Dissertations / Theses on the topic 'Hélicase d'ARN'

E. faecalis est une bactérie à gram positif, responsable d’infections nosocomiales. Dans cette étude, nous avons identifié par RNA-seq 65 ARN régulateurs potentiels induits en conditions de stress et/ou d’infection chez ce pathogène opportuniste. Parmi ceux-ci, trois ARN surexprimés in vivo, en présence de sels biliaires et à pH acide ont fait l’objet d’une étude approfondie.Le premier, SRC65, s’est avéré être un petit ARN (sARN) agissant probablement en trans. Il présenterait des fonctions redondantes avec son homologue SRC90. Différentes cibles potentielles ont été identifiées et des expériences de physiologie ont révélé un rôle de SRC65 dans le déclenchement de la phase exponentielle de croissance.Le 2ème ARN étudié est une région 5’ régulatrice non traduite (5’UTR), appelée 5’1515. Elle formerait un atténuateur et agirait de manière répressive sur le gène ef1515. EF1515 est un antiterminateur de la famille BglG/SacY capable de se fixer sur 5’1515 pour réguler son expression et celle du gène ef1516 localisé en aval et codant un système de transport des sucres de type PTS. L’antiterminateur EF1515 contrôle aussi l’expression du gène ef3023 codant une protéine impliquée dans la virulence d’E. faecalis.Le dernier ARN régulateur étudié est également une 5’UTR. Celle-ci participerait à la régulation d’une hélicase à motif DEAD (CshA) codée en aval de la 5’UTR. Sa caractérisation s’inscrit dans une étude plus large concernant les éléments du métabolisme des ARN, impliquant les ribonucléases et les autres hélicases à motif DEAD d’E. faecalis. CshA aurait un rôle prépondérant pour la bactérie, en étant impliquée dans la réponse au stress, le fitness et la virulence. L’identification de l’interactome de CshA a notamment permis d’identifier l’énolase comme partenaire privilégié<br>E. faecalis is a gram-positive bacterium responsible for nosocomial infections. Using RNA-seq, we identified 65 putative regulatory RNA induced under stress and/or during infection. Of these, three RNA overexpressed in vivo, in the presence of bile salts and at acidic pH have were more deeply studied.The first, SRC65, was found to be a small RNA (sRNA) probably acting in trans. It would present redundant functions with its homologous sRNA SRC90. Different potential targets were identified and physiology experiments revealed a role for SRC65 in triggering the exponential growth phase.The 2nd studied RNA is a 5’ untranslated region (5'UTR), called 5'1515 which would form an attenuator and act repressively on the ef1515 gene. EF1515 is an antiterminator of the BglG/SacY family capable of binding at 5'1515 to regulate its expression and that of the downstream gene ef1516 encoding a PTS-type sugar transporter. The EF1515 antiterminator also controls the expression of the ef3023 gene encoding a protein involved in E. faecalis virulence.The last regulatory RNA studied is also a 5'UTR. It would participate in the regulation of a DEAD-box helicase (CshA) encoded downstream of the 5'UTR. Its characterization is part of a broader study of the elements of RNA metabolism, involving ribonucleases and other DEAD-box helicases of E. faecalis. CshA would have a prominent role for the bacteria, being involved in stress response, fitness and virulence. The identification of the CshA interactome made it possible to identify enolase as a preferred partner

De nombreuses hélicases d'ARN sont requises pour la synthèse des ribosomes. Il a précédemment été démontré que Prp43p, hélicase d'ARN de type DEAH impliquée dans l'épissage, était également requise chez la levure pour la synthèse de la petite et de la grande sous-unité du ribosome et était associée à la plupart des particules pré-ribosomiques. Nous émettons l'hypothèse que Prp43p participe au remodelage de plusieurs particules pré-ribosomiques. Durant la première partie de ma thèse, j'ai contribué à la démonstration que la protéine à domaine G-patch Pfa1p se fixe directement sur Prp43p, pour stimuler ses activités d'hydrolyse de l'ATP et hélicase. Les données obtenues suggèrent fortement que l'activation de Prp43p par Pfa1p est requise pour une maturation efficace du pré-ARNr 20S en ARNr mature 18S. Les résultats obtenus durant la seconde partie de ma thèse étayent l'hypothèse que la protéine à domaine G-patch Gno1p, et son orthologue humain, l'inhibiteur de la télomérase PINX1, sont également des activateurs de Prp43p. Gno1p et PINX1 humaine exprimée chez la levure interagissent avec Prp43p. De plus, PINX1 interagit avec DHX15, l'orthologue humain de Prp43p, dans des cellules HeLa. PINX1 recombinante purifiée se fixe directement sur Prp43p de levure et stimule fortement son activité ATPase, alors que des altérations du G-patch abolissent l'interaction PINX1/Prp43p et la stimulation de l'activité ATPase de Prp43p. J'ai montré que chez la levure, Gno1p est requise avant tout pour la synthèse de la grande sous-unité ribosomique. Gno1p s'associe avec des composants des particules pré-ribosomiques 90S et pré-60S précoces, mais pas avec des composants des particules pré-60S intermédiaires. L'absence de Gno1p ou des altérations du domaine G-patch de Gno1p conduisent à une forte diminution de la quantité de pré-ARNr 27SB, mais ont peu d'effet sur l'accumulation du pré-ARNr 27SA2. Collectivement, mes résultats suggèrent que l'activation de Prp43p par Gno1p au sein de particules pré-ribosomiques 90S et/ou pré-60S précoces conduit à un/des réarrangement(s) de conformation cruciaux pour la maturation ultérieure de ce dernier type de particules<br>Numerous RNA helicases are required for ribosome synthesis. It has previously been shown that the splicing DEAH RNA helicase Prp43p is required in Saccharomyces cerevisiae for the synthesis of both large and small ribosomal subunits and is associated with most pre-ribosomal particles. We postulate that Prp43p remodels several pre-ribosomal particles. During the first part of my thesis, I have contributed to the demonstration that the G-patch protein Pfa1p directly binds to Prp43p, to stimulate its ATPase and helicase activities. The data obtained strongly suggest that activation of Prp43p by Pfa1p is required for efficient maturation of the 20S pre-rRNA into mature 18S rRNA. Data obtained in the second part of my thesis support the notion that the yeast G-patch protein Gno1p and its human orthologue, the telomerase inhibitor PINX1, are also activators of Prp43p. Gno1p and human PINX1 expressed in yeast interact with Prp43p. Moreover, PINX1 interacts with DHX15, the human orthologue of Prp43p, in HeLa cells. Purified recombinant PINX1 directly binds to yeast Prp43p and strongly stimulates its ATPase activity, while alterations of the G patch abolish both the PINX1/Prp43p interaction and the stimulation of Prp43p ATPase activity. In yeast cells, I have shown that Gno1p is above all required for the synthesis of the large ribosomal subunit. Gno1p associates with components of 90S and early pre-60S pre-ribosomal particles but not with components of intermediate nucleoplasmic pre-60S particles. Lack of Gno1p or alteration of the G patch of Gno1p lead to a strong decrease in 27SB pre-rRNA accumulation while levels of 27SA2 pre-rRNA are little affected. Altogether, my results suggest that activation of Prp43p by Gno1p within 90S and/or early pre-60S particles elicits (a) conformational rearrangement(s) crucial for the subsequent maturation of these latter particles

Nous avons étudié les propriétés des états excités singulets de deux doubles hélices modèles d’ADN, (dA)n. (dT)n et (dAdT)n. (dAdT)n et nous les avons comparées à celles des simples brins et de leurs monomères constitutifs, afin de caractériser les effets coopératifs qui existent entre les bases. Nous avons utilisé les spectroscopies optiques en régime stationnaire ainsi que la spectroscopie de fluorescence résolue en temps sur une large gamme temporelle (100 fs – 100 ns). Premièrement, nous avons déterminé les propriétés des états singulets des monomères. Nous avons montré que la fluorescence de dA et dAMP est émise aussi bien à partir de l’état S1 que de l’état S2. L’émission du S2 correspond essentiellement au maximum du spectre de fluorescence enregistré en régime stationnaire alors que l’aile rouge de ce spectre provient majoritairement de l’émission du S1. Ensuite, nous nous sommes intéressés aux états excités singulets des simples et doubles brins. Nous avons démontré que tous nos résultats expérimentaux obtenus pour les deux doubles brins ainsi que pour la simple hélice (dA)20, ne peuvent pas être interprétés en terme d’états excités localisés sur une seule base. Par contre, l’hypothèse d’une bande d’états délocalisés nous a permis de rendre compte de toutes nos observations. La formation des états délocalisés serait due à l’action des interactions dipolaires et des interactions à transfert ou résonance de charge. Finalement, l’observation des déclins d’anisotropie de fluorescence à l’échelle subpicoseconde, nous a permis de prouver qu’un transfert d’énergie a lieu au sein des hélices considérées. Ce transfert s’effectuerait par un mécanisme de diffusion intrabande<br>We have studied singlet excited states properties of two DNA double helices, (dA)n. (dT)n and (dAdT)n. (dAdT)n and we have compared them to the properties of the corresponding single strands ((dA)20 and (dT)20) and monomers (nucleosides and nucleotides), by focusing on cooperative effects between bases. We have used both steady-state (absorption, fluorescence) and time-resolved fluorescence optical spectroscopies covering a large time-domain (100 fs – 100 ns). The first step of the study was to determine the properties of the monomers (dA, dAMP, dT and TMP). Our main result is that fluorescence of dA and dAMP emanates from both S1 and S2. The peak of the steady-state fluorescence spectrum corresponds mainly to S2 fluorescence whereas the red tail arises from S1. We have shown that all our experimental results, obtained for the two double helices and the single helix (dA)20, cannot be described in terms of states localized on single bases. In contrast, formation of delocalized states, induced by the combined action of dipolar interactions and charge transfer or charge resonance interactions, can account for the ensemble of our observations. Finally, the observation of fluorescence anisotropy decays at the sub-picosecond time-scale, has shown that energy transfer takes place in the studied helices

Dans la première partie de cette thèse, nous avons étudié l'élasticité d'une molécule d'ADN simple brin à l'aide de pinces magnétiques. Les modèles de polymères idéaux ne rendent pas bien compte de l'élasticité de cette molécule, alors qu'ils décrivent très bien l'ADN double brin. Nous avons donc étudié expérimentalement l'élasticité d'une molécule simple brin dans différentes conditions salines, i.e. d'écrantage de charges, et dans des conditions modulant les interactions internes du polymère. En utilisant des conditions dénaturantes, nous avons pu séparer les effets des différentes interactions intramoléculaires et ainsi mieux caractériser leur importance respective pour décrire l'élasticité de la molécule. Il est ressorti de ces mesures qu'une description complète de l?ADN simple brin doit prendre en compte d'une part la formation de structures secondaires à basses forces, et d'autre part les effets de volume exclu: contrairement au double brin, le simple brin est tellement flexible que les répulsions électrostatiques dues aux groupements phosphates le long de la chaîne ne peuvent plus être négligées. Des simulations numériques prenant en compte ces deux effets sont en excellent accord avec nos observations expérimentales. Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons étudié l'activité de deux hélicases à l'échelle de la molécule unique. Les hélicases sont des moteurs moléculaires qui catalysent la séparation des deux brins de la double hélice d?ADN, permettant ainsi l'accès aux bases individuelles formant le code génétique. Dans notre expérience, une unique molécule d'ADN double brin était immobilisée par pinces magnétiques et son extension mesurée avec une précision de 10 nm. Ceci nous a permis de suivre l'activité des hélicases, puisque celles-ci provoquent un changement de l'extension de la molécule lorsque le double brin est converti en simple brin. Cette méthode présente l'avantage de permettre l'observation en temps réel de l'activité d'une seule protéine. L'analyse statistique des données nous a permis d'accéder aux distributions complètes de vitesse et de processivité des enzymes. Nous avons ainsi caractérisé le comportement dynamique d?hélicases uniques (leur vitesse, leur processivité, leur coopérativité et leur pas élémentaire sur l'ADN). Le suivi en temps réel de l'activité des hélicases nous a permis d'observer une instabilité dans leur mode d'ouverture, et ainsi de rendre compte de mesures de vitesse obtenues en volume.

Nous avons étudié la dynamique de structures d'ADN à 3 et à 4 brins. Une étude cinétique par résonance plasmonique de surface nous a permis de proposer un modèle de formation directionnelle des triple-hélices, qui découlerait de la nature droite du duplexe cible. Le polymorphisme structural de l'ADN permet également la réalisation de systèmes capables d'accomplir des mouvements. Nous avons réalisé une machine moléculaire à ADN fondé sur l'interconversion entre un duplexe et un G-quadruplexe. L'équilibre entre des conformations différentes d'ADN peut être modulé par des ligands spécifiques des structures en jeu. En particulier, la stabilisation d'une structure en G-quadruplexe à l'extrémité 3' des télomères constitue une approche potentielle pour inhiber la télomérase, une enzyme active dans la majorité des cellules tumorales. Afin d'identifier des ligands spécifiques des G-quadruplexes nous avons étudié la sélectivité de plusieurs composés vis-à-vis de différentes structures d'ADN<br>We have studied the dynamics of DNA three- and four-stranded structures. A kinetic study by surface plasmon resonance led us to the elucidation of a directional mechanism for triple-helix formation, probably due to the right-handedness of the target duplex. The DNA structural polymorphism also allows the realisation of systems capable of performing movements. We have realised a DNA system accomplishing an extension-contraction movement based on the interconversion between a double-helix and a G-quadruplex. The equilibrium between different DNA possible conformations may be modulated by small molecules specifically recognising a given DNA structure. In particular, the stabilisation of G-quadruplexes at telomeres represents a potential therapeutic approach to inhibit telomerase, an enzyme active in most of cancer cells. In order to identify G-quadruplexes specific ligands, we have explored the structural selectivity of different DNA binding molecules by a competition dialysis assay

A partir des données expérimentales dont on dispose sur les triples hélices - diffraction de rayons X par des fibres de polynucléotides triple brin, et cristallographie de l’ARN de transfert -, nous avons déduit des principes et des règles grâce auxquels nous avons construit une base de données structurales de 64 triplets. Nous avons ainsi envisagé, pour les triplets ATT, GCC+ et GCG, toutes les combinaisons possibles pour ce qui concerne l'appariement de troisième brin, l'orientation de sa chaîne sucre-phosphate, et son anomérie - alpha ou beta. Nous avons ensuite utilisé cette base de données pour caractériser toutes les fonctions possibles entre ces triplets, et nous proposons un certain nombre de jonctions pouvant être réalisées entre segments contenant purines et pyrimidines sur le premier brin. Apres avoir étendu aux triples hélices la convention qui définit les paramètres hélicoïdaux des ADNs double brin, nous avons donné une description géométrique des triples hélices existantes, et propose des modèles pour quatre d'entre elles, sur la base d'une étude par mécanique et dynamique moléculaires.

La famille RecQ des ADN hélicases est impliquée dans la maintenance de la stabilité génomique. Nous nous sommes intéressés, au cours de ce travail, au rôle du doigt de zinc du domaine RecQ Ct de ces hélicases. Les résultats indiquent que le motif à doigt de zinc est impliqué dans la fixation à l'ADN et le repliement correct de la protéine RecQ. Nous avons montré que le domaine hélicase de RECQ5 possède une activité intrinsèque qui tend à favoriser l'hybridation d'ADN et que le doigt de zinc de RECQ5(3 régule la fixation à l'ADN, l'activité ATPase, le déroulement de l'ADN, l'hybridation de l'ADN et l'échange des brins d'ADN. II semble que la présence du doigt de zinc est essentielle pour les activités ATPase et hélicase des hélicases RecQ, mais pas pour l'activité d'hybridation d'ADN. Notre travail sur les hélicase RecQ de Bacillus subtilis soutient aussi cette conclusion.

Nous avons étudié par modélisation moléculaire et dynamique moléculaire, en corrélation avec les résultats de la spectroscopie infrarouge et de la spectroscopie raman, la structure de différentes familles de triples hélices d'acides nucléiques. Dans la première famille possédant un troisième brin contenant des bases pyrimidiques, nous nous sommes intéressés à la conformation des sucres, puis à l'effet de l'anomérie alpha ou beta des nucléosides sur le mode d'appariement et la polarité du troisième brin. Suivant la triple hélice considérée, nous avons montré la coexistence de sucres de type sud et de type nord, ou la présence unique de sucres de type sud, et ainsi demontré la possibilité de former une triple hélice avec un duplex en forme b ou en forme hétéronome. La substitution d'un troisième brin d'anomérie beta par un brin d'anomérie alpha induit selon le type de triplets constitutifs de la triple hélice soit l'inversion de la polarité du troisième brin (anti parallèle) avec conservation du type d'appariement (Hoogsteen), soit la modification du type d'appariement (hoogsteen inversé) avec conservation de la polarité (parallèle). Nous avons ensuite examiné dans le cas des triples hélices formées à l'aide d'un troisième brin riche en purines, la conformation des sucres, l'influence de la séquence sur le mode d'appariement et sur la polarité du troisième brin, ainsi que la flexibilité de ces édifices. Un troisième brin ne possédant que des guanines est orienté parallèlement par rapport au brin purine du duplex gc, alors qu'un brin contenant à la fois des guanines et des adénines possède une orientation antiparallèle. Nous avons montré que l'appariement hoogsteen inversé couple à une orientation anti parallèle du troisième brin est corrélé à des sucres de type sud. La configuration hoogsteen parallèle nécessite la présence de sucres de type nord. De plus, les modèles présentant un appariement Hoogsteen inversé avec une polarité anti parallèle montrent une plus grande flexibilité que ceux en appariement hoogsteen avec une polarité parallèle.