Academic literature on the topic '¿-glucosidasa'

La α-glucosidasa II participa en la ruta de la N-glicosilación de proteínas. En Candida albi­cans se ha aislado un polipéptido soluble de 47 kDa con actividad de α-glucosidasa II; sin embargo, análisis bioinformáticos indican que la enzima nativa pudiera tener un peso mo­lecular de 100 kDa. En este trabajo se estudió el efecto de inhibidores de proteasas sobre la distribución intracelular de la α-glucosidasa II. Se demostró que la distribución intracelular no fue afectada significativamente, pero la actividad de la α-glucosidasa II estuvo asociada a una proteína de 83 ó 47 kDa en ausencia o presencia de inhibidores de proteasas, res­pectivamente. La enzima soluble de 83 kDa se purificó por métodos convencionales y se demostró que presenta características bioquímicas similares a la enzima de 47 kDa. Estos datos confirmaron que la proteína de 83 kDa es una α-glucosidasa II y sugieren que es precursora de la enzima de 47 kDa previamente descrita.

La pitahaya amarilla (Hylocereus megalanthus) y el tumbo serrano (Passiflora tripartita var. mollisima) son frutos cultivados en Perú. El objetivo de este estudio fue evaluar la propiedad hipoglicemiante de estos frutos mediante la inhibición in vitro de las enzimas α-amilasa y α-glucosidasa. Los frutos fueron despulpados y liofilizados, y luego de preparar los respectivos extractos acuosos, se determinó el contenido de polifenoles totales (TPC) mediante el método de Folin-Ciocalteu. La actividad inhibitoria se determinó mediante el IC50 y se evaluó el tipo de inhibición utilizando 0,25-2 mg/mL y 0,02-0,28 mg/mL del extracto del tumbo serrano sobre la α-amilasa y α-glucosidasa, respectivamente. Para la pitahaya se empleó 4-64 mg/ml y 0,8-25,6 mg/mL sobre la α-amilasa y α-glucosidasa, respectivamente. Los TPC para el tumbo serrano y pitahaya amarilla fueron de 614,67 y 16,17 mg/100 g de muestra, respectivamente, expresados en equivalente de ácido gálico. El extracto acuoso de tumbo serrano inhibió a las enzimas α-amilasa y α-glucosidasa (tipo no competitiva mixta) con un IC50 de 1719,18 y 77,68 μg/Ml, respectivamente, mientras que la pitahaya amarilla solo inhibió a la enzima α-glucosidasa con un IC50 de 8692,4 μg/mL (tipo competitiva).

La diabetes es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en el mundo. Muchos estudios están dirigidos hacia la búsqueda de componentes dietarios que sean benéficos para su tratamiento y prevención. El objetivo del presente estudio fue examinar el efecto antioxidante e inhibitorio de α-glucosidasa y α-amilasa de extractos acuosos de canela (Cinnamomum zeylanicum), comino (Cumi­num cyminum), orégano (Origanum vulgare), pimienta negra (Piper nigrum) y clavo (Euge­nia caryophyllus), que son especias utiliza­das comúnmente en la cocina mexicana. Se prepararon extractos acuosos (50 °C durante 3 h) y se determinó el contenido de compues­tos fenólicos totales, actividad antioxidante y potencial inhibitorio in vitro de α-glucosidasa y α-amilasa. El contenido de compuestos fenólicos totales varió de 3.12 a 104.4 mg/g de muestra. Todos los extractos mostraron ac­tividad antioxidante que fue expresada como porcentaje de inhibición del radical DPPH- (30 % a 80 %) y capacidad inhibitoria de α-glucosidasa de 22 % a 70 %. La inhibición de la actividad α-amilasa se encontró de 0 % a 50 %. Los extractos acuosos de canela pre­sentaron mayor capacidad inhibitoria contra la acción de la α-glucosidasa y actividad con­tra el radical DPPH-, los extractos acuosos de orégano mostraron menor inhibición de la actividad α-glucosidasa y no presentaron inhibición contra la actividad α-amilasa. La efectividad inhibitoria de las enzimas y el contenido de compuestos fenólicos totales no presentó correlación. Sin em­bargo, se encontró una correlación entre la actividad antioxidante y el contenido de compuestos fenólicos totales (r2 = 0.94, P < 0.05). La inhibición de α-glucosidasa y α-amilasa es una de las formas terapéuti­cas para retardar la digestión y absorción de los carbohidratos y en consecuencia, la reducción de glucosa postprandial en sangre. El uso de especias culinarias con­sumidas en los platillos mexicanos podría representar un uso potencial durante los estados tempranos de hiperglicemia.

Introducción: La enfermedad de Gaucher es un trastorno metabólico por deficiencia o ausencia de enzima β-Glucosidasa Ácida. El diagnóstico se sospecha clínicamente, pero requiere confirmación mediante medición, en leucocitos (estándar de oro) o en sangre seca sobre papel de filtro, de la actividad de la enzima β-Glucosidasa Ácida. Objetivo: Evaluar la validez de la medición de la actividad de la enzima β-Glucosidasa Ácida en sangre seca en papel de filtro, comparada con el estándar de oro, para el diagnóstico de enfermedad de Gaucher en pacientes con sospecha clínica. Metodología: Se hizo una revisión sistemática de literatura. Se construyó y validó una pregunta PICO. Se usó una estrategia de búsqueda genérica con base en los términos clave (Gaucher Disease y Dried Blood Spot Analysis). Dos evaluadores independientes revisaron, evaluaron la calidad y extrajeron la información de los artículos. Resultados: Descartando los duplicados, se obtuvieron 47 artículos. Se evaluaron los textos completos de cuatro, y tres de ellos fueron excluidos al aplicar criterios de inclusión y exclusión. El artículo incluido tuvo una calidad excelente y mostró que la actividad enzimática de la glucocerebrosidasa en sangre seca tuvo sensibilidad de 82.3% y especificidad de 94.0% con un punto de corte de 0.0-2.75 y sensibilidad de 88.2% y especificidad de 88.5% con un punto de corte de 0.0-4.4. Conclusiones: La medición enzimática de la β-glucosidasa ácida en sangre seca es una excelente prueba para diagnóstico inicial de enfermedad de Gaucher. Sin embargo, no es una prueba concluyente. [Vera-Cala LM, Serrano-Gómez SE, Córtes A, Estrada I, Gáfaro A. Validez de la prueba de actividad enzimática de la glucocerebrosidasa para el diagnóstico de enfermedad de Gaucher, revisión sistemática. MedUNAB 2017; 20(2): 201-206].

La cebolla (Allium cepa L.) ha sido cultivada durante miles de años y es utilizada como un componente importante en la dieta del ser humano. Estudios recientes sugieren que su consumo puede reducir o prevenir problemas de salud como asma, enfermedades cardiovasculares y diabetes, debido a sus efectos antioxidantes.En este estudio se determinó el contenido de compuestos fenólicos totales, la capacidad antiradical y la inhibición de las enzimas α-glucosidasa y α-amilasa de extractos acuosos y etanólicos de tres variedades de cebolla (blanca, amarilla y morada). El contenido de compuestos fenólicos totales varió de 6.59 a 9.25 mg/100 g y la actividad antiradical expresada como % DPPH- se encontró entre 20.4% a 39.6% y de 46.8 a 89.2% para los extractos acuosos y etanólicos respectivamente. Todos los extractos etanólicos fueron capaces de inhibir la actividad α-glucosidasa y α-amilasa de 58% a 34%% y 33 y 22% respectivamente, mientras que los extractos acuosos fueron menos efectivos. Entre los extractos estudiados, el extracto etanólicos de cebolla morada presenta la mayor concentración de compuestos fenólicos totales y la mayor actividad antiradical e inhibidora de α-glucosidasa. Las diferencias encontradas entre la concentración de compuestos fenólicos y las distintas actividades estudiadas parecen depender del perfil único de compuestos fenólicos que posee cada variedad de cebolla.

<span style="font-family: Verdana; font-size: small;"><em>Physalis peruviana</em> es una especie andina, cuyos frutos además de ser usados como alimento, son empleados en la medicina tradicional para el tratamiento de la diabetes mellitus. Además, estudios farmacológicos previos en ratas Wistar han demostrado actividad antidiabética de extractos de frutos de <em>P. peruviana</em>. Con el fin de profundizar en el modo de acción de la actividad antidiabética de los frutos de <em>P. peruviana</em>, en la presente investigación se determinó la concentración inhibitoria 50 (CI₅₀) del extracto crudo de frutos de <em>P. peruviana</em>, sobre las enzimas alfa glucosidasa obtenida de <em>S. cerevisiae</em> y de polvo intestinal de rata, maltasa y alfa amilasa. El comportamiento cinético del extracto sobre cada una de las enzimas también fue investigado y la constante enzimática (Km) y la velocidad máxima (Vmax) fueron determinadas. El extracto de frutos de <em>P. peruviana</em>, mostró diferentes valores de CI₅₀ para alfa glucosidasa obtenida de <em>S. cerevisiae</em> y para la obtenida de polvo intestinal de rata, sugiriendo una mayor afinidad por la enzima de origen mamífero (4114,7 and 3552,7 µg/mL, respectivamente). Para maltasa la CI₅₀ fue cercana a la obtenida para alfa glucosidasa (4191,0 µg/mL), mientras para alfa amilasa, el extracto presentó la mayor inhibición (CI₅₀: 619,9 g/mL). Respecto al comportamiento cinético, el extracto mostró inhibición de tipo competitiva sobre alfa glucosidasa y maltasa y no competitiva sobre alfa amilasa. Los resultados sugieren que la inhibición de carbohidrasas intestinales es uno de los modos de acción de los frutos de <em>P. peruviana</em> como agente antidiabético.</span>

ABSTRACT We cloned the genomic DNA and cDNA of bglA, which encodes β-glucosidase in Aspergillus kawachii, based on a partial amino acid sequence of purified cell wall-bound β-glucosidase CB-1. The nucleotide sequence of the cloned bglA gene revealed a 2,933-bp open reading frame with six introns that encodes an 860-amino-acid protein. Based on the deduced amino acid sequence, we concluded that the bglA gene encodes cell wall-bound β-glucosidase CB-1. The amino acid sequence exhibited high levels of homology with the amino acid sequences of fungal β-glucosidases classified in subfamily B. We expressed the bglA cDNA inSaccharomyces cerevisiae and detected the recombinant β-glucosidase in the periplasm fraction of the recombinant yeast.A. kawachii can produce two extracellular β-glucosidases (EX-1 and EX-2) in addition to the cell wall-bound β-glucosidase.A. kawachii in which the bglA gene was disrupted produced none of the three β-glucosidases, as determined by enzyme assays and a Western blot analysis. Thus, we concluded that thebglA gene encodes both extracellular and cell wall-bound β-glucosidases in A. kawachii.

La enfermedad de Pompe es una enfermedad inusual de presentación temprana, causada por el déficit de la síntesis de α 1-4 glucosidasa ácida. Presentamos un caso de inicio insidioso descompensado evidenciándose dificultad respiratoria y cardiomiopatía. La enfermedad de Pompe es muy infrecuente, siendo el primer caso reportado en nuestro medio.

El hombre, a través del manejo sustentable de los bosques nativos existentes y de forestaciones, es capaz de aumentar los flujos y reservas del carbono utilizando el enorme potencial de los bosques para mitigar los efectos del cambio del clima sobre la tierra. Las distintas especies de árboles afectan las propiedades químicas y microbiológicas del suelo. El objetivo de este trabajo fue estudiar la influencia sobre la calidad de un suelo de dos especies arbóreas implantadas, Eucalipto (Eucalyptus camaldulensis) y Roble europeo (Querqus robur), en dos muestreos en diferentes épocas del año, a través de indicadores biológicos, evaluando el potencial uso de la especie Roble europeo para posibles forestaciones en el sitio de estudio. El estudio se realizó en un establecimiento forestal (Luján, provincia de Buenos Aires) donde se seleccionaron al azar 10 árboles de cada una de las especies mencionadas. Se realizaron dos muestreos en distintas épocas del año. Se tomaron muestras superficiales de suelo debajo de cada árbol sobre las cuales se determinaron las actividades β-glucosidasa, fosfatasa ácida, proteasa, carbono orgánico y carbono de respiración. Los indicadores estudiados tales como la actividad enzimática de la β-glucosidasa y proteasa, carbono orgánico y carbono de respiración mostraron una tendencia hacia una mejor calidad del suelo desde el punto de vista microbiológico, cuando este se encuentra bajo la influencia de la especie Roble europeo respecto de Eucalipto, siendo esta influencia significativa en el muestreo de primavera. Por otro lado, la enzima β-glucosidasa resultó ser el indicador más sensible en nuestros resultados ya que influyó significativamente en ambos muestreos realizados. Sería de interés continuar con estudios que corroboren que plantaciones de Roble europeo podrían ser beneficiosas para mantener o mejorar la calidad del suelo respecto de plantaciones de Eucalipto, siendo el Roble europeo una especie promisoria desde un punto de vista microbiológico por generar una mejor calidad del suelo.

La Diabetes Mellitus es un trastorno crónico del metabolismo que conlleva a un aumento anormal en los niveles de glucosa en plasma, como consecuencia de la producción desequilibrada de insulina y/o la insensibilidad al efecto de esta hormona en la transducción de señales de los receptores celulares. Estos cambios metabólicos van acompañados de modificaciones en el metabolismo de carbohidratos, lípidos y proteínas y este trastorno puede conllevar al deterioro de diversos órganos como la ceguera e incluso está implicado en causas de muerte. La mayoría de las complicaciones de la diabetes tipo 2 en los pacientes se deben a la hiperglucemia como su causa principal. Una de las estrategias efectivas para el manejo de la diabetes tipo 2 es la inhibición de la hidrólisis de polisacáridos complejos por la α-amilasa pancreática y a limitación de la absorción de glucosa al inhibir la enzima α-glucosidasa. En este sentido, se ha realizado una revisión de la α-glucosidasa, su mecanismo de actuación y se presenta una posible vía de inhibición mediante flavonoides naturales.

En el presente trabajo se caracterizaron glicosil hidrolasas (GHs) y permeasas fúngicas implicadas en el metabolismo y transporte de azúcares, con dos aplicaciones diferentes: la producción de etanol y la síntesis de isomaltooligosacáridos (IMOS). Se han abordado tres objetivos específicos: 1) desarrollar un proceso eficiente de sacarificación y fermentación simultánea (SSF) de celulosa; 2) comparar distintas estrategias para la fermentación de celobiosa, paso crítico en la fermentación de celulosa; 3) sintetizar IMOS utilizando como material catalítico células de levadura que producen una ¿-glucosidasa de Aspergillus niger. En el proceso propuesto de sacarificación y fermentación simultánea celulosa, el material de partida (papel de filtro) se digirió con una preparación enzimática de Trichodema reesei, y se fermentó con una cepa recombinante de Saccharomyces cerevisiae (T500) que secreta una ß-glucosidasa de Saccharomycopsis fibuligera. La actividad ß-glucosidasa, deficitaria en el cóctel celulolítico de T. reesei, mejoró el progreso de la hidrólisis de la celulosa y la fermentación, ya que disminuye el efecto inhibitorio causado por la acumulación de celobiosa. Con este proceso se alcanzaron rendimientos de etanol por encima de 70 g/L. Se han comparado estrategias de hidrólisis extracelular o intracelular de celobiosa. Para ello, se utilizó la cepa T500 y nuevas cepas recombinantes generadas en este estudio. En una primera aproximación para la hidrólisis intracelular, se ensayaron tres ß-glucosidasas distintas y una permeasa de celobiosa de Penicillium oxalicum. En los transformantes resultantes, la tasa de crecimiento en celobiosa se vio limitada por ß-glucosidasas con baja actividad celobiasa, pero por encima de cierto valor de actividad el principal cuello de botella fue el transporte del azúcar. Por esta razón, buscamos nuevos transportadores de celobiosa procedentes de T. reesei. De 107 secuencias designadas como transportadores de azúcares en el genoma de T. reesei, se seleccionaron diez por su mayor similitud de secuencia con permeasas de celobiosa de otros hongos caracterizadas funcionalmente. Solo una de ellas (Tr_StrC) fue capaz de facilitar el transporte de celobiosa y permitir el crecimiento de S. cerevisiae. Finalmente, se comparó la capacidad de fermentar celobiosa de los dobles transformantes de levadura, con capacidad de transportar e hidrolizar intracelularmente el disacárido, con la del transformante T500. La estrategia extracelular permitió una tasa de fermentación más rápida y mayores rendimientos de etanol en comparación con la estrategia intracelular. La cepa T500 también fue más eficiente en un sistema SSF de celulosa. Se han construido y analizado cepas recombinantes de S. cerevisiae que expresan un gen (aglA) que codifica una ¿-glucosidasa de A. niger. Los transformantes de levadura produjeron actividad ¿-glucosidasa extracelularmente, la mitad de la cual quedó asociada a células y la otra mitad fue liberada al medio de cultivo. Usando maltosa como único sustrato de partida, tras 8 h de incubación, el principal producto de transglicosilación fue panosa, pero tras 24 h el producto predominante fue isomaltosa. La isomaltosa también predominó a tiempos cortos de reacción, si en lugar de sólo maltosa se utilizaba de partida una mezcla de maltosa y glucosa. Para facilitar la síntesis de IMOS se diseñó un proceso en el cual las células de levadura pueden ser utilizadas directamente como material catalítico. Para ello, se expresaron en S. cerevisiae construcciones génicas del gen aglA fusionado con el gen de levadura SED1, en versión completa o truncada, que posee la secuencia GPI (glicosilfosfatidil inositol) de anclaje a pared celular. Las enzimas híbridas resultantes se fijaron de forma estable a la superficie celular. Las células provenientes de los cultivos recombinantes que expresan las construcciones aglA-SED1 se pudieron reciclar p
In the present work, glycosyl hydrolases (GHs) and fungal permeases involved in the metabolism and transport of sugars were characterized, with two different applications: the production of ethanol and the synthesis of isomaltooligosaccharides (IMOS). Three specific objectives have been addressed in order to: 1) develop an efficient process of saccharification and simultaneous fermentation (SSF) of cellulose; 2) compare different strategies for cellobiose fermentation, a critical step in cellulose fermentation; 3) synthesize IMOS using, as catalytic material, yeast cells that produce Aspergillus niger ¿-glucosidase. Strategies for extracellular or intracellular hydrolysis of cellobiose have been compared. To this end, the T500 strain and new recombinant strains generated in this study were used. In a first approach for intracellular hydrolysis, three different ß-glucosidases and a cellobiose permease from Penicillium oxalicum were tested. In the resulting transformants, growth rate in cellobiose was limited by ß-glucosidases with low cellobiase activity, but above a certain activity value the main bottleneck was sugar transport. For this reason, we searched novel cellobiose transporters from T. reesei. Among 107 sequences designated as sugar transporters in the genome of T. reesei, ten were selected based on their higher sequence similarity with functionally characterized cellobiose permeases from other fungi. Only one of them (Tr_StrC) was able to facilitate cellobiose transport and to allow growth of S. cerevisiae. Finally, the ability to ferment cellobiose of the double yeast transformants, capable of transporting and hydrolyzing the disaccharide intracellularly, was compared with that of the transformant T500. The extracellular strategy allowed a faster fermentation rate and higher ethanol yields compared to the intracellular approach. The T500 strain was also more efficient in a cellulose SSF system. Recombinant strains of S. cerevisiae expressing a gene (aglA) encoding an ¿-glucosidase from A. niger have been constructed and analyzed. The yeast transformants produced ¿-glucosidase activity extracellularly, half of which was cell-associated and the other half was released into the culture medium. Using maltose as the only initial substrate, after 8 h of incubation, the main product of transglycosylation was panose, but after 24 h the predominant product was isomaltose. Isomaltose also predominated at short reaction times, if a mixture of maltose and glucose was used instead of maltose alone. In order to facilitate the synthesis of IMOS, a process was designed in which the yeast cells can be used directly as catalytic material. For this purpose, the aglA coding region was fused to full-length or truncated versions of the yeast gene SED1, containing the GPI (glycosylphosphatidyl inositol) sequence for anchoring to the cell wall, and expressed in S. cerevisiae. The resulting hybrid enzymes were fixed stably to the cell surface. Cells from the recombinant cultures expressing the aglA-SED1 constructs could be recycled to produce IMOS in successive reactions.
En aquest treball es van caracteritzar glicosil hidrolases (GHs) i permeases fúngiques implicades en el metabolisme i transport de sucres, amb dos aplicacions diferents: la producció d'etanol i la síntesi d'isomaltooligosacàrids (IMOS). S'han abordat tres objectius específics: 1) desenvolupar un procés eficient de sacarificació i fermentació simultània (SSF) de cel·lulosa; 2) comparar distintes estratègies per a la fermentació de celobiosa, pas crític en la fermentació de cel·lulosa; 3) sintetitzar IMOS utilizant com a material catalític cèl·lules de llevat que produeixen una ¿-glucosidasa de Aspergillus niger. En el procés proposat de sacarificació i fermentació simultània de cel·lulosa, el material de partida (paper de filtre) es va digerir amb una preparació enzimàtica de Trichodema reesei i es va fermentar amb una soca recombinant de Saccharomyces cerevisiae (T500), la qual secreta una ß-glucosidasa de Saccharomycopsis fibuligera. L'activitat ß-glucosidasa, deficitària en el còctel cel·lulolític de T. reesei, va millorar el progrés de la hidròlisi de la cel·lulosa i la fermentació, ja que disminuiex l'efecte inhibitori causat per l'acumulació de celobiosa. Amb aquest procés es van assolir rendiments d'etanol superiors a 70 g/L. S'han comparat estratègies d'hidròlisi extracel·lular o intracel·lular de celobiosa. Per a això, es va emprar la soca T500 i noves soques recombinants generades en aquest estudi. En una primera aproximació per a l'hidròlisi intracel·lular, s'assajaren tres ß-glucosidases distintes i una permeasa de celobiosa de Penicillium oxalicum. Als transformants resultants, la tasa de creixement amb celobiosa va estar limitada per ß-glucosidases amb baixa activitat celobiasa, però per damunt d'un cert valor d'activitat el principal coll d'ampolla va ser el transport del sucre. Per aquesta raó, cercàrem nous transportadors de celobiosa procedents de T. reesei. De 107 seqüències designades com a transportadors de sucres en el genoma de T. reesei, es van seleccionar deu per la seua major similitut de seqüència amb permeases de celobiosa d'altres fongs caracteritzades funcionalment. Només una d'elles (Tr_StrC) va ser capaç de facilitar el transport de celobiosa i permetre el creixement de S. cerevisiae. Finalment, es va comparar la capacitat de fermentar celobiosa dels dobles transformants de llevat, amb capacitat de transportar i hidrolitzar intracel·lularment el disacàrid, amb la del transformant T500. La estratègia extracel·lular va permetre una tasa de fermentació més ràpida i majors rendiments d'etanol en comparació amb la estratègia intracel·lular. La soca T500 també va ser més eficient en un sistema SSF de cel·lulosa. S'han construït i analitzat soques recombinants de S. cerevisiae que expresen un gen (aglA) que codifica una ¿-glucosidasa de A. niger. Els transformants de llevat produiren activitat ¿-glucosidasa extracelul·larment, la meitat de la qual va quedar associada a cèl·lules i l'altra meitat va ser alliberada al medi de cultiu. Utilitzant maltosa com a únic substrat de partida, després de 8 h d'incubació, el principal producte de transglicosilació va serpanosa, però després de 24 h el producte predominant va ser isomaltosa. La isomaltosa també va predominar a tiemps curts de reacció, si en lloc de només maltosa s'utilizava de partida una combinació de maltosa i glucosa. Per a facilitar la síntesi de IMOS es va dissenyar un procés en el qual les cèl·lules de llevat poden ser utilitzades directament com a material catalític. Per a això, s'expresaren en S. cerevisiae construccions gèniques del gen aglA fusionat amb el gen de llevat SED1, en versió completa o truncada, el qual conté la seqüència GPI (glicosilfosfatidil inositol) d'ancoratge a paret cel·lular. Els enzims híbrids resultants es van fixar de forma estable a la superfície cel·lular. Les cèl·lules provinents dels cultius recombinants que exp
Casa Villegas, MF. (2018). Caracterización de glicosidasas y permeasas fúngicas implicadas en el transporte y metabolismo de azúcares [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/106344
TESIS

Les ß-glucosidases són enzims que hidrolitzen enllaços b-glicosídics de disacàrids o oligosacàrids, amb una baixa regioespecificitat de manera que reconeixen específicament l'extrem glucídic no reductor i alhora tenen baixa especificitat per l'extrem reductor o aglicó. El mecanisme catalític és un doble desplaçament amb catàlisi àcid/base i formació d'un intermediari glicosil-enzim; la hidròlisi es produeix amb retenció de la configuració del carboni anomèric. En aquest treball s'ha estudiat la ß-glucosidasa Bgl3 d'Streptomyces sp. (ATCC 11238) clonada anteriorment al grup, s'ha millorat la producció de l'enzim posant-lo sota control del promotor de la T7-RNA polimerasa, i s'ha millorat el procés de purificació amb la fusió a una cua d'histidines al seu extrem N-terminal que permet l'obtenció de proteïna pura mitjançant un sol pas de purificació (columna d'afinitat). La proteïna obtinguda ha permès l'obtenció de l'estructura tridimensional de l'enzim per cristal.lografia de raigs X.
S'ha caracteritzat l'activitat catalítica de la Bgl3 amb dues bateries de substrats, una que variava l'extrem no reductor per determinar l'especificitat del subseti -1, i l'altre que variava les característiques de l'aglicó amb l'objectiu d'establir una relació lineal d'energia lliure (anàlisi de Hammett). L'estudi de la dependència de l'activitat respecte a la temperatura i al pH, ha permès dilucidar aspectes del mecanisme catalític com l'energia d'activació i la variació dels pKa dels residus catalítics essencials.
Per mutagènesi dirigida s'han obtingut enzims sense algun dels dos residus catalítics essencials, i s'ha comprovat la reducció de l'activitat catalítica. S'ha comprovat el paper de cada un d'aquests residus a la catàlisi per rescat químic de l'activitat dels mutants amb l'addició d'un nucleòfil extern, i posterior identificació per Ressonància Magnètica Nuclear dels productes formats.
Finalment s'ha avançat en l'estudi de l'especificitat de substrat respecte l'aglicó mitjançant mutagènesi dirigida i caracterització cinètica dels mutants sobre una posició conservada del centre actiu: la cisteïna 181 de la Bgl3.
ßeta-glucosidases are enzymes that can hydrolyze ßeta-glycosidic bonds from disaccharides or oligosacharides, with a low regiospecificity, so than they recognize specifically the glucidic non-reducing extreme and they have low specificity for the reducing extreme or aglycon. The catalytic mechanism is a double displacement with catalysis acid/base and formation of an intermediary glycosil-enzyme; the hydrolysis is produced with retention of the configuration of the anomeric carbon. In this work it has studied the ß-glucosidase Bgl3 from Streptomyces sp. (ATCC 11238) cloned before in the group, it has improve the production of the enzyme expressing it under control of T7-RNA polymerase promotor, and it has improve the purity method fusing at the N-terminus of the gene, a 6 histidines tag, allowing pure protein obtaining with a sole step purification (affinity column). Protein so obtained has allowed the resolution of the 3D structure for ray X crystallography.
It have characterized the catalytic activity of Bgl3 with 2 sets of substrates, one that vary his non reducing extreme to determine the specificity of subset -1, and the other set that vary the characteristics of the aglycon moiety to determine a free energy relationship (Hammett analysis). The study of the dependence between activity and temperature or pH, has show aspects of the catalytic mechanism as Energy of activation and the pKa variations of the essential catalytic residues during catalysis.
Trough site directed mutagenesis, it has been obtained enzymes without any one of the two essential catalytic residues, and it has been check reduction of the catalytic activity. It has been proved the role of those residues in the catalysis with the chemical rescue of the activity of the mutant forms adding an extern nucleophile, and identifying the products with Nuclear Magnetic Resonance.
Finally, it have been progress in the substrate specificity respect aglycon by means of site directed mutagenesis and kinetic characterization of the mutants over a conserved position in the active center: the cysteine 181 of the Bgl3.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico
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Ugni molinae Turcz., Myrtaceae conocida normalmente como murta o murtilla es un arbusto nativo siempre-verde del centro-sur y sur de Chile. La medicina folclórica le atribuye muchas propiedades y entre sus usos destaca como tratamiento para la diabetes al consumir la infusión de sus hojas y ramas. Se han demostrado la presencia de ácidos triterpénicos pentacíclicos y polifenoles en los extractos de murtilla con potente actividad inhibitoria de α-glucosidasa. Su inhibición permite la disminución del peak postprandial de glucosa al retardar y disminuir la absorción de monosacáridos. El objetivo de este estudio fue comparar la actividad inhibitoria de α-glucosidasa de extractos etanólicos (EETs) y acetato de etilo (EAEs) de hojas de 10 genotipos de U. molinae cultivadas en las mismas condiciones edafoclimaticas y manejo agronómico y determinar su mecanismo de inhibición. El estudio se llevó a cabo mediante el método espectrofotométrico de inhibición de α-glucosidasa utilizando pNPG como sustrato, descrito previamente por Kim et al. (2001) con las modificaciones correspondientes. Los resultados sugieren que los extractos más potentes corresponden a los EET 23-2 y EAE 27-1 observándose diferencias significativas en un 70% y un 60% de los genotipos respectivamente con valores de CI50 de 1,12  0,07 y 8,20  0,20 g/mL. Sin embargo todos los extractos fueron más potentes que acarbosa, fármaco de referencia (CI50 = 251,0  34,0 g/mL). Además el genotipo 23-2 para ambos extractos presento un comportamiento de inhibidor acompetitivo y el genotipo 27-1, de inhibidor no competitivo mixto, evaluados por la gráfica de Lineweaver- Burk y los cambios en sus constantes cinéticas. Se concluye que los genotipos difieren en potencia y tipo de inhibición debido al factor genético. En general los genotipos 23-2 y 27-1 que no presentan diferencias con los genotipos 19-1 y 14-4 poseen buenas proyecciones in vivo para el potencial tratamiento de DMT2, dada sus actividades antioxidantes e inhibidoras de enzimas claves en la DMT2 in vitro
Ugni molinae Turcz., Myrtaceae generally known as murta or murtilla is an evergreen shrub native of south-central and southern Chile. Folk medicine attributes many properties and among its uses include as a treatment for diabetes by consuming the infusion of its leaves and branches. It has demonstrated the presence of pentacyclic triterpenic acids and polyphenols in murtilla extracts with potent inhibitory activity of α-glucosidase. Its inhibition allows decreasing the postprandial glucose peak by to decreasing the absorption of monosaccharides. The aim of this study was to compare the inhibitory activity of α-glucosidase from etanolic (ETEs) and ethyl acetate (EAEs) leaves extracts of 10 U. molinae genotypes grown in the same soil and climatic conditions and agronomic management and determine its mechanism of inhibition. The study was performed by the spectrophotometric method of inhibiting α-glucosidase using pNPG as substrate, previously described by Kim et al. (2001) with appropriate modifications. The results suggest that ETE 23-2 and EAE 27-1 are more potent with significant differences about 70% and 60% of the genotypes respectively with IC50 values of 1.12  0.07 and 8.20  0.20 g/mL. However all extracts were more potent than acarbose, reference drug (IC50 = 251.0  34.0 g/mL). Besides for both extracts the 23-2 genotype present uncompetitive inhibitor behavior and genotype 27-1, mixed noncompetitive inhibitor, evaluated by the Lineweaver-Burk and changes in their kinetic constants. It is concluded that genotypes differ in power and inhibition type due to genetic factor. In general 23-2 and 27-1 genotypes not show differences with 19-1 and 14-4 genotypes possess good in vivo projections for the potential treatment of T2DM, due to its in vitro antioxidant and inhibiting activities of key enzymes in T2DM

Foram purificadas através de uma combinação de cromatografias as duas β- glicosidases digestivas (Mr 47.000 e 50.000 - denominadas β47 e β50, respectivamente) encontradas na larva de S. frugiperda. Experimentos de competição entre substratos e modificação química mostraram que a β47 possui dois sítios ativos. Um desses sítios denominado aril&$946;glicosidase apresenta um subsítio -1 que liga galactose mais eficientemente do enquanto ,que o subsítio +1 prefere pequenos grupos hidrofóbicos cíclicos. O segundo sítio, denominado celobiase, possui um subsítio -1 que prefere glicose. Já a região de ligação do aglicone apresenta 4 subsítios, que ligam glicose com afinidade decrescente à medida que afastam-se do ponto de clivagem do substrato. O cDNA que codifica a β50 foi clonado e sequenciado. Alinhamentos de sequência de aminoácidos, experimentos de competição entre substratos e inibição mostraram que esta enzima possui apenas um sítio ativo. O subsítio -1, cuja especificidade é controlada por uma rede de pontes de hidrogênio, foi estudado comparando-se os parâmetros cinéticos (Kcat e KcaUKm) para a hidrólise de NPβglicosídeos. A região de posicionamento do aglicone, uma fenda hidrofóbica composta de 3 subsítios, foi caracterizada utilizando-se alquil β-glucosídeos e oligocelodextrinas como inibidores. O alinhamento da sequência de aminoácidos da β50 com outras glicosil hidrolases sugeriu quais aminoácidos participariam da ligação do substrato e que o GlU187 (doador de prótons - pKa = 7,5) e o GIU399 (nucleófilo - pKa = 4,5) estão diretamente envolvidos na catálise. Além disso, a Arg97 e a Tyr331 participam indiretamente modulando o pKa do GIU399. r .
Two digestive β-glycosidases (MW 47,000 and 50,000, named βgly47 and βgly50, respectively) whose are found in the S. frugiperda larvae were purified by a combination of chromatographic steps. Substrate competition experiments and chemical modification data showed that βgly47 has two active sites. One of them was called aryl β-glycosidase and presents a -1 subsite that prefers galactose while the +1 subsite binds small cyclic hydrophobic groups. The other active site was called cellobiase and presents 4 subsites that bind glucose residues weaker as they get far from the cleavage point. The cDNA that codes the βgly50 was cloned and sequenced. Amino acid sequence alignment, substrate competition experiments and inhibitions proved that this enzyme has just one active site. The -1 subsite specificity is controlled by a hydrogen bond network as it was showed comparing the kinetic parameters (Kcat and KcatlKm) for some NPβglycosides hydrolysis. The aglycone binding region, a hydrophobic cleft, was studied with alkyl β-glucosides and oligocellodextrins as competitive inhibitors. Amino acid sequence alignment between the βgly50 and other glycosil hydrolases showed the amino acids responsible for the substrate binding and that the GIU