Academic literature on the topic 'Hématopoïèse – génétique'

La différenciation d'une cellule pluripotente s'accompagne de l'expression d'un programme génétique spécifique qui donne à la cellule mature toutes les caractéristiques propres à son lignage. L'hématopoièse est le processus qui conduit à la différenciation d'au moins huit lignages différents à partir d'une seule cellule souche, elle constitue donc un modèle intéressant pour l'étude du contrôle de l'expression des gènes spécifiques de lignage. Mona (Monocytic adapter) est un adaptateur moléculaire spécifiquement exprimé dans le système hématopoiétique. Ce travail décrit l'étude des mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels de contrôle de l'expression de Mona. Les transcrits de Mona exprimés dans les cellules T et myéloides (transcrits 1A) sont différents de ceux exprimés dans les cellules mégacaryocytaires et les plaquettes (transcrits 1B) au niveau de leur 5'UTR mais ils ont la même séquence codante. Les transcrits 1A et 1B sont synthétisés à partir de deux promoteurs distincts, nommés 1A et 1B, qui sont respectivement spécifiques des lignages T et myélo-monocytaire, et du lignage mégacaryocytaire. La caractérisation du promoteur 1A montre que son activité dépend principalement du facteur de transcription AML-1 (Acute Myeloid Leukemia-1). La caractérisation du promoteur 1B montre qu'il est caractéristique des promoteurs mégacaryocytaires connus, son activité dépend en effet de facteurs de transcription des familles GATA et ETS. L'expression de Mona dans le lignage mégacaryocytaire dépend également d'un mécanisme post-transcriptionnel. En effet, la traduction de Mona à partir des transcrits 1B est inhibée par deux trames de lecture ouverte dans la 5'UTR 1B. Nos résultats suggèrent que l'inhibition de la traduction de Mona pourrait être levée au cours de l'activation des plaquettes. Alternativement, une isoforme de Mona produite après épissage alternatif du transcrit 1B pourrait être stabilisée par l'activation des plaquettes.

Les cellules sanguines de drosophile, appelées hémocytes, sont de trois types : les plasmatocytes sont les phagocytes professionnels, les cellules à cristaux sont impliquées dans les réactions de mélanisation, et les lamellocytes sont impliqués dans les réactions d’encapsulement des parasites. Dans un premier projet, nous avons analysé les activités transcriptionnelles des hémocytes de la drosophile, ainsi que suite à une infection bactérienne, par la technique des puces à ADN Affymetrix. Nous avons ainsi mis en évidence certains points importants du processus d’encapsulement. Un rôle signal des hémocytes, primordial pour le déclenchement de la réponse immunitaire, a été établi. Le transcriptôme des hémocytes est un outil qui servira de base aux études futures concernant les hémocytes de drosophile. Mon projet principal fut consacré au transactivateur Collier (Col) dans l’hématopoïèse larvaire de la drosophile. Col est l’unique orthologue de EBF, un facteur impliqué dans la différenciation des lymphocytes B chez les mammifères. Nous avons montré que Col est indispensable à la différenciation des lamellocytes. Col est exprimé chez l’embryon, dans les cellules qui vont former l’organe hématopoïétique. Au cours de la vie larvaire, col reste exprimé dans un centre signalisateur de l’hématopoïèse. Nous proposons que le facteur Col confère la compétence à répondre à un signal informatif émis par les plasmatocytes suite à l’infection parasitaire. Dans notre modèle, ces cellules émettent alors un signal S2 vers les prohémocytes pour déclencher la différenciation des lamellocytes. Nous avons ensuite identifié le gène CG14225 qui code une protéine transmembranaire homologue du récepteur gp130 des mammifères. Notre analyse fait de ce gène un bon candidat pour coder le récepteur de S2. J’ai développé deux approches pour générer un mutant nul pour CG14225. La lignée mutante nous permettra de conclure sur l’implication de ce gène dans les processus hématopoïétiques de la drosophile
Drosophila have three blood cells (or hemocytes) types: plasmatocytes are professional phagocytes, crystal cells are involved in melanization reactions that accompanies immune defenses, and lamellocytes ensure parasites encapsulation. In a first project, we studied the transcriptional profiling of activities of distinct hemocyte populations and from naïve or infected larvae, using Affymetryx microarray. One outcome was the gain of new insights into the lamellocyte encapsulation process. A second compelling observation is that, after an immune challenge, Drosophila hemocytes produce a signal molecule that is essential to induce the immune reactions. The establishment of the transcriptional profiling of Drosophila hemocytes represents a useful tool for future studies on hemocyte functions. In my main research project, I investigated the role of Collier (Col) in the Drosophila larval hematopoiesis. Col is the unique Drosophila orthologue of the mammalian transactivator EBF, an important factor for B cell differentiation. We showed the critical requirement for Col activity in lamellocytes’ specification. Col is first expressed during embryogenesis, in the progenitors of the hematopoïetic organ. During larval stages, col is expressed in this organ in a signalling centre for hemaotopoiesis. We suggest that Col give the capacity to relay an instructive signal emitted by plasmatocytes upon their encounter with a parasite. In our model, these cells synthesise a signal S2 that orients precursors towards the lamellocyte fate. We then identified the gene CG14225, which encodes a transmembrane protein homologous of the mammalian gp130 receptor. Our first analysis revealed that CG14225 is a good candidate to encode the receptor for S2. I have developed two different strategies to generate a loss-of-function mutation for CG14225. The null mutant will enable us to conclude about this gene‘s implication in the Drosophila hematopoietic processes

Les érythrocytes (globules rouges, GR) transportent le dioxygène (via l’hémoglobine) des poumons aux tissus de l’organisme. Leur production est assurée par des cellules souches hématopoïétiques (CSH), garantes des cellules constituants le sang. Chez l’adulte, l’érythropoïèse (processus qui aboutit à la production d’érythrocytes) a lieu en continu dans la moelle osseuse pour produire au quotidien environ 1011 érythrocytes. C’est de loin le plus haut rendement de production cellulaire du corps humain. Ce processus est finement régulé par une balance prolifération versus différenciation et peut s’adapter aux besoins de l’organisme. Cependant, le moindre défaut de régulation peut aboutir progressivement à des désordres érythroïdes (anémies, polyglobulies, voire à des transformations leucémiques). Le gène CXXC5 (alias RINF, Retinoid-Inducible Nuclear Factor), a été découvert en 2009 comme une cible directe des rétinoïdes nécessaire à la granulopoïèse. En effet, des expériences d’invalidation par ARN interférence ont démontré que l’expression de ce facteur était essentielle à la différenciation granulocytaire terminale des cellules hématopoïétiques aussi bien normales (progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ cultivés en présence de G-CSF) que leucémiques (lignée NB4 traitée par l’ATRA, Acide Rétinoïque tout-trans). Ce gène est localisé en 5q31, une région fréquemment sujette à des délétions chromosomiques dans des hémopathies malignes. Il code un facteur chromatinien possédant un motif à doigt de Zinc de type CXXC, retrouvé conservé avec plusieurs modulateurs épigénétiques importants. Toutefois, la contribution fonctionnelle de RINF sur la maturation ou l’engagement des progéniteurs vers d’autres lignages hématopoïétiques, n’avait pas été déterminée. Mes travaux de thèse ont démontré l’implication de RINF dans l’érythropoïèse humaine par l’intermédiaire d’expériences de pertes et gains de fonction dans des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ (de sang de cordon ombilical ou de moelle osseuse) cultivés en présence d’EPO. Nous avons identifié le mécanisme d’action moléculaire et démontré que SMAD7 (un gène codant un inhibiteur de la voie de signalisation du TGF-β) était une cible transcriptionnelle directe de RINF (mis en évidence par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, cette cible a été validée sur des cellules primaires et dans deux lignées érythroleucémiques K562 et UT7). Nous avons également montré que ce mécanisme d’action est dépendant du TGF-β (par l’utilisation d’un inhibiteur du TGF-βRI sur des cellules primaires en culture). Ainsi, la perte d’expression du gène RINF/CXXC5 au cours de l’érythropoïèse sensibilise les érythroblastes au TGF-β et conduit à une production d’érythrocytes plus restreinte (et contribuerait ainsi in vivo à la cytopénie du lignage érythroïde). Enfin, la caractérisation phénotypique du modèle murin génétiquement invalidé pour le gène Rinf a été initiée. Mes travaux ont notamment mis en évidence une perte importante de viabilité et de fertilité des souris Rinf-/-. L’hématopoïèse murine a aussi été explorée. Les résultats préliminaires nous laissent penser que la régulation de Smad7 par le facteur RINF (mise en évidence dans l’érythropoïèse humaine) s’exerce aussi dans le tissu hématopoïétique murin. Ce facteur épigénétique pourrait jouer un rôle important en modulant (1) les capacités d’expansion et d’auto-renouvellement des progéniteurs hématopoïétiques, (2) leur sensibilité au TGF-β (via Smad7) et/ou (3) les processus d’hydroxyméthylation de l’ADN génomique
No abstract

Les hémopathies myéloïdes sont des maladies clonales de la cellule souche hématopoïétique. Récemment de nombreuses études ont démontré l'implication des facteurs épigénétiques dans l'apparition de ces maladies. En effet, le séquençage d'ADN de patients atteints de diverses hémopathies malignes a permis l'identification de mutations dans le gène TET2 (TET methylcytosïne dioxygenase 2). Cette enzyme convertit les 5-méthylcytosines en 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC). L'impact biologique de cette nouvelle base de l'ADN ainsi que la fonction des protéines TET sont encore mal connus. Les objectifs de ma thèse ont donc consisté à déterminer la ou les fonction(s) de TET2 au cours de l'hématopoïèse humaine et son implication dans la transformation maligne. Mes travaux ont confirmé, dans les cellules de patients atteints de NMP, que la mutation de TET2 induit une diminution du taux global de 5hmC génomique. Puis nous avons montré qu'une haploinsuffisance en TET2 dans des cellules CD34+ induisait un biais de différenciation vers le lignage myéloïde aux dépens des lignages lymphoïdes et érythrocytaires. Elle influence aussi les étapes terminales des trois lignages myéloïdes. Nous avons également démontré que l'inhibition de TET2 induit la surexpression de MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor}, TET2 est capable de se fixer au niveau de son site d'initiation de la transcription (TSS) et d'influencer sa transcription par recrutement d'EGR-1 et de la polymerase II activée. Enfin, l'haploinsuffisance de TET2 confère un avantage sélectif aux cellules CD34+ permettant une reconstitution supérieure du système hématopoïétique de souris immunodéficientes dans un modèle de xénogreffe
Myeloid malignancies are clonal disease of the hematopoietic stem cell develop following a skewed of the differentiation toward myeloid lineages associated with increased proliferation. Recently, many studies have demonstrated the involvement epigenetic factors in malignant transformation. Indeed, DNA sequencing of patients with diverse malignancies identified mutations in TET2 (TET methylcytosïne dioxygenase 2) gene. This gene encodes an enzyme that couverts 5-methylcytosines to 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC). The biological impact of this new modification of DNA bases and the TET protein function during hematopoiesis is poorly understood. The objectives of my thesis were to determine the function(s) of TET2 in human hematopoiesis and involvement in malignant transformation. My results confirmed in the cells from MPN patients that TET2 mutation induces a decrease in the overall rate of 5hmC. Then we hâve shown that TET2 haploinsufficiency after infection of CD34+ using a specific shRNA induces differentiation skewed toward myeloid lineage. This haploinsufficiency also affects the terminal stages of myeloid three lineages. We also demonstrated that TET2 inhibition induces expression of several inflammatory cytokines such as MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor}. TET2 binds to it promoter regions and influence their transcription through the recruitment of EGR1 and active polymerase II. Finally, haploinsufficiency of TET2 induces a selective advantage of CD34+ cells for reconstitution of the hematopoietic System of highly immunodeficient mice. TET2 is involved in several steps of tumor transformation but these functions factor transcription remain poorly understood

La première partie de ma thèse porte sur l'identification de l'événement génétique causant une nouvelle macrothrombopénie à transmission autosomale récessive, associée à une tendance au saignement, un défaut de réorganisation du cytosquelette, de formation des proplaquettes et d'activation des plaquettes. Après le séquençage exomique, une mutation homozygote du gène PRKACG a été identifiée. Elle conduit à un défaut de la PKA sans entraîner sa dégradation. Une absence quasi complète de la filamine A, un des ces substrats, est observée dans les mégacaryoyctes (MKs) des patients. La surexpression de PRKACG WT permet la restauration de la formation des proplaquettes des patients ce qui confirme son implication dans la pathologie. Ii. La deuxième partie s'inscrit au sein d'une étude fonctionnelle des gènes cibles de RUNX1 dérégulés dans la thrombopénie FPD/AML et dans ce cadre, au rôle de pl 9Ink4d dans l'hématopoïèse. Nous avons observé qu'après induction d'un stress, la sortie de quiescence des CSH, le niveau de ROS et des cassures doubles brins de l'ADN dans un contexte KO sont augmentés et conduisent à l'apoptose. Ce phénomène implique le rôle intrinsèque de p19. Un rôle extrinsèque de p19 à travers la régulation du microenvironnement a également été montré. En plus de son rôle dans l'arrêt des endomitoses des MKs, p19 contrôle négativement la prolifération des progéniteurs MK. En son absence, l'amplification de MKs s'accentue avec l'âge et conduit à une splénomégalie et au développement de fibrose suite à l'augmentation de TGFI31. Cette dernière expliquerait la diminution de pool des HSCs en absence de p19 à l'état basal et au cours du vieillissement
. The first part of my thesis focuses on the identification of genetic event causing a new macrothrombopénie recessive autosomal associated with a bleeding tendency, defective cytoskeletal reorganization. And a defect in proplatelets formation and platelet functions. After exome sequencing, a homozygous mutation in PRKACG gene was identified. It leads to a defect of PKA without causing its degradation. An almost complete absence of the filamin A, one of the PKA substrates, was observed in patient megakaryocytes (MKs). Overexpression in patient progenitors of WT PRKACG allows the restoration of proplatelet formation confirming its involvement in the disease. Ii. The second part fats within a functional study of RUNX1 target gens deregulated in FPD/AML thrombocytopenia and in this context, the role of pl 9liik44 in hematopoiesis. We observed that alter stress induction, the exit of quiescent state of HSC, the ROS level and DNA double strand breaks are increased in a KO background. This phenomenon leading to cell death by apoptosis is linked to an intrinsic role of p19. Extrinsic role of p19 through regulation of the microenvironment has also been shown. In addition to its role in the arrest of MK endomitoses, p19 negatively controls the proliferation of MK progenitors. In the absence of p19, the MK amplification increases with age and leads to splenomegaly and development of fibrosis following the increase of TGFI31. This last one could explain a decrease in HSC pool in the absence of p19 at basal state and during aging

La drosophile possède un système immunitaire inné qui fait intervenir deux types de réponses, une réponse humorale et une réponse cellulaire. Cette dernière met en jeu des cellules spécialisées appelées hémocytes ou cellules " sanguines ". Les hémocytes sont formés au cours de deux vagues d'hématopoïèse lors du développement, une vague embryonnaire et une vague larvaire. Les mécanismes moléculaires contrôlant l'hématopoïèse embryonnaire sont relativement bien connus, alors que ceux contrôlant l'hématopoïèse larvaire restent à ce jour très succints. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes moléculaires mis en jeu au cours de l'hématopoïèse larvaire qui a lieu dans un organe spécifique appelé la glande lymphatique. (1) J'ai participé à l'étude du rôle de la voie de signalisation JAK/STAT au cours de l'hématopoïèse larvaire, en caractérisant un nouveau gène appelé latran, qui agit comme un dominant négatif de la voie JAK/STAT. La fonction de latran est requise uniquement à la suite d'un challenge immun pour inactiver la voie JAK/STAT dans la glande lymphatique, mettant en évidence un nouveau mode de régulation pour cette voie de signalisation (Makki et al. , 2010 ; résultats partie I). (2) J'ai d'autre part entrepris une analyse globale de transcriptomes à partir d'ARNs isolés à partir de glandes lymphatiques disséquées dans divers contextes génétiques et physiologiques. J'ai pu identifier et caractériser de nouveaux gènes impliqués dans l'hématopoïèse larvaire (manuscript en préparation ; résultats partie II). (3) La comparaison des différents transcriptomes a suggéré un rôle de la voie Dpp/BMP dans le contrôle de l'hématopoïèse larvaire. Ceci m'a conduit à m'intéresser au rôle de cette voie de signalisation dans l'hématopoïèse larvaire. La " niche " est un microenvironnement qui contrôle la différenciation et l'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques. Récemment, notre laboratoire a montré qu'il existait une niche hématopoïétique dans la glande lymphatique appelé Posterior Signaling Center (PSC). J'ai montré que chez la drosophile, la voie de signalisation Dpp jouait un rôle clé dans le contrôle de la taille de la niche via le contrôle de l'expression du protooncogène dmyc. L'activation localisée de la voie Dpp dans le PSC est sous le contrôle du facteur de transcription collier. En 2003, il avait été montré que la voie BMP contrôle la prolifération de la niche hématopoïétique chez la souris (Zhang et al. , 2003). Ainsi, de façon très intéressante, mes résultats mettent en évidence la possibilité d'une conservation de la Drosophile aux mammifères des cascades moléculaires contrôlant la prolifération des cellules de la niche hématopoïétique (manuscrit soumis ; résultats partie III). Une question posée suite à mes résultats est de définir l'implication de Myc, Ebf2, l'orthologue de Col et les voies de signalisation Wnt et BMP dans le contôle de la taille de la niche hématopoïétique chez les mammifères
The fruit fly Drosophila melanogaster owns an immune system which consists in two different responses: the response and the cellular response. The cellular response required specialized cell types called hemocytes or "blood" cells. Hemocytes are specified during hematopoiesis which takes place in two waves during Drosophila development. The first wave occurs in the embryo while the second takes place at larval stages in a specific organ called the lymph gland. Molecular mechanisms controlling embryonic hematopoiesis are well known whereas those involved at larval stages are not known. During my PhD, I studied molecular mechanisms occurring during larval hematopoiesis. (1) I participated to the study of the role of the JAK/STAT signaling pathway during larval hematopoiesis. We characterized a new gene, called latran, which acts as a negative regulator of the pathway. Latran is required after an immune challenge to inactivate the JAK/STAT pathway, reaviling a new way to regulate this pathway (Makki and al. , 2010). (2) Secondly, I performed a transcriptome analysisusing RNAs isolated from dissected lymph glands in genetics and physiologic contexts. I identified and characterized new genes involved in larval hematopoiesis (manuscript in preparation). (3) Comparison of the different transcriptomes suggested a role of the Dpp/BMP signaling pathway in larval hematopoiesis. The "niche" is a microenvironment which controls the differentiation and the self-renewal of hematopoietic stem cells. Recently, our group identified a hematopoietic niche in Drosophila lymph gland called the Posterior Signaling Center (PSC). My data indicate that the Dpp pathway plays a key role in the control of PSC size via the regulation of the protooncogene dmyc expression. The localized activation of the Dpp pathway in the PSC is under the control of the transcription factor Collier (manuscript submitted). In 2003, it was shown in mouse that BMP pathway controls the proliferation of osteoblasts, one major component of the hematopoietic niche. My results highlight the very interesting possibility of the conservation, between Drosophila and mammals, of molecular cascades that control cell proliferation in the hematopoietic domain. A very challenging issue relates to the control of osteoblast proliferation in the osteoblastic niche and the potential implication of myc and links between BMP, Ebf2 (ortholog of Collier and Wnt signalling pathways in this process

Des travaux menes au laboratoire ont montre que des cellules hematopoietiques murines multipotentes de la lignee fdcp-mix exprimant le recepteur au csf-1 humain (csf-1r) de maniere ectopique, ne proliferent que si ce dernier est exprime sous sa forme membranaire a la surface de cellules stromales. Selon un procede similaire, une strategie visant a isoler des lignees de cellules hematopoietiques non transformees a partir de la moelle osseuse de souris a ete elaboree. Nous avons choisi de realiser des souris transgeniques pour le gene c-fms humain, qui code pour le csf-1r, afin de disposer, par simple prelevement de moelle osseuse, d'une source permanente de cellules hematopoietiques exprimant le csf-1r humain. Deux approches ont ete utilisees : l'infection retrovirale de cellules es et la microinjection de l'adnc c-fms dans des ovocytes fecondes. La seconde approche nous a permis d'etablir une lignee de souris transgeniques c-fms humain. Il nous a alors ete possible, apres ensemencement de cellules medullaires de souris transgeniques c-fms humain sur des cellules stromales ms-5 exprimant la forme membranaire du csf-1 humain (cellules 2m-1), d'isoler une lignee hematopoietique, denommee 47. 10. Cette lignee 47. 10 est heterogene et composee de cellules myeloides exprimant divers marqueurs immunologiques de differenciation myelomonocytaire (cellules lin+). Des cellules blastiques lin - peuvent etre enrichies par tri cellulaire et sont capables de regenerer la population initiale une semaine apres reensemencement sur cellules 2m-1. Des progeniteurs a tres fort potentiel de proliferation, ont egalement ete detectes et leur maintien depend du systeme csf-1r/csf-1 membranaire. La lignee 47. 10 apparait donc composee de progeniteurs immatures capables de differenciation myelomonocytaire spontanee et dont l'autorenouvellement est dependant de la presentation du csf-1 humain par les cellules stromales 2m-1.

Le csf-1 est un facteur de proliferation et de differenciation des precurseurs monocytaires. Son recepteur transmembranaire, code par le proto-oncogene c-fms, possede une activite tyrosine kinase inductible. L'adnc du csf-1r humain a ete transfere par vecteur retroviral dans des lignees cellulaires hematopoietiques murines facteur-dependantes, non-repondeuses au csf-1. Nous avons recherche si le csf-1 devenait alors capable de stimuler la proliferation de ces cellules, et si cela les engageait dans la voie de la differenciation monocytaire. Nous avons demontre que l'expression du csf-1r humain dans diverses lignees myeloides murines il-3-dependantes leur conferait la capacite de proliferer a long terme en reponse au csf-1. Cet effet du csf-1 est correle a la capacite des cellules a proliferer en reponse au stem cell factor (scf), ce qui suggere une inter-relation de leurs voies de signalisation respectives. De plus, une lignee murine multipotente exprimant le csf-1r humain, cultivee en csf-1 pendant une longue periode, a conserve ses caracteristiques de cellules immatures, notamment sa capacite a se differencier en cellules erythroides matures. Enfin, nous avons montre que le csf-1r humain est fonctionnel dans des progeniteurs erythroides (bfu-e) de moelle osseuse murine, puisqu'il est capable de se substituer a l'il-3 comme facteur stimulant la croissance de ces progeniteurs in vitro. En conclusion, nous suggerons que le csf-1r humain favorise l'auto-renouvellement plutot que la differenciation dans une cellule hematopoietique murine immature. L'ensemble de ces resultats nous permet d'envisager l'isolement de lignees csf-1-dependante de cellules souches hematopoietiques de souris