Academic literature on the topic 'Fosfolipase C'

Resumo Introdução A habilidade da Candida spp. em produzir enzimas proteolíticas, tais como fosfolipase e proteinases, tem um papel importante na patogenicidade destas leveduras. Objetivo Determinar as espécies causadoras das infecções orais por Candida spp., além de investigar a atividade in vitro das fosfolipases e proteinases em isolados clínicos do gênero Candida, provenientes de pacientes com candidíase oral. Material e método Isolados de Candida spp., pertencentes à Coleção de Cultivos Fúngicos do Laboratório de Microbiologia e Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Faculdade da Serra Gaúcha, foram analisados. Produção de fosfolipases foi analisada utilizando-se Ágar gema de ovo. Liberação de proteinases foi medida utilizando-se extrato de levedura adicionado à albumina bovina. Resultado Um total de 35 isolados clínicos do gênero Candida foi testado. C. albicans foi a espécie predominante (77%). Os demais isolados identificados foram: C. parapsilosis (20%) e C. tropicalis (2%). Ao comparar a atividade de fosfolipase do grupo C. albicans com o grupo Candida não-albicans, foi encontrada diferença significativa (P=0,04). Não foi encontrada diferença significativa entre a C. albicans e a C. não-albicans, para a produção de proteinase. A liberação de proteinase foi significativamente maior quando comparada à produção de fosfolipase para o gênero Candida (P=0,04). Diferença estatisticamente significativa foi encontrada quando a atividade de fosfolipase e proteinase da C. albicans foi comparada à atividade das espécies de C. não-albicans (P=0,02). Conclusão Diferentes quantificações de fosfolipase extracelular e atividade de proteinase têm sido atribuídas aos isolados clínicos de C. albicans quando comparados a outras espécies de Candida.

Foram avaliadas quanto a produção de exoenzimas fosfolipase e proteinase, 79 amostras de Candida isoladas da cavidade bucal de pacientes com lesões bucais características de candidose e indivíduos com boca clinicamente normal, atendidos na Faculdade de Odontologia de Ribeirão Preto USP. Dentre as cepas de C. albicans isoladas de lesões bucais, a fosfolipase e proteinase foram detectadas em, respectivamente, 83,3% e 66,7%. C. tropicalis e C. parapsilosis produziram somente proteinase. Quanto às cepas isoladas de nichos sem lesão, do total de 32 C. albicans, 71,9% apresentaram fosfolipase e 68,7% proteinase. C. tropicalis apresentou apenas a enzima proteinase, C. glabrata, C. krusei, C. guilliermondii e Candida spp, não apresentaram nenhuma das exoenzimas. Entre as amostras de C. albicans de ambos os grupos, o enzimotipo 22 (fosfolipase positiva e proteinase fracamente positiva) foi prevalente. Enzimotipos diferentes foram detectados em amostras da mesma espécie provenientes de mesmo paciente.

A mionecrose é um dos efeitos causados pelo veneno de Bothrops jararacussu. Uma miotoxina com homologia estrutural à fosfolipase A2 (PLA2), mas sem atividade enzimática, foi isolada desse veneno. O veneno de Crotalus durissus terrificus apresenta também atividade miotóxica, que vem sendo atribuída à crotoxina e à PLA2 (crotoxina B), o componente básico do complexo crotoxina. O veneno de Bothrops jararacussu apresenta três proteínas, que têm identidade imunológica com a PLA2 da crotoxina. O presente trabalho comparou a eficiência dos antivenenos polivalentes comerciais produzidos pelo Instituto Butantan - o antiveneno botrópico (AB) e o antiveneno botrópico-crotálico (AB/C) - na neutralização das atividades letal, hemorrágica, coagulante e miotóxica do veneno de B. jararacussu. Os dois antivenenos neutralizaram de maneira semelhante a atividade hemorrágica, mas o AB/C foi três vezes mais potente que o AB em neutralizar a ação miotóxica e duas vezes mais potente na neutralização da letalidade e na ação coagulante do veneno de B. jararacussu. Os dados sugerem que a utilização do AB/C pode ser vantajosa no tratamento de pacientes picados por serpentes dessa espécie

Introducción. Los venenos de serpientes representan una fuente importante de proteínas y péptidos, los cuales exhiben diversas actividades biológicas, tales como antibacterianas, antiparasitarias, antivirales, antitumorales, antifúngicas y contra la agregación plaquetaria, entre otras. Las fosfolipasas A2 presentes en los venenos de serpientes son las proteínas más estudiadas en estos modelos. Se ha demostrado que las fosfolipasas A2, activas e inactivas, poseen actividad catalítica contra células tumorales. Objetivo. Aislar, purificar y caracterizar la fosfolipasa A2 del veneno de Crotalus durissus cumanensis para evaluar su actividad antitumoral in vitro. Materiales y métodos. El aislamiento, la purificación y la identificación de la crotoxina B se hizo mediante la cromatografía de exclusión molecular, la cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC) y la espectrometría de masas. El efecto citotóxico sobre células tumorales (K562) y células normales (células mononucleares de sangre periférica) se determinó utilizando la técnica de MTT. Resultados. La separación y posterior identificación de la crotoxina B del veneno de C. d. cumanensis de Colombia, permitieron evidenciar que esta fosfolipasa A2 posee efecto citotóxico sobre las células mononucleares de sangre periférica con una dosis de 18,23 ± 0,57 μg/ml, mientras que, para las células K562, fue de 2,34 ± 0,199 μg/ml. Conclusiones. Los resultados sugieren la posibilidad de utilizar la crotoxina B aislada del veneno de C. d. cumanensis como un posible recurso terapéutico para su aplicación en humanos. Palabras clave: Crotalus durissus cumanensis; citotoxicidad; fosfolipasas A2; crotoxina B.

OBJETIVO: Desenvolver um sistema para o diagnóstico molecular da tuberculose por reação em cadeia da polimerase, do inglês polymerase chain reaction (PCR), pela construção de primers baseados na diferença da organização de uma região intergênica da fosfolipase (phospholipase) C (região plcB-plcC), que diferencia Mycobacterium tuberculosis das outras micobactérias. MÉTODOS: Um produto de PCR com o tamanho esperado (432 pb) foi obtido somente de M. tuberculosis e M. africanum. Um total de 33 isolados micobacterianos e 273 amostras clínicas de pacientes com suspeita de tuberculose foram examinados. Estes foram submetidos ao estudo comparativo da técnica de PCR contra o cultivo. RESULTADOS: Os dados mostraram 93,8% de exatidão para PCR contra o cultivo (p < 0,0001), 93,1% de sensibilidade (IC: 88,7-96,0) e especificidade de 96,4% (IC: 96,1-99,4). O valor de Kappa foi de 0,82, demonstrando um alinhamento perfeito para a verificação do grau de concordância entre os testes. CONCLUSÃO: O uso da região plcB-plcC para a amplificação por PCR é mostrado como uma ferramenta importante e de confiança para o diagnóstico específico de tuberculose nas amostras clínicas analisadas.

INTRODUÇÃO: A criptococose é uma patologia sistêmica decorrente da ação de leveduras do gênero Cryptococcus sp., em particular, as espécies C. neoformans e C. gattii. A doença acomete inicialmente os pulmões, todavia, os fungos apresentam forte tropismo para o tecido cerebral ocasionando a meningite criptocócica. Fatores como a atividade da cápsula proteica e as enzimas sintetizadas pelo fungo corroboram para a instauração da doença e, além disso, são parâmetros utilizados em testes laboratoriais para a detecção dos patógenos em amostras biológicas. OBJETIVO: Descrever os fatores comumente associados ao desenvolvimento da meningite criptocócica e os testes laboratoriais utilizados na detecção dos patógenos. METODOLOGIA: Este é um estudo exploratório, mediado por pesquisa bibliográfica, com trabalhos produzidos entre os anos 2000 e 2016, com ênfase na descrição dos aspectos funcionais, epidemiológicos e laboratoriais da doença. RESULTADOS E DISCUSSÃO: A criptococose é fortemente influenciada pela ação da cápsula proteica e enzimas como a fosfolipase e urease. O procedimento laboratorial mais utilizado é a pesquisa do fungo em ágar Sabouraud, visto que o meio canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) pode ser executado em segundo plano. CONCLUSÃO: O estudo dos fatores que reforçam a patogenicidade da meningite fúngica pode auxiliar na elaboração de futuras medidas terapêuticas direcionadas para o controle das taxas de mortalidade humana. 
 Palavras-chave: Cryptococcus neoformans. Meningite. Meningite criptocócica.
 ABSTRACT
 INTRODUCTION: Cryptococcosis is a systemic disorder resulting from the Cryptococcus sp. action, in particular, the species C. neoformans and C. gattii. The disease initially affects the lungs, however, fungi have strong tropism for the brain tissue causing cryptococcal meningitis. Factors such as the activity of the protein capsule and enzymes synthesized by the fungus to confirm the establishment of the disease and, furthermore, are parameters used in laboratory tests for detecting pathogens in biological samples. OBJECTIVE: To describe the factors commonly associated with the development of cryptococcal meningitis and the laboratory tests used in the detection of pathogens. METHODOLOGY: This is an exploratory study, mediated by literature, with works produced between 2000 and 2016, with emphasis on the description of the functional, laboratory and epidemiological aspects of the disease. RESULTS AND DISCUSSION: Cryptococcosis is strongly influenced by the action of the protein capsule and enzymes like phospholipase and urease. The most common laboratory procedure is the fungus research in Sabouraud agar, since the middle bromothymol canavanine-glycine-blue (CGB) can be run in the background. CONCLUSION: The study of the factors that enhance the pathogenicity of fungal meningitis can assist in the development of future therapeutic measures aimed to control mortality rates.
 Keywords: Cryptococcus neoformans. Meningitis. Cryptococcal meningitis.

Rhodococcus equi é um micro-organismo intracelular facultativo, agente etiológico da rodococose, uma importante enfermidade que acomete principalmente potros com menos de seis meses de idade, causando a morte geralmente em decorrência de lesões pulmonares. Este agente também tem potencial zoonótico e emergiu como um patógeno oportunista no mundo, acometendo humanos imunocomprometidos, especialmente os transplantados e infectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Entretanto, infecções por R. equi em hospedeiros hígidos tem sido relatadas, principalmente em crianças e idosos. Estudos tem mostrado um nível crescente na resistência de isolados de R. equi em relação aos antimicrobianos comumente utilizados no tratamento de animais e seres humanos infectados por este agente. A virulência deste pode estar associada a fatores como a cápsula de polissacarídeo, fosfolipase C e à enzima colesterol oxidase (fator equi). No entanto, uma proteína localizada em um plasmídeo, designada vapA, é essencial para a sobrevivência e replicação do agente em macrófagos. Com isso, os objetivos deste estudo foram avaliar o perfil de suscetibilidade de isolados de R. equi de diferentes fontes em relação aos antimicrobianos mais comumente utilizados na terapêutica animal e humana, bem como verificar a associação entre a presença do gene vapA e o índice de resistência múltipla aos antimicrobianos (IRMA). Neste estudo, 67 isolados brasileiros de R. qui de diferentes fontes foram analisados: 30 provenientes de amostras clínicas de equinos, sete de humanos e 30 ambientais (seis do solo e 24 de fezes de equinos). Para avaliar o perfil de suscetibilidade dos isolados utilizou-se o método de disco difusão, sendo testadas 16 drogas de diferentes classes de antimicrobianos. As amostras clínicas de equinos apresentaram as maiores taxas de resistência à penicilina (86,7%) e lincomicina (30%). Além disso, foram também resistentes a macrolídeos (azitromicina a 6,7%, eritromicina a 6% e claritromicina a 3,3%) e rifamicina (13%). Todas as amostras humanas e ambientais foram sensíveis aos macrolídeos e rifamicina. Contudo, isolados ambientais demonstraram níveis elevados de resistência à penicilina e cloranfenicol. Da mesma forma, os isolados humanos apresentaram alto nível de resistência ao ceftiofur, lincomicina e sulfazotrim. O IRMA em todos os isolados de R. equi variou de 0 a 0,67, tendo como valores médios 0,19 para as amostras clínicas de equinos, 0,14 nas ambientais e em isolados humanos foi de 0,1. Apesar da alta sensibilidade observada nos isolados analisados, verificaram-se diferentes níveis de resistência nas amostras clínicas de equinos. Em contraste, os isolados ambientais não demonstraram resistência em relação aos agentes antimicrobianos utilizados na terapia da rodococose equina. Além disso, em isolados humanos não se observou resistência contra a droga para uso restrito em terapia de humano. Com base no IRMA observado em isolados clínicos de equinos, destacamos a importância de medidas restritivas e mais cautela na utilização de antimicrobianos em infecções causadas por R. equi para evitar o aumento de novas cepas multirresistentes.

Infecções oportunistas da cavidade bucal são primariamente causadas por fungos do gênero Candida e freqüentemente ocorrem em pacientes com câncer que estão sobtratamento quimioterápico e antibacteriano. De 44 amostras coletadas da mucosa oral de pacientes com câncer, observou-se o isolamento de 25 leveduras do gênero Candida em cultivo realizado em ágar Sabouraud-dextrose. Foram identificados Candida albicans em 24 (96%) isolados e C. krusei em 1 (4%). As características fenotípicas das amostras de Candida albicans mostraram que todos os isolados foram fortemente proteolíticos, capazes de produzir fosfolipases e possuíam os biotipos caracterizados como 811(95,8%) e 511 (4,2%) em relação a susceptibilidade às toxinas killer.

Se determinó la capacidad de los extractos de seis plantas de uso etnomédico (Acacia hindsii, Aristolochia maxima, Cissampelos pareira, Hamelia patens, Piper peltatum y Sansevieria hyacinthoides) para neutralizar los efectos proteolí­tico y fosfolipasa A2 (PLA2) del veneno de Bothrops asper, la principal especie causante de envenenamiento en el paí­s. Estos efectos, indicadores de la capacidad miotóxica, hemorrágica e inflamatoria del veneno, se evaluaron en ensayos controlados in vitro. Las plantas fueron colectadas, secadas y extraí­das por percolación con etanol. Los resultados demuestran que ninguno de los extractos posee actividad PLA2 o proteolí­tica intrí­nseca a las dosis estudiadas. Se determinó que tres de los extractos neutralizaron pobremente (< 50%) los efectos estudiados: S. hyacinthoides neutralizó 13.90 ± 6.41% del efecto PLA2 y P. peltatum y C. pareira el 32.98 ± 5.51% y 24.52 ± 7.45%, respectivamente, del efecto proteolí­tico. Por ello, ningún extracto se evaluó en pruebas de neutralización de la letalidad en ratones. Se concluye que no es recomendable el uso aislado de estas plantas en el tratamiento del envenenamiento por mordedura de B. asper, aunque posiblemente las que demostraron alguna actividad puedan resultar potenciadas al usarse en combinación con otras plantas, como se hace en las recetas tradicionales. Dada la complejidad de los componentes del veneno y sus efectos fisiopatológicos, falta investigar la capacidad de las plantas estudiadas para neutralizar las coagulopatí­as, edema y miotoxicidad producidas durante el envenenamiento.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-08-30Bitstream added on 2014-06-13T19:45:11Z : No. of bitstreams: 1 villaverde_aisb_dr_botfmvz.pdf: 3478993 bytes, checksum: d5ea0090ec4786ded2155ff7802d56fe (MD5)<br>Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)<br>O estudo da proteína fosfolipase C zeta (PLCζ), considerada o fator espermático ativador do oócito em mamíferos, pode beneficiar algumas técnicas de reprodução assistida, como a injeção espermática intracitoplasmática e transferência nuclear, por propiciar conhecimento a respeito do processo de fertilização e a possibilidade de utilização da PLCζ presente nos extratos espermáticos. Portanto, o objetivo deste estudo foi localizar a PLCζ em extratos provenientes do citosol e matriz perinuclear de espermatozóides de gatos domésticos normospérmicos e teratospérmicos. Amostras de sêmen foram colhidas de seis gatos adultos: normospérmicos (n=3), teratospérmicos (n=2) e de qualidade seminal intermediária (n=1). As proteínas do citosol foram extraídas utilizando os procedimentos de sonicação, ultracentrifugação, ultrafiltração e precipitação em sulfato de amônio. Por sua vez, as proteínas da matriz perinuclear foram extraídas após incubação em Na2CO3, sonicação, ultracentrifugação, ultrafiltração e precipitação em sulfato de amônio. Com base na avaliação ultraestrutural dos espermatozóides e dosagem de proteína total, foi confirmada a eficiência de ambos os protocolos de extração. As amostras da matriz perinuclear apresentaram 3,3 vezes menos proteína total e diferente perfil protéico na eletroforese unidimensional e bidimensional quando comparadas as amostras obtidas do citosol. Após análise das proteínas encontradas, foi concluído que nos extratos espermáticos do citosol e matriz perinuclear de gatos domésticos normospérmicos e teratospérmicos estão presentes proteínas de peso molecular semelhante ao previamente descrito para a proteína PLCζ em outras espécies de mamíferos<br>The study of phospholipase C zeta protein (PLCζ), considered as the oocyte activating sperm factor in mammals, could benefit some assisted reproductive techniques, such as intracytoplasmic sperm injection and nuclear transfer, by providing knowledge about the process of fertilization and the possibility of using the PLCζ contained in the sperm extracts. Thus, the aim of this study was to localize the phospholipase C zeta (PLCζ) protein in extracts from the spermatozoa cytosol and perinuclear matrix of normospermic and teratospermic domestic cat. Sperm samples were collected from six adult male cats: normospermic (n=3), teratospermic (n=2) and with intermediate sperm quality (n=1). Proteins from the cytosol were extracted using the procedures of sonication, ultracentrifugation, ultrafiltration and precipitation in ammonium sulfate. On the other hand, proteins from perinuclear matrix were extracted after incubation in Na2CO3, sonication, ultracentrifugation, ultrafiltration and precipitation in ammonium sulfate. Based on the ultrastructural analysis of the spermatozoa and total protein determination, the efficiency of both extraction protocols was confirmed. Samples from perinuclear matrix showed 3.3 times less total recovered protein and different protein profile in the uni- and bidimensional electrophoresis when compared to the samples obtained from the cytosol. After protein profile analysis, it can be concluded that several proteins showing similar molecular weight to that previously described for PLCζ protein in other mammalian species are presented in both sperm extracts from cytosol and perinuclear matrix of normospermic and teratospermic domestic cats

Orientador: Maria Denise Lopes<br>Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga<br>Banca: Nereu Carlos Prestes<br>Banca: Claudia Barbosa Fernandes<br>Banca: Nei Moreira<br>Resumo: O estudo da proteína fosfolipase C zeta (PLCζ), considerada o fator espermático ativador do oócito em mamíferos, pode beneficiar algumas técnicas de reprodução assistida, como a injeção espermática intracitoplasmática e transferência nuclear, por propiciar conhecimento a respeito do processo de fertilização e a possibilidade de utilização da PLCζ presente nos extratos espermáticos. Portanto, o objetivo deste estudo foi localizar a PLCζ em extratos provenientes do citosol e matriz perinuclear de espermatozóides de gatos domésticos normospérmicos e teratospérmicos. Amostras de sêmen foram colhidas de seis gatos adultos: normospérmicos (n=3), teratospérmicos (n=2) e de qualidade seminal intermediária (n=1). As proteínas do citosol foram extraídas utilizando os procedimentos de sonicação, ultracentrifugação, ultrafiltração e precipitação em sulfato de amônio. Por sua vez, as proteínas da matriz perinuclear foram extraídas após incubação em Na2CO3, sonicação, ultracentrifugação, ultrafiltração e precipitação em sulfato de amônio. Com base na avaliação ultraestrutural dos espermatozóides e dosagem de proteína total, foi confirmada a eficiência de ambos os protocolos de extração. As amostras da matriz perinuclear apresentaram 3,3 vezes menos proteína total e diferente perfil protéico na eletroforese unidimensional e bidimensional quando comparadas as amostras obtidas do citosol. Após análise das proteínas encontradas, foi concluído que nos extratos espermáticos do citosol e matriz perinuclear de gatos domésticos normospérmicos e teratospérmicos estão presentes proteínas de peso molecular semelhante ao previamente descrito para a proteína PLCζ em outras espécies de mamíferos<br>Abstract: The study of phospholipase C zeta protein (PLCζ), considered as the oocyte activating sperm factor in mammals, could benefit some assisted reproductive techniques, such as intracytoplasmic sperm injection and nuclear transfer, by providing knowledge about the process of fertilization and the possibility of using the PLCζ contained in the sperm extracts. Thus, the aim of this study was to localize the phospholipase C zeta (PLCζ) protein in extracts from the spermatozoa cytosol and perinuclear matrix of normospermic and teratospermic domestic cat. Sperm samples were collected from six adult male cats: normospermic (n=3), teratospermic (n=2) and with intermediate sperm quality (n=1). Proteins from the cytosol were extracted using the procedures of sonication, ultracentrifugation, ultrafiltration and precipitation in ammonium sulfate. On the other hand, proteins from perinuclear matrix were extracted after incubation in Na2CO3, sonication, ultracentrifugation, ultrafiltration and precipitation in ammonium sulfate. Based on the ultrastructural analysis of the spermatozoa and total protein determination, the efficiency of both extraction protocols was confirmed. Samples from perinuclear matrix showed 3.3 times less total recovered protein and different protein profile in the uni- and bidimensional electrophoresis when compared to the samples obtained from the cytosol. After protein profile analysis, it can be concluded that several proteins showing similar molecular weight to that previously described for PLCζ protein in other mammalian species are presented in both sperm extracts from cytosol and perinuclear matrix of normospermic and teratospermic domestic cats<br>Doutor

Submitted by Rosana Amâncio (rosana.amancio@ufcg.edu.br) on 2018-07-11T20:08:46Z No. of bitstreams: 1 propriedades eletronicas, ópticas e vibracionais da região C.pdf: 18345145 bytes, checksum: e90bc1985f0f75d2e3d83ecaa39d4a34 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2018-07-11T20:08:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 propriedades eletronicas, ópticas e vibracionais da região C.pdf: 18345145 bytes, checksum: e90bc1985f0f75d2e3d83ecaa39d4a34 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29<br>Neste trabalho, apresentamos um estudo das propriedades eletrônicas, ópticas, vibracionais e termodinâmicas da região C-Terminal de Fosfolipases A2 Lisina 49 (PLA2s Lys 49). Este foi realizado por meio de cálculos quânticos através da Teoria do Funcional da Densidade (DFT), utilizando a aproximação da densidade local (Local Density Approximation - LDA) e a aproximação do gradiente generalizado (Generalized Gradient Approximation - GGA). Também foram realizados cálculos baseados no modelo tight binding. As PLA2 Lys 49 compõe um grupo de miotoxinas que apresentam pouca ou nenhuma atividade catalítica e ainda assim são capazes de atuarem na membrana celular por meio de um mecanismo alternativo propiciando a morte da célula. A região C-terminal destas proteínas, em particular a região compreendida entre os aminoácidos 115-129, é apontada como responsável pelo dano as membranas. Pouco se sabe sobre as características que propiciam a esta região tal capacidade e como acontece a sua interação com a membrana celular. Este trabalho realizou uma caracterização das propriedades físicas desta região. Buscando, portanto, estabelecer uma relação entre as propriedades físicas expressas por essa região e seu potencial de dano celular. Um resultado inicial obtido por este estudo foram as curvas corrente-voltagem (I-V ) para nove diferentes peptídeos que correspondem as regiões 115-129 de PLA2 de diferentes espécies de serpentes. As curvas I-V foram obtidas por meio do modelo tight binding. Elas demostraram que os peptídeos estudados apresentam características de semicondutores. Também apresentam semelhança com resultados experimentais obtidos por LOMONTE et al, 2003. Usando a DFT, foram realizados os cálculos da área acessível ao solvente, da densidade eletrônica, análise populacional de cargas, orbitais de fronteira, densidade de estados. Também foram realizados cálculos de propriedades vibracionais como espectro infravermelho, de propriedades ópticas e das propriedades termodinâmicas como capacidade térmica, entropia, entalpia e energia livre. As propriedades eletrônicas demostram que há a possibilidade de que a interação da região C-Terminal com a membrana seja predominantemente eletrostática. A análise populacional de carga demostrou que o aminoácido Lisina 122 possui carga igual a zero. Este fato indica que ele pode não possuir papel importante como é descrito na literatura. Os resultados obtidos para a área acessível ao solvente indicam que um peptídeo com maior área disponível para interagir com a membrana não causará maior dano. Os resultados ópticos apresentaram picos de absorção dentro da região visível. Estes resultados juntamente com os resultados vibracionais servem como uma "digital" para a identificação dos peptídeos estudados. Os resultados termodinâmicos apresentados neste trabalhos podem ser utilizados em futuras pesquisas envolvendo PLA2s Lisina 49.<br>In this work, we present a study of the electrical properties, optical, vibrational and thermodynamic of the C-terminal Phospholipase A2 Lysine region 49 (PLA2 Lys 49). This was done by means of quantum calculations by Density Functional Theory (DFT), using the approach of Local Density Approximation (LDA) and the approach of the Generalized Gradient Approximation (GGA). They were also made calculations based on the model tight binding. The PLA2 Lys 49 composes myotoxins group that presents a little or no catalytic activity and still are able to act on the cell membrane by providing an alternative mechanism of cell's death. The C-terminal region of these proteins, in particular the region between amino acids 115-129 is identi_ed as responsible for the damage the membranes. Little is known about the characteristics that propitiate to this region such capacity and how are their interaction with the cell membrane. This work constitutes a characterization of the physical properties of this region. Searching, therefore, establish a relationship between the physical properties expressed by this region and its potential for cell damage. An initial results obtained in this study were current-voltage curves (I-V) for nine di_erent peptides corresponding to regions 115-129 PLA2 from di_erent snake species. The (I-V) curves were obtained by the model tight binding. They demonstrate that the peptides studied have semiconductor characteristics. They also have similarity with experimental results obtained by LOMONTE et al., 2003. Using the DFT were performed the calculations of the area accessible to the solvent, the electron density, population analysis of load, orbital border, and density of states. They were also carried out calculations of vibrational properties as infrared spectrum, optical properties and thermodynamic properties such as heat capacity, entropy, enthalpy and free energy. The electronic properties show that there is a possibility the interaction of the C-terminal region with the membrane it's predominantly electrostatic. The load population analysis showed that the amino acid Lysine 122 has load zero. This indicates that it may not have important role as described in the literature. The consequences obtained for the solvent accessible area indicates that a peptide with the largest area available to interact with the membrane not cause greater damage. The optical results presented absorption peaks in the visible region. These results together with the results vibrational serve like a "digital"to identify the studied peptides. The Thermodynamic results presented in this work can be used in future research involving PLA2 Lysine 49.

Os conhecimentos sobre os mecanismos regulatórios responsáveis pelo crescimento dos fungos filamentosos apresentam lacunas e sua compreensão é necessária para o desenvolvimento de uma terapêutica antifúngica mais adequada, assim como para incrementar a síntese de produtos de interesse comercial. Assim sendo, estudar o envolvimento do Ca2+ na resposta de um fungo modelo como A. nidulans sob fontes de carbono diferentes constitui um meio de gerar conhecimentos sobre as características de crescimento dos fungos filamentosos, de sua resposta a adaptação ambiental e dos mecanismos que controlam essa resposta. Analisou-se na linhagem A26 e na AP27, esta última com ruptura do gene da plcA, o gradiente de Ca2+ citosólico, a morfologia das hifas, a germinação e o ciclo de divisão nuclear quando as linhagens tinham calcineurina ou calmodulina inibidas e quando os canais de Ca2+ estavam bloqueados ou abertos. Os níveis de Ca2+ citosólico na linhagem A26, crescendo em presença de glicose, foram maiores que os detectados em meio suplementado com pectina. O ciclo de germinação e divisão celular no AP27, independentemente da fonte de carbono, mostrou-se mais lento se comparado com a linhagem A26, provavelmente devido ao fato de seus estoques intracelulares de Ca2+, tanto em nível vesicular quanto citosólico, serem menores. A linhagem AP27 apresentou ramificações dicotômicas nas pontas das hifas e nas hifas laterais em ambas as fontes de carbono nas quais foi cultivada, o que não se observou na linhagem A26. Quando calcineurina foi inibida por ciclosporina A, as hifas das duas linhagens, em ambas condições de cultivo, alongaram-se menos e apresentaram-se mais ramificadas, no entanto este efeito foi mais pronunciado em presença de glicose, e entre as duas linhagens pode-se dizer que foi mais intenso na linhagem AP27, demonstrando a importância dos níveis de cálcio na atividade desta enzima e conseqüentemente no desenvolvimento normal das hifas. A abertura dos canais de Ca2+, por ionóforo, produziu hiperramificação em ambas as linhagens, mas principalmente quando cresciam em pectina e ao contrário do efeito observado em presença de verapamil, que bloqueia os canais de Ca2+, não promoveram hifas laterais e nem pontas dicotômicas. No entanto o outro bloqueador dos canais de Ca2+ testado, ácido caurenóico, apresentou efeito morfológico diferente, pois as hifas tornaram-se curvas o que indica perda de polaridade. O inibidor da calmodulina (TFP) retardou a germinação, principalmente no mutante AP27, quando crescendo em presença de glicose. Lembrando que o complexo Ca2+/CaM ativa a calcineurina e que o mutante apresenta menores níveis de cálcio, esse resultado é justificável. A ruptura do gene plcA não impediu o crescimento e desenvolvimento do mutante, provavelmente porque a função desta enzima poder ser provida por outras partes do genoma, mas comprometeu os níveis intracelulares de cálcio e conseqüentemente a sua morfologia. Este estudo mostra a importância da fosfolipase C, para manutenção dos níveis intracelulares de Ca2+, no desenvolvimento normal das hifas de A. nidulans e, pela primeira vez, demonstra que esses níveis são diferentes quando o fungo cresce em presença de uma fonte de carbono, prontamente metabolizável ou não. Esses resultados conferem ao cálcio um papel modulador nessas condições de cultivo.<br>The knowledge about regulatory mechanisms responsible for filamentous fungi growth presents lacks and its understanding is important to develop adequate antifungal therapy either to contribute the synthesis of interestingly commercial products. By this way, study Ca2+ relationship to a fungal model as A. nidulans about different carbon sources, constitute knowledge about the filamentous fungi growing characteristics, environment adaptation and its control mechanisms. The strains A26 and AP27 was analyzed, this last one with disruption plcA gene, cytosolic Ca2+ gradient hyphal morfology, germination and nuclear division cycle when these strains had calcineurin or calmodulin inhibition and Ca2+ channel were blocked or opened. Cytosolic Ca2+ levels in A26 strain, growing in the presence of glucose was higher than supplemented media with pectin. AP27 strain, independently of carbon source, demonstrated lower germination and cell division than A26 strains, probably due to the fact that intracellular Ca2+ stocks either vesicular as cytosolic levels were lower. AP27 strain presented dichotomous branching at tip-high and lateral hyphae, at both carbon source that was grown, didnt observed at A26 linkage. When calcineurin was inhibited by cyclosporin A, hyphae from both strains, in both growth conditions, had less elongated and showed more branching, however this effect was more pronounced in presence of glucose, and between both strains was more intense at AP27 strain, indicating the importance of Ca2+ levels at this enzymatic activity and therefore the normal development of hyphae. The opening of Ca2+ channel by ionophore, produced hyperbranching in both strains, even when growth in pectin and in contrast of effect observed in the presence of verapamil, that blocks Ca2+ channels, didnt promote lateral or tip high dichotomous branching. However kaurenoic acid, an another Ca2+ channel blocker tested, presented different morphological effect, because hyphae became curved, indicating loss of polarity. Calmodulin inhibitor (TFP) delayed germination mainly at mutant AP27, when growing in the presence of glucose. Remembering that Ca2+/CaM complex activate calcineurin and the mutant exhibit lower Ca2+ levels, justifying this results. The rupture of plcA gene didnt affected growth and development of mutant, probably because the function of this enzyme can be provided by another parts of genoma, damaged the Ca2+ intracellular levels and consequently its morphology. This study shows the importance of fosfolipase C to maintaining the intracellular Ca2+ levels, at the normal hyphae development of A. nidulans and for the first time, demonstrating that this levels are different when fungi are grown in the presence of carbon source, promptly metabolizable or not. This results gives to Ca2+ as modulator at growth conditions.

A cristalografia de raios-X e um método de singular importância para a determinação da estrutura de macromoléculas. A importância em resolver estruturas de proteínas continua a crescer em campos variando desde a bioquímica e biofísica básicas ate o desenvolvimento farmacêutico e biotecnologia. o presente trabalho esta relacionado com os estudos cristalográficos de três diferentes moléculas biológicas. Calgranulina C de granulócitos porcinos, uma proteína que liga cálcio, supostamente envolvida em processos celulares regulados, foi cristalizada com parâmetros de rede a=b=54.35 e c=141.32&#197, grupo espacial P3121 ou seu enantiomorfo P3221. Várias tentativas foram feitas no sentido de se determinar a estrutura por substituição molecular, mas a alta flexibilidade entre os motivos \"EF-hands\" quando da ligação ao íon cálcio podem ser responsáveis pelo insucesso dos resultados. Tripanotiona redutase de T. cruzi e um excelente alvo para modelagem de inibidores e potenciais drogas contra a doença de Chagas. O complexo mutante TR + GSPD foi cristalizado com parâmetros de rede a=b=92.7 e c=156.2&#197, grupo espacial P43. Um conjunto preliminar de fases foi obtido por refinamento de corpo rígido contra as coordenadas da TR nativa. O modelo foi refinado a 2.4&#197 de resolução, Rfactor=19.8%. Fosfolipase A2 extraída do veneno da serpente Bothrops moojeni foi cristalizada com parâmetros de rede a=63.1, b=90.5 e c=40.2&#197 e &#946=125.1&#176, grupo espacial C2. A estrutura foi resolvida por substituição molecular usando o dímero da fosfolipase A2 de Crotalus atrox como modelo. A analise de sua seqüência de aminoácidos e necessária para posteriores ciclos de refinamento.<br>X-ray crystallography is a essential method for determination of the structure of macromolecules. The importance of solving protein structures continues to grow in fields ranging from basic biochemistry and biophysics to pharmaceutical development and biotechnology. The current work is concerned to the crystallographic studies of three different biological molecules. Calgranulin C from pig granulocytes, a calcium binding protein though to be involved in regulation of cell process, was crystallized with cell parameters a=b=54.35 and c=141.32&#197, space group P3121 or its enantiomorph P3221. Several attempts were made in order to solve the structure, but the high flexibility between its EF-hands motives while binding the ion calcium may be responsible for the lack of success in the results. Trypanothione reductase (TR) from T. cruzi is a target enzyme for modeling an inhibitor for Chagas´ disease. The C58S TR + GSPD mutant complex was crystallized with a=b=92.7 and c=156.2&#197, space group P43. A preliminary set of phases was obtained by rigid body refinement against the coordinates for the native TR. The model was refined to 2.4&#197 resolution, Rfactor=19.8%. Phospholipase A2 extracted from the venon of the snake Bothrops moojen; was crystallized with cell parameters a=63.1, b=90.5, c=40.2&#197 and &#946=125.1&#176, space group C2. The structure was solved by molecular replacement techniques using the dimer of phospholipase A2 from Crotalus atrox as a model. The aminoacid sequence analysis is needed for further refinement cycles.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_otavio_brod.pdf: 418993 bytes, checksum: 32f13d3584050e87ad3df6842a8e5496 (MD5) Previous issue date: 2008-11-17<br>Antibiotics used for the last decades as growth promoters for animals, were banned in several countries because of the risk of inducing the appearance of antibiotic resistant bacteria. Probiotics, live microorganisms that benefit health promoting the stability of the gut microbiota, are their most promising substitutes. The objective of this research was to determine the probiotic properties of Pichia pastoris and a recombinant P. pastoris containing the Clostridium perfringens fosfolipase C gene. Ross® P8 female chicks were randomly distributed in four groups of ten each, in three repeats, and fed with a commercial food devoid of antibacterials. Group 1 was fed with un-supplemented food; group 2 was supplemented with 1x106 viable P. pastoris strain KM71H gr-1; group 3 with 1x106 viable recombinant P. pastoris containing the C. perfringens fosfolipase C gene gr-1 and group 4 with 1x106 viable spores of Bacillus cereus var. Toyoi gr-1. Water and food were supplied ad libitum. Weight gain of each animal and food conversion of each group at 49 days of age, were estimated. Individual seroconversions against C. perfringens &#945; toxin at days 1, 10, 20, 30 and 49 were estimated. At the end of the experiment the animals were slaughtered and samples from different organs examined histologically. Mean live weights at 49 days of age were 2.172, 2.228, 2.410 and 2.333 Kg for groups 1, 2, 3 and 4, respectively, different at P<0.05. Mean food conversions were 2.58, 2.41, 2.35 and 2.50 for groups 1, 2, 3 and 4, respectively. Seroconversions at 49 days of age were 1.1, 1.4, 1.5 and 1.3 for groups 1, 2, 3 and 4, respectively, different at P<0.05. Histological alterations were not detected. It was concluded that P. pastoris and recombinant P. pastoris may be used as probiotics for broilers due to their capacity of increasing food efficiency and seroconversion without undesirable effects.<br>Os antibióticos utilizados como promotores de crescimento nas últimas décadas foram banidos em vários países devido ao risco de induzir o surgimento de bactérias resistentes. Entre as alternativas para sua substituição, os probióticos, suplementos alimentares compostos de microrganismos vivos que beneficiam a saúde do hospedeiro através do equilíbrio da microbiota intestinal, aparecem como a mais plausível. Este trabalho objetivou determinar as propriedades como probiótico da levedura Pichia pastoris e sua variante recombinante contendo o gene da fosfolipase C de Clostridium perfringens. Frangas de um dia de idade da linhagem Ross® P8 foram distribuídas aleatoriamente em quatro grupos de dez animais cada, em três repetições, e alimentadas com ração comercial isenta de antibacterianos. O grupo 1 (Controle) recebeu ração não suplementada, o grupo 2 recebeu a mesma ração suplementada com 1x106 células viáveis gr-1 de P. pastoris cepa KM71H, o grupo 3 ração suplementada com 1x106 gr-1 de células viáveis de P. pastoris recombinante contendo o gene da toxina &#945; de C. perfringens, e o grupo 4 ração suplementada com 1x106 gr-1 de esporos viáveis de Bacillus cereus var. Toyoi. Ração e água foram oferecidos ad libitum. Estimou-se o ganho de peso de cada animal aos 49 dias de idade, e a conversão alimentar de cada grupo. Determinou-se a soroconversão individual por ELISA, utilizando como antígeno a toxina &#945; padrão de C. perfringens, a partir de amostras de sangue coletadas aos 1, 10, 20, 30 e 49 dias de idade. Ao término do experimento os animais foram abatidos e amostras de órgãos submetidos a análise histopatológica. No dia 49, os pesos vivos médios foram 2,172, 2,228, 2,410 e 2,333 kg, significativamente diferentes (P<0,05) ao grupo controle, para os grupos 1, 2, 3 e 4, respectivamente. As conversões alimentares médias foram 2,58, 2,41, 2,35 e 2,5 para os grupos 1, 2, 3 e 4, respectivamente. As soroconversões ao dia 49 foram 1,1, 1,4, 1,5 e 1,3 para os grupos 1, 2, 3 e 4, respectivamente, significativamente diferentes (P<0,05) ao grupo controle. Nos estudos histopatológicos não foram encontradas alterações. Concluiu-se que P. pastoris e P. pastoris recombinante podem ser utilizadas como probiótico em frangos de corte por aumentar a eficiência alimentar e a soroconversão, sem apresentar contraindicações.

O objetivo deste trabalho foi à purificação da toxina alfa produzida por Costridium perfringens tipo A em sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/fosfato nos modos contínuo e descontínuo. Dois planejamentos fracionários sequenciais foram aplicados para estudar a partição da toxina alfa em SDFA, em função de 4 variáveis: massa molar e concentração do PEG, concentração do fosfato e pH. Os melhores resultados para o fator de purificação, rendimento em atividade e coeficiente de partição foram obtidos com PEG 8000 g/mol (15%, w/w), fosfato 20% (w/w) e pH 8.0. Este sistema permitiu um fator de purificação de 4,6 com rendimento em atividade de 230% e coeficiente de partição de 113,9 na fase PEG. Após isto, novos experimentos foram realizados para aperfeiçoar a purificação da toxina alfa com o emprego de um planejamento experimental completo 22. Nesta pesquisa a concentração do PEG 8000 g/mol e sais de fosfato pH 8,0 foram variados. O coeficiente de partição, fator de purificação e rendimento em atividade foram fortemente influenciados por estas variáveis. Aumentando ambos os fatores estudados, foi observado um aumento nas respostas, com exceção para o fator de purificação. O melhor fator de purificação (5,7) foi obtido com 17,5% e 15% das concentrações de PEG e fosfato, respectivamente. A coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi usada para extrair toxina alfa a partir do sobrenadante com (PEG) (MM = 8,000 g/mol) e solução de sais de fosfato de sódio e de potássio (pH 8.0). Os resultados obtidos demonstraram que a velocidade de fluxo da fase dispersa (VD) de 3 Ml/min foi a melhor condição para as respostas hold up (ED = 0,8), eficiência de separação (ES = 100 %) e fator de purificação (Pf = 2,37), pois os melhores resultados foram obtidos nesta taxa de fluxo usando uma velocidade de rotação dos discos baixa (35 rpm), enquanto o melhor coeficiente de transferência de massa (KDa = 2,8 x10-3 min-1) foi encontrado na maior velocidade de rotação usada (140 rpm).<br>The aim this work was purification alpha-toxin (phospholipase C) produced by Costridium perfringens type A by aqueous two-phase systems (ATPS) PEG/phosphate in discontinue and continue mode. Two sequential half-fraction designs were applied to studying the &#8733;-toxin partition in ATPS, as a function of four factors: PEG molar mass and concentration, phosphate concentration and pH. The highest purification factor, yield and partition coefficient results were obtained with PEG 8000 (15%, w/w), phosphate at 20% (w/w) and pH 8.0. This system allows an &#8733;-toxin purification of 4.6 fold with final activity yield of 230% and partition coefficient of 113.9 in the PEG rich phase. After this, new experiments were realized for the optimization of &#8733;-toxin purification with employed of full experimental design. In this research the concentration of PEG 8000 g/mol and phosphate salts pH 8.0 were varied. The partition coefficient (K), purification factor (Pf) and activity yield (Y%) were strongly influenced for these variables. Increasing both factors was observed an increase of these responses, except for P Pf. The higher purification factor (5.7) was obtained with 17.5% and 15% of the PEG and phosphate concentration, respectively. A continuous perforated rotating disc contactor (PRDC) was used for extraction of &#8733;-toxin from the supernatant of Clostridium perfringens type A cultivations with polyethylene glycol (PEG) (MW = 8,000 g/mol) and dipotassium and sodium phosphate salt solution (pH 8.0). The results obtained demonstrated that VD = 3 L/min was by far the optimum dispersed phase flowrate for all these response variables. Besides, maximum values of ED (0.8), Es (100 %) and Pf (2.37) were obtained at this flowrate using the lowest rotational speed (35 rpm), while optimum KDa (2.8 x 10-3 min-1 ) was achieved at the highest agitation level (140 rpm).

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) catalisam a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios. Membros da sub-família de fosfolipases A2-Lisina49 (PLA2-Lys49), isolados de venenos de serpentes Viperidae mostram uma substituição do resíduo de aspartato na posição 49 por uma lisina, com a eliminação concomitante da atividade hidrolítica contra fosfolipídeos. Apesar da ausência de atividade catalítica, as PLA2-Lys49 apresentam propriedades farmacológicas variadas incluindo miotoxicidade, e danifica membranas artificiais por um mecanismo Ca2+-independente, que não envolve hidrólise de fosfolipídeos. As PLA2-Lys49 formam homodímeros em solução, e estudos cristalográficos e espectroscópicos de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, revelaram que a transição na estrutura quaternária do dímero provoca a mudança de posição da região C-terminal, apoiando a sugestão do envolvimento desta região no modelo proposto de danificação da membrana Ca2+-independente. Um papel para a região Cterminal das PLA2-Lys49 também foi sugerido na atividade bactericida observada para esta proteína, e o presente estudo investiga uma possível correlação entre a atividade de danificação de membranas Ca2+-independente e o efeito bactericida. O efeito bactericida de BthTx-I e mutantes da proteína na região C-terminal foi avaliado contra bactéria Escherichia coli (K12). A BthTx-I nativa e recombinante tiposelvagem apresentaram alta atividade bactericida com uma concentração de 5 mg/mL, porém as mutantes Y117W, Y119W, K122A e F125W reduziram significativamente este efeito, mostrando uma correlação entre os determinantes estruturais das atividades bactericida e de danificação em membranas artificiais. Na tentativa de correlacionar o mecanismo de danificação de membranas artificiais com a atividade bactericida de BthTx-I contra linhagem E.coli (K12), um estudo por partição de sondas fluorescentes em compartimentos celulares específicos foi realizado. A sonda hidrofóbica N-fenil-N-naftilamina (NPN) foi utilizada para avaliar a integridade da membrana externa da bactéria e a sonda Sytox Green (SG) para avaliar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana. A cinética de permeabilização da membrana externa é rápida e não foi influenciada por mutagênese da região C-terminal da proteína. Entretanto, a cinética de permeabilização da membrana plasmática mostrou-se lenta, com um efeito máximo de 2 horas de ação e identificou os mesmos determinantes estruturais como os identificados para a atividade bactericida de BthTx-I. Resultados obtidos pelas técnicas de citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão auxiliaram os dados evidenciando a importância da região C-terminal de BthTx-I na atividade bactericida contra linhagem E.coli.<br>Phospholipases A2 (PLA2 - EC 3.1.1.4) catalyze the hydrolysis of acid ester bonds at the sn-2 position of glycerophospholipids liberating fatty acids and lysophospholipids as catalysis products. Lysine 49 phospholipase A2 (Lys49-PLA2) are isolated from the venom of viperid snakes, and in these proteins, the aspartic acid at position 49 is replaced by a lysine, resulting in the elimination of hydrolytic activity against phospholipid substrates. Despite the absence of catalytic activity, these Lys49-PLA2s present various pharmacological properties and furthermore damage artificial membranes by a Ca2+-independent mechanism. Lys49- PLA2s form homodimers in solution, and crystallographic and spectroscopic studies of the bothropstoxin-I (BthTx-I), a Lys49-PLA2 isolated from venom of Bothrops jararacussu, reveal that a quaternary structure transition in the homodimer results in a change in the position of the C-terminal loop of the protein, suggesting the involvement of this region in the Ca2+- independent membrane damaging activity. A role for the C-terminal region of Lys49-PLA2 has also been suggested for the bactericidal activity of theses proteins, and using BthTx-I one as a model system, the present study investigates the possible correlation and between the Ca2+-independent membrane damaging and the bactericidal activities. The bactericidal effect of native BthTx-I and site-directed mutants of the C-terminal loop was evaluated using the Gram negative bacteria E. coli strain K12. Both the native and wild type recombinant BthTx-I presented a high bactericidal activity at a concentration of 5 mg/mL, whereas the mutants Y117W, Y119W, K122A and F125W showed significantly reduced the bactericidal effects, showing a correlation between the structural determinants of the bactericidal and membrane damaging activities. The fluorescent probe NPN was used to evaluate the integrity of the external membrane of the bacterial cells after exposure to the BthTx-I and mutants. The permeabilization of the external membrane is complete within 2 minutes, and neither the kinetics nor the extent of membrane damage was influenced by mutagenesis in the C-terminal region. The fluorescent probe Sytox Green (SG) was used to evaluate the integrity of the bacterial plasma membrane, an event which showed a significantly slower kinetic, with a maximum effect observed after two hours exposure to the BthTx-I. Furthermore, the extent of the membrane damage is influenced by mutagenesis in the C-terminal loop, and the structural determinants for the bactericidal activity of BthTx-I are the same as those that determine the permeabilization of the bacterial plasma membrane. Evidence obtained using flow cytometry and transmission electron microscopy support of the suggestion that the C-terminal region of BthTx-I is an important structural determinant of the plasma membrane damaging bactericidal activities.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:17:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Felipe Lopes Campos.pdf: 553352 bytes, checksum: e4d71e5d911a1305af8111fa2c150966 (MD5) Previous issue date: 2006-03-16<br>The aim of this survey was the isolation of the Cryptococcus neoformans yeast from cats and dogs central nervous system in Rio de Janeiro City. Periodic collections were made from brain samples from April 2004 to July 2005 at the rabies diagnosis laboratory in the Jorge Vaitsman Veterinary Medicine Municipal Institute in Mangueira, RJ. According to the results, of the 201 clinical samples, we found four positives samples; one of these was positive for C. laurentii, three were positive for Cryptococcus neoformans; of which two were neoformans variety and one was gattii variety. Secondarily we compared with strains from the ICB-USP, previously isolated and identified as for urease and fenol-oxidase production in qualitative character, in the same way that the potential of virulence demonstrated to fosfolipase and protease production. Killer biotyping used in all isolates showed a predominance of biotype II to neoformans variety and biotype VIII to gattii variety. All isolates showed protease and fosfolipase production in varied degrees. lipase<br>Objetivando o isolamento da levedura Cryptococcus neoformans do sistema nervoso central de c?es e gatos no Munic?pio do Rio de Janeiro, procedeu-se ?s coletas peri?dicas, no per?odo de abril de 2004 a julho de 2005, de amostras de c?rebro, no Laborat?rio de Diagn?stico de Raiva do Instituto Municipal de Medicina Veterin?ria Jorge Vaitsman no bairro da Mangueira, Rio de Janeiro. Das 201 amostras obteve-se um total de quatro positivas para o g?nero; sendo uma de Cryptococcus laurentii e tr?s de C. neoformans, das quais duas revelaram-se pertencentes ? variedade neoformans e uma ? variedade gattii. Secundariamente, confrontamos estas com amostras obtidas junto ao ICB-USP, previamente isoladas e identificadas, quanto ao potencial de virul?ncia espelhado pela produ??o de fosfolipase e de protease. A biotipagem Killer empregada em todos os isolados demonstrou uma predomin?ncia do biotipo II para a variedade neoformans e biotipo VIII para a variedade gattii. Todos os isolados apresentaram-se produtores de protease e de fosfolipase, em diferentes graus.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 &#181;mol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 &#181;mol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico.<br>Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 &#181;mol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 &#181;mol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.