Dissertations / Theses on the topic 'Furanocoumarins'

Au cours de l’évolution, les plantes ont développé de nombreux mécanismes de défense contre les stress biotiques, telles que la production de métabolites secondaires variés. Par exemple, certaines espèces comme le figuier (Ficus carica) produisent des molécules toxiques appelées furocoumarines. A l’heure où l’utilisation des pesticides est de plus en plus restreinte, comprendre les mécanismes naturels de défense des plantes devient de plus en plus important pour imaginer des méthodes de protection alternatives et repenser la gestion de nos cultures. Le premier objectif de ce projet consistait à poursuivre l’élucidation moléculaire de la voie de biosynthèse des furocoumarines ainsi qu’à mieux comprendre son évolution, à travers la caractérisation de nouveaux gènes de F. carica. Le second objectif consistait à évaluer le coût métabolique de la production de furocoumarines, en insérant la voie associée dans le génome de la tomate (Solanum lycopersicum), une plante qui, naturellement, ne produit pas ces molécules. Pour identifier de nouveaux gènes impliqués dans la synthèse de furocoumarines, nous avons combiné des approches de transcriptomique et de métabolomique : nous avons identifié des candidats dans une banque différentielle d’ARNseq de F. carica, avons cloné leurs séquences codantes, les avons exprimés dans un système hétérologue, et avons mené des tests d’activité enzymatiques. Nous avons ainsi identifié trois enzymes possédant des activités originales. Parmi elles, CYP76F112 joue un rôle clé dans la synthèse de furocoumarines, en convertissant la déméthylsubérosine en marmésine. Une analyse phylogénétique de gènes a été réalisée, suggérant fortement que CYP76F112 a évolué récemment dans un taxon restreint de Moracées, via une expansion de CYP76Fs. Des approches de modélisation et de mutagenèse dirigée ont également permis d’identifier quatre acides aminés impactant la spécificité et l’affinité de CYP76F112. Ces acides aminés semblent eux aussi avoir évolué récemment, et leur évolution a certainement été critique pour l’apparition de l’activité marmésine synthase. Ainsi, CYP76F112 améliore significativement notre compréhension de la production de furocoumarines dans le règne végétal, dans la mesure où son apparition récente supporte l’hypothèse selon laquelle les furocoumarines seraient apparues par évolution convergente dans des familles de plantes éloignées. De plus, CYP76F112 complète le jeu de quatre enzymes permettant la synthèse de psoralène (une furocoumarine toxique) à partir d’acide coumarique (un composé commun), ce qui ouvre de nouveaux horizons quant à l’utilisation des furocoumarines dans l’étude de la défense des plantes. Par exemple, en générant des tomates productrices de psoralène, il est désormais possible d’évaluer le coût métabolique et les bénéfices défensifs liés à la production de psoralène, ce qui pourrait conduire à une meilleure compréhension des compromis croissance-défense. En conséquence, nous avons utilisé la technique de clonage multigénique du GoldenBraid pour construire un plasmide portant les 4 gènes de la voie de biosynthèse du psoralène. En utilisant des techniques de transgenèse et de culture in vitro, nous avons utilisé ce plasmide pour initier des transformations de plantes, dont le but était de générer des tomates productrices de psoralène. Ces transformations n’ont pas été concluantes, mais notre étude constitue un travail pionnier qui sera poursuivi. En particulier, il a mené à l’identification de failles dans notre stratégie initiale, ainsi qu’à l’établissement de recommandations essentielles pour dépasser ces limites
To cope with pests and pathogens, plants have evolved many defence mechanisms such as the production of various specialised metabolites. For instance, some species including the fig tree (Ficus carica) produce toxic molecules called furanocoumarins. As the use of pesticides is being restricted, these age-old adaptations represent an interesting source of inspiration to find crop protection alternatives. Therefore, improving our understanding of plant defences becomes essential to rethink our crop management strategies. The first objective of this project was to pursue the molecular elucidation of the furanocoumarin biosynthesis pathway and to gain evolutionary insights through the characterisation of new genes in F. carica. The second objective was to assess the metabolic cost of furanocoumarin production by inserting the associated pathway in the genome of tomato (Solanum lycopersicum), a plant that does not naturally produce these molecules. To identify new genes involved in the furanocoumarin biosynthesis, we combined transcriptomic and metabolomic approaches: we identified candidate genes in a F. carica differential RNAseq database, cloned their coding sequences, heterologously expressed them, and performed enzymatic assays. This led us to identify three enzymes with original activities. Among these, CYP76F112 plays a key role in the furanocoumarin biosynthesis by converting demethylsuberosin into marmesin with a very high affinity. A phylogenetic gene-family analysis strongly suggests that CYP76F112 evolved recently in a restricted taxon of the Moraceae family, through an expansion of the CYP76Fs. Modelling and site-directed mutagenesis experiments permitted to highlight four amino acids that impact CYP76F112 specificity and affinity. Moreover, the recent evolution of these amino acids has most certainly been critical for the emergence of the marmesin synthase activity. Therefore, CYP76F112 significantly improves our understanding of furanocoumarin production in higher plants, since its recent evolution supports the hypothesis that furanocoumarins have appeared by convergent evolution in distant plant families. In addition, as CYP76F112 completes the set of four enzymes that allow the conversion of coumaric acid (a common molecule) into psoralen (a toxic furanocoumarin), it opens new horizons for the use of furanocoumarins in the study of plant defence. For instance, by generating psoralen-producing tomatoes, it is now possible to evaluate the metabolic costs and defensive profits linked to psoralen production, which might lead us to better understand the trade-offs between growth and defence. Consequently, we used a multi-gene cloning technology called GoldenBraid to construct a plasmid harbouring the four genes of the psoralen biosynthesis pathway. Using transgenesis methods along with in vitro culture, we used this plasmid to initiate plant transformation, in order to generate psoralen-producing tomatoes. These transformations were not conclusive, but our study constitutes a pioneer work that will be continued. In particular, it allowed to the identification of some weaknesses in the initial strategy and the establishment of recommendations that will be essential to overcome these limits

Les furocoumarines constituent l'une des classes de métabolites secondaires dérivant de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Elles ont été décrites comme étant des phytoaléxines mais sont également très largement utilisées par l'Homme pour leurs propriétés thérapeutiques. Un certain nombre d'études biochimiques ont été réalisées afin d'en comprendre la biosynthèse mais peu de choses sont connues concernant leur déterminisme moléculaire. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation fonctionnelle de gènes appartenant aux prényltransférases aromatiques potentiellement impliquées dans cette voie de biosynthèse. Les prényltransférases catalysent la première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines linéaires ou angulaires. Elles permettent l'addition d'un groupement dimethylally pyrophosphate (DMAPP) sur l'umbelliférone. En utilisant SfN8DT-1, une prényltransférase aromatique récemment caractérisée, comme sonde, nous avons identifié 7 gènes candidats chez deux familles de plantes (Rutaceae et Apiaceae). Dans la mesure où il a été décrit que ces enzymes étaient des protéines membranaires, nous avons adapté un système d'expression hétérologue basé sur l'utilisation de N. benthamiana. Ce système a été validé par l'expression de deux protéines membranaires : un cytochrome P450 CYP98A22 et une prényltransférase déjà caractérisée SfN8DT-1. Nous avons ensuite utilisé ce système d'expression pour réaliser l'étude des 7 gènes nouvellement isolés. Ces travaux nous ont permis de caractériser la première umbelliferone prenyltransferase de Petroselinum crispum capable de catalyser in vitro et in vivo la prénylation du carbone 6 ou 8 de l'umbelliférone en présence de DMAPP permettant ainsi la synthèse respectivement de demethylsuberosin et d'osthenol. Par ailleurs, une étude réalisée in planta chez le persil a permis de mettre en évidence une relation positive entre le niveau d'expression du gène et la teneur en umbelliférone prénylée. L'étude de la surexpression du gène chez Ruta graveolens a permis de mettre en évidence un lien entre l'expression du gène et la disparition de l'umbelliférone. Enfin nous avons identifié la même activité pour une prényltransférase de Pastinaca sativa, ce qui nous amène à émettre l'hypothèse que l'étape de prénylation n'est pas une étape limitante dans la biosynthèse des furocoumarines angulaires, étant donné que le persil ne produit que des furocoumarines linéaires, tandis que le panais produit des furocoumarines linéaires et angulaires. L'utilisation de ces mêmes systèmes d'expression hétérologue de N. benthamiana et R. graveolens nous a également permis d'identifier une seconde prényltransférase aromatique capable de catalyser l'addition de géranylpyrophosphate (GPP) sur l'umbelliférone et sur l'esculétine
Furanocoumarins constitute one of the classes of secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These molecules are described as phytoalexins in plants but are also used by humans for their pharmaceutical properties. A large number of biochemical studies were carried out to understand their biosynthetic pathway but little information was available concerning the genes involved in the pathway. In this study, we focused on the characterization of genes encoding for aromatic prenyltransferases which were described to be involved in this pathway. Prenlyltransferases catalyze the entry step to the linear or angular furanocoumarin pathway. Hence they catalyze the addition of a dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) prenyl moiety to umbelliferone. Using a recently characterized aromatic prenyltransferase (SfN8DT-1) as a probe, we isolated 7 different candidate genes from two plant families (Rutaceae and Apiaceae). As these enzymes were described as membrane bound proteins, we adapted a heterologous expression system made up of Nicotiana benthamian aand we validated its efficiency by using two membrane-associated enzymes: a cytochrome P450 (CYP98A22) and the already described prenyltransferase SfN8DT-1. Subsequently, this system was used to perform the functional characterization of the 7 newly identified proteins. This way we succeeded to characterize the first umbelliferone prenyltransferase of Petroselinum crispum that was able to catalyze both the 6-C and 8-C prenylation of umbelliferone with DMAPP producing demethylsuberosin and osthenol respectively. We made evidence that these reactions occurred both in vitro and in vivo. In addition, in planta studies performed in P.crispum showed a positive relationship between the gene expression level and the content of prenylated umbelliferone. The overexpression of this gene was investigated in Ruta graveolens and we could provide evidences of a link between the enzymatic activity and the disappearance of umbelliferone. We also reported a similar activity for a prenyltransferase isolated from Pastinaca sativa, which makes us assume that the prenylation step is not a rate limiting step in the biosynthetic pathway of angular furanocoumarins since parsley is producing only linear furanocoumarins whereas parsnip is producing both linear and angular furanocoumarins. In addition, using the same N. benthamiana and R. graveolens heterologous expression systems, we identified a second aromatic prenyltransferase able to catalyze the addition of geranyl pyrophosphate (GPP) both to umbelliferone and esculetin

Trabalho Complementar apresentado à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para obtenção do grau de licenciado em Ciências da Nutrição
Interação medicamentosa é um evento clínico em que os efeitos de um fármaco são alterados pelo uso concomitante ou anterior à administração de outro fármaco, alimento ou bebida. A toranja tem vindo a ser estudada pelo potencial da sua utilização no combate de doenças crónicas devido à sua atividade antioxidante, anti-inflamatória, anticancerígena, bem como anti aterosclerótica. No entanto, a toranja é um dos alimentos mais estudados pelo seu potencial de interações medicamentosas. Avaliar a importância terapêutica das interações entre os alimentos e os medicamentos é particularmente difícil, sendo estas interações principalmente de natureza farmacocinética e muito complexa. Deste modo, a ingestão de alimentos pode influenciar parâmetros como a absorção, distribuição, metabolização e eliminação de determinados fármacos, ou, por outro lado, não influenciar estes parâmetros. A toranja é um exemplo conhecido deste tipo de interações, uma vez que pode interferir com alguns fármacos e causar toxicidade severa. A naringina, a naringenina e as furanocumarinas são componentes presentes na toranja e que são responsáveis pela inibição do CYP3A4 originando assim as interações com os fármacos. Sabe-se que inúmeros fármacos interagem com o sumo da toranja. Muitos destes fármacos são prescritos para o tratamento de doenças comuns e são metabolizados pelo citocromo P450 3A4. A glicoproteína-P e os polipéptidos transporte de aniões orgânicos estão também envolvidos nas interações com os fármacos, uma vez que sofrem interações com os compostos polifenólicos presentes na toranja. Com o desenvolvimento deste trabalho, pretende-se estudar as características e as propriedades da toranja, assim como as interações que existem entre este fruto e os fármacos e em particular o modo como o perfil farmacocinético dos fármacos é afetado.
Drug interaction is a clinical event in which the effects of a drug are altered by the concomitant, or prior, use of another drug, food or drink. Grapefruit has been used in the fight against chronic diseases due to its anti-oxidant, antiinflammatory, anticancer, as well as anti-atherosclerotic activity. However, grapefruit is also one of the foods most studied for its potential drug interactions. Assessing the therapeutic importance of interactions between food and drugs is particularly difficult, and these interactions are mainly pharmacokinetics and very complex. Thus, food intake can influence parameters such as the absorption, distribution, metabolization and elimination of certain drugs, or, on the other hand, do not influence these parameters. Grapefruit is a known example of such interactions as it may interfere with some drugs and cause severe toxicity. Naringin, naringenin and furanocoumarins are components present in the grapefruit that are responsible for the inhibition of CYP3A4, thus leading to drug interactions. It is known that innumerable drugs interact with grapefruit juice. Many of these drugs are prescribed for the treatment of common diseases and are metabolized by cytochrome P450 3A4. P-gp and OATP are also involved in drug interactions as they undergo interactions with the polyphenolic compounds present in the grapefruit. This work intends to study the characteristics and properties of grapefruit, as well as the interactions between this fruit and drugs, and particularly to understand how the pharmacokinetic profile of the drugs is affected.
N/A

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-08-09T19:14:53Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Cristina de Morais Rodrigues - 2016.pdf: 1662967 bytes, checksum: 21eacb29fa5e6184be947945ff9816a4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)
Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-08-10T11:28:58Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Cristina de Morais Rodrigues - 2016.pdf: 1662967 bytes, checksum: 21eacb29fa5e6184be947945ff9816a4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)
Made available in DSpace on 2016-08-10T11:28:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Mariana Cristina de Morais Rodrigues - 2016.pdf: 1662967 bytes, checksum: 21eacb29fa5e6184be947945ff9816a4 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-03-21
Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
Brosimum gaudichaudii Trécul. from the Moraceae family is traditionally used as a therapeutic resource to treat leukoderma. The roots are the plant’s part that contain the highest concentration of photosensitizing substances, important against leukoderma, among them psoralen and bergapten that belong to the secondary metabolite class named linear furanocoumarins. By definition, phytotherapic is the product obtained exclusively from active vegetal raw material with prophylactic, curative or palliative purpose. They characteristically do not include isolated or highly purified substances in their composition from any source, or are associated with other extracts. One of the main challenges in producing phytotherapic medicine is the complex composition of the medicinal plant that depends on climatic and geographic factors, and cultivation, drying and storage conditions. The objective of this work was to obtain solid pharmaceutical forms containing extract standardized in psoralen and bergapten of B. gaudichaudii, as well as the analyses of these pharmaceutical forms following all the parameters stated by the Normative instruction no 04 of 2014. Chapter 1 is about the vegetal drug characterization and posterior production and standardization of the liquid extract, the analytical method was co-validated by High Efficiency Liquid Chromatography (CLAE) to determine the markers levels in the liquid extract, according to ANVISA norms. The method presented to be selective, linear, precise and exact. The liquid extract was standardized in total furanocoumarins expressed in psoralen and bergapten, and the level was 0.20% (m/v) (20.81 μg/mL of psoralen and bergapten). Chapter 2 describes the development of coated pellets containing the liquid standardized extract, having an average diameter of 0.75±0.08 mm and sphericity of 0.98±0.09. The acquired pellets were encapsulated in hard gelatinous capsules (500 mg of pellets per capsule), the average level of total furanocoumarins per capsule was 641.41 μg. Tablets containing the coated pellets were produced, and it was possible to keep the pellets whole, even after the compression force of 0.5 ton was applied on them. The tablets were tested according to the analyses recommended by the Brazilian Pharmacopeia and presented a total furanocoumarin level of 587.6 μg per tablet. The analytical methodology was co-validated for the quantification of psoralen and bergapten in the coated pellets and the tablets containing them. Chapter 3 describes the obtainment and standardization of the soft extract from B.gaudichaudii and the development of tablets containing the soft extract. The soft extract was characterized according the pharmacopeia tests, and there were 82.02% (m/m) of dry residue, and the total furanocoumarin levels expressed in psoralen and bergapten was 2.93% (m/v) (58.8 μg/g of psoralen and bergapten). Three different formulations of tablets containing soft standardized extract were acquired by humid rout previous granulation. In each formulation the diluents, microcrystalline cellulose (MCC) and starch proportion were variated. The compression was done in a hydraulic press and the process was controlled to establish the compression conditions. The analytical methodology was co-validated to quantify the total furanocoumarins in the tablets and the level were 16,800 μg per tablet.
Brosimum gaudichaudii Trécul. pertencente a família Moraceae é tradicionalmente utilizada como recurso terapêutico para o tratamento de leucodermias .A raiz desta planta é a parte que contém maior concentração de substâncias fotossensibilizantes importantes contra leucodermias, dentre elas o psoraleno e o bergapteno que pertencem à classe de metabólitos secundários denominados furanocumarinas lineares. Por definição, fitoterápico é o produto obtido exclusivamente de matéria prima ativa vegetal com propósito profilático, curativo ou paliativo. Caracterizam-se por não incluir na sua composição substâncias ativas isoladas ou altamente purificadas, de qualquer origem, nem as associações dessas com outros extratos. Um dos principais desafios na produção de um medicamento fitoterápico é a complexidade da composição da planta medicinal, que depende de fatores climátios, geográficos, condições de cultivo, secagem e armazenamento. O presente trabalho teve como objetivo a obtenção de formas farmacêuticas sólidas contendo o extrato padronizado em psoraleno e bergapteno de B. gaudichaudiii, bem como a análise destas formas farmacêuticas seguindo todos os parâmetros exigidos pela Instrução normativa n° 04 de 2014. O capítulo 1 trata da caracterização da droga vegetal e posteriormente a obtenção e padronização do extrato líquido, covalidou-se o método analítico por Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (CLAE) para determinação dos teores dos marcadores no extrato líquido, segundo as normas da ANVISA. O método mostrou-se seletivo, linear, preciso e exato. O extrato líquido foi padronizado em furanocumarinas totais expressas em psoraleno e bergapteno, e obteve-se o teor de 0,20% (m/v) (20,81 μg/mL de psoraleno e bergapteno). O capítulo 2 descreve o desenvolvimento de pellets revestidos contendo o extrato líquido padronizado obtido, tendo um diâmetro médio 0,75+0,08 mm e esfericidade 0,98+0,09. Encapsulou-se os pellets obtidos em cápsulas gelatinosas duras (500mg de pellets por cápsula), o teor médio de furanocumarinas totais por cápsula foi 641,41μg. Obteve-se comprimidos contendo pellets revestidos e foi possível manter os pellets íntegros mesmo após aplicada à força de compressão de 0,5 ton nos mesmos. Os comprimidos foram analisados segundo os testes preconizados pela Farmacopeia Brasileira e apresentaram um teor de furanocumarinas totais de 587,6μg por comprimido. A metodologia analítica foi covalidada para quantificação do psoraleno e bergapteno tanto nos pellets revestidos como nos comprimidos contendo pellets. O capítulo 3 descreve a obtenção e padronização do extrato mole de B.gaudichaudii e o desenvolvimento de comprimidos contendo o extrato mole obtido. O extrato mole foi caracterizado segundo os testes farmacopeicos e obteve 82,02% (m/m) de teor de sólidos, e o teor de furanocumarinas totais expressas em psoraleno e bergapteno que foi 2,93% (m/v) (58,8 μg/g de psoraleno e bergapteno). Obtiveram-se três diferentes formulações de comprimidos por previa granulação por via úmida, contendo o extrato mole padronizado. Em cada formulação variou-se a proporção dos diluentes celulose microcristalina (MCC) e amido. A compressão foi feita por meio de uma prensa hidráulica e efetuou-se o controle do processo para o estabelecimento das condições de compressão. A metodologia analítica foi covalidada para quantificação de furanocumarinas totais nos comprimidos obtidos, e a concentração de furanocumarinas totais para cada comprimido foi 16800 μg por comprimido.

Les furanocoumarines (FCs) sont des métabolites secondaires principalement synthétisés chez quatre familles botaniques et dérivent de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Ces phytoalexines interviennent dans les processus de défense de la plante et présentent un fort potentiel thérapeutique. Des travaux réalisés dans les années 1960 sur des cultures cellulaires en parallèle de l’utilisation de précurseurs radiomarqués ont permis de démontrer que de nombreuses enzymes impliquées dans cette voie appartenaient à la famille des cytochromes P450 (P450s). Seules deux d’entre elles avaient pu être identifiées d’un point de vue moléculaire au début de ce travail de thèse. Afin de générer des informations concernant le génome de plantes productrices de FCs, nous avons fait séquencer les ARNm extraits de feuilles de Pastinaca sativa, de Ruta graveolens et de Cullen cinereum. L’analyse in silico de ces trois banques de données a permis d’identifier près de 800 fragments d’ADNc codants pour des P450s. Des travaux antérieurs réalisés au laboratoire et l’analyse comparative des transcriptomes de ces 3 plantes nous ont amenés à nous focaliser sur la sous-famille CYP71AZ au travers d’une étude fine de CYP71AZ3 et CYP71AZ4. La caractérisation fonctionnelle de ces enzymes a été réalisée dans un système d’expression hétérologue eucaryote : Saccharomyces cerevisiae. Les résultats obtenus ont permis de montrer que CYP71AZ4 avait une spécificité de substrat assez large puisqu’elle pouvait métaboliser au moins une FC et 4 coumarines. L’analyse et la comparaison des constantes cinétiques pour chacun de ces substrats indiquent néanmoins que le psoralène est le substrat préférentiel. La caractérisation fonctionnelle de CYP71AZ3 a mis en évidence que cette enzyme pouvait hydroxyler l’esculétine, une coumarine, mais ne jouait aucun rôle dans la synthèse de FCs. Ces travaux mettent en évidence la diversité fonctionnelle au sein d’une même sous-famille enzymatique et permettent d’émettre des hypothèses nouvelles quant à l’apparition de cette voie de biosynthèse chez les Apiacées d’une part, et chez les autres familles botaniques d’autre part
Furanocoumarins (FCs) are secondary metabolites mainly synthetized in four botanical families deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These phytoalexins are involved in plant defense mechanisms and present strong therapeutic potential. Early studies in the 1960s based on cell cultures and the use of radiolabeled precursors have shown that many enzymes involved in this pathway belong to the cytochrome P450 family (P450s). Only two of them had been identified from a molecular point of view at the beginning of this thesis. In order to generate information regarding the genome of plants producing FCs, we sequenced the mRNA extracted from leaves of Pastinaca sativa, Ruta graveolens, and Cullen cinereum. In silico analysis of these three libraries identified nearly 800 cDNA fragments encoding for P450s. Previous studies in the laboratory and comparative transcriptome analysis of these three plants have led us to focus on the subfamily CYP71AZ through a detailed study of CYP71AZ3 and CYP71AZ4. Functional characterization of these enzymes was performed in an eukaryote heterologous expression system: Saccharomyces cerevisiae. The results showed that CYP71AZ4 had a broad substrate specificity enough as it could metabolize one FC and 4 coumarins. The analysis and comparison of the kinetic constants for each of these substrates indicate, however, that the preferred substrate is psoralen. The functional characterization of CYP71AZ3 showed that this enzyme could hydroxylate esculetin, a coumarin, but played no role in the synthesis of FCs. This study highlights the functional diversity within a single enzyme subfamily and allows to issue new hypotheses about the emergence of this biosynthetic pathway in Apiaceae on one hand, and among other botanical families on the other hand

Les différences de réponse médicamenteuse entre patients sont fréquentes, conduisant souvent à des difficultés à cibler la fenêtre thérapeutique et optimiser le traitement. Les médicaments courants sont efficaces pour seulement 25% à 60% des patients. Deux facteurs majeurs impliqués dans l’efficacité des médicaments sont leur métabolisme et clairance. Notamment, le CYP3A4 est la principale enzyme responsable du métabolisme des médicaments dans les hépatocytes ; des variations dans son activité entraînent une incertitude de dose. Pour améliorer l'efficacité du médicament, ce travail de thèse se concentre sur le développement de nano-transporteurs chargés avec des molécules naturelles inhibant le CYP3A4 et ciblant les hépatocytes, à administrer avant le médicament pour minimiser son métabolisme. Une méthodologie pour examiner les composés inhibiteurs du CYP3A4, fixer leur dose et leur temps d’administration pour une utilisation in vivo a été développée. Une première preuve de concept a été démontrée en utilisant une micelle chargée de furanocoumarine comme composé inhibiteur de CYP3A4 : des études d'efficacité antitumorale et la quantification dans la tumeur du médicament cytotoxique docetaxel, injecté après les micelles chargées de furanocoumarine, ont été engagés sur deux modèles de tumeurs xénogreffées chez la souris. Une deuxième génération de nano-transporteurs a été développée, avec des propriétés physico-chimiques optimisées pour cibler spécifiquement les hépatocytes. La démonstration de leur accumulation spécifique dans les hépatocytes et de l'amélioration supplémentaire de l’efficacité du docetaxel a été menée. Une perspective sur l'utilisation d'une telle approche pour améliorer l'efficacité des médicaments existants en oncologie est discutée, notamment pour le carcinome hépatocellulaire différencié
Differences in drug response among patients are common, often leading to challenges in targeting the therapeutic window and optimizing the treatment. Major drugs are reported to be effective in only 25% to 60% of patients. Two important factors responsible for the effective dose of drug are drug metabolism and clearance. Notably, CYP3A4 is the main enzyme responsible for drug metabolism in hepatocytes; variations in its activity result in dose uncertainty. To improve drug’s effectiveness, this thesis work focuses on the development of nanocarriers loaded with natural CYP3A4-inhibiting molecules and targeting hepatocytes, to be administered prior to the drug to minimize its metabolism. A methodology to systematically screen CYP3A4-inhibiting compounds and set the dose and schedule for in vivo use was developed. A first proof-of-concept was demonstrated using a furanocoumarin-loaded micelle as CYP3A4-inhibiting compound: anti-tumor efficacy studies and quantification within tumor of the cytotoxic drug docetaxel, injected after furanocoumarin-loaded micelle, were engaged on two xenografted tumor models in mice. A second generation of nanocarriers was developed, with optimised physico-chemical properties to target specifically hepatocytes. The demonstration of their specific accumulation in hepatocytes and additional improvement in boosting of docetaxel was conducted. A perspective in using such an approach to enhance the effectiveness of existing drugs in oncology is discussed, notably for differentiated hepatocellular carcinoma

Les furocoumarines sont des métabolites secondaires qui dérivent de la voie de biosynthèse des phénylpropanoïdes. Ces phytoalexines interviennent notamment dans les mécanismes de défense des plantes tels que la résistance aux bioagresseurs. Le déterminisme moléculaire de cette voie de biosynthèse est encore mal connu mais il a néanmoins été démontré depuis les années 1960 que les enzymes catalysant les différentes étapes de la voie la synthèse des furocoumarines appartenaient à différentes familles. Les travaux présentés dans ce document se sont focalisés sur deux familles d'enzymes : les dioxygenases oxoglutarate dépendantes et les cytochromes P450s. La première étape de la voie de biosynthèse des furocoumarines consiste en une ortho-hydroxylation du p-coumarate qui mène à la formation de l'umbelliférone. Basé sur des travaux récents sur Arabidopsis, six gènes codants pour des dioxygénases ont été isolés chez Ruta graveolens, Citrus limetta et Pastinaca sativa. Les protéines correspondantes présentent plus de 58% d'identité avec la Féruloyle 6' Hydroxylase (F6'H) d'A. thaliana. La caractérisation fonctionnelle de ces enzymes a été réalisée dans un système d'expression hétérologue procaryote. Sur les 6 enzymes, trois n'ont pu être exprimée efficacement, et deux présentent une activité F6'H similaire à celle décrite pour A. thaliana. La dernière enzyme dispose de caractéristiques nouvelles non décrites à ce jour. Elle est en mesure de réaliser l'hydroxylation du féruloyle coA et du p-coumaroyle coA. Ces études in vitro ont été complétées par une exploration des fonctions de la protéine dans la plante. Une analyse fine du profil d'expression du gène a permis de mettre en évidence une expression qui est en corrélation avec le niveau de production d'umbelliférone. La fonction de la protéine a également été validée par une analyse des produits formés dans des feuilles de Nicotiana benthamiana transformées transitoirement. Les cytochromes P450 catalysent 60% des réactions de la voie de biosynthèse de furocoumarines. Un travail de criblage fonctionnel de cytochromes P450 identifiés au préalable chez Ammi majus et Thapsia garganica a été entrepris. Les analyses de bio-informatiques et les modifications apportées au niveau du mode opératoire pour l'expression dans la levure ont permis d'émettre des hypothèses concernant le rôle de certains P450 candidats. Ces travaux exploratoires et préliminaires font supposer de nouvelles conjectures relatives à cette voie de biosynthèse
Furanocoumarins are secondary metabolites deriving from the phenylpropanoid biosynthetic pathway. These phytoalexins are especially involved in plant defense mechanisms against insects or phytopatogenous fungi and bacteria. The molecular control of this biosynthetic pathway is still poorly understood even though it has been demonstrated since the 1960s that enzymes catalyzing the different steps are belonging to different enzymatic families. The work presented here is focused on two enzyme families: oxoglutarate dependent dioxygenases and cytochrome P450s. The first step in the furanocoumarins biosynthetic pathway is the ortho-hydroxylation of p-coumarate, which leads to the formation of umbelliferone. Based on a recent work done on Arabidopsis, we isolated six genes encoding dioxygenases from Ruta graveolens, Citrus limetta and Pastinaca sativa. The corresponding proteins share more than 58% identity with the A. thaliana féruloyle 6' Hydroxylase (F6'H). The functional characterization of these enzymes was performed in a prokaryotic heterologous expression system. Of the six enzymes, three could not be functionnaly expressed and two exhibited a similar F6'H activity as described for A. thaliana. The last enzyme has new properties not described to date. It is able to achieve both hydroxylation of féruloyle CoA and p-coumaroyle CoA. These in vitro studies were completed by a functional exploration of the protein in planta. A detailed analysis of the gene expression pattern highlighted a link with the level of umbelliferone synthesis. The function of the protein was also confirmed by an analysis of the products formed in transiently transformed Nicotiana benthamiana leaves. Cytochrome P450s catalyze 60% of the reactions of the furanocoumarin biosynthetic pathway. Therefore, a functional screening of cytochrome P450 previously identified in Ammi majus and Thapsia garganica was undertaken. The bioinformatic analyses and the changes undertaken in the procedure for expression in yeast allowed drawing hypotheses on the function of some of these P450 candidates. These exploratory and preliminary experiments allowed suggesting new hypotheses about the biosynthetic pathway

Les coumarines et furocoumarines sont des phytoalexines synthétisées par certaines familles de plantes (ex : Rutacées dont font partie les agrumes), pour se défendre contre les bioagresseurs. Les furocoumarines peuvent être toxiques pour l’homme, lorsqu’elles sont combinées à certains médicaments : c’est l’effet pomelo. Aujourd’hui, la plupart des cytochromes P450 impliqués dans la synthèse des furocoumarines chez les Apiacées, ont déjà été caractérisés. En revanche, malgré l’importance économique des agrumes, nous en savons très peu sur la voie de biosynthèse des coumarines et furocoumarines chez ces plantes. Dans ce travail, nous avons créé, optimisé et validé une méthode d’analyse en chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à un spectromètre de masse (UPLC-MS), pour identifier et quantifier 28 coumarines et furocoumarines dans la peau et la pulpe d’agrumes. Cette méthode nous a permis de chémotyper 62 variétés d’agrumes, distinguées par leur faible ou forte capacité de production de ces composés. En parallèle, un travail de bioinformatique sur des banques publiques d’ADN génomique d’agrumes, a permis d’identifier sept gènes présentant de fortes homologies de séquences avec ceux intervenant dans la synthèse des furocoumarines chez Pastinaca sativa (CYP71) et chez Arabidopsis thaliana (CYP82). Une analyse quantitative de leur niveau d’expression chez des agrumes, a montré que quatre d’entre eux étaient plus fortement exprimés chez les fruits fortement producteurs de coumarines et furocoumarines. Le clonage de ces gènes et leur expression hétérologue chez la levure, a révélé la fonction de CYP82D64 de pomelo et de Combava, qui hydroxyle la xanthotoxine pour donner la 5-hydroxy-xanthotoxine. La synthèse des coumarines et furocoumarines chez les agrumes, ainsi mieux appréhendée, nous a permis de proposer un schéma de sélection variétale visant à abaisser les taux de ces composés chez les Citrus. Nous avons aussi montré l’évolution convergente des CYP71 et CYP82 dans leur synthèse chez les Apiacées et les Rutacées respectivement. La découverte du premier cytochrome P450 de Citrus intervenant dans la production de ces composés, ouvre de nouvelles perspectives quant à l’élucidation de leur voie de biosynthèse chez les agrumes
Coumarins and furanocoumarins are phytoalexines synthesized by some plant families (e.g. Rutaceæ that include citrus), to defend themselves against bioaggressors. Furanocoumarins can be toxic for humans, when combined with some drugs: this is the grapefruit juice effect. Nowadays, most of the cytochrome P450s involved in the furanocoumarin synthesis in Apiaceæ, have already been characterized. However, despite the economical importance of citrus, a little is known about the coumarins and furanocoumarins pathway in these plants. In this work, we created, optimized and validated an analytical method by ultra high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS), to identify and quantitate 28 coumarins and furanocoumarins in citrus peel and pulp. This method allowed us to chemotype 62 citrus varieties, distinguished by their low or high capacity to produce these compounds. In parallel, a bioinformatic work on public banks of genomic DNA from citrus, allowed to identify seven genes with high sequence homologies with those involved in the synthesis of furanocoumarins in Pastinaca sativa (CYP71) and in Arabidopsis thaliana (CYP82). A quantitative analysis of their expression level in citrus showed that four of them were more expressed in high coumarins and furanocoumarins producing fruits. The cloning of these genes and their heterologous expression in yeast, revealed the function of grapefruit and Combava CYP82D64, which catalyzes the hydroxylation of xanthotoxin in 5-hydroxy-xanthotoxin. The synthesis of coumarins and furanocoumarins in citrus, then better apprehended, allowed us to propose a breeding scheme aiming at decreasing the levels of these compounds in Citrus. We also showed the convergent evolution of CYP71 and CYP82 in their synthesis in Apiaceæ and in Rutaceæ respectively. The discovery of the first cytochrome P450 from Citrus involved in the production of these compounds, opens up new prospects for the elucidation of their biosynthetic pathway in citrus

Ruta graveolens L. Présente à l'état naturel de fortes concentrations en furanocoumarines, sa culture en conditions in vitro à des fins de production a été envisagée. Les tiges feuillées cultivées en milieu liquide possèdent des niveaux de synthèse élevés (de l'ordre du milligramme de furanocoumarine totale par gramme de matière sèche). L'optimisation des conditions de culture ont permis d'améliorer significativement la production de furanocoumarines. Ce résultat est du à un effet biomasse, les niveaux de synthèse des molécules dans les tissus s'étant révélés peu inductibles contrairement à la croissance des tiges feuillées. La seconde étape du travail consistait à provoquer l'excrétion des molécules des tissus vers le milieu de culture. L'utilisation du Tween 20 a permis de récupérer une partie des molécules sans sacrifier la biomasse. Les étapes de croissance et de perméabilisation ont constitué les bases d'un "process" dont la faisabilité technique a été testée sur des enceintes de culture simplifiées et des bioréacteurs classiques. La productivité est encourageant (0,051 mg. G-1. J-l contre 0,008 mg. G-l. J-l pour les plantes cultivées en champ).

Les plantes sont soumises durant leur vie à de nombreux stress environnementaux. Face à ces contraintes, les végétaux ont développé au cours de l'évolution différentes stratégies. La plus emblématique est la mise en place du métabolisme spécialisé, représenté par une grande diversité chimique et fonctionnelle. Bien que ce métabolisme soit de plus en plus étudié ces dernières années, de nombreuses lacunes persistes à son propos, liées notamment (i) à la complexité des modifications métabolomiques engendrées par la perception de stress, (ii) aux coûts et avantages que ces métabolites imputent à la plante les accumulant, et (iii) aux voies métaboliques menant à cette diversité de composés. Pour appréhender ces différentes problématiques, nous avons adopté une stratégie combinant des approches de phytochimie, de biologie moléculaire et de génétique. Dans un premier temps, nous avons étudié les changements métaboliques globaux engendrés par l’application de deux stress environnementaux, l’ozone et la blessure mécanique, sur une plante modèle au laboratoire, le panais, en fonction du temps. Les résultats de ces travaux nous ont permis d’identifier 40 métabolites différentiellement accumulés dans ces conditions, dont certaines furocoumarines. Par la suite, nous avons focalisé notre étude sur ces molécules en évaluant leurs profils d’accumulation, en condition de stress par blessures mécaniques, par la biais d’analyses différentielles. A partir de ces données, nous avons initié la recherche et l'identification de gènes candidats potentiellement impliqués dans cette voie à partir de plusieurs banques transcriptomiques et génomiques de panais. La fonction des gènes sélectionnés a été évalué par des approches d'expression hétérologue dans la levure. En parallèle de ces travaux, nous avons développé une stratégie destinée à mieux comprendre le coût métabolique de la synthèse de métabolites spécialisés. Pour ce faire, nous avons adapté aux furocoumarines une technique de clonage multigénique permettant de transférer dans une plante, et en une seule opération, plusieurs gènes impliqués dans la même voie de biosynthèse. Cette méthode nous a permis d'initier la génération de lignées stables ayant intégré les deux premiers gènes de la voie. Ces plantes seront comparées à des plantes sauvages et permettront ainsi d’étudier les coûts métaboliques et physiologiques de l’introduction de cette nouvelle voie de biosynthèse ainsi que ses bénéfices en termes de défense de la plante
Plants are subjected to many environmental stresses during their life. Faced with these constraints, plants have developed different strategies during their evolution. The most emblematic is the establishment of a specialized metabolism, represented by a great chemical and functional diversity. Although this metabolism has been studied more and more in recent years, many gaps remain, related in particular (i) to the complexity of the metabolomic changes generated by the perception of stress, (ii) to the costs and benefits that these metabolites impute to the producing plant, and (iii) to the metabolic pathways leading to the diversity of compounds. To cope with these different issues, we adopted a strategy combining approaches of phytochemistry, molecular biology and genetics. First, we studied global metabolic changes caused by the application of two environmental stresses, ozone and mechanical wounding, on parsnip. The obtained results allowed us to identify 40 metabolites differentially accumulated under these conditions, including some furocoumarins. Subsequently, we focused our study on these molecules by evaluating their accumulation profiles under mechanical wounding stress condition, using differential analyzes. From this data, we initiated the search and identification of candidate genes potentially involved in this pathway based on transcriptomic and genomic parsnip libraries analyses. The function of the selected genes was evaluated by heterologous expression approach in yeast. In parallel to this work, we have developed a strategy to better understand the metabolic cost of specialized metabolites synthesis. To do this, we have adapted a multigene cloning method to furocoumarines, allowing to transfer several genes involved in the same pathway in a plant, in a single operation. This method allowed us to initiate the generation of stable lines having integrated the first two genes of the pathway. These plants will be compared to wild plants and will thus allow to study the metabolic and physiological costs of the introduction of this new biosynthetic pathway and its benefits in terms of plant defense

Les plantes sont soumises durant leur vie à de nombreux stress environnementaux. Face à ces contraintes, les végétaux ont développé au cours de l'évolution différentes stratégies. La plus emblématique est la mise en place du métabolisme spécialisé, représenté par une grande diversité chimique et fonctionnelle. Bien que ce métabolisme soit de plus en plus étudié ces dernières années, de nombreuses lacunes persistes à son propos, liées notamment (i) à la complexité des modifications métabolomiques engendrées par la perception de stress, (ii) aux coûts et avantages que ces métabolites imputent à la plante les accumulant, et (iii) aux voies métaboliques menant à cette diversité de composés. Pour appréhender ces différentes problématiques, nous avons adopté une stratégie combinant des approches de phytochimie, de biologie moléculaire et de génétique. Dans un premier temps, nous avons étudié les changements métaboliques globaux engendrés par l’application de deux stress environnementaux, l’ozone et la blessure mécanique, sur une plante modèle au laboratoire, le panais, en fonction du temps. Les résultats de ces travaux nous ont permis d’identifier 40 métabolites différentiellement accumulés dans ces conditions, dont certaines furocoumarines. Par la suite, nous avons focalisé notre étude sur ces molécules en évaluant leurs profils d’accumulation, en condition de stress par blessures mécaniques, par la biais d’analyses différentielles. A partir de ces données, nous avons initié la recherche et l'identification de gènes candidats potentiellement impliqués dans cette voie à partir de plusieurs banques transcriptomiques et génomiques de panais. La fonction des gènes sélectionnés a été évalué par des approches d'expression hétérologue dans la levure. En parallèle de ces travaux, nous avons développé une stratégie destinée à mieux comprendre le coût métabolique de la synthèse de métabolites spécialisés. Pour ce faire, nous avons adapté aux furocoumarines une technique de clonage multigénique permettant de transférer dans une plante, et en une seule opération, plusieurs gènes impliqués dans la même voie de biosynthèse. Cette méthode nous a permis d'initier la génération de lignées stables ayant intégré les deux premiers gènes de la voie. Ces plantes seront comparées à des plantes sauvages et permettront ainsi d’étudier les coûts métaboliques et physiologiques de l’introduction de cette nouvelle voie de biosynthèse ainsi que ses bénéfices en termes de défense de la plante
Plants are subjected to many environmental stresses during their life. Faced with these constraints, plants have developed different strategies during their evolution. The most emblematic is the establishment of a specialized metabolism, represented by a great chemical and functional diversity. Although this metabolism has been studied more and more in recent years, many gaps remain, related in particular (i) to the complexity of the metabolomic changes generated by the perception of stress, (ii) to the costs and benefits that these metabolites impute to the producing plant, and (iii) to the metabolic pathways leading to the diversity of compounds. To cope with these different issues, we adopted a strategy combining approaches of phytochemistry, molecular biology and genetics. First, we studied global metabolic changes caused by the application of two environmental stresses, ozone and mechanical wounding, on parsnip. The obtained results allowed us to identify 40 metabolites differentially accumulated under these conditions, including some furocoumarins. Subsequently, we focused our study on these molecules by evaluating their accumulation profiles under mechanical wounding stress condition, using differential analyzes. From this data, we initiated the search and identification of candidate genes potentially involved in this pathway based on transcriptomic and genomic parsnip libraries analyses. The function of the selected genes was evaluated by heterologous expression approach in yeast. In parallel to this work, we have developed a strategy to better understand the metabolic cost of specialized metabolites synthesis. To do this, we have adapted a multigene cloning method to furocoumarines, allowing to transfer several genes involved in the same pathway in a plant, in a single operation. This method allowed us to initiate the generation of stable lines having integrated the first two genes of the pathway. These plants will be compared to wild plants and will thus allow to study the metabolic and physiological costs of the introduction of this new biosynthetic pathway and its benefits in terms of plant defense

Les furocoumarines sont des composés phénoliques impliqués dans la défense contre les herbivores. Ces molécules sont majoritairement décrites dans quatre familles botaniques, notamment les Rutaceae, dont font partie les agrumes. Ces molécules sont phototoxiques ce qui peut poser des problèmes pour leur utilisation comme par exemple en cosmétique ou en phytothérapie. D’autre part, en cas d’ingestion par exemple via la consommation de jus de certains agrumes, elles ont responsables de l’inhibition d’enzymes de détoxication comme le CYP3A4 humain. Cela peut conduire à des surdosages médicamenteux connus sous le nom d’Effet Pomelo. Ce travail de thèse a consisté à réfléchir et à développer, des outils qui permettront de générer de manière ciblée des variétés de pomelo qui ne produisent plus de furocoumarines. Nous avons abordé l’ensemble des étapes essentielles pour la mise en place d’une stratégie global : i) des méthodes reproductibles ont été développées pour la production de protoplastes et de cultures cellulaires de pomelo Star Ruby ; ii) des conditions de transformation de protoplastes par électroporation ont également été mises au point ; iii) finalement, pour inhiber de manière spécifique la voie de biosynthèse des furocoumarines, nous avons choisi de mettre en œuvre une approche d’édition de génome en utilisant une méthodologie CRISPR/Cas9. La mise au point de la méthode a été réalisée avec un gène codant pour une umbelliferone 6-dimethylallyl transférase. Les résultats obtenus indiquent que la stratégie est envisageable. Pour renforcer la stratégie CRISPR/Cas9, nous avons mis en œuvre une démarche d’identification de gènes cibles additionnels. En utilisant une approche de data mining de bases de données génomiques et transcriptomiques nous avons identifié 18 séquences candidates, potentiellement impliquées dans la voie de biosynthèse des furocoumarines. L’expression hétérologue des protéines correspondantes et leur caractérisation fonctionnelle a permis de montrer que CYP706J12 est en mesure de métaboliser l’hérniarine, une coumarine. Ce résultat apporte des éléments pour émettre des hypothèses sur l’évolution convergente de la synthèse des coumarines et des furocoumarines chez les végétaux supérieurs
Furanocoumarins are phenolic compounds involved in defense against herbivores. These molecules are mainly described in four botanical families. Rutaceae, one of those families, includes Citrus species. Furanocoumarins are phototoxic compounds, which can be problematic for their use in cosmetics or in phytotherapy. Furanocoumarin ingestion via citrus juice consumption, may inhibit human enzymes of detoxification, such as human CYP3A4. This can lead to drug overdoses known as the “Grapefruit Juice Effect”. This work consisted in the development of tools that will allow to generate new varieties of pomelo that no longer produce furanocoumarins by targeted genome edition. We have covered the essential steps for the implementation of a global strategy: i) reproducible methods have been developed for the production of protoplasts and cell cultures of Star Ruby grapefruit; ii) conditions for protoplast transformation by electroporation have also been developed; iii) finally, to specifically inhibit the furanocoumarin biosynthetic pathway, we chose to implement a genome editing approach using a CRISPR / Cas9 methodology. The development of the method was carried out with a gene encoding umbelliferon 6-dimethylallyltransferase. The results obtained indicate that the strategy is feasible. To strengthen the CRISPR / Cas9 strategy, we implemented a method to identify additional target genes. Using a data mining approach of available genomic and transcriptomic databases we identified 18 candidate sequences potentially involved in the furanocoumarin biosynthetic pathway. Heterologous expression of the corresponding proteins and their functional characterization made it possible to show that CYP706J12 is able to metabolize herniarin (a coumarin). This result provides elements to hypothesize about the convergent evolution of coumarin and furanocoumarin synthesis in higher plants

Les furocoumarines sont des composés phénoliques impliqués dans la défense contre les herbivores. Ces molécules sont majoritairement décrites dans quatre familles botaniques, notamment les Rutaceae, dont font partie les agrumes. Ces molécules sont phototoxiques ce qui peut poser des problèmes pour leur utilisation comme par exemple en cosmétique ou en phytothérapie. D’autre part, en cas d’ingestion par exemple via la consommation de jus de certains agrumes, elles ont responsables de l’inhibition d’enzymes de détoxication comme le CYP3A4 humain. Cela peut conduire à des surdosages médicamenteux connus sous le nom d’Effet Pomelo. Ce travail de thèse a consisté à réfléchir et à développer, des outils qui permettront de générer de manière ciblée des variétés de pomelo qui ne produisent plus de furocoumarines. Nous avons abordé l’ensemble des étapes essentielles pour la mise en place d’une stratégie global : i) des méthodes reproductibles ont été développées pour la production de protoplastes et de cultures cellulaires de pomelo Star Ruby ; ii) des conditions de transformation de protoplastes par électroporation ont également été mises au point ; iii) finalement, pour inhiber de manière spécifique la voie de biosynthèse des furocoumarines, nous avons choisi de mettre en œuvre une approche d’édition de génome en utilisant une méthodologie CRISPR/Cas9. La mise au point de la méthode a été réalisée avec un gène codant pour une umbelliferone 6-dimethylallyl transférase. Les résultats obtenus indiquent que la stratégie est envisageable. Pour renforcer la stratégie CRISPR/Cas9, nous avons mis en œuvre une démarche d’identification de gènes cibles additionnels. En utilisant une approche de data mining de bases de données génomiques et transcriptomiques nous avons identifié 18 séquences candidates, potentiellement impliquées dans la voie de biosynthèse des furocoumarines. L’expression hétérologue des protéines correspondantes et leur caractérisation fonctionnelle a permis de montrer que CYP706J12 est en mesure de métaboliser l’hérniarine, une coumarine. Ce résultat apporte des éléments pour émettre des hypothèses sur l’évolution convergente de la synthèse des coumarines et des furocoumarines chez les végétaux supérieurs
Furanocoumarins are phenolic compounds involved in defense against herbivores. These molecules are mainly described in four botanical families. Rutaceae, one of those families, includes Citrus species. Furanocoumarins are phototoxic compounds, which can be problematic for their use in cosmetics or in phytotherapy. Furanocoumarin ingestion via citrus juice consumption, may inhibit human enzymes of detoxification, such as human CYP3A4. This can lead to drug overdoses known as the “Grapefruit Juice Effect”. This work consisted in the development of tools that will allow to generate new varieties of pomelo that no longer produce furanocoumarins by targeted genome edition. We have covered the essential steps for the implementation of a global strategy: i) reproducible methods have been developed for the production of protoplasts and cell cultures of Star Ruby grapefruit; ii) conditions for protoplast transformation by electroporation have also been developed; iii) finally, to specifically inhibit the furanocoumarin biosynthetic pathway, we chose to implement a genome editing approach using a CRISPR / Cas9 methodology. The development of the method was carried out with a gene encoding umbelliferon 6-dimethylallyltransferase. The results obtained indicate that the strategy is feasible. To strengthen the CRISPR / Cas9 strategy, we implemented a method to identify additional target genes. Using a data mining approach of available genomic and transcriptomic databases we identified 18 candidate sequences potentially involved in the furanocoumarin biosynthetic pathway. Heterologous expression of the corresponding proteins and their functional characterization made it possible to show that CYP706J12 is able to metabolize herniarin (a coumarin). This result provides elements to hypothesize about the convergent evolution of coumarin and furanocoumarin synthesis in higher plants

Submitted by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-15T20:06:22Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Karinna Bannach Reis.pdf: 3955087 bytes, checksum: fbfd1023491588a9a5495cd281d72a41 (MD5)
Approved for entry into archive by Jaqueline Silva (jtas29@gmail.com) on 2014-09-15T20:06:45Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Karinna Bannach Reis.pdf: 3955087 bytes, checksum: fbfd1023491588a9a5495cd281d72a41 (MD5)
Made available in DSpace on 2014-09-15T20:06:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertação Karinna Bannach Reis.pdf: 3955087 bytes, checksum: fbfd1023491588a9a5495cd281d72a41 (MD5) Previous issue date: 2013-12-18
Ruta graveolens has been successfully applied for many human diseases treatment and promises a well succeed alternative for plant diseases control because it has also phytoalexins in its composition. The aim of this study was to standardise the R. graveolens liquid extract and evaluate its potential for controlling rice (Oryza sativa) leaf blast (Magnaporthe oryzae). The drug has been characterized, the liquid extract obtained and the methodology for quantifying the standards components, furanocoumarins psoralen and bergapten, validated by high performance liquide chromatography. The components of essential oil obtained from standardized liquid extract were characterized by gas chromatography-mass spectrometry. In a completely randomized design, conducted in artificial hydrophobic surface with three replications and eleven treatments composed of M. oryzae conidial suspension (105 con.ml-1) mixed with R. graveolens standardized extract (0.01 to 0.10 g.mL-1), or furocoumarins psoralen (0.18 to 1.82 μg. mL-1), or bergapten (0.29 to 2.91 μg. mL-1), or water (control). It was evaluated the inhibition of conidial germination and appressorium formation and the median lethal dose (LD50). A second assay, in a completely randomized design in three replications was conducted in greenhouse conditions. It was composed of 21 days old rice plants, which were sprayed with a mixture containing M. oryzae conidial suspension (3x105 con.ml-1) and R. graveolens extract, without dilution, or furocoumarins psoralen (18.26 μg. mL-1), or bergapten (29.14 μg. mL-1), or water (control). Nine days after inoculation, leaf blast severity was scored with a diagrammatic scale, the data were statistically analyzed and means compared. The standardized plant extract inhibited M. oryzae conidial germination (LD50=0.237mg) and appressorium formation (LD50=0.121 mg) up to 100% and reduced 80.84% of leaf blast. By fluorescence microscopy it was possible to observe that standardized plant extract did not damage M. oryzae cell wall and plasma membrane, indicating another type of interaction to inhibit conidia development. Isolated standards furanocoumarins psoralen and bergapten did not inhibit conidial germination and appressorium formation and reduce leaf blast severity proportionally, suggesting that synergistic interactions between extract and essential oil components were responsible for the success of R. graveolens in suppressing rice disease, making it an alternative to compose rice blast management.
Ruta graveolens é utilizada com sucesso no tratamento de diversas patologias humanas e possui potencial para o controle alternativo de fitopatógenos, pois também apresenta fitoalexinas em sua composição. O objetivo deste estudo foi padronizar o extrato vegetal líquido de R. graveolens e avaliar seu potencial para o controle da brusone foliar. O material vegetal foi caracterizado, o extrato líquido obtido e a metodologia para a quantificação dos padrões psoraleno e bergapteno foi validada por cromatografia líquida de alta eficiência. Os componentes do óleo essencial obtidos a partir do extrato líquido padronizado foram caracterizados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. No ensaio conduzido em superfície hidrofóbica artificial, com três repetições e onze tratamentos, 10 μL da suspensão de conídios de Magnaporthe oryzae (105 con/mL) foram misturadas com o extrato vegetal padronizado (0,01 a 0,10 g/mL), ou as furanocumarinas psoraleno (0,18 a 1,82 μg/mL) e bergapteno (0,29 a 2,91 μg/mL), ou água (controle). Avaliou-se a inibição da germinação conidial e da formação dos apressórios determinando-se a dose letal capaz de inibir 50% dos indivíduos (DL50). No experimento conduzido em casa de vegetação e com três repetições, plantas de arroz com 21 dias após plantio foram pulverizadas com uma suspensão de conídios de M. oryzae (3x105 com/mL) misturada com extrato vegetal padronizado sem diluição, ou psoraleno (18,26 μg/mL), ou bergapteno (29,14 μg/mL), ou água (controle). Após nove dias da inoculação, avaliou-se a severidade de brusone foliar com uma escala de 10 graus, os dados foram analisados estatisticamente e as médias comparadas. O extrato vegetal padronizado inibiu a formação de tubo germinativo (DL50= 0,237 mg) e a formação de apressório (DL50= 0,121 mg) de M. oryzae em até 100%, e reduziu a severidade de brusone nas folhas em 80,84%. Através de microscopia de fluorescência, não foi observada ação do extrato padronizado em membrana plasmática e parede celular de M. oryzae, o que indica outro tipo de interação para inibir o desenvolvimento do conídio. Os padrões psoraleno e bergapteno não inibiram proporcionalmente a germinação e a formação de apressório, como também não reduziram a severidade de brusone nas folhas em sua forma isolada, o que sugere que interações sinérgicas entre os diversos componentes do extrato e do óleo essencial de R. graveolens foram responsáveis pelo sucesso do extrato padronizado em suprimir a brusone foliar, tornando-o uma alternativa para compor o manejo de brusone em arroz.

碩士
中國醫藥大學
中國藥學研究所碩士班
94
The present study was firstly designed to investigate the inhibitory effects of the crude extract of Psoraleae Fructus and its fractions on the AChE activity in vitro. The results showed that the crude extract and its fractions inhibited AChE activity. Furthermore, I evaluated the performance impairment of both the passive avoidance test and the Morris water maze test induced by scopolamine in rats. I found that the crude extract and its fractions could ameliorate scopolamine-induced amnesia, and the chloroform and ethylacetate- fractions were better than other fractions. Next, I analyzed the amounts of psoralen and isopsoralen in the crude extract and its fractions by HPLC. The result showed the amounts of psoralen and isopsoralen in the chloroform- fraction were more than those of other fractions. Furtherover, I evaluated the AChE inhibitory activity of psoralen and isopsoralen in vitro and investigated the ameliorating effects of psoralen and isopsoralen on scopolamine-induced performance impairment in rats. The results showed psoralen and isopsoralen could ameliorate scopolamine-induced amnesia in rats. Psoralen was better than isopsoralen. Finally, I evaluated the role of central cholinergic and monoaminergic neuronal system in the ameliorating effects of psoralen and isopsoralen on scopolamine-induced performance impairment. The results showed only psoralen inhibited hippocampal AChE acvitity in rats. I also found that psoralen and isopsoralen increased hippocampal dopamine and serotonin levels, and cortical norepinephrine and epinephrine levels in rats. According to the above results, psoralen and isopsoralen are two active components of Psoraleae Fructus on the reversal from scopolamine-induced performance impairment. It suggests that the ameliorateing effects of psoralen is related to activating the central cholinergic neuronal system via inhibiting AChE activity, and monoaminergic neuronal system via increasing hippocampal DA and 5-HT levels, and cortical NE and EPI levels.

碩士
臺北醫學大學
藥學系
94
In this study, the composition of five furanocoumarins in four Citrus fruit (grapefruit, pomelo I, pomelo II, and shaddock) juices and ten Chinese herbal medicine (Bai-Zhi, Qiang-Huo, Du-Huo, Fang-Feng, Dang-gui, Huang-Qin, Gan-Cao, Ge-Gen, Yin-Chen-Hao, and Chen-Pi) extracts in water or alcohol have been investigated. A rapid and sensitive high-performance liquid chromatography (HPLC) method for quantitation of five major furanocoumarins (bergamottin, DHBG, bergapten, bergaptol and psoralen) was developed and validated. This method was applied to analyze the composition of five furanocoumarins in four Citrus fruit juices and ten Chinese herbal medicine extracts in water or alcohol. Results showed that five major furanocoumarins except bergapten were detected in grapefruit, pomelo I and pomelo II and the highest amount of these components found in the grapefruit juice. In the ten Chinese herbal medicines, five furanocoumarins were not detected in Ge-Gen and Yin-Chen-Hao, while the rest of herbs contained various compositions and amounts of furanocoumarins. Furthermore, the inhibitory effects on nifedipine dehydrogenation by CYP3A4 were evaluated for the four Citrus fruit juices and ten Chinese herbal medicines extracts in water or alcohol. Results show that all Citrus fruits juices exhibited CYP3A4 inhibitory effects on the metabolism of nifedipine. Among ten herbal medicines, both water and alcohol extracts of Huang-Qin demonstrated the greatest inhibition on CYP3A4 activity. In addition, Umbelliferous herbs including Bai-Zhi, Qiang-Huo, and Du-Huo also showed significant inhibitory potencies on CYP3A4 activity. Our results indicated that the inhibitory potency is in direct proportional to the abundant and different composition of the furanocoumarins in Citrus fruit juices and Umbelliferous herbs. However, the content of furanocoumarins were found to be very low or even undetectable in Huang-Qin and herbs not belong to Umbelliferae family, their inhibitory effect could be attributed to the dimeric forms of furanocoumarins or other unidentified components (eg. flavonoid).

博士
臺北醫學大學
藥學系(博士班)
96
An attempt made in this study was to predict the potential for metabolic interactions of herbal extracts of drugs based on their chromatographic profiles in reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) analysis. Twenty-nine structurally related furanocoumarin compounds with known effect on cytochrome P450 3A4 (CYP3A4), which is important for phase-I drug metabolism, were selected as a model system, and analyzed using an RP-HPLC system developed for this study. Log values of the partition coefficients (log P) of these furanocoumarin derivatives calculated using Molsuite 2000 molecular modeling pro plus software (ChemSW®) were used to interpolate the capacity factors from a validated correlation curve constructed using five standard references that covered the elution time range in the RP-HPLC analysis system developed in the lab. The obtained correlations were then used to estimate the capacity factor for all of the furanocoumarin derivatives collected from the literatures with reported herb-drug interaction activity in CYP3A4. The capacity factors for most of the furanocoumarins were between 1.65 and 10.57 (with retention times of 10~40 min), a range approximately equivalent to fractions 3 to 8 (Fr3~8) in the RP-HPLC fraction analysis. Each fraction was examined for its inhibition of microsomal nifedipine oxidation represented as the CYP3A4 inhibitory potency. Ru was designated the total response unit and expressed as Ru = R / 7.79 ?e 105; this was calculated for each single peak or each fraction in terms of the sum of the peak area (R) for all chromatographic peaks appearing in the chromatographic analysis. A sigmoidal relationship was established between the CYP3A4 inhibitory potency (y) and the RP-HPLC peak response unit (Ru，x) as y = 85.36 x (14.86 + x)-1 with a correlation coefficient of 0.63. The sigmoidal curve could be divided into three ranges designated low, medium, and high risk that were used to indicate the relative inhibitory potency of the metabolic interactions of herbs or traditional Chinese herb medicines with CYP3A4. These predictive classifications provide information and might be useful for “risk category” decisions concerning herb-drug interactions.

La berce du Caucase (Heracleum mantegazzianum) est une plante invasive importée par l’homme au Québec et identifiée dans cette province pour la première fois en 1982. En plus du problème écologique qu’elle peut poser, un contact cutané avec cette plante, suivi d’une exposition au soleil provoque des dermatites sévères. Ces inflammations peuvent être très douloureuses et même conduire à des brûlures du deuxième et du troisième degré. La berce du Caucase, comme un grand nombre d’Apiacées, comporte des molécules photosensibilisantes : les furanocoumarines. Ces composés sont responsables de l’activité phototoxique de cette plante et sont retrouvés dans tous ses organes. L’analyse de la composition et de la concentration en furanocoumarine de la berce pourrait donc permettre d’estimer son niveau de toxicité. L’objectif de ce projet de maîtrise était d’étudier les variations régionales de concentration et de composition en furanocoumarines de la berce du Caucase au Québec. Ce projet visait tout d’abord à identifier les populations les plus toxiques, afin de connaitre les zones où le risque de photodermatite est le plus élevé. De plus, l’autre objectif de ces travaux, plus fondamental, était d’étudier les variables influençant le contenu en furanocoumarines de cette plante, que ce soit la diversité génétique entre les populations mais aussi les facteurs environnementaux. Au cours de ce projet, une méthode d’extraction et de dosage analytique des furanocoumarines a été développée afin d’analyser 125 échantillons de feuilles de berce du Caucase récoltés à travers onze régions du Québec. Puis, des analyses statistiques par ANOVA et régressions multiples ont été réalisées afin d’analyser les variations de teneur et de composition en furanocoumarines. Ainsi, l’existence de variations régionales de concentrations en furanocoumarines dans les populations du Québec a pu être montrée, mais aussi des variations dans la proportion de ces molécules. Les régions de la Capitale-Nationale, le Centre-du-Québec et les Chaudière-Appalaches comportaient les populations les plus riches en furanocoumarines, et donc théoriquement les plus phototoxiques pour l’année étudiée. Les variations observées sont principalement expliquées par les différences de conditions environnementales existantes entre les régions. Les précipitations d’avril font augmenter la concentration totale en furanocoumarines, tandis que cette dernière diminue quand les précipitations du mois de mai augmentent. Une relation significative a été observée entre les proportions de deux molécules (le psoralène et l’angélicine) et la concentration totale en furanocoumarines. En effet, les individus, ayant une concentration en furanocoumarines plus élevée, présentent un pourcentage de psoralène plus important et un pourcentage d’angélicine plus faible. En bref, ce projet de maîtrise a permis d’accroitre les connaissances sur l’aspect chimique et écologique de la berce du Caucase, mais a aussi permis d’identifier les régions où cette espèce est potentiellement la plus dangereuse pour l’homme, de par une concentration plus élevée en furanocoumarines.