Dissertations / Theses on the topic 'Hémoglobinopathie'

Une mutation de l'hemoglobine (hb) peut etre caracterisee par un systeme d'identification combinant six methodes electrophoretiques associees ou non a l'etude structurale du variant et a ses proprietes fonctionnelles et physicochimiques. De nombreux variants de l'hb ont ete ainsi identifies et caracterises dans les groupes ethniques nord africain (algerie, maroc et tunisie) et francais. L'analyse de la diversite de ces variants et l'etude de leur repartition geographique dans les contextes respectifs maghrebin et francais ont montre que les flux migratoires ont conduit a l'apparition dans ces regions de variants pouvant etre consideres comme des marqueurs anthropologiques (hb setif, hb j broussais). Cette etude a permis d'apprecier le polymorphisme important de l'hb dans ces populations. Certains variants en s'associant a la drepanocytose conduisent a l'apparition de syndromes drepanocytaires majeurs dont la pathologie est similaire a la drepanocytose. La reactivation du gene de globine par l'hydroxyuree est une approche therapeutique de cette hemoglobinopathie. En raison de l'heterogeneite de la reponse clinique et de l'induction de l'hbf des patients traites, nous avons mis en place une methodologie d'interet clinique qui a permis de determiner un parametre predictif : la sensibilite in vitro en presence d'hu des progeniteurs erythroides de patients drepanocytaires. Dans l'etude du mecanisme d'action de l'hu dans la reactivation du gene , nous avons montre dans la lignee erythroide une correlation sous l'effet de l'hu, entre la variation de l'expression du gene p21 et la variation de la synthese de l'hbf. Cette correlation peut expliquer l'effet hypomethylant de l'hu au niveau du gene de globine.

Depuis 1995,l'administration d'hydroxyurée(HU) aux patients drépanocitaires montre une capacité à réduire la fréquence des crises vaso-acclusives et à diminuer l'incidence des complications majeures de cette pathologie. Cependant son mécanisme d'action précis resteàélucider. Dans ce contexte ,notre objectif est d'étudier les effets de l'HU sur l'endothélium. Une étude ciblée sur des gènes candidats combinée à une approche de type analyse du transcriptome (sur 406 gènes humains) a démontré la capacité de l'HU sur les cellules endothéliales humaines en culture à:diminuer la synthèse d'un facteur vasoconstricteur(l'endotheline-1). Induire la sur-expression de facteurs pro-inflammatoires comme ICAM-1 IL-8 et la chemokine RANTES. L'utilisation d'hinibiteurs spécifiques a suggéré l'implication de la guanylate cyclase soluble et de la voie liée au NFkB dans la sur expression de RANTES et IL-8. D'autre part ,la modulation d'ICAM-1 (récepteur endothélial majeur des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum) par l'HU nous a suggéré de mener une étude dans le contexte de l'infection palustre. En effet, les zones endémiques de la malaria et de la drépanocytose étant largement chevauchantes,toute utilisation de l'HU dans cette zone doit faire l'objet d'étude préalables. Ainsi ,en utilisant un modèle murin de neuropaludisme,nous avons montré qu'un traitement à l'HU diminuait de façon significative la mortalité des animaux infectés. Ce travail démontre donc que l'endothélium est une cible de l'HU. Les résultats obtenus ouvrent également de nouvelles perspectives thérapeutiques au niveau du traitement de la drépanocytose et du paludisme
Since 1995,administration of hydroxyurea(HU) to sickle cell patients allows to reduce vaso occlusive crisis frequency and to decrease incidence of some of the main complications of that disease. However,its mechanism of action remains to be elucidade. In this contex,our goal is to study the effects of HU on the endothelium. A targeted study on candidates genes associated to an transcriptome analysis approach (on 406 human genes),has demonstrated the capacity of HU in human endothelial cells in culture to:decrease the synthesis of a vaconstrictor factor (endothelin-1),increase the expression of pro inflammatory factors such as ICAM-1,il-8 and the chemokine RANTES. Involvement of the soluble guanylate cyclase and the NFKB pathways in over expression of RANTES and IL-8 has been suggested by the use of specific inhibitors. In addition ,modulation of ICAM-1(a major endothelial receptor of Plasmodium Falciparum parasited red blood cells) by HU suggested the need of study in the field of paludous infection ,indeed, since sickle cell dasease (SCD) and malaria endemic areas are largely overlapping,any utilisation of that drug in this area should be preceded of safety studies. Hence,using an murine model of neuromalaria,we showed that administration of HU significantly recuded the mortality of treated mice. Finally ,this work demonstrates that endothelium is a target of HU. The above mentioned results also opens new therapeutic avenues in the field of SCD and malaria treatment

La forte prévalence des hémoglobinopathies, notamment l'HbAS, l'HbC et l'α-thalassémie dans des zones d'endémie palustre est considérée comme la conséquence de la protection qu'elles procurent contre les formes létales du paludisme. De nombreux mécanismes ont été évoqués pour expliquer cette protection, ne sont pas cohérentes avec toutes les observations épidémio-cliniques disponibles. La première partie de ces travaux de thèse a abordé la réduction de la cytoadhérence des globules rouges (GR) parasités comme mécanisme potentiel commun aux trois hémoglobinopathies. Pour explorer plus en profondeur ce mécanisme, nous avons mené une étude comparative des phénotypes de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum obtenus chez des patients HbAS et HbAC et HbAA. Cela avait pour but de déterminer si l'HbAS et l'HbAC jouaient un rôle dans la sélection et le maintien des souches virulentes de P. falciparum dans la nature. La deuxième partie de la thèse a concerné l'influence du trait drépanocytaire (HbAS) sur la déformabilité des GR non parasités d'une part et sur la rétention splénique des GR non parasités et parasités par les formes jeunes de P. falciparum d'autre part. Nous avons observé que l'adhésion des GR parasités aux cellules endothéliales micro-vasculaires humaines ainsi qu'aux monocytes était réduite avec les GR α-thalassémiques par rapport aux GR HbAA. Aucune différence statistiquement significative n’a en revanche été observée entre les profils de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum issus de sujets HbAA, HbAS ou HbAC. L’étude de la déformabilité des GR a montré que les GR HbAS sont légèrement mais significativement moins déformables que les GR HbAA. En revanche, les GR HbAS parasités par les jeunes parasites de P. falciparum (anneaux) n’étaient pas plus retenus que leurs homologues HbAA dans la rate humaine isolé perfusée ex vivo, ou en microsphiltration, quelles que soient les conditions d’oxygénation. Nous n’avons observé aucune différence au niveau du taux de falciformation entre les GR parasités et non parasités que ce soit avec les GR HbAS ou avec les GR HbSS. En conclusion, nous proposons que la réduction de la cythoadhérence et la rétention splénique des GR contenant les formes matures de P. falciparum constituent un mécanisme commun à la protection des sujets HbAS, HbC et α-thalassémiques contre le paludisme. Ces deux phénomènes interconnectés peuvent rendre compte de l’ensemble des observations épidemio-cliniques disponibles sur la protection conférée par ces hémoglobinopathies
The high prevalence of several inherited hemoglobin disorders, namely sickle cell trait (HbAS), HbAC and α-thalassemia, in malaria endemic areas is thought to be the consequence of their protective effects against malaria life-threatening manifestations. Numerous potential mechanisms have been proposed to explain this protective effect although many of them are not fully consistent with all available epidemiologic and clinical data. The first part of this thesis work explored the reduction of cytoadherence of infected RBC as a potential common mechanism for α-thalassemia-, HbAS- and HbAC-induced protection against malaria. To further explore this mechanism, and determine whether HbAS and HbAC select and maintain virulent P. falciparum parasite in nature, we compared the cytoadherence phenotype of P. falciparum isolates obtained from HbAS/HbAC and controls HbAA patients. The second part of the thesis work addressed the influence of HbAS on the deformability of uninfected RBC as well as the splenic retention of both uninfected RBCs and ring-infected RBCs. We observed a reduced adherence of α-thalassemic infected RBCs to human micro-vascular endothelial cells and monocytes compared to controls HbAA infected RBCs. The reduction was correlated to the number of non functional α- gene. Expression of PfEMP-1 on the surface of α- thalassemic infected RBCs was lower than on the surface of HbAA infected RBCs. There was no statistically significant difference between the cytoadherence of P. falciparum isolates obtained either from HbAS/HbAC or control HbAA malaria patients. The deformability of uninfected HbAS RBCs was slightly but significant lower than that of control uninfected HbAA RBCs. Retention rates of ring-infected HbAS and HbAA RBCs were similar either in human isolated spleen perfusion ex vivo and in microsphilters in vitro regardless of the oxygenation level. We did not observe any enhanced sickling of ring-infected RBCs compared to non infected RBCs, both in HbAS and HbSS samples. Based on these results along with available epidemiologic and previous experimental data, we propose a common malaria-protective mechanism of HbAS, HbAC and α-thalassemia whereby these hemoglobin disorders reduce the cytoadherence of mature P. falciparum-infected RBCs that stay in circulation where they are exposed to an enhanced splenic retention. These 2 mechanisms would act in conjunction to slower the rise of parasites loads in infected patients and protect them from sequestration-related complications of malaria

La reactivation de l'expression des genes de globines foetale est une voie therapeutique importante dans la recherche de traitements des hemoglobinopathies severes. Nous avons decrit et etudie un nouveau mutant naturel de l'expression de ces genes. L'interet de cette nouvelle phhf: la phhf tunisia, reside dans le niveau particulierement eleve de l'hb f produite. La mutation, l'insertion d'une cytidine reside dans une region riche en gc et siege de nombreuses autres mutations phhf. Nous avons demontre en souris transgenique que la mutation caracterisee etait bien responsable du phenotype. L'exploration fonctionnelle n'a pas reussit a eclaircir le mecanisme moleculaire. Des experiences en cours devront dire si le mecanisme est lie a des differences d'affinite de facteurs se fixant sur les boites sp-1/caccc ou bien si il fait intervenir une structure non conventionnelle de l'adn (adn h) que cette region est susceptible d'adopter. Nous avons decrit et caracterise une region dont les polymorphisme sont lies au haplotypes de restrictions du locus globines. Les etudes fonctionnelles de cette region montrent que la fixation d'un facteur majeur de la differenciation erythroide est modifiee (gata1) et modifie la fixation d'un groupe de facteurs ubiquistes se fixant sur le motif cre. Nous avons developpe un modele in vivo utilisant une lignee transformee humaine bipotente qui nous a permis d'apporte des elements montrant que cette region n'est pas polymorphisme neutre du cluster mais qu'elle peut reagir differement dans des environnements de differenciation erythroide ou myeloide

La beta thalassemie frequente dans le pourtour mediterraneen et la drepanocytose venue d'afrique noire representent a elles seules la plus grande partie des hemoglobines anormales en tunisie. Les autres variants, dont la frequence est faible, ont une repartition inegale selon les regions. Le nord-ouest de la tunisie est la region la plus touchee (10,1%), anciennement impaludee, elle se singularise par un tres haut degre de consanguinite (24 a 46%). Nous avons d'abord effectue une enquete epidemiologique sur un echantillonnage largement representatif de la population tunisienne (12780 prelevements). Dans un deuxieme temps, nous avons effectue une autre enquete epidemiologique dans la region du nord-ouest, chez des jeunes enfants (1481 echantillons), en meme temps, nous avons determine la prevalence des anemies qui pourraient masquer les alpha et beta thalassemies. Nous avons trouve qu'environ un enfant sur deux a une anemie (les carences martiales: 28,4%). Ces anemies sont en rapport avec des conditions socio-economiques pour la plupart mediocres. Outre les hemoglobines frequentes (hb, s, hb c), nous avons mis en evidence des cas d'hb o arab, d punjab, korle bu, camperdown, d iran, e et quelques mutants tres rares tels que l'hb montgomery: (alpha 48(cd6) leucinearginine), l'hb athens-georgia: (beta40 (c6) argininelysine), ainsi qu'un mutant inedit, l'hb tunis: (beta124(h2)prolineserine), muet a l'electrophorese

L'interferometrie ultrasonore (echo-cell) est une methodologie revolutionnaire permettant d'evaluer la vitesse de sedimentation des globules rouges qui depend de leur taille, de leur forme et de leur densite. En outre, cette methode est utile pour etudier le compactage et la densite du sediment de cellules obtenue avec une gravite unite. Quand les erythrocytes sont agreges (par du dextran 70 ou des proteines plasmatiques) ou agglutines (par des anticorps), leur vitesse de sedimentation est acceleree et leur compactage est modifie. La taille moyenne des agregats et des agglutinats formes peut etre determinee. La methode appliquee en immuno-hematologie, notamment dans le groupage sanguin montre une tres bonne sensibilite et fiabilite en permettant a la fois de mesurer et surtout de quantifier la cinetique d'agglutination et d'ameliorer les parametres classiques du groupage sanguin (temps d'incubation, temps de lecture, diminution de la quantite des reactifs utilises). Sous l'effet de la desoxygenation, les globules rouges normaux ne subissent pas de modification (sedimentation, compactage, densite, agregation, agglutination). Par contre, les globules rouges drepanocytaires desoxygenes, ont un compactage reduit ainsi qu'une diminution importante de leur agregabilite et de leur agglutinabilite, en raison de la deformation induite (falciformation). Cette methode peut etre utilisee pour determiner le pourcentage de cellules contenant des polymeres a une po2 (ou a saturation) definie. Elle est utile pour l'evaluation des globules rouges des patients drepanocytaires, en integrant toutes les variables modulant la polymerisation de l'hb s dans les cellules. La cinetique d'agregation et de la sedimentation des agregats devrait fournir un indice de distribution des cellules contenant des polymeres

La photodissociation de l’hémoglobine carboxy par laser nanoseconde a permis de mettre en évidence d’une part une phase de recombinaison géminée du ligand photo dissocié et d’autre part une phase de restructuration R → T de la protéine. L’objet de notre travail consiste à déterminer l’influence de la partie protéique de la molécule d’hémoglobine sur la réaction d’association fer-ligand. Pour cela nous avons entrepris une étude systématique des effets de modifications protéiques sur la photodissociation par laser nanoseconde de l’hémoglobine ligandée. Les résultats montrent que les perturbations du milieu protéiques engendrées par les substitutions d’acides aminés (Hb anormales, Hb fœtale) affectent la recombinaison géminée nanoseconde du CO. Les modifications physiques (force ionique, température, viscosité) et chimiques (fixations du PMB) perturbent également ce processus. Par contre, le pH et la concentration en DPG sont sans effet sur la cinétique de recombinaison nanoseconde Fe-CO. Par ailleurs, l’étude a permis de confirmer le caractère diffusionnel de la recombinaison géminée. Ce résultat met en évidence le rôle important des fluctuations structurales de l’hémoglobine sur le processus nanoseconde. Nous avons également montré que la dynamique de restructuration R → T de l’hémoglobine est généralement indépendante des perturbations physiologiques du milieu protéique (Hb anormales, Hb fœtale) mais dépend de la force ionique du milieu. Ce travail comporte aussi une étude de la photodissociation nanoseconde de l’hémoglobine oxy. On montre que la recombinaison nanoseconde de O₂ correspond également à une réaction à caractère diffusionnel. Les résultats révèlent la plus grande réactivité du fer envers l’O₂ qu’envers le CO
The photodissociation of carboxyhemoglobin by nanosecond laser irradiation is followed by geminate recombination of CO with the heme and an R → T change in conformation of the deoxy protein. In this work a systematic investigation of the influence of modifications on the protein part of hemoglobin on the ion-ligand association was undertaken using the method of nanosecond Laser photolysis associated with kinetic absorption spectroscopy. The study showed that substitution of amine acids (abnormal hemoglobins, fetal hemoglobin) modify the nanosecond geminate recombination of CO to the heme. Physical modifications (ionic strength, temperature, viscosity) and chemical modifications (PMB) also affect this process whereas pH or DPG concentration have no effect. In addition, the kinetics of the geminate recombination has confirmed the diffusion-like character of this process, thus emphasizing the role of structural fluctuations of the protein. This work also shows that the dynamics of the R → T restructuration are independent of amino-acid substitution but depends on the ionic strength. The nanosecond photodissociation of oxyhemoglobin was also studied. The results showed that nanosecond recombination of O₂ to the heme has the same kinetic behavior as that of CO. The results confirm the higher reactivity of the heme towards O₂ as compared to that towards CO

Lors d'essais cliniques réalisés chez des patients atteints de maladies génétiques du système hématopoïétique, il fut démontré que la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) modifiées par des vecteurs intégratifs apportait un bénéfice thérapeutique. Cependant parfois, des niveaux de correction limités n'apportèrent qu'un bénéfice restreint. Dans le but d'obtenir des niveaux élevés de CSH génétiquement modifiées sans augmenter le risque de mutagenèse insertionnelle de manière inconséquente, nous avons développé des systèmes de sélection des CSH, transduites par des vecteurs lentiviraux codant une protéine de résistance à un antibiotique ou protégeant l'ADN contre des agents alkylants. Nous avons introduit ces gènes dans un vecteur exprimant le gène [3-globine capable de corriger les cellules de patients 3-thalassémiques. L'évaluation in vitro du vecteur portant la protéine déalkylante nous suggéra que son expression était trop faible pour protéger efficacement les cellules transduites. Au contraire, le vecteur (3-globine portant le gène de résistance à la puromycine nous permit de sélectionner les cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées de manière optimale. Une fois sélectionnées ex vivo, les CSH étaient capables de reconstituer l'hématopoïèse humaine dans des souris immunodéficientes. Par ailleurs, les cellules érythroïdes pouvaient exprimer le gène 3-globine à un niveau compatible avec la correction du phénotype des cellules de patients 3-thalassémiques. Nous avons également introduit un gène suicide dans le vecteur, fonctionnel et capable d'éliminer les cellules hématopoïétiques génétiquement modifiées en cas de nécessité
Recent clinical trials conducted in patients with hematopoietic congenital diseases have demonstrated the potential benefit of autologous hematopoietic stem cell (HSC) transplantation combined with gene transfer using integrative lentiviral vectors. However, the level of transduced HSCs was occasionally non optimal, resulting in partial correction of the diseases. In order to achieve high level HSC modification without increasing the concurrent risk of insertional mutagenesis and oncogene activation, we decided to develop methods aimed at selecting genetically modified stem cells rather than increasing their initial transduction rate. In order to demonstrate the feasibility of our approach, drug resistance genes encoding an antibiotic resistant protein or a dealkylating agent were introduced, together with a suicide gene, in a clinical 3-globin lentiviral vector specifically designed for patients with hemoglobin disorders. In vitro evaluation made with a vector encoding the dealkylating protein suggested that its expression was too low to provide full protection to the cells. Lnterestingly, we demonstrated that the puromycin resistant gene allowed optimal ex vivo selection of genetically modified puromycin treated human HSC, provided that P-gp transporter inhibitors were added to the cells. Once selected, transduced HSC survived and were able to reconstitute human hematopoiesis in immunodeficient animal. Furthermore, the vector was able to express the therapeutic [3- globin gene for correction of hemoglobin disorders and to produce the suicide protein in vivo, for elimination of transduced stem cells if necessary

La protection contre le paludisme, conférée par les hémoglobinopathies (HbS et HbC), a été bien définie mais les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents restent méconnus. Un des mécanismes proposés, implique une présentation anormale des PfEMP1 à la surface des globules rouges infectés et a été associé à une diminution de l’expression de surface de ces PfEMP1 causant une diminution de l’adhérence des globules rouges parasités (GRp) aux cellules de l’endothélium vasculaire. Dans une étude de cohorte de femmes enceintes au Bénin, nous avons premièrement montré que le génotype HbAC et non HbAS était associé à un poids de naissance plus élevé des nouveau-nés parmi les femmes ayant souffert de paludisme gestationnel. PfEMP1-VAR2CSA est le ligand parasitaire principal interagissant avec la CSA placentaire et joue donc un rôle primordial dans le paludisme gestationnel. Nous avons étudié la capacité de parasites exprimant VAR2CSA et cultivés dans des globules rouges HbAS et HbAC à adhérer à la CSA.Bien que nous ayons observé une diminution de l’adhérence pour les GRp HbAS et HbAC en comparaison aux GRp HbAA, nous n’avons observé aucune différence d’expression de surface de VAR2CSA. Cela pourrait suggérer que VAR2CSA est moins fonctionnel dans les globules rouges de patients porteurs d’hémoglobinopathies. Nous avons ensuite initié une étude de transcriptome différentiel durant la croissance asexuée du parasite en globule rouge HbAA, HbAS et HbAC. Bien que très peu de gènes aient été trouvés différentiellement exprimés entre les parasites HbAA et les parasites HbAC, l’expression d’un grand nombre de gènes s’avère différente entre les parasites HbAS et HbAA
Malaria protection conferred by hemoglobinopathies (HbS or HbC hemoglobin polymorphisms) is well established, but the underlying molecular and cellular mechanisms remain largely unknown. One proposed protective mechanism involves the abnormal display of PfEMP1 on the surface of infected erythrocytes (IEs), and has been associated with reduced surface levels of PfEMP1 and knob density, in turn leading to decreased IEs binding to endothelial receptors.Adhesion of IEs to placental chondroitin sulfate A (CSA) is a central pathological process in placental (PM) malaria, predominantly operated by the VAR2CSA-PfEMP1. In a cohort study on pregnant women from Benin, we reported that HbAC but not HbAS maternal genotype is associated with higher new-born birthweight among women with PM. We examined the ability of VAR2CSA-expressing IEs grown in HbAS and HbAC erythrocytes to cytoadhere to CSA and assessed VAR2CSA surface expression. Although we observed a significant decrease of cytoadhesion, VAR2CSA surface expression was unchanged in the HbAS and HbAC erythrocytes. This suggested that VAR2CSA might be less functional in IEs derived from patients with hemoglobinopathies. We further initiated a differential transcriptomic analysis during asexual growth (10, 20, 30 and 40 h post-invasion) using high-throughput RNA sequencing of NF54 parasites expressing VAR2CSA grown in HbAA, HbAS or HbAC erythrocytes. Although, few genes were differentially transcribed between parasites grown in HbAA and HbAC red cells, a high number of genes were differentially transcribed between parasites grown in HbAA and HbAS. Overall, our study provides an important stepping-stone towards the understanding of protective mechanisms associated with hemoglobinopathies

La forte prévalence des hémoglobinopathies, notamment l'HbAS, l'HbC et l'α-thalassémie dans des zones d'endémie palustre est considérée comme la conséquence de la protection qu'elles procurent contre les formes létales du paludisme. De nombreux mécanismes ont été évoqués pour expliquer cette protection, ne sont pas cohérentes avec toutes les observations épidémio-cliniques disponibles. La première partie de ces travaux de thèse a abordé la réduction de la cytoadhérence des globules rouges (GR) parasités comme mécanisme potentiel commun aux trois hémoglobinopathies. Pour explorer plus en profondeur ce mécanisme, nous avons mené une étude comparative des phénotypes de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum obtenus chez des patients HbAS et HbAC et HbAA. Cela avait pour but de déterminer si l'HbAS et l'HbAC jouaient un rôle dans la sélection et le maintien des souches virulentes de P. falciparum dans la nature. La deuxième partie de la thèse a concerné l'influence du trait drépanocytaire (HbAS) sur la déformabilité des GR non parasités d'une part et sur la rétention splénique des GR non parasités et parasités par les formes jeunes de P. falciparum d'autre part. Nous avons observé que l'adhésion des GR parasités aux cellules endothéliales micro-vasculaires humaines ainsi qu'aux monocytes était réduite avec les GR α-thalassémiques par rapport aux GR HbAA. Aucune différence statistiquement significative n’a en revanche été observée entre les profils de cytoadhérence des isolats primaires de P. falciparum issus de sujets HbAA, HbAS ou HbAC. L’étude de la déformabilité des GR a montré que les GR HbAS sont légèrement mais significativement moins déformables que les GR HbAA. En revanche, les GR HbAS parasités par les jeunes parasites de P. falciparum (anneaux) n’étaient pas plus retenus que leurs homologues HbAA dans la rate humaine isolé perfusée ex vivo, ou en microsphiltration, quelles que soient les conditions d’oxygénation. Nous n’avons observé aucune différence au niveau du taux de falciformation entre les GR parasités et non parasités que ce soit avec les GR HbAS ou avec les GR HbSS. En conclusion, nous proposons que la réduction de la cythoadhérence et la rétention splénique des GR contenant les formes matures de P. falciparum constituent un mécanisme commun à la protection des sujets HbAS, HbC et α-thalassémiques contre le paludisme. Ces deux phénomènes interconnectés peuvent rendre compte de l’ensemble des observations épidemio-cliniques disponibles sur la protection conférée par ces hémoglobinopathies
The high prevalence of several inherited hemoglobin disorders, namely sickle cell trait (HbAS), HbAC and α-thalassemia, in malaria endemic areas is thought to be the consequence of their protective effects against malaria life-threatening manifestations. Numerous potential mechanisms have been proposed to explain this protective effect although many of them are not fully consistent with all available epidemiologic and clinical data. The first part of this thesis work explored the reduction of cytoadherence of infected RBC as a potential common mechanism for α-thalassemia-, HbAS- and HbAC-induced protection against malaria. To further explore this mechanism, and determine whether HbAS and HbAC select and maintain virulent P. falciparum parasite in nature, we compared the cytoadherence phenotype of P. falciparum isolates obtained from HbAS/HbAC and controls HbAA patients. The second part of the thesis work addressed the influence of HbAS on the deformability of uninfected RBC as well as the splenic retention of both uninfected RBCs and ring-infected RBCs. We observed a reduced adherence of α-thalassemic infected RBCs to human micro-vascular endothelial cells and monocytes compared to controls HbAA infected RBCs. The reduction was correlated to the number of non functional α- gene. Expression of PfEMP-1 on the surface of α- thalassemic infected RBCs was lower than on the surface of HbAA infected RBCs. There was no statistically significant difference between the cytoadherence of P. falciparum isolates obtained either from HbAS/HbAC or control HbAA malaria patients. The deformability of uninfected HbAS RBCs was slightly but significant lower than that of control uninfected HbAA RBCs. Retention rates of ring-infected HbAS and HbAA RBCs were similar either in human isolated spleen perfusion ex vivo and in microsphilters in vitro regardless of the oxygenation level. We did not observe any enhanced sickling of ring-infected RBCs compared to non infected RBCs, both in HbAS and HbSS samples. Based on these results along with available epidemiologic and previous experimental data, we propose a common malaria-protective mechanism of HbAS, HbAC and α-thalassemia whereby these hemoglobin disorders reduce the cytoadherence of mature P. falciparum-infected RBCs that stay in circulation where they are exposed to an enhanced splenic retention. These 2 mechanisms would act in conjunction to slower the rise of parasites loads in infected patients and protect them from sequestration-related complications of malaria

La drépanocytose est la maladie génétique la plus répandue au monde. Elle est caractérisée par la synthèse d’une hémoglobine anormale S (HbS) et associée à une altération des processus de distribution d’oxygène. Bien que ces anomalies puissent impacter le muscle strié squelettique, ce tissu n’a que très rarement été étudié. L’objectif de ce travail de thèse était de décrire les réponses fonctionnelles et énergétiques du muscle à l’exercice aigu, à l’ischémie – reperfusion et à l’entraînement en endurance dans un modèle de souris drépanocytaires, et d’identifier les mécanismes responsables des échanges de protons entre le muscle et le sang.Des souris drépanocytaires sédentaires et entraînées ont été soumises à des protocoles standardisés de repos – stimulation – récupération et repos – ischémie – reperfusion pendant lesquels la force et le métabolisme énergétique (par spectroscopie de résonance magnétique du phosphore 31) étaient mesurés. Des souris hétérozygotes pour le transporteur de monocarboxylate 1 (MCT1) ont également été soumises au protocole de stimulation. Des analyses in vitro du métabolisme énergétique et des mécanismes de régulation du pH ont également été réalisées.Ce travail a permis de démontrer que les réponses fonctionnelles et énergétiques à l’exercice musculaire et l’ischémie - reperfusion étaient affectées par la présence d’HbS et que l’entraînement en endurance permettait d’améliorer une partie de ces anomalies. Nous avons également observé que MCT1 était responsable de l’entrée des protons dans la cellule au repos, mais peu actif pendant l’exercice
Sickle cell disease (SCD) is the most frequent inherited disorder in the world. It is characterized by the synthesis of an abnormal hemoglobin S (HbS) and associated with impairments in oxygen delivery processes. If these abnormalities could impact skeletal muscle, this tissue has been rarely investigated. The aim of this thesis was to investigate muscular function and energetics in response to acute exercise, ischemia – reperfusion and endurance training in a mouse model of SCD, as well as identify the mechanisms involved in proton exchanges between muscle and blood.Sedentary and trained SCD mice were submitted to protocols of rest – stimulation – recovery and rest – ischemia – reperfusion during which muscular force and energetics (by magnetic resonance spectroscopy of phosphorus 31) were measured. Monocarboxylate transporter 1 (MCT1) haploinsufficient mice were also submitted to the stimulation protocol. Several muscles were sampled and permitted to analyze in vitro enzyme activities, content of proteins involved in pH regulation and some markers of oxidative stress.This thesis demonstrated that muscular function and energetics were impaired in SCD mice in response to both exercise and ischemia – reperfusion and that endurance training could alleviate some of these abnormalities, particularly acting on oxidative processes. We have also observed that MCT1 is involved in proton uptake by myocytes at rest, but its action is less important during exercise

Deux aspects de l'etude contemporaine de l'hemoglobine ont ete abordes: 1) nous avons mis au point une methode d'identification rapide et precise des differents variants deja decrits de l'hemoglobine par des techniques d'electrophoreses et de chromatographie liquide a haute performance. Nous avons pu mettre en evidence un comportement electrophoretique unique pour 92% des 206 variants testes. 2) nous avons cherche a miniaturiser les techniques d'etude de la structure primaire des proteines, l'hemoblogine etant alors consideree comme proteine modele. L'utilisation de la chromatographie liquide a haute performance, d'un microsequenceur proteique automatique et de la spectrometrie de masse ont ete des evenements clefs de l'evolution des techniques. Les quantites de materiel necessaire et les delais d'obtention d'un resultat par ces techniques utilisees isolement ou en association en font des outils d'analyse tout a faire competitifs en regard des techniques de biologie moleculaire

La drépanocytose est la maladie génétique la plus fréquente en France et dans le monde (500 naissances par an en France). Cette hémoglobinopathie est responsable de la production de l’hémoglobine S mutée (HbS) qui a la propriété de polymériser en condition désoxygénée, entrainant la falciformation des globules rouges (GRs). Les GRs des patients souffrant d’une drépanocytose SS sont moins déformables et plus fragiles que les GRs des sujets sains. La drépanocytose SS est caractérisée par la présence d’une anémie hémolytique chronique, des crises vaso occlusives douloureuses répétées ainsi que de multiples autres complications aiguës et chroniques dont les ulcères de jambe. La drépanocytose SS est autant une maladie du GR que des vaisseaux. L’hémolyse et l’inflammation chroniques, les anomalies de la coagulation et la diminution de la biodisponibilité du monoxyde d’azote (nitric oxide (NO) en anglais) sont à l’origine d’une dysfonction vasculaire importante. Toutefois, la survenue des ulcères de jambe est imprévisible et mal comprise. Nous avons fait l’hypothèse qu’il existait une atteinte microvasculaire plus prononcée chez les patients souffrants d’ulcère de jambe. L’étude drépanO2 a inclus 65 patients atteints de drépanocytose sans infection ou crise vaso occlusive dans les 3 derniers mois. L’objectif était d’étudier simultanément la fonction microcirculatoire de la peau (en mesurant la pression transcutanée en oxygène et la vasodilatation en réponse à la chaleur, au courant et à l’acetylcholine) et différents paramètres biologiques sanguins en fonction de la présence ou non d’ulcères de jambe. Nous avons également testé l’effet du plasma de patients avec et sans ulcères de jambe sur l’activation de cellules endothéliales. Parmi les 65 patients inclus, un ulcère de jambe actif a été diagnostiqué chez 9 patients (LU+). Tous les patients inclus avaient un traitement modifiant la maladie à l’exception d’un seul. Chez les 9 patients avec ulcère actif, nous avons observé une altération de la fonction microvasculaire de la peau, sans modification pour les marqueurs d’inflammation plasmatique ni l’activation des cellules endothéliales. Parmi ces 9 patients avec ulcères actifs, 8 ont pu ensuite être suivis sur une période de 8 mois, dont 6 ont cicatrisé en environ 4 mois. Nos résultats ont montré que la fonction microcirculatoire cutanée s’est améliorée après cicatrisation. Nos résultats montrent donc une atteinte fonctionnelle de la microcirculation cutanée moins prononcée après cicatrisation. L’exploration de l’inflammation, coagulation, hémolyse et rhéologie sanguine n’a pas mis en évidence de différences entre les patients avec ou sans ulcères de jambes. D’autres études sont nécessaires pour progresser sur les mécanismes sous-jacents de cette complication
Sickle cell disease is the first genetic disorder in France and worldwide (around one birth over 2,000 in USA). This hemoglobinopathy leads to the production of a mutated hemoglobin called hemoglobin S (HbS) which has the property to polymerize in deoxygenated condition, leading to red blood cell (RBC) sickling. Sickle cell anemia (SCA) patient RBCs are more fragile and less deformable than RBC from healthy individuals. Patients suffer from hemolytic anemia, repeated painful vaso-occlusive crisis and other acute and chronical complications including leg ulcers (LU). SCA is both a RBC disease and a vascular disease. Chronic hemolysis and inflammation, coagulation abnormalities and decrease nitric oxide bioavailability are the causes of significant vascular dysfunction. However, LU are an unpredictable debilitating complication of sickle cell anemia (SCA). We hypothesized that SCA patients with LU would be characterized by lower microvascular reactivity than patients without LU. The DrepanO2 study included 65 adults with SCA in steady-state condition. The aim was to investigate simultaneously the skin microcirculatory function (measuring transcutaneous oxygen pressure and heat, current and acetylcholine-related vasodilatation) and several blood biological parameters in SCA patients with and without LU. We also tested the effects of plasma from patients with and without LU on endothelial cells activation (HDMEC in 2D culture). Over the 65 patients included, LU has been diagnosed in 9 patients (LU+). All patients had disease-modifying treatment except one. We observed a reduction of the skin microcirculatory function in the 9 LU+ patients, with no change in plasma inflammation markers or endothelial cell activation. Among the 9 patients with active ulcers (LU+ group), 8 were subsequently followed over a period of 8 months, 6 of whom healed in approximately 4 months. Our results showed that skin microcirculatory function improved after healing. Our results therefore showed less pronounced functional impairment of cutaneous microcirculation after healing. Investigation of inflammation, coagulation, hemolysis, and blood rheology did not reveal any differences between patients with or without leg ulcers. Further studies are needed to better understand the underlying mechanisms of this complication

L'objectif de cette thèse était triple 1)- Etudier la fonction ventilatoire durant un exercice incrémental maximal et un exercice sous-maximal prolongé chez des sportifs porteurs de trait drépanocytaire (PTD) 2)- Etudier la performance de la fonction ventilatoire durant un exercice à charge constante chez des sujets ayant une β-thalassémie mineure, 3)- Evaluer l'adaptation physiologique durant un effort sous-maximal prolongé chez des sportifs atteints de drépanocytose hétérozygote. La première étude a montré que l'exercice incrémental maximal et l'exercice à charge constante induisent une fatigue spirométrique, de la force et de l'endurance des muscles respiratoires chez les sujets porteurs de trait drépanocytaire. L'exercice rectangulaire affecte de façon importante la force et l'endurance musculaire respiratoire que l'exercice triangulaire. La deuxième étude a montré par ailleurs, une altération de la performance de la fonction ventilatoire après la réalisation d'un exercice sous-maximal prolongé chez les sujets ayant une β-thalassémie mineure. Ainsi, une diminution importante de l'endurance des muscles respiratoires a été constatée chez ces individus pathologiques en réponse à l'exercice à charge constante par rapport aux sujets sains. Ces résultats confirment que les sujets ayant des hémoglobinopathies n'ont pas la capacité de maintenir des niveaux élevés de ventilation pendant un exercice physique intense. Ensuite, lors de la troisième étude, la détermination de la PMA a permis d'affirmer que la forme hétérozygote de la drépanocytose n'est pas un facteur limitant de l'aptitude physique aérobie maximale. L'adaptation à un effort sous-maximal, évaluée par la phase rapide est parfaitement normale chez les sujets ayant un trait drépanocytaire. Par contre, l'amplitude de la composante lente de VO2, plus élevée chez les PTD suggère que ces individus pathologiques se caractérisent par une mauvaise tolérance à l'effort. Cette élévation était corrélée avec l'HbO2 et HHb qui étaient stables durant l'effort. Cette stabilité confirme la génération du mécanisme de remodelage vasculaire chez les PTD en réponse à des problèmes hémorhéologiques produits par l'effort. Une augmentation précoce du RMS et une diminution linéaire de 25,63% de MPF corrélée avec HHb, ont été constatées durant l'effort chez les individus pathologiques par rapport aux sujets sans hémoglobinopathie, affirmant que la baisse de déformabilité des globules rouges dont sont signalés généralement les sujets porteurs de trait drépanocytaire bouleverse de façon accrue la microcirculation musculaire qui pourrait être responsable de la composante lente de VO2. Ces résultats montrent que les sujets ayant une hémoglobinopathie pourraient avoir une fonction ventilatoire moins performante durant un effort physique intense que les sujets sains. Également, ces individus pourraient avoir une fatigue musculaire périphérique plus importante que les sujets à hémoglobine normale et une oxygénation musculaire stable durant un exercice rectangulaire. Ils présentent une capacité aérobie et une tolérance à l'effort d'endurance, inférieures aux sujets sains durant un effort sous-maximal
The aim of this thesis was threefold 1)- To study the ventilatory function during a maximal incremental exercise and a prolonged submaximal exercise in athletes with sickle cell trait (SCT), 2)- To study the performance of the ventilatory function during a constant load exercise in subjects with minor β-thalassemia, 3)- Evaluate the physiological adaptation during prolonged submaximal exercise in athletes with heterozygous sickle cell disease. The first study showed that maximal incremental exercise and constant load exercise induce spirometric fatigue, and decreased strength and endurance of the respiratory muscles in subjects with sickle cell trait. Rectangular exercise significantly affects respiratory muscle strength and endurance than triangular exercise. The second study was showed an impairment of the performance of ventilatory function after performing prolonged submaximal exercise in subjects with minor β-thalassemia. Thus, a significant decrease in the endurance of the respiratory muscles was observed in these pathological individuals in response to constant load exercise compared to healthy subjects. These results confirm that hemoglobinopathic subjects do not have the ability to maintain high levels of ventilation during intense physical exercise. Then, in the third study, the determination of the MAP confirmed that the heterozygous form of sickle cell disease is not a limiting factor in maximal aerobic physical fitness. Adaptation to submaximal effort, assessed by the rapid phase, is perfectly normal in subjects with sickle cell trait. In contrast, the amplitude of the slow component of VO2, which is higher in SCT, suggests that these pathological individuals are characterized by weak tolerance to exercise. This rise was correlated with HbO2 and HHb which were satble during exercise. This stability confirms the generation of the vascular remodeling mechanism in SCT in response to hemorheological problems produced by exercise. An precocious increase in RMS and a 25.63% linear decrease in MPF correlated with HHb, were observed during exercise in pathologic individuals compared to subjects without hemoglobinopathy, affirming that the decrease in erythrocyte deformabilities which are generally reported in subjects with sickle cell trait disrupts the muscular microcirculation in an increased manner which could be responsible for the slow component of VO2. These results show that subjects with hemoglobinopathy could have a less efficient ventilatory function during intense physical exertion than healthy subjects. Also, these individuals might have more significant peripheral muscle fatigue than subjects with normal hemoglobin and stable muscle oxygenation during rectangular exercise. They exhibit aerobic capacity and tolerance to endurance effort inferior than healthy subjects during submaximal effort

Le Cambodge présente la particularité d’être endémique pour les quatre espèces de Plasmodium infectant l’Homme et d’avoir de fortes prévalences de maladies héréditaires du globule rouge. Des mutations touchant l’hémoglobine comme l’hémoglobine E et d’autres comme le déficit en G6PD (au travers notamment de la mutation G6PD Viangchan) y ont été identifiées. En 2001, la politique national de lutte contre le paludisme a été mise en place dans le Rattanakiri, province du Nord-est du Cambodge. Celle-ci repose sur l’utilisation des tests rapides pour le diagnostic des accès palustres en formant du personnel local, les « Village Malaria Worker », l’utilisation d’ACT et la distribution de moustiquaires imprégnées d’insecticide. Nos travaux reposent sur deux études transversales menées dans huit villages avant et après la mise en place du programme de lutte (respectivement en 2001 et 2002) dans cette région de forte endémie palustre. Ce travail de thèse a permis de mettre au point une méthode moléculaire rapide de diagnostic des infections plasmodiales utilisable à large échelle et d’établir les limites de la mise au point et de l’utilisation de puces à ADN dans ce type d’emploi. L’utilisation de cette nouvelle technique a permis de mieux caractériser les infections plasmodiales dans une zone reculée du Cambodge où elles sont beaucoup plus fréquentes que ne le laissait penser la microscopie ou qu’auraient pu l’objectiver les tests rapides. Notre travail a donc souligné la difficulté du défi que constitue l’élimination de ces infections plasmodiales par dépistage et traitement systématique, objectif actuellement affiché par les autorités sanitaires locales et internationales. Nos travaux de génotypage humain ont enfin permis de révéler des taux de prévalence élevés de portage de l’hémoglobine E et, dans certaines communautés, de mutations du gène de la G6PD. Cette dernière anomalie génétique peut poser un problème de sécurité au déploiement de l’utilisation de la primaquine sans dépistage des déficits en G6PD ou d’élimination des infections à P. Vivax faute d’utilisation de la primaquine
Cambodia has the characteristic of being an endemic country for all four Plasmodium species pathogenic for human, as well as being characterised by high prevalence of red blood cell illnesses. Hemoglobin mutation, as hemoglobin E, and other G6PD deficiencies (Viangchan mutation) have been identified. In 2001, a national health policy against malaria has been set up in the North-East province of Cambodia, Rattanakiri. Such polity consists of: staff training (known as Village Malaria Worker) on the use of diagnostic rapid tests for malaria, the use of ACT, and the distribution of impregnated bednets. Our work consists of two transversal studies conducted in eight villages in such high endemic region, before and after the health policy took place (2001 and 2002 respectively). The present thesis work allowed us to set up a rapid molecular methodology for the diagnosis of Plasmodium infection on large scale, and the evaluation of DNA microarray use limits in such application. The use of this new molecular technique gave us the opportunity of better characterise Plasmodium infections in this isolated area of Cambodia, where they are much more frequent than shown by microscopy or rapid test. Moreover, our work highlighted the challenge of infection reduction by mass screening and treatment policy in Cambodia. Finally, the human genotyping study highlighted the high prevalence of hemoglobin E and, in some communities, G6PD Viangchan mutation. This last genetic abnormality could represent a problem for primaquine use without concurrent screening for G6PD deficiency

La drépanocytose est la maladie héréditaire autosomique récessive la plus fréquente. Elle affecte la synthèse de l'hémoglobine suite à des mutations du gène de la chaîne de la ß-globine. La falciformation des globules rouges en situation d'hypoxie se manifeste par une anémie hémolytique chronique et une vaso-occlusion microvasculaire conduisant à des lésions d'ischémie-reperfusion et à des thromboses. Les taux sériques d'IL1ß, IL6, IL8, TNF-alpha et MCP1 sont significativement plus élevés chez ces patientes et participent à l'expression de molécules d'adhésion sur les cellules endothéliales. L'hémolyse chronique est responsable de la libération de l'hème et contribue à un état proinflammatoire et procoagulant qui provoque l'activation de l'endothélium. La grossesse est une situation à risque pour les femmes drépanocytaires en raison de la consommation accrue d'oxygène par la croissance fœtale et du contexte pro-inflammatoire qui augmente le risque de vaso-occlusion et d'hémolyse. La littérature a rapporté de nombreuses complications : prééclampsie, prématurité, retard de croissance intra-utérin et mort fœtale in utero. Très peu d'études sur la structure et les fonctions du placenta sont décrites dans la littérature. Le but de ce travail était de caractériser le développement et la fonction du placenta drépanocytaire et de rechercher une explication aux complications décrites. Dans notre cohorte de patientes drépanocytaires, nous avons constaté une dysmorphie placentaire majeure, malgré une croissance fœtale conservée. Notamment, nous avons observé un défaut d'arborisation des villosités choriales associé à une augmentation significative du ratio sFlt1 / PlGF à terme. L'analyse longitudinale des taux sériques de PlGF et de sFlt1 pendant la grossesse a confirmé cette altération de l'équilibre angiogénique. De plus, en réalisant des cultures cellulaires, nous avons constaté que les cytotrophoblastes des placentas drépanocytaires s'agrégeaient mais ne fusionnaient pas de manière efficace pour former le syncytiotrophoblaste et que la synthèse d'hCG associée était anormale. Cette morphologie anormale des placentas associée à une croissance fœtale conservée nous a amené à émettre l'hypothèse que des mécanismes compensatoires pourraient exister. L'environnement inflammatoire a été confirmé dans les sérums maternels par une augmentation significative de nombreuses cytokines. De plus, comme l'indolamine-2,3-dioxygénase (IDO1) est induite par les cytokines pro-inflammatoires et est impliquée dans la tolérance materno-fœtale, nous avons exploré la voie métabolique du tryptophane dans les placentas drépanocytaires. Comme attendu, le rapport kynurénine / tryptophane (activité IDO1) était significativement augmenté dans les sérums maternels et fœtaux. Par perfusion placentaire de tryptophane, nous avons mis en évidence une baisse du taux d'acide quinolinique dans le compartiment fœtal, expliquée par une forte diminution de l'activité placentaire de la Kynurénine 3-mono-oxygénase. L'impact sur la concentration en NAD, impliqué dans l'équilibre redox et dans de nombreuses voies métaboliques doit être évalué. L'analyse transcriptomique bioinformatique des gènes exprimés dans les cytotrophoblastes extraits des placentas drépanocytaires, a retrouvé des modifications du métabolisme lipidique : diminution de la Fatty acid transport protein 2, augmentation de la périlipine 2, associées à une diminution de la protéine MLN64 (transporteur du cholestérol mitochondrial). Ces résultats peuvent contribuer à expliquer la diminution des concentrations d'estradiol et de progestérone observées dans les sérums des patientes drépanocytaires à terme. Toutes ces données nous permettent d'avoir une meilleure connaissance de l'adaptation placentaire dans les grossesses drépanocytaires. Il est nécessaire de poursuivre les recherches pour établir un lien entre altération morphologique, dysfonctionnement placentaire et préservation de la croissance fœtale
Sickle cell disease (SCD) is the most common inherited autosomal recessive disease that affects hemoglobin synthesis, because of mutations in the ß-globin chain gene inherited from each parent. Signs and symptoms of SCD usually begin in early childhood. The sickling of red blood cells in deoxygenated conditions manifest in chronic hemolytic anemia and microvascular vaso-occlusion leading to ischemia-reperfusion injury and infarction. Serum levels of IL1ß, Il6, TNF-alpha, IL8, MCP1 have been shown to be significantly elevated in SCD patients and activate the expression of adhesion molecules on endothelial cells. Chronic hemolysis is responsible for heme release, that contributes to a proinflammatory and procoagulant state and activates endothelium. Pregnancy is a significant concern for women with SCD because of the increased consumption of oxygen by fetal growth and the proinflammatory context that raise the risk of vaso-occlusion and hemolysis. Literature reported numerous complications including preeclampsia, premature birth, intrauterine growth retardation, and intrauterine fetal death. Very few studies on placental structure and functions are described in the literature. The aim of this work was to characterize SCD placental development and function and to search explanation of described pregnancies impairment. We first reported in a large cohort of SCD pregnancies, that major placental dysmorphias were observed, although growth retardation was not frequent. Notably, we observed a relative lack of arborization in chorial villosities with a significant increase of the ratio sFlt1 / PlGF leading at term. Longitudinal PlGF and sFlt1 levels during pregnancy confirmed this impairment in the angiogenic balance of SCD pregnancies. Furthermore, using cultured cells from SCD placentas, we found that cytotrophoblast cells aggregate normally but fuse inefficiently to form syncytiotrophoblast with an abnormal hCG synthesis. This abnormal placenta morphology with normal fetal growth led us to hypothesize that some compensatory mechanisms could counterpart those abnormal placentas. The inflammatory environment was confirmed by a significant increase of IL1 ß, IL6, IL8, IL10, TNF-alpha, MCP1 in maternal sera. Moreover, because Indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO1) is induced by pro-inflammatory cytokines and is involved in feto-maternal tolerance, we explored tryptophan metabolic pathway in the placentas of pregnant women with SCD. As expected, Kynurenine/Tryptophan ratio (IDO1 activity) was significantly increased in maternal and fetal sera at term. By placental perfusion of tryptophan, we highlighted a drop in quinolinic acid fetal compartment concentration, explained by a strong decrease in Kynurenine 3-mono-oxygenase (KMO) activity. The impact on the NAD concentration, involved in redox balance and in numerous metabolic pathways have to be assessed. Finally, by bioinformatic transcriptomic analysis of cytotrophoblast gene expression, we have found modifications in lipid metabolism: a decrease in FATP2 (Fatty acid transport protein 2) and an increase in PLIN2 (perilipine 2) m RNA, associated to a decrease of MLN64 protein expression (mitochondrial cholesterol transporter). These results can contribute to explain the decrease in estradiol and progesterone concentrations observed in SCD maternal sera. All these datas allow us to have a better knowledge of placental adaptation to SCD pregnancies. Further investigation should be continued to link morphological impairment, placental dysfunction and fetal growth preservation

Le transfert d'un gène de globine dans les cellules souches hématopoïétiques autologues devrait bénéficier aux patients souffrant de b-thalassémie ou d drépanocytose, les maladies génétiques les plus répandues chez l'homme. La preuve de l'efficacité de ce traitement a été obtenue dans différents modèles murins d'hémoglobinopathies grâce à des vecteurs lentiviraux exprimant la b-globine humaine (vecteur LentiGlobin). Sur la voie d'un essai clinique, trois problèmes importants ont été étudiés. 1) La sécurité oncogénique du vecteur LentiGlobin auto-inactivant et pourvu d'insulateurs a été évaluée chez des souris létalement irradiées après greffe de cellules médullaires génétiquement modifiées par le vecteur. Les analyses biologiques et toxicologiques n'ont montré aucun effet oncogénique associé à la présence du vecteur. 2) La méyloablation est un obstacle majeur au traitement par thérapie génique, à grande échelle, des maladies héréditaires du système hématopoïétique. Effectivement, en absence de conditionnement myéloablatif ou d'avantage sélectif des cellules génétiquement modifiées, aucun bénéfice thérapeutique n'est observé. Deux systèmes dont l'objectif est d'amplifier spécifiquement les cellules érythroïdes génétiquement modifiées ont été testés. Le premier est basé sur une érythropoïétine ancrée à la surface cellulain et le deuxième utilise un récepteur tronqué de l'érythropoietine. Ce dernier conduit à l'amplification spécifique des cellules érythroïdes in vivo, sans prolifération cellulaire incontrôlée. 3) Une méthode permettant d'identifier et de quantifier la protéine thérapeutique a été développée pour corréler sa production à l'amélioration phénotypique
The transfer of a regulated b-globin gene in autologous haematopoietic stem cells should benefit to patients with b-thalassemia and sickle cell disease, the most common monogenic disorders in humans. Proof-of-principle for the efficacy of this treatment has been obtained in various mouse models of haemoglobinopathies using lentiviral vectors expressing thé human b-globin (lentiglobin). In this work, three main issues were studied on the way leading to the LentiGlobin clinical trial. 1) The oncogenic safety of a self-inactivating, insulator containing, LentiGlobin vector was assessed by transplanting LentiGlobin modified mouse bone marrow cells in lethally irradiated recipients. Biological and toxicological studies did not show any evidence of oncogenesis associated to the vector. 2) A major drawback to the large use of haematopoietic gene therapy for inherited disorders is the toxicity of myeloablation and the absence of therapeutic effect without this kind of conditioning (in absence of spontaneous selective advantage). Two Systems were designed in order to amplify specifically the genetically modified erythroid cells and to reduce the toxic myeloablative conditioning. One is based on a cell surface anchored erythropoietin and the other on a truncated erythropoietin receptor. Modified erythropoietin receptor led to specific erythroid amplification in vivo with no sign of uncontrolled cell proliferation. 3) Therapeutic haemoglobin identification and quantification is of major concern in order to establish a correlation between transgene expression and phenotypic improvement. A new method of high performance liquid chromatography was successfully design with this purpose

La thérapie génique par transplantation de cellules souches hématopoïétiques génétiquement modifiées peut constituer une thérapeutique idéale pour les patients atteints de maladies génétiques du système sanguin. Cette méthode a été validée entre autres par des résultats précliniques probants dans des modèles murins de β-thalassémie. Deux problèmes associés au transfert de gène dans les cellules hématopoïétiques doivent être résolus: 1) réduire le conditionnement toxique préalable à la greffe ; 2) évaluer et minimiser les risques de mutagenèse insertionnelle. En l'absence d'avantage sélectif spontané, aucun bénéfice thérapeutique ne peut être observé sans conditionnement myéloablatif. Deux systèmes, basés sur l'érythropoïétine et son récepteur, dont le but est d'amplifier in vivo les cellules érythroïdes génétiquement corrigées ont été évalués: une forme membranaire de l'érythropoïétine et un récepteur tronqué. Pour favoriser la prolifération des cellules érythroïdes modifiées, l'expression de l'érythropoïétine membranaire doit être réduite et se produire à un stade de différenciation érythroïde tardif. L'expression érythroïde du récepteur tronqué permet d'augmenter in fine la proportion de globules rouges corrigés. L'expansion est régulée de manière physiologique, par la concentration plasmatique d'Epo, elle-même corrélée au degré de correction de la pathologie. Ceci reflète un phénomène de contrôle physiologique de l'homéostasie hématopoïétique. La sécurité oncogénique d'un vecteur lentiviral (utilisé en clinique), produisant la chaîne p-globine thérapeutique, a été évaluée dans un modèle transgénique pour l'oncogène Spi1, prédisposé au développement d'érythroleucémies
Gene therapy by transplantation of genetically modified hematopoietic stem cells would be ideal for patients with genetic blood diseases. The foremost advantage of infusing genetically modified autologous cells is to avoid the risk of graft-versus-host disease and the host immunosuppression necessary for preventing graft rejection. However, cytoreductive regimens are still required to achieve significant chimerism with small number of modified hematopoietic stem cells. One question is how to establish a stable chimerism with maximal repopulation by genetically modified cells, with minimal or without conditioning, with low number of corrected stem cells and with no risk of abnormal cell proliferation. We tested in vivo the cell expansion ability of two Systems based on erythropoietin and its receptor, especially adapted for gene therapy of hemoglobinopathies. A truncated EpoR, together with the p-globin transgene, induced a 100-fold expansion of erythroid cells in a mouse model of p-thalassemia. The second objective was to develop an acquired preleukemic mouse model in order to evaluate the oncogenic risk of a viral LentiGlobin vector for gene therapy of erythroid cell disorders. A toxicology study was performed in irradiated mice transplanted with bone marrow cells from donor transgenic mice overexpressing Spi-1 (commonly activated oncogene in Friend-mediated mouse erythroleukemias), with hightened susceptibility towards this hematological malignancy. The LentiGlobin vectors did not increase the leukemic risk

Cette thèse est une contribution à trois champs distincts d’analyse anthropologique : d’une part le traitement social des maladies héréditaires ; d’autre part les usages sociaux des connaissances génétiques ; enfin, l’étude des systèmes de soins du monde arabe. Fondée sur une enquête ethnographique d’environ dix-huit mois au sultanat d’Oman (péninsule Arabique), elle aborde deux maladies héréditaires du sang, drépanocytose et bêta-thalassémie — nommées faqr al-dam, « l’indigence du sang » dans le pays. Pour ce faire, ce travail s’articule autour de la description de l’apparente disjonction entre une technicité telle que l’on peut l’attendre dans un pays doté d’une rente pétrolière, et les affres quotidiennes de l’expérience des malades et de leurs familles. Il s’agit d’étudier à des échelles sociales diverses (expérience de la maladie aussi bien que politiques de santé publique) des faits de santé impliquant des innovations médicales récentes (génétique) dans le Golfe, zone du globe d’ordinaire plus volontiers examinée pour ses soubresauts politiques et religieux. Cette recherche observe la société omanaise des années 2000 à travers le prisme de ces maladies héréditaires du sang, qui constituent une mise à l’épreuve du politique. Les objets d’étude que sont ces deux hémoglobinopathies permettent d’interroger la construction politique de la société et de commencer à démêler l’écheveau des liens entre les institutions, les identités et l’histoire
This thesis is a contribution to three different anthropological fields of analysis: social treatment of inherited disorders on one hand; social uses of genetic knowledge on the other hand; and finally the study of healthcare systems in the Arab world. Based on an eighteen-month ethnographic fieldwork in Oman (Arabian Peninsula), this PhD deals with two inherited blood disorders: sickle cell anemia and beta-thalassemia — named faqr al-dam, “indigence of the blood” in the country. The thesis broaches the description of the apparent disjunction between advanced technologies one can expect to find in an oil-producing country and the daily throes of patients and families experiences. The aim of this PhD is to study at various social scales (experience of illness as well as public health policy) recent medical innovations (genetics) in the Gulf, whereas this area is usually more examined for its political and religious upheavals. This work observes the contemporary Omani society through these inherited blood disorders which put to the test the country's political institutions. As anthropological objects, these two hemoglobinopathies allow to examine the political construction of social order as well as to begin to disentangle the links between institutions, identities and history

Le développement de stratégies thérapeutiques curatives pour les patients affectés de β-hémoglobinopathies, c’est à dire drépanocytose et β-thalassémies, fait face à une grande demande. En effet, un accès restreint à des donneurs compatibles limite l’unique thérapie définitive autorisée, la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH). Au cours de la première partie de cette thèse,nous avons optimisé une alternative thérapeutique,la transplantation autoloque de CSH corrigées par le biais de lentivirus (LV). Le développement de lentivirus exprimant la β-globine et l’amélioration des conditions de transduction des CSH a débouché sur de probants bénéfices cliniques pour les patients drépanocytaires et thalassémiques traités par cette approche dans le cadre d’essais cliniques récents. Malgré ces progrès majeurs,cette thérapie pourrait bénéficier d’améliorations. En effet,la correction de thalassémies majeures, dépendantes de transfusion, ainsi que de la drépanocytose requiert de forts niveaux d’expression du transgène. Le but de ce projet est de choisir un LV à titre élevé, capable de transduire une large portion de CSH et d’entraîner une forte expression du transgène dans des globules rouges (GR) dérivés de CSH. A cet effet, nous avons comparé différentes combinaisons d’éléments régulateurs afin de définir la cassette régulatrice minimale nécessaire pour l’obtention de forts niveaux d’expression de la β-globine. Nous avons construit 2 mini-LCRs contenant soit HS2 et HS3 (taille totale 2.6 kb) ou HS2, HS3 et HS4 (taille totale 3.7 kb) provenant du Locus Control Region (LCR). Ces cassettes ont été insérées dans les LV β-AS3 et β-AS3 HS4, respectivement, qui contrôlent l’expression d’une globine anti-falciformante, βAS3-globine.Premièrement, nous avons comparativement évalué l’efficacité de transduction des vecteurs β-AS3 et β-AS3 HS4 dans des cellules souches progéniteurs hématopoïétiques (CSPH) drépanocytaires et dans des CSH drépanocytaires. Le deuxième volet de cette étude a permis de déterminer l’expression de la βAS3-globine issue de ces deux constructions dans des GR dérivés de CSPH drépanocytaires, et d’évaluer l’efficacité du LV le plus efficace pour secourir le phénotype drépanocytaire.La seconde partie de cette thèse vise à développer une nouvelle stratégie thérapeutique par édition du génome pour réactiver l’hémoglobine fœtale (HbF). Cette approche s’appuie sur l’observation d’une meilleure évolution clinique des β-thalassémies et de la drépanocytose en présence de niveaux élevés d’HbF.Par l’utilisation de la technologie CRISPR/Cas9, nous avons invalidé les sites de liaisons de répresseurs transcriptionnels au niveau des promoteurs de la γ-globine pour réactiver l’expression de l’HbF dans des GR dérivés de CSPH drépanocytaires. La réactivation des gènes de γ-globine fœtale dans leur locus génomique endogène permet de s’affranchir des difficultés liées à l’expression relativement faible de transgène par copie de LV, principalement lié à la faible capacité des LV qui ne permet d’insérer que de courts fragments d’ADN du LCR, arrangés de manière non-physiologique. De plus,cette stratégie offre une approche potentiellement plus sûre comparée à une stratégie addition de gène basée sur l’usage de LV. Dans la drépanocytose, cette approche thérapeutique favorise l’expression de la γ-globine anti-falciformante aux dépens de la globine βS-globine mutée. Dans le cadre d’une approche comparative,nous avons évalué des cibles thérapeutiques connues et nouvelles au niveau des promoteurs de la γ-globine. A cet effet, plusieurs ARN guides (ARNg) ont été designés pour cibler 3 régions des promoteurs de la γ-globine, où des variants associés à des niveaux élevés d’HbF et/ou à des sites de liaison de répresseurs de l’HbF ont été décrits
Highly efficient curative therapeutic strategies are in great demand for patients affected by β-hemoglobinopathies, namely sickle cell disease (SCD) and β-thalassemia. Indeed, the poor access to compatible donors restrains the application of the only approved definitive therapy, the allogeneic hematopoietic stem cell (HSC) transplantation. In the first part of this thesis, we aimed at optimizing an established therapeutic alternative consisting in the autologous transplantation of lentivirus (LV)-corrected hematopoietic HSCs. The development of β-globin expressing LVs and the improvement of HSC transduction conditions have led to a clear clinical benefit for SCD and β-thalassemia patients treated with this approach in the frame of recent clinical trials. Despite these significant progresses, there is room for further improvement. Indeed, the correction of severe transfusion-dependent B-thalassemia and SCD patients requires high levels of transgene expression. The goal of this project was to select a high-titer LV able to transduce efficiently HSCs and to drive high levels of transgene expression in HSC-derived RBCs. To this purpose, we compared different combinations of regulatory elements, in order to define the minimal regulatory cassette needed for achieving high levels of globin expression in the frame of LVs. We constructed 2 mini-LCRs containing either HS2 and HS3 (total size 2.6 kb) or HS2, HS3 and HS4 (total size 3.7 kb) derived from the 16-kb Locus Control Region. These cassettes were inserted in the β-AS3 and β-AS3 HS4 LVs, respectively, driving the expression of an anti-sickling βAS3-globin transgene. First, we aimed at comparatively evaluate the transduction efficiency of β-AS3 and β-AS3 HS4 in SCD hematopoietic stem progenitor cells (HSPCs) and long term-repopulating HSCs. The second aim of the study was to assess β-AS3 and β-AS3 HS4 derived transgene expression in RBCs produced from SCD HSPCs, and to evaluate the efficacy of the best-performing LV in rescuing the SCD phenotype. The second part of this thesis aimed to develop a novel genome editing-based strategy to restore fetal γ-globin genes expression. This therapeutic approach stems from the observation that the clinical course of β-thalassemia and SCD is improved in the presence of elevated HbF levels. By using the innovative CRISPR/Cas9 technology, we aimed at disrupting repressors binding sites in the γ-globin promoters to reactivate HbF expression in SCD HSPCs-derived RBCs. Reactivating fetal γ-globin genes at their endogenous genomic locus can circumvent the difficulties associated with the relatively low LV-derived transgene expression per vector copy, likely because the low LV vector capacity allows the usage only of short DNA stretches from the LCR, arranged in a non-physiological manner. In addition, this strategy offers a potentially safer targeted approach compared to the LV-based gene addition. In SCD, this therapeutic approach can favor the anti-sickling γ-globin expression, at the expense of the mutated βS-globin, given the competition between the fetal and the adult genes for the interaction with the LCR. In a comparative approach, we intended to evaluate novel and known therapeutic targets in the γ-globin promoters. To this purpose, several gRNAs have been designed to target 3 regions of the γ-globin promoters, where variants associated with elevated HbF levels and/or binding sites for HbF repressors have been described. We aimed to screen these gRNAs in an adult erythroid cell line (HUDEP-2) and SCD HSPCs-derived RBCs in terms of HbF reactivation and correction of the patient phenotype, to select the best therapeutic target for an efficient and safe therapeutic approach for β-hemoglobinopathies

Mon travail de thèse est fondé sur la recherche d’une meilleure compréhension de la distribution géographique des polymorphismes érythrocytaires: antigènes de surface des systèmes de groupes sanguins érythrocytaires (GSE) et glucose-6-phosphate déshydrogénase (G6PD) intracellulaire. L’analyse sur 75 populations d’Asie des fréquences de l'allèle DI*01 du système de GSE Diego, des haplotypes C2-M217 et C2-M401 du chromosome Y, des coordonnées géographiques et des langues, a pu montrer la corrélation entre ces marqueurs. La répartition de DI*01 semble suivre les conquêtes mongoles, avec une expansion radiale depuis la Mongolie, porté par les nomades de langue Altaïque présentant C2-M217 et C2-M401. L'étude du gène G6PD chez 80 individus de Guyane Française de la communauté des Noirs Marrons originaire d’Afrique sub-Saharienne, aborde les relations santé-environnement. Les mutations du déficit en G6PD caractéristiques des variants sub-Sahariens ont été retrouvées chez une personne sur huit. La répartition du déficit était inconnue en Guyane Française et est encore mal connue en Amérique Latine et dans les Caraïbes, où sévit encore Plasmodium vivax dont le traitement nécessite l’utilisation de la primaquine pouvant entraîner une hémolyse sévère chez les individus G6PD-déficients. Mon troisième objectif a été de mettre en évidence l’influence de différents facteurs sur la répartition des polymorphismes de 10 systèmes de GSE étudiant 343 populations. Par des modélisations, les fréquences alléliques ont été confrontées aux données environnementales et culturelles. Enfin, une étude a été réalisée sur le système Duffy avec des analyses de détection de la sélection sur données SNP
My Ph.D. work is based on the search for a better understanding of the geographical distribution of red blood cell polymorphisms: the surface antigens of red cell blood group systems (BGS) and the intracellular glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The analysis on 75 Eurasian populations of frequencies of the DI*01 allele coding for Diego a antigen of Diego BGS, the C2-M217 and C2-M401 haplotypes of the Y chromosome, geographic coordinates and languages, has shown a correlation between these markers. The DI*01 distribution seems to follow the Mongol conquests, carried by the Altaic-speaking nomads possessing the C2-M217 and C2-M401 haplotypes with a radial expansion from Mongolia. The study of the G6PD gene in 80 individuals from French Guiana of the Noir Marron community originating from sub-Saharan Africa, addresses health-environment relations. Characteristic mutations of sub-Saharan variants of G6PD deficiency have occurred in one in eight people. The G6PD deficiency distribution was previously unknown in French Guiana and is still poorly known in Latin America and the Caribbean, where Plasmodium vivax still cracks down. Its treatment requires the use of primaquine which may cause severe haemolysis in G6PD-deficient individuals. My third objective was to highlight the influence of different factors on the distribution of polymorphisms of 10 BGS studying 343 populations. Through model adjustments, allelic frequencies have been confronted to environmental and cultural data. Finally, a study has been also conducted on the Duffy BGS by analyses of detection of natural selection on SNP data