Dissertations / Theses on the topic 'Gonades – Différenciation'

Les analgésiques tel que le paracétamol, ou acétaminophène (ACE), et les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) comme l’aspirine et l’ibuprofène, sont largement utilisés dans le monde pour soulager douleur, fièvre ou inflammation. Ces médicaments, vendus sans ordonnance et souvent pris en automédication, sont de plus en plus utilisés par les femmes enceintes depuis les années 1990, notamment aux États-Unis et en Europe. De nombreuses études de cohorte ont mis en avant l’association entre la prise de ces molécules par les femmes durant le premier et deuxième trimestre de grossesse, et l’apparition de malformations congénitales des organes reproducteurs des garçons nouveau-nés, comme la cryptorchidie ou l’hypospadias. Ces analgésiques inhibent l’activité enzymatique des cyclooxygénases (Cox), qui catalysent l’étape clef de la voie de biosynthèse des prostaglandines (PGs), dont la prostaglandine D2 (PGD2), impliquée dans la détermination sexuelle des lignées somatique et germinale de la gonade mâle chez la souris. Afin d’étudier si la gonade embryonnaire peut constituer une cible de ces molécules, l’objectif principal de cette thèse a été d’analyser l’impact de l’exposition in utero à l’ACE, l’aspirine et l’ibuprofène seuls ou en combinaison, pendant la période de détermination sexuelle (de 10,5 à 13,5 jours post coitum (jpc) chez la souris). Des doses « thérapeutiques » similaires à celles utilisées chez l’Homme ont été administrées par voie orale. Mon travail a permis de démontrer que l’exposition in utero à la combinaison des deux drogues ACE et ibuprofène induisait, dans le testicule embryonnaire, une accélération de la différenciation de la lignée germinale du testicule embryonnaire, précurseurs des gamètes à l’âge adulte, par le biais d’une reprogrammation épigénétique avancée, ainsi qu’une augmentation du stockage du glycogène dans les cordons testiculaires, via l’activation de l’expression des gènes de la matrice extracellulaire. De plus, ce projet a permis d’identifier pour la première fois le profil d’expression des prostaglandines dans le testicule embryonnaire de souris. Dans un deuxième temps, l’impact de l’exposition in utero à ces drogues sur la stéroïdogenèse a été étudié, en parallèle avec l’étude sur le rôle de la PGD2 dans les cellules stéroïdogènes (cellules de Leydig) dans le testicule fœtal de souris à 17,5 jpc. Ces résultats pourraient conduire à modifier l’utilisation de ces médicaments chez la femme, au cours des deux premiers trimestres de grossesse<br>Mild analgesics such as paracetamol, or acetaminophen (ACE), and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as aspirin and ibuprofen, are widely used worldwide for relieving pain, fever or inflammation. These over-the-counter drugs are often taken as self-medication, and are increasingly used by pregnant women since the 1990s, particularly in the United States and Europe. Many cohort studies have highlighted the association between intake of these molecules by women during the first and second trimester of pregnancy, and the occurrence of birth defects of the reproductive organs of newborn boys, such as cryptorchidism or hypospadias. These analgesics inhibit the enzymatic activity of cyclooxygenases (Cox), which catalyze key step in the biosynthetic pathway of prostaglandins (PGs), whose prostaglandin D2 (PGD2), involved in the male sex determination of both somatic and germinal lineages in mice. To investigate whether the embryonic gonad can be a target of these molecules, the main objective of this thesis was to analyze the impact of in utero exposure to ACE, aspirin and ibuprofen alone or in combination, during the period of sex determination (10.5 to 13.5 days post coitum (dpc) in mice). "Therapeutic" doses similar to those used in humans were orally administered. My work has shown that in utero exposure to the combination of both ACE and ibuprofen drugs induced acceleration of the differentiation of the embryonic testis germline, the precursors of gametes in adulthood, through an advanced epigenetic reprogramming, and an increase of glycogen storage in the testicular cords, via activation of extracellular matrix gene expression. In addition, this project has identified for the first time the profile of prostaglandins expression in mouse embryonic testis. Secondly, the impact of in utero exposure to these drugs on steroidogenesis was evaluated, in parallel with the study on the role of PGD2 in steroidogenic cells (Leydig cells) in mouse fetal 17.5 dpc testis. These results could lead to change the use of these drugs in women, during the first two trimesters of pregnancy

Chez l'amphibien urodèle Pleurodeles waltl, le détenninisme génétique du sexe est influencé par la température: les larves génétiquement femelles évoluent en mâles fertiles lors d'un élevage à 32ʿC pendant la période thennosensible (stades 42-54). L'aromatase, enzyme qui synthétise les œstrogènes, joue un rôle clef dans la différenciation femelle. Notre but initial était de détenniner si les différences d'activité enzymatique observées lors de la différenciation sexuelle (stade 52) étaient liées à des différences d'expression. L'ADNc de l'aromatase a été isolé. L'expression est plus importante chez les femelles témoins que chez les mâles ou les femelles chauffées. Cependant, par rapport à l'activité, cette différence est faible et s'observe tardivement (stade 54). Des modifications post-transcriptionnelles interviennent donc vraisemblablement en plus des modifications transcriptionnelles. Pour expliquer ces dernières, nous avons étudié d'autres gènes susceptibles d'agir en amont de l'aromatase. Les ADNc de sn, Dmrtl et Sox9 ont été isolés. Leur expression dans les complexes gonades-mésonéphros est précoce (stade 42). Au stade 55, sn est surexprimé chez les femelles mais cela est postérieur aux changements qui affectent l'aromatase, suggérant une régulation de SfI par les œstrogènes. Dmrtl fait l'objet d'un épissage alternatif chez les larves et l'expression est plus forte dans les gonades femelles au stade 55. A l'état juvénile, l'expression cesse dans l'ovaire alors qu'elle est spécifique du testicule chez les mâles. Sox9 ne présente pas d'expression différentielle au cours du développement. Par ailleurs, les analyses portant sur sn et l'aromatase au niveau cérébral sont en désaccord avec un rôle de cet organe comme relais dans la différenciation gonadique<br>Ln the urodele amphibian Pleurodeles waltl, the genetic sex detennination is influenced by temperature : genetically female larvae develop in fertile males when bred at 32ʿC during the thennosensitive period (stages 42-54). Aromatase, the estrogens enzyme synthesising, plays a key role in female gonadal differentiation. Our initial goal was to detennine if the rise of aromatase activity observed at the onset of sexual differentiation (stage 52) was related to an up regulation of expression. The cDNA of aromatase was isolated. Its expression is more important in control females than in males or in heated females. However, compared to enzyme activity, this difference is weak and is delayed (stage 54). Thus, post-transcriptionnal modifications could be involved in addition to transcritional regulation. Genes that are supposed to act upstream of aromatase were then studied. The cDNA of SfI, Dmrtl and Sox9 were isolated. Their expression in the complexes gonads-mesonephros is detected as early as stage 42. At stage 55, sn is overexpressed in female gonads. So these changes appear after those affecting aromatase expression, suggesting a regulation of SfI by estrogens. Dmrtl is alternatively spliced at larval stages and its expression is stronger in female gonads at stage 55. Ln juvenile larvae, the expression stops in ovary and becomes testis-specific. Sox9 does not present any differential expression during gonad development. Ln addition, analyses of SfI and aromatase expression in brain disagree with a role of central nervous system as a relay during gonadal differentiation

La détermination du sexe chez les reptiles est classée traditionnellement en deux catégories distinctes: la détermination du sexe gènotypique et la détermination du sexe par la température. Le but de ce travail est d'évaluer l'importance du composant génétique dans la différenciation de la gonade chez les reptiles ayant une détermination du sexe sensible à la température. La morphogenèse de la gonade a été étudiée chez des embryons de la tortue emys orbicularis incubés à 28,5c, température à laquelle les deux sexes se différencient. D'une part nous mettons en évidence l'effet d'un composant génétique dans la différenciation sexuelle lors d'incubation à cette température et d'autre part nous montrons que des caractéristiques morphomètriques du cortex et de la medulla de la gonade corrèlent avec l'activité aromatase. Par ailleurs chez la tortue marine dermochelys coriacea la période de sensibilité à la température pour l'activité aromatase est la même que la période thermosensible pour la différenciation des gonades ce qui confirme que l'aromatase joue bien un rôle clé dans la détermination du sexe chez ces espèces. L'influence du composant génétique sur la détermination du sexe au sein d'une population naturelle a été évaluée par la mesure de l'expression de l'antigène H-Ys dans le sang d'animaux captures en brenne. . .

Les organes centraux du tractus urogénital sont le testicule et l’ovaire, qui assurent la production de gamètes et d’hormones, et donc la fertilité de l’individu. Ces deux organes, parfaitement distincts et complémentaires, ont pour origine une gonade bipotentielle qui s’engagera vers une trajectoire de différenciation masculine ou féminine au cours de la vie fœtale. Les deux gonades vont par la suite subir plusieurs phases de différenciation et de développement de leurs populations cellulaires, afin d’acquérir leurs fonctions propres qui leur permettront d’assumer leur rôle à l’âge adulte. Depuis plus d’une quinzaine d’années, le concept de syndrome de dysgénésie testiculaire fait état d’un lien entre l’exposition du fœtus à des composés environnementaux et des anomalies du tractus urogénital. Bien que sujette à de vifs débats au sein de la communauté scientifique, cette hypothèse a attiré l’attention de la recherche sur les conséquences de l’exposition des mères aux xénobiotiques sur l’enfant à naître. La différenciation et le développement des gonades fœtales sont gouvernés par des programmes d’expression spécifiques de chaque sexe, dont de nombreuses zones d’ombres subsistent, notamment concernant la fraction non-codante exprimée par le génome humain. La première partie de cette thèse de doctorat présente, pour la première fois, le paysage transcriptionnel contrôlant ces processus complexes entre la 6ième et 17ième semaine de développement chez l’Homme. Grâce à l’avènement des technologies de transcriptomique, il est désormais possible d’identifier et d’observer l’expression des gènes de manière sensible et sans a priori. Le RNA-seq m’a donc permis de décrire de manière exhaustive la dynamique d’expression des gènes, pendant les stades précoces de la différenciation sexuelle, jusqu’aux phénomènes plus tardifs conduisant aux linéages des différentes populations cellulaires spécifiques du testicule et de l’ovaire. Dans une deuxième partie, mon travail de recherche s’est attaché à étudier l’impact de deux perturbateurs endocriniens suspectés, l’ibuprofène et le chlordécone, sur le programme d’expression du testicule fœtal humain. L’utilisation du RNA-seq m’a permis de définir et de comparer la signature toxicogénomique de chaque molécule afin de contribuer à la compréhension de leur mécanisme d’action et d’identifier les populations cellulaires affectées. Enfin, face à l’essor des technologies ultra-haut-débit dans les sciences de la vie, y compris dans les domaines de la reproduction, j’ai activement participé au déploiement d’une nouvelle version du Reprogenomic Viewer dans la dernière partie de ma thèse (http://rgv.genouest.org). Cet outil nternet a pour vocation de centraliser et de rendre accessibles les données de séquençage accumulées au sein de la communauté de la reproduction via des outils de visualisation intuitifs<br>Fetal life is a crucial period for sexual reproduction when bipotential gonads differentiate into either a testis or an ovary. Gaining insights into the complex molecular events underlying this process is central to a better understanding of disorders of sexual development. The present work intends to improve the knowledge on molecular pathways at play during gonad development in humans using RNA-sequencing. This project particularly seeks to identify early transcriptional events that may play critical role in the regulatory network driving human sexual differentiation. To address this issue, we defined the transcriptional landscape of fetal human gonads by sequencing total RNA extracted from testes and ovaries between 6 and 17 gestational weeks. The resulting paired-end reads were mapped on the human genome and then assembled into transcripts using the Tuxedo suite. We next defined a high-confidence set of transcripts showing differential expression across samples. Clusters of co-expressed genes were subjected to functional analysis. The analysis of this massive RNA-seq dataset has led to a high-confidence set of 35,194 assembled transcripts; among which 32,391 known and novel isoforms coding genes (mRNAs), 1,209 to long non-coding (lnc) RNAs and 318 to novel unannotated transcripts/genes (NUTs). The dynamic of transcriptional landscape occurring during human fetal gonads development has been described and new genes and interesting candidates, including new genes, have been highlighted as potential key genes governing this biological process. The second interest of this work was the study of the impact of two endocrine disruptors, ibuprofene and chlordecone, on human fetal testis using RNA-seq. The transcriptional alteration induced by these compound in the gonad allowed a deeper understanding of their mechanisms of action of endocrine disruption. The last part of this work was the development of a new version of the ReproGenomics Viewer (http://rgv.genouest.org), a web tool dedicated to the integration and accumulation of sequencing data from studies performed in the field of reproduction

Chez les vertébrés, avant la différenciation sexuelle, les futures gonades sont bipotentielles. Chez le mâle, la présence du gène SRY induit la différenciation testiculaire. En absence de celui-ci, ou si sa protéine est non fonctionnelle, des ovaires se forment. Ce travail traite de la différenciation sexuelle précoce et se divise en deux parties traitant respectivement de la voie femelle et mâle. La première partie de cette thèse traite de la différenciation ovarienne précoce. Cette étude se focalise sur le rôle de deux gènes femelles : Foxl2 et Rspondin-1 (Rspo1). Les souris XX Foxl2-/- sont infertiles, quant aux Rspo1-/-, elles développent des ovo-testicules. L’étude des gonades de souris XX Foxl2-/-/Rspo1-/- démontre une masculinisation des gonades ainsi que du tractus. Ceci serait dû à la présence ectopique de cellules stéroïdogènes fœtales. Nos résultats tendent à conclure que Foxl2 et Rspo1, par deux voies de signalisation distinctes, qui réprimeraient la voie mâle, via entre autre, l’inhibition de la stéroïdogénèse fœtale. La seconde partie traite de différenciation testiculaire et plus particulièrement de la caractérisation de lignées de souris transgéniques pour SRY caprin (SRYg). Chez les mammifères, SRY est exprimé lors de la différenciation sexuelle, jusqu’à l’âge adulte, sauf chez la souris où il s’éteint rapidement. Il existe un site de fixation de la protéine SOX9 sur le promoteur SRY, absent chez la souris, qui active l’expression de SRY in vitro. Grâce à l’étude de nouvelles lignées de souris transgéniques pour SRYg, dont le site SOX9 a été muté, nos résultats démontrent que ce site n’est pas le seul responsable de l’expression continue du gène SRYg<br>In vertebrates, before sexual differentiation, future gonads are bipotential. In males, presence of the testis-determining factor, SRY gene, induces testis differentiation. In its absence or if SRY protein is not functional, ovaries are formed. This work is about early sexual differentiation and is divided into two parts dealing with female or male pathway. The first part is about early ovarian differentiation. This study focuses on the role of two genes, Foxl2 and Rspondin-1 (Rspo1). In XX mice, invalidation of Foxl2 and Rspo1 lead respectively to infertility and ovo-testis formation. Our results show masculinization of XX Foxl2-/-/Rspo1-/- gonads in mice, apparently du to the presence of ectopic steroidogenic fetal cells. Our results tend to conclude that Foxl2 and Rspo1 belong to two distinct signalling pathways that suppress testicular differentiation, via for example, inhibition of fetal steroidogenesis in female. The second part is about testicular differentiation and especially characterization of transgenic mouse lines for SRY goat (SRYg). In mammals, SRY gene is expressed during sexual differentiation, until adulthood, except in mice where expression rapidly switches off. A SOX9 binding site localised on SRY promoter has been described as inducing SRY gene expression in vitro. Thanks to new SRYg transgenic mouse lines studies, whose SOX9 binding site was deleted, our results do not demonstrate any crucial regulatory effect of this binding site on SRYg expression. Therefore, this SOX9 binding site is not responsible alone for continuous expression of the gene SRYg

La morphogenèse épithéliale qui se produit au cours de l'organogenèse des gonades conduit à la différenciation des structures caractéristiques de chaque sexe : les cordons séminifères dans le testicule et les cordons ovigères à l'origine des follicules dans l'ovaire. Nous avons étudié l'expression des kératines, protéines du cytosquelette spécifiques des cellules épithéliales, au cours de la différenciation gonadique chez la souris depuis le stade indifférencié jusqu'à l'âge adulte. Les résultats obtenus par immunohistochimie, hybridation in situ, et RT-PCR montrent que, comme chez le rat (Fridmacher et al. , 1995), le gène de la kératine 19 (K19), exprimé dans la gonade indifférenciée et dans l'ovaire fœtal, est réprimé dès les premiers signes de la différenciation testiculaire lorsque les cellules de Sertoli se différencient, produisent l'hormone anti-Müllerienne (AMH) et s'agrègent pour former les cordons séminifères. Pour tenter d'identifier les séquences nucléotidiques responsables de l'inhibition de l'expression du gène dans les cellules de Sertoli, nous avons isolé et séquencé un fragment de 1,4 kb de la région 5'-flanquante du gène de la K19 de rat. Après avoir déterminé le site précis d'initiation de la transcription, nous avons réalisé des délétions croissantes de l'extrémité 5' de la région promotrice, et étudié leur activité transcriptionelle par transfection transitoire dans des cultures primaires issues de testicules ou d'ovaires fœtaux ainsi que dans différentes lignées clonales. Les résultats montrent que la région promotrice du gène de la K19 de rat est fonctionnelle et qu'une région minimale d'environ 100 pb en amont du codon ATG, recouvrant la boîte ATA ainsi que 2 sites AP2, est suffisante pour induire la transcription basale du gène. Cependant, toutes les constructions contenant cette région minimale et jusqu'à 1,4 kb en amont du codon ATG induisent la transcription du gène rapporteur dans tous les types cellulaires testés quel que soit le niveau d'expression du gène de la K19 endogène. Les résultats pourraient indiquer soit que les séquences responsables de la spécificité tissulaire d'expression, et notamment de l'inhibition dans le testicule, ne sont pas présentes dans la région promotrice que nous avons isolée, soit que ces séquences ne sont pas fonctionnelles en transfection transitoire. Dans le but d'analyser les relations pouvant exister entre l'inhibition du gène de la K19 et les évènements précoces de la différenciation du testicule, nous avons utilisé des modèles expérimentaux en culture organotypique dans lesquels la morphogenèse testiculaire ou ovarienne est perturbée. Dans le modèle testiculaire, les cellules de Sertoli se différencient, sécrètent l'AMH mais ne s'agrègent pas en cordons séminifères. Dans le modèle ovarien, les ovaires sont masculinisés par la co-culture avec un testicule fœtal ou par l'action de l'AMH. L'étude du profil d'expression du gène de la K19 a été réalisée par hybridation in situ. Dans les testicules, l'inhibition du gène de la K19 est obtenue malgré l'absence des cordons séminifères. Dans les ovaires, l'expression du gène de la K19 est inhibée dès le premier jour de culture avant que les modifications induites par l'action masculinisante n'apparaissent. Ces résultats indiquent que l'inhibition du gène de la K19 ne résulte pas d'évènements mophogénétiques mais plutôt d'évènements cytodifférenciateurs reproduits par l'AMH.

Chez les mammifères, la gonade embryonnaire a la potentialité de se différencier en deux organes morphologiquement et physiologiquement différents : un testicule ou un ovaire. L’orientation de la différenciation gonadique vers l’un ou l’autre des deux sexes va dépendre de la présence ou non d’un gène porté par le chromosome Y : le gène SRY. En sa présence, la différenciation testiculaire va avoir lieu, à l’inverse en son absence la différenciation ovarienne sera privilégiée. De nombreuses études visent encore à élucider les voies moléculaires impliquées dans cette différenciation gonadique. C’est dans cette optique que j’ai œuvré au cours de ma thèse et ceci en utilisant le modèle caprin. Ainsi, nos études sur le gène PrnD semblent indiquer que la protéine Doppel peut être impliquée dans la différenciation gonadique. Par ailleurs, nos travaux sur les gènes R-spondin ont permis d’apporter de nouvelles données moléculaires sur la fonction de deux gènes clés de la différenciation ovarienne, RSPO1 et FOXL2. Nos résultats démontrent pour la première fois qu’un ovaire présente très précocement au moins deux types de cellules somatiques ; celles exprimant RSPO1 qui sont en étroites relations avec les cellules germinales, et celles exprimant FOXL2 qui sont directement impliquées dans la stéroidogenèse ovarienne fœtale. Outre ces résultats, nos travaux ouvrent différentes perspectives d’études concernant entre autre, le rôle de RSPO1 sur les cellules germinales, le lien entre FOXL2 et un de ses nouveaux gènes cibles potentiels, RSPO2<br>In mammals, the embryonic gonad can give either a testis or an ovary. The choice of gonad differentiation depends of the presence or not of a gene bearing by the Y chromosome: SRY. In its presence, the gonad differentiates into a testis and in its absence the ovary differentiation take place. A large number of studies are carried out in order to elucidate the molecular pathway involved in this gonad differentiation. This is also the goal of my thesis using the goat model. Our studies on the PrnD gene seem to show that Doppel protein may be involved in the gonad differentiation. Furthermore, our studies on the R-spondin gene brought new molecular data on the role of both important genes of the ovary differentiation: RSPO1 and FOXL2. For the first time, our results show that an ovary contains two types of somatic cells; those expressing RSPO1 which were in short relation with the germ cells and those expressing FOXL2 which were directly involved in the fetal ovarian steroidogenesis. Our results open different perspectives concerning the RSPO1 role on the germ cells, the link between FOXL2 and one of its putative target gene, RSPO2

Chez le poulet, le déterminisme du sexe est génétique (ZZ/ZW) mais à la différence des mammifères le déterminant majeur du sexe n’a pas été identifié. Néanmoins, un certain nombre d’acteurs moléculaires impliqués en aval dans la différenciation du testicule (DMRT1, AMH, SOX9…) ou de l’ovaire (CYP19A1, FOXL2, RSPO1…) ont été identifiés. D’autre part, le modèle poulet présente deux particularités que sont l’asymétrie du développement ovarien et la sensibilité aux stéroïdes donnant la possibilité d’inversions du sexe par des hormones exogènes. Par une analyse par PCR en temps réel à moyen débit, nous avons identifié des gènes dont l’expression est sexuellement dimorphique et/ou asymétrique au cours de la différenciation gonadique. Parmi ces gènes plusieurs membres de la famille des bone morphogenetic protein sont préférentiellement exprimés dans l’ovaire en comparaison au testicule. L’étude des effets de BMP4 sur la culture organotypique d’ovaires ou de testicules a montré qu’il était un inhibiteur de la stéroïdogénèse basale et induite par la FSH et d’autre part qu’il est un inhibiteur de l’expression de l’AMH. Résultats qui nous ont amené à émettre l’hypothèse que BMP4 était un facteur « anti-testiculaire »<br>In chicken, sex is determined by a ZZ/ZW sex chromosome system, where the female is heterogametic (ZW). However, the mechanism involved in the sex determination is still unknown. Several genes involved in testicular (DMRT1, AMH, SOX9…) or in ovarian (CYP19A1, FOXL2, RSPO1...) differentiation have been identified. Furthermore, gonadal development in chicken embryos presents two particularities which are the asymmetrical ovarian development and the sensitivity to exogenous hormones leading to sex reversal. By real-time PCR analysis, we have identified several genes whose expression is sexually dimorphic and/or asymmetric. In particularly, we showed that several members of bone morphogenetic protein family are preferentially expressed in the ovary compared to the testis. Using organotypic culture of embryonic ovaries and testes, we showed that BMP4 inhibits the basal and FSH induced steroidogenesis and is an inhibitor of AMH mRNA expression. These findings lead us to propose that BMP4 is an “anti-testicular” factor

La détermination du sexe et la différenciation des cellules germinales est un processus très organisé qui commence au stade embryonnaire et se termine à la vie adulte. Dans les gonades embryonnaires l'expression de Sry suivie par l'expression de Sox9 initie le développement testiculaire tandis que, en l'absence de l'expression de Sry, les gènes associés au sexe féminin initient le développement des ovaires. Les cellules germinales qui ont migré vers les gonades nouvellement formées continuent leur prolifération intense jusqu'à ce qu'ils s'engagent dans la voie le mâle ou femelle. La décision de devenir des cellules germinales mâle ou femelle ne dépend pas seulement du chromosome sexuel des cellules germinales, mais aussi du microenvironnement des gonades. Si les cellules germinales entrent dans la gonade femelle, ils doivent arrêter la prolifération, dépasser l'arrêt mitotique et entrer en méiose et alors s'arrêter en prophase I. Alors que si les cellules germinales entrent dans la gonade mâle, ils doivent arrêter la prolifération et entrer en arrêt de la mitose. Ici, nous montrons que, lors de la détermination du sexe embryonnaire, la prostaglandine D2 (PGD2) produite par chacune des deux enzymes: la L-PGDS et H-PGDS dans les cellules somatiques et les cellules germinales du testicule mâle participe au programme de différenciation des cellules germinales. La voie de signalisation PGD2 entraine l'arrêt de la mitose par l'activation de l'expression et de la localisation nucléaire de l'inhibiteur du cycle cellulaire p21Cip1 et en réprimant les marqueurs de pluripotence et aussi Stra8. En outre, PGD2 est responsable de l'activation du gène spécifique au mâle Nanos2. Par conséquent, ces données suggèrent que la signalisation par le récepteur de PGD2 DP2 est requise pour la différenciation correcte de la cellule germinale mâle<br>The sex determination and subsequent germ cell differentiation is highly ordered process that starts at embryonic stage and completes at adult life. In the embryonic gonads Sry expression followed by Sox9 expression initiates testis development while in the absence of Sry expression, genes associated to female fate initiate ovary development. The germ cells that migrated towards newly formed gonads continue extensive proliferation until they commit to the male or female pathway. The fate decision of germ cells as male or female does not depend only on germ cell chromosomal sex but also on gonadal micro-environment. If germ cells enter into female gonad, they have to stop proliferation, pass through mitotic arrest and enter into meiosis; then arrest into prophase I. While if germ cells enter into male gonad, they have to stop proliferation and enter into mitotic arrest. Here we show that during embryonic sex determination, Prostaglandin D2 (PGD2) produced by each of the two enzymes: L-Pgds and H-Pgds in somatic cells and germ cells of testis participates in male germ cell differentiation program. PGD2 signalling supports mitotic arrest by activating the expression and nuclear localization of cell cycle inhibitor P21cip1 and by repressing pluripotency markers and PGD2 has negative effects on Stra8 expression. In addition PGD2 supports activation of male specific gene Nanos2. Hence these data suggest that PGD2 signalling through DP2 receptor is required for proper male germ cell differentiation

La connaissance et la maîtrise du déterminisme du sexe et de la différenciation sont des défis majeurs pour la production de tilapia. L'élevage de populations monosexes mâles évite les effets négatifs d'une reproduction continue et profite de la meilleure croissance des mâles. Dans le contexte d'une aquaculture durable, le développement de stratégies alternatives et écologiques est nécessaire pour le contrôle du sexe du tilapia sans avoir recours aux approches hormonales. Ces alternatives reposent sur des approches génétiques ou environnementales, en utilisant l'effet masculinisant des températures élevées appliquées au cours de la différenciation sexuelle. Dans cette thèse la recherche de gènes impliqués dans la différenciation sexuelle a été réalisée dans les gonades et le cerveau en utilisant l'analyse de certains gènes candidats. L'objectif était de développer des marqueurs putatifs pour produire des populations monosexes mâles par des approches respectueuses des consommateurs et de l'environnement. Les expressions temporelles et spatiales de cyp19a1a, cyp19a1b, FOXL2, dmrt1, SOX9, DAX1 et amh ont été analysées dans plusieurs descendances de mâles ou des femelles génétiques ainsi que dans des femelles traitées à fortes températures. Leur lien avec les masculinisations par la températ ure a également été recherché sur des lignées thermosensibles de tilapia. L'un des gènes qui présente un dimorphisme sexuel important est l'amh qui est exprimé aussi bien dans les gonades que dans le cerveau pendant les premiers stades de la différenciation sexuelle. Le niveau d'expression de l'amh dans le cerveau est élevé chez les mâles quand les gonades sont toujours indifférenciées et probablement même avant la synthèse des stéroïdes gonadique. Une procédure de sexage moléculaire précoce a été développée en utilisant ce gène chez le tilapia. Cette procédure sera d'un grand intérêt pour les éleveurs et les scientifiques pour identifier rapidement des individus YY mâles avec un gain en temps et en argent, et pourra être utilisée également pour rechercher d'autres approches fiables de production de populations monosexes mâles sans l'utilisation des hormones<br>Knowledge and the control of sex determination and differentiation are major challenges for tilapia production. Farming of male monosex populations avoids the negative effects of a continuous reproduction and benefits from males' fast growth. In the context of a sustainable aquaculture, alternative and ecological strategies have to be developed to control sex in tilapia without hormonal treatment. These approaches will rely on genetic and environmental treatments, such as the use of masculinising high temperatures applied during sex differentiation. The search for genes implicated in sex differentiation has been performed in both gonads and brains using the analysis of candidate genes. The objective was to develop putative markers to produce male monosex populations through consumer and environmentally friendly approaches. Temporal and organ expressions of cyp19a1a, cyp19a1b, foxl2, dmrt1, sox9, dax1 and amh were analysed in several progenies o f genetic males or females as well as in temperature-treated individuals. Their link with temperature masculinisation was also performed on the thermosensitive tilapia lines. One of the sexual dimorphic genes was amh which was found expressed in both gonads and brains during early stages of sex-differentiation. Brain amh was elevated in males when the gonads were still undifferentiated and probably before steroid synthesis took place. A precocious molecular sexing procedure was developed in tilapia using this gene. This procedure will be of great advantage for both farmers and scientists in identifying quickly male individuals and in finding reliable male monosex approaches not using hormones

La détermination sexuelle chez les vertèbres repose sur différents mécanismes génétiques et epigenetiques. Chez les vertebres hétérothermes, la détermination du sexe de l'embryon ou de la larve par la température existe dans de nombreuses espèces. Chez l'amphibien pleurodèles waltl, une température d'élevage de 32c inverse le sexe des larves femelles génétiques. Cette inversion est fonctionnelle et permet ainsi l'obtention de thermoneomales phénotypiques. Nous avons étudié les bases génétiques de la détermination du sexe chez le pleurodèle en recherchant des gènes homologues de sry, déterminant testiculaire des mammifères. Une séquence sox (sry-box containing gène) a été clonée chez le pleurodèle mais elle ne joue sans doute aucun rôle dans la détermination sexuelle. Dans un deuxième temps, nous avons étudié l'activité de l'aromatase chez le pleurodèle. La régulation de l'expression de cette enzyme, qui catalyse la conversion des androgènes en strogenes, constitue un événement-clef de la différenciation sexuelle chez les vertebres hétérothermes. L'activité aromatase a été étudiée dans les conditions de différenciation sexuelle normale et sous l'effet de traitements thermiques et hormonaux. Des traitements de larves en cours de différenciation sexuelle par divers inhibiteurs, comme des inhibiteurs de l'aromatase, ou d'hormones, comme l'stradiol et la dihydrotestosterone, ont également été entrepris. Les résultats obtenus montrent le rôle primordial de l'stradiol et de l'aromatase dans la différenciation sexuelle chez le pleurodèle. La dihydrotestosterone pourrait également intervenir de façon importante dans la différenciation male.

L'hormone anti-Müllérienne (AMH) est impliquée dans la différenciation sexuelle foetale des Mammifères : produite exclusivement par les gonades mâles, elle induit la régression des canaux de Müller, ébauches de l'utérus. L'AMH, dont le gène a été identifié chez plusieurs espèces, est une glycoprotéine de la superfamille des TGFβ. Elle est produite exclusivement par les cellules de Sertoli des testicules chez les mâles prépubères et, plus faiblement, par les cellules de Sertoli testiculaires et les cellules de la granulosa ovarienne chez les individus pubères et adultes. Chez la souris mâle, nous avons trouvé que le taux sérique d' AMH chute parallèlement au taux de ses ARNm, au début de la puberté. En utilisant des souris mutantes insensibles aux androgènes ou dépourvues de cellules germinales méïotiques, nous avons pu suggérer une répression par les androgènes et par la méïose et une stimulation par la FSH de la sécrétion d'AMH chez le mâle postnatal. Par ailleurs, nous avons généré des souris transgéniques pour 3,6 kb 5'-flanquantes du gène de l'AMH humaine, couplées soit à l'oncogène du virus SV40 (souris AT), soit à un minigène de l' AMH humaine. L'analyse de l'expression de ces transgènes suggère que ces 3,6 kb contiennent des régions régulatrices transcriptionnelles activées dans les cellules de Sertoli immatures et dans les cellules de la granulosa de l'adulte. Les souris AT adultes développent des tumeurs testiculaires de Sertoli et des tumeurs ovariennes de la granulosa et nous avons établi des lignées cellulaires à partir de gonades de ces souris. Par northern blot des ARN totaux, de nombreux ARNm caractéristiques des cellules de Sertoli sont détectables dans toutes les lignées testiculaires, alors que ceux de l'AMH ne le sont que dans les lignées prépubères (prétumorales). L'une d'elles (SMATl) a été clonée, a un profil d'expression génique en accord avec un état immature des cellules de Sertoli et, jusqu'à plus de 30 repiquages, sécrète de l'AMH et exprime ses ARNm. Etant le premier modèle cellulaire exprimant stablement le gène endogène de l'AMH en culture in vitro, elle devrait être utile pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires des régulations de l'expression de cette hormone. Une lignée cellulaire dérivée de tumeurs ovariennes devra être caractérisée davantage pour confirmer sa différenciation de type granulosa. Nos lignées cellulaires gonadiques exprimant les ARNm du récepteur de l'AMH (AMHR-II), elles devraient être utiles pour étudier sa signalisation et les effets autocrines de l'AMH. Nos lignées cellulaires gonadiques et les souris AT servent aussi de modèles pour étudier l'intérêt de l'AMH et de l'AMHR-II comme marqueurs moléculaires des tumeurs de la granulosa de l'ovaire, qui représentent 6 à 10% des tumeurs malignes de l'ovaire chez la femme.

Chez les mammifères, le sexe génétique de l'embryon est déterminé au moment de la fécondation, selon la répartition des chromosomes X et Y dans l'oeuf. La constitution des chromosomes sexuels est homogamétique (XX) chez la femelle et hétérogamétique (XY) chez le màle. Des données cytogénétiques établies de longue date indiquent que le déterminisme de la différenciation sexuelle masculine repose sur le capital génétique porté par le chromosome Y. Tout organisme normal pourvu de ce chromosome est destiné à subir irrévocablement une longue succession de phénomènes de différenciation. Ces phénomènes déterminent dans un premier temps l'organisation et la nature des cellules germinales et des gonades développées au cours de l'embryogénèse, puis dans un second temps, les processus qui permettent d'aboutir à l'établissement du sexe phénotypique, seul définissable à la naissance. Nous sommes partis de l'hypothèse émise par Wachtel et Ohno, selon laquelle un facteur émis ou contrôlé par le chromosome Y et dénommé antigène H-Y orienterait vers une différenciation testiculaire l'évolution d'une ébauche gonadique, qui, en son absence, aboutirait à un ovaire. D'après des analyses sérologiques utilisant un test radioimmunologique quantitatif, que nous avons mis au point, associées à des analyses cliniques, cytogénétiques et physiologiques, nous avons tenté d'élucider le rôle de l'antigène H-Y dans la détermination primaire du sexe masculin chez l'homme. L'analyse de différents individus porteurs d'anomalies de la différenciation sexuelle révèle que si l'expression de l'antigène H-Y parait effectivement impérative au développement de testicules, observé même dans un contexte génétique ou physiologique apparemment paradoxal, elle n'entraîne cependant pas nécessairement la masculinisation. Il nous apparait aujourd'hui plus logique de proposer que l'antigène H-Y, dont la présence ou l'absence ne suffisent pas à elles seules à distinguer un organisme mâle d'un organisme femelle, soit en fait un antigène de différenciation embryonnaire, exprimé à un taux optimal au niveau de certaines cellules, à un stade particulier de l'embryogénèse. Par la suite, sa persistance n'étant plus nécessaire, il pourrait cesser d'être exprimé à un taux élevé, d'où les difficultés rencontrées tant dans la mise au point de tests quantitatifs que dans l'obtention d'anticorps monoclonaux.

Le rôle des microenvironnements dans la différenciation embryonnaire à été étudié sous deux aspects, d'une part les intéractions entre deux lignées de cellules d'origines différentes, d'autre part les reconnaissances entre sites de l'embryon et rudiments gréffés en position ectopique. Ces aspects ont été étudiés sur deux ébauches, celle des gonades et celle de l'aorte, dont la paroi est le progéniteur des cellules souches hématopoîques embryonnaires

Le facteur de transcription SOX9 contrôle en aval du facteur de détermination testiculaire SRY, l'ensemble des transformations morphologiques conduisant à la différenciation des cellules de Sertoli et à la formation de la gonade mâle chez les vertébrés. La translocation nucléaire de SOX9 est une étape cruciale pour la différenciation des cellules de Sertoli. J'ai identifié la prostaglandine D2 (PGD2) comme inducteur autocrine de la translocation nucléaire de SOX9 dans les cellules de Sertoli, proposant ainsi un nouveau rôle pour la PGD2 dans la gonade et une nouvelle pièce dans le "puzzle" de la détermination du sexe. De plus, j'ai montré que la régulation de la rétention cytoplasmique de SOX9 se fait via le réseau de microtubules. Mon travail a également mis en évidence un rôle de cette voie PGD2/SOX9 dans l'ovaire, à la fois dans l'ovaire sain en fonction du cycle folliculaire et surtout dans le processus de tumorigenèse ovarienne avec un rôle anti-prolifératif et pro-apoptique.

Dans le contexte de la physiologie comparée de la reproduction, les amphibiens sont peu étudiés. Le travail réalisé durant cette thèse visait à analyser des marqueurs de différenciation testiculaire chez l'urodèle Pleurodeles waltl, dont le déterminisme génétique du sexe (ZZ/ZW) peut être influencé par la température. Nos études ont d'abord porté sur le gène sox9 marqueur de la différenciation testiculaire chez les vertébrés supérieurs. Le gène cloné chez le pleurodèle montre une bonne conservation par rapport aux autres vertébrés. Son expression plus élevée dans la gonade mâle n'apparaît que tardivement suggérant qu'il n'est probablement pas impliqué dans les stades précoces de la différenciation testiculaire. En outre, son expression dans le mésonéphros rend difficile son utilisation comme marqueur de différenciation testiculaire. Nous avons ensuite étudié l'Amh, hormone testiculaire impliquée dans la régression des canaux de Müller chez de nombreux vertébrés. Son expression spécifique de la gonade, précocement plus élevée chez les larves ZZ que les ZW en font un excellent marqueur de la différenciation testiculaire. Le fait que les pleurodèles mâles voient les canaux de Müller persister malgré la présence d'Amh suggère que la fonction primaire de cette hormone était en relation avec la différenciation gonadique et que la fonction de régression des canaux de Müller n'est apparue que secondairement au cours de l'évolution. Ces marqueurs ont été mis à profit pour caractériser le phénotype gonadique lors d'inversions sexuelles ou lors de développements en absence de cellules germinales. Ils ont permis de montrer que les cellules germinales ne semblent pas jouer de rôle dans la différenciation gonadique du pleurodèle<br>In the context of comparative physiology of reproduction, amphibians are poorly studied. This work was dedicated to the analysis of testis differentiation markers in the newt Pleurodeles waltl, which shows a ZZ/ZW genetic mode of sex determination that can be affected by temperature. First, we studied sox9, a testis differentiation marker well characterized in many higher vertebrates. The gene cloned in Pleurodeles shows a good level of identity with other vertebrates. The testis-enriched expression appears late during the testis differentiation process indicating that it is probably not involved in the early steps of testis differentiation. Its use as a marker of testicular differentiation proved difficult since it is expressed not only in the gonads but also in the mesonephros. Then, we studied amh, a testis hormone responsible for müllerian duct regression in many vertebrates. Its early expression in the gonad, significantly higher in male than in female larvae makes it an excellent marker for testis differentiation. Since in Pleurodeles waltl, Müllerian ducts persist in males, it suggests that during the course of evolution, the function of Amh on the regression of Müllerian ducts appeared secondarily after its role in gonadal differentiation. These markers have been used to characterize the gonadal phenotype during sex reversal, or in gonads developed in the absence of germ cells. They showed that these cells do not seem to play a role in gonadal differentiation of Pleurodeles waltl