Dissertations / Theses on the topic 'Gène LUNA'

L’infection primaire par le cytomégalovirus (CMV) humain est asymptomatique. Le sujet infecté reste cependant porteur du virus à l’état latent. Le CMV ne se réactive que sporadiquement chez l’individu immunocompétent. Chez les patients immunodéprimés, la réactivation du CMV peut induire des maladies à CMV touchant des organes vitaux et peut mettre en jeu le pronostic vital du patient. Les traitements standards sont efficaces mais leurs effets secondaires et l’apparition de souches virales résistantes relancent l’engouement pour le développement de nouvelles thérapies. Lors de ma thèse, j’ai utilisé le système CRISPR/Cas9 afin de déstabiliser le génome du CMV. Nous avons choisi de cibler le gène UL122/UL123 codant pour les molécules immediate early essentielles au cycle lytique réplicatif et à la sortie de la latence. Nous avons comparé deux stratégies utilisant soit un soit trois gRNAs, respectivement appelées singleplex et multiplex ciblant ce même gène. Alors que le singleplex induit des insertions et délétions au site de coupure du gRNA, la stratégie multiplex induit la délétion de 3500 paires de bases du gène ciblé. De ce fait, la stratégie multiplex bloque efficacement l’expression du gène ciblé, la réplication virale et le relargage de nouveaux virions. Une autre stratégie a été développée pour cibler spécifiquement le génome à l’état latent. Les deux régions homologues TR et le gène LUNA sont ciblés par deux gRNAs. Cette seconde stratégie résulte elle aussi en une diminution du nombre de copies de génome viral lors du cycle lytique de réplication. Il est désormais possible d’envisager de nouvelles solutions thérapeutiques anti-HCMV avec la stratégie CRISPR/Cas9
The human cytomegalovirus (HCMV) primary infection is usually asymptomatic but leads to latent infection of blood progenitor cells. Immunocompromised patients are at high risks of HCMV reactivation, which is associated with severe end organ diseases and increased mortality in transplant patients. Standard anti-viral treatments based on nucleotide analogues decreased the occurrence of HCMV reactivation and diseases, but induce side effects and drug-resistant viral strains. In this thesis, we introduced new anti-viral approaches based on the CRISPR/Cas9 gene editing tool. Two strategies are designed to target the UL122/123 gene of HCMV encoding the immediate early proteins, essential for lytic viral replication and reactivation from latency. We validated that the disruption of the UL122/123 gene by the CRISPR/Cas9 system to abrogate viral replication. The multiplex CRISPR/Cas9 system (three gRNA) was much more efficient than the singleplex approach targeting the same gene. Target gene expression, concomitant genome replication and virion release were significantly impaired by the multiplex strategy. A further anti-HCMV CRISPR/Cas9 system was developed specifically to target the HCMV genome during latency. Two gRNAs target the viral genome at three target sites: LUNA, essential for reactivation, and the two homolog TR regions. We verified this duplex strategy on the lytic replicating virus and detected mutations at the target site as well as the reduction of viral genome copy number. In conclusion, the anti-HCMV strategies based on two or three gRNAs efficiently blocked viral replication. This provides the basis for the development of an anti-HCMV CRISPR/Cas9 therapy

Dans de nombreux cancers, l’expression du gène Fhit (Fragile Histidine Triad) estfréquemment altérée. Fhit est décrit comme un important gène suppresseur de tumeur de parson rôle pro-apoptotique et anti-prolifératif. Nous avons mis en évidence que, in vivo et invitro, la diminution de l’expression de Fhit est associée au caractère infiltrant des cellulestumorales bronchiques, ce qui suggère que Fhit pourrait être impliqué dans le processusd’invasion tumorale. Nous avons en effet montré que la surexpression et l’inhibition de Fhitinduisent respectivement une diminution et une augmentation des capacités migratoires etinvasives des cellules bronchiques. Nous avons aussi mis en évidence que Fhit contrôlel’invasion des cellules tumorales bronchiques en régulant l’expression d’éléments clés de latransition épithélio-mésenchymateuse (TEM) tels que l’organisation des jonctions serrées etadhérentes, l’expression des métalloprotéinases matricielles et de la vimentine. De plus, Fhitrégule la TEM via une cascade de signalisation impliquant le récepteur au TGF-β, lesrécepteurs à tyrosine kinase (RTK), Src, Erk et Slug. Le double rôle de Fhit en tant quesuppresseur de tumeur et d’invasion renforce l’idée que Fhit pourrait représenter un nouveaubiomarqueur d’agressivité tumorale et pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutiquedans le traitement des cancers broncho-pulmonaires
In many types of cancers, Fhit (Fragile histidine triad) expression is frequentlydecreased or lost. Fhit is described as a tumor suppressor gene by its ability to induceapoptosis and to inhibit proliferation of tumor cells. We have demonstrated that a low Fhitexpression is associated with in vivo and in vitro invasiveness of lung tumor cells. Then, wehave shown that Fhit controls the invasive phenotype of lung tumor cells by regulating keyelements of epithelial-mesenchymal transition (EMT) such as cell-cell adhesion molecules,matrix metalloproteinase and vimentin expression. Our results provide also evidence that Fhitcontrols EMT by regulating several signaling pathways implying TGF-βR, RTK, Src, ERKand Slug. The dual function of Fhit as a tumor and invasion suppressor gene strengthens theidea that Fhit could represent a new biomarker of aggressiveness of lung cancer and couldconstitute a new therapeutic target to limit tumor progression

Les mutations du gène codant pour la protéine C (SP-C) du surfactant pulmonaire (SFTPC) sont à l’origine de pathologies interstitielles chroniques du nourrisson, de l’enfant mais également de l’adulte. Une importante hétérogénéité phénotypique est cependant observée, y compris au sein d’une même famille. Par un épissage alternatif, le gène SFTPC permet la synthèse de deux isoformes du précurseur protéique de SP-C (proSP-C) pour aboutir à la protéine mature après plusieurs modifications post-traductionnelles. Les conséquences des mutations de SFTPC sur l'homéostasie du surfactant ne sont pas clairement élucidées, mais il semble que le mauvais repliement de la protéine soit une caractéristique commune. A l’issue de nos travaux antérieurs, nous avons mis en évidence un effet de certaines mutations et de polymorphismes sur l’épissage de SFTPC faisant ainsi varier significativement l’expression de chacune des deux isoformes protéiques, sans qu’à l’heure actuelle nous ne connaissions le rôle de chacune dans la synthèse de la protéine SP-C mature. Notre projet, s’inscrivant dans la continuité de mon master 2, a pour but de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques pré et post-transcriptionnels associés aux variations de SFTPC et leurs conséquences sur le développement des pneumopathies interstitielles. Le premier axe de notre projet repose sur l’étude in vitro (lignées cellulaires) et in vivo (modèle murin, ARN des patients) des variations de chacun des isoformes. Dans un second axe, nous souhaitons poursuivre l'étude de facteurs pouvant influencer le phénotype des patients porteurs de mutations du gène SFTPC, qu'ils soient d'origine externes (infections virales et bactériennes ou environnementaux comme le tabac) ou génétique. Collectivement, ces études nous permettrons de fournir une signature moléculaire pour cette maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’en améliorer le pronostic mais également la prise en charge et la qualité de vie des patients
Surfactant pathologies linked to mutations in the SFTPC gene, via autosomal dominant transmission, are most commonly associated with diffuse interstitial diseases in infants, children and adults, and may also be responsible for acute respiratory distress syndrome in newborns. They are most often accompanied by a high morbidity and mortality rate, thus rendering early diagnosis essential for ideal intervention and support. Mutations in the SFTPC gene lead to alveolar and intracellular accumulation of an abnormal form of the precursor protein SP-C (ProSP-C), which is responsible for the resulting tissue damage. However, the pathophysiological mechanisms are not yet completely deciphered. The gene encodes two isoforms of ProSP-C from three alternative transcripts. The expression level of each is currently unknown and the vast majority of studies evaluating the effect of mutations are performed on only one isoform. Incidentally, our preliminary results on the analysis of RNA extracted from bronchoalveolar washing, both from control subjects and patients harboring a mutation, show that the all three SFTPC transcripts are expressed and that the presence of a mutation is associated with a variation in the expression levels of the transcripts. The aim of my project is to study the expression level of SFTPC transcripts and ProSP-C isoforms from the heterologous expression of the SFTPC gene (exons and introns) in cell lines. I will beanalyzing the post-translational maturation profile of these pro-proteins and evaluating the effect of the mutations on their expression and maturation in both our cellular models and in vivo with two Knock-in mice models.A better understanding of the pathophysiology of genetic abnormalities associated with mutations in the SFTPC gene will not only greatly contribute to earlier management of patients, but also it will help in modifying the progression of lung injury and its prognosis

La cachexie est un syndrome clinique et métabolique caractérisé par une perte de tissu adipeux et de tissu musculaire, fréquemment observé chez les patients atteints de cancer. La myostatine (Mstn) régule négativement la masse musculaire. Bien que la régulation des mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la masse musculaire joue un rôle central dans la cachexie associée au cancer, les relations existant entre la Mstn et les mécanismes physiopathologiques restent largement inconnues. Suite à l'inoculation de cellules Lewis lung carcinoma (LLC) à des souris, nous avons montré que l'invalidation du gène de la Mstn (souris Mstn-/-) confère une résistance au développement de la cachexie associée au cancer par rapport à des souris sauvages. La déficience en Mstn prévient la perte de masse musculaire et réduit la croissance tumorale, 35 jours après l'injection des cellules LLC, et est associée à un allongement de la durée de vie des souris. L'invalidation du gène de la Mstn provoque aussi une augmentation de l'apoptose des cellules LLC et une diminution de l'expression de gènes impliqués dans la prolifération et le métabolisme tumoraux. L'activation des systèmes protéolytiques ubiquitine-protéasome et autophagie-lysosome, due au développement tumoral, est réduite voire supprimée dans le muscle des souris Mstn-/-. L'accumulation de céramides intramusculaires, un sphingolipide formé suite à une lipolyse exacerbée, est corrélée à la perte de masse musculaire, suggérant que les céramides pourraient être un médiateur cellulaire impliqué dans la cachexie associée au cancer. Ces résultats montrent que la Mstn joue un rôle essentiel dans la cachexie associée au cancer

La neurofibromine, produit du gène NF1, agit comme un inhibiteur de la voie RAS-MAPK (Mitogen-activated protein kinases), voie majeure de la cancérogenèse. Le gène NF1 est donc un gène suppresseur de tumeurs. Des mutations constitutionnelles hétérozygotes perte-de-fonction de NF1 causent la neurofibromatose de type 1 (NF1 ; MIM#162200). Cette maladie rare prédispose notamment au développement de tumeurs des gaines nerveuses. Des mutations somatiques de NF1 ont par ailleurs été décrites dans des cancers sporadiques, hors contexte de neurofibromatose. Des données récentes de la littérature confirment que NF1 est un gène suppresseur de tumeurs crucial en oncologie. L'implication de la voie RAS-MAPK dans les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) est bien caractérisée avec la mise en évidence de mutations somatiques activatrices spécifiques de la voie, notamment des oncogènes EGFR, KRAS et BRAF dans les adénocarcinomes pulmonaires. Cependant, l'implication du gène NF1 a été peu étudiée dans les CBNPC. Nous avons confirmé l'implication de NF1 dans le développement des adénocarcinomes bronchiques par une approche ciblée de NGS (Next Generation Sequencing) sur une cohorte de 138 échantillons tumoraux : 36 altérations somatiques (26%) de NF1 ont été retrouvées dont 25 mutations ponctuelles (parmi lesquelles 4 homozygotes) et 11 délétions. Ces altérations étaient majoritairement exclusives de mutations affectant d'autres effecteurs de la voie RAS-MAPK. Il était retrouvé un nombre plus important d'altérations de NF1 dans les échantillons de patients ayant reçu une chimiothérapie. Une corrélation génotype-phénotype a pu être établie : il s'agissait en majorité d'hommes (72%), fumeurs (75%) avec une survie sans progression et une survie globale significativement meilleures que les patients KRAS mutés. Afin de déterminer les conséquences fonctionnelles des altérations de NF1, nous avons établi des modèles cellulaires mutés dans NF1 grâce au système d'édition du génome CRISPR/Cas9. Trois lignées de carcinomes bronchiques non à petites cellules ont été modifiées génétiquement. Nous avons notamment évalué les conséquences de l'inactivation bi- ou mono-allélique de NF1 réalisée respectivement par CRISPR/Cas9 et Nickase. Les western blot ont confirmé la perte d'expression partielle ou complète de la neurofibromine en cas de mutations mono- ou bi-alléliques du gène NF1 ainsi qu'une activation de la voie RAS-MAPK avec un ratio pERK/ERK augmenté en cas de mutations. Nous avons observé que les clones NF1-/- présentaient un phénotype plus agressif en termes de migration, invasion et prolifération que les clones NF1+/- ou sauvages. L'analyse différentielle des transcriptomes a montré des profils transcriptomiques distincts en cas d'altérations homozygotes ou hétérozygotes de NF1 ainsi que dans les cellules sauvages ; les profils transcriptomiques des clones sauvages étaient plus proches des clones avec mutations hétérozygotes de NF1. Des approches pharmacologiques in vitro sur nos modèles cellulaires transgéniques pour tester la sensibilité aux inhibiteurs de MEK seuls ou en association avec des inhibiteurs de PIK3CA, ainsi que la validation in vivo sur des modèles de xénogreffes murines sont en cours. Notre étude montre que les CBNPC présentant des altérations somatiques de NF1 constituent une entité clinique et pronostique distincte. L'étude de nos modèles cellulaires permettra (1) d'évaluer l'influence du caractère mono- ou bi-allélique des altérations de NF1 sur les conséquences fonctionnelles et (2) de tester de nouvelles perspectives thérapeutiques qu'il conviendra de confirmer in vivo sur des modèles pré-cliniques
Driver molecular alterations are found in >40% of non-small cell lung cancers (NSCLCs). They specifically target the RAS-MAPK pathway, including the EGFR, KRAS, and BRAF oncogenes. NF1 is a tumor suppressor gene that encodes neurofibromin, an inhibitor of the RAS-MAPK pathway. NF1 mutation detection is challenging owing to the large size of the gene, the presence of numerous pseudogenes, and the absence of mutation hotspot. Recent studies showed that NF1 is a major tumor suppressor gene implicated in carcinogenesis. According to The Cancer Genome Atlas data (TCGA), NF1 somatic mutations are found in ~15% of lung cancer. However, NF1 mutations in NSCLCs are not extensively explored in NSCLCs to date. We hypothesized that NF1 alterations could define a specific NSCLC subtype with distinct clinical and molecular profiles. We performed NF1 analysis using next generation sequencing (NGS) in lung adenocarcinoma surgical specimens with known KRAS, EGFR, TP53, BRAF, HER2, and PIK3CA status. We evaluated the molecular and clinical specificities of NF1 mutated NSCLCs. Then, we established NF1-mutated cellular models from different NF1 wild-type (WT) cell lines, using the CRISPR-Cas9 system. Mono- and bi-allelic NF1 mutations were generated using CRISPR-Cas9 and nickase CRISPR-Cas9 technologies. In vitro functional tests and drug screening were performed using these isogenic cell models. In our series of 138 lung adenocarcinoma specimens, 25 tumours showed NF1 mutations (18%) and 11 showed NF1 deletions (8%). NF1 mutations were rarely associated with other mutations. Most of patients with NF1 alterations were males (72%) and smokers (75%). Overall survival and disease-free survival were statistically better in patients with NF1 alterations patients (N=35) than in KRAS mutated patients (N=30) in univariate analysis. There were more NF1 mutations in patients treated by neoadjuvant chemotherapy (p = 0.01). Then, we established cellular models of NF1-mutated NSCLCs, using nickase and CRISPR-Cas9 technology. Mono- and bi-allelic NF1 mutations were generated. Loss of NF1 expression was confirmed by western blot: partial and total loss-of-expression of neurofibromin was found in mono-allelic and bi-allelic NF1 mutated cell lines, respectively. Using western blot, we showed that pERK/ERK ratio was higher in NF1-mutated cell lines versus WT cell lines, confirming that NF1 loss-of-function triggered RAS-MAPK pathway activation. Homozygous NF1 mutated cells seemed to be more aggressive in vitro compared to heterozygous and WT mutated cells, using migration, invasion, and proliferation tests. Transcriptome analysis confirmed that WT, heterozygous, and homozygous NF1 mutations defined distinct clusters. WT and NF1 heterozygous clones showed closer transcriptional profiles. In vitro pharmacological screens in this isogenic NSCLC model are ongoing using MEK and PIK3CA inhibitors alone and in combination. In vivo pharmacological screen will also be performed on murine PDX models. Our results confirm that NF1 is frequently mutated and represents a distinct molecular and clinical subtype of NSCLCs. A better comprehension of functional consequences of NF1 mutations, including mono- and bi-allelic alterations, may open new avenues for NSCLCs therapy

Chacune de nos cellules possède l’information génétique nécessaire à la constitution de l’organisme entier, mais les cellules différenciées n’expriment qu’un répertoire restreint de gènes. Le contrôle des expressions des gènes apparaît fondamental dans la mise en place et le maintien de l’identité cellulaire. Le contrôle transcriptionnel, premier niveau de régulation de l’expression des gènes, est basé sur l’intégrité de la séquence génique et sur son accessibilité, elle-même conditionnée par les mécanismes épigénétiques contrôlant la dynamique chromatinienne. Dans un contexte pathologique, des altérations génétiques et/ou épigénétiques pourront alors être à l’origine de dérégulations géniques et mener à des fonctions cellulaires altérées. Lors du développement d’un carcinome bronchique, les cellules pulmonaires acquièrent une capacité de prolifération incontrôlée et une résistance accrue à l’apoptose. Ces caractéristiques phénotypiques, bases de la croissance tumorale, sont le reflet des anomalies qui s’accumulent dans le génome des cellules cancéreuses. Aux altérations génétiques somatiques (mutations ponctuelles, remaniements chromosomiques) s’ajoute un bouleversement global du paysage épigénétique, le tout conduisant une crise de l’identité cellulaire et à des dérégulations massives des expressions géniques. Alors que la répression aberrante de gènes (notamment des gènes suppresseurs de tumeur) a été largement étudiée, l’activation ectopique de gènes normalement silencieux demeure un aspect plus méconnu. Notre hypothèse de travail est que les expressions hors-contexte de gènes tissu-spécifiques puissent être non seulement impliquées dans le phénomène de cancérogenèse, mais également constituer des biomarqueurs tumoraux ou cibles thérapeutiques innovantes. Dans cette thèse, notre attention s’est portée sur le gène PRL codant la prolactine, normalement exprimée dans l’hypophyse et absente du poumon non tumoral. Nous avons détecté une activation ectopique du gène PRL dans 10% des tumeurs pulmonaires, principalement des tumeurs neuroendocrines. Nous avons observé que l’expression de PRL est associée à des tumeurs particulièrement agressives et à un pronostic sombre pour les patients. Nous avons également démontré que l’expression de PRL confère aux cellules cancéreuses pulmonaires une résistance accrue à un stress génotoxique. De manière inattendue, nos résultats suggèrent que l’effet oncogène de l’expression de PRL ne repose pas sur les mécanismes d’action classique de la prolactine et nous avons dû remettre en question l’hypothèse initiale d’une sécrétion de l’hormone par les cellules cancéreuses pulmonaires et d’une action autocrine/paracrine au sein de la tumeur via l’activation du récepteur à la prolactine. Le récepteur est en effet absent des cellules cancéreuses pulmonaires et le transcrit PRL exprimé est dépourvu de ses premiers exons, ce qui pourrait conduire à la production d’une protéine tronquée de son peptide signal, incapable d’emprunter la voie de sécrétion classique, et par conséquent retenue à l’intérieur de la cellule cancéreuse pulmonaire. Même si les mécanismes d’action in cellulo de la prolactine restent à décrypter, nos données suggèrent que l’expression ectopique de PRL pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des tumeurs pulmonaires agressives. Ce travail de thèse, incluant également des résultats complémentaires obtenus sur trois gènes spécifiques du testicule exprimés de manière aberrante dans les tumeurs pulmonaires (BRDT, SOX30 et SPATA22) met en lumière l’intérêt des expressions ectopiques. Celles-ci peuvent en effet fournir de nouveaux outils de diagnostic et de pronostic aux cliniciens, mais également de nouvelles approches ciblées en complément des thérapies classiques qui ne suffisent pas à limiter la mortalité importante due aux néoplasies pulmonaires
Each human cell contains a genome carrying all the genetic information necessary for the constitution of the whole organism. However, differentiated cells express only a restricted repertoire of genes. The control of gene expressions is fundamental for the establishment and maintenance of cell identity. The first level of gene expression regulation, the transcriptional control, is based on the integrity of the gene sequence but also on its accessibility, itself dependent on a set of epigenetic mechanisms that control chromatin dynamics. In a pathological context, genetic and epigenetic alterations can lead to gene deregulations and altered cellular functions. During the bronchial carcinogenesis, lung cancer cells acquire a capacity of uncontrolled proliferation and an increased resistance to cell death. These phenotypic characteristics, favoring tumor growth, result from abnormalities that accumulate in the genome of cancer cells. These are somatic genetic alterations, from point mutations to large-scale chromosomal rearrangements, but also a global disruption of the epigenetic landscape – both leading to an identity crisis and to gene deregulations. While the phenomenon of aberrant gene repression (including repression of tumor suppressor genes) has been extensively studied, ectopic activation of normally silent genes remains poorly understood. Our hypothesis is that the “out of context” expression of tissue-specific genes not only could be involved in carcinogenesis, but could also be of high interest as tumor biomarkers or novel therapeutic targets. In this work, we focused on the prolactin-encoding PRL gene, normally mainly expressed in the pituitary gland and absent from non-tumor lung. We detected an ectopic PRL gene activation in 10% of lung tumors, mainly neuroendocrine tumors. We observed that PRL expression is associated with aggressive tumors and a poor prognosis for patients. We also found that the expression of PRL is associated with an increased resistance of lung cancer cells to a genotoxic stress. Unexpectedly, our data suggest that the oncogenic action of PRL expression is not based on the conventional mechanisms of prolactin action, and we did not confirm the initial hypothesis of a secretion by lung cancer cells of the prolactin hormone, and its action in an autocrine/paracrine loop within the tumor through the activation of the prolactin receptor. Indeed, the receptor is absent in lung cancer cells and the transcribed PRL mRNA is missing its first exons, possibly leading to the production of a truncated prolactin protein, without a functional signal peptide, therefore unable to follow the classical secretion pathway and retained inside the cancer cell. Although the detailed mechanisms of prolactin action in lung cancer remain to be deciphered, our study suggests that the ectopic expression of PRL could be used as a new therapeutic target in the treatment of aggressive lung tumors. This work, also including additional results on three testis-specific genes aberrantly expressed in lung tumors (BRDT, SOX30 and SPATA22) highlights the interest of studying ectopic gene expressions in tumor cells, which can provide new diagnosis and prognosis tools for clinicians as well as new targeted approaches that could be used in addition to conventional lung cancer therapies, which are presently insufficient to limit the high mortality due to lung neoplasms

La mucoviscidose est une maladie héréditaire monogénique grave en rapport avec une mutation du gène codant pour la protéine CFTR et dont la morbidité est due principalement aux atteintes pulmonaires. La greffe pulmonaire développée depuis quelques années semble être la seule thérapie curative efficace. Toutefois, la rareté des greffons disponibles, justifie de développer d’autres thérapies comme la thérapie génique. Les pseudovirions de papillomavirus sont capables de transférer des gènes dans de nombreuses lignées cellulaires. Cependant, le tropisme naturel des papillomavirus est l’épithélium malpighien et ces pseudovirions sont peu efficaces pour les cellules de l’épithélium pulmonaire. Afin de modifier le tropisme de nos pseudocapsides de papillomavirus, la première étape de mon travail a été d’identifier de nouveaux motifs de ciblage pulmonaire. La technique de phage display a permis l’identification des motifs PHPNRAQ et VDRLQQK par sélection sur les cellules épithéliales bronchique IB3-1 et S9
Cystic fibrosis is an autosomal recessive genetic disorder caused by mutations in the gene encoding the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein. Lung transplantation developed in recent years is the only effective curative treatment. However, due to the limitation in organ donors, it is necessary to develop other therapies such as gene therapy. Papillomavirus pseudovirions have the potential to deliver genes into different cells. However, the natural tropism of HPV is directed to the cervical epithelial cells and these pseudovirions have low transduction efficacy in pulmonary epithelial cells. The purpose of this thesis was to retarget and optimize the HPV-16 pseudovirions tropism to airway cells by insertion of short amino acid sequences within the major capsid protein L1

RFLP des gènes de l'inhibiteur de la trypsine inter alpha chez l'homme, déterminisme génétique et fréquence allélique de ces marqueurs dans une population de référence et dans une population constituée d'individus non déficitaires en alpha-1-antitrypsine souffrant d'emphysème pulmonaire

Dans les cancers du poumon, une des altérations les plus souvent observées est la perte ou l’atténuation de l’expression du gène FHIT (Fragile Histidine Triad). Nous avons précédemment montré que FHIT est un suppresseur d’invasion tumorale. En effet, FHIT contrôle l’invasion des cellules tumorales bronchiques en régulant négativement l'expression de gènes associés à la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), en particulier la vimentine et la MMP-9 via l’inhibition d’une voie orchestrée par l’EGFR. Un intérêt particulier a donc été porté aux relations entre FHIT et un autre membre de la famille de l’EGFR : HER2. Nous avons non seulement mis en évidence, in vivo et in vitro, une corrélation inverse entre les taux de FHIT et l’activité du récepteur HER2 dans les CBNPC mais également montré que FHIT est capable de réguler l’activité du récepteur HER2 dans les cellules tumorales pulmonaires et ce grâce à sa dimérisation avec HER3. De plus, l’utilisation de deux inhibiteurs spécifiques d’HER2, le Trastuzumab et l’Irbinitinib, nous a permis de mettre en évidence, que l’activation du récepteur HER2 lors de l’inhibition de FHIT, participe à l’acquisition par les cellules tumorales bronchiques de caractéristiques invasives via la régulation de certaines cibles de la TEM, telles la vimentine, la MMP-14 ou encore le facteur de transcription TWIST-1. Ces résultats montrent que FHIT régule l’activité d’HER2 dans les cellules tumorales pulmonaires et que les inhibiteurs d’HER2 sont capables de limiter l’invasion induite par l’inhibition de FHIT. Cette étude laisse envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le cancer du poumon
The lack or decrease of FHIT (fragile histidine triad) expression is a common event in lung cancer. We recently showed that FHIT acts as a suppressor of tumor invasion. Indeed, FHIT controls the invasive phenotype of lung tumor cells by regulating the expression of genes associated with epithelial-mesenchymal transition (EMT) such as vimentin or MMP-9 through an EGFR signaling pathway. Accordingly, we focused on the relationships between FHIT and another member of this tyrosine kinase receptor family: HER2. First, we observed in vivo and in vitro a negative correlation between FHIT expression and the activated form of HER2 in lung tumor cells. Moreover, FHIT controls HER2 activation through its dimerization with HER3. The use of HER2 specific inhibitors, Trastuzumab and Irbinitinib, allowed to demonstrate that the in vitro invasion induced by FHIT inhibition is HER2-dependent. Furthermore, FHIT controls the HER2-dependent invasion by regulating genes associated with EMT such as vimentin, MMP-14 or TWIST-1. In conclusion, we showed that FHIT regulates HER2 activity in lung tumor cells and that HER2 inhibitors reduce invasion induced by FHIT inhibition. This study would allow for the identification of new therapeutic leads for lung cancer

Mondialement, le carcinome hépatocellulaire (CHC) et le cancer du poumon (CP) constituent un problème majeur de santé publique. Plusieurs études d'association gène candidat ont montré que les SNPs de gènes candidats à la réparation d'ADN et au métabolisme des monocarbones (MMC) influencent le risque de CHC et CP. Toutefois, aucune étude n'a évalué, de façon exhaustive, l'influence des SNPs de la réparation d'ADN ou du MMC avec le risque de CP ou de CHC. Notre étude vise à identifier - à l'aide de deux SNP array de 384 SNPs - les polymorphismes génétiques de la réparation d'ADN et du MMC qui sont prédictifs du risque de CHC chez des Caucasiens cirrhotiques. Nous avons aussi recherché les déterminants génétiques de la réparation d'ADN associés au risque de CP. Nos résultats ont montré que six SNPs du gène BRIP1 (BRCA1interacting protein C?terminal helicase ; rs4986763, rs4986764, rs1557720, rs4986765, rs2191248, et rs11871785) étaient significativement associés au risque de CHC chez les patients porteurs d'une cirrhose d'étiologie virale selon le modèle génétique additif. Après correction de "False Discovery Rate", BRIP1 rs4986764 et rs1557720 étaient significativement associés au risque de CHC. Deux SNPs du MMC situés sur GGH (rs11545076 et rs11545077) étaient significativement associés au risque de CHC chez les patients porteurs d'une cirrhose d'étiologie non virale. Par ailleurs, seul le polymorphisme POLL rs3730477 était associé à un risque accru de CP dans le modèle génétique récessif. La dernière partie de notre étude était consacrée à l'analyse comparée d'hémogrammes et des dommages d'ADN chez des conducteurs de taxi-moto (CTM) de Cotonou - exposés à l?air pollué par le benzène et les HAPs -, et les témoins non exposés. Nos résultats ont montré une réduction significative du nombre des globules blancs, lymphocytes, neutrophiles et plaquettes, avec une misincorporation accrue d'uracile, de 8 oxodG et la présence d'un adduit majeur d'ADN chez les CTM par rapport aux témoins. En conclusion, nous avons identifié six variants sur BRIP1 et deux variants sur GGH associés au risque de CHC sur une cirrhose d'étiologie virale et non virale, respectivement. De plus, nous avons montré que POLL rs3730477 est un prédicteur significatif du risque de cancer du poumon. Une validation de ces résultats dans des cohortes indépendantes s'avère indispensable
Worldwide, hepatocellular carcinoma (HCC) and lung cancer (LC) represent a major public health problem. Previous studies reported associations between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in DNA repair or monocarbon metabolism (MCM) genes and LC or HCC risk. However, influences of these SNPs on LC or HCC risk have not been comprehensively evaluated. Our study aimed to identify potential interesting DNA repair and MCM gene variants associated with HCC risk in cirrhotic Caucasians. To this end, we used the Illumina's GoldenGate® technology and performed a comprehensive investigation of 384 SNPs on 94 DNA repair genes and 384 SNPs on 77 MCM genes. This comprehensive SNP-array fine mapping approach was also used to identify potential interesting DNA repair gene variants associated with susceptibility to LC in Caucasians. Our results showed that six variants on BRIP1 gene (BRCA1 interacting protein C-terminal helicase: rs4986763, rs4986764, rs1557720, rs4986765, rs2191248, and rs11871785) were significantly associated with HCC risk in patients carrying hepatitis virus-associated cirrhosis under an additive genetic model. After false discovery rate (FDR) correction for multiple testing, BRIP1 rs4986764 and rs1557720 displayed statistically significant associations with HCC risk. Two SNPs on GGH gene were associated with HCC risk in patients carrying non viral cirrhosis. In our study, only POLL rs3730477 was associated with an increased LC risk under a recessive genetic model (OR=2.81, 95% CI 1.51?5.24). Lastly, we evaluated hematologic changes and levels of DNA adducts, 8-oxodG, dU, and m5dC in Cotonou's motorbike taxi drivers (MBTD) - exposed to air pollution by benzene and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) - compared to unexposed controls. Compared to controls, MBTD displayed a significant decrease in the number of white blood cells, lymphocytes, neutrophils and platelets, with the formation of an unknow DNA adduct, whereas uracil misincorporation and 8-oxodG levels in DNA were significantly increased. In conclusion, we identified six variants on BRIP1 gene and two variants on GGH gene that are associated with susceptibility to HCC. In addition, POLL rs3730477 variant was associated with susceptibility to LC. Replication of these findings in independent cohorts is warranted

Les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur à l’Epidermal Growth Factor (EGFR) constituent un nouveau traitement du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC), particulièrement efficace chez les patients porteurs d’une mutation d’EGFR (EGFR M+). Néanmoins, certains de ces patients peuvent avoir une résistance primaire à ces traitements, et les autres développent inéluctablement une rechute correspondant au phénomène de résistance acquise. L’objectif de ce travail était d’étudier les mécanismes de résistances primaire et acquise chez les patients avec CBNPC EGFR M+.Nous avons montré que le statut mutationnel de KRAS était le même dans la tumeur primitive et les métastases dans la majorité des cas de CBNPC. Dans quelques cas cependant, le statut différait entre tumeur primitive et métastase, ce qui soulève la question d’une dissociation de la réponse aux ITK, les mutations de KRAS étant associées à une résistance primaire au traitement.Nous avons par ailleurs mis en évidence la fréquente inactivation de la voie p53, soit par mutation de TP53 soit par diminution d’expression de p14arf, dans les tumeurs EGFR M+, qui pourrait être une des causes des variations de réponse aux ITK chez les patients EGFR M+. Enfin, nous avons montré que la résistance à deux ITK de nouvelle génération, PF299804 et WZ4002, passait par un phénomène en deux étapes impliquant d’une part l’activation de la voie IGF1R, via la diminution de l’expression d’IGFBP3, et d’autre part celle de la voie des MAP kinases. Ces travaux pourraient déboucher sur des stratégies thérapeutiques innovantes chez les patients présentant une résistance acquise aux ITK de nouvelle génération
Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Tyrosine Kinase Inhibitors (TKI) provide clinical efficacy in Non Small Cell Lung Cancer (NSCLC) patients, especially in the presence of an EGFR mutation. However, some EGFR mutated patients display primary resistance to EGFR TKI, and the others will ultimately develop acquired resistance. We focused our work on mechanisms of primary and acquired resistance in EGFR mutated NSCLC.We first showed that KRAS mutational status is the same in primary NSCLC and matched metastases in most of the cases. However, in some patients, we found a discordant KRAS status between primary tumors and metastases, which could translate into a discordant response to EGFR TKI, since KRAS mutations are associated with resistance to EGFR TKI.We also showed that EGFR mutated tumors are associated in most of the cases with an inactivation of the p53 pathway, either through a TP53 mutation or through loss of expression of p14arf, which could account for some of the variations observed in the response to TKI in EGFR mutated patients.Last, we showed that acquired resistance to two new generation EGFR TKI, PF299804 and WZ4002, occurred through a multistep process involving activation of the IGF1R pathway through downregulation of IGFBP3 and activation of the MAP kinase pathway. These results provide new insights into the treatment of NSCLC in EGFR mutated patients with acquired resistance to new generation TKI

En raison de l'utilisation croissante de nanomatériaux dans divers procédés industriels, le nombre de salariés potentiellement exposés ne cesse d’augmenter, sans que pour autant les propriétés toxicologiques de ces agents chimiques ne soient parfaitement connues. Comme des nanoparticules (NP) peuvent être mises en suspension dans les environnements de travail, l'inhalation représente la principale voie d'exposition professionnelle. Ainsi, l’évaluation des dangers associés à l’exposition à des aérosols nanostructurés nécessite de réaliser des études de toxicologie expérimentale par inhalation, en utilisant des modèles animaux. Dans ce travail, les propriétés toxicologiques pulmonaires d’un aérosol nanostructuré de dioxyde de titane (TiO2) ont été étudiées à court et long termes, en combinant des analyses toxicologiques conventionnelles (analyses du lavage broncho-alvéolaire (LBA), histopathologie des poumons et des ganglions lymphatiques); et de criblage moléculaire à haut contenu (analyses de transcriptomique et de protéomique). Des rats Fischer 344 ont été exposés par inhalation oro-nasale, à un aérosol nanostructuré de TiO2 à 10 mg / m3 ; 6 heures par jour, 5 jours par semaine pendant 4 semaines. Des échantillons biologiques ont été prélevés immédiatement et jusqu'à 180 jours suivant la fin de l'exposition. L'exposition à l'aérsosol nanostructuré de TiO2 a entraîné une importante réponse inflammatoire pulmonaire aiguë. Cette réponse était caractérisée par un influx de granulocytes neutrophiles, la présence de macrophages chargés en particules au niveau alvéolaire, la surexpression de gènes et de protéines impliqués dans les réponses inflammatoires et immunitaires, les cascades du complément et de la coagulation, le stress oxydant. Certains gènes surexprimés étaient également impliqués dans les lésions de l'ADN et la fibrose; et certaines protéines surexprimées étaient associées au protéasome et à l'organisation du cytosquelette. Dans le surnageant du LBA, l’augmentation du niveau d'histones et d'autres protéines associées aux pièges extracellulaires des neutrophiles (Neutrophilic Extracellular Trap, NET) suggère la libération de ces pièges extracellulaires dans l'espace alvéolaire. Cette libération possible de NET se produit dans un contexte inflammatoire mais en l'absence de changements histopathologiques significatifs. Ce processus inattendu n’a fait l’objet que de très peu d’études en lien avec une exposition à des nanomatériaux. Six mois après la fin de l'exposition (réponse à long terme), l'inflammation a diminué et s’accompagnait d’une baisse de la charge pulmonaire de titane (un marqueur fiable de la charge pulmonaire en nanoparticules de TiO2), mais de nombreux gènes et protéines étaient différentiellemment exprimés. Les conséquences physiopathologiques des changements rapportés ici ne sont pas entièrement connues, mais ces résultats devraient susciter des interrogations quant aux effets pulmonaires à long terme des NP inhalées biopersistantes de faible toxicité comme le TiO2. En conclusion, ce travail montre qu'il existe une bonne relation entre les changements cytologiques et histopathologiques d'une part et les modifications des profils d'expression de gènes et de protéines d'autre part. Cependant, dans certains cas, la transcriptomique et la protéomique pourraient être plus sensibles que les méthodes conventionnelles pour identifier de nouvelles propriétés toxicologiques, ou pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents de la toxicité des produits chimiques. Notre étude avec d'autres travaux de la littérature pourraient également être utiles pour identifier des biomarqueurs d’exposition aux nanomatériaux ou prédire leurs effets nocifs à long terme
Due to the growing use of nanomaterials in various industrial processes, the number of workers potentially exposed is increasing even though the toxicological properties of these compounds are not completely known. Since nanoparticles (NP) may get aerosolized, inhalation represents their main route of occupational exposure. Then, inhalation studies of nanomaterial toxicity in animal models appear to be the most relevant approach to assess their hazards. In this work, we studied the short and long term pulmonary toxicological properties of inhaled titanium dioxide (TiO2) nanostructured aerosol (NSA), using conventional (broncho-alveolar lavage (BAL) analyses, lung and lymph nodes histopathology); and high content molecular toxicological approaches (transcriptomics and proteomics analyses). Fischer 344 rats were exposed to 10 mg/m3 of TiO2 nanostructured aerosol by nose-only inhalation, 6h/day, 5 days/week for 4 weeks. Biological samples were collected immediately and up to 180 post-exposure days. Exposure to TiO2 NSA resulted in a strong acute pulmonary inflammation. This response was characterized by a neutrophil influx, the presence of particle-laden macrophages in the alveolar lumen, as well as overexpression of genes and proteins involved in inflammatory and immune responses, complement and coagulation cascades, oxidative stress. Some overexpressed genes were also involved in DNA damage and fibrosis; and some overexpressed proteins in proteasome and cytoskeleton organization. In the BAL supernatant, the increased level of histones and other neutrophilic extracellular trap (NET) -associated proteins suggests the release of these traps in the alveolar space. This possible NET release occurs in an inflammatory context but in the absence of significant histopathological changes. Very few studies reported this unexpected process related to exposure to nanomaterials. Six months after the end of exposure (long-term response), inflammation had decreased in line with the decrease of titanium lung burden (a surrogate for TiO2 pulmonary deposition), but many genes and proteins remained differentially expressed. The physiopathological consequences of the molecular changes reported here are not fully known, but these results should raise concern about the long-term pulmonary effects of inhaled low toxicity NP such as TiO2. Altogether, this work shows that there is a good relationship between cytological and histopathological changes in one hand and gene as well as protein expression profile modifications in the other hand. However, in some cases transcriptomics or proteomics could be more sensitive than conventional methods to identify new toxicological properties or to better understand the underlying molecular mechanisms of chemicals toxicity. Our study along with others could also be helpful to identify biomarkers of exposure or predict the long-term adverse effects of nanomaterials

FHIT (fragile histidine triad) est un gène fréquemment inactivé dans le cancer du poumon. Nos travaux précédents ont montré que FHIT contrôle l’invasion des cellules tumorales pulmonaires via la régulation de la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) et que son expression est liée à l’activation du récepteur HER2. Ici, nous avons recherché l’implication du lien FHIT/HER2 dans la progression tumorale broncho-pulmonaire et les potentielles retombées cliniques.Nous avons mis en évidence une corrélation inverse entre l'expression de FHIT et l’activation d’HER2 dans des cellules tumorales de patients atteints de CBNPC. De plus, la mise au point d’un modèle stable KO FHIT par CRISPR/Cas9 nous a permis de montrer que la perte de FHIT induit l’activation d’HER2 associée à une TEM via l’implication du récepteur LRP-1 et de la signalisation ERK. Nous avons également démontré que les drogues anti-HER2, irbinitinib et trastuzumab, restaurent un phénotype plus épithélial et contrecarrent l'invasivité et la croissance des cellules tumorales FHIT négatives in vitro et in vivo. Enfin, nous avons montré que le phénotype FHITfaible/pHER2élevé est associé à l’expression de vimentine et prédit la sensibilité à une thérapie anti-HER2 dans les cellules tumorales de patients atteints de CBNPC.Nos résultats montrent que FHIT régule l'activité d’HER2 et que des drogues anti-HER2 diminuent l'agressivité des cellules tumorales inactivées pour FHIT. Cette étude suggère que la plasticité phénotypique des cellules tumorales pourrait être un biomarqueur prédictif pour les thérapies ciblées et qu'une nouvelle sous-classe de patients atteints de CBNPC pourrait être éligible à une thérapie anti-HER2
The lack or decrease of FHIT (fragile histidine triad) expression is a common event in lung cancer. We previously showed that FHIT controls the invasiveness of lung tumor cells by regulating the epithelial-mesenchymal transition (EMT) and that its expression is correlated with the activation of HER2 receptor. Here, we investigated the implication of the relationship between FHIT and HER2 during lung tumor progression and its potential clinical relevance.Firstly, we showed a negative correlation between FHIT expression and the activated form of HER2 in primary tumor cells from NSCLC patients. Moreover, a stable KO FHIT cell model, using CRISPR/cas9 technology, allowed to show that inhibition of FHIT expression induces HER2 activation associated with an EMT program through the involvement of LRP-1 receptor and ERK signaling. We also demonstrated that anti-HER2 drugs, irbinitinib and trastuzumab, restore a more epithelial phenotype and counteract invasiveness and growth of FHIT-silenced tumor cell lines. Finally, we showed that the FHITlow/pHER2high phenotype is associated with vimentin expression and predicts sensitivity to an anti-HER2 therapy in primary tumor cells from NSCLC patients.Our results showed that FHIT regulates the activity of HER2 receptor in lung tumor cells and that HER2 specific inhibitors decrease the aggressiveness of FHIT-inactivated tumor cells. This study suggests that phenotypic plasticity of tumor cells could be a predictive biomarker for targeted therapies and that a new subclass of patients with NSCLC may be eligible for an anti-HER2 therapy

Les tumeurs sont généralement constituées de différentes sous-populations de cellules cancéreuses génétiquement hétérogènes, responsables en grande partie de la capacité de la tumeur à évoluer rapidement et à s’adapter aux conditions environnementales. Cette diversité génétique a des conséquences majeures pour le patient, notamment au cours de la progression tumorale et pour l’acquisition d’une résistance aux traitements.Nous avons développé une nouvelle stratégie basée sur la technologie CRISPR/Cas9 qui consiste à introduire, en plus d’une altération de séquence voulue d’un gène d’intérêt, une série de mutations silencieuses, constituant une sorte d’étiquette génétique qui peut être détectée par PCR quantitative ou séquençage de nouvelle génération. En parallèle, un code-barres constitué exclusivement de mutations silencieuses est utilisé comme contrôle interne pour les effets non spécifiques potentiels qui peuvent être engendrés suite au clivage hors-cible par le système CRISPR/Cas9. Cette approche, que nous avons appelée CRISPR-barcoding, permet de générer et de suivre l’émergence d’un petit groupe de cellules cancéreuses contenant une mutation voulue au sein d’une population de cellules non modifiées, représentant ainsi un nouveau modèle expérimental d’hétérogénéité génétique intratumorale. Grâce à une série de preuves de concept, nous avons montré que CRISPR-barcoding est une nouvelle approche qui permet d’étudier de façon simple et rapide les conséquences fonctionnelles de différents types de modifications génétiques apportées directement au niveau de la séquence génomique.Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé cette nouvelle approche pour l'étude de la résistance du cancer bronchique non à petites cellules (CBNPC) à la thérapie ciblée. Les patients de CBNPC dont la tumeur présente une mutation activatrice de l'epidermal growth factor receptor (EGFR) sont généralement traités avec des inhibiteurs de ce récepteur. Malheureusement, malgré une réponse initiale, presque invariablement ces patients rechutent, suite au développement d’une résistance causée, dans la majorité des cas, par l’apparition de mutations secondaires ou tertiaire de l'EGFR. Grâce à un criblage réalisé en utilisant un modèle de CBNPC basé sur la stratégie CRISPR-barcoding, nous avons pu identifier l’inhibiteur multikinase sorafenib pour sa capacité à prévenir la résistance de ces cellules aux inhibiteurs d’EGFR. Ce composé présente un mécanisme d’action original, impliquant une diminution précoce du niveau de phosphorylation de STAT3, suivie par une baisse considérable de l’expression de l’EGFR, aboutissant à une inhibition des voies intracellulaires en aval de ce récepteur, telles que RAS-MAPK et PI3K-AKT-mTOR. Ces données ont été confirmées in vivo en utilisant un modèle de xénogreffe de cellules de CBNPC modifiées par CRISPR-barcoding.En conclusion, l’ensemble de nos résultats montre que le sorafenib peut prévenir l’émergence de cellules de CBNPC résistantes aux inhibiteurs d’EGFR, indiquant que ce composé pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour le traitement de ce type de tumeur
Individual tumors are composed of multiple and genetically distinct subpopulations of transformed cells that can adapt and evolve in a different way based on environmental conditions. This genetic diversity has major consequences for the patient, particularly during tumor progression and for cancer treatment.We devised a new strategy based on CRISPR/Cas9 technology in which a potentially functional modification in the sequence of a gene of interest is coupled with a series of silent point mutations, functioning as a genetic label for cell tracing. In parallel, a second barcode consisting of distinct silent mutations is inserted in the same cell population and used as a control for CRISPR/Cas9 off-target cleavage. This approach, that we named CRISPR barcoding, enables detection of cells containing the mutation of interest within a mass population of unmodified cells using real-time quantitative PCR or deep sequencing. Through a series of proof-of-concept studies, we demonstrated that CRISPR-barcoding is a fast and highly flexible strategy to investigate the functional consequences of a specific genetic modification in a broad range of assays.In the second part of my thesis, we used CRISPR-barcoding to investigate non-small cell lung cancer (NSCLC) resistance to targeted therapy. Some NSCLCs harbor activating mutations of the epidermal growth factor receptor (EGFR) and are addicted to this signaling pathway. These tumors initially show a good response to EGFR inhibitors (EGFRi), but they almost invariably relapse, due to the acquisition of a resistance, as a result of additional genetic alterations, including secondary and tertiary EGFR mutations. Using a CRISPR-barcoding model, we identified the multikinase inhibitor sorafenib for its ability to prevent EGFRi resistance in NSCLC cells. This compound acts through an original mechanism that involves early reduction of STAT3 phosphorylation and late down-regulation of EGFR, resulting in the inhibition of different downstream pathways activated by this receptor, including, RAS-MAPK and PI3K-AKT-mTOR. These results were confirmed in vivo, using a CRISPR-barcoding xenograft model for NSCLC.Altogether, our data indicate that sorafenib can prevent NSCLC resistance to EGFRi through a novel mechanism, thus providing a new potential therapeutic strategy for the treatment of this type of cancer

Parmi les manifestations cliniques du paludisme où P. falciparum est le principal responsable des formes graves, les manifestations pulmonaires sont souvent sous-estimées. Malgré de nombreuses études tentant de mieux comprendre les mécanismes inflammatoires mis en jeu dans l'aggravation de la maladie, des zones d'ombres persistent. Pour étudier les interactions hôte-parasite et identifier des biomarqueurs de classification et d'évolutivité de l'accès palustre, nous avons effectué une étude de cohorte longitudinale prospective à l'Hôpital Monkole de Kinshasa, par une approche combinée immunologique et transcriptomique sur 30 jours. L'étude devant porter initialement sur les atteintes pulmonaires a été recentrée sur l'étude de la sévérité de l'accès palustre devant le peu de patients présentant des atteintes pulmonaires.A travers l'approche immunologique, une réponse pro-inflammatoire de type Th1 modérée est activée à l'admission des patients impaludés. L'approche transcriptomique a permis de le relier à une activation modérée des monocytes/macrophages médiée par la voie de signalisation de l'IL-12, toutefois plus importante chez les accès graves. L'infection palustre, et plus particulièrement l'accès grave paraissent être fortement sous dépendance de la réponse Th17 et plus particulièrement à l'activité des neutrophiles. La mise en place d'une réponse Th2 est également observée chez les patients impaludés. A J7, la réponse Th2 est majoritaire, associée à une importante activité hématopoïétique. A J30, les patients sont guéris et présentent globalement un profil similaire aux témoins.Ces résultats sont à confirmer et à approfondir par une augmentation de notre cohorte
Among complications of the malaria access, mostly due to P. falciparum, the pulmonary injuries are often underestimated. Despite numerous studies trying to better understand the inflammatory mechanisms involved in disease worsening, they are still poorly understood. In view to study the host-parasite interactions and identify biomarkers according to severity of malaria, a prospective longitudinal cohort study was carried out in Monkole Hospital (Kinshasa) through a combined immunological and transcriptomic approach, with a follow up on 30 days. Initially, the study concerned the pulmonary injuries, but was focused on the the severity of malaria because of a weak patients number with lung damages.The immunological approach highlighted a moderate Th1 pro-inflammatory response at admission. The transcriptomic approach allowed to connect it with a moderate activation of monocytes/macrophages, mediated by IL-12 signaling pathway, higher in severe malaria. Malaria infection, particularly severe malaria, appears to be strongly dependent on Th17 response, especially to neutrophil activity. The establishment of a Th2 response is also observed in malaria patients. On day 7, Th2 response is predominant, associated with significant hematopoietic activity. On day 30, patients are cured and present a similar profile to healthy controls.These results have to be confirmed with an increased cohort

Introduction : Le traitement des cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) EGFR mutés repose sur les inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) du récepteur de l’Epidermal Growth Factor (EGFR). Cependant tous les patients traités par ITK EGFR finissent par présenter une progression tumorale, du fait de mécanismes de résistance comme l’amplification du gène codant pour le récepteur tyrosine kinase MET. Il n’existe actuellement aucune donnée sur les modifications phénotypiques induites par l’activation de MET dans ce contexte. L’objectif de cette thèse est de déterminer si l’amplification de MET, lors de la résistance aux ITK EGFR dans les CBNPC EGFR mutés, confère aux cellules tumorales un phénotype plus agressif et modifie l’histoire naturelle de la maladie.Méthodes : Les capacités de prolifération, de croissance sans ancrage, de formation de sphéroïdes, de résistance à l’anoïkis et de migration ont été étudiées in vitro dans la lignée HCC827, dérivée d’un CBNPC EGFR muté, et dans sa lignée fille HCC827-GR6 (GR6) devenue résistante aux ITK EGFR via une amplification du gène MET. L’expression de la vimentine, de ZEB1, et de la E-cadherine a également été étudiée dans les deux lignées cellulaires afin d’évaluer l’impact de l’amplification de MET sur la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM). In vivo la croissance tumorale et le potentiel métastatique ont respectivement été analysés dans des modèles murins de xénogreffe ectopique et d’injection intracardiaque. Enfin les données cliniques de patients issus de 15 centres avec un CBNPC EGFR muté métastatique, présentant une forte surexpression de MET en immunohistochimie (score 3+) ou une amplification de MET en FISH sur une re-biopsie réalisée après la progression sous ITK EGFR ont été analysées rétrospectivement. Résultats : In vitro, l’amplification de MET induisait une augmentation significative de la prolifération, de la croissance sans ancrage, de la formation de sphéroïdes, de la résistance à l’anoïkis et de la migration. En présence d’un inhibiteur de MET, le PHA-665752, ces différentes propriétés biologiques étaient réduites de façon significative dans les cellules GR6 porteuses de l’amplification de MET. Il était également mis en évidence dans les cellules GR6 une augmentation de l’expression de la vimentine et de ZEB1. In vivo, l’amplification de MET augmentait significativement la croissance tumorale et le potentiel métastatique. Un traitement par crizotinib, ITK ciblant MET, diminuait de façon significative le potentiel métastatique des cellules porteuses de l’amplification de MET. Enfin les patients atteints d’un CBNPC EGFR muté, porteur d’une amplification de MET à la résistance à l’ITK EGFR, présentaient une durée jusqu’à apparition de nouvelles métastases plus courte après progression sous ITK EGFR que les patients avec une forte surexpression de MET sans amplification génique. Conclusion L’amplification de MET dans un contexte de résistance aux ITK EGFR est associée à un phénotype tumoral plus agressif. Ces résultats plaident en faveur d’une utilisation précoce d’inhibiteurs de MET en association avec les ITK EGFR afin d’éviter l’émergence d’un clone tumoral résistant plus agressif
Introduction: Treatment of Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) mutated non-small cell lung cancers (NSCLC) relies on EGFR tyrosine kinase inhibitors (TKI). However, all patients treated with EGFR TKI eventually present tumor progression, due to mechanisms of resistance such as the MET amplification. There is currently no data on phenotypic changes induced by MET activation in this context. The objective of this thesis is to determine whether the MET amplification during EGFR TKI resistance in the EGFR mutated NSCLC induces a more aggressive phenotype in tumor cells and alters the natural history of the disease.Methods: Proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration were studied in vitro in the HCC827 cell line, derived from an EGFR mutated NSCLC, and in its daughter cell line HCC827-GR6 (GR6) which became resistant to EGFR TKI through MET amplification. The expression of vimentin, ZEB1, and E-cadherin was evaluated in these cellular models in order to investigate an epithelial to mesenchymal transition (EMT) process induced by the MET amplification. In vivo, the tumor growth and the metastatic potential were analyzed by subcutaneous xenograft and intracardiac injection in mouse models. Finally, the clinical data of patients from 15 centers with a metastatic EGFR mutated NSCLC, exhibiting high MET overexpression in immunohistochemistry (score 3+) or MET amplification assessed by FISH on a re-biopsy performed after TKI EGFR progression were analyzed retrospectively.Results: In vitro, the MET amplification induced a significant increase in proliferation, anchorage independent growth, spheroid formation, anoïkis resistance and migration. Treatment with PHA-665752, a MET TKI, significantly reduced these biological properties in the GR6 cells harboring the MET amplification. An increase in the expression of vimentin and ZEB1 was also observed in the GR6 cells. In vivo, the MET amplification significantly increased the tumor growth and the metastatic potential. Treatment with crizotinib, another MET TKI, significantly decreased the metastatic potential of cells carrying MET amplification. Finally, patients with an EGFR mutated NSCLC, displayed a time to new metastases after TKI EGFR progression shorter than patients with high MET overexpression without MET amplification.Conclusion: The MET amplification during EGFR TKI resistance is associated in EGFR muted NSCLC with a more aggressive tumor phenotype. These results argue for the early use of MET inhibitors in combination with EGFR TKIs to avoid the emergence of a more aggressive resistant tumor clone

Il est maintenant bien établi que le système immunitaire joue un rôle majeur dans le contrôle des tumeurs, y compris dans les carcinomes pulmonaires. Cependant, les interactions entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires du microenvironnement tumoral sont mal connues. Dans ce travail, nous avons étudié les caractéristiques morphologiques et moléculaires des cellules tumorales provenant d’adénocarcinomes pulmonaires et leur association avec la composition du microenvironnement immunitaire. Nous avons rapporté la valeur pronostique des paramètres morphologiques de ces tumeurs, comme le grade histologique des adénocarcinomes, et leur association avec le statut moléculaire EGFR et KRAS. Nous avons émis l’hypothèse que la diversité morphologique et moléculaire de ces tumeurs pouvait être associée à une signature immunitaire intra-tumorale spécifique et que cela pourrait avoir un impact pronostique. Nous avons mis en évidence que la densité des cellules dendritiques matures, situées au sein de structures lymphoïdes tertiaires, variait en fonction du statut moléculaire EGFR et KRAS des tumeurs. De même, l’impact pronostique des cellules dendritiques matures et des lymphocytes CD8+ variait en fonction du statut moléculaire des tumeurs. Nous avons également retrouvé la valeur pronostique de l’environnement immunitaire, représenté par la densité en cellules dendritiques matures et en lymphocytes CD8+, sur la survie à long terme des carcinomes pulmonaires de stade III-N2 opérés après chimiothérapie néoadjuvante. Enfin, nous avons démontré que la chimiothérapie n'est pas associée à de profondes modifications de l’infiltrat immunitaire, alors qu’elle entraîne des modifications des cellules tumorales. L’ensemble de ces résultats suggère que l’infiltrat immunitaire est intimement lié à la cellule tumorale et que la composition du microenvironnement immunitaire varie avec les caractéristiques de la tumeur. Cette interaction entre les cellules tumorales et les cellules immunitaires contribue au pronostic de ces tumeurs. Ces données démontrent l’intérêt d’utiliser des traitements combinant des drogues cytotoxiques, telle la chimiothérapie conventionnelle, à des traitements immunomodulateurs permettant de favoriser une réponse immunitaire anti-tumorale efficace
The major role of the immune system against tumor development is now clearly established, including lung carcinoma. Nevertheless, interaction between tumoral cells and immune environment is less well-defined. In that study, we have studied morphological and molecular tumoral cells characteristics from lung adenocarcinoma and their role in the composition of immune environment. We reported the prognostic value of morphological parameters, as histological grade of adenocarcinoma, and their association with molecular EGFR and KRAS status. We hypothesized that morphological and molecular diversity of these tumors could be associated with a specific intratumoral immune signature, and could have an impact in prognosis. We showed that mature dendritic cells density, located in tertiary lymphoid structures, differed according to EGFR and KRAS status. Morever, molecular status of tumors modified the pronostic value of mature dendritics cells and CD8+ T cells. We found a prognostic value of immune environment, represented by dendritic cells and T CD8+ cells, in operated stage III-N2 lung carcinomas treated by neoadjuvant chemotherapy. At last, we demonstrated that chemotherapy is not associated with wide modifications in immune infiltrate, whereas it induced modifications in tumoral cells. All together, these data strongly argue for a close link between tumoral cells and immune environment, which seems to depend on tumoral cell characteristics. This interaction between tumoral cells and immune cells contribute to the prognosis of these tumors. These results show the evidence that combine cytotoxic treatment, like conventional chemotherapy, with immunomodulators, favour a protective anti-tumor immune response