Dissertations / Theses on the topic 'Hématopoïèse – génétique'

La différenciation d'une cellule pluripotente s'accompagne de l'expression d'un programme génétique spécifique qui donne à la cellule mature toutes les caractéristiques propres à son lignage. L'hématopoièse est le processus qui conduit à la différenciation d'au moins huit lignages différents à partir d'une seule cellule souche, elle constitue donc un modèle intéressant pour l'étude du contrôle de l'expression des gènes spécifiques de lignage. Mona (Monocytic adapter) est un adaptateur moléculaire spécifiquement exprimé dans le système hématopoiétique. Ce travail décrit l'étude des mécanismes transcriptionnels et post-transcriptionnels de contrôle de l'expression de Mona. Les transcrits de Mona exprimés dans les cellules T et myéloides (transcrits 1A) sont différents de ceux exprimés dans les cellules mégacaryocytaires et les plaquettes (transcrits 1B) au niveau de leur 5'UTR mais ils ont la même séquence codante. Les transcrits 1A et 1B sont synthétisés à partir de deux promoteurs distincts, nommés 1A et 1B, qui sont respectivement spécifiques des lignages T et myélo-monocytaire, et du lignage mégacaryocytaire. La caractérisation du promoteur 1A montre que son activité dépend principalement du facteur de transcription AML-1 (Acute Myeloid Leukemia-1). La caractérisation du promoteur 1B montre qu'il est caractéristique des promoteurs mégacaryocytaires connus, son activité dépend en effet de facteurs de transcription des familles GATA et ETS. L'expression de Mona dans le lignage mégacaryocytaire dépend également d'un mécanisme post-transcriptionnel. En effet, la traduction de Mona à partir des transcrits 1B est inhibée par deux trames de lecture ouverte dans la 5'UTR 1B. Nos résultats suggèrent que l'inhibition de la traduction de Mona pourrait être levée au cours de l'activation des plaquettes. Alternativement, une isoforme de Mona produite après épissage alternatif du transcrit 1B pourrait être stabilisée par l'activation des plaquettes.

Les cellules sanguines de drosophile, appelées hémocytes, sont de trois types : les plasmatocytes sont les phagocytes professionnels, les cellules à cristaux sont impliquées dans les réactions de mélanisation, et les lamellocytes sont impliqués dans les réactions d’encapsulement des parasites. Dans un premier projet, nous avons analysé les activités transcriptionnelles des hémocytes de la drosophile, ainsi que suite à une infection bactérienne, par la technique des puces à ADN Affymetrix. Nous avons ainsi mis en évidence certains points importants du processus d’encapsulement. Un rôle signal des hémocytes, primordial pour le déclenchement de la réponse immunitaire, a été établi. Le transcriptôme des hémocytes est un outil qui servira de base aux études futures concernant les hémocytes de drosophile. Mon projet principal fut consacré au transactivateur Collier (Col) dans l’hématopoïèse larvaire de la drosophile. Col est l’unique orthologue de EBF, un facteur impliqué dans la différenciation des lymphocytes B chez les mammifères. Nous avons montré que Col est indispensable à la différenciation des lamellocytes. Col est exprimé chez l’embryon, dans les cellules qui vont former l’organe hématopoïétique. Au cours de la vie larvaire, col reste exprimé dans un centre signalisateur de l’hématopoïèse. Nous proposons que le facteur Col confère la compétence à répondre à un signal informatif émis par les plasmatocytes suite à l’infection parasitaire. Dans notre modèle, ces cellules émettent alors un signal S2 vers les prohémocytes pour déclencher la différenciation des lamellocytes. Nous avons ensuite identifié le gène CG14225 qui code une protéine transmembranaire homologue du récepteur gp130 des mammifères. Notre analyse fait de ce gène un bon candidat pour coder le récepteur de S2. J’ai développé deux approches pour générer un mutant nul pour CG14225. La lignée mutante nous permettra de conclure sur l’implication de ce gène dans les processus hématopoïétiques de la drosophile
Drosophila have three blood cells (or hemocytes) types: plasmatocytes are professional phagocytes, crystal cells are involved in melanization reactions that accompanies immune defenses, and lamellocytes ensure parasites encapsulation. In a first project, we studied the transcriptional profiling of activities of distinct hemocyte populations and from naïve or infected larvae, using Affymetryx microarray. One outcome was the gain of new insights into the lamellocyte encapsulation process. A second compelling observation is that, after an immune challenge, Drosophila hemocytes produce a signal molecule that is essential to induce the immune reactions. The establishment of the transcriptional profiling of Drosophila hemocytes represents a useful tool for future studies on hemocyte functions. In my main research project, I investigated the role of Collier (Col) in the Drosophila larval hematopoiesis. Col is the unique Drosophila orthologue of the mammalian transactivator EBF, an important factor for B cell differentiation. We showed the critical requirement for Col activity in lamellocytes’ specification. Col is first expressed during embryogenesis, in the progenitors of the hematopoïetic organ. During larval stages, col is expressed in this organ in a signalling centre for hemaotopoiesis. We suggest that Col give the capacity to relay an instructive signal emitted by plasmatocytes upon their encounter with a parasite. In our model, these cells synthesise a signal S2 that orients precursors towards the lamellocyte fate. We then identified the gene CG14225, which encodes a transmembrane protein homologous of the mammalian gp130 receptor. Our first analysis revealed that CG14225 is a good candidate to encode the receptor for S2. I have developed two different strategies to generate a loss-of-function mutation for CG14225. The null mutant will enable us to conclude about this gene‘s implication in the Drosophila hematopoietic processes

Les érythrocytes (globules rouges, GR) transportent le dioxygène (via l’hémoglobine) des poumons aux tissus de l’organisme. Leur production est assurée par des cellules souches hématopoïétiques (CSH), garantes des cellules constituants le sang. Chez l’adulte, l’érythropoïèse (processus qui aboutit à la production d’érythrocytes) a lieu en continu dans la moelle osseuse pour produire au quotidien environ 1011 érythrocytes. C’est de loin le plus haut rendement de production cellulaire du corps humain. Ce processus est finement régulé par une balance prolifération versus différenciation et peut s’adapter aux besoins de l’organisme. Cependant, le moindre défaut de régulation peut aboutir progressivement à des désordres érythroïdes (anémies, polyglobulies, voire à des transformations leucémiques). Le gène CXXC5 (alias RINF, Retinoid-Inducible Nuclear Factor), a été découvert en 2009 comme une cible directe des rétinoïdes nécessaire à la granulopoïèse. En effet, des expériences d’invalidation par ARN interférence ont démontré que l’expression de ce facteur était essentielle à la différenciation granulocytaire terminale des cellules hématopoïétiques aussi bien normales (progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ cultivés en présence de G-CSF) que leucémiques (lignée NB4 traitée par l’ATRA, Acide Rétinoïque tout-trans). Ce gène est localisé en 5q31, une région fréquemment sujette à des délétions chromosomiques dans des hémopathies malignes. Il code un facteur chromatinien possédant un motif à doigt de Zinc de type CXXC, retrouvé conservé avec plusieurs modulateurs épigénétiques importants. Toutefois, la contribution fonctionnelle de RINF sur la maturation ou l’engagement des progéniteurs vers d’autres lignages hématopoïétiques, n’avait pas été déterminée. Mes travaux de thèse ont démontré l’implication de RINF dans l’érythropoïèse humaine par l’intermédiaire d’expériences de pertes et gains de fonction dans des progéniteurs hématopoïétiques CD34+ (de sang de cordon ombilical ou de moelle osseuse) cultivés en présence d’EPO. Nous avons identifié le mécanisme d’action moléculaire et démontré que SMAD7 (un gène codant un inhibiteur de la voie de signalisation du TGF-β) était une cible transcriptionnelle directe de RINF (mis en évidence par des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, cette cible a été validée sur des cellules primaires et dans deux lignées érythroleucémiques K562 et UT7). Nous avons également montré que ce mécanisme d’action est dépendant du TGF-β (par l’utilisation d’un inhibiteur du TGF-βRI sur des cellules primaires en culture). Ainsi, la perte d’expression du gène RINF/CXXC5 au cours de l’érythropoïèse sensibilise les érythroblastes au TGF-β et conduit à une production d’érythrocytes plus restreinte (et contribuerait ainsi in vivo à la cytopénie du lignage érythroïde). Enfin, la caractérisation phénotypique du modèle murin génétiquement invalidé pour le gène Rinf a été initiée. Mes travaux ont notamment mis en évidence une perte importante de viabilité et de fertilité des souris Rinf-/-. L’hématopoïèse murine a aussi été explorée. Les résultats préliminaires nous laissent penser que la régulation de Smad7 par le facteur RINF (mise en évidence dans l’érythropoïèse humaine) s’exerce aussi dans le tissu hématopoïétique murin. Ce facteur épigénétique pourrait jouer un rôle important en modulant (1) les capacités d’expansion et d’auto-renouvellement des progéniteurs hématopoïétiques, (2) leur sensibilité au TGF-β (via Smad7) et/ou (3) les processus d’hydroxyméthylation de l’ADN génomique
No abstract

Les hémopathies myéloïdes sont des maladies clonales de la cellule souche hématopoïétique. Récemment de nombreuses études ont démontré l'implication des facteurs épigénétiques dans l'apparition de ces maladies. En effet, le séquençage d'ADN de patients atteints de diverses hémopathies malignes a permis l'identification de mutations dans le gène TET2 (TET methylcytosïne dioxygenase 2). Cette enzyme convertit les 5-méthylcytosines en 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC). L'impact biologique de cette nouvelle base de l'ADN ainsi que la fonction des protéines TET sont encore mal connus. Les objectifs de ma thèse ont donc consisté à déterminer la ou les fonction(s) de TET2 au cours de l'hématopoïèse humaine et son implication dans la transformation maligne. Mes travaux ont confirmé, dans les cellules de patients atteints de NMP, que la mutation de TET2 induit une diminution du taux global de 5hmC génomique. Puis nous avons montré qu'une haploinsuffisance en TET2 dans des cellules CD34+ induisait un biais de différenciation vers le lignage myéloïde aux dépens des lignages lymphoïdes et érythrocytaires. Elle influence aussi les étapes terminales des trois lignages myéloïdes. Nous avons également démontré que l'inhibition de TET2 induit la surexpression de MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor}, TET2 est capable de se fixer au niveau de son site d'initiation de la transcription (TSS) et d'influencer sa transcription par recrutement d'EGR-1 et de la polymerase II activée. Enfin, l'haploinsuffisance de TET2 confère un avantage sélectif aux cellules CD34+ permettant une reconstitution supérieure du système hématopoïétique de souris immunodéficientes dans un modèle de xénogreffe
Myeloid malignancies are clonal disease of the hematopoietic stem cell develop following a skewed of the differentiation toward myeloid lineages associated with increased proliferation. Recently, many studies have demonstrated the involvement epigenetic factors in malignant transformation. Indeed, DNA sequencing of patients with diverse malignancies identified mutations in TET2 (TET methylcytosïne dioxygenase 2) gene. This gene encodes an enzyme that couverts 5-methylcytosines to 5-hydroxyméthylcytosines (5hmC). The biological impact of this new modification of DNA bases and the TET protein function during hematopoiesis is poorly understood. The objectives of my thesis were to determine the function(s) of TET2 in human hematopoiesis and involvement in malignant transformation. My results confirmed in the cells from MPN patients that TET2 mutation induces a decrease in the overall rate of 5hmC. Then we hâve shown that TET2 haploinsufficiency after infection of CD34+ using a specific shRNA induces differentiation skewed toward myeloid lineage. This haploinsufficiency also affects the terminal stages of myeloid three lineages. We also demonstrated that TET2 inhibition induces expression of several inflammatory cytokines such as MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor}. TET2 binds to it promoter regions and influence their transcription through the recruitment of EGR1 and active polymerase II. Finally, haploinsufficiency of TET2 induces a selective advantage of CD34+ cells for reconstitution of the hematopoietic System of highly immunodeficient mice. TET2 is involved in several steps of tumor transformation but these functions factor transcription remain poorly understood

La première partie de ma thèse porte sur l'identification de l'événement génétique causant une nouvelle macrothrombopénie à transmission autosomale récessive, associée à une tendance au saignement, un défaut de réorganisation du cytosquelette, de formation des proplaquettes et d'activation des plaquettes. Après le séquençage exomique, une mutation homozygote du gène PRKACG a été identifiée. Elle conduit à un défaut de la PKA sans entraîner sa dégradation. Une absence quasi complète de la filamine A, un des ces substrats, est observée dans les mégacaryoyctes (MKs) des patients. La surexpression de PRKACG WT permet la restauration de la formation des proplaquettes des patients ce qui confirme son implication dans la pathologie. Ii. La deuxième partie s'inscrit au sein d'une étude fonctionnelle des gènes cibles de RUNX1 dérégulés dans la thrombopénie FPD/AML et dans ce cadre, au rôle de pl 9Ink4d dans l'hématopoïèse. Nous avons observé qu'après induction d'un stress, la sortie de quiescence des CSH, le niveau de ROS et des cassures doubles brins de l'ADN dans un contexte KO sont augmentés et conduisent à l'apoptose. Ce phénomène implique le rôle intrinsèque de p19. Un rôle extrinsèque de p19 à travers la régulation du microenvironnement a également été montré. En plus de son rôle dans l'arrêt des endomitoses des MKs, p19 contrôle négativement la prolifération des progéniteurs MK. En son absence, l'amplification de MKs s'accentue avec l'âge et conduit à une splénomégalie et au développement de fibrose suite à l'augmentation de TGFI31. Cette dernière expliquerait la diminution de pool des HSCs en absence de p19 à l'état basal et au cours du vieillissement
. The first part of my thesis focuses on the identification of genetic event causing a new macrothrombopénie recessive autosomal associated with a bleeding tendency, defective cytoskeletal reorganization. And a defect in proplatelets formation and platelet functions. After exome sequencing, a homozygous mutation in PRKACG gene was identified. It leads to a defect of PKA without causing its degradation. An almost complete absence of the filamin A, one of the PKA substrates, was observed in patient megakaryocytes (MKs). Overexpression in patient progenitors of WT PRKACG allows the restoration of proplatelet formation confirming its involvement in the disease. Ii. The second part fats within a functional study of RUNX1 target gens deregulated in FPD/AML thrombocytopenia and in this context, the role of pl 9liik44 in hematopoiesis. We observed that alter stress induction, the exit of quiescent state of HSC, the ROS level and DNA double strand breaks are increased in a KO background. This phenomenon leading to cell death by apoptosis is linked to an intrinsic role of p19. Extrinsic role of p19 through regulation of the microenvironment has also been shown. In addition to its role in the arrest of MK endomitoses, p19 negatively controls the proliferation of MK progenitors. In the absence of p19, the MK amplification increases with age and leads to splenomegaly and development of fibrosis following the increase of TGFI31. This last one could explain a decrease in HSC pool in the absence of p19 at basal state and during aging

La drosophile possède un système immunitaire inné qui fait intervenir deux types de réponses, une réponse humorale et une réponse cellulaire. Cette dernière met en jeu des cellules spécialisées appelées hémocytes ou cellules " sanguines ". Les hémocytes sont formés au cours de deux vagues d'hématopoïèse lors du développement, une vague embryonnaire et une vague larvaire. Les mécanismes moléculaires contrôlant l'hématopoïèse embryonnaire sont relativement bien connus, alors que ceux contrôlant l'hématopoïèse larvaire restent à ce jour très succints. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les mécanismes moléculaires mis en jeu au cours de l'hématopoïèse larvaire qui a lieu dans un organe spécifique appelé la glande lymphatique. (1) J'ai participé à l'étude du rôle de la voie de signalisation JAK/STAT au cours de l'hématopoïèse larvaire, en caractérisant un nouveau gène appelé latran, qui agit comme un dominant négatif de la voie JAK/STAT. La fonction de latran est requise uniquement à la suite d'un challenge immun pour inactiver la voie JAK/STAT dans la glande lymphatique, mettant en évidence un nouveau mode de régulation pour cette voie de signalisation (Makki et al. , 2010 ; résultats partie I). (2) J'ai d'autre part entrepris une analyse globale de transcriptomes à partir d'ARNs isolés à partir de glandes lymphatiques disséquées dans divers contextes génétiques et physiologiques. J'ai pu identifier et caractériser de nouveaux gènes impliqués dans l'hématopoïèse larvaire (manuscript en préparation ; résultats partie II). (3) La comparaison des différents transcriptomes a suggéré un rôle de la voie Dpp/BMP dans le contrôle de l'hématopoïèse larvaire. Ceci m'a conduit à m'intéresser au rôle de cette voie de signalisation dans l'hématopoïèse larvaire. La " niche " est un microenvironnement qui contrôle la différenciation et l'autorenouvellement des cellules souches hématopoïétiques. Récemment, notre laboratoire a montré qu'il existait une niche hématopoïétique dans la glande lymphatique appelé Posterior Signaling Center (PSC). J'ai montré que chez la drosophile, la voie de signalisation Dpp jouait un rôle clé dans le contrôle de la taille de la niche via le contrôle de l'expression du protooncogène dmyc. L'activation localisée de la voie Dpp dans le PSC est sous le contrôle du facteur de transcription collier. En 2003, il avait été montré que la voie BMP contrôle la prolifération de la niche hématopoïétique chez la souris (Zhang et al. , 2003). Ainsi, de façon très intéressante, mes résultats mettent en évidence la possibilité d'une conservation de la Drosophile aux mammifères des cascades moléculaires contrôlant la prolifération des cellules de la niche hématopoïétique (manuscrit soumis ; résultats partie III). Une question posée suite à mes résultats est de définir l'implication de Myc, Ebf2, l'orthologue de Col et les voies de signalisation Wnt et BMP dans le contôle de la taille de la niche hématopoïétique chez les mammifères
The fruit fly Drosophila melanogaster owns an immune system which consists in two different responses: the response and the cellular response. The cellular response required specialized cell types called hemocytes or "blood" cells. Hemocytes are specified during hematopoiesis which takes place in two waves during Drosophila development. The first wave occurs in the embryo while the second takes place at larval stages in a specific organ called the lymph gland. Molecular mechanisms controlling embryonic hematopoiesis are well known whereas those involved at larval stages are not known. During my PhD, I studied molecular mechanisms occurring during larval hematopoiesis. (1) I participated to the study of the role of the JAK/STAT signaling pathway during larval hematopoiesis. We characterized a new gene, called latran, which acts as a negative regulator of the pathway. Latran is required after an immune challenge to inactivate the JAK/STAT pathway, reaviling a new way to regulate this pathway (Makki and al. , 2010). (2) Secondly, I performed a transcriptome analysisusing RNAs isolated from dissected lymph glands in genetics and physiologic contexts. I identified and characterized new genes involved in larval hematopoiesis (manuscript in preparation). (3) Comparison of the different transcriptomes suggested a role of the Dpp/BMP signaling pathway in larval hematopoiesis. The "niche" is a microenvironment which controls the differentiation and the self-renewal of hematopoietic stem cells. Recently, our group identified a hematopoietic niche in Drosophila lymph gland called the Posterior Signaling Center (PSC). My data indicate that the Dpp pathway plays a key role in the control of PSC size via the regulation of the protooncogene dmyc expression. The localized activation of the Dpp pathway in the PSC is under the control of the transcription factor Collier (manuscript submitted). In 2003, it was shown in mouse that BMP pathway controls the proliferation of osteoblasts, one major component of the hematopoietic niche. My results highlight the very interesting possibility of the conservation, between Drosophila and mammals, of molecular cascades that control cell proliferation in the hematopoietic domain. A very challenging issue relates to the control of osteoblast proliferation in the osteoblastic niche and the potential implication of myc and links between BMP, Ebf2 (ortholog of Collier and Wnt signalling pathways in this process

Des travaux menes au laboratoire ont montre que des cellules hematopoietiques murines multipotentes de la lignee fdcp-mix exprimant le recepteur au csf-1 humain (csf-1r) de maniere ectopique, ne proliferent que si ce dernier est exprime sous sa forme membranaire a la surface de cellules stromales. Selon un procede similaire, une strategie visant a isoler des lignees de cellules hematopoietiques non transformees a partir de la moelle osseuse de souris a ete elaboree. Nous avons choisi de realiser des souris transgeniques pour le gene c-fms humain, qui code pour le csf-1r, afin de disposer, par simple prelevement de moelle osseuse, d'une source permanente de cellules hematopoietiques exprimant le csf-1r humain. Deux approches ont ete utilisees : l'infection retrovirale de cellules es et la microinjection de l'adnc c-fms dans des ovocytes fecondes. La seconde approche nous a permis d'etablir une lignee de souris transgeniques c-fms humain. Il nous a alors ete possible, apres ensemencement de cellules medullaires de souris transgeniques c-fms humain sur des cellules stromales ms-5 exprimant la forme membranaire du csf-1 humain (cellules 2m-1), d'isoler une lignee hematopoietique, denommee 47. 10. Cette lignee 47. 10 est heterogene et composee de cellules myeloides exprimant divers marqueurs immunologiques de differenciation myelomonocytaire (cellules lin+). Des cellules blastiques lin - peuvent etre enrichies par tri cellulaire et sont capables de regenerer la population initiale une semaine apres reensemencement sur cellules 2m-1. Des progeniteurs a tres fort potentiel de proliferation, ont egalement ete detectes et leur maintien depend du systeme csf-1r/csf-1 membranaire. La lignee 47. 10 apparait donc composee de progeniteurs immatures capables de differenciation myelomonocytaire spontanee et dont l'autorenouvellement est dependant de la presentation du csf-1 humain par les cellules stromales 2m-1.

Le csf-1 est un facteur de proliferation et de differenciation des precurseurs monocytaires. Son recepteur transmembranaire, code par le proto-oncogene c-fms, possede une activite tyrosine kinase inductible. L'adnc du csf-1r humain a ete transfere par vecteur retroviral dans des lignees cellulaires hematopoietiques murines facteur-dependantes, non-repondeuses au csf-1. Nous avons recherche si le csf-1 devenait alors capable de stimuler la proliferation de ces cellules, et si cela les engageait dans la voie de la differenciation monocytaire. Nous avons demontre que l'expression du csf-1r humain dans diverses lignees myeloides murines il-3-dependantes leur conferait la capacite de proliferer a long terme en reponse au csf-1. Cet effet du csf-1 est correle a la capacite des cellules a proliferer en reponse au stem cell factor (scf), ce qui suggere une inter-relation de leurs voies de signalisation respectives. De plus, une lignee murine multipotente exprimant le csf-1r humain, cultivee en csf-1 pendant une longue periode, a conserve ses caracteristiques de cellules immatures, notamment sa capacite a se differencier en cellules erythroides matures. Enfin, nous avons montre que le csf-1r humain est fonctionnel dans des progeniteurs erythroides (bfu-e) de moelle osseuse murine, puisqu'il est capable de se substituer a l'il-3 comme facteur stimulant la croissance de ces progeniteurs in vitro. En conclusion, nous suggerons que le csf-1r humain favorise l'auto-renouvellement plutot que la differenciation dans une cellule hematopoietique murine immature. L'ensemble de ces resultats nous permet d'envisager l'isolement de lignees csf-1-dependante de cellules souches hematopoietiques de souris

Le gene tall code des facteurs de transcription de la famille bhlh (pour basic helix-loop-helix) qui jouent un role essentiel dans le developpement hematopoietique. L'expression detall est etroitement controlee dans les lignees hematopoietiques via l'usage de promoteurs alternatifs et des interactions complexes entre differents elements cis-regulateurs. Tall n'est pas exprime dans les cellules t normales mais on observe une expression constitutive du gene dans plus de 50% des cas de leucemies aigues lymphoblastiques t (lal-t). Des experiences de transgenese chez la souris ont clairement demontre que l'expression ectopique de tall dans la lignee t constitue un evenement oncogenique. Nous avons precedemment decrit des transcrits inities au milieu du gene tall associes exclusivement a certaines lal-t. Ces transcrits tronques codent des proteines tal1 depourvues du domaine de transactivation amino-terminal et dont le role a ce jour n'est pas encore etabli. Dans cette etude, nous avons caracterise le promoteur humain responsable de cette activite transcriptionnelle, niche dans une region de l'exon iv tres riche en gc. L'usage restrictif du promoteur iv est assure par un nouvel element silencer situe dans la 3 non traduite qui inhibe son activite dans les cellules erythroides et megacaryocytaires mais pas dans les cellules t. L'activite du silencer est mediee par la fixation d'un(des) facteur(s) specifique(s) de lignee sur un nouveau motif de reconnaissance proteique (appele ici tal-re). La mutation d'un seul residu dans le tal-re abolit a la fois la fixation du(des) represseur(s) specifique(s) et l'activite propre du silencer. Nos resultats montrent que le promoteur intragenique de tall est activement reprime dans les cellules des lignees erythro-megacaryocytaires et que l'absence de ce represseur dans les cellules de la lignee t est responsable de la production du transcrit tronque et des formes courtes des proteines tal1 dans les cellules t leucemiques.

Le facteur de transcription Aiolos, membre de la famille des protéines à doigts de zinc de type Ikaros, joue un rôle important dans la différenciation des lymphocytes B. Notre premier objectif a été de définir les mécanismes impliqués dans la régulation de la transcription du gène aiolos humain. Nous avons analysé la méthylation de l'îlot CpG d'Aiolos et les modifications de ses histones dans différentes lignées et cellules primaires. Nous avons observé une méthylation dense de l'ilot CpG, associée à des niveaux faibles de marques d'euchromatine (H3K4 di-/tri-méthylées, H3K9 acétylées) dans les lignées Aiolos négatives U937 et 1106mel, tandis que les cellules exprimant Aiolos présentaient les caractéristiques opposées. L'inhibition des Dnmt dans les U937 et 1106mel avec la 5-Aza-dC a entrainé une déméthylation de l'îlot CpG, associée à une augmentation des marques d'euchromatine et à une induction d'Aiolos. La répression d'Aiolos dans les monocytes et mélanocytes primaires a quant à elle été associée à une augmentation des H3K9me3 et H3K27me3, indépendamment de la méthylation de l'ADN. Notre deuxième objectif était d'étudier l'implication d'Aiolos dans les syndromes lymphoprolifératifs des cellules B matures chez l'homme (leucémie lymphoïde chronique et autres lymphomes B). Nous avons démontré que les cellules B, saines et tumorales, exprimaient majoritairement le variant hAio1 (80%) et nous avons observé pour la première fois une augmentation globale des transcrits Aiolos dans la LLC, indépendamment des marqueurs pronostiques (ZAP-70, statut mutationnel des IgVH). Cette augmentation, confirmée au niveau protéique, semble indépendante des niveaux d'H3K4me3 et H3K9ace.

L’hématopoïèse est un processus complexe et extrêmement régulé qui permet la production de l’ensemble des cellules sanguines à partir de cellules souches. Différents acteurs interviennent dans cette régulation et une altération de l’un ou plusieurs de ces régulateurs est souvent à l’origine de leucémies. L’un des acteurs majeurs de cette régulation est le complexe Core Binding Factor (CBF), particulièrement touché dans ces hémopathies. Ce facteur de transcription se compose de la sous-unité CBFβ et d’une sous unité variable RUNX, (habituellement RUNX1 dans l’hématopoïèse). Dans la leucémie aiguë myéloïde 4 à composante éosinophile (LAM4 Eo), le gène CBFβ est retrouvé fusionné au gène MYH11, entraînant la formation d’un gène chimérique codant pour l’oncoprotéine de fusion CBFβ–SMMHC. Cette version altérée du complexe CBF a pour caractéristique de séquestrer RUNX1 dans le cytoplasme et de déréguler l’expression des gènes cible du complexe via diverses mécanismes. Elle est en effet capable d’inhiber l’expression génique par le recrutement d’inhibiteurs transcriptionnels mais a également récemment été décrite comme liée au promoteur de gènes actifs. Ces dérégulations entraînent une altération de la différenciation et/ou une apoptose chez différents progéniteurs hématopoïétiques via divers mécanismes particulièrement étudiés chez la souris. Chez l’homme, les processus oncogéniques par lesquels CBFβ–SMMHC altère la différenciation et induit la leucémogénèse restent cependant peu décrits. Au moyen de deux modèles humains : une lignée ME-1 inductible pour l’inhibition de l’expression de l’oncoprotéine et des blastes leucémiques de patients atteints de LAM4 Eo dérivés de xénogreffes murines, nous avons découvert un nouveau composant cellulaire dérégulé par CBFβ–SMMHC ainsi qu’un nouveau partenaire d’interaction. En effet, dans un premier temps, ce travail révèle que l’oncoprotéine a des effets complexes sur la biogenèse des ribosomes aux niveaux génomique et post-transcriptionnel. Nous avons montré que CBFβ–SMMHC fixe le promoteur des gènes ribosomiques et active leur transcription. Nous avons également observé un niveau d’expression de ces gènes, supérieur dans les LAM dites de type CBFβ–SMMHC comparées aux autres sous-groupes de LAM. Dans la lignée ME-1 cette activation de la transcription ne se traduit cependant pas par une augmentation du contenu cellulaire en ribosomes, expliqué en partie par une maturation du précurseur des ARN ribosomiques moins efficiente en présence de l’oncoprotéine. Dans un second temps nous avons observé que CBFβ–SMMHC interagit directement avec la protéine Polycomb RING1B et BMI1 sous-unité du complexe de répression des gènes PRC1. L’inhibition de CBFβ–SMMHC entraînant une augmentation du niveau de fixation globale de RING1B sur l’ensemble du génome. Nous pensons que de cette altération du niveau de fixation de RING1B induite par CBFβ–SMMHC, découle la dérégulation de nombreux gènes impliqués dans diverses voies ou mécanismes critiques de l’hématopoïèse. Nous avons ainsi mis en lumière deux nouveaux mécanismes oncogéniques médiés par l’oncoprotéine CBFβ–SMMHC ouvrant de nouveaux horizons pour de potentielles cibles thérapeutiques
Haematopoiesis is a complex process allowing the production of all mature blood cells from stem cells. This process is highly regulated at the transcriptional level, and perturbation of normal transcriptional regulation may cause leukaemia. One of the major actors of this regulation is the Core Binding factor (CBF) complex, which is frequently subject to genetic alteration in leukaemia. This transcription factor consists of a constant CBFβ subunit and a variable RUNX subunit, usually RUNX1 in haematopoiesis. In acute myeloid leukemia 4 with eosinophilic component (AMLM4 Eo), the CBFβ gene is fused to the MYH11 gene, leading to the formation of a chimeric gene encoding the CBFβ–SMMHC oncoprotein. This altered version of the CBF complex sequesters RUNX1 into the cytoplasm, and deregulates wild type CBF target gene expression though diverse mechanisms. While CBFβ–SMMHC can inhibit gene expression by recruiting transcriptional inhibitors, it has also recently been described to bind and activate certain gene promoters. The mechanisms by which these deregulations lead to an alteration of the differentiation and/or an apoptosis of diverse hematopoietic progenitors is best characterised in murine models. In humans, the oncogenic processes by which CBFβ–SMMHC alters differentiation and induces leukaemogenesis remain unclear. Using two human cellular models, namely (i) an ME-1 cell line containing an inducible shRNA directed against the CBFβ- MYH11 fusion transcript and (ii) Patient-derived AML M4Eo murine xenografts, we describe two novel activities of CBFβ–SMMHC. Firstly, we discovered that the oncoprotein has complex effects on ribosome biogenesis at both the genomic and post-transcriptomic levels. We found that CBFβ–SMMHC binds ribosomal gene promoters and activates their transcription, which was corroborated by the observation of higher ribosomal gene expression in human AML M4Eo, compared with other AML subgroups. In the ME-1 cell line this transcriptional activation did not lead to the higher cellular ribosome content, which was explained in part by decreased efficiency of ribosomal RNA maturation in the presence of the oncoprotein. Secondly, we found that CBFβ–SMMHC interacts directly with RING1B and BMI1 protein subunit of the Polycomb gene repression complex PRC1. Depletion of CBFβ–SMMHC lead to increased global binding of RING1B to the genome, resulting in deregulation of numerous genes that are critical for normal haematopoietic differentiation. We have therefore highlighted two new oncogenic mechanisms mediated by the CBFβ–SMMHC oncoprotein, therefore opening new avenues to investigate potential therapeutic targets

Les souris transgéniques pour spi-1 présentent en 3 mois une anémie et une hépatosplénomégalie due à la prolifération de proérythroblastes bloqués dans leur différenciation (HS1) et dépendant de l'érythropoïétine (Epo) pour leur prolifération. Ensuite, les souris développent une seconde hépatosplénomégalie due à la prolifération de proérythroblastes (HS2) bloqués dans leur différenciation mais indépendant de l'Epo pour leur prolifération et tumorigènes in vivo. Nous montrons que deux mutations activatrices du récepteur au SCF Kit (KitD814Y et KitD818Y) sont retrouvées dans 85% des cellules leucémiques HS2 établies en lignées et in vivo dans les rates des animaux malades. Nous avons montré que l'acquisition de mutations activatrices du récepteur Kit est un événement oncogénique qui coopère avec la surexpression de Spi-1 pour transformer le proérythroblaste en une cellule maligne. Cette coopération apporte la preuve du principe de coopération d'oncogènes proposé pour les LAM humaines. La mutation KitD814Y rend l'activité kinase de la protéine insensible au Gleevec (Mesylate d'Imatinib), agent thérapeutique de référence dans le traitement des pathologies impliquant des formes mutées de Kit. Notre modèle permet l'étude de mutations du récepteur Kit retrouvées dans différentes pathologies humaines. Il a d'ores et déjà permis de considérer le Semaxinib ou SU5416, molécule initialement décrite comme un inhibiteur du récepteur au VEGF, comme une alternative thérapeutique pour les formes mutées de Kit résistantes au Gleevec. Enfin, ce travail rapporte une étude des interactions existant entre le récepteur à l'érythropoïétine et le récepteur Kit dans les cellules préleucémiques HS1
3 month after birth, Spi-1 transgenics mice present an anemia and a hepatoslenomegaly due to the proliferation of proerythroblastic cells (HS1) blocked in their erythroid differentiation process and dependent on erythropoietin (Epo) for their growth and survival. In a second step, leukemic proerythroblasts (HS2 cells) appear in mice. These HS2 cells are also blocked in their differentiation process but are independent on Epo for their growth and proliferation. Moreover, HS2 cells are able to induce tumors into nude mice. Here, we have shown that two kind of mutation of the SCF receptor Kit (KitD814Y and KitD818Y) are found in 85% of these leukemic cells. Mutated forms of Kit cooperate with Spi-1 overexpression to transform a proerythroblastic cell into a malignant one. The mutant form KitD814Y is unsensible to the inhibitory effect of Gleevec (Imatinib Mesylate) which is the compound used in the treatment of disease implicating some mutated form of Kit. Here we repport that Semaxinib (SU5416), intially described as a VEGF-Receptor inhibitor, may act as a therapeutic agent targeting oncogenic Kit mutants resistant to Gleevec. Finally, we have also studied the interactions between the Epo receptor and the SCF receptor in HS1 preleukemic cells. We have shown that these receptors are able to activate similars and disctincts signalling pathways which may implicate Lyn, a kinase which belong to the SrcKinase Family

L'interleukine-1 a, est une cytokine stimulant l'hématopoïèse mais dont les propriétés pro-inflammatoires limitent son utilisation thérapeutique lié à l'existence d'effets secondaires systémiques. Nous proposons une approche de délivrance locale médullaire d'IL-1 a, chez le macaque cynomolgus par le développement d'une méthode de transfert de gène selon deux stratégies vectorielles différentes. Le transfert ex vivo du gène de l'IL 1-a, par vecteur rétroviral dans les cellules stromales de moelle osseuse permet un accroissement de la production de GM-CSF et de G-CSF et de l'activité stimulant les colonies de progéniteurs myéloïdes du surnageant de culture. La ré-injection intraveineuse à l'animal de cellules génétiquement modifiées exprimant le gène de l'IL-1 a, et amplifiées ex vivo, entraîne une inflation modérée des lignées leucocytaire et plaquettaire. Une domiciliation médullaire est mise en évidence par la détection moléculaire du gène marqueur lacZ au niveau de la moelle osseuse. L'injection intramédullaire directe d'adénovirus recombinant exprimant l'IL 1-a, à l'animal sain entraîne une hyperleucocytose immédiate et une hyperplaquettose différée dont les mécanismes sont discutés. Après irradiation à doses sub-létales·(4 Gy), l'administration intramédullaire d'adénovirus recombinant IL-1 a permet une protection partielle des animaux liée à une diminution de la profondeur et de la durée de l'aplasie médullaire. La tolérance clinique des deux procédures est satisfaisante sans effet secondaire immédiat lié au vecteur rétroviral ou adénoviral ou à la production intramédullaire d'IL-1 a. En conclusion, la stratégie de délivrance locale intramédullaire d'un gène codant une cytokine possédant des effets secondaires systémiques, pourrait être mise en œuvre dans un but de stimulation de la myélopoïèse tout en limitant la toxicité générale de son administration par voie générale. Cette approche thérapeutique est discutée dans le cadre de la prise en charge des aplasies médullaires secondaires à une irradiation accidentelle
Pas de résumé en anglais

La thérapie génique associée à la transplantation de cellules médullaires est une approche médicale expérimentale, notamment développée pour des individus atteints de maladies génétiques du sang. Les premiers essais cliniques concluants furent basés sur l'utilisation de vecteurs y-rétroviraux mais leur insertion dans le génome a provoqué l'émergence de néoplasmes à une fréquence élevée. Depuis près de dix ans, les vecteurs lentiviraux sont testés chez l'Homme. En plus d'une meilleure efficacité de transduction des cellules souches hématopoïétiques, l'intégration de ces vecteurs, guidée par le facteur cellulaire LEDGF, se concentre dans des régions à plus faible risque oncogénique. Toutefois, des études réalisées in vitro et in vivo montrent qu'ils ne sont pas totalement dénués de risque génotoxique. Lors du premier essai clinique de thérapie génique lentivirale pour la p-thalassémie, l'insertion du vecteur dans le gène HMGA2 a conduit à la surexpression du gène et à l'expansion d'un clone hématopoïétique myéloïde. Nous avons entrepris d'éclaircir les mécanismes cellulaires affectés par l'expression du gène HMGA2. Les résultats mettent en évidence une expansion bégnine des cellules souches hématopoïétiques ainsi que des lymphocytes T de mémoire centrale. Afin de réduire le risque oncogénique associé à l'insertion des vecteurs lentiviraux, nous avons conçu des protéines capables de se substituer au facteur endogène LEDGF et susceptibles d'assurer l'intégration des vecteurs dans des régions du génome dénuées d'oncogènes. Nous avons également mis au point un protocole de transfert de gènes permettant l'exploitation de ces résultats dans les cellules souches hématopoïétiques
Gene therapy based on the transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells is an experimental medical approach for patients with genetic blood diseases when compatible allogeneic donors are not available. The first clinical successes were based on the use of y¬retroviral vectors, but vector insertions close to oncogenes have led to the development of neoplasms at a high frequency. Lentiviral vectors have been tested in human clinical trials for nearly ten years. In addition to better transduction efficiency in hematopoietic stem cells, their integration, guided by the cellular LEDGF protein, is less genotoxic than that of y-retroviral vectors. Nevertheless, in vitro and in vivo studies have demonstrated the existence of residual genotoxic potential. In the first lentiviral clinical trial for P-thalassemia, one patient had anintegration site within the HMGA2 gene, leading to overexpression of a truncated form of the protein and to clonai dominance restricted to the myeloid compartment. In order to clarify the cellular mechanisms affected by HMGA2, we have undertaken in vivo mouse studies. Our results indicate that HMGA2 induces a benign expansion of hematopoietic stem cells as well as of self-renewing central memory T cells. In order to reduce the risk associated with lentiviral vector integration, we have developed chimeric proteins, targeted to safe genomic harbors, which were able to substitute for the cellular LEDGF tethering protein. We also developed a gene transfer protocol allowing the translation of these results to hematopoietic stem cells

Le traitement de la leucémie aiguë promyélocytaire (LAM3) représente à plusieurs titres un modèle d'étude en cancérologie. La sensibilité de la LAM3 à l'acide rétinoïque tout¬trans (ATRA) a constitué le premier exemple de thérapeutique basée sur la différenciation cellulaire. Les effets biologiques de l'acide rétinoïque (AR) sont relayés par deux familles de protéines : les récepteurs nucléaires RAR et RXR et les protéines cytoplasmiques appelées CRABP. A partir de l'étude des mécanismes secondaires de résistance à cette thérapeutique, nous avons démontré que la CRABPII augmentait la transactivation de gènes cibles de l'AR. Nous avons identifié une nouvelle fonction de la CRABPII dans l'activation de la transcription. Elle interagit physiquement et fonctionnellement avec les récepteurs nucléaires de l'AR, RAR et RXR et fait ainsi partie du complexe RANC (Retinoic Acid-dependent Nuclear Complex). La CRABPII possède certaines caractéristiques spécifiques des co¬activateurs des récepteurs nucléaires. Cependant, elle présente des propriétés distinctes correspondant à l'absence de similitude structurale avec les co-activateurs identifiés, à la fixation du ligand et à son activité dépendante de sa localisation cellulaire. Nous avons caractérisé un domaine minimal d'interaction de la CRABPII avec les récepteurs nucléaires, appelé mNRID responsable de son activité co-activatrice. De plus, la CRABPII interagit avec le domaine DEF de RAR et le domaine DE de RXR, de façon indépendante de la partie " cœur " du domaine AF-2. Dans le cadre de nos travaux sur la différenciation myélo-monocytaire, nous avons étudié les interférences fonctionnelle et moléculaire des deux hormones impliquées dans cette voie de différenciation, l'acide rétinoïque et la Vitamine D3. A partir de cellules de lignées leucémiques et de cellules mononucléées de la moelle osseuse, nous avons décrit un effet inhibiteur de l'AR sur la voie de différenciation monocytaire et un effet inhibiteur de la VD3 sur la voie de différenciation granulocytaire. Ainsi, au niveau d'une cellule souche pluripotente, ces deux hormones agissent sur l'activation des gènes cibles impliqués dans leur voie de différenciation et sur l'inhibition des gènes cibles impliqués dans la voie contro¬latérale. Nous avons défini la CRABPII comme premier membre d'une nouvelle famille de co-activateur des récepteurs nucléaires aux rétinoïdes et nous avons déterminé l'effet modulateur de la Vitamine D3 sur la voie de signalisation des rétinoïdes dans l'hématopoïèse.

L'hématopoïèse est un processus complexe et dynamique qui conduit à la formation ainsi qu'au remplacement continu et régulé des cellules sanguines. Au cours de ce processus, une série de facteurs de transcription contrôle l'apparition, l'engagement et la différentiation des cellules souches dans un lignage déterminé. En particulier, chez les vertébrés, le facteur RUNX1/AML1 (pour Acute Myeloid Leukemia 1) est requis pour l'émergence des cellules souches hématopoïétiques ainsi que pour la différentiation des lignées myéloïdes et lymphoïdes. Chez l'homme, différentes altérations génétiques affectant AML1 sont liées au développement de pathologies du système hématopoïétique. Notamment, la translocation chromosomique t(8;21), codant la protéine de fusion AML1-ETO, est associée à 10-15 % des cas de leucémies myéloïde aiguës. Il a été décrit que AML1-ETO agit essentiellement en interférant avec la fonction de AML1 au cours de la différentiation hématopoïétique. Cependant, le mode d'action de cet oncogène reste mal compris et peu de facteurs modulant son activité sont connus. Récemment, de nombreux travaux ont mis en évidence que divers aspects du développement des cellules hématopoïétiques sont conservés de la Drosophile aux vertébrés. Notamment, les facteurs de transcription des familles RUNX et GATA, acteurs clefs de l'hématopoïèse chez les vertébrés, contrôlent aussi le développement des cellules sanguines chez la Drosophile. Tirant profit d'une part de la conservation phylogénétique des circuits géniques régulant l'hématopoïèse chez l'homme et la Drosophile et d'autre part des puissants outils d'analyses génétiques disponibles chez la Drosophile, nous avons cherché à utiliser la Drosophile comme système modèle pour étudier le mécanisme d'action de l'oncogène humain AML1-ETO et identifier des modulateurs de son activité. Nos résultats montrent que AML1-ETO exerce dans des cellules sanguines de la Drosophile dont la différentiation dépend de l'expression d'un facteur RUNX (Lozenge, LZ), des effets similaires à ceux observés dans des cellules leucémiques humaines portant la translocation t(8;21), à savoir : un blocage de la différenciation des cellules hématopoïétiques exprimant LZ et une augmentation de leur nombre. Grâce à la réalisation d'un crible génétique in vivo par interférence à l'ARN, nous avons identifié calpainB comme requis pour que AML1-ETO induise ces effets. De plus, nous avons pu montrer que l'inhibition des calpaines provoque la dégradation de AML1-ETO et diminue le potentiel clonogénique de cellules leucémiques humaines exprimant cette chimère. Ces travaux montrent que la Drosophile peut être utilisée comme modèle alternatif pour mieux comprendre la fonction de AML1-ETO et identifier de nouveaux facteurs régulant son activité
Hematopoiesis is a complex and dynamic process that leads to the formation and continuous blood cells replenishment. During this process, a series of transcription factors controls the appearance, commitment and differentiation of stem cells into specific lineages. In particular, in vertebrates, the factor RUNX1/AML1 (for Acute Myeloid Leukemia 1) is required for the emergence of hematopoietic stem cells and for the differentiation of both myeloid and lymphoid lineages. In humans, several genetic alterations affecting AML1 are linked to the development of different hemopathies. Notably, the chromosomal translocation t (8; 21), encoding the fusion protein AML1-ETO, is associated with 10-15% of cases of acute myeloid leukemia. It has been described that AML1-ETO acts essentially by interfering with AML1 function during hematopoietic differentiation. However, the mode of action of this oncogene remains poorly understood and few factors modulating its activity are known. Recently, numerous studies have shown that several aspects of hematopoietic development are conserved from Drosophila to vertebrates. Notably, transcription factors of RUNX and GATA families, which are key players in vertebrate's hematopoiesis, also control the development of blood cells in Drosophila. Taking advantage of the phylogenetic conservation of genetic circuitry regulating hematopoiesis between humans and Drosophila and of the powerful genetic tools available in Drosophila, we assessed whether Drosophila can provide a suitable model system to study the mechanism of action of the human oncogene AML1-ETO and to identify modulators of its activity. Our results show that AML1-ETO exerts in Drosophila blood cells expressing a RUNX factor (Lozenge, LZ) similar effects to those observed in human leukemic cells carrying the t(8;21), namely a differentiation blockage and an increased proliferation. In addition, by performing a large scale in vivo screen based on RNA interference, we identified calpainB as required for AML1-ETO-induced blood cell disorders in Drosophila. In addition, we showed that calpains inhibition resulted in AML1-ETO degradation and reduced the clonogenic potential of human leukemic cells expressing intrinsically this chimera. Our results establish that Drosophila can be used as an alternative model to better understand AML1-ETO function and to identify new factors regulating its activity

L'etude comparative de la degradation de la proteine cellulaire c-fos et de son homologue viral v-fosfbr par les calpaines a montre que la forme virale etait plus resistante a ces proteases. Cette resistance vis a vis de la degradation pourrait contribuer au pouvoir tumorigenique accru de la forme virale. Par ailleurs, l'expression des genes c-fos et v-fosfbr dans les cellules stomales d'une culture a long terme permet d'immortaliser ces cellules. Par contre, l'expression de ces deux genes dans la lignee stromale murine s17 induit la production d'un inhibiteur de la myelopoiese dans ces cellules

Les mécanismes moléculaires de l'hématopoïèse sont remarquablement conservés de la mouche aux mammifères. On peut notamment citer l'intervention des facteurs de transcription à domaine Runt (RUNX1 chez les mammifères et Lozenge (LZ) chez la drosophile) et de la famille GATA (GATA-1 et GATA-2 chez les mammifères et Serpent (SRP) chez la drosophile). De même, les protéines MLF (Myelodysplasia/myeloid Leukemia Factor) sont conservées de la mouche à l'Homme. Le gène hMLF1 a été identifié dans des cas de leucémies aiguës myéloïdes (LAM) et est exprimé dans les progéniteurs hématopoïétiques. Son expression en culture de cellules favorise la différenciation monocytaire et inhibe la différenciation érythroïde, suggérant que cette protéine joue un rôle au cours de l'hématopoïèse normale. Les protéines MLF ne présentent aucune homologie avec des protéines déjà caractérisées ou des domaines permettant de prédire leur fonction moléculaire. Cependant, différentes données vont dans le sens d'un rôle des protéines MLF dans la régulation du cycle cellulaire. DMLF a été identifiée indépendamment par différents laboratoires. DMLF est notamment impliquée dans la suppression de la toxicité causée par les protéines à expansion poly-glutamine et elle fait partie d'un réseau d'interactions avec des protéines régulant la transcription et interagit ainsi avec des facteurs de transcription tels que Hunchback et DREF. Enfin, nous avons identifié dMLF comme un interacteur de dSU(FU), un régulateur négatif de la voie de signalisation Hedgehog. Afin de caractériser la fonction et les rôles de dMLF chez Drosophila melanogaster, différentes approches ont été menées en parallèle au cours de cette thèse. L'étude du profil d'expression de dmlf au cours du développement, ainsi que la localisation subcellulaire de la protéine dans différents tissus montre que dMLF est une protéine ubiquitaire, apportée maternellement. Elle est en général nucléaire et est localisée au niveau de nombreux sites de l'euchromatine sur les chromosomes polytènes suggérant un rôle transcriptionnel. Cependant, sa localisation subcellulaire peut varier dans certaines conditions, indiquant qu'elle peut être régulée. Les mutants de perte de fonction de dmlf obtenus au cours de cette thèse, présentent une forte létalité embryonnaire sans arrêt développemental à un stade particulier ni défauts phénotypiques évidents. Certains adultes émergent tout de même, avec seulement des phénotypes subtils, tels que des veines ectopiques au niveau des ailes et des macrochaetes crochues localisées postérieurement aux ocelles. Il est donc à l'heure actuelle, difficile de proposer une hypothèse quant à la cause de la létalité chez ces mutants. De plus, dMLF est présente à un fort niveau dans une lignée de cellules hématopoïétiques de la drosophile, les cellules à cristaux qui sont responsables du processus de mélanisation en cas d'infections ou de cicatrisation. Une étude du rôle de dMLF au cours de l'hématopoïèse a alors été entreprise. Ainsi, dMLF n'est ni nécessaire ni suffisante à la formation des cellules à cristaux. En revanche, les mutants dmlf présentent une hyperplasie des glandes de la lymphe (organe hématopoïétique de la larve) associée à une augmentation de la prolifération dans cet organe, suggérant que dMLF limite la prolifération des cellules hématopoïétiques. Enfin, l'expression de dmlf est induite par le facteur de transcription LZ, qui est nécessaire à la formation des cellules à cristaux. Ces résultats indiquent que dmlf pourrait alors être une cible transcriptionnelle du complexe SRP/LZ, à l'instar d'autres gènes exprimés dans les cellules à cristaux. Il sera alors intéressant d'étudier si le complexe GATA/RUNX1 peut également réguler la transcription du gène MLF1 au cours de l'hématopoïèse chez les mammifères. En conclusion, on peut émettre l'hypothèse que les protéines MLF sont des inhibiteurs du cycle cellulaire, notamment au cours de l'hématopoïèse et que la fusion NPM-hMLF1 pourrait agir comme un dominant négatif sur hMLF1, conduisant ainsi à l'apparition de LAM. Le rôle des protéines MLF dans l'hématopoïèse semble être conservé de la mouche à l'Homme validant ainsi l'utilisation de la drosophile comme système modèle pour comprendre le rôle de ces protéines
Molecular mechanisms underlying hematopoiesis are remarkably conserved from flies to mammals. We can notably cite transcription factors with Runt domain (RUNX1 in mammals and Lozenge (LZ) in drosophila) and from GATA family (GATA-1 and GATA-2 in mammals and Serpent (SRP) in drosophila). Likewise, MLF proteins (Myelodysplasia/myeloid Leukaemia Factor) are conserved from fly to human. The hMLF1 gene is expressed in hematopoietic progenitors and alteration in this gene was identified in some cases of acute myeloid leukaemia (AML). Its expression in cultured cells faveurs monocytic differentiation and inhibits erythroid differentiation, suggesting that this protein is involved in normal hematopoiesis. MLF proteins do not share homology with already known proteins or do not contain domains permitting to predict their molecular function. Nonetheless, different data suggest a role for MLF proteins in cell cycle regulation. DMLF was identified independently by different laboratories. DMLF is notably involved in suppression of toxicity caused by proteins with poly-glutamine expansion. Moreover, it is part of an interaction network with transcriptional regulators and interacts with the transcription factors Hunchback and DREF. Lastly, we identified dMLF as an interactor of dSU(FU), a negative regulator of the Hedgehog signalling pathway. In an attempt to characterize dMLF roles and functions in Drosophila melanogaster, different approachs were undertaken during my thesis. The expression pattern study of dmlf during development and the protein subcellular localization in different tissues show that dMLF is an ubiquitous protein, maternally deposited. It is generally nuclear and is localized over a lot of sites on polytenic chromosomes suggesting that it plays transcriptional role. However, its subcellular localization changes in some circumstances, indicating a potential regulation of it. Dmlf loss of function mutants obtained during my thesis, show a strong embryonic lethality without developmental arrest at a particular stage nor obvious phenotypically defects. However, some adults emerge, with only subtle phenotypes, as ectopic veins on wings and bent macrochaetes posteriorly to ocelli. It is then actually difficult to propose an hypothesis for the cause of lethality in these mutants. Moreover, dMLF is present at high level in an hematopoietic cell lineage in drosophila, the crystal cells that are responsible of the melanization process during infections or wound heeling. A study of dMLF role during hematopoiesis was initiated and has shown that dMLF is not necessary nor sufficient for crystal cells formation. On the other hand, dmlf mutants show an hyperplasia of lymph glands (larva hematopoietic organ) with an increased proliferation in this organ, suggesting that dMLF limits hematopoietic cells proliferation. Lastly, dmlf expression is induced by the transcription factor LZ that is necessary for the crystal cells formation. These results suggest that dmlf could be a transcriptional target of the SRP/LZ complex, like other genes expressed in crystal cells. It would be interesting to search if the GATA/RUNX1 complex can regulate MLF1 gene transcription during hematopoiesis in mammals too. To conclude, we can suggest that MLF proteins are cell cycle inhibitors, notably during hematopoiesis and that the NPM-hMLF1 fusion can act as dominant negative over hMLF1, leading to AML formation. MLF proteins role in hematopoiesis seems to be conserved from fly to human, validating so drosophila as a model system to understand these protein's roles

La télomérase est une transcriptase inverse constituée d'une sous-unité catalytique hTERT, facteur limitant de l'activité télomérase, et d'une sous-unité ribonucléique hTR. Sa fonction primordiale est de compenser l'érosion des télomères lors des divisions cellulaires. Cette enzyme est fortement exprimée dans la plupart des cellules tumorales dont les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) ainsi que dans les cellules à renouvellement rapide comme les cellules de l'hématopoïèse. L'objectif de notre travail était d'étudier les voies de régulation de hTERT par les facteurs de croissance et les cytokines inhibitrices de l'hématopoïèse dans les cellules normales et leucémiques. Nous avons montré ainsi que le TNF-alpha inhibe dans des cellules de LAM, la transcription du gène hTERT en activant une voie céramide/JNK. Le GM-CSF permet de bloquer cette inhibition. De plus, le TNF-alpha régule négativement hTERT dans les progéniteurs hématopoïétiques normaux avec une diminution de la prolifération et une accélération de la différenciation. De même, au cours de l'érythropoïèse, l'EPO active transcriptionnellement hTERT via la voie JAK2/STAT5/c-myc. Le TGF-alpha active Smad3 et bloque cette activation. De plus, l'inhibition de hTERT par expression d'un dominant négatif a révélé que cette enzyme ne joue pas de rôle direct dans la prolifération induite par l'EPO ou la protection contre l'apoptose, mais permet l'expansion cellulaire à long terme. L'ensemble de nos résultats suggère que la télomérase peut être régulée par les cytokines de l'hématopoïèse, et que tout événement conduisant à la répression de l'expression de cette enzyme devrait induire de profondes altérations de l'hématopoïèse
Human telomerase is a ribonucleoprotein DNA polymerase comprising a catalytic protein subunit, telomerase reverse transcriptase (hTERT), which represents the rate-limiting state in telomerase activity, and a RNA template (hTR). The primary defined function of telomerase is to elongate telomere at the end of chromosomes and allow cells to bypass replicative senescence. Recently, other important cellular functions have been attributed to telomerase, including cell proliferation, genetic stability, protection against apoptosis and cell differentiation. HTERT is highly expressed in cancer cells including acute myeloid leukaemia (AML), and in proliferative tissues such as haematopoietic cells. Previous studies have indicated that telomerase activity is low in primitive haematopoietic cells, but increases upon stimulation with a mixture of cytokines in parallel to cell expansion, and then declines progressively during differentiation. These observations suggest a function for telomerase in haematopoiesis. The aim of our study was to assess hTERT regulation by HGF in normal and leukemic cells. In the first part of the study, we showed that in AML cells, treatment with TNF-α induces a decrease in hTERT gene transcription through a ceramide/JNK pathway, and that coincubation with GM-CSF can inhibit the effect of TNF-α. Interestingly, in normal haematopoietic progenitors, TNF-α also down-regulate hTERT gene expression alongside with a decrease in proliferation and an increase in differentiation. In the second part of the study, we investigated whether hTERT can be regulated during erythropoiesis, by erythropoietin (EPO) and TGF-β, wich are respectively the major positive and negative regulators of erythropoiesis. As a result, we demonstrated that EPO can stimulate hTERT transcription through a JAK2/STAT5/c-myc pathway, and that TGF-β counteracts this effect through Smad3 activation. Moreover, hTERT inhibition by ectopic expression of a dominant negative, reveals that EPO-mediated hTERT regulation serves neither for the proliferative response to EPO, nor to enhance cell survival, but can play a role in long term erythroid expansion. In conclusion, the compiled results produced clearly suggest that telomerase can be regulated by haematopoietic cytokines, and that all events leading to inhibition of hTERT expression may potentially alter haematopoiesis and lead to medullar insufficiency found in myelodysplastic syndromes for instance

La tumorigenèse est un processus complexe provoqué par l'accumulation d'altérations génétiques contribuant à la transformation progressive d'une cellule normale en une cellule cancéreuse. Les travaux menés en hématologie ont permis d'identifier de nombreux mécanismes de signalisation impliqués dans des processus cellulaires clés comme la prolifération, la différenciation et la survie cellulaire, particulièrement au niveau des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Parmi ces mécanismes, ceux déclenchés par les récepteurs à activité tyrosine kinase comme c-KIT ou FLT-3 ont été largement décrits au cours de ces dernières années. PTK7 est un récepteur tyrosine kinase de la famille des pseudokinases impliqué dans le développement embryonnaire qui joue un rôle important dans la polarité planaire. Le gène humain initialement cloné à partir de cellules de cancer du côlon code pour une protéine surexprimée dans de nombreuses tumeurs malignes. Nous avons confirmé sa surexpression dans les leucémies aiguës myéloïdes humaines et démontré que cet évènement représente un facteur indépendant de mauvais pronostic, en modulant la réponse aux agents cytotoxiques. Afin de mieux comprendre le rôle de PTK7 dans l'hématopoïèse physiologique, mon projet a consisté à générer une souris déficiente pour cette protéine et à étudier sa fonction dans la biologie des CSH. J'ai montré que les cellules déficientes pour PTK7 présentent un défaut de domiciliation vers la moelle osseuse. Ce travail contribue à mettre en évidence le rôle des protéines de la polarité dans le système hématopoïétique et, plus particulièrement, dans la biologie des CSH
Tumorigenesis is a multiple step process resulting from accumulation of genetic alterations leading to progressive transformation of normal cells into tumoral cells. Many signaling pathways have been described as key processes implicated in cell proliferation, cell differentiation and cell survival, in particular in mature hematotopoietic cells and hematopoietic stem cells (HSCs). Among these signaling pathways, those controlled by tyrosine kinase receptors such as c-KIT or FLT-3 have been extensively described during the last two decades.PTK7 is a pseudokinase receptor of the tyrosine kinase receptor family involved in embryonic development and described for its role in planar cell polarity. The human gene has been initially cloned from colon carcinoma cells and is frequently overexpressed in solid tumors. We described PTK7 overexpression in acute myeloid leukemia and demonstrated that it represents an independent poor prognosis factor acting as a modulator of the chemotherapeutic response.To better understand the physiological role of PTK7 in the hematopoietic system, my project consisted in the generation of a PTK7 deficient mouse model, and in the study of its function, in particular in HSC biology. My work demonstrated that PTK7 deficient HSCs have a general homing defect and poorly colonize hematopoietic organs including the bone marrow. This work contributes to a better understanding of PTK7 functions and, more generally, sheds light on the role of cell polarity proteins in the biology of HSCs

The main topic of my PhD studies was to investigate the role of sumoylation in the function of Ikaros transcription factor, that regulates the lymphocyte differentiation and function. Sumoylation is a posttranslational modification that can change the properties and regulate the function of a given protein. Up to now, one study addressed the question of how sumoylationmodulates Ikaros function. It shows that Ikaros is sumoylated in total primary thymocytes, and that this dynamic event modulates Ikaros' repressive function. It also describes two consensus sumoylation sites on Ikaros (K58 and K240), the sumoylation of which leads to loss of Ikaros repressive function in ectopic reporter gene assays. The final conclusion of the study is that sumoylation does not alter the nuclear localization of Ikaros but acts as a mechanism disrupting its participation in both histone deacetylase (HDAC) dependent and independent repression. My work shows the presence of additional sumoylation site on Ikaros and demonstrates that sumoylation does not significantly alter its interaction with the nucleosome remodelling and histone deacetylase (NURD) complex in T-cell lines. The functional analysis of sumo-deficientmutants indicates a complex role of this modification in regulating Ikaros' transcriptional properties. The identification of this new sumoylation site contributes to a better understanding of Ikaros' dual repressive - activating function and suggests the existence of conditional Ikaros' interacting partners. Moreover, the different Ikaros splicing isoforms would have differentsumoylation profiles, which would complete the knowledge of their functional diversity.

Le développement lymphocytaire B murin comprend 2 lignages, B1 et B2, différentiables par leurs progéniteurs, leurs fonctions et leurs localisations. Le facteur de transcription Ikaros, codé par le gène Ikzf1, a un rôle essentiel dans le développement lymphocytaire B2. Cependant, son rôle dans le développement lymphocytaire B1 reste à déterminer. Les altérations génétiques d’IKZF1 sont souvent associées aux leucémies aiguës lymphoblastiques B (LAL-B) de haut risque. Considérant que la lymphopoïèse s’établit par une vague fœtale, majoritairement de type B1, puis une vague adulte, majoritairement de type B2, les progéniteurs B1 pourraient-être à l’origine de certaines LAL-B pédiatriques.En utilisant un modèle murin avec une délétion conditionnelle du gène Ikzf1 dans les progéniteurs B (Ikzf1f/f Mb1-Cre), nous avons montré qu’Ikaros est nécessaire à la différenciation lymphocytaire B1 de manière équivalente à la différenciation B2. En utilisant l’oncogène BCR-ABL, nous avons également montré que les progéniteurs B1 peuvent être à l’origine de LAL-B chez les murins et qu’Ikaros a un rôle suppresseur de tumeur dans ces cellules.La poursuite de ce travail consistera à déterminer si des LAL-B de type B1 existent chez l’Homme
Murine B cell development comprises 2 main B cell lineages, B1 and B2, with distinct progenitors, functions and localization. The transcription factor Ikaros, encoded by the Ikzf1 gene, is a major regulator of lymphopoiesis and plays a crucial role in B2 cell differentiation. However, the role of Ikaros in B1 cell differentiation is unclear. Genetic alterations of IKZF1 are a hallmark of high-risk B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (BCP-ALL). Considering that lymphopoiesis takes place in distinct fetal and adult waves, with B1 cell lymphopoiesis predominating in fetuses and neonates and B2 cell progenitors predominating in adults, some pediatric BCP-ALL cases may originate from B1 cell progenitors. Using a mouse model with a conditional deletion of Ikzf1 in B cell progenitors (Ikzf1f/f Mb1-Cre), we show that Ikaros is critical for normal B1 cell differentiation, similarly to B2 cell differentiation. Using the BCR-ABL oncogene, we show that B1 progenitor can induce BCP-ALL in the murine model and that Ikaros has a tumor suppressor function in these cells. Further studies are required to determine if B1 cell progenitors can contribute to B1-like BCP-ALL in human

L'hématopoïèse est le processus de formation des cellules sanguines. Une régulation fine de ce processus permet d'assurer le remplacement de ces cellules et d'adapter leur production aux conditions environnementales. Chez la Drosophile, comme chez les vertébrés, l'hématopoïèse s'effectue en deux vagues. La première, qui prend place pendant l'embryogenèse, permet la genèse de cellules qui vont persister dans la circulation pendant tout le développement de l'animal jusqu'au stade adulte. La deuxième vague a lieu durant les stades larvaires dans un organe spécialisé, la glande lymphatique. Les cellules hématopoïétiques, nommées hémocytes, assurent des fonctions développementales et défensives. Les hémocytes sont donc des acteurs de l'immunité qui est uniquement de type innée chez cet insecte. Les deux principaux types d'hémocytes sont les plasmatocytes qui sont des macrophages et les cellules à cristaux qui participent à la mélanisation. Le troisième type cellulaire, les lamellocytes, sont uniquement générés durant la vie larvaire en réponse à certaines situations de stress telle que l'infection des larves par des oeufs de guêpe parasitoïde. Cette infection va induire une réponse immunitaire coordonnée impliquant à la fois les cellules sanguines circulantes et celles de la glande lymphatique pour aboutir à l'encapsulation du parasite par les lamellocytes. D'autre part, des mutations génétiques sont connues pour induire la différentiation massive de ces cellules en absence d'infection. La production inappropriée de ces cellules s'accompagne alors fréquemment d'une réaction d'encapsulation détectable par la formation d'amas d'hémocytes mélanisés, historiquement appelés " tumeurs mélanotiques ". Le contrôle de l'homéostasie du système hématopoïétique larvaire est donc primordial pour éviter l'apparition de tels désordres et d'assurer un système de défense efficace. L'objectif de mon travail de thèse était de découvrir de nouveaux gènes contrôlant l'homéostasie du système hématopoïétique et de mieux comprendre comment la différenciation des lamellocytes est régulée. Pour cela, Nous avons réalisé un crible génétique visant à découvrir de nouveaux gènes " suppresseurs de tumeurs mélanotiques" en exprimant spécifiquement dans les cellules sanguines des dsRNA permettant d'inhiber la fonction du gène ciblé par interférence à l'ARN. Nous avons criblé avec deux pilotes GAL4 spécifique des hémocytes plus de 1300 lignées UAS-dsRNA, ciblant ainsi environ 10% de l'ensemble gènes de la Drosophile codant pour des protéines. Après une phase de validation, cinquante-neuf gènes dont la perte de fonction conduit à la formation de capsules mélanotiques ont été identifiés, dont 55 n'avaient pas été associés au développement des cellules sanguines auparavant. La majorité des candidats se répartissent en 7 groupes fonctionnels (protéines chaperonnes, protéasome, trafic vésiculaire, protéines ribosomales, métabolisme des mitochondries, réparation de l'ADN, transcription). Grâce à l'utilisation de pilotes GAL4 ciblant différents tissus et sous population d'hémocytes avons montré que la formation de tumeur mélanotiques peut être provoquée par un défaut soit des hémocytes circulant soit de la glande lymphatique mais aussi par un défaut du corps gras, un acteur majeur de réponse immunitaire humorale. Cette stratégie couplée à une analyse de lignage nous a aussi permis de mettre en évidence que des plasmatocytes circulants d'origine embryonnaire peuvent se différencier en lamellocyte. Cette plasticité étonnante est notamment régulée par le cofacteur de transcription de la famille FOG U-shaped, qui est requis de manière cellulaire autonome pour empêcher la transformation des plasmatocytes en lamellocytes
In metazoans, the hematopoietic system plays a key role both in normal development and in defense of the organism. In Drosophila, the cellular immune response involves three types of blood cells: plasmatocytes, crystal cells and lamellocytes. This last cell type is barely present in healthy larvae, but its production is strongly induced upon wasp parasitization or in mutant contexts affecting larval blood cell homeostasis. Notably, several zygotic mutations leading to melanotic mass (or "tumor") formation in larvae have been associated to the deregulated differentiation of lamellocytes. To gain further insights into the gene regulatory network and the mechanisms controlling larval blood cell homeostasis, we conducted a tissue-specific loss of function screen using hemocyte-specific Gal4 drivers and UASdsRNA transgenic lines. By targeting around 10% of the Drosophila genes, this in vivo RNA interference screen allowed us to recover 59 melanotic tumor suppressor genes. In line with previous studies, we show that melanotic tumor formation is associated with the precocious differentiation of stem-cell like blood progenitors in the larval hematopoietic organ (the lymph gland) and the spurious differentiation of lamellocytes. We also find that melanotic tumor formation can be elicited by defects either in the fat body, the embryo-derived hemocytes or the lymph gland. In addition, we provide a definitive confirmation that lymph gland is not the only source of lamellocytes as embryo-derived plasmatocytes can differentiate into lamellocytes either upon wasp infection or upon loss of function of the Friend of GATA cofactor Ushaped. In this study, we identify 55 genes whose function had not been linked to blood cell development or function before in Drosophila. Moreover our analyses reveal an unanticipated plasticity of embryo-derived plasmatocytes, thereby shedding new light on blood cell lineage relationship, and pinpoint the Friend of GATA transcription cofactor U-shaped as a key regulator of the plasmatocyte to lamellocyte transformation

Les syndromes myéloprolifératifs (SMP) non leucémie myéloïde chronique (LMC) sont des hémopathies myéloïdes chroniques affectant la cellule souche hématopoïétique, pouvant évoluer en leucémie aigüe myéloïde (LAM). Les SMP non LMC incluent la polyglobulie de Vaquez (PV), la thrombocytémie essentielle (TE) et la myélofibrose (MF). La mutation JAK2V617F est retrouvée dans 97% des cas de PV et dans 50% des cas de TE et MF ; elle n'est pas indispensable à la physiopathologie des SMP car JAK2 n'est pas muté à 100%. Afin de progresser dans la compréhension de la physiopathologie des SMP et afin d'identifier de nouveaux marqueurs moléculaires pour le diagnostic, le suivi et le pronostic; nous avons étudié des échantillons de PV, TE, MF ainsi que des LAM post-SMP. Nous avons utilisé des approches moléculaires complémentaires: séquençage, hybridation génomique comparative (CGH-array) et profils d'expression génique. Nous avons identifié des mutations de gènes régulateurs de l'épigénétique (ASXL1, TET2, DNMT3A, SUZ12) et des gènes de la machinerie de l'épissage de l'ARN (SF3B1, SRSF2). Nous avons également identifié que les co-mutations des gènes JAK2 et ASXL1 étaient associées à un mauvais pronostic. Au sein du sous-type MF, nous avons identifié par CGH-array des aberrations du nombre de copies des gènes. Celles-ci contiennent plusieurs gènes candidats susceptibles de participer à la physiopathologie des MF et à l'évolution en LAM (délétion 20q, NF1, ETV6). Nos travaux sur la caractérisation moléculaire des SMP contribuent à l'évolution vers une classification moléculaire avec l'objectif d'une médecine de précision où chaque SMP sera traité en fonction de ses altérations
Myeloproliferative neoplasms (MPN) are chronic and clonal stem cell myeloid disorders, which can evolve to acute myeloid leukemia (AML). MPN non-chronic myeloid leukemia (CML) include Polycythemia Vera (PV), Essential Thrombocythemia (ET) and Myelofibrosis (MF) (primary or secondary to PV/ET). JAK2V617F mutation is found in 97% of PV and in around half of patients with ET or MF. Nevertheless, this mutation is not essential for MPN physiopathology, because in half of ET/MF cases, JAK2 is not mutated. To progress in the knowledge of MPN physiopathology and in particular of MF; and to find new molecular markers for MPN diagnosis, disease course, and prognosis, we studied several samples of PV, ET, MF and post-AML. We used gene sequencing, array-Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and gene expression analyses. We identified several mutations in genes implicated in Epigenetic regulation (ASXL1, TET2, DNMT3A, SUZ12) and in genes implicated in the RNA splicing machinery (SF3B1, SRSF2). We also found that JAK2 and ASXL1 co-mutation is associated with a poor prognosis. In MF, we found by aCGH several copy number aberrations that involve potential leukemogenic genes. Our gene expression data support the hypothesis that PV, ET and MF are a continuum of the same pathology. Our results on molecular characterization help establish a new molecular classification of MPNs with the objective personalized treatment where each MPN will be treated depending on the alterations present in the myeloid cell genome

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) avec dysplasie, identifiées par la classification OMS 2008 sous le nom de LAM-MRC (« AML with myelodysplasia-related changes »), sont actuellement définies par la présence de critères cliniques, cytologiques et cytogénétiques. Elles forment un groupe hétérogène tant sur le plan biologique que pronostique. Nous avons fait l'hypothèse que la caractérisation moléculaire des LAM-MRC pourrait permettre d'identifier des marqueurs spécifiques associés à ces pathologies et d'en distinguer différents sous-groupes. Nous avons mis en évidence que les LAM-MRC de risque cytogénétique intermédiaire présentent un profil mutationnel spécifique caractérisé par un taux élevé de mutation d'ASXL1 et une faible proportion de mutations de DNMT3A, NPM1 et FLT3. Les LAM-MRC de risque cytogénétique défavorable, essentiellement complexes et/ou monosomales, sont quant à elle associées aux mutations de TP53. Alors que les critères actuels des LAM-MRC ne permettent pas d'en stratifier le pronostic, nous avons montré que les mutations d'ASXL1 ou de TP53 sont des facteurs pronostics péjoratifs majeurs. Ainsi, une reclassification basée sur la présence de ces altérations moléculaires exclusives entre elles permettrait d'affiner le diagnostic et la stratification pronostique de ces maladies. Enfin, dans une stratégie de médecine personnalisée combinant le séquençage à haut débit à des tests de sensibilité thérapeutique in vitro, l'identification de tels marqueurs moléculaires permettraient de prédire la réponse aux traitements, de guider les choix thérapeutiques et d'orienter le développement de nouvelles drogues
Acute myeloid leukemia (AML) with myelodysplasia-related changes (AML-MRC) as reported in the WHO 2008 classification are defined by the presence of clinical, morphological and cytogenetic criteria. AML-MRCs are heterogeneous diseases with prognostic heterogeneity. We hypothesized that molecular characterization of AML-MRC could identify specific molecular markers and disease subgroups. We showed that AML-MRCs with intermediate cytogenetic risk harbor a specific mutational profile characterized by a high frequency of ASXL1 mutations and a low incidence of DNMT3A, NPM1 and FLT3 mutations. Unfavorable cytogenetic risk AML-MRCs, especially due to complex and/or monosomal karyotypes, are associated with TP53 mutations. While WHO criteria do not stratify the prognosis of AML-MRC patients, we showed that the mutations of ASXL1 or TP53 are major poor prognostic factors. The criteria defining AML-MRC do not identify distinct clinical and biological subgroups and do not predict outcome of patients with AML-MRC. In contrast, ASXL1 and TP53-mutated AML identify two distinct biological subgroups of AML-MRC with very poor outcome. This molecular characterization could be useful to redefine AML-MRC in a future classification aiming at merging biological characterization and specific prognostic value. Finally, we showed that a personalized treatment approach combining next generation sequencing and in vitro drug screening could be useful to predict therapeutic response and to guide both treatment choices and new targeted drug developments

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B (LAL-B) sont les cancers pédiatriques les plus fréquents. Dans ce type de leucémie, l'une des anomalies génétiques les plus fréquentes est la translocation t(12 ;21) aboutissant à la protéine de fusion ETV6-RUNX1. Cette pathologie est décrite comme un modèle à deux « hits ». Le premier, se produit in utero et génère la protéine de fusion. Le second, correspond à l’acquisition d’anomalies génétiques après la naissance. Ces réarrangements génomiques aberrants ont été décrits comme provenant d’une activité anormale de la recombinasse RAG. Notre travail a consisté dans un premier temps à compléter le modèle de leucémogénèse à plusieurs « hits ». En continuant notre étude des LAL B à translocation ETV6-RUNX1, nous nous sommes concentrés sur le rôle de RUNX1, gène dérégulé dans ce type de leucémie.L’ensemble de nos résultats confirme le rôle prépondérant de RUNX1 dans l’hématopoïèse et la leucémogenèse grâce à sa capacité à s’associer à des protéines aux fonctions différentes et grâce à son implication dans la transcription de gènes clé en hématologie. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et dans son rôle dans les hémopathies malignes
B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common pediatric cancer. In this type of leukemia, one of the most common genetic abnormalities is the ETV6-RUNX1 rearrangement. This malignancy is described as a two "hits" model. The first event occurs mainly in utero and generates the fusion gene ETV6-RUNX1. The second event consists in the acquisition of additional genetic abnormalities after birth. These aberrant genomic modifications have been described as resulting from abnormal activity of the RAG recombinase. Our work consisted initially in completing the leukemogenesis model. In continuing our study of ETV6-RUNX1 B-ALL, we focused on the role of RUNX1, an upregulated gene in this type of leukemia. All results confirm the predominant role of RUNX1 in hematopoiesis and leukemogenesis thanks to its ability to associate with proteins with different functions and its involvement in the transcription of key genes in hematology. Our results therefore open new perspectives in understanding the control of transcriptional activity of RUNX1 and its role in malignant hematology

Les leucémies aiguës lymphoblastiques T (LAL-T) sont caractérisées par la prolifération maligneincontrôlée de précurseurs lymphoïdes T bloqués dans la différenciation. Les stades d’arrêt dematuration observés dans les LAL-T reproduisent fidèlement les différentes étapes de la maturationthymique humaine. Ainsi nous avons montré que le facteur de transcription myéloïde CEBPA, expriméuniquement dans les précurseurs thymiques les plus immatures (ETP), est réprimé par un mécanismed’hyperméthylation dans les LAL-T à l’exception des formes les plus immatures. Il est aujourd’huicommunément admis que les LAL-T constituent une pathologie dite « multi-hits » où les oncogènesde type A affectent la différenciation tandis les oncogènes de type B sont impliqués dans la régulationdu cycle cellulaire, l’auto-renouvellement et/ou l’engagement dans la lignée T. La voie de signalisationde NOTCH, cruciale pour le développement lymphoïde T, est constitutivement activée par la survenuede mutations des gènes NOTCH1 et/ou FBXW7 (N/F) dans environ 60% des LAL-T. La valeurpronostique de ces mutations est controversée. Dans notre travail, nous avons montré que lesmutations de N/F sont plus fréquentes dans les LAL-T arrêtées à un stade de maturation cortical etconfèrent un bon pronostic qui semble toutefois dépendre de la chimiothérapie administrée. Grâce àl’étude de cette large cohorte de LAL-T nous avons pu également établir la fréquence de l’anomalieoncogénique CALM-AF10. Cette dernière est très fréquente dans les LAL-T qui se développent àpartir des ETP dites de mauvais pronostic. Nous avons montré que c’est la présence de l’anomalieCALM-AF10 qui confère le pronostic défavorable à ce sous-type de LAL-T. Contrairement à lalittérature nous n’avons pas retrouvé de valeur pronostique liée à la surexpression des gènes ERG etBAALC. L’étude des anomalies génétiques des LAL-T permet de mieux comprendre l’oncogénèse etd’identifier les anomalies avec une valeur pronostique. L’intérêt de ces travaux est d’apporter une aideaux cliniciens pour une stratification thérapeutique adaptée afin de donner les meilleures chances desurvie aux patients
T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) are lymphoid neoplasms characterized by theproliferation of malignant T lymphoblasts arrested at early stages of maturation. Maturation arrest in TALLmirrors normal lymphopoiesis. Thus we have shown that the myeloid transcription factor CEBPA,expressed only in the most immature thymic precursors (ETP), is commonly repressed byhypermethylation in T-ALL with the exception of the most immature subset. It is now widely acceptedthat T-ALL is a “multi-hits” disease where the type A oncogenes affect the differentiation while type Boncogenes are involved in cell cycle regulation, self-renewal and T-cell commitment. The Notchsignaling pathway, crucial for T cell development, is constitutively activated by the occurrence ofmutations in NOTCH1 and /or FBXW7 (N / F) genes in approximately 60% of T-ALL. The prognosticvalue of these mutations is controversial. In our study, we showed that N/F mutations are morefrequently observed in T-ALL arrested at a cortical stage of maturation and confer a good prognosiswhich seems to be influenced by the therapeutic regimen. In this large cohort of T-ALL we could alsodetermine the frequency of the CALM-AF10 oncogenic abnormality. The latter is very common in TALLdeveloped from ETP wich are of very poor prognosis. We have shown that this is the presence ofCALM-AF10 which confers the poor prognosis in this subtype of T-ALL. Contrary to the litterature wedid not find any prognostic value associated with the overexpression of ERG and BAALC genes. Thestudy of genetic abnormalities in T-ALL provides a better understanding of oncogenesis and identifyabnormalities with prognostic value. The interest of this work is to assist clinicians for an efficienttherapeutic stratification to overcome the poor outcome of T-ALL patients

Les leucémies lymphoïdes de type T et B sont des maladies malignes typiques des cellules sanguines. Afin d'approfondir nos connaissances concernant ces dernières, nous avons utilisé le rétrovirus murin Graffi. Pendant longtemps, on pensait que ce rétrovirus ne provoquait que l'apparition des leucémies myéloïdes pour constater, plus tard avec des outils moléculaires et plus perfectionnés, qu'il était capable d'induire différents types de leucémies (lymphoïdes et non lymphoïdes). Pour mieux caractériser les leucémies lymphoïdes et dans le but de trouver des gènes potentiellement impliqués dans ce type de leucémie ou dans le processus de l'hématopoïèse, la technique des microarrays a été retenue. Cette technique permet de mesurer en une seule expérience le niveau d'expression de plusieurs milliers de gènes. Les analyses ont porté sur 8 échantillons de souris constitués de 3 sous types de leucémies T (CD4+/CD8+, CD4+/CD8-, CD4-/CD8+), de 3 sous-types de leucémies B (CD45R low/CD19+, CD45R+/CD19+, CD45R+/CD19+/SCA1+) et d'un contrôle constitué de lymphocytes T (CD4+/CD8+) et B (CD45R+/CD19+) exprimant les marqueurs de surface exprimés à la surface de chacun des types de leucémies. Différentes approches d'analyse des résultats obtenus par les microarrays ont été appliquées de façon à distinguer ou à regrouper les gènes dont l'expression est altérée dans les différents types de leucémies analysées. Ceci nous a permis de sélectionner 56 gènes qui étaient soit spécifiques aux leucémies T, soit spécifiques aux leucémies B, soit communs à ces deux types. Parmi ces gènes se trouvent des gènes qui sont connus dans d'autres types de cancers mais qui n'ont pas encore été impliqués dans la leucémie. D'autres ne sont connus que dans les leucémies non lymphoïdes ou encore n'ont jamais été impliqués ni dans la tumorigénèse ni dans la leucémogénèse mais qui ont des fonctions physiologiques nécessaires au bon fonctionnement de l'organisme. Pour certains autres gènes, aucune information n'était disponible. L'application des microarrays a donc permis de créer une liste constituée des gènes potentiellement impliqués dans le développement de leucémies et qui pourraient servir de marqueurs diagnostiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Rétrovirus, Rétrovirus murin Graffi, Leucémies lymphoïdes, Leucémies non lymphoïdes, Cytométrie de flux, Tri cellulaire, Micropuces à ADN, Gènes différentiellement exprimés, Oncogènes.

La santé cardiovasculaire, la fonction immunitaire, l'hémostase et la réponse à d'autres maladies dépendent de l'abondance et des caractéristiques spécifiques des cellules sanguines. Au fil des années, un effort considérable a été fait pour trouver les variants génétiques, les gènes et les mécanismes de régulation impliqués dans la création de ces cellules. L'inactivation d'un allèle, appelée "perte de fonction" (LoF), est un type de variant codant que nous aimerions associer aux phénotypes sanguins. Comme ces mutations ne peuvent pas être artificiellement induites chez l'humain, pour des raisons éthiques évidentes, nous observons les occurences naturelles de ces pertes de fonction et espérons que la taille des cohortes sera suffisante pour trouver des associations statistiquement significatives. L'inactivation des deux allèles, appelée "knockout" (KO), peut avoir des conséquences plus fortes qu'une simple perte de fonction. Nous espérons également trouver des KO d'origine naturelle grâce à la taille des cohortes. La combinaison de deux variants LoF différents sur les deux allèles est appelée knockout hétérozygote composé. Nous nous intéressons également aux variants non codants qui affectent l'expression des gènes impliqués dans l'hématopoïèse. Certains de ces variants créent ou perturbent des sites de liaison des facteurs de transcription (TF), ces protéines qui se lient à des séquences d'ADN spécifiques et régulent l'expression des gènes. Les sites de liaison (TFBS) des facteurs de transcription se trouvent dans les promoteurs des gènes et dans les amplificateurs spécifiques au type cellulaire. Alors que certaines de ces mutations peuvent être bénignes ou même bénéfiques, la présence d'un LoF ou d'un KO peut être trop nuisible à la survie de l'individu. Les résultats de cette étude sont limités par le biais de survie. Comparée à une étude d'association pangénomique, cette étude se concentre sur un plus petit nombre de variants génétiques pour augmenter la puissance statistique et offrir une interprétation pour les résultats statistiquement significatifs. Le programme Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) recueille et garantit la qualité des 45 000 séquences du génome entier que nous avons utilisées dans cette étude, ainsi que les bilans sanguins correspondants. Grâce à ces données, nous avons pu trouver plusieurs associations connues et nouvelles entre des variants rares et des phénotypes sanguins.
Cardiovascular health, immune function, hemostasis and the response to other illnesses depend on the abundance and specific features of blood cells. Over the years, a considerable effort has been made to find which genetic variants, genes and regulatory mechanisms are involved in the creation of these cells. The inactivation of an allele, called a loss-of-function (LoF), is a type of coding variant we would like to associate with blood phenotypes. For obvious ethical reasons, these mutations cannot be artificially induced in human, so we fall back on natural occurrences and hope that large cohorts will provide enough samples to find statistically significant associations. The inactivation of both alleles, called a knockout (KO), may have stronger consequences than a simple loss-of-function. We also hope to find naturally occurring knockouts thanks to the size of a large cohort. The combination of two different LoF variants is called a compound heterozygote knockout. We are also interested in non-coding variants that affect the expression of genes that are involved in hematopoiesis. Some of these variants create or disrupt the binding sites of transcription factors (TF), the proteins that bind to specific DNA sequences and regulate gene expression. Transcription factors binding sites (TFBS) are found in gene promoters and cell type specific enhancers. While some of these mutations can be benign or even beneficial, the presence of a LoF or KO may be too detrimental for the individual to survive. The results of this study are limited by survival bias. Compared to a genome-wide association study, this study focuses on a smaller number of genetic variants to increase statistical power and give an interpretation to the statistically significant findings. The Trans-Omics for Precision Medicine (TOPMed) program collects and ensures the quality of the 45,000 whole-genome sequences we used in this study, as well as the corresponding complete blood counts. Thanks to this raw data, we were able to find several known and novel associations between rare variants and blood phenotypes.

La dérégulation de l'expression génétique est une base pathophysiologique de plusieurs maladies. On a utilisé le locus du gène β-globine humain comme modèle pour élucider le mécanisme de régulation de la transcription génétique et évaluer son expression génétique durant l'érythropoïèse. La famille des protéines 'E' est composée de facteurs de transcription qui possèdent plusieurs sites de liaison au sein de locus du gène β-globine, suggérant leur rôle potentiel dans la régulation de l’expression de ces gènes. Nous avons montré que les facteurs HEB, E2A et ETO2 interagissent d’une manière significative avec la région contrôle du Locus (LCR) et avec les promoteurs des gènes de la famille β-globine. Le recrutement de ces facteurs au locus est modifié lors de l'érythropoïèse dans les cellules souches hematopoitiques et les cellules erythroides de souris transgéniques pour le locus de la β-globine humain, ainsi que dans les cellules progénitrices hématopoïétiques humaines. De plus par cette étude, nous démontrons pour la première fois que le gène β-globine humain est dans une chromatine active et qu’il interagit avec des facteurs de transcriptions de type suppresseurs dans les cellules progénitrices lymphoïdes (voie de différentiation alternative). Cette étude a aussi été faite dans des souris ayant une génétique mutante caractérisée par l'absence des facteurs de transcription E2A ou HEB.
Aberrant gene expression is an underlying pathophysiology in many disease conditions. Lineage-specification and -commitment is tightly dependent on lineage-specific transcription factors to regulate the expression of target genes. Using human β-globin locus as a model, we investigated how the transcriptional machinery is set and regulated during erythropoiesis and how it impacts globally on gene expression. Class I bHLH proteins are important transcription factors whose binding sites are frequently clustered throughout the β-globin gene locus, suggesting their role in globin gene regulation. We showed that, in hematopoietic progenitor (HPC) and erythroid cells (EryC) of the transgenic mouse for human β-globin locus and human HPC cells (CD34+); HEB, E2A and ETO-2 significantly interact with locus control region (LCR) and promoters of globin genes, and their relative ratio is altered during erythropoiesis. For the first time, we found that in other hematopoietic lineages, human β-globin locus is in active chromatin and interacts with transcription factors involved in repression. Strikingly and consistent with the expression of globin genes, we characterized transcription factors involved in open chromatin configuration and basal level of globin gene expression in lymphoid progenitor cells. Further, with the genetic power of E2A and HEB knockout mice, our findings were clarified in mutant backgrounds.