and reactivity of adoptively-transferred T cells

La fonction presidentielle de regulation du regime parlementaire hellenique constitue l'objet de la presente these. L'intervention du roi dans le fonctionnement du regime politique conduisit les redacteurs de la constitution de 1975 a reglementer de facon detaillee les rapports entre les pouboirs legislatif et executif. Le predicent de la republique fut dote de pouvoirs a caractere regulateur dans ses rapports avec le gouvernement (premier ministre), l'assemblee, les partis politiques et le peuple. La revision constitutionnelle de 1986 modifia le role juridique du regulateur du regime en supprimant une partie de ses pouvoirs et en transferant nombre de ceux-ci au gouvernement (premier ministre), a la chambre des deputes et aux partis politiques. Dans la premiere partie nous procedons a une interpretation juridique des pouvoirs presidentiels de regulation du regime selon la constitution de 1975; ensuite nous examinons la pratique suivie par le chef de l'etat - sous le regime de cette meme constitution - afin d'elucider sa fonction regulatrice dans ses rapports avec le gouvernement (premier ministre), l'assemblee, les partis politiques et le peuple. Dans la deuxieme partie nous procedons de facon analogue a l'interpretation des competences presidentielles a caractere regulateur et a l'examen de la pratique suivie par le president afin d'expliciter sa nouvelle fonction regulatrice sous le regime de la constitution revisee. La pratique suivie par le president nous a conduit a faire la distinction entre sa fonction regulatrice institutionnalisee, prevue par la constitution, et sa fonction non institutionnalisee, non prevue par cette meme constitution. Une serie de facteurs d'ordre juridique, politique, sociopolitique et personnel relativisent son role. Le facteur humain. Les conditions politiques, certains phenomenes sociopolitiques, et surtout le systeme des paris exercent une influence importante sur la fonction
The object of this thesis is establishing the regulatory function of the president of the third greek republic. The king's intervention in the function of the regime led the authors of the 1975 constitution to a detailed regulation of the relations between the executive and the legislative. The president of the republic was invested with powers of a regulatory character in his relations with the government (the prime minister), the parliament, the political parties and the people. The 1986 constitutional revision changed the legal role of the regulator of the regime by abolishing part of his powers and transferring some of them to the government (the prime minister), the parliament and the political parties. In the first part we attempt a legal interpretation of the president's powers to regulate the regime according to the 1975 constitution; next we ewamine the practice followed by the head of state under the same constitution with a view to establishing the regulatory function in his relations with the government (the prime minister), the parliament, the political parties and the people. In the second part we proceed in a similar way, to interpret his powers of a regulatory character and examine the practice followed by the president to clarify his new regulatory function under the revised constitution. The practice followed by the regulator of the regime led us to distinguish between the institutionalized regulatory function, provided for by the constitution, and his noninstitutionalized regulatory function, non-provided for by the same constitution. An array of factors of the legal, political, socio-political and personal character make his role relevant. The human factor, the political conditions, certain socio-political phenomena, and mainly the party system exert

Relax chez le rat ou Neurogénine 3 (ngn3) chez la souris est un facteur de transcription de la famille basique Hélice Boucle Hélice (bHLH). Le profil d'expression de ce gène au cours du développement embryonnaire indique qu'il pourrait jouer un rôle fondamental dans la détermination du devenir nerveux ou endocrine des précurseurs neuronaux et pancréatiques respectivement. Le premier objectif de mon projet vise à élucider, les mécanismes moléculaires permettant de rendre compte de la mise en place et du contrôle de l'expression tissulaire restreinte du gène ngn3. Cette étude réalisée par transgenèse, a été possible grâce à l'installation au laboratoire d'une plate-forme de transgenèse, qui m'a permis de générer des modèles de souris transgéniques de façon autonome. J'ai donc réalisé différentes constructions permettant d'exprimer le gène β-galactosidase sous le contrôle d'éléments potentiellement « enhancer » du promoteur ngn3. J'ai caractérisé un élément de 3,85kb permettant de diriger l'expression du gène rapporteur exclusivement dans les territoires d'expression du gène endogène ngn3. L'étude de fragment plus restreints se poursuit actuellement mais nous disposons l'un fragment de 2,2kb dirigeant en transgenèse l'expression du gène LacZ dans l'hypothalamus ventral et les épithéliums pancréatiques et intestinaux. Le second objectif de cette thèse est d'obtenir un marquage in vivo, par transfert de gène, de la population des cellules souches du pancréas endocrine exprimant ngn3 dans des explants de pancréas embryonnaires murins puis humains. En effet, nous disposons d'un système in vivo unique capable de récapituler le développement du pancréas endocrine par xénogreffe d'ébauches pancréatiques. Jai démontré, dans ce modèle expérimental, la capacité de lentivirus recombinants à infecter efficacement des cellules progénitrices du pancréas, en ciblant à l'aide de promoteurs spécifiques l'expression du gène rapporteur dans les différentes populations cellulaires qui se sont différenciées. La construction et la production d'un vecteur lentiviral assurant l'expression du gène rapporteur de la GFP (Green Fluorescent protein) sous le contrôle de l'élément de 2,2kb du promoteur du gène ngn3, permet actuellement de transduire des explants de pancréas embryonnaires murins. La transposition de ces modèles à du tissu embryonnaire humain est actuellement validée. Ce travail nous donne accès, chez l'homme, au réservoir des cellules souches du pancréas endocrine. L'amplification et la sélection de telles cellules souches constituent un défi majeur pour le développement de nouvelles thérapies du diabète de type I. La fonction proendocrine de ngn3 étant déjà clairement établie au niveau du pancréas, le troisième objectif consiste à démontrer la fonction de détermination neuronale de ce facteur dans la moelle épinière. Dans le cadre d'une fonction de détermination, l'absence de différenciation d'une population de neurones est attendue suite à l'inactivation du gène ngn3. Nous avons pu démontrer que la mutation nulle ngn3 induit l'expression ectopique du facteur de détermination Mash1 dans la région ventrale de la moelle épinière exprimant normalement ngn3, assurant ainsi, une compensation fonctionnelle. Afin d'appréhender directement la fonction de détermination de ngn3 et cela en absence de compensation, nous avons généré des souris doubles mutant nulles Mash1-Ngn3. L'analyse phénotypique des mutants perte de fonction ngn3 et Mash1/ngn3 dans la moelle épinière ventral nous a permis de démontrer la fonction de ngn3 dans la détermination du devenir neuronal. De plus nous avons, pour la première fois, établi que les neurones matures dont la différenciation est déterminée par ngn3 présentent un phénotype glutamatergique. Mots clés : Ngn3, bHLH, expression tissu-spécifique, régions régulatrices, embryons transgéniques et fondateurs, ciblage progéniteurs/souches, transfert de gène, fonctions proneurale et proendocrine

Le lymphocyte B (LB) des patients lupiques est réfractaire à tous les procédés décrits à ce jour pour activer une fonction régulatrice B (Breg). Il constitue de ce fait un modèle intéressant d’étude de la déficience Breg chez l’Homme et soulève de nombreuses interrogations. Est-il possible de restaurer un défaut d’activation de la régulation LB? Si oui est-il possible d'agir à temps et le plus efficacement possible, et comment s'y prendre? Ou au contraire, est-ce un état irréversible de la cellule B? Ce travail de thèse a pour objectif principal de répondre à cette problématique essentielle à notre compréhension du Breg. Grace à un polypeptide de synthèse le Glatiramer acetate (GA), nous montrons que la restauration de la fonction régulatrice d’un Breg chez les patients lupiques est possible. Le compartiment LB mémoire fixe fortement le GA et la pré-sensibilisation par le GA permet d’augmenter le potentiel régulateur des LB mémoires mais n’affecte aucunement celui des LB matures. Le GA exerce deux actions majeures sur le LB mémoire. D’une part, il génère une meilleure capacité d’inhibition de la prolifération T, dont le mécanisme est associé à un contact cellulaire impliquant les molécules HLA-DR. D’autre part, il favorise un contrôle plus efficace de la polarisation Th1 qui est très probablement associé à sa capacité à induire la production d’IL-10 dans ces LB. Enfin, le GA modifie le phénotype des LB mémoires puisque l’expression de CD5, IL-21R, ou encore PD-1 est significativement augmentée, autant de molécules impliquées dans la fonction suppressive et dans la production d’IL-10. En conclusion, nous montrons qu’amplifier une fonction régulatrice et surtout la restaurer lorsqu’elle est défaillante chez les malades, est parfaitement possible in vitro. Face à l’engouement suscité par le développement de procédés favorisant l’expansion des Bregs chez la souris à des fins thérapeutiques, l’enjeu est aujourd’hui d’être en mesure d’extrapoler de telles démarches chez l’Homme. Ce travail, avec toute la modestie requise, contribuera à faire naître un nouvel élan vers de telles perspectives
B cell in systemic lupus erythematous (SLE) is unresponsive to all methods described to date, to activate B cells regulatory (Breg) function. Therfore, it is an interesting model to study the Breg deficiency in Human, and highlights many questions: is there a way to restore a defect of the Breg activation ? If yes, how can we act more efficiently ? Or in contrast, is it an irreversible state of the B cell? Glatiramer Acetate (GA) is a synthetic polypeptide used in the treatment of multiple sclerosis. We show that Breg activity of SLE B cells can be restored after stimulation with GA. Interestingly, memory B cells bound high level of FITC-conjuated GA in contrast to mature B cells. We desmonstrate that GA can increased specifically the regulatory activities of memory B cells. GA exerts two major actions on the memory B cells. It generates an improved capacity of inhibition of the T cell proliferative response, whose mechanism is associated with a cellular contact involving HLA-DR molecules. In addition, GA supports a more effective control of the Th1 polarization which is most likely associated with its capacity to induce the production of IL-10 in these B cells. Finaly, GA modifies the memory B cell phenotype since the expression CD5, IL-21R, or PD-1 is significantly increased, all molecules involved in the suppressive function and the IL-10 production. In conclusion, our results show for the first time that amplification of Breg function and additionally its restoration when it is defective in patients, can be perfectly achieved in vitro. Currently, while the development of new process supporting the expansion of Bregs in the mouse model exist, the challenge is to extrapolate such methods in human. Through the control of their regulatory potential, regulatory B cells could be the targets of novel therapeutic approach in autoimmune diseases. This study might open up new horizons in this field

Les vascularites associées aux anticorps anti-cytoplasme des polynucléaires neutrophiles sont caractérisées par une atteinte inflammatoire et nécrosante des vaisseaux de petit calibre, dont la physiopathologie reste encore mal établie. Les cellules dendritiques (DC) et les cellules T régulatrices (Treg) jouent un rôle clé dans le contrôle des réponses immunes adaptatives. Dans ce travail nous avons étudié les sous populations de DC circulantes et les Treg chez des patients ayant une vascularite à ANCA. Nous observons chez ces patients premièrement, une baisse des DC qui est plus importante et accompagnée d’une augmentation de l'expression de CD62L en phase aiguë de la maladie et deuxièmement, une diminution du nombre de Treg et de leur fonction suppressive, fonction qui est fortement diminuée chez les patients en phase aiguë. Ces résultats suggèrent que le déficit fonctionnel des Treg puisse jouer un rôle dans le caractère récidivant de la maladie et que les cellules dendritiques pourraient être impliquées dans cette modulation de la fonction des Treg
Antineutrophil cytoplasmic antibodies-associated vasculitides are the most common primary systemic small-vessel vasculitis in adults. Dendritic cells and regulatory cells play pivotal roles in controlling both normal and autoimmune adaptive immune responses. In this study, we examine the frequency and phenotype of DC subsets, and the frequency and function of Treg from patients with ANCA-associated vasculitis. We observe in these patients firstly, a decrease numbers of DC which is more pronounced and associated with an increased expression of CD62L for patients in acute phase and secondly, a decrease numbers and suppressive function of Treg with a functional defect more pronounced during flares than remission. Taken together, these data point to a role for Treg functional deficiency in the pathogenesis of AAV and relapses, and suggest that DC might be involved in this modulation of Treg suppressive function

A partir des donnees relatives aux pratiques psychologiques en afrique, cette recherche rend compte des processus fondamentaux regissant les transferts culturels et techniques heterogenes qui s'effectuent des societes industrialisees vers celles en transition d'afrique. La demonstration s'appuie sur les recherches menees en psychologie sociale, en psychologie interculturelle et en sociologie du developpement sur les concepts de transfert, de regulation, d'apprentissage, d'identite et de developpement. La demarche adoptee est non deterministe. Les resultats montrent que ces transferts peuvent contribuer a la regulation (limitee) des societes en voie de developpement a la recherche de leur identite (fonction manifeste). Mais ils vehiculent aussi des systemes de valeurs, de croyances et de significations heterogenes qui menacent l'identite africaine autochtone (fonction latente). D'ou la predominance des processus qui visent a concilier les registres endogene et exogene, dans des societes ou aucun des deux n'est a lui seul suffisant. Cette etude montre, en somme, que la dialectique apprentissage culturel heterogene defense identitaire et la strategie du compromis sont bien au centre des transferts culturels et techniques heterogenes
This investigation, based on data relative to psychological pratice in africa reports upon the basic fundamental processes govorning heterogenous cultural and technical transfers which are performed by industrialized societies towards african societies in transition. Our approach is non-deterministic. Results show that these transfers can contribute to a (limited) regulation of societies in process of developement and searching their identity (obvious, manifest function). These transfers also convey value systems, beliefs and heterogenous significations which upset the african autochtonous identity ( latent function). Whence the predominance of processes aiming at the conciliation of the endogenous and the exogenous level in societies where none of these two levels, taken separately, is sufficent. In short, this thesis shows that the dialectics of heterogenous cultural apprenticeship identical defense and strategy of compromise are in the centre of heterogenous cultural transfers

Un des objectifs en transplantation est d’induire un état de tolérance opérationnelle. Cet état, rare en transplantation rénale, se définit comme l’acceptation à long terme d’un greffon à fonction stable sans immunosuppresseur chez un hôte immunocompétent. Ce travail vise à comprendre les mécanismes impliqués dans le processus de tolérance opérationnelle chez les transplantés rénaux. L’étude d’une petite cohorte de patients tolérants a permis d’identifier un phénotype particulier de leurs lymphocytes T sanguins CD4+CD25+, différent de celui des patients en rejet chronique. Nous avons montré que les patients tolérants présentent un nombre plus important de cellules CD4+CD25+FOXP3+ que les patients en rejet chronique et semblable à celui des individus sains. Ces cellules présentent également une fonction régulatrice semblable à celle d’individus normaux et significativement supérieure à celle de patient en rejet chronique
Despite being efficient in preventing acute rejection, immunosuppressors have little effect on chronic rejection. A major goal in transplantation is therefore to induce a state of operational tolerance. This state, which is rare in kidney transplant recipients, is defined as long-term graft acceptance with a stable function, without immunosuppression in an immunocompetent recipient. Here we tried to understand the mechanisms implicated in operational tolerance to kidney transplants. The study of a small cohort of tolerant patients allowed us to identify a particular phenotypic profile of CD4+CD25+ blood lymphocytes that was different to that of patients with chronic rejection. Tolerant patients displayed an increased number of CD4+CD25+FOXP3+ T cells compared to patients with chronic rejection. These cells also displayed a regulatory function similar to that of healthy individuals and significantly higher than that of patients with chronic rejection

La première partie de cette thèse concerne l'hydratation de dAn•dTn et rAn•rUn, et des triple-hélices dTn*dAn•dTn, rUn*dAn•dTn, dTn*rAn•rUn et rUn*rAn•rUn. Leurs taux d'hydratation sont obtenus par des mesures gravimétriques. Les profils des courbes de desorption obtenus par pesées et FTIR sont corrélés avec des modifications conformationnelles induites par la déshydratation. La deuxième partie traite des télomères humains et d'Oxytricha nova pouvant former des quadruple-hélices. Une bande infrarouge, marqueur de l'orientation parallèle ou antiparallèle des quadruple-hélices, est proposée. L'effet de l'addition d'ions métalliques Na+, K+ ou Ca2+ sur les orientations relatives des brins est examiné. La troisième partie concerne la structure de Hfq de E. Coli et ses interactions avec des ARN (rU7, rA7 et rC7) en relation avec son rôle fonctionnel. Hfq seule forme une structure de feuillets bêtapolymérisés en fibre (empilement de 36 monomères agencés en hexamères d'homohéxamères).

Clef de voûte des négociations ayant conduit à l’adoption du Protocole n° 11 à la Convention européenne des droits de l’Homme, la Grande chambre de la Cour européenne s’est vu attribuer des compétences contentieuse et consultative atypiques et étendues. Les réformes ultérieures ont contribué à étendre ses prérogatives, confirmant ainsi l’importance de son rôle au sein du système européen de protection. Cette thèse prend pour objet l’office de la Grande chambre dans sa double dimension, formelle et substantielle. À partir de matériaux juridiques classiques et de méthodes issues des sciences sociales, cette recherche montre qu’en dépit de conditions initialement défavorables, la Grande chambre est parvenue à redéfinir son office pour le mettre au service de la construction d’un droit commun européen. Elle s'est également rendue indispensable à la préservation du système de protection
As the cornerstone of the negotiations leading to the adoption of Protocol No. 11 to the European Convention on Human Rights, the Grand Chamber of the European Court was given atypical as well as extensive contentious and advisory powers. Subsequent reforms have helped to extend its prerogatives, thus confirming the importance of its role within the European protection system. This thesis focuses on the office of the Grand Chamber in its twofold dimension, formal and substantial. Based on traditional legal materials and methods from the social sciences, this research shows that, despite initially unfavourable conditions, the Grand Chamber has succeeded in redefining its office in order to put it at the service of the construction of a common European law. It has also made itself essential to the preservation of the protection system

L'objet principal de notre recherche sera d'essayer d'éclairer l'obscurité relative à la figure du contrat normatif, existante particulièrement en espagne, en élaborant une étude minutieuse et en profondeur qui fait actuellement défaut dans la littérature juridique. de même, il sera aussi bien nécessaire d'analyser si la notion de contrat normatif, telle qu'elle est proposée par la doctrine et jurisprudence espagnole et surtout italienne, peut être transposée au droit français des contrats. et, d'autre part, si la notion française de contrat-cadre correspond à celle, espagnole, de « contrato marco ». pour ce faire, il sera nécessaire d'entamer une étude de ses différences et similitudes au moyen d'une comparaison de l'emploi, par les professionnels du droit de chaque pays, de chacun des termes. finalement il sera envisagé, le cas échéant, l'opportunité d'une éventuelle transposition de la figure du contrat-cadre au droit espagnol à travers celle de « contrato marco », l'intégrant comme équivalente ou application de la figure de contrat normatif.ainsi, une fois notre recherche achevée nous serons en mesure de proposer une définition complète et claire de contrat normatif, de déterminer sa nature juridique, d'obtenir ses principaux caractères, d'en tirer sa portée et, enfin, de rassembler ces principales applications pratiques. et ce, naturellement sans oublier de relever tant l'histoire ou la genèse de cette figure que sa valeur actuelle, en tant que nouvelle forme de négociation, d'autorégulation et de limitation volontaire de la liberté contractuelle
How far are now individuals free to create the most appropriate contractual tool to achieve the satisfaction of their needs and interests? What they have in common figures as diverse as a joint-venture agreement, a franchise agreement or a marriage contract? Is the old general theory of contract adapted to the contractual practice of the XXI century? A deep study of the normative contract in this book provides answers to these and to many other momentous matters of Private Law of Contract. Reconstructed from the detailed analysis of the theory and legal practice, the notion of normative contract as an agreement of cooperative nature could constitute the bridge to a new and inspiring way of conceiving the contract. Not surprisingly, as shown by its main practical manifestations, the contract is often more than just an instrument to organize an exchange of goods and services, a powerful regulatory tool of reality and human behavior. To put it briefly, if on the one hand in this essay the author seeks find a remedy for a situation of great uncertainty regarding the so-called normative contract, in the other hand he also invites the legal community to reflect calmly on the role played by contract in present society.Keywords: Normative contract, Normenvertrag, Alfred HUECK, genesis, concept, pactum de modo contrahendo, contrat-cadre, framework agreements, distribution, collective agreement, financial transactions, joint venture, marriage contract, codes of conduct, Spanish private law, French private law, contractual clause, cooperative agreement, intuitus personae, no-obligational and obligational content of the contract, union of contracts, regulatory function of contract, general contract theory, theory of legal regulation, Hans KELSEN , freedom of contract

La malaria, maladie causée par le protozoaire Plasmodium, tue chaque année plus d'un million de personnes. L'émergence de parasites résistants à plusieurs traitements anti-malariques ainsi que l'absence de vaccin efficace rendent la lutte contre le Plasmodium de plus en plus difficile. Afin de pouvoir identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et d'optimiser l'efficacité des vaccins dans les zones endémiques, une meilleure compréhension des interactions hôte/parasite est nécessaire. Lors de la malaria, un état d'immunosuppression systémique est induit par le parasite. Cet état de suppression immunitaire pourrait être à l'origine de la persistance du parasite au sein de l'hôte ainsi que de la difficulté à obtenir une protection efficace contre la réinfection décrite dans les zones endémiques. Mieux comprendre comment le Plasmodium interfère avec la réponse immunitaire permettra de mettre en place des thérapies favorisant la résolution des infections par ce parasite. Dans ce sens, notre étude a pour but d'évaluer l'activation des cellules T régulatrices naturelles (TregN) ainsi que la modulation de la physiologie des macrophages (MP) lors des infections par Plasmodium. Une étude antérieure a suggéré que l'activation des cellules TregN lors des infections par Plasmodium yoelii l7XL (PyL) était impliquée dans le développement de l'immunosuppression et permettait au parasite d'échapper au système immunitaire. En utilisant un modèle alternatif d'infection par Plasmodium, nous avons démontré que l'activation des cellules TregN pouvait aussi représenter un mécanisme protecteur pour l'hôte. Lors des infections par Plasmodium chabaudi adami (Pca) chez les souris BALB/c, l'activation des cellules TregN permet de tempérer la réponse immunitaire afin d'éviter le développement d'une inflammation excessive sans toutefois affecter le contrôle du parasite. Ainsi, il semblerait que le rôle des cellules TregN lors des infections par Plasmodium dépende de l'espèce du parasite considérée. Les infections par Plasmodium sont associées à une diminution de la sécrétion d'interleukine 12 (IL-12) et de la viabilité des MP ayant vraisemblablement des répercussions sur le développement de la pathologie et le contrôle du parasite. Notre étude a démontré que l'hémine (HE), produite suite à l'oxydation de l'hème provenant de l'hémoglobine (Hb), pourrait être impliquée dans ces deux phénomènes. Lors des infections par Plasmodium, les MP entrent en contact avec et internalisent des quantités importantes de ce composé ferrique via la phagocytose de globules rouges (GR) parasités ou abimés ainsi que via l'ingestion d'Hb et/ou d'HE libérées dans le sang suite à la lyse des érythrocytes. In vitro, des doses physiologiques d'HE diminuent de manière significative la quantité d'IL-12 sécrétée par les MP dérivés de la moelle osseuse en réponse à une stimulation avec l'interféron gamma (IFN-y) et le lipopolysaccharide (LPS). L'HE agit principalement sur l'effet synergique de l'IFN-y et ceci d'une manière dépendante de l'interleukine 10 (IL-10), de la MAPK (de l'anglais "mitogen activated protein kinase") p38 et du stress oxydatif. D'autre part, l'utilisation de GR de souris infectées par le Pca ou de GR oxydés, permettant de stimuler une forte érythrophagocytose in vitro, a permis de démontrer que l'internalisation d'un nombre important de GR induisait l'apoptose des MP de la lignée J774A.1. La phagocytose des GR conduit à l'internalisation d'une quantité importante d'HE induisant un stress oxydatif impliqué dans la diminution de la viabilité des MP. Bien que l'activation des cellules TregN et l'inhibition des MP à la suite de l'ingestion d'HE puissent représenter des mécanismes permettant au Plasmodium d'échapper au système immunitaire, ces mécanismes immunosuppresseurs pourraient aussi permettre de limiter l'inflammation et la pathologie favorisant ainsi la survie de l’hôte lors de la malaria. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Plasmodium, immunosuppression, macrophages, interleukine 12, érythrophagocytose.

La réaction du greffon contre l’hôte (GvH) est responsable d’un grand taux de morbidité et de mortalité chez les patients recevant des greffes de cellules souches (GCSH) allogéniques. Dans ce contexte, les cellules T régulatrices sont largement étudiées et semblent avoir un grand potentiel d’utilisation dans le domaine de la thérapie cellulaire de la GvH. Parmi les populations cellulaires T régulatrices, les lymphocytes T CD4-CD8- TCRαβ+ « Doubles-Négatifs » (DN), qui ne représentent que 1-3% des lymphocytes T, ont été décrits. Ces cellules ont des propriétés inhibitrices de la réponse immunitaire qui s’avèrent spécifiques aux antigènes auxquels elles ont préalablement été exposées. La répression de la réponse immunitaire par les cellules T DN régulatrices semble être un mécanisme important impliqué dans l’induction de la tolérance aux allo-antigènes. De plus, ces cellules confèrent une tolérance immunitaire dans des modèles de greffes allogéniques et xénogéniques. En effet, ces cellules ont la capacité d’inhiber la réaction contre un allo-antigène auquel elles ont été exposées, sans inhiber la réaction contre un allo-antigène inconnu. Les cellules T DN ont été isolées et caractérisées chez l’homme où elles ont la capacité d’interagir avec des cellules présentatrices d’antigènes (APCs) par un contact cellulaire, comme chez la souris. Cependant, leur capacité immunomodulatrice reste inconnue chez l’humain. Notre objectif consistait donc principalement à étudier le rôle et le mécanisme d’action des cellules T DN régulatrices humaines in vitro, en étudiant leur capacité à inhiber une réaction lymphocytaire mixte (MLR). Nous avons montré que les cellules T DN stimulées par un allo-antigène donné inhibent des cellules syngéniques effectrices dirigées contre ce même alloantigène mais n’inhibent pas des cellules syngéniques effectrices dirigées contre un autre alloantigène, démontrant ainsi la spécificité aux antigènes de ces cellules. De plus, les T DN non stimulées par un allo-antigène n’ont pas de rôle inhibiteur. Cependant, durant cette inhibition, nous n’observons pas de modulation de l’expression des marqueurs d’activation et d’induction de l’apoptose. Afin d’étudier le mécanisme d’action des cellules T DN, nous avons mesuré l’expression intracellulaire de la granzyme B. Les résultats démontrent que les cellules T DN stimulées expriment un niveau significativement plus élevé de granzyme B que les cellules T DN non-stimulées par l’allo-antigène. Ceci suggère que l’immunosuppression induite par les cellules T DN stimulées pourrait passer par la voie granzyme B. Le mécanisme utilisé par ces cellules reste à être confirmé par nos futures expériences.
Graft-versus-Host Disease (GvHD) is a major cause of morbidity and mortality in patients receiving an allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation (HSCT). Many regulatory T cell populations have been studied and shown to have immunosuppressive properties in GvHD. Among these populations, Double Negative CD4-CD8-TCRαβ+ regulatory T cells (DN T) have been described. These cells represent 1-3% of all T cell lymphocytes and are known to have antigen-specific inhibitory functions of the immune response. The suppression of an immune response by DN T cells seems to be an important mechanism involved in the induction of tolerance to allo-antigens. Moreover, these cells also confer immune tolerance in models of allogeneic and xenogenic grafts. DN T cells have the ability to suppress syngeneic T CD4+ and T CD8+ cells in an antigen-specific manner. Therefore, these DN T cells can inhibit the reaction caused by syngeneic effector cells against a specific alloantigen to which they have been previously exposed. However, they cannot inhibit a reaction directed against an unknown alloantigen. Human DN T cells have been isolated and characterized as cells that have the capacity to interact with APCs by cell-to-cell contact, just like in mice. However, their immunomodulatory properties are still unknown in humans. The goal of our project was to study the role and immunomodulatory functions of human DN T cells in Mixed Lymphocyte Reactions (MLR). The MLRs have allowed us to demonstrate that DN T cells, after having been stimulated by an allo-antigen, have an antigen-specific inhibitory function towards the syngeneic effector cells reacting against the same alloantigen that they have been exposed to. Interestingly, they do not inhibit the reaction of these effector cells against an unknown alloantigen. However, stimulated DN T cells did not modulate the expression of the activation markers expressed by the effector cells and did not give a death signal to these cells either. Moreover, we also wanted to study how DN T cells have an immunosuppressive activity. Therefore, we compared the expression of Granzyme B in stimulated versus non-stimulated cells. Our results suggest that DN T cells may use the Granzyme B pathway to immunosuppress the effector cells. In conclusion, our results demonstrate that DN T cells have an antigen-specific inhibitory function. The mechanism used by these DN T cells remains to be confirmed with our future experiments.

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle de premier plan dans le contrôle fin de l’expression génique en permettant une modulation de la synthèse de protéines dans le temps et l’espace, en fonction des besoins de la cellule. Ainsi, des protéines reconnaissant des éléments d’ARN présents sur des transcrits peuvent influencer toutes les étapes de leur existence, soit leur épissage, leur export nucléaire, leur localisation subcellulaire, leur traduction et leur dégradation. Staufen1 (Stau1) est un membre de la famille des protéines liant l’ARN double-brin qui contribue à la régulation post-transcriptionnelle par son implication dans des mécanismes qui vont promouvoir l’épissage alternatif, le transport, la dé-répression de la traduction et l’induction de la dégradation d’ARN messagers (ARNm) spécifiques. L’identité des cibles potentielles de Stau1 est maintenant connue puisqu’une étude à l’échelle du génome a montré que la protéine s’associe à près de 7% du transcriptome des cellules HEK293T. Ces ARNm se classent dans un large éventail de catégories fonctionnelles, mais il est tout de même intéressant de noter qu’une grande proportion d’entre eux code pour des protéines reliées au métabolisme cellulaire et à la régulation de processus cellulaires. En considérant toutes ces informations, nous avons émis l’hypothèse que les différentes activités de Stau1 puissent être modulées afin de contrôler adéquatement l’expression des transcrits liés par la protéine. Dans la mesure où certains ARNm faisant partie des complexes définis par la présence de Stau1 codent pour des régulateurs clés de la prolifération cellulaire, nous avons voulu examiner si l’expression de la protéine varie au cours du cycle de division cellulaire. Nous avons montré que l’abondance de Stau1 est maximale en début de mitose et qu’elle diminue ensuite lorsque les cellules complètent la division cellulaire. Nous avons ensuite découvert que cette baisse d’expression de Stau1 en sortie de mitose dépend du complexe promoteur d’anaphase/cyclosome (APC/C). En soutien à l’idée que Stau1 soit une cible de cette ubiquitine ligase de type E3, nous avons de plus démontré que Stau1 est ubiquitiné et dégradé par le protéasome. Ce contrôle des niveaux de Stau1 semble important puisque la surexpression de la protéine retarde la sortie de mitose et entraîne une diminution importante de la prolifération cellulaire. Par ailleurs, nous avons supposé que les différentes fonctions de Stau1 puissent également être sujettes à une régulation. Compte tenu que les activités de nombreuses protéines liant l’ARN peuvent être contrôlées par des modifications post-traductionnelles telles que la phosphorylation, nous avons voulu tester la possibilité que Stau1 soit phosphorylé. L’immunopurification de Stau1 et son analyse par spectrométrie de masse nous a permis d’identifier trois phosphosites dans la protéine. L’évaluation du rôle de ces événements de phosphorylation à l’aide de mutants phoshomimétiques ou non-phoshorylables a révélé que la modification de Stau1 pourrait compromettre son association à la protéine UPF1. Comme cette interaction est nécessaire pour déstabiliser les transcrits liés par Stau1, nos résultats suggèrent fortement que la fonction de Stau1 dans la dégradation d’ARNm est régulée négativement par sa phosphorylation. Toutes ces données mettent en lumière l’importance des modifications post-traductionnelles telles que l’ubiquitination et la phosphorylation dans la modulation de l’expression et des fonctions de Stau 1. Somme toute, il est vraisemblable que ces mécanismes de contrôle puissent avoir un impact significatif sur le destin des ARNm liés par Stau1, particulièrement dans un contexte de progression dans le cycle cellulaire.
Post-transcriptional regulation plays a major role in the fine tuning of gene expression by allowing a modulation of protein synthesis in space and time, according to cellular requirements. For instance, proteins recognizing RNA elements on transcripts can influence all the steps of their existence, such as their splicing, nuclear export, subcellular localization, translation and degradation. Staufen1 (Stau1) is a member of the double-stranded RNA-binding protein family that contributes to the post-transcriptional regulation of gene expression by its involvement in mechanisms that promote alternative splicing, transport, de-repression of translation and decay of specific messenger RNAs (mRNAs). The identity of potential Stau1 targets is now known as genome-wide analyses have shown that the protein is associated with about 7% of the HEK293T cell transcriptome. Although these mRNAs are classified in a broad range of functional categories, a large proportion of them code for proteins related to cellular metabolism and regulation of cellular processes. Considering all this information, we hypothesized that the different activities of Stau1 may be modulated in order to control appropriately the expression of Stau1-bound mRNAs. Since some of the mRNAs that are part of Stau1-containing complexes encode key regulators of cell proliferation, we wanted to examine whether Stau1 expression fluctuates during the cell division cycle. We showed that Stau1 abundance peaks at the onset of mitosis and then decreases as cells complete division. We then found that Stau1 down-regulation in mitosis exit is mediated by the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C). To support the idea that Stau1 is a target of this E3-ubiquitin ligase, we further demonstrated that Stau1 is ubiquitinated and degraded by the proteasome. The importance of controlling Stau1 levels during the cell cycle is underscored by the observation that its overexpression delays mitotic exit and impairs cell proliferation. Furthermore, we speculated that Stau1 different functions may also be regulated. In the view that the activities of numerous RNA-binding proteins can be controlled by post-translational modifications such as phosphorylation, we tested the possibility that Stau1 is phosphorylated. Mass spectrometry analysis of immunopurified Stau1 allowed the identification of three phosphosites in this protein. Assessment of the role of these phosphorylation events using phosphomimetic or non-phosphorylatable mutants revealed that Stau1 phosphorylation may compromise its association with Upf1. Because this interaction is necessary to elicit the destabilisation of Stau1-bound RNAs, our results strongly suggest that Stau1 function in mRNA decay is negatively regulated by its phosphorylation. Collectively, these data highlight the importance of post-translational modifications such as ubiquitination and phosphorylation in the modulation of Stau1 expression and functions. Overall, the mechanisms that control Stau1 are likely to have a significant impact on the fate of Stau1-bound mRNAs, especially in the context of cell cycle progression.