Academic literature on the topic 'Fourche de réplication'

Le génome des cellules est constamment soumis à des agressions exogènes (rayonnement UV, composés chimiques) ou endogènes (dommages oxydatifs). Ces agressions ont pour conséquence de créer des lésions sur l'ADN. Au cours de la réplication du chromosome, la machinerie réplicative de la bactérie Escherichia coli va rencontrer certaines de ces lésions qui n'ont pas été réparées. Ces lésions constituent un obstacle pour la polymérase réplicative. De nombreuses questions se posent :-Que se passe-t-il au niveau de la lésion et de la polymérase bloquée ?-Que devient la fourche de réplication dont l'un des brins est bloqué ?Afin de répondre à ces questions, nous avons mis au point une technique qui permet d'étudier la cinétique de synthèse de chacun des brins d'un plasmide, portant une lésion ou non, au sein d'une bactérie. Ainsi, nous avons pu déterminer que le temps nécessaire à la réplication au travers d'une lésion modèle que forme le cancérogène Acétylaminofluorène (AAF), est d'environ 50 minutes. Nous montrons également que ce temps de passage dépend du contexte de séquence et de la nature de la lésion. L'analyse des intermédiaires de réplication bloqués au niveau de la lésion a permis de mettre en évidence une inhibition partielle de l'activité de correction de lecture (proofreading) de la polymérase réplicative, dépendante de l'induction du système SOS. L'analyse de la cinétique de réplication des deux brins (endommagé ou non) d'un plasmide a permis de montrer un découplage transitoire de la synthèse des deux brins probablement suivi d'un blocage définitif de la fourche de réplication : ces phénomènes sont nécessaires à la formation de structures dites de "fourches régressées", structures intermédiaires essentielles à la mise en place de mécanismes qui vont assurer la continuité du brin en cours de synthèse, et ainsi restaurer une fourche de réplication intacte
Genomes of all living organisms are constantly injured by exogenous and endogenous agents that modify the chemical integrity of DNA. During chromosomal replication, the replicative machinery of Escherichia coli in-avoidably encounters DNA lesions that have escaped the various excision repair pathways, blocking the progression of the replicative DNA polymerase and thus raising several key questions:-What happens to the polymerase blocked at the lesion?-What is the fate of a replication fork in which synthesis is blocked in one strand?In order to answer these questions, we set up an assay that allow to monitor in vivo, the kinetics of replication of both strands of a DNA molecule containing a single replication block. Hence, we managed to determine that bypass of a model DNA replication-blocking lesion formed by the binding of the chemical carcinogen N-2-acetylaminofluorene (AAF) to guanine residues requires about 50 minutes. It was also found that this time depends upon the sequence context and the chemical nature of the lesion. Moreover, the fine analysis of the replication intermediate pattern in the vicinity of the lesion allowed us to "visualize" a partial inhibition of the proofreading activity of the replicative polymerase (PolIII), dependant upon SOS-induction. Analysis of the kinetics of replication of both damaged and undamaged strands of a plasmid, revealed transient uncoupling of leading- and lagging-strand DNA replication. Lagging strand synthesis proceeds beyond the block in the leading strand over a distance > 1 kb before the whole fork will probably block. These events are essential to generate "regressed forks", intermediate structures that allow the damaged strand to be rescued and a normal replication fork to be restored

Les fourches de réplication arrêtées peuvent être retournées lors de la réaction de retournement des fourches de réplication (RFR) chez la bactérie Escherichia coli. Cette réaction consiste en l’appariement des brins nouvellement synthétisés de la fourche pour former une structure à quatre branches, la Jonction de Holliday (JH). RuvAB est une hélicase induite par la présence de lésions de l’ADN. Elle se fixe spécifiquement sur les JH formées lors de la recombinaison homologue (RH) et permet leur résolution par la résolvase RuvC dans le complexe RuvABC. Nous avons montré que RuvAB retourne les fourches de réplication dans les mutants dnaEts, holD, et partiellement rep mais pas dans les mutants priA et dnaNts. Nous proposons donc que RuvAB possède deux fonctions distinctes : sa fonction dans la RH qui est bien décrite et un nouveau rôle dans la réplication. Une mutagénèse aléatoire dans ruvA nous a permis d’isoler et caractériser des mutants de dissociation de fonction, où le RFR est totalement ou partiellement aboli, tandis que divers tests de recombinaison (recombinaison Hfr, réparation par RH des lésions après irradiation UV ou traitement à la mitomycine C) montrent que la RH n’est pas affectée in vivo. Les mutants sont affectés pour la fixation à l'ADN, l’octamérisation et la stimulation de l'activité hélicase de RuvB in vitro. Les protéines RuvA affectées sont donc incapables de convertir des fourches de réplication en jonctions de Holliday tandis qu’elles restent capables de faire de la migration de branche et de résoudre les intermédiaires de recombinaison in vivo. Les données indiquent que les deux fonctions de RuvAB peuvent être séparées et que la réaction de RFR est plus exigeante que la RH.

Ce travail présente l'étude à l'echelle de la molécule unique la jonction de Holliday, et de ses interactions avec les protéines MutS et ReG. Nous commençons par le comportement de la jonction de Holliday. La présence au niveau du centre de la jonction d'une hétérologie entre les séquences suffit à bloquer la migration sous certaines conditions expérimentales. Ce phénomène nous permet de détecter les hétérologies de séquences entre deux molécules. Nous avons étudié l'interaction entre une molécule d'ADN présentant une jonction de Holliday, et la protéine MutS. La présence de MutS bloque la migration lorsqu’un mésappariement arrive au niveau du centre de la jonction. La protéine RecG est une hélicase qui intervient dans le sauvetage des fourches de réplication. Des études suggèrent sa capacité à faire rebrousser les fourches de réplication arrêtées. Nous avons étudié ces réactions à l'échelle de la molécule unique. Nous avons observé la migration de la jonction. Cela nous a permis d'effectuer une mesure directe de la vitesse de l'enzyme, sa processivité et le couple maximal fourni par l'enzyme. Nous avons étudié la dépendance en concentration d'ATP et d'enzyme

Les éléments transposables ont un rôle majeur dans la plasticité et l'évolution des génomes bactériens. Les séquences d'insertion bactériennes de la famille IS200/IS605, très présentes chez les Eubactéries et les Archaea, codent une transposase de type Y1 et possèdent un mécanisme de transposition atypique, mettant en jeu exclusivement des intermédiaires ADN sous forme simple brin. Différents processus cellulaires génèrent de l'ADN simple brin, comme la réplication ou le transfert conjugatif. L'équipe a récemment mis en évidence un lien entre la transposition d'IS608, un membre de la famille IS200/IS605, et la réplication du chromosome de l'hôte : la transposition d'IS608 est renforcée au niveau des fourches de réplications arrêtées. Notre étude concerne la caractérisation du ciblage des fourches de réplication arrêtées par la transposase TnpA d'IS608. Nos travaux in vivo ont montré que TnpA est localisée au niveau des fourches, arrêtées par un système opérateur/répresseur placé sur le chromosome. La méthode de purification de complexes natifs employée (TAP-tag) ne nous a pas permis de mettre en évidence de partenaire protéique impliqué dans ce ciblage. In vitro, TnpA est capable d'interagir avec divers substrats ADN structurés, mimant des structures produites in vivo par les systèmes de redémarrage, tels qu'une fourche, une D-loop ou une jonction de Holliday. Ces données suggèrent un modèle d'action dans lequel TnpA ciblerait les sites de redémarrage des fourches, avant de " glisser " vers ses substrats cibles simple brin et de catalyser l'intégration d'IS608
Transposable elements have a major role in plasticity and evolution of bacterial genomes. The bacterial insertion sequences of the IS200/IS605 family, largely represented in Eubacteria and Archaea, encode a Y1-type transposase and have an atypical transposition mechanism, involving only single-stranded DNA intermediates. Various cellular processes generate single-stranded DNA, such as replication or conjugative transfer. The team recently demonstrated a link between the transposition of IS608, a member of the IS200/IS605 family, and the host chromosome replication: transposition of IS608 is enhanced at stalled replication forks. Our study concerns the characterization of targeting stalled replication forks by the transposase TnpA of IS608. Our in vivo studies showed that TnpA is localized at the forks, stalled by a system operator / repressor located on chromosome. The method used for native complex purification (TAP-tag) did not allow us to identify any protein partner involved in this targeting. In vitro, TnpA is able to interact with various structured DNA substrates, mimicking the structures produced in vivo by restarting systems, such as fork, D-loop or Holliday junction. These data suggest a model in which TnpA would target fork restart sites before "sliding" towards its single-stranded substrates target and catalyzing IS608 integration

Le Stress Réplicatif est caractérisé par une accumulation de fourches bloquées et est connu pour être une source majeure d'instabilité génétique dans les cellules humaines. Le Stress Réplicatif et l'instabilité génétique sont des marqueurs précoces de la tumorigenèse. Il est connu que les fourches de réplication bloquées peuvent dégénérer en cassures double brin. En effet, après un stress réplicatif prolongé (24h) induit par l'hydroxyurée (HU), l'endonucléase MUS81-EME1 peut promouvoir l'effondrement des fourches de réplication. Cette endonucléase prévient l'accumulation de régions sous-répliquées en G2 et des défauts de ségrégation chromosomique en mitose. Dans cette étude, en suivant l'apparition de cassures double brin (CDB) par les techniques sensibles d'essai comète neutre et de QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry), nous avons pu mettre en évidence que l'effondrement des fourches est un événement qui peut être visualisé rapidement suite au stress réplicatif (dès 2h après HU). Nous avons pu caractériser cet effondrement rapide comme étant un mécanisme indépendant de MUS81, sous unité catalytique du complexe MUS81-EME1. De plus, en réalisant des extinctions de l'expression de gènes par siARN, nous avons identifié deux nucléases, Artémis et XPF, comme étant impliquées dans ce mécanisme d'effondrement rapide des fourches de réplication. Nos résultats suggèrent un rôle de ce mécanisme d'effondrement rapide dans la prévention d'intermédiaires mitotiques et de la transmission de lésions aux cellules filles. Nous avons également identifié l'ADN polymérase alternative, Pol theta comme étant un facteur impliqué dans la prévention de la mort cellulaire induite par ce mécanisme. L'exploration de données de qPCR sur des prélèvements de tissus cancéreux nous a permis d'identifier la surexpression de Pol theta comme étant corrélée à des gènes de la HR. Ceci suggère un potentiel mécanisme d'adaptation pour prévenir de l'accumulation de fourches effondrées dans les cellules cancéreuses. L'ensemble de ces données révèle que les cellules humaines ont acquis au cours de l'évolution la capacité de cliver rapidement des fourches bloquées qui pourrait s'avérer importante pour la stabilité du génome, notamment en contexte de stress réplicatif
Replicative stress is characterized by an accumulation of stalled replication forks and is known to be a major source of genetic instability in human cells. Replicative stress and genetic instability are early markers of tumorigenesis. It is known that stalled replication forks can degenerate into double strand breaks (DSB), a process called replication fork collapse. Indeed, after an extended replicative stress (24h) induced by hydroxyurea (HU), the endonuclease MUS81-EME1 can promote the collapse of replication forks. This endonuclease prevents accumulation of under replicated regions in G2 and mitotic segregation defects. Here, by monitoring DSB with sensitive neutral comet assay and QIBC (Quantitative Image-Based Cytometry) approaches, we found that replication forks can also collapse rapidly after replicative stress (as early as 2 hours after HU). We characterised this rapid replication fork collapse as a MUS81-independent mechanism. Moreover, by performing siRNA based knock down, we identified two nucleases, Artemis and XPF, involved in rapid replication fork collapse mechanism. Our results point toward a role of this rapid collapse mechanism in preventing mitotic intermediates and lesion transmission to daughter cells. Also, we identified the role of an alternative DNA polymerase Pol theta as a molecular factor involved in preventing this mechanism to induce cell death. Data mining of expression data from tumour samples allowed us to identify Pol theta verexpression as correlated with HR genes, underpinning a potential adaptation mechanism to prevent collapsed fork accumulation in cancer cells. Collectively, these data reveal that human cells have evolved a quick cleavage response to stalled forks that might be important for genome stability notably in cells undergoing replicative stress

Des stress réplicatifs sont rencontrés à chaque phase S du cycle cellulaire et différents mécanismes permettent leur prise en charge. La recombinaison homologue (RH) tient un rôle important dans le maintien de la stabilité du génome au cours de la réplication. En effet, la RH escorte la progression des fourches et prévient les défauts mitotiques. Toutefois, le lien moléculaire entre le stress réplicatif et les défauts mitotiques n’est pas élucidé. De façon générale, les fourches de réplication bloquées peuvent être sauvées grâce à leur fusion avec la fourche convergente ou au redémarrage de fourche par la RH. Le laboratoire a développé un essai génétique reposant sur l’utilisation d’une barrière de réplication conditionnelle afin d’étudier le mécanisme par lequel la RH contribue au sauvetage des fourches de réplication bloquées. L’équipe a montré que le redémarrage des fourches bloquées par la RH est conditionné par l’exposition d’un ADNsb et non d’une cassure double-brin. Ainsi, les fonctions de la RH au cours de la gestion du stress réplicatif peuvent être adressées indépendamment de sa fonction de réparation des cassures (fonction relativement bien documentée). Les travaux décrits dans ce manuscrit s’inscrivent autour des mécanismes que la RH engage afin d’assurer la stabilité génétique en réponse au stress réplicatif. Plus précisément, je me suis intéressée à l’implication des facteurs de la RH dans la protection des fourches de réplication bloquées au niveau moléculaire et cellulaire. En absence de la recombinase Rad51 ou de son chargeur Rad52, le blocage d’une seule fourche de réplication est suffisant pour induire des défauts mitotiques, incluant des ponts anaphasiques (lien physique entre chromatides sœurs). Il s’avère que les fourches bloquées sont extensivement dégradées par la nucléase Exo1 en absence de Rad51/Rad52. De manière intéressante, l’accumulation excessive d’ADNsb à la fourche est à l’origine de la non-disjonction des chromatides sœurs en mitose et ce malgré l’arrivée de fourches convergente. Ainsi, les fourches de réplication non protégées sont le siège de terminaison pathologique mettant à mal la ségrégation des chromosomes. La RH étant impliquée dans la protection et le redémarrage des fourches de réplication, l’utilisation du mutant de séparation de fonction Rad51-3A a permis de montrer que ces deux fonctions sont génétiquement séparables. Les fourches de réplication protégées et incapables d’être redémarrées par la RH ne présentent pas de symptômes de terminaison pathologique. Ainsi, au-delà de sa capacité à redémarrer les fourches inactivées, les facteurs de la RH assurent la complétion de de la réplication en maintenant les fourches de réplication dans une conformation propice à une fusion avec la fourche convergente. Ces résultats contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires invoqués par la RH afin de maintenir la stabilité génétique au cours du stress réplicatif
At each cell cycle, cells undertaking the DNA replication process face several sources of replication stress (RS) compromising the progression of the replicating forks and threatening both chromosome duplication fidelity and their correct segregation during mitosis. Replication stresses emerged as a major source of genetic instability and cancer development. Several mechanisms, among which homologous recombination (HR), operate to buffer the deleterious effects of RS. HR acts as an escort to fork progression and prevents mitotic defects. Nonetheless, the molecular connection between replication stress and mitotic defects remains elusive. A conditional replication fork barrier (RFB) acting in a polar manner was developed in the lab to terminally-arrest fork progression. In this system, HR functions handling replication stress can be assessed independently of its well-known function in double strand break repair. The work described here aims to understanding the mechanism that HR performs to ensure genetic stability in response to replication stress. In general, blocked replication forks can be rescued either by fork convergence or by active HR-mediated fork restart. However, in absence of Rad51 recombinase or it loader Rad52, a single activated RFB is sufficient to induce mitotic abnormalities including anaphase bridges. The involvement of HR factors in fork protection was explored at the molecular and cellular levels. It turns out that terminally-arrested forks are extensively resected by the Exo1 nuclease in the absence of Rad51/Rad52. Interestingly, the excess of ssDNA accumulation at the fork triggers sister chromatid non-disjunction in mitosis despite the arrival of an uncorrupted converging fork to rescue replication. Thus, unprotected replication forks are prone to pathological termination threatening chromosome segregation. HR being involved in fork protection and restart, the use of a Rad51 mutant showed that these two functions are genetically separable. Indeed, protected forks unable to restart by HR do not show any pathological termination. Thus, beyond their ability to restart inactivated forks, HR factors ensure replication completion by maintaining the forks in a suitable conformation for a fusion with the converging fork. Overall, these results shed light on the molecular events engaged by RH to ensure genome stability in response to replication stress

Au cours de la réplication de l’ADN, les cellules rencontrent régulièrement des obstacles d’origine endogène et exogène qui peuvent mettre en péril la réplication des génomes et menacer la duplication et ségrégation des chromosomes en mitose. La Recombinaison Homologue (RH) a un rôle bien caractérisé dans la réparation des cassures double-brin. Par contre, son rôle dans la protection et le redémarrage des fourches de réplication est moins bien caractérisé. Il a été montré par l’équipe que le redémarrage des fourches bloquées par la RH dépend de la formation d’ADN simple-brin et pas d’une cassure double-brin.Afin d’étudier les mécanismes par lesquels la RH contribue au sauvetage des fourches de réplication bloquées, un système permettant de bloquer localement la progression d’une seule fourche de réplication a été utilisé. Cet essai génétique a permis de montrer que le redémarrage de fourches bloquées par la RH est associé à une synthèse d’ADN fautive suite à des événements de glissement de la polymérase au niveau de micro-homologies. Un marqueur génétique a été associé à la barrière de réplication afin de mesurer l’efficacité de redémarrage des fourches bloquées et d’étudier l’étape de résection (i.e formation de l’ADN simple brin) dans différents fonds génétiques.Dans ce travail, le rôle de facteurs impliqués dans la résection a été étudié dans le contexte d’un blocage de fourche de réplication. Comme pour la réparation de cassures double-brin, la résection des fourches bloquées se fait en deux étapes : résection initiale et extensive. La résection initiale, de faible portée, dépend du complexe MRN (Mre11/Rad50/Nbs1) et Ctp1. A cette étape, la dégradation de l’ADN néosynthétisé se fait sur une distance de 110 bp. Cette résection est suffisante pour permettre de recruter les facteurs de la RH, mais est aussi nécessaire pour que les fourches continuent à être résectées. L’absence de MRN et/ou Ctp1 conduit à un défaut de redémarrage. La résection extensive, qui expose de l’ADN simple brin sur une distance de 0,8 à 1Kb, est largement dépendante de la nucléase Exo1. Contrairement à la résection initiale, la résection extensive n’est pas critique pour le redémarrage des fourches par la RH.De façon intéressante, le facteur Ku, connu pour être impliqué dans la jonction d’extrémités non-homologue, a un rôle dans le contrôle de la résection initiale et extensive et dans l’optimisation du redémarrage des fourches bloquées. Plus précisément, en absence de Ku, de l’ADN simple-brin s’accumule en amont des fourches bloquées, et la dynamique de redémarrage est affaiblie, mais pas abolie. Globalement, ces résultats clarifient une étape cruciale dans le redémarrage des fourches par la RH : la résection
On a regular basis, cells encounter endogenous and exogenous replication stresses that jeopardize the progression of replication forks, thus threatening both the accuracy of chromosome duplication and their segregation during mitosis. Homologous recombination (HR) has a well-known role in repairing DNA double strand breaks (DSB). Other less acknowledged functions of HR are to protect and restart impeded forks. As it was previously reported by the team, restarting replication forks by HR requires the exposure of a single-stranded gap through fork resection, and not a DSB, to allow the recruitment of recombination factors.To study the effects of HR in blocked replication forks, a conditional fork barrier (RFB) was used to terminally-arrest replication at a specific locus. This construct allowed to determine that replication restart by HR is error-prone, leading to replication forks liable to slippage at micro-homology. A genetic reporter assay was placed in the vicinity of the RFB to allow the efficiency of replication restart and the step of resection to be quantified.In here, we explored factors involved in the formation of ssDNA gaps at halted replication forks. Similarly to DSB repair, resection in fork restart occurs in two steps. The initial resection is performed by MRN (Mre11/Rad50/NBS1) and Ctp1. This small degradation of approximately 110 bp of newly synthetized strands is sufficient to recruit HR factors and is required to promote the subsequent resection. The absence of either MRN or Ctp1 leads to defective replication restart by HR. The extensive resection (about 0.8-1Kb in size) is largely dependent on the nuclease Exo1, and it is not required for efficient fork restart.Interestingly, the non-homologous end-joining factor Ku was found to have a role in orchestrating initial and extensive resection and fine-tuning fork restart. Specifically, in the absence of Ku, ssDNA accumulates at the terminally-arrested replication forks, and fork restart dynamics is decreased, but not abolished. Overall, these results shed light on a delicate step of replication fork recovery by homologous recombination: resection

Le programme spatiotemporel de réplication de l'ADN est régulé au cours du développement et altéré durant la progression cancéreuse. Nous proposons une caractérisation originale de la plasticité du programme de réplication de l’ADN se basant sur le profilage de 12 lignées cellulaires humaines normales ou cancéreuses par la méthode Ok-seq de purification et séquençage des fragments d'Okazaki qui permet de déterminer l'orientation de la progression des fourches de réplication (OFR) à haute résolution (10 kilo bases). L'analyse comparative des profils OFR montre que les changements réplicatifs permettent la classification des lignées cellulaires en fonction de leur tissu d'origine, la nature cancéreuse ou non de la lignée n'intervenant qu'en second ordre. Il n’apparait pas de point chaud pour l’accumulation des changements réplicatifs, ceux-ci étant largement dispersés sur tout le génome. Néanmoins, les régions riches en G+C et en gènes actifs, répliquées précocement au cours de la phase S, ont le programme de réplication le plus stable, elles présentent une forte densité de zones d'initiation de la réplication (ZI) efficaces et conservées entre lignées cellulaires. En contraste, les dernières régions répliquées, à faible densité de gènes et pauvres en G+C, présentent peu de ZI efficaces, souvent spécifiques d'un tissu ou d'une lignée. Ceci nous conduit à quantifier le degré de dissociation entre ZI et activation de la transcription. Ce travail propose un panorama original des modifications du programme de réplication au cours de la différentiation normale ou pathologique, dont un contrôle lignée cellulaire spécifique des ZI dans les déserts de gènes à réplication tardive
The spatiotemporal program of DNA replication is regulated during development and altered during cancer progression. We propose an original characterization of the plasticity of the DNA replication program based on the profiling of 12 normal or cancerous human cell lines by the Ok-seq method of purification and sequencing of Okazaki fragments which allows to determine the orientation of the progression of replication forks (RFD) at high resolution (10 kilo bases). Comparative analysis of the RFD profiles shows that the replicative changes allow the classification of the cell lines according to their tissue of origin, the cancerous or non-cancerous nature of the cell line type intervening only in second order. There is no hotspot for the accumulation of replicative changes, they are widely dispersed throughout the genome. Nevertheless, the G+C rich and active gene regions, replicated early in the S phase, have the most stable replication program, they present a high density of efficient replication initiation zones (IZ) conserved between cell lines. In contrast, the late replicated, low gene density and low G+C content regions have few efficient IZs, often specific to a tissue or lineage. This leads us to quantify the degree of dissociation between IZ and activation of transcription. This work provides an original overview of replication program changes during normal or pathological differentiation, including a cell line specific control of IZ in late-replication gene deserts

Ce travail s'intéresse au rôle de l'hélicase UvrD dans le redémarrage des fourches de réplication inactivées chez Escherichia coli. Dans le cas d'arrêt de la réplication à un site Ter/Tus de terminaison de la réplication ectopique, nous avons montré que UvrD est l'hélicase majeure impliquée dans le redémarrage. Nous proposons que le rôle de l'hélicase UvrD lors du redémarrage des fourches bloquées à un site de terminaison ectopique consiste à déplacer le complexe Ter/Tus de terminaison lors du redémarrage de la réplication après recombinaison homologue. Nous avons pu montrer que ce rôle de UvrD est conservé chez son homologue PcrA de Bacillus subtilis. Dans le cas d'arrêt de la réplication après inactivation d'une sous-unité de la polymérase réplicative (Pol III) d'E. Coli, la sous-unité catalytique (mutant dnaEts) ou le facteur de processivité (mutant dnaNts), l'action anti-RecA de UvrD est essentielle à la réaction de réversion des fourches de réplication (RPR) permettant un redémarrage de la réplication. L'étude du mode d'action anti-RecA de UvrD aux fourches de réplication inactivées montre qu'il dépend de la sous-unité de Pol III inactivée. Dans le mutant dnaNts l'activité ATPase de UvrD est essentielle à son action anti-RecA. Au contraire, dans le mutant dnaEts l'action anti-RecA de UvrD ne nécessite pas l'activité ATPase de la protéine, et corrèle avec un besoin de la protéine RarA/MgsA pour la fixation de RecA. Par ailleurs, nous avons montré que l'action anti-RecA de UvrD aux fourches de réplication inactivées est conservé chez son homologue PcrA de Bacillus subtilis
This study aims at understanding the role of the UvrD helicase in the restart of arrested replication forks in Escherichia coli. After replication arrest at ectopic replication terminaison sites of Ter/Tus, we showed that UvrD is the major helicase needed to restart. We propose that UvrD acts in concert with homologous recombination proteins to dislodge Tus form Ter sites during replication restart. The Tus-removal action of UvrD is conserved in Bacillus subtilis homologous helicase PcrA. After replication fork arrest by the inactivation of a subunit of the DNA polymerase III holoenzyme (Pol Illh), either the catalytic subunit (dnaEts mutant) or the (3-clamp (dnaNts mutant), the anti-RecA action of UvrD at blocked forks is essential for the replication fork reversal reaction (RPR) to promote replication restart. We have shown that the anti-RecA action of UvrD at blocked forks reflects two different activities of this enzyme. An ATPase-deficient UvrD mutant is able to antagonize RecA in cells affected for the Pol IIIh catalytic subunit DnaE. In this mutant, RecA action at blocked forks specifically requires the protein RarA (MgsA). This suggests that UvrD acts by preventing RecA binding, possibly through counteracting RarA. In contrast, at forks affected for the Pol Illh clamp (DnaN), RarA is not required for RecA binding and the ATPase fonction of UvrD is essential to counteract RecA, supporting the idea that UvrD removes RecA from DNA. The anti-RecA action of UvrD at Pol IIIts-blocked forks is conserved in the Bacillus subtilis homologous helicase PcrA. Proliferative disorders, this unique mutation will permit a new molecular classification of these disorders and novel therapeutical approaches

Dans Escherichia coli la Dam Methyl Transferase (DamMT) est responsable du transfert d'un groupement méthyle sur les adénosines situés au cœur du tétranucléotide GATC; il s'agit donc d'une activité post réplicative. Ainsi, après le passage de la fourche de réplication, le brin d'ADN nouvellement synthétisé est non méthylé - l'ADN est dit hémimethylé. L'ADN reste hémimethylé pendent une brève période - de l'ordre de la minute - avant d'être reméthylé par la DamMT. L'hypothèse de l'implication de la méthylation de l'ADN dans le contrôle général du programme de maintenance de l'ADN repose essentiellement sur cette observation, puisque l'ADN hemimethyle - exception faite de l'origine de réplication et de la région promotrice du gène dnaA - est diagnostique du passage récent de la fourche de réplication. Cette hypothèse, et le criblage phylogénomique qui en a découlé a conduit a l'identification de plusieurs gènes dont les produits sont supposes être impliqués dans la maintenance de l'ADN. yjaG est l'un de ces gènes. Il a été renomme cycC en raison des dérèglements de la progression du cycle cellulaire associés a un mutant nul de ce gène. L'étude effectuée au cours de ma thèse s'attachera à expliquer l'état actuel de nos connaissances sur la protéine CycC et de son implication dans le processus de réplication de l'ADN. Nos résultats montrent que la protéine CycC est impliquée dans la processivité de la réplication lorsqu'il y a un dommage au niveau de l'ADN. CycC spécifie une activité qui conduit à freiner les fourches de réplication, afin de prévenir des avortements des réplisomes. La surexpression de CycC bloque l'initiation de la réplication entre l'ouverture de la molécule d'ADN et le chargement de l'hélicase réplicative. Nous proposons que CycC interagisse avec le complexe réplicative et ralentit les fourches de réplication. Ce ralentissement prévient de nouvelles collisions lorsque les cellules sont dans des conditions de stress-qui cause des arrêts de la réplication.