Dissertations / Theses on the topic 'Fungos endófitos'

Orientadora : Profª Drª Chirlei Glienke
Coorientadora : Profª Drª Yvelise Maria Possiede
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/02/2012
Inclui referências : f. 22-31;59-68;89-92
Área de concentração
Resumo: Os fungos endofíticos, ou endófitos, pertencem a uma das Classes de fungos que apresentam grande riqueza e ampla distribuição, e, além disso, são capazes de produzir uma enorme variedade de metabólitos que podem ser aplicados nos mais diversos setores da sociedade. O estudo destes microrganismos em áreas remotas ainda é escasso, a exemplo da região do Pantanal sul-mato-grossense, que apresenta características biogeográficas únicas. Uma das particularidades da região são as formações monodominantes de Vochysia divergens, popularmente conhecido como Cambará, este vegetal de porte arbóreo também é capaz de produzir substâncias bioativas importantes. O estudo da comunidade de fungos endofíticos em folhas de Cambarás da região pantaneira pode revelar novas espécies de microrganismos com aplicação biotecnológica, como o controle biológico de Phyllosticta citricarpa, causador da doença Mancha Preta do Citros (MPC). Este fitopatógeno é o responsável por severas barreiras fitossanitárias impostas pelos países importadores que ainda estão livres da doença, o que resulta em grandes perdas econômicas para o Brasil. O uso de técnicas moleculares na identificação de fungos endofíticos tem-se revelado útil, a exemplo destas ferramentas está o sequenciamento das regiões ITS do rDNA. No presente estudo, 81 isolados tiveram seu DNA extraído e amplificaram a região do gene ITS1 - 5,8S - ITS2 do rDNA e de acordo com a análise de máxima verossimilhança os isolados foram agrupados em dois filos, quatro Classes e quinze gêneros do Reino Fungi. De 70 isolados testados contra o fitopatógeno P. citricarpa, três apresentaram resultados inibitórios promissores, e após a estratificação dos metabólitos o isolado pertencente a família Xylariaceae inibiu cerca de 80% o crescimento micelial e formação de picnídios do fitopatógeno. O gene LSU dos três isolados com maior inibição foi sequenciado para confirmação da identificação via sequencias da região ITS do rDNA. Palavras-chave: endofíticos, V. divergens, P. citricarpa, ITS e antagonismo.
Abstract: The endophytes are one class of fungi that possess a great richness and wide geographical distribution and in addition to this are capable to produce a large variety of metabolites that can be applied in several society fields. The surveys of these microorganisms in distant and isolated geographical areas are scarce; one example is the Pantanal of Mato Grosso do Sul, which own unique biogeographical characteristics and one of those peculiarities are the monodominant formations of Vochysia divergens, popularly known as "Cambará"; this vegetable is a tree also capable to produce many kinds of bioactive compounds. The study of the fungal endophytes in the "Cambará" leaf from the Pantanal region may lead to the discovery of new microorganism species with biotechnological application, as an example, the biological control of the pathogen Phyllosticta citricarpa, the responsible for the disease known as Citrus Black Spot (CBS). This phytopathogen is the cause of many phytosanitary barriers imposed by the foreign buyers free from the disease leading to great economics losses for Brazil. The application of molecular technics in the identification of fungal endophytes has proved useful, for example, the rDNA ITS regions sequencing. In the present work 81 isolates had their DNA extracted and amplified the region gene ITS1 - 5.8 S - ITS2 of the rDNA and according to maximum likelihood analysis isolates were grouped into two phyla, four Classes and fifteen genres of the Fungi Kingdom. 70 isolates were tested against the plant pathogen P. citricarpa. Three isolated showed promising results, and after the stratification of the metabolites the isolated belonging to the family Xylariaceae inhibited about 80% of mycelial growth and pycnidia formation of the pathogen. The LSU gene of three isolates with the greatest inhibition was sequenced to confirm the results of ITS. Key words: endophytes, V. divergens, P. citricarpa, ITS and antagonism.

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Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Fungo endofítico é aquele que coloniza os tecidos saudáveis da planta hospedeira, sem causar sintomas aparentes. Vitis labrusca L. é uma espécie de Vitaceae originária da América do Norte, sendo a cultivar Isabel bastante produtiva. O cultivo de V. labrusca cv. Isabel é praticado há cerca de 40 anos no Vale do Siriji (municípios de São Vicente Férrer e Macaparana), Pernambuco, Brasil. Devido à importância agroeconômica da uva Isabel, este trabalho teve por objetivo determinar a micobiota endofítica de folhas sadias de Vitis labrusca cv. Isabel em duas áreas do Vale do Siriji. Entre junho/2009 e maio/2010, foram realizadas quatro coletas de folhas sadias de V. labrusca cv. Isabel, sendo duas no período de estiagem e duas no período chuvoso. No laboratório, as folhas foram lavadas com água corrente e sabão neutro, e com auxílio de um furador esterilizado foram feitos discos foliares (6 mm), posteriormente desinfestados em álcool 70% por 30 segundos, em hipoclorito de sódio (NaOCl) a 2% por 2 minutos e 30 segundos, e finalmente duas lavagens com água destilada esterilizada. Seis discos foliares foram transferidos para placas de Petri, em triplicata, contendo Batata-Dextrose-Ágar (BDA) acrescido de cloranfenicol (50 mg.L-1). As placas foram incubadas em temperatura ambiente (28 ± 2°C) e observadas por 15 dias quanto ao crescimento fúngico. Fragmentos de micélio foram transferidos para tubos de ensaio contendo meio BDA, e após purificação os fungos foram identificados. Foram obtidas 424 colônias de fungos endofíticos pertencentes a 40 espécies. Nigrospora oryzae, Glomerella cingulata, Colletotrichum gloeosporioides, Guignardia bidwellii e Cladosporium cladosporioides foram as espécies mais frequentes. A similaridade entre os fungos endofíticos nas duas áreas estudadas foi de 49,06%, e entre períodos de coleta de 56%. A maioria das espécies isoladas neste trabalho já foi citada como endofíticos de outros vegetais, sendo Gonatobotrys simplex, Graphium putredinis, Paecilomyces marquandii, Rhodotorula acheniorum e R. aurantiaca citadas pela primeira vez como endofíticas de videiras

Submitted by Daniela Soares (dmeireles2@gmail.com) on 2017-04-12T15:29:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertação - Carla Figueiredo Coelho.pdf: 1046058 bytes, checksum: 851306d91f79626aa3cd7b9adf532e31 (MD5)
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CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
Urena lobata is grown only to obtain fiber, and as seeds are derived from the extractive process. This scenario tends to change, for this issue is relevant for the socioeconomic situation, especially for the State of Amazonas. The objective of this research was to investigate the occurrence of endophytic fungi in U. lobata, evaluating an influence of the plant organ and culture site, since the endophyte-host interaction may be beneficial or may become harmful to the plant. The frequency and degree of colonization, diversity indexes of Shannon-Weaver, Simpson, and Pielou uniform were calculated and the dominance component curve was performed. The genera found were: Phomopsis, Colletotrichum, Fusarium, Pestalotiopsis, Curvularia and Cochliobolus. Greater diversity and fungal richness was found in Manaus with high colonization present in the leaves. Preference was given to the following genera: Curvularia and Fusarium seed and Colletotrichum leaf. A similarity between the main cropping systems and the results of a mutualistic or balanced antagonistic interaction.
A malva é cultivada apenas para a obtenção de fibra, e as sementes são oriundas de processo extrativista. Esse cenário tende a mudar, pois esta espécie apresenta relevante importância socioeconômica, principalmente para o Estado do Amazonas. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência de fungos endofíticos em Urena lobata, avaliando a influência do órgão vegetal e local de cultivo, visto a interação endófito-hospedeiro poder ser benéfica ou tornar-se maléfica para a planta. Foram calculados a frequência e grau de colonização, índices de diversidade de Shannon-Weaver, Simpson, e uniformidade de Pielou e realizada a curva do componente dominância. Os gêneros encontrados foram: Phomopsis, Colletotrichum, Fusarium, Pestalotiopsis, Curvularia e Cochliobolus. A maior diversidade e riqueza de fungos foi encontrada em Manaus com elevada colonização presente nas folhas. Observou-se preferência dos gêneros: Curvularia e Fusarium à semente e Colletotrichum em folha. A similaridade foi maior entre órgãos vegetais do que nos locais de cultivo, o que indica a coevolução desses fungos com o hospedeiro, resultado de uma interação mutualística ou antagônica equilibrada.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-20Bitstream added on 2014-06-13T19:00:05Z : No. of bitstreams: 1 medeiros_jb_me_araiq.pdf: 3851893 bytes, checksum: ca39fa9d9a3d6332fa80515bbbc4edf6 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A área de biocatálise está em franco desenvolvimento e fungos associados a espécies vegetais dos biomas brasileiros são biocatalisadores em potencial, praticamente inexplorados. Nesse contexto, o presente trabalho descreve a avaliação do potencial biocatalítico de 7 fungos endófitos isolados de espécies vegetais do Cerrado. Foi avaliada a capacidade dos micro-organismos Nigrospora sphaerica, Schizophyllum commune, Phomopsis sp., Tricoderma viridae, Aspergillus versicolor, Xylaria sp. e Phomopsis stipata biotransformarem ou biodegradarem os substratos ácido gálico e cassina. O estudo de tolerância dos micro-organismos aos substratos permitiu selecionar as concentrações nas quais o ácido gálico (1,0 g L-1) e a cassina (0,5 g L-1) foram adicionados ao meio reacional na etapa de biotransformação/biodegradação. Todos os micro-organismos estudados se mostraram capazes de biotransformar o substrato ácido gálico. Os 26 produtos biotransformados são mais apolares que o composto de partida e foram encontrados na fase aquosa ou no micélio microbiano. Em relação à cassina, os endófitos Schizophyllum commune, Tricoderma viridae e Xylaria sp. não a metabolizaram, mesmo após 14 dias de incubação.Os endófitos Nigrospora sphaerica e Aspergillus versicolor a biodegradaram, enquanto que Phomopsis stipata e Phomopsis sp. a biotransformaram em 6 e 3 novos compostos, respectivamente. Os produtos de biotransformação do ácido gálico e da cassina terão suas estruturas determinadas em trabalhos futuros, e a partir desses dados poderemos inferir as reações que os fungos são capazes de realizar, e consequentemente sugerir as atividades enzimáticas presentes nos fungos endófitos estudados
The area of biocatalysis is developing fast and fungi associated with plant species of Brazilian biomes are potential biocatalysts, virtually unexplored. In this context, this work describes the evaluation of biocatalytic potential of seven fungal endophytes isolated from species of the Cerrado. We evaluated the ability of the micro-organisms Nigrospora sphaerica, Schizophyllum commune, Phomopsis sp., Tricoderma viridae, Aspergillus versicolor, Xylaria sp. and Phomopsis stipata to biotransform or biodegrade the substrates gallic acid and cassine. The study of microorganisms tolerance to the substrate allowed to select the concentrations in which the gallic acid (1.0 g L-1) and cassine (0.5 g L-1) were added to the reaction medium in step biotransformation/ biodegradation. All microorganisms studied are quite capable of biotransform substrate gallic acid. The 26 biotransformed products are less polar than the starting compound and were found in the aqueous phase or microbial mycelium. In relation to the cassine, the endophytes Schizophyllum commune, Tricoderma viridae and Xylaria sp. didn´t metabolize it, even after 14 days of incubation. Endophytes Nigrospora sphaerica and Aspergillus versicolor biodegraded the cassine, while Phomopsis stipata and Phomopsis sp. biotransformed this substrat in six and three new compounds, respectively. The biotransformation products of gallic acid and cassine will have their structures determined in future studies, allowing to infer which biotransformations occurred, and therefore suggest which the enzyme activities are found in the fungal endophyte studied

Resumo: A área de biocatálise está em franco desenvolvimento e fungos associados a espécies vegetais dos biomas brasileiros são biocatalisadores em potencial, praticamente inexplorados. Nesse contexto, o presente trabalho descreve a avaliação do potencial biocatalítico de 7 fungos endófitos isolados de espécies vegetais do Cerrado. Foi avaliada a capacidade dos micro-organismos Nigrospora sphaerica, Schizophyllum commune, Phomopsis sp., Tricoderma viridae, Aspergillus versicolor, Xylaria sp. e Phomopsis stipata biotransformarem ou biodegradarem os substratos ácido gálico e cassina. O estudo de tolerância dos micro-organismos aos substratos permitiu selecionar as concentrações nas quais o ácido gálico (1,0 g L-1) e a cassina (0,5 g L-1) foram adicionados ao meio reacional na etapa de biotransformação/biodegradação. Todos os micro-organismos estudados se mostraram capazes de biotransformar o substrato ácido gálico. Os 26 produtos biotransformados são mais apolares que o composto de partida e foram encontrados na fase aquosa ou no micélio microbiano. Em relação à cassina, os endófitos Schizophyllum commune, Tricoderma viridae e Xylaria sp. não a metabolizaram, mesmo após 14 dias de incubação.Os endófitos Nigrospora sphaerica e Aspergillus versicolor a biodegradaram, enquanto que Phomopsis stipata e Phomopsis sp. a biotransformaram em 6 e 3 novos compostos, respectivamente. Os produtos de biotransformação do ácido gálico e da cassina terão suas estruturas determinadas em trabalhos futuros, e a partir desses dados poderemos inferir as reações que os fungos são capazes de realizar, e consequentemente sugerir as atividades enzimáticas presentes nos fungos endófitos estudados
Abstract: The area of biocatalysis is developing fast and fungi associated with plant species of Brazilian biomes are potential biocatalysts, virtually unexplored. In this context, this work describes the evaluation of biocatalytic potential of seven fungal endophytes isolated from species of the Cerrado. We evaluated the ability of the micro-organisms Nigrospora sphaerica, Schizophyllum commune, Phomopsis sp., Tricoderma viridae, Aspergillus versicolor, Xylaria sp. and Phomopsis stipata to biotransform or biodegrade the substrates gallic acid and cassine. The study of microorganisms tolerance to the substrate allowed to select the concentrations in which the gallic acid (1.0 g L-1) and cassine (0.5 g L-1) were added to the reaction medium in step biotransformation/ biodegradation. All microorganisms studied are quite capable of biotransform substrate gallic acid. The 26 biotransformed products are less polar than the starting compound and were found in the aqueous phase or microbial mycelium. In relation to the cassine, the endophytes Schizophyllum commune, Tricoderma viridae and Xylaria sp. didn't metabolize it, even after 14 days of incubation. Endophytes Nigrospora sphaerica and Aspergillus versicolor biodegraded the cassine, while Phomopsis stipata and Phomopsis sp. biotransformed this substrat in six and three new compounds, respectively. The biotransformation products of gallic acid and cassine will have their structures determined in future studies, allowing to infer which biotransformations occurred, and therefore suggest which the enzyme activities are found in the fungal endophyte studied
Orientador: Angela Regina Araujo
Coorientador: Lucimar Pinheiro Rosseto
Banca: Daniela Alonso Bocchini Martins
Banca: Edson Rodrigues Filho
Mestre

Secondary metabolites production by fungal endophytes was investigated in two sets of experiments. In the first one, a collection of 56 strains belonging to two morphologically similar genera, Phomopsis and Cytospora, was cultivated and submitted to micro-scale extraction of metabolites followed by metabolite profiling using HPLC-DAD and LC-MS. Detected metabolites were defined by their retention index and UV spectra, and the profiles obtained were used to classify the fungal strains in chemotypes. High resolution mass spectrometry data were used for dereplication of the major metabolites characteristic of each chemotype. Thirty eight strains were grouped in five distinct chemotypes; five strains produced unique metabolite profiles and were not classified in chemotypes. Thirteen fungi did not produced detectable amounts of metabolites. The strain Cytospora sp. fel 302, from chemotype 5, was cultivated in larger scale and its crude extract was chromatographed followed by the purification of the major metabolites. Fourteen metabolites were purified, including the known compounds cytosporones B, C, D, E, dothiorelones A, B, C, H, and new compounds cytosporones O, P and Q. Three metabolites were not fully identified and received the trivial names yellow 1, yellow 2 and red. Multivariate statistical analysis of classification was performed with data derived from the metabolite profiling, and the results confirmed the classification of the investigated strains into five chemotypes. In a second group of experiments, the crude extracts of a collection of 36 fungal endophytes belonging to different species were screened for bioactivity against chronic lymphocytic leukemia cells. Twenty one extracts were toxic to leukemia cells in minimum inhibitory concentrations ranging from 50 to 6.25 mg/200 mL of cell suspension. The extract of strain Libertella sp. cml 1671 inhibited leukemia cells in a concentration of 24.4 ng/200 mL. This fungus was cultivated in larger scale and part of the crude extract was micro-fractionated by semipreparative HPLC. Ninety six fractions (1.25 mL each) were collected and submitted to cytotoxicity bioassays against leukemia cells, and fraction number 54 was detected as the most active one. LC-MS followed by metabolite dereplication identified one major compound in fraction 54, and its calculated molecular formula corresponded to those of the cytochalasins scoparasin A and phenochalasin B. The remaining extract was chromatographed and three metabolites containing the same molecular formula as the major compound of the bioactive fraction 54 were purified: scoparasin A, phenochalasin B, and the D6,12 isomer of scoparasin A. Further bioassays will be conducted to identify which compounds are responsible for the cytotoxic effect against leukemia cells.
A produção de metabólitos secundários por fungos endófitos de diferentes plantas foi investigada em dois conjuntos de experimentos. No primeiro, 56 fungos pertencentes aos gêneros morfologicamente semelhantes Phomopsis e Cytospora foram submetidos ao cultivo e extração dos metabólitos em micro-escala, seguida do perfilamento dos extratos por CLAE-DAD e CLAE-DAD-EM. Os metabólitos detectados foram caracterizados pelos respectivos índices de retenção e espectros de absorção na região do UV e os perfis obtidos foram usados para a classificação dos fungos em quimiotipos. Os dados de espectrometria de massas de alta resolução foram usados na desreplicação dos metabólitos majoritários característicos de cada quimiotipo definido. Trinta e sete fungos foram agrupados em cinco quimiotipos distintos, cinco exibiram perfis únicos e não foram agrupados em quimiotipos. Quatorze fungos não produziram quantidades detectáveis de metabólitos em seus extratos. O fungo Cytospora sp. fel 302, representante do quimiotipo 5, foi cultivado em maior escala e seu extrato submetido ao fracionamento cromatográfico visando à purificação de seus metabólitos secundários majoritários. No total quatorze metabólitos foram isolados, dentre os quais as citosporonas B, C, D, E, dotiorelonas A, B, C, H, e os metabólitos inéditos citosporonas O, P e Q. Três metabólitos coloridos não puderam ser identificados e foram denominados de amarelos 1 e 2 e vermelho. A análise multivariada de classificação, realizada com os dados obtidos durante o perfilamento dos extratos, confirmou a classificação dos fungos em cinco quimiotipos. Em um segundo conjunto de experimentos, os extratos brutos de uma coleção de 36 fungos endófitos, pertencentes a diferentes espécies, foram submetidos a uma triagem por meio de bioensaios de citotoxidade contra células de leucemia linfóide crônica. Vinte e um extratos foram tóxicos às células leucêmicas em concentrações inibitórias mínimas variando de 50 a 6,25 mg/200 mL de suspensão de células. O extrato do fungo Libertella sp. cml 1671 foi capaz de inibir as células leucêmicas em uma concentração de 24,4 ng/200 mL. O fungo Libertella sp. cml 1671 foi cultivado em maior escala e parte do extrato foi submetido ao microfracionamento por CLAE semipreparativa. As frações foram re-submetidas aos bioensaios de citotoxidade contra células de leucemia e aquela de número 54 mostrou-se a mais ativa. A análise por CLAE-DADEM, e posterior desreplicação, da fração 54 indicou a presença de um metabólito majoritário, cuja fórmula molecular calculada correspondeu a duas citocalasinas isoméricas, escoparasina A e fenocalasina B. O restante do extrato bruto do fungo Libertella sp. cml 1671 foi submetido ao fracionamento cromatográfico e três substâncias, contendo a mesma fórmula molecular do metabólito majoritário da fração bioativa 54, foram purificadas e identificadas: escoparasina A, fenocalasina B e o isômero D6,12 da escoparasina A. Novos bioensaios serão realizados para determinação de quais dos metabólitos isolados são os responsáveis pela citotoxidade contra células de leucemia linfóide crônica.

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eliandra de Freitas Sia.pdf: 1557550 bytes, checksum: e4d21c384795b53b83656a535e1bf31f (MD5) Previous issue date: 2012-09-04
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
The filamentous fungi are an important group of microorganisms, being not only one of the most numerous among the microorganisms due to their potential in biotechnological processes such as the production of antibiotics, enzymes, vitamins and others. The fungi are also plant, animals and human pathogens, acting sometimes as toxins producers. The fungal growth is a routine practice at microbiological laboratories and the Potato Dextrose Agar (PDA) medium is the most used medium due to be a rich source of starch. However, in some regions of Brazil, the potato production has a quite high cost. For this reason the aiming of the present work was the search for new alternative sources of starch. Thus, initially several tubercles: cassava (Manihot esculenta), sweet potato (Ipomoea batatas), carrot (Daucus carota), ginger (Zingiber officinale) and yam (Dioscorea alata) were tested as a starch source to fungal growth. The cassava (Manihot esculenta) showed the best results to fungal growth. This species is a tropical plant with a great commercial importance to Brazil, Africa and other parts of the world. In brazilian north and northeast regions, the cassava is hugely cultivated by a low cost. After the first screening, it was optimized the utilization of Cassava Dextrose Agar (CDA) media. Many fungal species of biotecnological importance (Beauveria bassiana, Aspergillus niger, Penicillium sp., Fusarium sp., Phanerochaete chrysosporium) were evaluated to growth, development sporulation and hyphal formation. The BDA media was used as a control. The present results demonstrated a high efficiency of MDA to fungal growth. However, in MDA was observed a reduction of fungal sporulation comparing with BDA. Finally, both media BDA and MDA, were used to the endophytic fungal isolation from: guarana (Paullinia cupana) and olives (Olea europea). The fungal identification demonstrated that isolates varied according to host plant. The fungal diversity was higher in guaraná being higher using the MDA in comparison with the BDA media. To both media, it was obtained a low number of isolated fungi from O. europea. The present results clearly demonstrated that the cassava is an feasible important starch source, being a potential alternative media, mainly in tropical countries
Os fungos filamentosos são um importante grupo de micro-organismos, não apenas por serem os mais numerosos dentre todos os micro-organismos, mas devido ao seu potencial em processos biotecnológicos como a produção de antibióticos e enzimas, fontes de vitaminas, alimentação e outros. Os fungos também são conhecidos como patógenos de plantas, animais e humanos, e produtores de toxinas. Cultivar fungos é uma rotina em laboratórios de microbiologia e um dos meios muito utilizado é o Batata Dextrose Ágar (BDA), que utiliza a batata como uma fonte rica em amido. Em algumas regiões do país, como a Região Norte, a batata tem um elevado custo e por este motivo a busca por novas fontes de amido é uma alternativa. Assim, outros vegetais devem ser pesquisados visando a substituição da batata. No presente trabalho foram inicialmente utilizados mandioca (Manihot esculenta), batata-doce (Ipomoea batatas), cenoura (Daucus carota), gengibre (Zingiber officinale) e cará (Dioscorea alata), sendo demonstrado que a mandioca (Manihot esculenta) é uma alternativa relevante para o cultivo de fungos. Esta espécie vegetal é uma planta tropical de grande importância comercial no Brasil, na África e em outras regiões do mundo, sendo que para a região Norte a mandioca é muito cultivada e também de baixo custo. Assim, após a triagem inicial com outros tubérculos, foi realizada a avaliação e otimização do meio de cultura de Mandioca Dextrose Ágar (MDA). Para o ensaio do meio com mandioca foram utilizadas diversas espécies de fungos com importância biotecnológica (Beauveria bassiana, Aspergillus niger, Penicillium sp., Fusarium sp., Phanerochaete chrysosporium). Foi avaliada a taxa de crescimento, a esporulação e a formação de hifas no meio de cultura BDA (utilizado como controle) e MDA. Os resultados comprovaram a eficiência do MDA para o crescimento dos fungos analisados, destacando-se a taxa de crescimento radial em meio sólido e peso seco do micélio em meio líquido. Entretanto, em MDA há uma menor esporulação dos fungos quando comparado ao BDA. Finalmente, foi realizado, utilizando meio BDA e MDA, o isolamento de fungos endofíticos de duas plantas: guaraná (Paullinia cupana) e oliveira (Olea europea), nos quais o meio de cultura MDA também se mostrou eficiente. A identificação de fungos endofíticos revelou que eles variaram conforme a planta hospedeira. A diversidade de fungos endofíticos foi maior em guaraná no meio MDA que em BDA, e o número de isolados foi menor em oliveira nos dois meios utilizados. Assim, do ponto de vista econômico e social, o substrato de mandioca pode ser considerado uma alternativa de alta potencialidade na obtenção de meios de cultura para laboratórios de micologia, especialmente em países tropicais

Os fungos endofíticos têm sido cada vez mais pesquisados como fonte de moléculas bioativas. Neste trabalho, foram isolados fungos endofíticos de uma árvore produtora de compostos medicinais, Handroanthus impetiginosus, com o objetivo de verificar se produziam metabólitos com atividade biológica e de identificar as espécies fornecedoras de princípios bioativos. Todas as 148 cepas isoladas foram triadas segundo a atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus ATCC 6538, Candida albicans ATCC 10231 e Escherichia coli ATCC 25922 pelo método do ágar em bloco. Dentre essas, cinco fungos foram submetidos a fermentação em pequena escala, em caldo Czapek, durante 15 dias, a 28°C, tanto sob agitação quanto em modo estático. Ao final desse período, as culturas foram filtradas e submetidas a extração líquido-líquido. Os extratos obtidos foram avaliados quanto à capacidade de inibir o crescimento dos micro-organismos patogênicos citados anteriormente, por teste de difusão em ágar e determinação da concentração inibitória mínima (CIM). As menores faixas de CIM observadas foram 125-250 μg.mL-¹, de Alternaria alternata, e 250-500 μg.mL-¹, de Lasiodiplodia sp. Também avaliou-se o efeito sobre a viabilidade de linhagens celulares derivadas de câncer humano de mama (MCF-7), fígado (HepG2) e pulmão (A549). Os extratos de A. alternata e de Lasiodiplodia sp. reduziram a menos que 10% a viabilidade das células tumorais MCF-7 e HepG2. O primeiro também reduziu a menos que 5% a viabilidade de células A549. Por isso, tais fungos endofíticos foram submetidos a fermentação submersa em maior escala. O extrato de Alternaria alternata e algumas de suas frações reduziram expressivamente a viabilidade das três linhagens celulares testadas. Dentre tais frações, a F3 se destacou por apresentar menores valores de IC50 para MCF-7 e HepG2 (10,28±5,22 e 9,75±1,31 μg.mL-¹, respectivamente) do que o fármaco cisplatina (21,12±1,56 e 27,15±1,73 μg.ml-¹, respectivamente). O fracionamento dos extratos por cromatografia em coluna e cromatografia líquida de alta eficiência permitiram o isolamento de dois compostos, provenientes de A. alternata, e de um produzido por Lasiodiplodia sp. Tais amostras foram analisadas por ressonância magnética nuclear, e foi identificado o composto 4-hidróxi-benzaldeído no extrato de A. alternata. Ficou comprovado que os extratos de fermentação de fungos endofíticos isolados de H. impetiginosus exerceram importante atividade biológica, reduzindo a viabilidade de células derivadas de câncer de mama, fígado e pulmão.
Endophytic fungi have been prospected as source of active metabolites. In this work, endophytic fungi had been isolated from a tree that produces medicinal compounds, Handroanthus impetiginosus, in order to check if they produce biological active metabolites and to identify the biologically active species. All the 148 strains isolated were screened by agar piece method to investigate their antibiotic activity against Staphylococcus aureus ATCC 6538, Candida albicans ATCC 10231 e Escherichia coli ATCC 25922 . Among them, five endophytic fungi were fermented on small scale. The fermentation was performed in a Czapek broth, for 15 days, 28oC, under either stirring or static conditions. After this period, the cultures were filtered and subjected to liquid-liquid extraction. The obtained extracts were tested against the microorganisms mentioned above and the cancer cells MCF-7, HepG2 and A549. The lowest minimum inhibitory concentrations (MIC) exhibited were 125-250 μg.mL-¹ (from Alternaria alternata) and 250-500 μg.mL-¹ (from Lasiodiplodia sp.) both against S. aureus . Two extracts appreciably reduced tumor cells viability and, therefore, these endophytic fungi were fermented on large scale. The extract from A. alternata significantly reduced the viability of all three cell lines tested to less than 10% and its chemical study was biomonitored. One of its fractions, F3, exhibited lower IC50 against MCF-7 and HepG2 (10.28±5.22 and 9.75±1.31 μg.mL-¹, respectively) than cisplatin, a pharmaceutical compound commercially available (21.12±1.56 and 27.15±1.73 μg.mL-¹, respectively). The extract from Lasiodiplodia sp. diminished the viability of MCF-7 and HepG2 cells to less than 10%. The partitioning of the extracts by column chromatography and high performance liquid chromatography provided two isolated compounds from A. alternata and one from Lasiodiplodia sp. The samples were analyzed by nuclear magnetic resonance technique and the compound 4-hydroxybenzaldehyde was identified for A. alternata extract. The fermentation extracts of endophytic fungi from H. impetiginosus exhibited relevant biologic activity reducing the viability of cells derived from breast, liver and lung cancer.
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Atualmente, fungos endófitos são alvos de estudo para descoberta de substâncias bioativas com interesse na agricultura, no controle de pragas, na descoberta de novos ativos para uso na terapêutica, entre outros. Assim como toda planta, o Theobroma cacao L. serve de habitat para diversos fungos endófitos que vivem no interior dos tecidos das plantas numa relação de simbiose, mutualismo ou parasitária. No total de 37 linhagens de fungos endófitos isolados do Theobroma cacao L. foram cultivados in vitro e seus extratos brutos foram analisados, sendo que um fungo foi selecionado para investigação das atividades antimicrobiana, antioxidante e antiproliferativa. O fungo endófito Microsphaeropsis sp. CML 1765 apresentou um crescimento e estabilidade satisfatória além de boa atividade antimicrobiana contra S. aureus. Os resultados da concentração inibitória mínima (CIM) do extrato da fermentação de Microsphaeropsis sp ficou entre 62,5 e 125 µg/mL. A análise em CG/EM identificou a composição química do extrato de Microsphaeropsis sp mostrando ser, essencialmente, constituído de ácidos graxos e esteróides. A atividade antioxidante foi determinada através do teste de DPPH e não foi expressiva, possivelmente por não conter compostos fenólicos em sua composição química. A atividade antiproliferativa foi testada frente a nove linhagens de células tumorais e o extrato de Microsphaeropsis sp apresentou seletividade contra células de melanoma (UACC-62) atingindo o TGI (inibição total do crescimento), na concentração de 4 µg/mL. Todas as linhagens atingiram o GI50 (atividade citostática) e LC50 (atividade citocida) nas concentrações de 25 µg/mL e 250 µg/mL, respectivamente. A biodiversidade da natureza abre caminhos para muitos estudos sobre fungos endófitos que são fontes naturais pouco exploradas de metabólitos bioativos, com potencial terapêutico desconhecido.
Nowadays, there is an increasing interest in endophytics fungi research as a source oh bioactive substances that could be applied in agriculture for pest control, and even for the discovery of new drugs. Like any plant, Theobroma cacao L. serves as habitat for diverse fungal endophytes that live within plant tissues in a symbiotic, mutualistic or parasitic. A total of 37 strains of fungal endophytes isolated in Theobroma cacao L. were cultured in vitro and their extracts were analyzed, and a fungus was selected for investigation of the antimicrobial, antioxidant and antiproliferative activities. The fungus endophyte Microsphaeropsis sp. CML 1765 presented a satisfactory growth and stability in addition to good antimicrobial activity against S. aureus. The results of minimum inhibitory concentration (MIC) of the extract from fermented Microsphaeropsis sp were between 62.5 and 125 µg/mL. The chemical composition analysis of the extracts was carried by CG/MS and allowed the identification of fatty acids and steroids as main components. The antioxidant activity was determined using the DPPH test and was not significant, possibly because it contains phenolic compounds in their chemical composition. The antiproliferative activity was tested against nine cancer cell lines and extract Microsphaeropsis sp. showed selectivity against melanoma cells (UACC-62) reaching the TGI (total growth inhibition) at a concentration of 4 µg/mL. The extracts was cytostatic and cytocide for all cell lines at concentration of 25 µg/mL and 250 µg/mL, respectively. The diversity of nature opens the way for studies on fungal endophytes that are natural sources of unexplored bioactive metabolites with therapeutic potential unknown.

Diversos estudos evidenciam dezenas de espécies de fungos de diferentes gêneros nas colônias de formigas-cortadeiras. No entanto, a procedência desses microrganismos ainda é incerta. Alguns desses podem ser endofíticos oriundos do material vegetal transportado para o ninho. Assim sendo, determinados fungos endofíticos possuem a capacidade de contaminar a colônia das cortadeiras ou influenciar no seu microbioma simbiótico. Com isso, os endófitos fúngicos têm potencial no controle de formigas-cortadeiras como parceiros mutualistas das plantas. Esse sistema simbiótico pode se tornar uma estratégia no manejo dessa importante praga dentro do ecossistema florestal. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de colonização endofítica de mudas de Eucalyptus urophylla pelos fungos Escovopsis sp., Metarhizium anisopliae e Trichoderma strigosellum, e analisar, por meio da avaliação de características biométricas, a influência da inoculação desses microrganismos sobre o desenvolvimento das plantas. O delineamento adotado foi o inteiramente casualizado, usandose o esquema fatorial 4 x 3, com 15 repetições, sendo cada parcela constituída por uma muda. Os fatores foram: três espécies de fungos (Escovopsis sp., M. anisopliae, T. strigosellum) mais um controle e três métodos de inoculação (inoculação via foliar, inoculação via solo e inoculação via plântula). Para avaliação da colonização endofítica, utilizaram-se dez mudas, sendo cinco destinadas para avaliação das características biométricas. No método de inoculação via plântula, o fungo T. strigosellum foi isolado apenas nas raízes. Contudo, no método de inoculação via solo, além das raízes, esse fungo colonizou também o caule. As plantas de E. urophylla não foram colonizadas endofiticamente quando inoculadas pelo método de inoculação via foliar. As plantas inoculadas com o fungo T. strigosellum, pelo método de inoculação via plântula, apresentaram maiores valores nas características altura de plantas, número de folhas, massa seca da parte aérea e massa seca total quando comparado com os outros métodos de inoculação. Houve incremento também, por esse método, para a variável altura de plantas, quando comparadas às plantas controle e às inoculadas pelos fungos Escovopsis sp. e M. anisopliae. Dentre os fungos estudados, o isolado T. strigosellum colonizou endofiticamente o E. urophylla e influenciou positivamente no seu desenvolvimento, quando inoculado via plântula.
Several studies evidenced dozens of fungus species of different genera in the colonies of leafcutting ants. However, the origin of these microorganisms is still uncertain. Some of these may be endophytes from plant material transported to the nest. Thus, certain endophytic fungi have the ability to contaminate the leaf-cutting ant colony or influence its symbiotic microbiome. Thus, fungal endophytes have the potential to control leaf-cutting ants as mutual plant partners. This symbiotic system could become a strategy in the management of this important forest pest. The objective of this work was to evaluate the potential of endophytic colonization of Eucalyptus urophylla plants by fungi Escovopsis sp., Metarhizium anisopliae e Trichoderma strigosellum, and to analyze, by means of the evaluation of biometric characteristics, the influence of the inoculation of these microorganisms on the plant development. Experimental design was completely randomized, using the factorial scheme 4 x 3, with 15 replicates, each plot consisting of one plant. The factors were: three fungi species (Escovopsis sp., M. anisopliae, T. strigosellum) plus one control and three methods of inoculation (foliar inoculation, inoculation via soil and seedling inoculation). For the evaluation of endophytic colonization, ten plants were used; five of them were destined to evaluate the biometric characteristics. In the seedling inoculation method, the T. strigosellum fungus was isolated only in the roots. However, in the soil inoculation method, besides the roots, this fungus also colonized the stem. E. urophylla plants were not colonized endophiatically when inoculated by foliar inoculation method. The plants inoculated with T. strigosellum by the seedling inoculation method had higher values in the characteristics of plant height, number of leaves, root dry mass and total dry mass when compared to the other inoculation methods. There was also an increase, by this method, for the plant height variable, when compared to the control plants and those inoculated by the fungi Escovopsis sp. and M. anisopliae. Among the fungi studied, the isolate T. strigosellum endofitically colonized E. urophylla and positively influenced its development when inoculated via seedling.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
A source of great biotechnological potential for the production of enzymes are endophytic microorganisms. These microorganisms are capable of producing a wide variety of enzymes, among them phytase, which is responsible for phytate hydrolysis. The objective of this work was to evaluate the potential of endophytic fungi of the mangroves of the state of São Paulo for phytase production. Initially, a qualitative selection of 33 isolates with PSM (Phytase Screening Medium) and a second quantitative selection was carried out, in which the preselected fungi were submitted to solid state fermentation (SSF) for phytase production. Among the isolates evaluated, the fungus Aspergillus awamori 9(4) was selected, which presented phytase activity of 43.98 U/100g when submitted to SSF culture for 72 h with soybean meal as substrate. In order to improve phytase production, the use of wheat bran as substrate was evaluated, reaching an activity of 82.77 U/100g, under the same conditions of cultivation. The use of KH2PO4 as an inducer in phytase production and the use of dialysis for the removal of interfering ions from the crude extract in phytase activity were also evaluated. For the experiments performed without the inducer, the dialysis of the extract resulted in activities of 85.42 U/100g with soybean meal and 55.44 U/100g with wheat bran. For the experiments of cultivation with the inductor and then dialysed resulted in activities of 132.35 U/100g with soybean meal and 115.52 U/100g with wheat bran, indicating that the effect of the inducer is positive in the production of Phytase and that dialysis is important for enzyme activity. These results indicate that the endophytic fungus of the mangrove of the State of São Paulo is promising for the production of phytase enzyme, being unpublished the use of endophytic micro-organisms for the production of this enzyme.
Uma fonte de grande potencial biotecnológico para a produção de enzimas são os microrganismos endofíticos. Estes microrganismos são capazes de produzir grande variedade de enzimas, dentre elas a fitase, que é responsável pela hidrólise do fitato. O objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de fungos endofíticos dos manguezais do estado de São Paulo para a produção de fitase. Inicialmente foi realizada uma seleção qualitativa de 33 isolados com meio diferencial PSM (Phytase Screening Medium), e uma segunda seleção quantitativa, em que os fungos pré-selecionados foram submetidos à fermentação em estado sólido (FES) para produção de fitase. Dentre os isolados avaliados, selecionou-se o fungo Aspergillus awamori 9(4), tendo este apresentado atividade de fitase de 43,98 U/100g quando submetido a cultivo FES por 72 h com farelo de soja como substrato. A fim de melhorar a produção de fitase, avaliou-se o uso de farelo de trigo como substrato, atingindo assim atividade de 82,77 U/100g, sob as mesmas condições de cultivo. Avaliou-se também o uso de KH2PO4 como indutor na produção de fitase e o uso de diálise para a remoção de íons interferentes do extrato bruto na atividade de fitase. Para os experimentos realizados sem o indutor, a diálise do extrato resultou em atividades de 85,42 U/100g com farelo de soja e 55,44 U/100g com farelo de trigo. Já para os experimentos de cultivo com o indutor e em seguida dialisados resultaram em atividades de 132,35 U/100g com farelo de soja e 115,52 U/100g com farelo de trigo, indicando que o efeito do indutor é positivo na produção de fitases e que a diálise é importante para a atividade enzimática. Esses resultados indicam que o fungo endofítico do manguezal do Estado de São Paulo é promissor para a produção da enzima fitase, sendo inédito o uso de micro-organismos endofíticos para a produção desta enzima.

Mestrado em Biologia Funcional - Instituto Superior de Agronomia / UL
Avaliou-se uma coleção de endófitos de videira do género Epicoccum (Epic 1 a 16), com o objetivo de determinar a respetiva composição específica e avaliar a sua atividade antimicrobiana contra fungos do lenho de videira. Com base em características culturais e moleculares, todos os isolados foram agrupados em Epicoccum nigrum, que revelou ser um complexo de espécies. A coleção foi testada contra “Botryosphaeria” sp., um fungo do lenho de crescimento rápido, tendo o isolado Epic 2 surgido no grupo dos que revelaram maior atividade antagonista (α = 0,05). Epic 2 inibiu também significativamente o crescimento micelial dos fungos causadores do "complexo da esca", Phaeomoniella chlamydospora (45,8%), Fomitiporia mediterranea (42,7%) e, em menor grau, Phaeoacremonium aleophilum (18,8%). Adicionalmente, avaliaram-se interações entre os fungos causadores da doença de Petri/“complexo da esca” e do pé negro da videira, Ilyonectria liriodendri e Dactylonectria macrodidyma, tendo os últimos sido significativamente favorecidos por Pa. chlamydospora e Pm. aleophilum. Por sua vez, o fungo F. mediterranea, inicialmente favorecido por Pa. chlamydospora e Pm. aleophilum, foi posteriormente inibido por Pm. aleophilum, mas não por Pa. chlamydospora. Discute-se a relação complexa entre fungos causadores do “complexo da esca”, bem como o potencial apresentado por Epic 2 como antagonista
N/A

The search for new substances of pharmaceutical interest in the area or even in the most diverse agricultural industry uses, has led researchers to seek alternatives before not properly explored. One such alternative would be to isolate the microorganisms that inhabit plant asymptomatically to produce new substances, studies have shown that these microorganisms, called endophytes, through the coevolution of host plants, has given them many benefits such as protection and resistance pest attack. In parallel, it is seen that many compounds produced by host plants, can also be produced by these microorganisms, and thus its industrial production could be facilitated. This study aimed to isolate and identify fungal endophytes from two species A. cochliocarpos and D. ecsatophyllum popularly known as barbatimão and rabo – de- bugio, respectively, and to examine its antagonism between fungi isolated and the antioxidant activity are also the focus of this work. Endophytic fungi were isolated from six. Of these, five were identified as two of the genus Phomopsis fungi, a fungus of the genus Guignardia and one identified as being of order Pleosporales, the fungus was identified as the fifth genus Nigrospora. One of the fungus could not be identified by the technique used and was called DeF2. The fungi grew better when kept in dark on PDA growth medium and BSA in the laboratory. As antagonists, we observed that the isolates coming from the host D. ecstophyllum were the most efficient and that one gender may have different behaviors depending on the host that originated. From experiments with mycelia of these fungi were obtained organic extrados of different polarities, and the analysis of the antioxidant activity of these extracts showed that the fungus Phomopsis sp. isolated from D. ecastophyllum presented extracts with antioxidant activity than those of other fungi analyzed.
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Alagoas
A procura de novas substâncias de interesse na área farmacêutica ou mesmo agroindústria nos mais variados usos, tem levado os pesquisadores a buscar alternativas antes não devidamente exploradas. Uma dessas alternativas seria o isolamento de microrganismos que habitam vegetais de forma assintomática para a produção novas substâncias, estudos tem demonstrado que estes microrganismos, chamados de endofíticos, através da coevolução em suas plantas hospedeiras, tem conferido a elas diversos benefícios como proteção e resistência ao ataque de pragas. Paralelamente, é visto que muitos compostos produzidos pelas plantas hospedeiras, também podem ser produzidos por esses microrganismos, e com isso a sua produção industrial poderia ser facilitada. Este trabalho teve como objetivo isolar e identificar fungos endofíticos de duas espécies vegetais a A. cochliocarpos e a D. ecastophyllum conhecidas popularmente como barbatimão e rabo-de-bugio, respectivamente, bem como analisar suas inter-relações entre os fungos isolados e a atividade antioxidante também são objetivos deste trabalho. Foram isolados seis fungos endofíticos. Destes, cinco foram identificados como sendo dois fungos do gênero Phomopsis, um fungo do gênero Guignardia e um identificado como sendo da ordem Pleosporales, o quinto fungo identificado foi do gênero Nigrospora. Um dos fungos não pôde ser identificado pela técnica utilizada e foi chamado de DeF2. Os fungos tiveram crescimento superior quando mantidos em ambiente escuro e em meio de cultura BDA e BSA em laboratório. Como antagonistas, foi possível observar que os isolados provindos do hospedeiro D. ecstophyllum foram os mais eficientes e que um mesmo gênero pode apresentar comportamentos diferenciados dependendo do hospedeiro que foi originado. A partir de experimentos realizados com micélios destes fungos foi possível obter extrados orgânicos de diferentes polaridades e, a análise da atividade antioxidante destes extratos, mostrou que o fungo Phomopsis sp. isolado de D. ecastophyllum apresentou extratos com atividade antioxidante superior aos de outros fungos analisados.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-06-22Bitstream added on 2014-06-13T20:19:04Z : No. of bitstreams: 1 somensi_a_me_araiq_parcial.pdf: 755004 bytes, checksum: e4cb6a8a7eb9151e858628e8b3911a51 (MD5)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Uma fonte de novas substâncias potencialmente bioativas e úteis como fármacos são os produtos naturais, principalmente os metabólitos oriundos de plantas e microrganismos (fungos, bactérias, actinomicetos). Os fungos endofíticos são microrganismos que residem nos espaços intercelulares das plantas e estabelecem uma interação não-patogênica com a planta. Portanto, o estudo dos endófitos parece ser uma estratégia promissora na obtenção ou identificação e substâncias potencialmente bioativas. Phomopsis stipata isolado como endófito da espécie vegetal Styrax camporum foi cultivado em diferentes meios de cultivo para se avaliar a produção metabólica e a bioatividade dos extratos brutos obtidos. Com esta avaliação, realizada por RMN de 1H e CLAE-DAD, os meios MDB e Milho foram escolhidos para o cultivo de P. stipata em escala ampliada. O extrato bruto obtido em MDB foi fracionado utilizando técnicas cromatográficas adequadas fornecendo nove frações, sendo que as frações foram submetidas à desreplicação utilizando a técnica de simulação de espectro de RMN de 1H e 13C com o auxílio do software MestreNova®, e posteriormente a EM. Esta avaliação permitiu a identificação de cinco dicetopiperazinas, que são substâncias que apresentam inúmeras atividades biológicas: a Rel.ciclo (Pro-Val), Rel.ciclo (Pro-Leu), Rel.ciclo (Pro-Phe), Rel.ciclo (Pro-Ile) e Rel.ciclo (Pro-Tyr) e uma mistura de acilglicerídeos, evidenciando P. stipata como um potencial produtor de biocombustíveis. O fungo P. stipata também foi cultivado em escala ampliada em milho e o extrato bruto obtido foi fracionado utilizando técnicas cromatográficas apropriadas. Deste fracionamento foi obtido uma mistura de acilglicerídeos, que após analises por Cromatografia Gasosa de Alta Resolução a Altas Temperaturas (CGARAT) evidenciou a presença...
One source of new bioactive substances and potentially useful as drugs are the natural products, mainly, the metabolites from plants and microorganisms (fungi, bacteria, actinomycetes). Endophytes are microorganisms that reside in the intercellular spaces of plants and establish a non-pathogenic interaction with the plant. Therefore, the study of endophytes, seems to be a promising strategy for identifying or obtaining potentially bioactive substances. Phomopsis stipata isolated as endophytes of the plant Styrax camporum was cultivated in different culture medium to evaluate the metabolic production and bioactivity of crude extracts. In this evaluation, carried out by 1H NMR and HPLC-DAD, the culture medium of MDB and corn were chosen for the cultivation of P. stipata on a large scale. The obtained crude extract was fractionated using MDB suitable chromatographic techniques providing nine fractions, these fractions are subjected to dereplication using simulation technique of NMR spectra of 1H and 13C with software MestreNova ®, and then the MS. This evaluation allowed identification of five diketopiperazines, which are substances that have several biological activities: a Rel. cyclo (Pro-Val), Rel. cyclo (Pro-Leu), Rel. cyclo (Pro-Phe), Rel.ciclo (Pro-Ile) and Rel.ciclo (Pro-Tyr) and a mix of glycerides, showing P. stipata as a potential producer of biofuel. The fungi P. stipata was also cultivated on a large scale in corn and the crude extract obtained was fractionated using suitable chromatographic techniques. From this fractionation was obtained a mixture of glycerides, that after analysis by High Resolution Gas Chromatography at High Temperatures (HRGCHT) revealed the presence of monoglycerides. The results obtained... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Angela Regina Araujo
Banca: Sandra Imaculada Maintinguer
Banca: Luce Maria Brandão Torres
Resumo: Uma fonte de novas substâncias potencialmente bioativas e úteis como fármacos são os produtos naturais, principalmente os metabólitos oriundos de plantas e microrganismos (fungos, bactérias, actinomicetos). Os fungos endofíticos são microrganismos que residem nos espaços intercelulares das plantas e estabelecem uma interação não-patogênica com a planta. Portanto, o estudo dos endófitos parece ser uma estratégia promissora na obtenção ou identificação e substâncias potencialmente bioativas. Phomopsis stipata isolado como endófito da espécie vegetal Styrax camporum foi cultivado em diferentes meios de cultivo para se avaliar a produção metabólica e a bioatividade dos extratos brutos obtidos. Com esta avaliação, realizada por RMN de 1H e CLAE-DAD, os meios MDB e Milho foram escolhidos para o cultivo de P. stipata em escala ampliada. O extrato bruto obtido em MDB foi fracionado utilizando técnicas cromatográficas adequadas fornecendo nove frações, sendo que as frações foram submetidas à desreplicação utilizando a técnica de simulação de espectro de RMN de 1H e 13C com o auxílio do software MestreNova®, e posteriormente a EM. Esta avaliação permitiu a identificação de cinco dicetopiperazinas, que são substâncias que apresentam inúmeras atividades biológicas: a Rel.ciclo (Pro-Val), Rel.ciclo (Pro-Leu), Rel.ciclo (Pro-Phe), Rel.ciclo (Pro-Ile) e Rel.ciclo (Pro-Tyr) e uma mistura de acilglicerídeos, evidenciando P. stipata como um potencial produtor de biocombustíveis. O fungo P. stipata também foi cultivado em escala ampliada em milho e o extrato bruto obtido foi fracionado utilizando técnicas cromatográficas apropriadas. Deste fracionamento foi obtido uma mistura de acilglicerídeos, que após analises por Cromatografia Gasosa de Alta Resolução a Altas Temperaturas (CGARAT) evidenciou a presença... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Abstract: One source of new bioactive substances and potentially useful as drugs are the natural products, mainly, the metabolites from plants and microorganisms (fungi, bacteria, actinomycetes). Endophytes are microorganisms that reside in the intercellular spaces of plants and establish a non-pathogenic interaction with the plant. Therefore, the study of endophytes, seems to be a promising strategy for identifying or obtaining potentially bioactive substances. Phomopsis stipata isolated as endophytes of the plant Styrax camporum was cultivated in different culture medium to evaluate the metabolic production and bioactivity of crude extracts. In this evaluation, carried out by 1H NMR and HPLC-DAD, the culture medium of MDB and corn were chosen for the cultivation of P. stipata on a large scale. The obtained crude extract was fractionated using MDB suitable chromatographic techniques providing nine fractions, these fractions are subjected to dereplication using simulation technique of NMR spectra of 1H and 13C with software MestreNova ®, and then the MS. This evaluation allowed identification of five diketopiperazines, which are substances that have several biological activities: a Rel. cyclo (Pro-Val), Rel. cyclo (Pro-Leu), Rel. cyclo (Pro-Phe), Rel.ciclo (Pro-Ile) and Rel.ciclo (Pro-Tyr) and a mix of glycerides, showing P. stipata as a potential producer of biofuel. The fungi P. stipata was also cultivated on a large scale in corn and the crude extract obtained was fractionated using suitable chromatographic techniques. From this fractionation was obtained a mixture of glycerides, that after analysis by High Resolution Gas Chromatography at High Temperatures (HRGCHT) revealed the presence of monoglycerides. The results obtained... (Complete abstract click electronic access below)
Mestre

En raison de la nature symbiotique des micro-organismes endophytes, cette étude visait à étudier l'activité antibactérienne, antifongique et cytotoxique chez les métabolites secondaires des extraits endophytes foliaires de plantes de l'Amazonie brésilienne et du Cerrado. Dans ce travail de thèse 147 micro-organismes cultivables ont été isolés (130 champignons, 3 bactéries e 14 champignons non-identifiés ou inconnus) à partir de 28 plantes (4 espèces collectées au Brésil et 24 en Guyane Française). Tous les micro-organismes furent identifiés par analyse moléculaire des régions spécifiques de l'ADNr en utilisant des techniques de séquençage génomique. Des champignons endophytes de l’ordre des Xylariales furent ceux de plus importante fréquence d’isolation dans cette étude, représentés par 25 isolats. Des extraits bruts à l’AcOEt furent produits à partir de cultures de chaque micro-organisme isolé. Une proportion relative signifiante (23,1%) des extraits démontra une activité sur Candida albicans ATCC 10213, pendant que 4% furent actifs sur Staphylococcus aureus ATCC 29213. Le potentiel cytotoxique des extraits fut évalué pour des lignées cellulaires humaines KB (carcinome cervical utérin), MDA-MB-435 (mélanome), et MRC-5 (fibroblastes de poumon normal), résultant en proportion signifiante avec activité d’inhibition de la prolifération cellulaire (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectivement).Dix-huit métabolites secondaires furent isolés et identifiés à partir du fractionnement des extraits bruts de huit endophytes. Dix-sept de ces substances furent déjà décrites précédemment dans la littérature: l’acide piliformique (24) et la griséofulvine (25) isolés à partir de Xylaria cubensis SNB-GCI02; La phomopirone (26), la pyrenocine (27), l’alterpérilenol (28) et la novae-zelandine (29), isolés de Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-métilmelleina (31) et la dihidrosporothrioride (32) isolées à partir de Xylaria sp. SNB-GTC2501; La mycoleptodiscine (34) et la mycoleptodiscine B (35) isolées à partir de Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; le mycoepoxidiène (36) et la altiloxina A (37) isolés à partir de Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; L’acremonisol (40), le semicochliodinol (41) et le cochliodinol (42) isolés à partir de Chaetomium globosum SNB-GTC2114; la colletofragarone A2 (43) isolée à partir de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; la flavoglaucine (44) isolée à partir de Eurotium rubrum BBS01. Parmi ces substances, la flavoglaucine (44) isolée à partir de E. rubrum BBS01 démontra une activité comparable au contrôle fluconazol en C. albicans (CIM de 4 µg.mL-1). La substance (44) présenta IC50 >10 µM sur cellules normales MRC-5, ce qui en fait un candidat pour des études ultérieures. Dans ce travail, fut identifié pour la première fois l’activité de la colletofragarone A2 (43) isolée à partir de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201. La substance inédite nommée pyrrocidine C (30) fut isolée à partir de L. infectoria SNB-GTC2402 et identifiée par des analyses spectroscopiques (Casella et al., 2013). La pyrrocidine C (30) fut active en S. aureus ATCC 10213 (CIM de 2 µg.mL-1) et ne fut pas considérées cytotoxique pour les cellules normales MRC-5 (IC50 >10 µM), démontrant une sélectivité dans l’action antimicrobienne. Ces résultats démontrent la grande diversité des endophytes fongiques chez les plantes de l'Amazonie brésilienne et du Cerrado et la grande chimiodiversité associée aux métabolites secondaires de ces micro-organismes. Des champignons endophytes tropicaux, comme ceux présentés dans cette étude, peuvent apparaître comme une nouvelle source de substances antimicrobiennes et cytotoxiques
Because of the symbiotic nature of endophytes, this survey aims to investigate the probality of discovering antibacterial, antifungal and cytotoxic activities in secondary metabolites of leaf endophytes isolated from plants of Amazon and Cerrado biomes. In this study, 147 cultivable microorganisms were isolated (130 fungi, 3 bacteria and 14 unidentified or unknown microbes) from 28 plant species (4 species collected in Brazil and 24 in French Guyana). All endophytes were identified by molecular analyses of specific rDNA regions, with genomic sequencing techniques. Fungal endophytes belonging to Xylariales order were the most frequently isolated in this study, represented by 25 isolates. Crude AcOEt extracts were produced from cultures of each isolated endophyte. A significant relative proportion (23,1%) of extracts showed activity in Candida albicans ATCC 10213, while 4% were active in Staphylococcus aureus ATCC 29213. The cytotoxic potencial of the extracts was evaluated for human cell lines KB (uterin cervical carcinome), MDA-MB-435 (melanoma) and MRC-5 (normal lung fibroblasts), and a significant proportion of them showed cellular proliferation inhibition (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectively).Eighteen secondary metabolites were isolated by the fractionation of eight endophytic extracts. Seventeen of these substances had already been previously described in the literature: piliformic acid (24) and griseofulvin (25) isolated from Xylaria cubensis SNB-GCI02; phomopiron A (26), pyrenocin A (27), alterperilenol (28) and novae-zelandin A (29) isolated from Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-metilmellein (31) and dihidrosporothriorid (32) isolated from Xylaria sp. SNB-GTC2501; mycoleptodiscin A (34) and mycoleptodiscin B (35) isolated from Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; mycoepoxidien (36) and altiloxin A (37) isolated from Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; acremonisol A (40), semicochliodinol A (41) and cochliodinol (42) isolated from Chaetomium globosum SNB-GTC2114; colletofragaron A2 (43) isolated from Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; flavoglaucin (44) isolated from Eurotium rubrum BBS01. Among these substances, flavoglaucin (44), isolated from E. rubrum BBS01, showed comparable antifungal activity with the positive control fluconazol in C. albicans (MIC of 4 µg.mL-1). Flavoglaucin (44) also showed IC50 >10 µM in normal MRC-5 cells, becoming a good candidate for further studies. In this work, the cytotoxic activity of colletofragaron A2 (43), isolated from Colletotrichum sp. SNB-GTC0201 was described for the first time. The unpublished substance named pyrrocidin C (30) isolated from L. infectoria SNB-GTC2402 was identified by spectroscopic analyses (Casella et al., 2013). The pyrrocidin C (30) was active in S. aureus ATCC 10213 (MIC of 2 µg.mL-1), and was not considered cytotoxic for normal MRC-5 cells (IC50 >10 µM), showing selectivity in antimicrobial activity. These results demonstrate the great endophytic fungal diversity in plants of Amazon and Cerrado biomes, along with the chemodiversity associated to the secondary metabolites of these endophytes. Tropical fungal endophytes, like those seen in this work, may emerge as a new source of antimicrobial and cytotoxic substances
Devido à natureza simbiótica dos micro-organismos endofíticos, este estudo teve como objetivo investigar a atividade antibacteriana, antifúngica e citotóxica em metabólitos secundários de extratos de fungos endofíticos foliares de plantas do bioma Amazônia e Cerrado. Neste trabalho de tese foram isolados 147 micro-organismos cultiváveis (130 fungos, 3 bactérias e 14 fungos não-identificados ou desconhecidos) a partir de 28 plantas (4 espécies coletadas no Brasil e 24 na Guiana Francesa). Todos os micro-organismos foram identificados por análise molecular de regiões específicas de DNAr, com uso de técnicas de sequenciamento genômico. Fungos endofíticos da ordem Xylariales foram os de maior frequência de isolamento neste estudo, representados por 25 isolados. Extratos brutos em AcOEt foram produzidos a partir de culturas de cada micro-organismo isolado. Uma proporção relativa significante (23,1%) dos extratos demonstrou atividade em Candida albicans ATCC 10213, enquanto 4% foram ativos em Staphylococcus aureus ATCC 29213. O potencial citotóxico dos extratos foi avaliado para as linhagens celulares humanas KB (carcinoma cervical uterino), MDA-MB-435 (melanoma), e MRC-5 (fibroblastos de pulmão normal), resultando em proporção significante com atividade de inibição da proliferação celular (24,4%, 23,1% e 16,3%, respectivamente). Dezoito metabólitos secundários foram isolados a partir do fracionamento de oito extratos brutos endofíticos. Dezessete destas substâncias já tinham sido descritas anteriormente na literatura: ácido pilifórmico (24) e griseofulvina (25) isoladas de Xylaria cubensis SNB-GCI02; phomopirona A (26), pyrenocina A (27), alterperilenol (28) e novae-zelandina A (29) isoladas de Lewia infectoria SNB-GTC2402; 5-metilmelleina (31) e Dihidrosporothriolida (32) isoladas de Xylaria sp. SNB-GTC2501; mycoleptodiscina A (34) e mycoleptodiscina B (35) isoladas de Mycoleptodiscus sp. SNB-GTC2304; mycoepoxidieno (36) e altiloxina A (37) isoladas de Diaporthe pseudomangiferae SNB-GSS10; acremonisol A (40), semicochliodinol A (41) e cochliodinol (42) isoladas de Chaetomium globosum SNB-GTC2114; colletofragarona A2 (43) isolada de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201; flavoglaucina (44) isolada de Eurotium rubrum BBS01. Dentre estas substâncias, a flavoglaucina (44) isolada de E. rubrum BBS01, demonstrou atividade comparável ao controle fluconazol em C. albicans (CIM de 4 µg.mL-1). Esta substância (44) apresentou IC50 >10 µM em células normais MRC-5, tornando-se candidata para estudos posteriores. Neste trabalho foi identificado pela primeira vez a atividade citotóxica da colletofragarona A2 (43), isolada de Colletotrichum sp. SNB-GTC0201. A substância inédita nomeada pyrrocidina C (30) foi isolada a partir de L. infectoria SNB-GTC2402 e identificada através de análises espectroscópicas (Casella et al., 2013). A pyrrocidina C (30) foi ativa em S. aureus ATCC 10213 (CIM de 2 µg.mL-1), e não foi considerada citotóxica para as células normais MRC-5 (IC50 >10 µM), demonstrando seletividade na ação antimicrobiana. Estes resultados demonstram a grande diversidade fúngica endofítica em plantas do bioma Amazônia e Cerrado, e a quimiodiversidade associada aos metabólitos secundários destes micro-organismos. Fungos endofíticos tropicais, como os vistos neste trabalho, podem emergir como uma nova fonte de substâncias antimicrobianas e citotóxicas

A busca de novos princípios ativos de microrganismos é uma das áreas em que mais se investe nos países desenvolvidos. Entre estes microrganismos, os fungos têm grande destaque por sua produção de diversos metabólitos de interesse farmacológico. Endófitos são todos os microrganismos, cultiváveis ou não, que habitam o interior dos tecidos vegetais, sem causar danos ao hospedeiro e sem desenvolver estruturas externas, excluindo, dessa forma, bactérias noduladoras e micorrizas. Considerando a importância da cultura do café no estado de Minas Gerais, pesquisas com fungos endófitos de café, permitem a ampliação do conhecimento da diversidade desses fungos. Neste estudo, um total de 22 fungos endófitos isolados de café (Coffea arabica L.) foi cultivado in vitro. O screening foi conduzido usando o método de difusão em agar contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e leveduras. O isolado mais efetivo contra todos os microrganismos testados foi a linhagem Alternaria alternata e posteriormente, seu extrato bruto foi analisado. A concentração de fenólicos totais do extrato bruto do endófito foi de 3,44 μgEAG/mg de extrato. Para os testes de atividade antimicrobiana, a concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida e fungicida mínima (CBFM) conta Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans foram determinadas. Os valores de CIM variaram entre 50-100 μg/mL para S. aureus e 400-800 μg/mL para E. coli. O extrato não apresentou atividade nas concentrações testadas para C. albicans. Além destes testes, foi avaliada a atividade antioxidante pela capacidade sequestrante de radicais DPPH e pela oxidação do sistema β-caroteno/ácido linoleico, as quais não apresentaram resultados significativos. A atividade antitumoral foi avaliada pelo teste do MTT. À diluição de 400 μg/mL, o extrato apresentou atividade de aproximadamente 50% sobre células HeLa in vitro. Esses resultados demonstram que fungos endófitos podem ser uma promissora fonte de compostos antimicrobianos necessitando de estudos posteriores.
The search for new active components of microorganisms is one of the areas of greatest investment in developed countries. Among these microorganisms, fungi are distinguished by their ability to produce diverse metabolites for pharmacological purposes. Endophytes are all microorganisms, cultivated or not, that live inside plant tissue, without causing harm to the host and without developing external structures, excluding nodule bacteria and mycorrhiza. Considering the importance of coffee production in the state of Minas Gerais, studies of endophytic fungi in coffee allow for greater understanding of the diversity of these fungi. In this study, a total of 22 endophytic fungi isolated from coffee (Coffea arabica L.) were cultivated in vitro. The screening was conducted using the agar diffusion method against Gram-positive and Gram-negative bacteria and yeast. The most effective isolated fungus among all of the tested microorganisms was the lineage Alternaria alternata, and subsequently, its extract was assayed. The total phenolic content was 3.44 μgGAE/mg of the crude extract. For the antimicrobial activity assays, the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal and fungicidal concentration (MBFC) against Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans were determined. The ranges of MIC values were 50-100 μg/mL for S. aureus and 800-1000 μg/mL for E. coli. The crude extract did not show activity in the tested concentrations for C. albicans. Through these tests, the antioxidant activity of the fungus was assayed through its ability to scavenge DPPH radicals and through β-carotene/linoleic acid system oxidation, both of which were not significant. Antitumour activity was studied by the MTT assay. At a dilution of 400 μg/mL, the extract displayed a cytotoxic activity of approximately 50% towards HeLa cells in vitro. These results indicate that endophytic fungi could be a promising source of antimicrobial compounds and are worthy of further study.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Considerando a variedade de compostos encontrados em produtos de origem natural, o estudo da biodiversidade de um país é de interesse tanto científico quanto econômico. Sendo possível destacar os ecossistemas marinhos que apresentam biodiversidade comparável às florestas tropicais. Devido ao ambiente diferenciado, muitas vezes inóspito, os habitantes do ambiente marinho exibem características bioquímicas diferenciadas, mostrando grande potencial para bioprospecção. A importância do estudo de organismos marinhos na busca por metabólitos secundários bioativos levou à proposta de aprofundar a prospecção química do fungo endofítico Humicola fuscoatra, isolado da alga vermelha Asparagopsis taxiformis. A partir de seu extrato foi possível purificar por técnicas cromatográficas, e identificar 7 substâncias com base nos dados de ressonância magnética nuclear uni e bidimensional (RMN de 1H, RMN de 13C, TOCSY-1D, COSY, HSQC, HMBC) e espectrometria de massas (EM). Dentre estes foram identificados um composto da classe das dicetopiperazinas (P01), duas isocumarinas (P02 e P05), além de 4 substâncias não relatadas na literatura, incluindo três valerolactamas (P03, P06 e P07) e uma cicloexadienona (P04). Além dos compostos purificados por CLAE, foi possível identificar duas substâncias por cromatografia a gás acoplada a espectrometria de massas (CG-EM) sendo elas uma dicetopiperazina e um ftalato. A variedade estrutural dos compostos isolados e a grande quimiodiversidade do extrato de Humicola fuscoatra reforçam a necessidade de se realizar estudos químicos de fungos endofíticos de origem marinha, visto que estes são uma fonte de metabólitos com grande potencial para contribuir na busca por protótipos para novos agentes terapêuticos, além de enfatizar a importância da preservação dos biomas aquáticos, sob constante ameaça por impactos ambientais e mudanças climáticas.
Seeing the variety of compounds obtained from natural products, study a country biodiversity have a scientific interest as well as economic. It is possible to highlight marine ecosystems that present biodiversity comparable to rainforests. Due to the unique environment, often inhospitable, the organisms of the marine environments display uncommon biochemical characteristics, showing great potential for bioprospecting. The importance of the study of marine organisms in the search for bioactive compounds led to the proposal to deepen the prospection of the endophytic fungus Humicola fuscoatra, isolated from the red alga Asparagopsis taxiformis. Its extract led to the purification by chromatographic methods, and identification of 7 compounds based on their NMR spectral data obtained by uni and bidimensional experiments (1H NMR, 13C NMR, TOCSY-1D, COSY, HSQC, HMBC) and mass spectrometry (MS). One diketopiperazine (P01), two isocoumarins (P02 and P05) in addition to four novel compounds, including three valerolactams (P03, P06 and P07) and one cyclehexadienone (P04) were isolated. Moreover another diketopiperazine and one phthalate derivative were identified by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The structural variety of the identified compounds associated to the rich chemodiversity observed for the Humicola fuscoatra extract reinforces the need to develop additional chemical studies of endophytic fungal strains of marine origin, since they have been providing metabolites with great potential to the development of novel therapeutic agents, in addition to emphasize the importance of aquatic biomes preservation, as they have been continuously threatened by environmental and climate change impacts.

Microrganismos endofíticos são definidos como organismos que habitam em pelo menos durante um período de seu ciclo vital, o interior de um vegetal, sem causar aparentemente nenhum dano a este. Na busca de novos organismos e novos metabólitos secundários, um estudo foi conduzido visando avaliar a diversidade química de bactérias endofíticas por meio do isolamento e identificação de metabólitos secundários produzido por bactérias endofíticas de etnovariedades de mandioca, mantidas por tribos indígenas da Amazônia brasileira. Sessenta e sete bactérias endofíticas de mandioca foram selecionadas e submetidas à uma seleção através de testes de antagonismo in vitro. A bactéria endofítica, Bacillus pumilus foi a que apresentou forte ação inibitória contra os fitopatógenos Rhizoctonia solani, Pythium e Sclerotium rolfsii. Essa bactéria foi identificada através do sequenciamento de um fragmento do gene de 16S rRNA e por meio da análise de ácidos graxos (FAME). A obtenção dos metabólitos da bactéria selecionada foi realizada através da extração dos meios de cultura com os solventes hexano, acetato de etila e diclorometano. Após a concentração dos extratos, seus constituintes químicos foram realizados através de cromatografia em camada delgada, cromatografia em coluna, cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas CG-EM) e cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (CL-EM). Os extratos obtidos por meio de diclorometano e acetato de etila continham diferentes componentes químicos que mostraram atividade inibitória contra os três fitopatógenos testados. O método cromatográfico CL-EM permitiu a identificação de uma substância antifúngica produzida pela bactéria endofítica, Bacillus pumilus, conhecida como pumilacidina.
Endophytic microorganisms are defined as organisms that inhabit the interior of a vegetable at least during a period of the vital cycle, without causing any apparent damage. In the search for new organisms and new secondary metabolites, a study was conducted to evaluate the chemical diversity of endophytic bacteria through the isolation and identification of secondary metabolites produced by endophytic bacteria of cassava cultivated by Brazilian Amazon Indian tribes. Sixty seven endophytic bacteria isolated from cassava were screened using in vitro antagonisms tests. An endophytic bacterium, the Bacillus pumilus, which showed a strong inhibitory activity against Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum and Sclerotium rolfsii was selected. This bacterium was identified by sequencing of 16S rRNA genes and by FAME. The bacterial endophytic localization was confirmed by cassava cell tissue examination using scanning electron microscopy. The bacterial metabolites were extracted from the culture media using the solvents hexan, ethyl acetate and dichloromethane. After concentrate the extracts their chemical constituents were analyzed using thin layer chromatography (TLC), chromatography column, gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC/MS) and liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC/MS). The extracts obtained with dichloromethane and ethyl acetate contained different chemical compounds that showed inhibitory activity against the three plant-pathogenic fungi tested. The LC/MS method allowed the identification of an antifungal compound produced by the B. pumilus, which is known as pumilacidin.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-04-22Bitstream added on 2014-06-13T19:38:07Z : No. of bitstreams: 1 freire_rt_me_araiq.pdf: 2477231 bytes, checksum: 781528a47787381127bf13c26d933f48 (MD5)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
O presente trabalho descreve o desenvolvimento de método de extração e quantificação da citocalasina D, produzida pelo fungo endofítico Xylaria sp.. A técnica de extração tem embasamento no planejamento fatorial utilizando um gráfico ternário como referência, onde cada vértice foi constituído de um solvente puro. Os solventes utilizados foram: acetato de etila, álcool isopropílico e éter etílico. Foram selecionados 10 pontos no gráfico a partir dos quais foram realizadas as devidas extrações em triplicata, resultando em 30 amostras do extrato bruto de Xylaria sp.. A avaliação da quantidade de citocalasina D no extrato bruto foi feita por quantificação por RMN de 1H utilizando-se o antraceno como padrão interno. A escolha do melhor solvente extrator ocorreu após a quantificação, em que foi levado em conta: o teor de citocalasina D no extrato bruto, o rendimento do extrato bruto, a quantidade total de citocalasina D presente no extrato bruto e o custo de extração. A análise das variáveis nos permitiu a escolha do acetato de etila como melhor solvente extrator.
The present work describes the development of method for extraction and quantification of cytochalasin D, produced by the endophytic fungus Xylaria sp. The technique of extracting makes uses of a factorial design with a ternary graph as reference, where each vertex has consisting of one solvent. The solvents used were: ethyl acetate, ethyl ether and isopropyl alcohol. It was selected 10 points at the graph which were due to extractions in triplicate, resulting in 30 samples of crude extract of Xylaria sp .. For the avaliation of the amount of cytochalasin D in crude extract it was developed a quantification technique by 1H NMR of which the internal standard used was the anthracene.. Choosing the best solvent extractor occurred after the quantification, which was taken into account: the content of cytochalasin D in the crude extract, the yield of the crude extract, the total cytochalasin D present in the crude extract and the cost of extraction. After the analysis, the ethyl acetate was elected the best solvent for the extraction.

Orientador: Ângela Regina Araujo
Banca: Alberto José Cavalheiro
Banca: Antonio Gilberto Ferreira
Resumo: O presente trabalho descreve o desenvolvimento de método de extração e quantificação da citocalasina D, produzida pelo fungo endofítico Xylaria sp.. A técnica de extração tem embasamento no planejamento fatorial utilizando um gráfico ternário como referência, onde cada vértice foi constituído de um solvente puro. Os solventes utilizados foram: acetato de etila, álcool isopropílico e éter etílico. Foram selecionados 10 pontos no gráfico a partir dos quais foram realizadas as devidas extrações em triplicata, resultando em 30 amostras do extrato bruto de Xylaria sp.. A avaliação da quantidade de citocalasina D no extrato bruto foi feita por quantificação por RMN de 1H utilizando-se o antraceno como padrão interno. A escolha do melhor solvente extrator ocorreu após a quantificação, em que foi levado em conta: o teor de citocalasina D no extrato bruto, o rendimento do extrato bruto, a quantidade total de citocalasina D presente no extrato bruto e o custo de extração. A análise das variáveis nos permitiu a escolha do acetato de etila como melhor solvente extrator.
Abstract: The present work describes the development of method for extraction and quantification of cytochalasin D, produced by the endophytic fungus Xylaria sp. The technique of extracting makes uses of a factorial design with a ternary graph as reference, where each vertex has consisting of one solvent. The solvents used were: ethyl acetate, ethyl ether and isopropyl alcohol. It was selected 10 points at the graph which were due to extractions in triplicate, resulting in 30 samples of crude extract of Xylaria sp .. For the avaliation of the amount of cytochalasin D in crude extract it was developed a quantification technique by 1H NMR of which the internal standard used was the anthracene.. Choosing the best solvent extractor occurred after the quantification, which was taken into account: the content of cytochalasin D in the crude extract, the yield of the crude extract, the total cytochalasin D present in the crude extract and the cost of extraction. After the analysis, the ethyl acetate was elected the best solvent for the extraction.
Mestre

Grapevine trunk diseases (GTDs) is one of the most important groups of fungal diseases affecting grapevine plants in all the major growing regions of the world, with more than 130 fungal species associated. All grapevine species are susceptible to these diseases and their complete eradication is not possible for many reasons. In addition, GTDs are influenced by the type of disease and/or pathogens involved, leading management of this diseases complex to focus primarily on disease prevention and mitigation. Focusing on finding alternatives to avoid the spread and higher incidence of the disease, the present work had the aim to identify molecularly the phytopathogenic fungi responsible for GTDs present in vineyards of Alentejo region, and to test the antagonist potential of some endophytes against those pathogens. PCR assays followed sequencing of ITS region were performed to identify fungi and among them, three GTDs fungi were identified at genera level (Diaporthe sp., Pestalotiopsis sp., Neofusicocum sp.) and six at specie level (Hormonema viticola, Stereum armeniaccum, Phialophora fastigiata, Truncatella angustata, Cytospora acaciae, Diplodia pseudoseriata). The most prevalent fungus verified in the samples were Diaporthe sp., Neofusicocum sp. and Hormonema viticola in symptomatic plants. Almost all these pathogens were also verified in asymptomatic plants, highlighting the incidence of Hormonema viticola, what confirms the need of early diagnosis of this diseases complex. All the endophyte used in the direct inhibition antagonism test had the capacity of inhibit the pathogen mycelia growth, showing their potential biocontrol. This study allowed a deeper knowledge of the fungi present in vineyards from Alentejo region associated to GTDs and will contribute to further studies on fungi molecular identification in order to monitor the behaviour of the disease in the vineyards; Resumo: Identificação de espécies de fungos associadas a doenças do lenho em videira na região do Alentejo As doenças do lenho da videira são um dos grupos mais importantes de doenças fúngicas que afetam as plantas da videira em todas as principais regiões produtoras do mundo, com mais de 130 espécies de fungos associadas. Todas as espécies de videira são suscetíveis a essas doenças e sua erradicação completa não é possível por diversos motivos. Além disso, as doenças do lenho são influenciadas pelo tipo de doença e / ou agentes patogénicos envolvidos, levando a gestão deste complexo de doenças a concentrar-se principalmente na prevenção e mitigação de doenças. Com o objetivo de encontrar alternativas para evitar a disseminação e maior incidência da doença, o trabalho aqui apresentado teve como objetivo identificar molecularmente os fungos fitopatogénicos responsáveis pelas doenças do lenho presentes em vinhas da região do Alentejo, e testar o potencial antagonismo de alguns fungos endófitos contra esses agentes patogénicos. Os testes de PCR seguidos de sequenciação da região ITS foram realizados para identificar os fungos, tendo sido identificados três fungos causadores de doenças do lenho ao nível de género (Diaporthe sp., Pestalotiopsis sp., Neofusicocum sp.) e seis ao nível de espécie (Hormonema viticola, Stereum armeniaccum, Phialophora fastigiata, Truncatella angustata, Cytospora acaciae, Diplodia pseudoseriata). Os fungos mais prevalentes verificados nas amostras foram Diaporthe sp., Neofusicocum sp. e Hormonema viticola em plantas sintomáticas. A grande maioria dos agentes patogénicos foram também verificados em plantas assintomáticas, destacando a incidência de Hormonema viticola, o que confirma a necessidade de diagnóstico precoce desse complexo de doenças. Todos os endófitos utilizados no teste de antagonismo de inibição direta tiveram a capacidade de inibir o crescimento mecelial do patogénico, mostrando seu potencial de biocontrole. Este estudo permitiu um conhecimento mais aprofundado dos fungos presentes nas vinhas da região do Alentejo associadas às doenças do lenho, e contribuirá para mais estudos sobre a identificação molecular dos fungos, a fim de monitorizar o comportamento da doença nas vinhas.

Na literatura encontram-se referências de estudos envolvendo micro-organismos endofíticos, e mais recentemente estudos que avaliam a interação entre micro-organismos o que resulta na modificação, no tipo ou quantidade dos compostos que são produzidos. Neste trabalho foram realizados cultivos simples e mistos do fungo Colletotrichum boninense FLe 8.1 e da actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7, endófiticos isolados de Lychnophora ericoides que pertencem à coleção do Laboratório de Química de Microorganismos (LQMo) da FCFRP-USP, com o objetivo de aumentar suas capacidades de produção de novos compostos com atividade biológica. O cultivo misto, ou co-cultivo, é uma estratégia que tem sido usada para o acesso aos produtos naturais de origem microbiana. Existem poucos relatos de compostos com atividade biológica isolados a partir de S. albospinus e não há relatos de metabólitos secundários obtidos a partir de C. boninense. Nenhum desses micro-organismos tem sido descrito como endofítico na literatura e não existem relatos sobre co-cultivos envolvendo qualquer um deles na busca de compostos bioativos. Juntando as informações geradas através das diferentes técnicas de detecção utilizadas, como TLC, HPLC-DAD, GC-MS, ESI-MS, RMN e depois da análise correspondente, foi possível identificar e atribuir as estruturas de algumas substâncias conhecidas de origem microbiana como a mevalonolactona, o tirosol, a fisostigmina, a desferrioxamina E. ESI-MS foi utilizada para análises dos extratos brutos originados dos cultivos em meio arroz parbolizado permitindo visualizar compostos produzidos em baixas quantidades pelos micro-organismos na cultura simples quanto na co-cultura. Além disso, foram obtidos os perfis metabólicos desses micro-organismos a partir de cultivos em placa de Petri, possibilitando a detecção dos metabólitos em regiões específicas da interação microbiana, o que conduziu à identificação da fisostigmina e o seu análogo N-etilcarbamato produzidos pela actinobactéria, na interação com o fungo. Análises posteriores de MS sequencial permitiram obter perfis de fragmentação, os quais, juntamente com os dados dos íons detectados nos extratos, foram comparados com a informação disponível em bases de dados como DNP, METLIN e MassBank. Tais informações geradas a partir dessas análises permitiram sugerir possíveis compostos envolvidos na interação dos micro-organismos endofíticos mencionados. Foi sugerido que a fisostigmina, substância produzida pela actinobactéria S. albospinus RLe 7 e isolada nesse trabalho, poderia ter algum papel na inibição do crescimento do fungo C. boninense FLe 8.1 já que a inibição só foi observada quando cultivados ambos os micro-organismos na mesma placa de Petri. Porém, bioensaios com fisostigmina pura demonstraram que essa substância não possui atividade antifúngica per se, mas é possível que exista uma sinergia com outras substancias produzidas pela actinobactéria. Os resultados apresentados nesse trabalho demonstram a importância do uso de técnicas de detecção muito sensíveis, como a ESI-MS, na identificação de substâncias envolvidas na troca metabólica e permitiram gerar informações que serão utilizadas em estudos futuros utilizando esses micro-organismos endofíticos.
There are several studies involving endophytic microorganisms, and more recently some studies evaluate microbial interaction resulting in metabolic profiles modifications. In this study, simple and mixed cultures of the fungus Colletotrichum boninense FLe 8.1 and the actinobacteria Streptomyces albospinus RLe 7 were carried out. These endophytic microorganisms, isolated from Lychnophora ericoides, belong to the collection of the Laboratory of Microbial Chemistry (LQMo) of the FCFRP-USP. The main goal of this work was to increase the bioactive compounds production capacities. Co-culture, or mixed culture, is a recent strategy for accessing microbial natural products. There are few reports of bioactive metabolites from S. albospinus RLe 7 and there are no one about secondary metabolites obtained from C. boninense FLe 8.1. Neither the actinobacteria nor the fungus have been described as endophytic microorganisms and there are no co-culture studies involving these microorganisms in order to obtain natural products. Joining and analyzing all together the generated information from several detection techniques, such as TLC, HPLCDAD, GC-MS, ESI-MS, NMR, it was possible to identify and attribute the chemical structures of some known natural, such as mevalonolactone, tyrosol, physostigmine and deferrioxamine E. ESI-MS was used for extracts analysis from cultures in parboiled rice medium, allowing visualization of compounds produced in very low yields. Besides that, it was possible to obtain metabolic profiles from cultures in Petri dishes, leading to the detection of metabolites in specific regions of the microbial interaction. Physostigmine and its N-ethylcarbamate analogue were identified as actinobacteria metabolites in the interaction against the fungus. Posterior analysis by MS/MS allowed to obtain fragmentation profiles, which together with the ions detected from the extracts analysis, were compared by searching in databases, such as DNP, METLIN and MassBank. Such information allowed to suggest possible candidates for the compounds involved in the microbial metabolic exchange. It was hypothesized that physostigmine, isolated from the actinobacteria in this work, had a role in the fungal growth inhibition observed when both microorganisms were co-cultured. However, this substance did not show considerable antifungal activity when tested against C. boninense FLe 8.1, but it is possible that other compounds produced by this actinobacteria are acting in a synergistic way. The results showed here demonstrated the importance of very sensitive techniques, as ESI-MS, in the identification of molecules involved in the microbial metabolic exchange and will help in the generation of information for future studies involving those endophytic microorganisms.

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019
Os fungos endófitos são microrganismos que vivem nos tecidos das plantas durante, pelo menos, parte do seu ciclo de vida, sem, no entanto, provocar sinais de doença. A relação simbiótica detetada entre o fungo endofítico e a planta medicinal é benéfica para ambos, uma vez que o fungo possui maior disponibilidade de nutrientes e a planta possui maior proteção contra diversos patogénicos e maior promoção do crescimento e tolerância a fatores de stress. Nos últimos anos, os fungos endofíticos têm ganho especial atenção por parte dos investigadores devido às suas capacidades de sintetizar inúmeros novos compostos bioativos importantes em indústrias como a agricultura, medicina e indústria farmacêutica. Com o agravamento de problemáticas como o aumento da resistência aos antimicrobianos e consequente diminuição da eficácia dos fármacos existentes atualmente, a obtenção de novas alternativas terapêuticas tornou-se uma prioridade a nível mundial. A presente monografia caracteriza a biodiversidade dos endófitos existentes na natureza, assim como também a produção de metabolitos secundários, com especial foco em agentes anticancerígenos, antimicrobianos e antioxidantes, juntamente com outros compostos de elevado interesse para as ciências farmacêuticas. Em suma, os fungos endofíticos representam uma fonte com forte potencial de exploração de novos compostos químicos, sendo a investigação e o desenvolvimento de metabolitos derivados desta relação simbiótica necessária para um maior aprofundamento. O desenvolvimento de ferramentas biotecnológicas efetivas para a caracterização desses fungos, a otimização das condições de cultura e a engenharia genética são exemplos de abordagens que poderão possibilitar o aumento do rendimento dos metabolitos secundários desejados e, por conseguinte, o scale-up da produção a nível industrial.
Endophyte fungi are microorganisms that live in plant tissues for at least part of their life cycle without causing signs of disease. The symbiotic relationship detected between the endophytic fungus and the medicinal plant is beneficial for both, since the fungus achieve a greater availability of nutrient and the plant achieve higher levels of protection against various pathogens and promotes growth and tolerance to stressors. In recent years, endophytic fungi have gained special attention from researchers because of their ability to synthesize numerous important new bioactive compounds in agriculture, medicine and the pharmaceutical industries. With problems such as increased antimicrobial resistance and consequent decrease in the efficacy of existing drugs, new therapeutic alternatives have become a worldwide priority. This monograph characterizes the biodiversity of naturally occurring endophytes, as well as the production of secondary metabolites, with special emphasis on anticancer, antimicrobial and antioxidant agents, along with other compounds of high interest to the pharmaceutical sciences. In conclusion, endophytic fungi represent a source with strong potential for the exploration of new chemical compounds, being the research and development of metabolites derived from this symbiotic relationship necessary for further deepening of the issue. The development of effective biotechnological tools for the characterization of these fungi, the optimization of culture conditions and genetic engineering are good examples of approaches that can increase the yield of desired secondary metabolites and scale up production at industrial levels.

O potencial biotecnológico dos fungos endófitos é actualmente reconhecido, contudo a sua utilização à escala industrial é ainda muito limitada. Isso deve-se, sobretudo ao facto do seu crescimento e composição de metabolitos formados ser dependente e variar de acordo com as condições de crescimento e da influência e interacções com a sua planta hospedeira. É fundamental, por isso, que se criem estratégias e condições simples, mas eficazes, que possibilitem o cultivo destes fungos e consequentemente a produção de compostos biologicamente activos. É importante a par de estratégias de isolamento e caracterização de novas espécies de microrganismos endofíticos sejam também optimizadas condições de crescimento e produção dos seus metabolitos e posteriormente a sua purificação e caracterização. O trabalho experimental teve como principal objectivo optimizar as condições de crescimento e de formação de produtos com actividade antimicrobiana do fungo endófito Fusarium oxysporum isolado da oliveira. As condições estudadas e variadas foram a concentração inicial de glucose (1, 2 e 3%), pH (5,5; 6,5 e 7,5), temperatura (20, 25 e 30 ºC) e agitação (80, 160 e 240 rpm). Verificou-se que as condições que permitiram um maior crescimento do fungo Fusarium oxysporum foram 25 ºC, 30 g/L de glucose inicial, 240 rpm e pH 5,5. No entanto, não se verificou uma diferença significativa no crescimento do fungo relativamente à temperatura de 30 ºC, à concentração inicial de glucose de 20 g/L, a uma agitação de 160 rpm e ao pH 7,5. A formação de compostos com actividade antibacteriana foi favorecida quando as condições de fermentação foram 25 ºC, 10 g/L de glucose inicial, uma agitação de 80 rpm e um pH inicial de 7,5. Contudo, a concentração de compostos com poder antibacteriano presentes nos extractos fúngicos foi muito reduzida, dificultando a sua purificação e caracterização. Os resultados obtidos parecem indicar que se deveria utilizar condições de fermentação diferentes em termos de agitação e concentração inicial de glucose, quando se pretende optimizar o crescimento e a formação de compostos bioactivos, Contudo, será necessário a realização de mais experiências para se conseguir estipular as condições óptimas e um crescimento mais homogéneo dos fungos de fermentação para fermentação.

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas
Cork oak (Quercus suber) is a species of high importance in the Mediterranean. Besides its ecological importance, the cork oak also has a high relevance for the Portuguese economy. This importance is due to the production and processing of cork. However, the sustainability of the cork oak is being threatened due to climate change, which will reduce the availability of water in the Mediterranean, and the occurrence of diseases that increasingly affect their normal development. The charcoal disease, caused by the fungus Biscogniauxia mediterranea, leads to decline, and eventually, death of the tree. Diplodia corticola is another pathogen of the cork oak and is involved in various diseases considered responsible for the decline of the cork oak in the Mediterranean Basin. Currently, the use of fungicides is the main technique used to combat these problems. However the environmental hazard and toxicity of this process leads to the necessity of finding a more effective method. Biological control is an appropriate strategy as an alternative to this problem. Endophytes have the potential to be used as biological agents to control diseases. In addition to being described as potentiators of plant responses to stressful situations, endophytes have the potential for use as biological control agents. To identify endophytic fungi in cork oak, four sites of continental Portugal (Bragança, Gerês, Alcobaça and Grândola), which had differences in water availability, were selected to carry out the collection of biological material. Subsequently, the community of fungal endophytes of three organs (leaves, stems, roots) was evaluated. The trees analysed were largely colonized by fungi of the phylum Ascomycota. In general, Grândola had the highest colonization frequency and diversity of endophytes, while Alcobaça had the lowest. Of all study sites, the cork oaks from Gerês showed a more distinct community, differentiating from all other locations. The roots have a more diverse fungal community than the leaves and stems. It was found that the pathogenic fungi tested (B. mediterranea and D. corticola), essentially affect the aboveground organs of the tree, however no disease symptoms were detected. Furthermore, Gerês was the only study site that did not show any signs of infection by these pathogenic fungi. D. corticola only infected the southern regions (Alcobaça and Grândola), where as B. mediterranea also infected the trees in Bragança. Taking this into account, many fungi were selected for antagonism assays of biological control. Three species (belonging to two genera) may potentially act as biocontrol agents against diseases in Q. suber.
O sobreiro (Quercus suber) é uma espécie de elevada importância na região do Mediterrâneo. Para além da sua importância ecológica, o sobreiro também apresenta uma elevada relevância para a economia Portuguesa. Esta relevância provém da indústria de produção e transformação da cortiça. No entanto, a sustentabilidade do sobreiro poderá estar ameaçada devido às previstas alterações climáticas, que diminuirão a disponibilidade de água na região do Mediterrâneo, e à ocorrência de doenças que afetam cada vez mais o seu normal desenvolvimento. A doença do carvão do entrecasco, causada pelo fungo Biscogniauxia mediterranea, origina um acentuado declínio na árvore, podendo levar à sua morte. Diplodia corticola é um outro fungo patogénico do sobreiro, que está envolvido em várias doenças consideradas responsáveis pelo declínio do sobreiro na Bacia do Mediterrâneo. Atualmente, a utilização de fungicidas é a técnica mais usada para o combate destes problemas. Contudo, o risco ambiental e a toxicidade deste processo levam à necessidade da utilização de outros métodos eficazes. A luta biológica é uma estratégia adequada como alternativa a este problema. Além de se encontrarem descritos como potenciadores das respostas das plantas a situações de stresse, os organismos endófitos têm potencial para serem utilizados como agentes na luta biológica. Para identificar fungos endófitos em sobreiro, quatro locais de Portugal continental (Bragança, Gerês, Alcobaça e Grândola), que apresentavam diferenças na disponibilidade de água, foram selecionados para realizar a recolha de material biológico. A comunidade de fungos endófiticos foi avaliada em três órgãos (folhas, caules, raiz). Os sobreiros testados encontram-se maioritariamente colonizados por fungos do filo Ascomycota. Os sobreiros de Grândola apresentaram uma maior frequência de colonização e diversidade de endófitos, enquanto que os de Alcobaça apresentaram a menor. De todos os locais, os sobreiros do Gerês foram os que apresentaram uma comunidade mais distinta, diferenciando-se de todos os outros locais. As raízes apresentaram uma comunidade de fungos mais diversa do que as folhas e caules. Verificou-se ainda que os fungos patogénicos testados (B. mediterranea e D. corticola), infetaram essencialmente a parte aérea da árvore, apesar de não terem sido verificados sintomas nas mesmas. O Gerês foi o único local de estudo que não apresentou nenhum sinal de infeção por parte destes fungos. O fungo D. corticola infetou exclusivamente as regiões mais a sul (Alcobaça e Grândola), enquanto o fungo B. mediterranea foi também encontrado na região de Bragança. Tendo isto em consideração, diversos fungos foram selecionados para estudos de antagonismo e luta biológica, tendo sido encontradas três espécies (pertencentes a dois géneros) que poderão potencialmente atuar como agentes de biocontrolo contra as doenças de Q. suber.