Academic literature on the topic 'Genómics diversity'

Purificación y amplificación de ADN genómico en escamas de la serpiente Bothrops atrox “jergón” (Ofidia: Viperidae) Genomic DNA purification and amplification from scales to snake Bothrops atrox “lancehead” (Ofidia: Viperidae) Rommel Rojas, Roberson Ramirez, Marianela Cobos y Juan Castro Centro de Investigaciones de Recursos Naturales-CIRNAUniversidad Nacional de la Amazonia Peruana-UNAP. Apartado postal 496S Facultad de Ciencias Biológicas. DOI: https://doi.org/10.33017/RevECIPeru2011.0052/ RESUMEN Los estudios moleculares exigen la creación de nuevos protocolos que permitan obtener un ADN de alta calidad en la mayor cantidad de especies posibles y garantizar el conocimiento de la diversidad genética, por tal motivo el objetivo del presente trabajo fue purificar y amplificar de ADN genómico de las escamas de la serpiente Bothrops atrox “jergón”. Las escamas fueron recolectadas en el campo utilizando la técnica de revelamiento por encuentros casuales [1], para la purificación del ADN genómico se modificó el protocolo de [2], verificándose su pureza por el método electroforético utilizando agarosa 2% y su calidad y concentración por el método espectrofotométrico, la amplificación fue realizada por la reacción en cadena de polimerasaPCR utilizando iniciadores aleatorios. Los resultados muestran la obtención de ADN en excelente estado con un alto ratio de calidad (2) y concentración (585.85 µg/mL), asimismo se logró la amplificación del ADN, demostrándose que el protocolo utilizado es útil para estudios moleculares y genéticos. Se concluye mencionado que el método empleado es efectivo para obtener ADN de buena calidad en escamas de serpientes. Descriptores: Serpiente, escama, ADN, reacción en cadena de polimerasa-PCR. ABSTRACT Molecular research demand the creation of new protocols and permit the obtain a high quality DNA in the most quantity of species and know the genetic diversity, for that objective of the present research was obtained the purification and amplification of scales DNA in the snake Bothrops atrox. the scales were recollected in the field using the visual encounter survey [5] The For the purification of the DNA was modification the protocol [4], the DNA purity was verifiable for the electrophoretic method and it quality and concentration for spectrophotometry, the amplification was carried for Polymerase chain reaction-PCR using random primers. The results show the successful DNA purification, showing an acceptable quality ratio (2) and concentration (585.85 µg/mL), at the same time was made the amplification of DNA for PCR. We conclude indicating the useful of this technique for the purification of high quality DNA from snake´s scales for molecular and genetic research. Keywords: snake, scale, DNA, polymerase chain reaction-PCR.

ABSTRACTThe view of the gene as a structural and functional unit has been increasingly challenged by findings mostly resulting from eukaryote research. We can classify these challenges in three kinds: (i) one-to-many correspondences between DNA segments and RNAs/polypeptides (as, for instance, in alternative splicing); (ii) many-to-one correspondences between DNA segments and RNAs/polypeptides (as in genomic rearrangements, say, those involved in the generation of diversity in lymphocyte antigen receptors); (iii) lack of correspondence between DNA segments and RNAs/polypeptides (as, for example, in mRNA editing). However, even if a single definition of a gene may not be a realistic (or even helpful) goal, being able to have different definitions connected to each other –operationally and theoretically– is of central importance.KEYWORDSGENE CONCEPT, DEFINITION, DNARESUMENLa idea según la cual el gen es una unidad estructural y funcional se ha visto cada vez más cuestionada a causa de descubrimientos realizados en investigaciones con eucariotas. Podemos clasificar los desafíos planteados a dicha idea en tres tipos: (i) correspondencias uno-a-muchos entre segmentos de ADN y ARN/polipéptidos (como, por ejemplo, en el empalme alternativo); (ii) correspondencias muchos-a-uno entre segmentos de ADN y ARN/polipéptidos (como en las reorganizaciones genómicas, tales como las implicadas en la generación de diversidad en los receptores de antígenos de los linfocitos); (iii) falta de correspondencia entre segmentos del ADN y ARN/polipéptidos (como, por ejemplo, en la edición del ARNm). Sin embargo, incluso si, por estas razones, no sería realista (o incluso útil) buscar una definición única de gen, es de capital importancia que seamos capaces de formular diferentes definiciones conectadas entre sí teórica y operacionalmente.PALABRAS CLAVECONCEPTO DE GEN, DEFINICIÓN, ADN

El de la raza de Lidia ha sido seleccionado durante siglos por caracteres relacionados al comportamiento, una peculiaridad que la distingue del resto de las razas vacunas, principalmente seleccionadas por características de interés productivo, como carne y leche. En España, la población de Lidia originaria ha sido estudiada por medio de información genómica, permitiendo conocer que la riqueza genética de ésta raza se debe al aporte proporcionado por cada uno de los múltiples encastes o linajes en los que se subdivide. En México la raza de Lidia representa un legado histórico y cultural importante y actualmente, su población no ha sido caracterizada genéticamente. En esta tesis analizamos la diversidad y estructura genética de la población Mexicana y la comparamos con información proveniente de la población originaria Española utilizando información genómica mediante diferentes tipos de marcadores moleculares. Primero analizamos los parámetros de diversidad genética en ambas poblaciones con marcadores autosómicos de tipo Microsatélite y Polimorfismos de nucleótido único, encontrando valores similares de heterocigosis esperada con ambos tipos de marcadores moleculares. Encontramos también valores elevados en términos de FIS en ambas poblaciones. Tanto los valores elevados de FIS en los encastes así como el comportamiento que presentan las Carreras de Homocigosis son consecuencia del bajo censo de los encastes, contribuyendo por ende a incrementar la tasa de endogamia. También encontramos una alta diferenciación genética entre poblaciones con ambos tipos marcadores moleculares; microsatélites y SNPs. La partición de la variabilidad genética total analizada con SNPs mostró que el 19% de la variación se explica por las diferencias genéticas entre linajes. Curiosamente, la estructura genética de la población mexicana reveló que comparte escasos orígenes genéticos en común con la población originaria española, ubicando a ambas poblaciones en grupos diferentes. El análisis de cromosoma Y mostró que la Casta Navarra ha dejado huella paterna en la población mexicana mediante una frecuencia elevada en el haplotipo H6, exclusivo de ésta casta así como del encaste de Miura. Los análisis de ADN mitocondrial, por otro lado, revelaron patrones de haplotipos similares en ambas poblaciones. Por último, considerando la peculiaridad en la selección de esta raza, realizamos un análisis para detectar huellas de selección que pudieran afectar caracteres asociados a comportamiento de tipo agonista, utilizando dos razas mansas españolas como referencia. Utilizando dos métodos que se basan en inferencias bayesianas, identificamos en común dos regiones genómicas seleccionadas. A demás, la dirección e intensidad en la frecuencia del alelo seleccionado en la raza de Lidia es opuesto a los de las razas mansas. En éstas regiones detectamos genes asociados a rutas metabólicas como las de la serotonina y la dopamina, así como genes expresados en corteza cerebral, los cuáles han sido relacionados con patrones de comportamiento agresivo en humanos y animales de laboratorio.
The cattle of the Lidia breed have been selected during centuries for behavioral related traits, a peculiarity that distinguishes it from the rest of the bovine breeds, selected mostly for characteristics of productive interest, such as meat and milk. In Spain, the original Lidia population has been studied through genomic data, allowing to know that the genetic richness of the breed is owed to the contribution of each of the multiple lineages or encastes in which it is subdivided. In Mexico, the Lidia breed represents an important historical and cultural legacy and currently, its population has not been genetically characterized. In this thesis we analyze the genetic diversity and structure of the Mexican population and compared it with data from the original Spanish population by using genomic information derived from different types of molecular markers. First, we analyzed parameters of genetic diversity in both populations using Microsatellite and Single Nucleotide Polymorphisms autosomal markers, finding similar values of expected heterozygosities with both types of molecular markers. We found also high values in terms of FIS in both populations. Both, the high values of FIS in the lineages and the behavior of the Runs of Homocigosity are a consequence of the lineages´ low census, contributing hence to increase the inbreeding rate. Furthermore, we detected high genetic differentiation between populations with both types of molecular markers: microsatellite and SNP, and the partition of the total genetic variability analyzed with SNPs showed that 19% of the variation is explained by the genetic differences among lineages within populations. Curiously, the genetic structure of the Mexican population revealed that it shares few common genetic origins with the original Spanish population, placing both populations in different groups. The Y chromosome analysis evidenced the paternal footprint that Casta Navarra has left in the Mexican population through a high frequency of the H6 Haplotype, exclusive of this lineage. Mitochondrial DNA analyzes, on the other hand, revealed similar haplotype patterns in both populations. Finally, considering the peculiarity of the selection performed in this breed, we carried out an analysis to detect signatures of selection that could affect agonistic behavioral related traits, using as a reference two tamed Spanish breeds. Using two methods based on Bayesian inferences, we jointly identified two selected genomic regions. Also, the direction and intensity in the frequency of the allele selected of the Lidia breed is opposite to that of the tame breeds. In these regions were detected genes associated to metabolic pathways such as serotonin and dopamine, as well as genes expressed in the brain cortex, which have been related to patterns of aggressive behavior in humans and laboratory animals.

Las técnicas actuales de genotipado masivo de marcadores SNP han proporcionado una herramienta muy útil, tanto para determinar la diversidad como para la mejora genética animal. Sin embargo, en las razas españolas de vacuno de carne su aplicabilidad no ha sido tan evidente hasta ahora. Es por esta razón, que las preguntas más importantes que se plantearon en esta tesis doctoral fueron: 1) determinar la cantidad de variación genética que hay en las principales razas autóctonas de ganado de carne español; 2) estimar la estructuración de esa variación en las distintas poblaciones; 3) calcular las distancias genéticas y tener una visión global del grado de mixtura entre las distintas razas; y 4) explorar la historia y constitución genética de las razas a través del desequilibrio de ligamiento, la persistencia de fases y el tamaño efectivo ancestral con miras a una futura implementación de la selección genómica. Las razas objeto de estudio y el número de trios analizados fueron los siguientes: Asturiana de los Valles (AV, 25), Avileña-Negra Ibérica (ANI, 24), Bruna dels Pirineus (BP, 25), Morucha (Mo, 25), Pirenaica (Pi, 24), Retinta (Re, 23) y Rubia Gallega (RG, 22). Los análisis partieron con la estimación de los parámetros demográficos y poblacionales evaluados mediante un análisis de pedigrís. Los resultados mostraron incrementos continuos de los censos poblacionales y una alta tasa de intercambio de machos reproductores entre rebaños en todas las razas evaluadas. La compleción del pedigrí mostró índices promedio del 92% una generación atrás y del 61% si se consideran seis generaciones previas. Los coeficientes de endogamia promedio variaron entre 0,6% (BP) y 7,2% (Re). El tamaño efectivo de la población, basado en el incremento promedio de la tasa de endogamia individual para generaciones equivalentes, varió entre 19 (Mo) y 90 (AV). El número efectivo de ancestros osciló entre 42 (RG) y 838 (BP) y fue menor de lo que era el número efectivo de fundadores en todas las razas, lo que sugiere la existencia de cuellos de botella en las poblaciones estudiadas. La diversidad y divergencia genética fueron evaluadas por medio de marcadores moleculares de tipo SNP obtenidos a partir de un chip de alta densidad. Los resultados mostraron una heterocigosis esperada de alrededor de 0,30. Por su parte, el análisis de varianza molecular reveló gran diversidad dentro de individuos y un bajo grado de divergencia entre las razas. Las distancias genéticas, estimadas entre cada par de poblaciones, indicaron una estrecha relación. El árbol filogenético neighbor joining y el análisis de componentes principales mostraron dos grupos principales de razas: Pi y BP, por un lado, y ANI, Mo y Re, por el otro. Las razas AV y RG, por su parte, ocuparon una posición intermedia. El análisis de clúster reveló cierto grado de mixtura entre las razas. La magnitud del desequilibrio de ligamiento y la persistencia de las fases haplotípicas, estimadas a partir de los marcadores SNP, disminuyeron a medida que se incrementó la distancia entre los marcadores. Estos resultados indican que con un panel de cómo mínimo 38.000 SNP dentro de cada raza o con un panel de entre 50.000 y 83.000 SNP entre razas sería suficiente para alcanzar un programa de selección genómica exitoso. Por otro lado, la divergencia entre razas se dio aproximadamente en la primera mitad de la Edad Media. Los tamaños efectivos ancestrales revelaron una disminución sustancial hace 200 generaciones, prolongándose de forma continuada hasta la actualidad. Los resultados de este estudio son relevantes para la futura implementación dentro y entre razas de programas de selección genómica en las poblaciones de ganado vacuno español.
Currently, massive SNP genotyping techniques have provided a very useful tool, both to determine the diversity as well for breeding purposes. However, the applicability in the Spanish beef cattle breeds has not been so evident so far. It is for this reason that the most important questions raised in this thesis were: 1) to determine the genetic variation existing in the autochthonous Spanish beef cattle breeds; 2) to estimate the structure of this variation in the different populations; 3) to calculate the genetic distances and get an overview of the degree of admixture between breeds; and 4) to explore the genetic history of the breeds through linkage disequilibrium, persistence of LD phase and the past effective population size to implement genomic selection in the future. The breeds and number of trios used in this study were: Asturiana de los Valles (AV, 24), Avileña-Negra Ibérica (ANI, 24), Bruna dels Pirineus (BP, 25), Morucha (Mo, 25), Pirenaica (Pi, 24), Retinta (Re, 23) and Rubia Gallega (RG, 22). We estimated demographic and population parameters assessed by pedigree analysis. There were continued increases in population censuses and a high exchange rate of breeding males among herds in all breeds studied. Pedigrees showed average of completeness indexes of 92% one generation ago, and 61% six generations ago. Average inbreeding coefficients ranged from 0.6% (BP) to 7.2% (Re). Effective population size based on averages of individual increase of inbreeding by equivalent generations ranged from 19 (Mo) to 90 (AV). Effective number of ancestors ranged from 42 (RG) to 838 (BP), and was lower than was the effective number of founders in all breeds, suggesting the existence of bottlenecks in the populations studied. The genetic diversity and the degree of divergence were evaluated using a high-density SNP chip. The expected heterozygosity was around 0.30. The analysis of molecular variance revealed great diversity within individuals and low degree of divergence among breeds. The genetic distances, estimated between each pair of populations, indicate a close relationship. The neighbor joining phylogenetic tree and the principal component analysis showed two main groups of breeds: Pi and BP on the one hand, and ANI, Mo and Re, on the other. The AV and RG breeds occupied an intermediate position. A cluster analysis revealed some degree of admixture among breeds. The extent of linkage disequilibrium and the persistence of the haplotypic phases, estimated from molecular markers, decreased with the increase of the distance between markers. It is suggested that a minimum boundary of 38,000 and a maximum of 83,000 SNP markers would be needed for within breed and across-breed genomic evaluation, respectively. On the other hand, the divergence among breeds occurred about the first half of the Medieval period. Past effective sizes revealed a substantial decrease since 200 generations ago that continued until today. The results of this study are relevant for the future implementation of within breed and across breed genomic selection programs in the Spanish beef cattle populations.

The Antarctic bottoms harbour rich communities of sponges, which play an important role in structuring benthic habitats. Many Antarctic sponge species have been discovered in the past but most of them were poorly described or incorrectly ascribed to species or genera. Thus, the biodiversity this area is still incompletely explored. However, in the last 20 years the taxonomic and ecological studies of marine benthic invertebrates have benefited from the use of molecular tools, such a mitochondrial and nuclear markers or species-specific markers obtained from sequencing a part of the sponge genome. The present thesis contributed to improve the systematic of an Antarctic sponge group and its phylogenetic relationships with other members of the family (Tetillidae) spread all over the world, and to assess the asexual reproduction rate of an Antarctic sponge species (Stylocordyla chupachups). The phylogeny of Tetillidae has been previously approached using several nuclear and mitochondrial markers but including an incomplete number of Antarctic species. This study, did not resolve completely the family phylogeny and lacked a deep morphological revision of the species sequenced. Hence, in this thesis we performed a new phylogenetic analysis of the family by adding more Antarctic specimens and additional mitochondrial and nuclear markers. Moreover, the morphological characters plus the secondary structure of the (V4) region of the 18S rDNA were analyzed under the principle of maximum parsimony. The resulting trees retrieved seven monophyletic well-supported clades in both the molecular and morphological phylogenies, which correspond to the genera: Cinachyra, Acanthotetilla, Tetilla, Cinachyrella, Craniella, Antarctotetilla and Levantiniella. However, the mitochondrial and nuclear markers used were very conserved and could not discriminate Antarctic species of their corresponding genera (Antarctotetilla and Cinachyra). The revision of the species type of Tethya coactifera and Tethya crassispicula with the COI minibarcode sequence (useful for sequences with degraded DNA) confirmed that these two species were within the Antarctic clade, but the minibarcode was not informative at genus or species levels. Antarctotetilla and Levantiniella are described for the first time in this thesis. The main diagnostic traits of these genera are: pores grouped in small surface depressions and a slight cortical region (pseudocortex) in Antarctotetilla, and small surface cavities that resemble porocalices in Levantiniella. A detailed morphological revision of the types T. coactifera and T. crassispicula, confirmed that they belong to Antarctotetilla and Cinachyra, respectively. A new Antarctotetilla species (Antarctotetilla pilosa) was also described. On the other hand, we performed a genetic study of three populations of S. chupachups, using microsatellites, to test the hypothesis of a relatively higher asexual reproduction rate in Antarctic sponges due to the Antarctic stable environment and the selection of adapted genotypes. Our analysis proved that the 25% of the populations reproduce asexually, which represents a higher rate with respect to that reported for non-Antarctic sponge species. The three populations were slightly but significantly structured, which indicates a low genetic connectivity. Heterozygote excess was found in the three study populations. Relatively elevated rates of clonal reproduction and heterozygote excess are traits rarely found in sponge species from other latitudes and can be related to the particular environmental characteristics and the evolutionary history of the Antarctic. A founder effect was found in two of the study populations, which agrees with the pioneer nature reported for the species. At first sight, low genetic diversity resulting from a high rate of clonal reproduction would suggest vulnerability of sponge populations in the Antarctic ecosystems. However, compensatory genetic mechanisms, such an ancestral selection for heterozygotes, may be acting, and together with sexual reproduction, may preserve the minimal genetic diversity in S. chupachups populations to success in the Antarctic.
Esta tesis estudia las esponjas antárticas desde varios puntos de vista, utilizando especies ad hoc como “casos de estudio”. En primer lugar, analiza la sistemática y filogenia de la familia Tetillidae, muy bien representada en la Antártida. La filogenia molecular de Tetillidae había sido previamente estudiada pero los resultados no resolvieron las relaciones filogenéticas de todos los géneros analizados. Además, el estudio incluía un bajo número de especies antárticas. En esta tesis se pretende mejorar la filogenia de Tetillidae, incluyendo un número mayor de especies antárticas y utilizando marcadores moleculares adicionales. La filogenia molecular se complementó con un análisis filogenético de caracteres morfológicos bajo el criterio de máxima parsimonia. Los resultados mostraron que la familia está dividida en siete clados, dos de los cuales corresponden a los nuevos géneros: Antarctotetilla y Levantiniella. Los marcadores moleculares utilizados no discriminan las especies de los géneros Cinachyra y Antarctotetilla. Revisiones morfológicas y moleculares (partición minibarcode del COI) de los tipos de las especies Tethya coactifera y Tethya crassispicula confirmaron que estas especies pertenecen a los géneros Antarctotetilla y Cinachyra, respectivamente. Además, se describió una nueva especie de Antarctotetilla denominada A. pilosa. Una segunda parte de la tesis aborda el estudio genético de tres poblaciones de la especie Stylocordyla chupachups (Demospongiae, Suberitida), con un particular enfoque en la importancia de la reproducción asexual en las esponjas antárcticas, como adaptación al ambiente estable de los fondos antárticos. Se utilizaron ocho marcadores microsatélites seleccionados a partir de la secuenciación masiva de una parte del genoma de la especie. Los resultados mostraron que el 25% de la población se reproduce asexualmente, lo que representa una tasa alta comparada con las de esponjas de otras latitudes. Contrariamente a lo que se ha descrito en otras poblaciones de esponjas, las poblaciones de S. chupachups mostraron un exceso de heterocigotos. Las poblaciones estaban estructuradas, indicando un bajo flujo génico. Dos poblaciones presentaban un efecto fundador lo que confirma la naturaleza colonizadora de esta especie, sugerida en base a observaciones de su rápida colonización de áreas arrasadas por el efecto de los icebergs.

The human colonization of worldwide landmasses occurred through complex patterns of dispersal and admixture. At the same time, the survival in the different areas of the world depended on the adaptation to new habitats that imposed novel selective challenges. With the advent of high-throughput genotyping technologies and dense catalogues of human genetic variation, the demographic history of many human populations has been unraveled from genomic data, with important implications in medical genetics. However, several human groups are yet to be genetically characterized. These incomplete past histories include the determination of ancestries of the current Cuban population, as well as the origins and dispersal of European Romani, whose demographic history is aimed to be reconstructed in this work. Finally, the present study also aims to describe the genetic basis and evolution of one of the most striking human phenotypes, the African Pygmy height.
La colonización humana de las diferentes masas continentales se produjo mediante complejos patrones de dispersión y mezcla. La supervivencia en las diversas regiones del planeta ha dependido de la adaptación a las presiones selectivas impuestas por los nuevos hábitats. Con el desarrollo de tecnologías de genotipado masivo y las bases de datos de la diversidad genética humana, la historia demográfica de muchas poblaciones humanas, y sus implicaciones médicas, han sido descritas. Sin embargo, algunas poblaciones todavía no han sido caracterizadas genéticamente. Por ejemplo, tanto la descomposición de la ancestría genética de la población cubana actual como los orígenes y la dispersión de los gitanos europeos siguen siendo historias incompletas que se han reconstruido en esta tesis. Finalmente, este estudio también tiene como objetivo describir la evolución y las bases genéticas de uno de los fenotipos humanos más llamativos, la altura de los pigmeos africanos.

Tese de mestrado, Microbiologia Aplicada, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2020
Erwinia amylovora is a phytopathogenic bacterium and the causative agent of fire blight, a destructive disease that affects several members of the Rosaceae family. Pear and apple are particularly susceptible hosts of this bacterium, representing a major concern due to their socioeconomic value. The devasting nature of this disease has led to the classification of E. amylovora as a quarantine organism. Although this bacterium is widespread throughout the world, its emergence in Portugal happened relatively recently when compared to other European countries. Since its first report in 2006 in Fundão region, the number of outbreaks has increased, leading Portugal to loss its statute of Integral Protected Area within the European Union, in 2019. Factors such as the absence of a cure, false-negatives results and the need to understand unknown aspects about the life cycle of E. amylovora, lead to the interest in conducting characterization studies and developing alternative laboratory methods as an attempt to make preventive measures more effective. A set of Portuguese and foreign E. amylovora isolates was characterized by molecular, pathogenicity and virulence studies. Molecular characterization used CRISPR-PCR and genomic fingerprintings, whereas pathogenicity and virulence were assessed by biological tests on immature fruitlets of Pyrus communis cv. “Rocha”. In addition, a flow cytometry and an immuno-flow cytometry protocols were developed using pure and mixed bacterial cultures for the detection and cell viability assessment of E. amylovora in planta. A total of two CRISPR genotypes, A and D, was observed revealing a low genetic diversity among the E. amylovora isolates tested. Genomic fingerprinting reinforced the high homogeneity of this species. In contrast, a wide diversity in virulence was displayed. Flow cytometry and immuno-flow cytometry protocols were validated, revealing the capacity to detect and distinguish different viability states of E. amylovora artificially inoculated in pear fruitlets. In the future, the established protocols may help shed some light over previously undiscovered aspects of E. amylovora life cycle.
Erwinia amylovora é uma bactéria fitopatogénica Gram-negativa responsável pela doença comummente denominada por fogo bacteriano. A designação desta doença está relacionada com o desenvolvimento de necroses de cor castanha a preta no hospedeiro durante o processo de infeção, cuja aparência se assemelha a uma queima. Outros sintomas típicos incluem o surgimento de lesões, exsudado bacteriano, cancros nos ramos e tronco, bem como de mumificação dos frutos. Originalmente nativa da América do Norte, E. amylovora foi detetada pela primeira vez no final do século 18. Atualmente, por consequência da ação humana, a doença está amplamente disseminada pelo globo. Devido à elevada capacidade de propagação e ao efeito potencialmente devastador para os seus hospedeiros, E. amylovora foi classificada como um organismo de quarentena. Os hospedeiros desta bactéria pertencem à família Rosaceae, na qual estão inseridos géneros de plantas agrícolas importantes a nível socioeconómico, tais como Malus e Pyrus, Em Portugal, a presença de fogo bacteriano foi reportada pela primeira vez em 2006 no Fundão, data relativamente tardia aquando comparação do surgimento da doença nos restantes países da Europa. Desde então, a ocorrência de situações reportadas em várias regiões do país tem vindo a aumentar, fazendo com que o país perdesse o estatuto de Zona Integral Protegida na União Europeia em 2019. Alguns fatores que tornam esta doença preocupante são a inexistência de cura e o desconhecimento de alguns aspetos do ciclo de vida de E. amylovora. Assim, são aplicadas estratégias de controlo que incluem abordagens complementares, tais como medidas preventivas, profiláticas e de erradicação. Outro fator preocupante é a ocorrência de resultados falso-negativos aquando aplicação dos métodos utilizados para o diagnóstico desta bactéria. Estes podem dever-se a uma concentração bacteriana insuficiente ou à indução do estado viável não cultivável em E. amylovora, o qual pode estar associado, por exemplo, a condições climáticas adversas e à utilização de compostos cúpricos como medida profilática. Um diagnóstico errado pode conduzir à falta de aplicação de medidas de controlo e, consequentemente, acarretar consequências catastróficas. O presente trabalho teve dois objetivos. O primeiro consistiu na caracterização de um conjunto de isolados de Erwinia amylovora da Coleção Portuguesa de Bactérias Fitopatogénicas através de estudos genómicos, de patogenicidade e de virulência. O segundo compreendeu o desenvolvimento e validação de protocolos de citometria de fluxo e de imuno-citometria de fluxo, para servirem como método de diagnóstico alternativo na deteção e avaliação da viabilidade celular de populações de E. amylovora presentes em material infectado. Um total de 48 isolados de E. amylovora foram caracterizados genotipicamente a partir da utilização CRISPR-PCR e de fingerprintings genómicos, nomeadamente rep- e MSP-PCR. A patogenicidade e virulência destes isolados foram caracterizadas a partir da utilização de frutos imaturos de Pyrus communis cv. “Rocha”, os quais foram artificialmente infetados por um subconjunto dos 48 isolados. Após 6 e 12 dias de infeção, foram registados o tamanho da lesão necrótica e a presença/ausência de exsudado bacteriano, respetivamente. Para avaliação da viabilidade celular de E. amylovora por citometria de fluxo, foram testados três fluoróforos diferentes, nomeadamente Syto9, PI e DIBAC4(3). Estes foram aplicados em células tratadas por calor e em células não tratadas. A aplicação do protocolo de imuno-citometria de fluxo compreendeu o uso do anticorpo monoclonal Ea7A IVIA e de um anticorpo secundário conjugado com FITC. Ambos os protocolos foram testados primeiramente numa cultura pura de E. amylovora e posteriormente em culturas mistas. Por fim, os dois protocolos foram implementados na deteção e avaliação de viabilidade celular de E. amylovora presente em peras imaturas cv. “Rocha” infetadas artificialmente. A técnica CRISPR-PCR permitiu diferenciar os isolados em dois grupos consoante a presença ou ausência da duplicação do spacer 1029, nomeadamente em genótipo A e genótipo D, respetivamente. A análise dos isolados Portugueses permitiu verificar que ambos os genótipos estão presentes no país desde 2010 e que existe uma ligeira predominância do genótipo D, o qual foi registado em 17 dos 31 isolados. Em termos de distribuição, observou-se que o genótipo A e D estão presentes nas regiões Centro e Oeste de Portugal, contudo no Alentejo só se verificou a presença do genótipo A. Aquando análise conjunta de resultados de estudos prévios com os que foram obtidos no presente trabalho, verificou-se que o genótipo A é o genótipo mais distribuído na Europa, possivelmente devido à introdução mais precoce do mesmo no continente Europeu. As técnicas de fingerprinting genómico utilizadas, nomeadamente rep- e MSP-PCR, permitiram a obtenção de perfis genómicos complexos, mas muito homogéneos entre si. Desta forma, os mesmos mostraram não ter poder discriminatório suficiente para a diferenciação dos isolados de E. amylovora a nível infraespecífico. Estes resultados são o reflexo de uma variedade genómica limitada característica desta espécie bacteriana, que culmina numa elevada homogeneidade entre os isolados. Os ensaios em peras imaturas revelaram que, à excepção dos isolados CPBF 142 e CPBF 544, 43 isolados são patogénicos, uma vez que possuíram a capacidade de induzir o aparecimento de pelo menos um dos sintomas típicos do fogo bacteriano no hospedeiro. Todos os isolados patogénicos provocaram lesão necrótica de cor castanha a preta, contudo apenas 28 isolados produziram exsudado bacteriano. A análise destes sintomas permitiu observar variabilidade na virulência, de tal modo que os isolados foram distribuídos em três categorias de virulência, nomeadamente baixa, média e alta. Estas categorias tiveram em consideração o tamanho da lesão necrótica provocada no hospedeiro. Adicionalmente, observou-se a existência de correlação entre a categoria de virulência baixa e o genótipo D. Os dados de CRISPR-PCR, patogenicidade, virulência e presença/ausência de exsudado bacteriano foram agrupados para uma análise polifásica de modo a adquirir mais informação acerca dos isolados. Os dados obtidos por fingerprinting genómico não foram considerados, uma vez que não tiveram o poder discriminatório adequado. A utilização desta abordagem permitiu separar os isolados em 11 grupos de estirpes distintos. Contudo, não foi possível fazer uma associação entre estes grupos e o hospedeiro original a partir do qual cada isolado foi obtido. Relativamente à citometria de fluxo, a utilização dos fluoróforos permitiu a distinção de diferentes populações relativamente à integridade celular e potencial membranar presentes na cultura pura de E. amylovora. De facto, esta técnica apresentou uma boa correlação entre a viabilidade esperada e a observada, o que significa que os três fluoróforos se mostraram apropriados para serem utilizados em estudos de viabilidade celular nesta bactéria. O estudo de viabilidade celular de E. amylovora em cultura mista ficou comprometido devido ao comportamento semelhante que as bactérias podem ter face aos fluoróforos. O protocolo de imuno-citometria de fluxo permitiu detetar E. amylovora em cultura pura a partir da observação de uma elevada intensidade de fluorescência verde. Em cultura mista, para além da intensidade de fluorescência verde característica de E. amylovora, verificou-se também a ocorrência de uma emissão de fluorescência verde menor que se supõe que resulte de ligações inespecíficas entre o anticorpo secundário e outros alvos que não o anticorpo monoclonal Ea7A IVIA. Contudo, uma vez que a intensidade da emissão de fluorescência verde adicional foi reduzida, a mesma não impossibilitou a detecção de E. amylovora. O presente estudo reforçou a paradoxalidade existente entre a homogeneidade genómica e a heterogeneidade de virulência em Erwinia amylovora. Adicionalmente, o mesmo mostrou que o desenvolvimento de um potencial método alternativo para a detecção desta bactéria, nomeadamente com recurso a citometria de fluxo e técnicas afins, pode significar uma melhoria considerável no processo de diagnóstico, bem como abrir portas para descobertas futuras relacionadas com o ciclo de vida de E. amylovora.