Dissertations / Theses on the topic 'Fosfolipase C'

O objetivo deste trabalho foi à purificação da toxina alfa produzida por Costridium perfringens tipo A em sistema de duas fases aquosas (SDFA) PEG/fosfato nos modos contínuo e descontínuo. Dois planejamentos fracionários sequenciais foram aplicados para estudar a partição da toxina alfa em SDFA, em função de 4 variáveis: massa molar e concentração do PEG, concentração do fosfato e pH. Os melhores resultados para o fator de purificação, rendimento em atividade e coeficiente de partição foram obtidos com PEG 8000 g/mol (15%, w/w), fosfato 20% (w/w) e pH 8.0. Este sistema permitiu um fator de purificação de 4,6 com rendimento em atividade de 230% e coeficiente de partição de 113,9 na fase PEG. Após isto, novos experimentos foram realizados para aperfeiçoar a purificação da toxina alfa com o emprego de um planejamento experimental completo 22. Nesta pesquisa a concentração do PEG 8000 g/mol e sais de fosfato pH 8,0 foram variados. O coeficiente de partição, fator de purificação e rendimento em atividade foram fortemente influenciados por estas variáveis. Aumentando ambos os fatores estudados, foi observado um aumento nas respostas, com exceção para o fator de purificação. O melhor fator de purificação (5,7) foi obtido com 17,5% e 15% das concentrações de PEG e fosfato, respectivamente. A coluna de discos perfurados rotativos (PRDC) foi usada para extrair toxina alfa a partir do sobrenadante com (PEG) (MM = 8,000 g/mol) e solução de sais de fosfato de sódio e de potássio (pH 8.0). Os resultados obtidos demonstraram que a velocidade de fluxo da fase dispersa (VD) de 3 Ml/min foi a melhor condição para as respostas hold up (ED = 0,8), eficiência de separação (ES = 100 %) e fator de purificação (Pf = 2,37), pois os melhores resultados foram obtidos nesta taxa de fluxo usando uma velocidade de rotação dos discos baixa (35 rpm), enquanto o melhor coeficiente de transferência de massa (KDa = 2,8 x10-3 min-1) foi encontrado na maior velocidade de rotação usada (140 rpm).<br>The aim this work was purification alpha-toxin (phospholipase C) produced by Costridium perfringens type A by aqueous two-phase systems (ATPS) PEG/phosphate in discontinue and continue mode. Two sequential half-fraction designs were applied to studying the &#8733;-toxin partition in ATPS, as a function of four factors: PEG molar mass and concentration, phosphate concentration and pH. The highest purification factor, yield and partition coefficient results were obtained with PEG 8000 (15%, w/w), phosphate at 20% (w/w) and pH 8.0. This system allows an &#8733;-toxin purification of 4.6 fold with final activity yield of 230% and partition coefficient of 113.9 in the PEG rich phase. After this, new experiments were realized for the optimization of &#8733;-toxin purification with employed of full experimental design. In this research the concentration of PEG 8000 g/mol and phosphate salts pH 8.0 were varied. The partition coefficient (K), purification factor (Pf) and activity yield (Y%) were strongly influenced for these variables. Increasing both factors was observed an increase of these responses, except for P Pf. The higher purification factor (5.7) was obtained with 17.5% and 15% of the PEG and phosphate concentration, respectively. A continuous perforated rotating disc contactor (PRDC) was used for extraction of &#8733;-toxin from the supernatant of Clostridium perfringens type A cultivations with polyethylene glycol (PEG) (MW = 8,000 g/mol) and dipotassium and sodium phosphate salt solution (pH 8.0). The results obtained demonstrated that VD = 3 L/min was by far the optimum dispersed phase flowrate for all these response variables. Besides, maximum values of ED (0.8), Es (100 %) and Pf (2.37) were obtained at this flowrate using the lowest rotational speed (35 rpm), while optimum KDa (2.8 x 10-3 min-1 ) was achieved at the highest agitation level (140 rpm).

As fosfolipases A2 (EC 3.1.1.4) catalisam a hidrólise das ligações ácido-éster na posição sn-2 de glicerofosfolipídios liberando, como produto da catálise, ácidos graxos e lisofosfolipídios. Membros da sub-família de fosfolipases A2-Lisina49 (PLA2-Lys49), isolados de venenos de serpentes Viperidae mostram uma substituição do resíduo de aspartato na posição 49 por uma lisina, com a eliminação concomitante da atividade hidrolítica contra fosfolipídeos. Apesar da ausência de atividade catalítica, as PLA2-Lys49 apresentam propriedades farmacológicas variadas incluindo miotoxicidade, e danifica membranas artificiais por um mecanismo Ca2+-independente, que não envolve hidrólise de fosfolipídeos. As PLA2-Lys49 formam homodímeros em solução, e estudos cristalográficos e espectroscópicos de Bothropstoxina-I, uma PLA2-Lys49 do veneno de Bothrops jararacussu, revelaram que a transição na estrutura quaternária do dímero provoca a mudança de posição da região C-terminal, apoiando a sugestão do envolvimento desta região no modelo proposto de danificação da membrana Ca2+-independente. Um papel para a região Cterminal das PLA2-Lys49 também foi sugerido na atividade bactericida observada para esta proteína, e o presente estudo investiga uma possível correlação entre a atividade de danificação de membranas Ca2+-independente e o efeito bactericida. O efeito bactericida de BthTx-I e mutantes da proteína na região C-terminal foi avaliado contra bactéria Escherichia coli (K12). A BthTx-I nativa e recombinante tiposelvagem apresentaram alta atividade bactericida com uma concentração de 5 mg/mL, porém as mutantes Y117W, Y119W, K122A e F125W reduziram significativamente este efeito, mostrando uma correlação entre os determinantes estruturais das atividades bactericida e de danificação em membranas artificiais. Na tentativa de correlacionar o mecanismo de danificação de membranas artificiais com a atividade bactericida de BthTx-I contra linhagem E.coli (K12), um estudo por partição de sondas fluorescentes em compartimentos celulares específicos foi realizado. A sonda hidrofóbica N-fenil-N-naftilamina (NPN) foi utilizada para avaliar a integridade da membrana externa da bactéria e a sonda Sytox Green (SG) para avaliar a integridade da membrana citoplasmática bacteriana. A cinética de permeabilização da membrana externa é rápida e não foi influenciada por mutagênese da região C-terminal da proteína. Entretanto, a cinética de permeabilização da membrana plasmática mostrou-se lenta, com um efeito máximo de 2 horas de ação e identificou os mesmos determinantes estruturais como os identificados para a atividade bactericida de BthTx-I. Resultados obtidos pelas técnicas de citometria de fluxo e microscopia eletrônica de transmissão auxiliaram os dados evidenciando a importância da região C-terminal de BthTx-I na atividade bactericida contra linhagem E.coli.<br>Phospholipases A2 (PLA2 - EC 3.1.1.4) catalyze the hydrolysis of acid ester bonds at the sn-2 position of glycerophospholipids liberating fatty acids and lysophospholipids as catalysis products. Lysine 49 phospholipase A2 (Lys49-PLA2) are isolated from the venom of viperid snakes, and in these proteins, the aspartic acid at position 49 is replaced by a lysine, resulting in the elimination of hydrolytic activity against phospholipid substrates. Despite the absence of catalytic activity, these Lys49-PLA2s present various pharmacological properties and furthermore damage artificial membranes by a Ca2+-independent mechanism. Lys49- PLA2s form homodimers in solution, and crystallographic and spectroscopic studies of the bothropstoxin-I (BthTx-I), a Lys49-PLA2 isolated from venom of Bothrops jararacussu, reveal that a quaternary structure transition in the homodimer results in a change in the position of the C-terminal loop of the protein, suggesting the involvement of this region in the Ca2+- independent membrane damaging activity. A role for the C-terminal region of Lys49-PLA2 has also been suggested for the bactericidal activity of theses proteins, and using BthTx-I one as a model system, the present study investigates the possible correlation and between the Ca2+-independent membrane damaging and the bactericidal activities. The bactericidal effect of native BthTx-I and site-directed mutants of the C-terminal loop was evaluated using the Gram negative bacteria E. coli strain K12. Both the native and wild type recombinant BthTx-I presented a high bactericidal activity at a concentration of 5 mg/mL, whereas the mutants Y117W, Y119W, K122A and F125W showed significantly reduced the bactericidal effects, showing a correlation between the structural determinants of the bactericidal and membrane damaging activities. The fluorescent probe NPN was used to evaluate the integrity of the external membrane of the bacterial cells after exposure to the BthTx-I and mutants. The permeabilization of the external membrane is complete within 2 minutes, and neither the kinetics nor the extent of membrane damage was influenced by mutagenesis in the C-terminal region. The fluorescent probe Sytox Green (SG) was used to evaluate the integrity of the bacterial plasma membrane, an event which showed a significantly slower kinetic, with a maximum effect observed after two hours exposure to the BthTx-I. Furthermore, the extent of the membrane damage is influenced by mutagenesis in the C-terminal loop, and the structural determinants for the bactericidal activity of BthTx-I are the same as those that determine the permeabilization of the bacterial plasma membrane. Evidence obtained using flow cytometry and transmission electron microscopy support of the suggestion that the C-terminal region of BthTx-I is an important structural determinant of the plasma membrane damaging bactericidal activities.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:17:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Felipe Lopes Campos.pdf: 553352 bytes, checksum: e4d71e5d911a1305af8111fa2c150966 (MD5) Previous issue date: 2006-03-16<br>The aim of this survey was the isolation of the Cryptococcus neoformans yeast from cats and dogs central nervous system in Rio de Janeiro City. Periodic collections were made from brain samples from April 2004 to July 2005 at the rabies diagnosis laboratory in the Jorge Vaitsman Veterinary Medicine Municipal Institute in Mangueira, RJ. According to the results, of the 201 clinical samples, we found four positives samples; one of these was positive for C. laurentii, three were positive for Cryptococcus neoformans; of which two were neoformans variety and one was gattii variety. Secondarily we compared with strains from the ICB-USP, previously isolated and identified as for urease and fenol-oxidase production in qualitative character, in the same way that the potential of virulence demonstrated to fosfolipase and protease production. Killer biotyping used in all isolates showed a predominance of biotype II to neoformans variety and biotype VIII to gattii variety. All isolates showed protease and fosfolipase production in varied degrees. lipase<br>Objetivando o isolamento da levedura Cryptococcus neoformans do sistema nervoso central de c?es e gatos no Munic?pio do Rio de Janeiro, procedeu-se ?s coletas peri?dicas, no per?odo de abril de 2004 a julho de 2005, de amostras de c?rebro, no Laborat?rio de Diagn?stico de Raiva do Instituto Municipal de Medicina Veterin?ria Jorge Vaitsman no bairro da Mangueira, Rio de Janeiro. Das 201 amostras obteve-se um total de quatro positivas para o g?nero; sendo uma de Cryptococcus laurentii e tr?s de C. neoformans, das quais duas revelaram-se pertencentes ? variedade neoformans e uma ? variedade gattii. Secundariamente, confrontamos estas com amostras obtidas junto ao ICB-USP, previamente isoladas e identificadas, quanto ao potencial de virul?ncia espelhado pela produ??o de fosfolipase e de protease. A biotipagem Killer empregada em todos os isolados demonstrou uma predomin?ncia do biotipo II para a variedade neoformans e biotipo VIII para a variedade gattii. Todos os isolados apresentaram-se produtores de protease e de fosfolipase, em diferentes graus.

A resistência aos antibióticos adquirida por micro-organismos patogênicos é um problema de saúde mundial e, por isso, o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos vem sendo amplamente estimulado. Sabendo que muitos peptídeos bioativos correspondem a fragmentos peptídicos de proteínas e/ou seus análogos, este trabalho teve o objetivo de desenvolver novos peptídeos antimicrobianos (AMPs) a partir das sequências aminoacídicas e das estruturas 3D de proteínas possivelmente envolvidas na atividade antimicrobiana de venenos de serpentes pouco estudados. As etapas iniciais seguidas foram: a) escolher uma fosfolipase A2 (PLA2) de veneno de serpente peruana do gênero Bothrops da família Viperidae com sequência de aminoácidos conhecida e modelar por homologia a sua estrutura 3D; b) verificar atividade antimicrobiana em venenos de serpentes peruanas dos gêneros Bothrops e Bothriopsis da família Viperidae, selecionar um veneno ativo, fracioná-lo para isolar proteínas provavelmente envolvidas nessa atividade, tripsinizar as proteínas isoladas, sequenciar os fragmentos trípticos para identificá-las, localizar esses fragmentos em sequências aminoacídicas de proteínas com estruturas 3D disponíveis correlatas às proteínas isoladas/identificadas em classe, função e fonte natural. Em seguida, foram escolhidos fragmentos peptídicos da PLA2 (item a) e das proteínas isoladas do veneno ativo (item b) e/ou desenhados análogos que apresentassem características exibidas por AMPs conhecidos. Os peptídeos desenhados foram sintetizados, purificados, caracterizados e testados em suas atividades antimicrobianas. Os modelos estruturais 3D da PLA2 de Bothrops pictus e quatro peptídeos (PLA2-1 a -4) amidados derivados dela foram obtidos, sendo o PLA2-1 ativo frente a Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida krusei e Candida parapsilosis (MICs de 6,25-200 &#181;mol.mL-1). Dos três venenos de serpentes peruanas testados, Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti e Bothriopsis oligolepis, os dois últimos inibiram o crescimento de S. aureus (MICs 0,78-50 &#181;mol.mL-1), mas apenas B. oligolepis demonstrou espectro de ação amplo. O seu fracionamento sequencial, acompanhado de ensaios de inibição do crescimento de S. aureus, gerou frações ativas relativamente homogêneas que, tripsinizadas e os fragmentos trípticos sequenciados, continham metalo-peptidases do tipo III, serino-peptidase ou lectinas do tipo C. A verificação de atividade enzimática e de coagulação sanguínea nessas frações confirmaram as naturezas das proteínas isoladas. Dos três peptídeos amidados (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) desenhados a partir de suas estruturas, um deles foi ativo frente às leveduras C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (Bo-Met1; MIC de 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). Pela primeira vez, foi demonstrado que: a) os venenos das serpentes peruanas B. barnetti e B. oligolepis apresentam ação antimicrobiana, sendo o último de espectro amplo; b) que as proteínas acima citadas, que incluem uma serino-peptidase, estão envolvidas com essa propriedade do veneno de B. oligolepis; c) que as sequências aminoacídicas e modelo 3D de uma PLA2 ácida e de proteínas presentes nos venenos das serpentes peruanas B. pictus e Bothriopsis oligolepis podem funcionar como fontes naturais para o desenvolvimento de novos AMPs de ação potente em micro-organismos de interesse clínico e científico.<br>Resistance to antibiotics obtained by pathogenic microorganisms is a global health problem, so the search for new antimicrobial agents has been encouraged. Knowing that many protein fragments and analogues are bioactive peptides, the aim of this work was to develop new antimicrobial peptides (AMPs) based on the amino acid sequences and 3D structures of proteins apparently involved in the antimicrobial activity of snake venoms very little or not studied so far. The first steps taken were: a) selection of a phospholipase A2 (PLA2) present in the venom from a Peruvian Bothrops sp. belonging to the family Viperidae, whose amino acid sequence was known, to model by homology its 3D structure; b) detection of antimicrobial activity in venoms from other Peruvian Viperidae Bothrops and Bothriopsis snakes, selection of an active venom, fractionation of it for isolation of proteins possibly involved in the antimicrobial activity, trypsinization of the isolated proteins, sequencing of the tryptic fragments for protein identification, location of such fragments in the amino acid sequences and 3D structures of proteins directly related in class, function and natural source to the isolated proteins. Then, peptide fragments from the chosen PLA2 (item a) and from the isolated proteins (item b) that presented structural features found in the known AMPs were selected and/or their analogues were designed. Finally, synthesis, purification and characterization of the peptides with AMP potential, (viii) verification on whether or not they display antimicrobial activity. The 3D-structure models of Bothrops pictus PLA2 and four amidated peptides (PLA2-1 to -4) derived from it were obtained, being PLA2-1 active against Gram negative bacteria Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa as well as the yeasts Candida albicans, Candida krusei and Candida parapsilosis (MICs de 6.25-200 &#181;mol.mL-1). Among the three Peruvian snake venoms tested Bothrops taeniatta, Bothrops barnetti and Bothriopsis oligolepis, the last two inhibited the growth of S. aureus (MICs 0.78-50 &#181;mol.mL-1) and B. oligolepis presented a wide spectrum of bacterial action. Sequential fractionation followed by S. aureus growth inhibition assays of the main fractions led to active relatively homogeneous ones. Their trypsinization and sequencing of the tryptic fragments indicated that they contained metalloproteinases type III, serine-proteinase or lectins type CTL. Enzymatic activity and blood coagulation assays confirmed the nature of the isolated proteins. From the three amidated peptides (Bo-Ser1, Bo-Met1 e Bo-Lec1) derived from them, Bo-Met1 showed to be active against C. albicans, C. krusei e C. parapsilosis (MIC 6,25 - 200 &#181;mol.mL-1). In summary, for the first time, it was demonstrated that: a) the venoms of the Peruvian snakes B. barnetti and B. oligolepis display antimicrobial activity, being the last of wide spectrum of action, b) the proteins isolated from B. oligolepis snake venom, including a serine-peptidase, are involved in the antimicrobial activity of the B. oligolepis snake venom, c) the amino acid sequences and 3D structures of acidic PLA2 and of other proteins found in the venoms of the Peruvian B. pictus e Bothriopsis oligolepis snakes can be used as safe and natural sources for the development of new AMPs potent against microorganisms of clinical and scientific interest.

BARBOSA, Paulo Sérgio Ferreira. Efeitos renais de miotoxinas e lectinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu e Bthrops moojeni : papel da ciclooxigenase e endotelina. 2006. 175 f. Tese (Doutorado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2006.<br>Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-09-06T11:39:45Z No. of bitstreams: 1 2006_tese_psfbarbosa.pdf: 4134390 bytes, checksum: 386687118259e7d665fe77b7ce37b254 (MD5)<br>Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-09-06T12:25:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_tese_psfbarbosa.pdf: 4134390 bytes, checksum: 386687118259e7d665fe77b7ce37b254 (MD5)<br>Made available in DSpace on 2012-09-06T12:25:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_tese_psfbarbosa.pdf: 4134390 bytes, checksum: 386687118259e7d665fe77b7ce37b254 (MD5) Previous issue date: 2006<br>Acute renal failure is one of the most common systemic complications after snakebite. However, its pathogenesis remains obscure. In this study, we evaluated the renal effects of Bothrops jararacussu myotoxins I and II (Bthtx-I Lys 49 and BthtxII, Asp 49), Bothrops moojeni myotoxin I and the lectins from Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu. Attempting to investigate the mechanisms involved in the renal effects of the mentioned toxins, we tested indomethacin, an unespecific cyclooxigenase inhibitor. Additionally, tezosentan, an endothelin receptor blocker, was used to evaluate the role of endothelin in the renal effects of Bothrops moojeni myotoxin I. All myotoxins (5 µg/mL) and lectins (10µg /mL) were added to the perfusion system 30 min after the beginning of each perfusion. Indomethacin (10µg/mL) and tezosentan (10 µg /mL) were always added 30 minutes before the tested substances. The renal effects were compared against a control group, where kidneys were perfused only with the modified Krebs-Henseleit solution. Myotoxins from Bothrops jararacussu and the lectin from Bothrops moojeni increased the perfusion pressure (C120= 110.28 ± 3.09, Bthtx I120= 171.20 ± 6.3 * ,Bthtx II120= 175.50 ± 7.20 * and BmLec120= 152.50 ± 2.10 *), the renal vascular resistance (C120= 5.46 ± 0.54, Bthtx I120= 8.62 ± 0.37 *, Bthtx II120= 8.90 ± 0.36 * and BmLec120= 7.77 ± 0.30*), the urinary flow (C120= 0.143 ± 0.008, Bthtx I120= 0.326 ± 0.048*, and Bthtx II120= 0.373 ± 0.085* ), the glomerular filtration rate (C120= 0.678 ± 0.065, Bthtx I120= 0.855 ± 0.133 *, Bthtx II120= 1.224 ± 0.282* and BmLec120= 1.037 ± 0.055*) and the sodium, potassium and chloride excretion. On the other hand, the same substances decreased the percent of renal tubular transport of sodium (C120= 79.76 ± 0.56, Bthtx I120= 62.23 ± 4.12*, Bthtx II120= 70.96 ± 2.93* and BmLec60= 77.25 ± 1.36*), potassium (C60= 66.38 ± 3.31, Bthtx I60= 55.79 ± 5.57 *, Bthtx II60= 50.86 ± 6.16* and BmLec60= 59.78 ± 3.49*). Indomethacin inhibited the renal effects induced by Bothrops jararacussu myotoxin I and Bothrops moojeni lectin, but partially blocked the effects promoted by myotoxin II and the lectin of Bothrops jararacussu, and the effects of myotoxin I of Bothrops moojeni. Tezosentan inhibited the renal effects induced by B. moojeni myotoxin I. In conclusion, prostaglandins are involved in the renal alterations induced by myotoxins and lectins purified from the snake venoms of Bothrops jararacussu and Bothrops moojeni. In addition, endothelin is the main mediator of the renal alterations promoted by Bothrops moojeni myotoxin I<br>A insuficiência renal aguda é uma das complicações mais freqüentes nos envenenamentos ofídicos. Contudo, a sua patogênese permanece obscura. Em nossos estudos foram avaliados os efeitos renais causados pelas miotoxinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu (Bthtx I, Lys 49 e Bthtx II, Asp 49) e Bothrops moojeni (BmTx I, Lys 49), assim como pelas lectinas dos venenos de Bothrops moojeni (BmLec) e Bothrops jararacussu (BJcuL). Tentando avaliar o mecanismo envolvido nos efeitos renais das substâncias acima mencionadas, foram testados os efeitos da indometacina, um bloqueador inespecífico de ciclooxigenase. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos inibitórios do Tezosentan, um bloqueador de receptor de endotelina, nos efeitos renais causados pela miotoxina I da serpente Bothrops moojeni. Para tanto, as miotoxinas, na dosagem de 5µg/mL, ou as lectinas, na dosagem de 10µg/mL foram adicionadas 30 minutos depois do início dos experimentos. Contudo, a indometacina e o tezosentan foram adicionados no sistema de perfusão sempre no início de cada experimento na dosagem de 10µg/mL. Os efeitos renais foram comparados com um grupo controle, onde os rins foram perfundidos somente com a solução de Krebs-Henseleit modificada. Bthtx I, BthtxII e BmLec aumentaram a pressão de perfusão (C120= 110,28 ± 3,09, Bthtx I120 = 171,20 ± 6,3 *, Bthtx II120 = 175,50 ± 7,20 * e BmLec120 = 152,50 ± 2,10 *), a resistência vascular renal (C120= 5,46 ± 0,54, Bthtx I120= 8,62 ± 0,37 *, Bthtx II120= 8,90 ± 0,36 * e BmLec120= 7,77 ± 0,30*), o fluxo urinário (C120= 0,143 ± 0,008, Bthtx I120= 0,326 ± 0,048*, e Bthtx II120= 0,373 ± 0,085*, BmLec120= 0,085 ± 0,007* ), o ritmo de filtração glomerular (C120= 0,678 ± 0,065, Bthtx I120= 0,855 ± 0,133 *, Bthtx II120= 1,224 ± 0,282*, BmLec120=1,037 ± 0,055*) e a excreção de sódio potássio e cloreto (ENa+, EK+, ECl-). Porém, diminuíram os percentuais dos transportes tubulares de sódio (C120= 79,76 ± 0,56, Bthtx I120= 62,23 ± 4,12*, Bthtx II120= 70,96 ± 2,93* e BmLec60= 77,25 ± 1,36*) e potássio (C60= 66,38 ± 3,31, Bthtx I60= 55,79 ± 5,57 *, Bthtx II60= 50,86 ± 6,16* e BmLec60= 59,78 ± 3,49). A indometacina foi capaz de bloquear os efeitos causados pela miotoxina I da B. jararacussu e lectina da B. moojeni, mas reverteu parcialmente os efeitos causados pelas miotoxinas II e lectina da B. jararacussu e miotoxina I da B. moojeni. O tezosentan, por sua vez, bloqueou os efeitos causados pela miotoxina I da B. moojeni. Foi concluído que prostaglandinas estão envolvidas nas alterações renais promovidas pelas substâncias isoladas das serpentes B. jararacussu e B. moojeni, enquanto que endotelina seria o principal mediador nas alterações renais causadas pela miotoxina I da B. moojeni.

The expression of phospholipase C-β1 (PLC-β1) and cyclin D3 is highly induced during skeletal myoblast differentiation. We have previously shown that PLC-β1 activates cyclin D3 promoter during the differentiation of myoblasts to myotubes, indicating that PLC-β1 is a crucial regulator of mouse cyclin D3 gene. Here we report that PLC-β1 catalytic activity plays a role in the increase of cyclin D3 levels and in the induction of differentiation of C2C12 skeletal muscle cells. PLC-β1 mutational analysis revealed the importance of His331 and His378 for the catalytic activity. We show that following insulin administration, cyclin D3 mRNA levels are lower in cells overexpressing the PLC-β1 catalytically inactive form, as compared to wild type cells. We describe a novel signaling pathway elicited by PLC-β1 that modulates Activator Protein-1 (AP-1) activity. Indeed, gel mobility shift assays indicate that there is a c-jun binding site located in cyclin D3 promoter region specifically regulated by PLC-β1 and that c-jun binding activity is significantly increased by insulin stimulation and PLC-β1 overexpression. Moreover, mutation of c-jun/AP-1 binding site decreases the basal cyclin D3 promoter activity and eliminates its induction by insulin and PLC-β1 overexpression. Interestingly, we observed that the ectopic expression of the Inositol Polyphosphate Multikinase (IPMK) in C2C12 myoblasts enhances cyclin D3 gene expression and that the mutation of c-jun site in cyclin D3 promoter determines an impairment of IPMK-dependent promoter induction. These results indicate that PLC-β1 activates a c-jun/AP-1 target gene, i.e. cyclin D3, during myogenic differentiation through IPMK signaling.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico<br>Los fibroblastos cardiacos son los mayores responsables de la secreción y renovación de la matriz extracelular (MEC). Por otro lado, bajo condiciones patológicas como en el post-infarto al miocardio, los fibroblastos cardiacos se diferencian a miofibroblastos, células con un fenotipo mucho más activo en cuanto a la producción de la MEC, además ambos elementos celulares son claves en el desarrollo del remodelamiento cardiaco después de un infarto agudo al miocardio. Una regulación controlada en el crecimiento de la población de fibroblastos y miofibroblastos es importante para una correcta cicatrización y mantención de la función cardiaca. Uno de los mayores reguladores de la población cardiaca es el Sistema Renina-Angiotensina (RAS) y se ha reportado que en una situación post-infarto este sistema se encuentra sobre-activado, específicamente la enzima convertidora de angiotensina y el receptor subtipo AT1 de angiotensina (AT1R). Nuestro modelo experimental consideró sobrexpresar el AT1R en ambos tipos celulares con el uso de adenovirus y evaluar si angiotensina II (Ang II) modula la viabilidad celular. Nuestros resultados demuestran que la estimulación con Ang II conduce a una masiva muerte del fibroblasto cardiaco neonato que sobrexpresa el AT1R (FCN-AdAT1R) de una manera tiempo-dependiente. Ang II gatilla la apoptosis por la vía mitocondrial, promoviendo el aumento de los niveles de Bax, la pérdida del potencial de membrana mitocondrial (mΔψ) y la fragmentación de la caspasa 3. Los efectos producidos por Ang II sobre los FCN-AdAT1R fueron bloqueados por Losartan (antagonista específico AT1R) y por los inhibidores de la vía de la fosfolipasa C -proteínakinasa C (PLC-PKC), U73122 y Gö6976, respectivamente. Por otra parte, los miofibroblastos cardiacos neonatos que sobrexpresan el AT1R (MCN-AdAT1R), fueron menos propensos que los FCN-AdAT1R a los efectos inducidos por Ang II, en cuanto a muerte celular, apoptosis y aumentos en los niveles de Bax. La diferente sensibilidad a la apoptosis producida por Ang II por parte de los MCN-AdAT1R se debió en parte al cambio del fenotipo celular Nuestros resultados demuestran que Ang II ocasiona apoptosis del FCN-AdAT1R por la vía AT1R-PLC-PKC y que esta depende de la vía mitocondrial<br>The cardiac fibroblasts are main cells involved in secretion and turnover to extracellular matrix protein (ECM). Under pathological conditions characterized by inflammation, as in myocardial infarction, they are differentiated to cardiac myofibroblast, which are cells with a more active phenotype, producing higher ECM protein. Both cellular types are key elements in the development of cardiac remodeling after myocardial infarction. A tight regulation of fibroblast and myofibroblast growth is important to correct wound healing and maintain cardiac function. Renine-angiotensin-system (RAS) is the most important regulator of cardiovascular system, and have been reported that after myocardiac infarction the RAS is up-regulated, specifically angiotensin converting enzyme (ACE) and angiotensin type 1 receptor (AT1R). In our experimental model using adenovirus to overexpress the AT1R in cardiac fibroblast (FCN-AT1R), we evaluated the Ang II effects on cell viability. Ours results show that Ang II triggers FCN-AdAT1R death, in a time-dependent manner. The death cell produced for Ang II in our model was apoptosis by mitochondrial pathway, through an increase Bax expression, loss of mitochondrial membrane potential (mΔψ) and caspase 3 activation. These effects were blocked by Losartan (specific antagonist of AT1R) and by phospholipase C-proteinkinase C (PLC-PKC) inhibitors, U73122 and Gö6976 respectively. For other hand, cardiac myofibroblast that overespressing AT1R (MCN-AdAT1R) were less sensible than FCN-AdAT1R to effect of Ang II on death cell, apoptosis and expression of Bax. The different sensibility to apoptosis Ang II-induced was due to the different phenotype. Ours results show that Ang II triggers apoptosis of FCN-AdAT1R by AT1R-PLC-PKC pathway through mitochondrial disruption

La enterotoxemia, causada por el Clostridium perfringens, es la enfermedad infecciosa más importante que afecta a las alpacas, debido a que ocasiona elevadas tasas de mortalidad neonatal de hasta 70%. Recientes estudios han sugerido la participación de la Cp-PLC (C. perfringens fosfolipasa C) como factor de virulencia responsable del cuadro enterotoxemico en alpacas y otras especies domesticas. El presente estudio evaluó las características toxigénicas de la Cp-PLC y de sobrenadantes de diferentes aislados de C. perfringens obtenidos de casos de enterotoxemia en alpacas relacionándolos con sus niveles de producción de Cp-PLC. El protocolo de purificación de Cp-PLC mostró ser exitoso, mostrando su comportamiento como una enterotoxina incapaz de generar lesiones entéricas. Asimismo, los aislados de C. perfringens analizados evidenciaron distintas características toxigénicas independientes de la presencia de Cp-PLC. Al parecer, la Cp-PLC no seria un factor esencial del C. perfringens en la producción de lesiones entéricas en casos de enterotoxemias en alpacas. Palabras Claves: Cp-PLC, Clostridium perfringens, enterotoxigenico<br>--- Enterotoxemia caused by Clostridium perfringens, causes a mortality neonatal rate up to 70%, this is why it is considered as the most important infections disease. Recent studies has suggested that Cp-PLC (Clostridium perfringens phospholipase C) is a main virulence factor responsible of the enterotoxemic lesions found in alpacas and other domestic animals. This study evaluated the toxigenic characteristics of Cp-PLC and of supercultures of C. perfringens isolates from enterotoxemia in alpacas associated with their levels of Cp-PLC production. The Cp-PLC purification protocol used was successful, showing that Cp-PLC as an enterotoxin enteric unable to cause injury. Similarly, C. perfringens isolates analyzed showed different toxigenic characteristics independently of the Cp-PLC production. Apparently, Cp-PLC does not be a essential factor from C. perfringens in the production of enteric lesions in cases of enterotoxemia in alpacas. Key Word: Cp-PLC, Clostridium perfringens, enterotoxigenic.<br>Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario<br>La enfermedad de Chagas congénita es causada por el parásito hemoflagelado Trypanosoma cruzi (T. cruzi) que alcanza al feto atravesando la barrera placentaria. Los mecanismos de infección e invasión tisular del parásito T. cruzi son poco conocidos. La invasión celular de T. cruzi induce la activación de vías de transducción de señales, las que se cuentan las vías PLC- (Fosfolipasa C-) y ERK1/2 (Señal extracelular regulada por quinasas) MAPK (Proteína quinasa activada por mitógenos) en el hospedero. La activación de estas vías se relaciona con la infectividad del parásito. Para estudiar la participación de estas vías de transducción de señales en la infección tisular, se incubaron explantes de vellosidades coriónicas humanas sanas en presencia y ausencia del parásito y en presencia y ausencia de inhibidores específicos de cada una de las vías. La infección exitosa de los explantes de vellosidades coriónicas humanas fue determinada por detección del parásito mediante PCR. Los efectos de la infección del parásito respecto a la modulación de las vías de transducción de señales se determinaron mediante métodos de Western Blot e inmunofluorescencia. Bajas concentraciones de T. cruzi inducen la activación de las vías de transducción de señales PLC- y ERK1/2 MAPK. Altas concentraciones de parásitos activan a la vía PLC- e inhiben a la vía ERK1/2 MAPK. Ninguno de los inhibidores de las vías de transducción de señales fue capaz de impedir la infección ex vivo de las vellosidades coriónicas humanas con T. cruzi. Se concluye que ambas vías de transducción de señales son parte de una compleja “estrategia” de invasión celular de T. cruzi<br>Proyectos Bicentenario Anillo 112 y FONDECYT 11080166

El objetivo final de nuestro trabajo es la obtención de proteínas recombinantes de interés farmacológico en la leche de animales transgénicos de producción. En nuestro grupo, previamente a este trabajo, se han llevado a cabo distintos proyectos con el fin de estudiar las regiones reguladoras del gen de la b-lactoglobulina (bLG) caprina y obtener así un cassette de expresión que pueda dirigir la expresión del transgén de forma específica y eficaz a la glándula mamaria de los animales transgénicos. Todas las construcciones han sido testadas previamente en el ratón al ser un modelo animal más barato ya que presenta un menor coste de mantenimiento y su ciclo reproductivo e intervalo generacional es más corto con respecto a los animales de producción. <br/>En el presente trabajo se ha utilizado un cassette de expresión que contiene 410 pb de región promotora proximal y 2,5 kb de región 3' flanqueante del gen de la bLG caprina para dirigir la expresión de las dos subunidades (a y b) de la Hormona Estimulante del Folículo (FSH) humana a la glándula mamaria de ratones transgénicos. Se han obtenido 4 líneas transgénicas que son capaces de expresar los dos transgenes en su glándula mamaria. <br/>Por otra parte, en la obtención de ratones transgénicos para el transgén de la bLG caprina, con el fin de testar las regiones reguladoras del gen, se observó un fenotipo conspicuo en los ratones homocigotos de la línea tg56; en el presente trabajo se ha caracterizado el lugar de integración de este transgén, el cual provocó una mutación por inserción en el gen de la Fosfolipasa C-b1 (PLC-b1) del ratón.<br/>Asimismo, se ha desarrollado una nuevo protocolo basado en la PCR cuantitativa a tiempo real para determinar el número de copias integradas del transgén en las distintas líneas transgénicas. Este método puede ser utilizado en todas aquellas líneas transgénicas que contengan cassettes de expresión pertenecientes a genes de especies rumiantes.<br/>Por último se han identificado y caracterizado un total de 15 polimorfismos en el gen de la bLG caprina, 9 de los cuales se encuentran localizados en la región promotora proximal, con el fin de encontrar mutaciones en las regiones reguladoras que puedan ser importantes en la expresión del gen.<br>The final aim of this project is to produce pharmaceutical recombinant proteins in milk of farm animals. Previous works of our group have been performed to study the caprine b-lactoglobulin (bLG) regulatory sequences resulting in a expression cassette that is able to target the expression of the transgene to the mammary gland of transgenic mice in an integration-site dependent manner, independently of the number of copies in the array. All the constructions have been previously tested in a mouse model due to their short generation intervals and ease of genetic manipulation being cheaper than farm animals.<br/>In the present work, a goat bLG expression cassette which contained 410 bp of proximal promoter region and 2.5 kb of 3' flanking region has been used to target the expression of the two subunits (a and b) of human Follicle Stimulating Hormone (hFSH) to the mammary gland of transgenic mice. Four established transgenic lines that express both hFSH transgenes (a and b) to their mammary gland have been obtained.<br/>On the other hand, homozygous mice from one (tg56) of the different transgenic lines, that have been previously obtained for the goat bLG gene to study the regulatory sequences, displayed a distinct phenotype. Here, we present the identification and characterization of the transgene-induced insertional mutation at the PLC-b1 locus (PLC-b1bLG) in line tg56 of bLG transgenic mice.<br/>Furthermore, a rapid and accurate real-time quantitative PCR-based system to determine transgene copy number in transgenic animals has been developed. This method can be used directly for the analysis of transgenic mice for transgenes with different ruminant sequences without the requirement of control sample previously quantified by blotting techniques.<br/>Finally, fifteen polymorphisms, nine in the promoter region, of the caprine bLG gene have been identified and characterized. The main aim of this study has been identified mutations in the proximal promoter region that could be important in the expression of the gene.

O presente trabalho teve como objetivo o estudo da variabilidade genética e dos fatores de virulência de isolados de U. diversum. As cepas foram submetidas a sequenciamento dos genes da urease e 16S rRNA e a testes para verificar os fatores de virulência: cápsula, fosfolipase C, IgAse e adesão e invasão. A análise do sequênciamento parcial do gene 16S rRNA resultou na presença de polimorfismos em 44 posições da seqüência, que diferenciou as amostras em sete grupos. Em relação aos fatores de virulência, os dados mostraram que as cepas estudadas apresentaram uma camada densa ao redor da membrana celular dos microrganismos e atividade de fosfolipase C. No entanto, não foi observado a atividade de IgAse nas cepas. Em relação a atividade de invasão, observou-se que os ureaplasma estudados puderam ser visualizados no interior de células Hep-2 com apenas um minutos de infecção, sendo observados em uma região perinuclear, mas não no interior do núcleo. Além disto, pode verificar que entre 1% a 10% dos ureaplasmas estudos penetraram na célula pelo teste da gentamicina.<br>The aim of the present study was the study of genetic variability and virulence factors of U. diversum clinical isolates. The strains were submitted to sequencing for 16S rRNA and urease genes. Moreover, the strains were analyzed to the virulence factors: capsule, phospholipase C, IgA protease and adhesion and invasion into Hep-2 cells. The sequencing of parcial 16S rRNA gene showed polymorphic patterns into 44 positions. These polymorphisms clustered the strains in seven groups. For the virulence factors, ureaplasma cells showed a dense-stained external capsule-like structure surrounding the cell membrane. A high level of phospholipase C activity was also detected in 31 studied ureaplasma. However, no strains showed IgA protease activity. For the invasion assay, the isolates and strains used were detected inside the cells after infection of one minute. The invasions of the ureaplasmas surrounded the nuclear region but were not observed inside the nuclei. The gentamicin invasion assay detected that 1% to 10% of studied ureaplasmas were inside the infected cells.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior<br>A insuficiÃncia renal aguda à uma das complicaÃÃes mais freqÃentes nos envenenamentos ofÃdicos. Contudo, a sua patogÃnese permanece obscura. Em nossos estudos foram avaliados os efeitos renais causados pelas miotoxinas purificadas dos venenos das serpentes Bothrops jararacussu (Bthtx I, Lys 49 e Bthtx II, Asp 49) e Bothrops moojeni (BmTx I, Lys 49), assim como pelas lectinas dos venenos de Bothrops moojeni (BmLec) e Bothrops jararacussu (BJcuL). Tentando avaliar o mecanismo envolvido nos efeitos renais das substÃncias acima mencionadas, foram testados os efeitos da indometacina, um bloqueador inespecÃfico de ciclooxigenase. Adicionalmente, foram avaliados os efeitos inibitÃrios do Tezosentan, um bloqueador de receptor de endotelina, nos efeitos renais causados pela miotoxina I da serpente Bothrops moojeni. Para tanto, as miotoxinas, na dosagem de 5Âg/mL, ou as lectinas, na dosagem de 10Âg/mL foram adicionadas 30 minutos depois do inÃcio dos experimentos. Contudo, a indometacina e o tezosentan foram adicionados no sistema de perfusÃo sempre no inÃcio de cada experimento na dosagem de 10Âg/mL. Os efeitos renais foram comparados com um grupo controle, onde os rins foram perfundidos somente com a soluÃÃo de Krebs-Henseleit modificada. Bthtx I, BthtxII e BmLec aumentaram a pressÃo de perfusÃo (C120= 110,28  3,09, Bthtx I120 = 171,20  6,3 *, Bthtx II120 = 175,50  7,20 * e BmLec120 = 152,50  2,10 *), a resistÃncia vascular renal (C120= 5,46  0,54, Bthtx I120= 8,62  0,37 *, Bthtx II120= 8,90  0,36 * e BmLec120= 7,77  0,30*), o fluxo urinÃrio (C120= 0,143  0,008, Bthtx I120= 0,326  0,048*, e Bthtx II120= 0,373  0,085*, BmLec120= 0,085  0,007* ), o ritmo de filtraÃÃo glomerular (C120= 0,678  0,065, Bthtx I120= 0,855  0,133 *, Bthtx II120= 1,224  0,282*, BmLec120=1,037  0,055*) e a excreÃÃo de sÃdio potÃssio e cloreto (ENa+, EK+, ECl-). PorÃm, diminuÃram os percentuais dos transportes tubulares de sÃdio (C120= 79,76  0,56, Bthtx I120= 62,23  4,12*, Bthtx II120= 70,96  2,93* e BmLec60= 77,25  1,36*) e potÃssio (C60= 66,38  3,31, Bthtx I60= 55,79  5,57 *, Bthtx II60= 50,86  6,16* e BmLec60= 59,78  3,49). A indometacina foi capaz de bloquear os efeitos causados pela miotoxina I da B. jararacussu e lectina da B. moojeni, mas reverteu parcialmente os efeitos causados pelas miotoxinas II e lectina da B. jararacussu e miotoxina I da B. moojeni. O tezosentan, por sua vez, bloqueou os efeitos causados pela miotoxina I da B. moojeni. Foi concluÃdo que prostaglandinas estÃo envolvidas nas alteraÃÃes renais promovidas pelas substÃncias isoladas das serpentes B. jararacussu e B. moojeni, enquanto que endotelina seria o principal mediador nas alteraÃÃes renais causadas pela miotoxina I da B. moojeni.<br>Acute renal failure is one of the most common systemic complications after snakebite. However, its pathogenesis remains obscure. In this study, we evaluated the renal effects of Bothrops jararacussu myotoxins I and II (Bthtx-I Lys 49 and BthtxII, Asp 49), Bothrops moojeni myotoxin I and the lectins from Bothrops moojeni and Bothrops jararacussu. Attempting to investigate the mechanisms involved in the renal effects of the mentioned toxins, we tested indomethacin, an unespecific cyclooxigenase inhibitor. Additionally, tezosentan, an endothelin receptor blocker, was used to evaluate the role of endothelin in the renal effects of Bothrops moojeni myotoxin I. All myotoxins (5 Âg/mL) and lectins (10Âg /mL) were added to the perfusion system 30 min after the beginning of each perfusion. Indomethacin (10Âg/mL) and tezosentan (10 Âg /mL) were always added 30 minutes before the tested substances. The renal effects were compared against a control group, where kidneys were perfused only with the modified Krebs-Henseleit solution. Myotoxins from Bothrops jararacussu and the lectin from Bothrops moojeni increased the perfusion pressure (C120= 110.28  3.09, Bthtx I120= 171.20  6.3 * ,Bthtx II120= 175.50  7.20 * and BmLec120= 152.50  2.10 *), the renal vascular resistance (C120= 5.46  0.54, Bthtx I120= 8.62  0.37 *, Bthtx II120= 8.90  0.36 * and BmLec120= 7.77  0.30*), the urinary flow (C120= 0.143  0.008, Bthtx I120= 0.326  0.048*, and Bthtx II120= 0.373  0.085* ), the glomerular filtration rate (C120= 0.678  0.065, Bthtx I120= 0.855  0.133 *, Bthtx II120= 1.224  0.282* and BmLec120= 1.037  0.055*) and the sodium, potassium and chloride excretion. On the other hand, the same substances decreased the percent of renal tubular transport of sodium (C120= 79.76  0.56, Bthtx I120= 62.23  4.12*, Bthtx II120= 70.96  2.93* and BmLec60= 77.25  1.36*), potassium (C60= 66.38  3.31, Bthtx I60= 55.79  5.57 *, Bthtx II60= 50.86  6.16* and BmLec60= 59.78  3.49*). Indomethacin inhibited the renal effects induced by Bothrops jararacussu myotoxin I and Bothrops moojeni lectin, but partially blocked the effects promoted by myotoxin II and the lectin of Bothrops jararacussu, and the effects of myotoxin I of Bothrops moojeni. Tezosentan inhibited the renal effects induced by B. moojeni myotoxin I. In conclusion, prostaglandins are involved in the renal alterations induced by myotoxins and lectins purified from the snake venoms of Bothrops jararacussu and Bothrops moojeni. In addition, endothelin is the main mediator of the renal alterations promoted by Bothrops moojeni myotoxin I

Phosphatidylinositol is a a minor membrane component of eukaryotic cells, however, it plays a crucial role in cell signaling pathways as a precursor for a number of signaling molecules and second messengers. Among the most significant ones are phosphoinositides created by phosphorylation of the hydroxyl groups of phosphatidylinositol at positions 3,4, and 5 of the inositol ring. Despite its significance, the spatial and temporal distribution and dynamics of phosphatidylinositol remains unclear owing mainly to the lack of a specific optical probe (biosensor) to visualize phosphatidylinositol in living cells. Biosensor for inositol phospholipids are based on lipid-binding domains of their effector proteins with high enough affinity and specificity for a given phosphoinositide - but nosuch domain is known for PI. However, an enzyme - phosphatidylinositol-dependent phospholipase C - that specifically recognizes phosphatidylinositol is known. This enzyme catalyzes the hydrolysis of phosphatidylinositol into diacylglycerol and inositol 1-phosphate and unlike eukaryotic homologs does not act upon the phosphorylated forms of phosphatidylinositol. The main aim of this thesis was to solve the structures of several inactive mutant forms of phospholipase C from Bacillus cereus complexed to myo-inositol which...