Dissertations / Theses on the topic 'Hémolysat'

Des immunoadsorbeurs ont été développés à partir de disques CIM monolithiques pour l'analyse de biomarqueurs impliqués dans des maladies cardio-vasculaires. Les colonnes développées ont permis d'isoler sélectivement la myoglobine et le NT-proBNP du sérum humain. Les colonnes anti-NT-proBNP ont permis l'isolation quantitative du NT-proBNP (R2=0,998) à des concentrations jusqu'à 750 amol/μL de sérum.
Six matériaux à accès restreints ont été évalués en fonction de leur aptitude à exclure l'hémoglobine d'hémolysats sanguins. Des injections à différents pH ont montré que la rétention de l'hémoglobine est drastiquement restreinte à pH 10,7. En raison d'une bonne stabilité à pH basique, la colonne polymérique Biotrap 500 MS RAM a été retenue pour l'extraction d'antibiotiques d'hémolysats sanguins. Des extractions quantitatives d'analytes à faibles concentrations (200 pg/μL) ont été réalisées sans effet mémoire d'hémoglobine sur la colonne.
Un nouveau système 2D-HPLC-ESI-MS/MS pour l'analyse protéomique a été développé. Le système est composé d'une séparation par RP-HPLC à pH 10,0, suivie d'une séparation par IP-RP-HPLC à pH 2,1. Ce nouveau système a été comparé à un système conventionnel SCX x IP-RP-HPLC. L'orthogonalité des méthodes de séparation est plus élevée dans l'approche SCX x IP-RP-HPLC que dans le schéma RP x IP-RP-HPLC. Cependant, en raison d'une meilleure distribution des peptides et d'une meilleure efficacité de séparation, le système RP x IP-RP-HPLC permet d'identifier significativement plus de peptides. Les deux approches sont complémentaires et une combinaison des deux systèmes permet d'identifier plus de peptides que des analyses répétées par un système unique.

Le comportement de la membrane de l'hématie et en particulier la mesure de sa résistance osmotique présente un intérêt diagnostique pour le clinicien. De nombreuses pathologies hémolytiques influencent considérablement cette résistance (maladies hémolytiques auto-immunes, sphérocytose héréditaire,. . . ). Quelques appareils commercialisés permettent d'étudier les propriétés rhéologiques de la membrane et leurs caractéristiques dimensionnelles, mais aucun ne réalise automatiquement la mesure de la résistance des membranes jusqu'à leur rupture. Actuellement seule la technique manuelle proposée par DACIE est utilisée en routine par les laboratoires d'analyses médicales. Dans ce travail, il est développé un appareil (Fragilimètre) destiné à la mesure de la résistance des membranes à l'hémolyse provoquée. Le principe consiste à faire évoluer progressivement la force ionique, de 0,154 M à environ 0,025 M d'une suspension d'hématies diluées dans une solution tampon. La variation de pression osmotique engendrée au niveau de la cellule provoque l'ouverture de pores par lesquels s'échappe l'hémoglobine. La mesure en temps réel de l'intensité de transmission lumineuse traversant une solution de sang total diluée renseigne sur le phénomène. Les résultats obtenus informent directement sur la résistance de la membrane qui est considérée optiquement comme une particule diffusante. La détermination de l'hémolyse initiale, à 50% et totale permet d'apprécier les caractéristiques de l'hémolyse. Les études ont porté principalement sur l'analyse d'échantillons de sang divers (témoins, pathologiques,. . . ) frais et incubé 24 H à 37ʿC. Les résultats des valeurs obtenues sur ces différentes populations permettent au système de les distinguer aisément. L'expérience, entièrement automatisée, est réalisée en 10 min.

La drépanocytose est une maladie génétique caractérisée par la présence d’une hémoglobineanormale. Les travaux de cette thèse visaient à caractériser les fonctions micro-et macrovasculaires chezles enfants atteints de la drépanocytose SS et SC et ses conséquence sur la sévérité clinique. Nosrésultats, réalisées sur une cohorte pédiatrique antillaise, démontrent que les fonctions micro-etmacrovasculaires étaient altérées chez les enfants drépanocytaires homozygotes (SS) et chez les enfantsSC par rapport aux enfants non malades. Ainsi il semble que les patients drépanocytaires présentent, etce dès le plus jeune âge, une défaillance vasculaire marquée. Plusieurs facteurs semblent être impliqués :(1) l’activation endothéliale chronique, (2) la faible biodisponibilité en monoxyde d’azote causée parl’installation d’un état de stress oxydatif et nitrosatif chronique, (3) l’altération du système nerveuxautonome avec un risque vasoconstricteur (4) la défense anti-oxydante sur-sollicitée et (5) le faible niveaud’activité physique. En outre, nos résultats indiquent que la dysfonction vasculaire était plus sévère chezles enfants SS comparé aux enfants SC. Le faible taux d’hémolyse et le moindre stress oxydatif,pourraient expliquer la meilleure fonction vasculaire chez les enfants SC. Cette interaction entre stressoxydatif et hémolyse semble jouer un rôle clefs dans le cercle vicieux de la physiopathologiedrépanocytaire. Dans cette cohorte pédiatrique, le degré de dysfonction vasculaire ne semble pasmoduler la sévérité clinique. Cependant une dysfonction vasculaire plus développée a probablement desconséquences néfastes sur la sévérité clinique dans la drépanocytose
Sickle cell disease is the most common genetic disease in the West Indies that affectshemoglobin. Because of considerable heterogeneity in clinical outcomes, its complex pathophysiology isstill not totally understood. For many decades it was widely assumed that blood disorders were the solecause of vaso-occlusion. More recently blood vessel dysfunction also seem to be involved. But it isunclear whether vascular function is affected similarly in children with sickle cell anaemia (SS) and childrenwith sickle haemoglobin C (SC) disease. This study with a cohort of Guadeloupean children demonstratedthat microvascular reactivity is impaired already in sickle cell SS and SC children compared to healthychildren. Divers biological and physiological analysis revealed that there are many interacting factors, all ofwhich may contribute to vasculopathy: (1) chronic endothelial stress due to elevated blood flow level, (2)reduced nitric oxide bioavailability due to chronic hemolysis and oxidative stress, (3) altered autonomicnervous system activity with increase risque in vasoconstrictor activity, (4) saturated antioxidant activityand (5) limited physical activity known to improve vascular function. In this children cohort, vascularimpairments were not associated to clinical severity. However vascular dysfunction seems to beexacerbated in SS. Mild haemolysis in SC, compared to SS, may limit oxidative and nitrosative stress andcould explain the better preserved microvascular function in this group. Learning more about the progressof vascular dysfunction in sickle cell disease seems to be essential. In advanced state it may possibleseriously worsen clinical severity

La leptospirose est une zoonose de représentation mondiale concernant la plupart des Mammifères dont l'homme. Hap1 a été purifiée dans une fraction protéique de 32 kDa extraite de leptospires, bactéries responsables de la leptospirose. La protéine Hap1 s'est révélée être associée à une protection hétérologue contre la leptospirose chez des gerbilles. Le gène hap1 a été exprimé par E. Coli afin de produire la protéine recombinante rHap1. Ce travail confirme et prolonge les travaux antérieurs : Hap1 est secrétée par les seuls leptospires pathogènes lors de leur multiplication. Très immunogène et protectrice dans les conditions naturelles, cette protéine sous sa forme recombinante ne permet pas de reproduire les activités protectrices dans les conditions naturelles. L'objectif de ce travail était donc de purifier la ou les formes naturelles de la protéine Hap1 afin d'en définir les présentations structurales expliquant cette contradiction
Leptospirosis is a zoonosis with a worldwide distribution concerning most Mammalians among which humans. Hap1 was purified from an antigenic zone with an apparent molecular mass of 32 kDa extracted from leptospires, bacteria responsible for leptospirosis. Immunization with Hap1 expressed by adenovirus or plasmid induced in gerbils a protection against leptospirosis. Then hap1 gene was expressed by E. Coli to product the recombinant protein rHap. This present work confirms these previous data: Hap1 is secreted during the multiplication of only pathogenic leptospires. Very immunogenic and protective in the natural conditions, this protein in the recombinant form doesn't permit to reproduce protective activity in the natural conditions. So, the purpose of this work was to purify one or many Hap1 naturally forms in order to determine the structural difference to understand this contradiction

Ce travail présente la synthèse de neuf disaccharides à a-L-rhamnopyranose/a-L-arabinopyranose, ß-D-xylopyranose/a-L-arabinopyranose et ß-D-glucopyranose/a-L-rabinopyranose. Après activation de ces disaccharides en position anomérique par un trichloroacétimidate, ces composés ont été couplés sur un dérivé de l'hédéragine, donnant accès, après déprotection, à une série de 12 saponosides. Une seconde série de saponosides à hédéragénine (chaînes osidiques à D-cellobiose, D-lactose, D-maltose, D-mélibiose, D-gentiobiose ou D-isomaltose) a également été synthétisée par la méthode des trichloroacétimidates. L'activité hémolytique de ces saponosides sous forme d'acide carboxylique libre et d'ester méthylique a été mesurée afin d'établir des relations de structure-Activité. L'activité cytotoxique des saponosides dérivés de l'a-hédérine, sous forme d'acide carboxylique libre, a également été mesurée in vitro sur cellules KB. Une autre partie de cette thèse concerne la synthèse de dérivés de l'isomaltose. L'isomaltose trichloroacétimidate a été synthétisé en 5 étapes à partir de l'amygdaline par un réarrangement en milieu acide de la liaison interglycosidique
This @PhD thesis presents the synthesis of nine disaccharides consisting of a-L-rhamnopyranose/a-L-arabinopyranose, ß-D-xylopyranose/a-L-arabinopyranose and ß-D-glucopyranose/a-L-arabinopyranose. The anomeric position of these disaccharides were then activated and these compounds were coupled to a hederagenin derivative, giving access, after total deprotection to a serie of 12 saponins. A second serie of hederagenin saponins (D-cellobiose, D-lactose, D-maltose, D-melibiose, D-gentiobiose or D-isomaltose osidic moiety) was also synthesized by the trichloroacetimidate glycosylation method. All of the resulting saponins were then tested for their hemolytic activity as either the free carboxylic acid or as the coresponding methyl ester in order to establish structure-activity relationships. The cytotoxic activity of the free carboxylic acid saponins derivative from a-hederin, was also measured in vitro on KB cells. Another part of this thesis deals with the synthesis of isomaltose derivatives. Isomaltose trichloroacetimidate was synthesized in five steps from D-amygdalin by acid catalyzed rearrangement of the interglycosidic bond

L’hémolyse post transfusionnelle retardée (HPTR) est une complication potentiellement mortelle de la transfusion dans la drépanocytose. Sa fréquence est sous-estimée et aucun facteur prédictif de sa survenue n'a encore été identifié. Nous avons mené une étude observationnelle prospective monocentrique pendant 30 mois. Nous avons inclus 694 épisodes transfusionnels (ET) chez 311 patients adultes drépanocytaires, divisés en ET ponctuels (ETP = 360) et en ET chronique dans le cadre d’un programme (ETC = 334). Au cours de ce suivi, 15 HPTR ont été enregistrées, exclusivement après un ETP. L'incidence cumulative d’HPTR sur 30 mois était de 4,2 % par ETP (IC 95 % [2,6 ; 6,9]) ou 6,8 % par drépanocytaires transfusés (IC 95 % [4,2 ; 11,3]). Le taux d’incidence était de 16,4 HPTR pour 1000 ETP-Année (IC 95 % [10,1 ; 27,2]) ou 27,1 HPTR pour 1000 Personne-Année (IC 95% [16,7 ; 45,0]). Nous avons étudié 11 HPTR supplémentaires afin de construire un score prédictif. Les variables retenues étaient un antécédent d’HPTR, le nombre d’unités précédemment transfusées et l’état d’immunisation pré transfusionnelle. L’adéquation du score était excellente (Hosmer-Lemeshow = 1,40, p = 0,71), sa capacité discriminante très satisfaisante (aire sous la courbe ROC = 0,85 ; p < 0,0001), une valeur prédictive négative de 98,4 % et une valeur prédictive positive de 50,0 %. La validité interne du score, réalisée par Bootstrap, montre une très bonne performance. Nous rapportons, pour la première fois, l'incidence de l’HPTR et montrons qu’elle survient uniquement suite à un ETP. Nous décrivons également un score simple de prédiction d’une HPTR avant un ETP afin de mieux prendre en charge cette transfusion
Delayed hemolytic transfusion reaction (DHTR) is a life-threatening complication of transfusion in sickle cell disease (SCD). The frequency of DHTR is underestimated and no predictive fac-tors for identifying patients likely to develop DHTR have yet been defined. We conducted a prospective single-center observational study over 30 months. We included 694 transfusion epi-sodes (TE) in 311 adult patients, divided into occasional TE (OTE: 360) and TE during a chronic program (CTE: 334). During follow-up, 15 cases of DHTR were recorded, exclusively after OTEs. DHTR cumulative incidence durin the 30 months was 4.2% per OTE (95% CI [2.6, 6.9]) or 66.8% per patient (95% CI [4.2, 11.3]). The incidence rate was 16.4 DHTR per 1000 OTE-Year (95% CI [10.1, 27.2]) or 27.1 DHTR per 1000 Person-Year (95% CI [16.7 ; 45.0]). We studied 11 additional DHTR cases to construct a score for predicting DHTR after OTE. Fifteen % of the 26 DHTR patients died. The variables retained in the multivariate model were history of DHTR, number of units previously transfused and immunization status before transfusion. The score adequacy was excellent (Hosmer-Lemeshow = 1.40, p = 0.71), very satisfactory dis-criminant capacity (area under ROC curve = 0.85, p <0.0001), negative-predictive value of 98.4% and a positive-predictive value of 50%. The internal validity of the score, realized by Bootstrap, shows a very good performance.We report, for the first time, the incidence of DHTR and we show that DHTR developed only in OTE. We also describe a simple score for predicting DHTR in patients undergoing occasional transfusion, to facilitate the management of blood transfusion in SCD patients

En hématologie, des tensioactifs tels que les saponines sont utilisés comme agent érythrolytique afin de compter et identifier les différentes populations de globules blancs, qui sont mille fois moins abondants que les érythrocytes. Ces saponines sont utilisées pour leur lyse sélective des globules rouges dans les réactifs d’HORIBA Médical. Au cours de cette thèse, nous avons étudié l’action de différents tensioactifs sur les cellules sanguines afin d’avoir une meilleure compréhension des interactions tensioactifs/membrane. Le premier projet a porté sur l’observation et la caractérisation des effets des saponines sur les érythrocytes par des méthodes microscopiques et spectrophotométriques, dans le but d’obtenir une meilleure compréhension de leur sélectivité vis-à-vis des globules rouges. Nous avons ainsi démontré la participation du cholestérol, des transporteurs tels que la bande 3 et du cytosquelette lors de la lyse par les saponines. Dans une seconde étude, des recherches ont été entreprises afin d’identifier les propriétés requises d’un tensioactif pour obtenir un agent lytique efficace. Nous avons sélectionné deux types de familles de tensioactifs, l’une non-ionique de type éther d’alcool polyoxyéthylèné, et l’autre anionique à base d’acides aminés. Ces études se sont concentrées sur la relation entre le pouvoir érythrolytique et certains paramètres physico-chimiques des tensioactifs tels que la concentration micellaire critique (CMC), la balance hydrophile-lipophile (HLB), le coefficient de partage entre la membrane et le milieu aqueux (Kb), et le packing parameter (P). Nous avons montré qu’une considération globale de l’ensemble de ces paramètres était nécessaire pour pouvoir prédire les interactions des tensioactifs avec la membrane des érythrocytes. Enfin, l’effet lytique de ces tensioactifs sur les leucocytes a été étudié en cytométrie en flux afin de vérifier l’intégrité des globules blancs lors des différentes lyses. Les résultats obtenus au cours de ces travaux de thèse rendent possible le développement de futurs réactifs hématologiques pour la différenciation leucocytaire
Surfactants such as saponins are employed, in the haematology field, as erythrolytic agent in order to count and to identify different leukocyte populations, which are typically thousand times less abundant than erythrocytes. These saponins are used for erythrocytes selective lysis in HORIBA Medical reagents. This thesis aimed to study the action of different surfactants on red blood cells in order to have a better understanding of surfactants/membrane interactions. The first project involved the observation and the characterization of saponins effects on erythrocytes by microscopic and spectrophotometric methods, in order to understand saponins selectivity regarding erythrocytes. We have thus demonstrated the participation of cholesterol, transporters such as band 3 and erythrocyte cytoskeleton during saponins lysis. In a second study, investigations have been performed in order to identify surfactants properties required to get a suitable erythrocyte lysing agent. We have chosen two surfactants families: non-ionic surfactants of the polyoxyethylene alkyl ethers series and anionic amino acid-based surfactants. These studies are focused on the relation between surfactants erythrolytic potency and some physico-chemical parameters such as the critical micellar concentration (CMC), the hydrophile-lipophile balance (HLB), the surfactants membrane / water partition coefficient (Kb) and the packing parameter (P). We have thus shown that the global consideration of all these physico-chemical parameters was necessary to predict surfactants interactions with the erythrocytes membrane. Finally, the lytic effects of surfactants on leukocytes were studied in flow cytometry to verify leukocytes integrity during different lysis. The results obtained in this thesis make possible the future development of hematological reagent for leukocytes differentiation

L'etude des hemoglobines anormales, presentees dans ce memoire, a permis de preciser certains mecanismes moleculaires impliques dans la stabilite du tetramere. Elle a confirme l'importance, pour la stabilite, de l'integrite de la poche de l'heme ou pour la premiere fois, on a pu apprecier les effets d'une deletion dans l'angle cd (hemoglobine bruxelles). Elle a contribue a mettre en evidence le role preponderant des contacts entre les helices b et g (hemoglobine henri mondor) et entre les helices h et f (hemoglobine olmsted) de la chaine beta. Elle a confirme le role du contact alpha1 beta1 (hemoglobine camperdown). Elle a renforce la notion que le glycocolle destabilise les structures en helice alpha (hemoglobine dhonburi). Elle a illustre l'effet sur la stabilite de la deletion d'une des bases codant pour un residu situe en fin de chaine et entrainant u decalage du cadre de lecture (hemoglobine saverne). Elle a montre a nouveau que dans le cas des hemoglobines tres instables, difficiles a identifier dans le globule rouge, les techniques de synthese de chaines pourraient suggerer l'existence d'une hemoglobine anormale (hemoglobine olmsted)

Les tensioactifs, que nous appellerons aussi surfactifs, composés amphiphiles ou agents de surface sont présents à peu près partout et constituent l'une des plus grandes familles d'auxiliaires chimiques. Le plus souvent, leur présence se fait discrète et ne se manifeste que dans les processus de mise en oeuvre de procédés industriels ou agricoles (Extraction du pétrole, épandage des pesticides, fabrication des polymères, etc. . . ). Ils constituent l'une des plus grandes familles d'auxiliaires chimiques et interviennent directement dans notre vie quotidienne avec des produits de grande consommation comme les détergents, les adoucissants, les cosmétiques, les schampooings, etc. . .

LORSQUE DES GLOBULES ROUGES SONT SOUMIS A UNE AGRESSION RADICALAIRE, ON OBSERVE UNE OXYDATION DES LIPIDES ET PROTEINES MEMBRANAIRES RESPONSABLE D'UNE FUITE POTASSIQUE ET D'UNE HEMOLYSE. LE BUT DU PRESENT TRAVAIL ETAIT D'ETUDIER LES EFFETS ANTIOXYDANTS DES ANESTHESIQUES LOCAUX SUR DES GLOBULES ROUGES HUMAINS SOUMIS A UNE AGRESSION RADICALAIRE. DANS LES CONDITIONS EXPERIMENTALES, LA LIDOCAINE DIMINUAIT L'EFFET PO ASSIQUE ET L'HEMOLYSE, MAIS ETAIT DENUEE D'EFFET PIEGEUR DE RADICAUX LIBRES. L'ACTION DE L'OUBAINE, DU LEMAKALIM ET DU FUROSEMIDE A ETE EGALEMENT TESTEE. L'OUBAINE ET LE LEMAKALIM ETAIENT SANS EFFET, CE QUI ELIMINAIT UNE ACTION IMPLIQUANT UNE INHIBITION DE LA Na-K ATPase OU UNE OUVERTURE DES CANAUX Katp. LE FUROSEMIDE SE COMPORTANT COMME UN PIEGEUR DE RADICAUX LIBRES, IL N'A PAS ETE POSSIBLE DE PRECISER LE ROLE DE L'ECHANGEUR Na-K-Cl. LA COMPARAISON DES EFFETS DE LA LIDOCAINE AVEC CEUX DE LA BUPIVACAINE ET DE LA ROPIVACAINE A MONTRE QUE LA LIDOCAINE ETAIT PLUS EFFICACE QUE LES DEUX AUTRES MOLECULES, CE QUI ECARTAIT L'HYPOTHESE D'UN MECANISME IMPLIQUANT LE CANAL SODIQUE ET L'EVENTUEL INFLUENCE DE LA STEREOISOMERIE. SECONDAIREMENT, CE MODELE D'ETUDE A ETE UTILISE POUR VERIFIER IN VITRO L'INTERACTION ENTRE LE FLUMAZENIL ET LA BUPIVACAINE. CETTE INTERACTION A ETE RETROUVEE , CONFIRMANT AINSI QU'ELLE SIEGEAIT AU NIVEAU DE LA MEMBRANE CELLULAIRE. ENFIN, IL A ETE MONTRE QUE LA LIDOCAINE DIMINUAIT L'EFFLUX POTASSIQUE ET L'HEMOLYSE LORSQUE DES GLOBULES ROUGES ETAIENT CONSERVES PENDANT UNE SEMAINE. TOUS CES RESULTATS CONFIRMENT LA VALIDITE DE CE MODELE POUR L'ETUDE DES EFFETS DE MOLECULES SUR LA MEMBRANE CELLULAIRE. LA LODOCAINE POSSEDE UN PUISSANT EFFET PROTECTEUR , IMPLIQUANT VRAISEMBLABLEMENT UNE ACTION DIRECTE AU SEIN DE LA MEMBRANE CELLULAIRE.

L’identification fréquente de mutations des protéines régulatrices du complément suggère que les lésions endothéliales du syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa) résultent d’une activation incontrôlée de la voie alterne du complément. Les mutations, en soi, ne constituent cependant que des facteurs de susceptibilité et les mécanismes menant de l’anomalie de régulation du complément au développement de lésions de microangiopathie thrombotique rénale restent mal compris. L’objectif de ce projet était donc d'étudier certains mécanismes de l’activation du complément à la surface des cellules endothéliales dans le SHUa et les conséquences de cette activation pour l’endothélium. Dans ce but, ce travail s’est initialement concentré sur la mutation C3R139W, dont nous avons réalisé la caractérisation phénotypique et fonctionnelle et qui a constitué un modèle d’étude des conséquences d’un complément dérégulé sur l’endothélium. Cette mutation a été identifiée de façon sporadique chez 4% des patients de la cohorte française de SHUa. Son étude phénotypique a mis en avant une évolution fonctionnelle rénale souvent sévère mais inhomogène ainsi qu’une fréquence non négligeable d’événements cardio-vasculaires. Sa caractérisation fonctionnelle a révélé une augmentation de son affinité pour le facteur B, à l’origine de la formation d’une « hyper C3 convertase », échappant également en partie aux systèmes de contrôle (diminution de liaison avec la MCP). L’étude de ses conséquences endothéliales a montré, à la surface de cellules pré-activées, une augmentation des produits d’activation du complément et de l’expression membranaire de facteur tissulaire, faisant le lien avec l’acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique. Nous rapportons également, sous l’effet de sérum porteur de cette mutation, une majoration de la perméabilité et du détachement cellulaire, susceptibles de traduire une souffrance endothéliale. Dans la deuxième partie et en vue de préciser les liens entre anomalie du complément et activation des cellules endothéliales, nous nous sommes intéressés au rôle de l’hémolyse, dénominateur commun des SHU. Nous avons ainsi montré que l’hème libre activait la voie alterne du complément dans le sérum et à la surface des cellules endothéliales et ce, de façon exacerbé, en cas de dysrégulation sous-jacente du complément. Nous avons identifié plusieurs mécanismes d’action par lesquels l’hème peut activer le complément : il favorise les interactions C3/C3 et ainsi la formation d’une hyper C3/C5 convertase, déclenche une mobilisation des corps de Weibel-Palade à l’origine de l’expression membranaire de P-selectine, qui est capable d’activer la voie alterne du complément et induit une diminution de l’expression membranaire des régulateurs MCP et DAF. Par ces travaux, nous avons précisé les liens entre activation du complément et acquisition d’un phénotype endothélial prothrombotique dans le SHUa. Nous avons notamment identifié l’hémolyse comme un acteur potentiel de l’amplification des lésions endothéliales complément-dépendantes. Son contrôle pourrait ainsi constituer une nouvelle voie thérapeutique dans le SHU
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Le traitement actuel de l’hépatite C chronique repose sur l’association synergique entre l’IFN-alpha pégylé et la ribavirine et permet une réponse virologique chez environ 60% des patients. Un des mécanismes permettant d’expliquer cette synergie repose sur l’effet mutagène de la ribavirine. Notre objectif a été tout d’abord d’évaluer cet effet sur le système de culture du VHC (VHCcc: JFH-1). L’analyse nucléotidique montre une augmentation significative du taux de mutations de la région NS5a à la dose de 50µM de ribavirine. Au niveau peptidique, la pression de sélection exercée par la ribavirine, se caractérise par l’obtention de deux clusters montrant chacun au moins une mutation spécifique. De plus le traitement par la ribavirine a modifié l’efficacité du traitement par l’interféron. La dose inhibitrice 50% était inférieure pour les virus obtenus après un mois de ribavirine à 50 µM. Dans un deuxième temps nous nous sommes intéressés à l’effet indésirable majeur de la ribavirine, l’anémie de type hémolytique. Cet effet indésirable est très fluctuant d’un patient à l’autre. C’est pourquoi la prédiction de l’hémolyse avant le traitement est un enjeu majeur pour optimiser la réponse au traitement. Par le test d’hémolyse in vitro développé et le dosage des protéines sulfhydryles plasmatiques, il semble possible d’anticiper la chute de l’hémoglobine sous traitement. Nous avons identifié au niveau plasmatique un bon marqueur pronostic de chute de l’hémoglobine de plus ou moins 3 grammes/dL au cours du traitement avec une sensibilité de 100% et une spécificité de 80%. En conclusion, l’effet mutagène de la ribavirine déjà observé dans d’autres modèles (modèle réplicon, poliovirus,…) augmenterait la sensibilité à l’IFN de la population virale obtenue. Il est donc probable que cette mutagenèse puisse expliquer en partie l’action synergique de la ribavirine avec l’interféron au cours du traitement de l’hépatite C chronique. La prédiction de l’hémolyse sous traitement est donc un enjeu majeur pour améliorer l’efficacité antivirale de la ribavirine
The current treatment of chronic hepatitis C is based on synergistic association between pegylated interferon and ribavirin and allows a sustained virological response in approximatively 60% of the patients. One of the mechanisms making it possible to explain this synergy is support by the mutagen effect of ribavirin. Our objective was first of all to evaluate this effect on the in vitro cell culture system of HCV (HCVcc: JFH-1). The nucleotidic analysis shows a significant increase in the mutation rate of NS5a at a ribavirin concentration of 50µM. At the peptide level, the selective pressure exerted by ribavirin, is characterized by two clusters obtained showing each one at least a specific change. Moreover the treatment by ribavirin modified the effectiveness of interferon. The inhibitory concentration 50% (IC50) was lower for the viruses obtained after one month of ribavirin at a concentration of 50 µM. In the second time we were interested in the major undesirable effect of ribavirin: hemolysis. This side effect is very fluctuating from one patient to another. For this reason, the prediction of hemolysis before treatment is a major stake to optimize the answer to the treatment. By our hemolysis in vitro test developed and the quantification of the plasmatic proteins sulfhydryl, it seems possible to anticipate the fall of hemoglobin under treatment. We identified at the plasmatic level a good predictive marker of fall of the hemoglobin from more or less 3 g/dL during the treatment with a sensitivity of 100% and a specificity of 80%. In conclusion, the mutagen effect of ribavirin already observed in other models (réplicon, poliovirus,…) would increase the sensitivity to IFN of the viral population obtained. It is thus probable that this mutagenesis can partly explain the synergistic action of ribavirin with interferon during the treatment of chronic hepatitis C. The prediction of the hemolysis under treatment could allow an optimization of current and future therapy with ribavirin in the field of chronic hepatitis C

L'hémolyse intravasculaire est la destruction prématurée et chronique des globules rouges. Elle est caractérisée par une libération accrue d’hème et de microvésicules (MV) membranaires dans la circulation sanguine. L'hémolyse chronique est une des caractéristiques de la drépanocytose. Elle joue un rôle très important dans la physiopathologie de la drépanocytose. La drépanocytose est associée à une agrégation des globules rouges dans la circulation, menant à des occlusions vasculaires et des crises vaso-occlusives extrêmement douloureuses. Les travaux précédents de l’équipe dans la drépanocytose, ont montré que les MV de globules rouges transfèrent de l’hème aux cellules endothéliales, participent à la dysfonction vasculaire et induisent des vaso-occlusions rénales dans un modèle de souris drépanocytaire. Ces résultats nous ont incités à poursuivre l’étude des effets des MV de globules rouges, chargées en hème. Nous avons émis l’hypothèse que les MV chargées en hème stimulent également l’inflammation dans la drépanocytose au de-là de la dysfonction endothéliale. Ce travail regroupe trois parties. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à l’effet pro-inflammatoire des MV de globules rouges, chargées en hème. Nous avons démontré que les MV stimulent les neutrophiles qui libèrent leur ADN. Les taux plasmatiques d’ADN extracellulaire sont élevés dans la drépanocytose, comparés aux taux plasmatiques chez les individus sains, et augmentent encore durant les crises vaso-occlusives. Cet ADN, qui pourrait provenir en partie des pièges extracellulaires d’ADN (dits NETs), affecte l’hémorhéologie drépanocytaire en modifiant les propriétés d’agrégation et d’adhésion des globules rouges. Par ailleurs, nous avons constaté que le plasma des patients drépanocytaires était incapable de dégrader l’ADN in vitro, et présentait une activité DNase plasmatique réduite. La baisse de l’activité DNase dans la drépanocytose crée un déséquilibre entre les taux d’ADN circulant et son inhibiteur endogène. En contre partie, une supplémentation en DNase-I humaine recombinante par perfusion intraveineuse a libèré les vaso-occlusions rénales dans le modèle de souris drépanocytaire et a réduit l’excès d’agrégation et d’adhésion des globules rouges drépanocytaires. Ces résultats démontrent un déséquilibre entre les taux d’ADN circulant et l’activité DNase chez les patients drépanocytaires conduisant à une inflammation chronique, une forte agrégation des globules rouges et la survenue des vaso-occlusions. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés aux effets du remodelage et du remaniement membranaire des globules rouges dans la drépanocytose. Nous avons identifié que les globules rouges et leurs MV sont associés à une externalisation accrue de la phosphatidylsérine et que cette externalisation accrue ne résulte pas d’une composition lipidique modifiée de la membrane des globules rouges, mais, il s’agit principalement d'une externalisation exagérée de la phosphatidylsérine. L’externalisation de la phosphatidylsérine contribue aux occlusions vasculaires in vivo. La neutralisation de la phosphatidylsérine des MV et des globules rouges avec de l’annexine-A5 recombinante permet la libération des vaso-occlusions rénales induites par les MV de globules rouges dans le modèle de souris drépanocytaire. Ces résultats démontrent le rôle de la phosphatidylsérine externalisée par les globules rouges et les MV dans les occlusions vasculaires in vivo et le potentiel thérapeutique de l’annexine-A5 pour restaurer l’hémorhéologie et la perfusion tissulaire durant les vaso-occlusions drépanocytaires. Dans une troisième partie, nous nous sommes intéressés aux annexines en tant qu’inhibiteurs endogènes de la phosphatidylsérine des membranes de globules rouges et de MV. Nous avons mis au point un nouveau test qui permet de quantifier la fonctionnalité de l’annexine-A5 et –A7. (...)
Pas de résumé

L' @étude chimique des fruits et des écorces de tronc de Caryocar glabrum et Caryocar villosum, ainsi que celle des feuilles de Guioa crenulata a permis d'identifier 76 composés dont 53 correspondent à de nouvelles structures. Les composés isolés appartiennent à huit classes de métabolites secondaires : 54 saponosides, 4 glycosides d'alcool benzylique ou phénolique, 3 galloylhamameloses, 2 glycosides de 3,4-dihydroisocoumarine phénylée, 5 dérivés de l'acide ellagique, 3 flavonoïdes, 1 tanin trimère et 4 glycosides de farnésol. La détermination de structure de ces différents composés a été réalisée à l'aide des méthodes spectroscopiques de RMN et de spectrométrie de masse ESI-(MS)n. Dans certains cas, un recours au dichroïsme circulaire s'est avéré nécessaire afin de déterminer la configuration des carbones asymétriques. Les activités biologiques des différents extraits et de certains composés isolés purs ont été étudiées. Pour l'activité hémolytique des saponosides, l'influence d'un acide glucuronique par rapport à un glucose a été comparée et montre une inversion d'activité lorsque l'on augmente la polaritié sur le cycle A de la génine. L'activité toxique des extraits et fractions enrichies en saponosides a été testée sur Artemia salina et montre que les saponosides des fruits sont toxiques avec une CI50 de 100 µg/ml. L'activité antibactérienne de certains composés a été mesurée sans donner de composés actifs. Les extraits acétate d'éthyle des fruits de C. Villosum et des écorces de tronc de C. Glabrum ont montré une activité antipaludique (CI50=10 µg/ml) sur P. Falciparum. Aucune activité dermatocosmétique (inhibition de la DOPA oxydase et lipolyse) n'a été observée chez les composés testés. Seul un saponoside présente une cytotoxicité iportante sur cellules HaCat
The @chemical investigation of fruits and stem barks of Caryocar glabrum and Caryocar villosum, as well as leaves of Guioa crenulata led us to identify 76 compounds, 53 of which possess new structures. The isolated compounds belong to eight families of secondary metabolites: 54 saponins, 4 glycosides of benzylic or phenolic alcohols, 3 galloylhamameloses, 2 glycosides of 3,4-dihydroisocoumarin, 5 derivatives of ellagic acid, 3 flavonoids, 1 trimeric tannin formed by three epicatechinic units, and 4 glycosides of farnesol. Their structures were established by 1D and 2D NMR experiments, ESI-(MS)n and acid hydrolysis. In some cases, we have used circular dichroism to determine the configuration of asymmetric carbons. The influence of glucose and glucuronic acid on the hemolytic activity of saponins was evaluated. The toxic activity of methanol extracts of C. Glabrum and C. Villosum was evaluated by determination of lethal dose using brine shrimps (Artemia salina). The antiplasmodial activity of ethyl acetate extracts of fruits of C. Villosum and stem barks of C. Glabrum was measured. The dermocosmetic activity of some saponins which have hederagenin as aglycone, bidesmosides and galloylhamameloses was evaluated. The cytotoxic activity of ethanolic and ethyl acetate extracts of the leaves of Guioa crenulata was evaluated

Objectifs: Malgré beaucoup de progrès dans la gestion médico-électrique, certains problèmes demeurent et plusieurs patients souffrant d'insuffisance cardiaque sont encore dans l'impasse. Ainsi, les dispositifs d'assistance ventriculaire gauche (LVAD) ont été développés pour réduire les conséquences de l'insuffisance cardiaque et améliorer la qualité de vie. Malgré les avantages évidents, plusieurs complications : thrombo-embolie, infection dû au câble d'alimentation externe, dépendance aux batteries demeurent. L'ICOMS est un nouveau concept de LVAD mélangeant une pompe entièrement intraventriculaire, synchronisé avec le cœur et relié à une batterie interne. Méthodes et résultats : L'intervalle de fonctionnement prévu est un débit de 0.8 to 6.7 10-5 m3/s à une vitesse de rotation de 733 to 942 rad/s, avec des pressions physiologiques. Le point de fonctionnement choisi pour la conception est un débit de 3.3 10-5 m3/s et 10.6 103 Pa . Dans cette étude, Une simulation numérique est réalisée avec des profils de lames différents pour chaque région de fluide étudié. Les performances telles que l'efficacité, la contrainte de cisaillement sont analysée pour vérifier l'efficacité pour les patients atteints d'insuffisance cardiaque. Afin d'obtenir le meilleur résultat avec le logiciel ANSYS, le modèle k-ε turbulent a été appliquée pour obtenir des caractéristiques d'écoulement entre l'entrée et à la sortie de l'évacuateur du redresseur de la pompe. Les résultats numériques montrent une performance acceptable pour les adultes pour délivrer des pressions physiologiques avec une efficacité hydraulique de 10 à 37% ainsi qu'un niveau acceptable de stress de cisaillement maximale le long de la surface de la partie mobile de la pompe. La deuxième partie de l'étude est une étude expérimentale où un prototype a été testé sur banc d'essai. Les résultats ont montré que la pompe pourrait fonctionner et améliorer le débit cardiaque de 1.7 à 6.7 10-5 m3/s. Les résultats in vitro convergent vers les résultats numériques. Pour les tests in vivo, 6 moutons ont été opérés pour l'implantation du LVAD. L'ICOMS a été implanté dans l'apex du ventricule gauche. Plusieurs paramètres hémodynamiques et échocardiographiques ont été stockés dans des conditions normales ou pathologiques. Conclusion: Nous avons montré que l'ICOMS pourrait présenter un effet potentiel pour réduire les conséquences de l'insuffisance cardiaque. De nouvelles expérimentations sont nécessaires pour confirmer notre résultat et optimiser ce nouveau LVAD
Objectives: Despite much progress in medical-electrical management, some problems remain and several heart failure patients are still in a no option solution. In this way, artificial hearts as Left Ventricular Assist Device (LVAD) have been developed. Despite evident benefits, several complications as thromboembolism, driveline infection, batteries dependency remain. ICOMS is a new LVAD concept mixing a fully intraventricular pump, heat rate-synchronized and connected with intracorporeal batteries. Methods and Results : It is expected to deliver 0.8 to 6.7 10-5 m3/s at rotational speeds of 733 to 942 rad/s over physiologic pressures and has a selected design point of 3.3 10-5 m3/s and 10.6 103 Pa . In this study, the axial blood pump with motor connected to impeller has been selected to numerical simulation. This selection is based on axial flow pump with different blade profile for each fluid region and studied on its performance such as efficiency, wall shear stress and considering effective operation for cardiac failure patients. In order to achieve the best result with the ANSYS software, k-ε turbulent model has been applied to obtain the flow characteristics from inducer inlet to straightener outlet of the pump. Numerical results show acceptable performance to deliver physiologic pressures with hydraulic efficiency of 10 to 37 % as well as acceptable maximum shear stress level along the blade tip surface of the impeller. The second part of the study is an experimental investigation where a prototype device was tested in a test bench circulation loop have shown that the pump could operate and improve the cardiac output of 1.7 to 6.7 10-5 m3/s. In vitro results converge to numerical results. For test vivo 6 sheep were operated for the LVAD implantation with the support of cardiopulmonary by-pass. The ICOMS was implanted into the LV apex. Several hemodynamic and echocardiographic parameters were stored as well as in normal or pathological conditions and analyzed. Conclusion: We showed that the ICOMS could present a potential effect in the LV support reducing the heart failure criteria. As evidence, further experimentations are necessary to confirm our result and to optimize this new LVAD

L’étude entreprise couvrant une large variabilité génétique a permis de confirmer sur poussins le rôle antinutritionnel des saponines de la luzerne. Les effets variétaux, cycles de récolte, organes (feuilles, tiges, racines) ont été analysés. Le devenir des saponines au cours du processus d’extraction industrielle des protéines est étudié. Les méthodes de dosage biologique utilisables (Trichoderma, Tenebrio, hémolyse…) ont été mises en œuvre et comparées : elles apparaissent très bien corrélées et disponibles en sélection pour l’obtention de génotypes à faible teneur en saponines
The study undertaken dealnig with a large genetical variability allowed the author to confirm the antinutritional effect of lucerne saponins on chickens. The varietal effects, sequence cropping, plant parts (leaves, stems, roots) have been analysed. The becoming of saponins during the industrial extraction process of proteins have been studied. The biological dosage methods available (Trichoderma, Tenebrio, hemolysis…) have been tried and compared : they are very well correlated and available for plant breeders to obtain genotypes with low content of saponins

Cette thèse est consacrée à l'étude des problèmes posés par la plasmaphérèse membranaire et plus spécialement ceux de l'hémolyse et du colmatage de la membrane. Un des objectifs était de déterminer les causes de l'hémolyse lors de la filtration et dans quelle mesure la conception du module peut affecter le degré d'hémolyse produite. Cette thèse a montré que l'on pouvait réduire l'hémolyse en réduisant la longueur du filtre car cela réduit à la fois la pression transmembranaire et le temps de résidence du sang près de la membrane. L'adsorption des protéines par la membrane a été également étudiée. On trouve que cette adsorption est importante mais qu'elle peut être réduite en alimentant le filtre par un débit pulsé. La filtration extra liminale de l'extérieur vers l'intérieur des fibres a été également étudiée sur des prototypes spéciaux à peau externe. Dans le cas de la plasmaphérèse, ce procédé est moins intéressant car il réduit le flux de filtration et augmente l'hémolyse. Enfin, l'adaptation de notre système de filtration par débit pulsé à un moniteur de plasmaphérèse comportant une pompe sur le circuit de perméat a été réalisée et testée in vitro avec du sang bovin
This thesis has focused on the problems encountered during membrane plasmapheresis. These are specifically the causes of haemolysis and flux decline during membrane separations. The objective was to find what causes haemolysis in a filtering system and how the design of a module may affect the overall haemolysis. This thesis shows that haemolysis is due to the pressure gradient across the membrane and that by reducing fibber length the potential for haemolysis is reduced. The adsorption of plasma proteins onto the membrane surface was also investigated. It was shown that during steady blood flow conditions high levels of adsorption or trapping occurred and by introducing flow pulsations this level maybe minimised. A comparison between blood flow inside and outside the fibbers was made with respect to both filtration and haemolysis performances. It was found that with blood flow inside the fibbers haemolysis was lowest and filtration was highest. Having considered these factors a system of control was tested in vitro using bovine blood and flow pulsations. The system yielded a high filtration with very low haemolysis levels

Synthèse d'acides aminés F-alkylés, de bétaïnes F-alkylées, d'un dérivé de l'acide cholique conjugué à un aminoacide F-alkylé et d'acides aminés N-fluroés alkylés. Propriétés tensioactives, biocompatibilité

La faible solubilité de certains médicaments cause des problèmes majeurs dans les formulations pharmaceutiques, puisque la solubilité dans l'eau est un critère indispensable pour la biodisponibilité. Les composés macrocycliques tels que les CDs et les calixarènes ont une cavité relativement hydrophobe, leur permettant ainsi d'encapsuler de nombreuses molécules. Les CDs ont déjà été utilisées comme excipients pharmaceutiques pour l'amélioration de la solubilité. La structure de ces macrocycles permet d'effectuer de nombreuses modifications, qui causent des changements tant au niveau de leurs caractéristiques physico-chimiques que sur leurs effets sur les organismes vivants. Ainsi, l'évaluation de la biocompatibilité de ces dérivés est primordiale en vue de leur utilisation en pharmacie. Puisque l'étude de la biocompatibilité de plusieurs dérivés de β-CD a déjà été étudiée, l'objectif de cette recherche était d'étendre ces expériences à des dérivés de l'α-CD qui sont disponibles dans le commerce. Nous nous sommes intéressés aux relations entre structure et toxicité. Ainsi les dérivés alkyl éther d'α-CD, avec des chaînes alkyle de longueur croissante et substitués sur différentes positions, ont été synthétisés et leur toxicité étudiée. Les para-sulphonato-calix[n]-arènes quant à eux, ont souvent été étudiés et ont montré une forte capacité à complexer de nombreux médicaments. Ils ont aussi démontré une activité biologique polyvalente. Néanmoins, leurs effets sur le mécanisme de transport paracellulaire n'a jamais été évaluée. Les tests de viabilité cellulaire et d'hémolyse nous ont permis d'une part de classer les α-CDs et de choisir les dérivés les plus sûrs, et d'autre part de comparer leur effets toxiques dans des systèmes différents. La comparaison des α- et ß-CDs portant les mêmes modifications chimiques nous a montré l'importance du nombre d'unités de construction. Le rapport entre l'effet cytotoxique et le nombre de groupes hydroxyles libres est également très important. Les dérivés portant de longues chaînes alkyles possèdent une faible solubilité, ce qui nous a conduits vers d'autres modifications chimiques : la sulfonation de ces derniers dérivés semble avoir un impact bénéfique sur la biocompatibilité de CDs. Elle a aussi amélioré la solubilité des calixarènes. Les calix[4] et [8]arène sulphonates ont prouvé leur effet positif sur l'absorption paracellulaire, tandis que le calix[6]arène sulphonate n'a pas eu d'effet similaire. Notre recherche conclut que les changements structurels sur les anneaux macrocycliques peuvent avoir un impact majeur sur la biocompatibilité. Comme les possibilités de modification sont pratiquement illimitées, l'évaluation de la structure et de l'activité est indispensable pour faciliter les choix les plus sûrs dans les applications pharmaceutiques à venir
The low solubility of drug candidates cause a major problem in pharmaceutical formulations, as the aqueous solubility is an indispensable criterion for appropriate bioavailability. Macrocyclic compounds possess a relatively hydrophobic cavity, which is suitable for guest molecule inclusion. Cyclodextrins and calixarenes are widely studied organic host-compounds, and CDs have already been used as pharmaceutical excipients for solubility enhancement. The macrocycles’ chemical structure allows their versatile modification, which eventuates changes not only in physicochemical characteristics, but in their effects on living organisms, as well. Thus, the biocompatibility evaluation of the derivatives is fundamental. Owing to the already performed assessment of numerous β-CD derivatives’ biocompatibility, the aim of this research was to extend these experiments to commercially available α-CDs. They have been used less frequently, however several derivatives, which have not been tested yet in vitro, have the possibility of future pharmaceutical use. Their importance is also certified by their benefits in nanoparticle formation. We have been interested in concrete structure-toxicity correlations, thus alkyl ether α-CD derivatives were synthetized bearing increasing length alkyl chains, in different positions. Para-sulphonato-calix[n]-arenes have already been widely examined due to their efficient drug complexation and versatile biological activity, however, their effects on paracellular transport mechanism have not been evaluated until now.The cell viability and hemolysis tests have allowed us to rank the α-CDs and to choose the safest derivatives, also to compare their toxic effects in different systems. The comparison of α- and β-CDs bearing the same chemical modifications highlighted the importance of the number of building units. Important information has been evaluated regarding the connection between the cytotoxic effect and the number of free hydroxyl groups. Derivatives with long alkyl chains possess low solubility, which led us towards further chemical modifications. Sulfonation seemed to have beneficial impact on the biocompatibility. Sulfonation also improved the solubility of calixarenes. C4S and C8S proved their positive effect on paracellular absorption in a non-toxic concentration range, however C6S had no similar effect, thus their behaviour in in vitro absorption model system arose forward-looking questions.Our research concludes, that the structural changes on the macrocyclic rings may have major impact on the biocompatibility. As the modification possibilities are practically unlimited, the evaluation of structure and activity cannot be avoided, facilitating the safest choice for further pharmaceutical use
A gyógyszerhatóanyagok rossz vízoldékonysága nagy kihívást jelent formulálásuk során, ugyanis a vízoldékonyság elengedhetetlen feltétele a megfelelő biohasznosulásnak. A makrociklusos vegyületek belső ürege viszonylag hidrofób, ez alkalmassá teszi őket vendégmolekulákkal való komplexképzésre. A ciklodextrinek és kalixarének széles körben tanulmányozott vegyületek, egyes CD-ek bejegyzett oldékonyságnövelő segédanyagok. A makrociklusok felépítése számos kémiai módosításra ad lehetőséget, amelyek nem csupán a fiziko-kémiai tulajdonságok változását eredményezik, hanem az élő organizmusokra kifejtett hatásokat is módosítják. Ezen származékok biokompatibilitás vizsgálata tehát elengedhetetlen. Számos β-CD származék biokompatibilitása ismert már, így kutatásunk célul tűzte ki ezen vizsgálatok α-CD-ekre történő kiterjesztését. Az α-CD-ek alkalmazása ritkább, azonban vannak származékok, amelyek in vitro vizsgálata még nem történt meg, de jelentőségük a nanopartikulum-képzésben már igazolt. A szerkezet-toxicitás összefüggések feltárása érdekében olyan alkil-éter CD származékokat szintetizáltunk, amelyek növekvő szénatomszámú alkil-csoportokkal rendelkeznek, eltérő pozíciókban. A para-szulfonáto-kalix[n]aréneket hatóanyag-komplexáló tulajdonságuk, valamint sokoldalú biológiai aktivitásuk miatt széles körben tanulmányozták már, azonban a paracelluláris anyagtranszportra gyakorolt hatásuk ezidáig még nem volt ismert. A sejtéletképességi és hemolízis vizsgálatok hozzásegítettek az egyes α-CD-ek rangsorolásához, továbbá a vegyületek különböző rendszerekben mért toxikussága is összevethetővé vált. A megegyező kémiai módosításokon átesett α- és β-CD-ek biokompatibilitása rávilágított a CD-gyűrű mértének jelentőségére. Egyértelmű összefüggést fedeztünk fel a toxicitás és a szabad hidroxil-csoportok száma között. A hosszú alkil-csoporttal rendelkező CD-ek rossz oldékonysága további kémiai módosításokat tett szükségszerűvé; a szulfát csoportok jelenléte jótékony hatással volt az oldhatóságra, és a citotoxicitásra is. A szulfatálás a kalixarének oldékonyságát is növelte. A C4S és C8S vegyületek növelték a paracelluláris felszívódás mértékét szubtoxikus koncentrációban, azonban a C6S nem mutatott hasonló hatást. Ezen eredmények további kérdéseket vetnek fel a pontos hatásmechanizmusról. Eredményeink rávilágítanak a makrociklusok szerkezetének és biokompatibilitásának összefüggéseire, valamint ezen ismeretek fontosságára annak érdekében, hogy minden formulációban a legbiztonságosabb segédanyagok legyenek alkalmazhatóak

Une méthode de purification du C5, en quatre étapes, permet d'obtenir C5, C3 et H. La présence des sites hydrophobes dans C5 est mise en évidence. La localisation de ces sites est réalisée par digestion par la trypsine et analysé par électrophorèse bidimensionnelle. Par chromatographie hydrophobe, trois fragments sont isolés et caracterisés. La comparaison des compositions de ces fragments et des degrés d'hydrophobicité permet de localiser les sites hydrophobes dans le fragment alpha-2 de la chaîne peptidique alpha

Les fetidines 40 et 45, lipoglycoproteines du liquide coelomique de l'annelide oligochete eisenia fetida andrei, de masse moleculaire 40 et 45 kda, ont ete purifiees en chromatographie sur resine echangeuse d'anions a partir du liquide coelomique dialyse. Elles sont toujours hemolytiques apres purification, agissant sur les membranes d'hematies de mouton en formant des pores de diametre compris entre 1,9 et 2,6 nm. La lyse d'une cellule est provoquee par la fixation de 22000 molecules de fetidine, apres reconnaissance d'un recepteur lipidique comportant au minimum quatre lipides differents (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, sphingomyeline et cholesterol) et un ou plusieurs autres lipides de nature differente tels que des glycolipides. Elles ont une activite bactericide vis a vis de pathogenes pour le ver mais egalement pour l'homme ou les agrumes. Elles presentent en outre une activite peroxydase. Les activites hemolytique et antibacterienne (bacteriostatique) se retrouvent aussi au niveau de la proteine recombinante non glycosylee qui correspond a un adnc clone dans escherichia coli, adnc correspondant lui-meme a un gene de eisenia. Hormis ces activites, la proteine recombinante presente un nombre important d'acides amines aromatiques comme les fetidines, un site peroxydase et un site consensus de n-glycosylation (les fetidines sont des n-glycoproteines). Cette glycosylation protege les fetidines contre l'action des proteases. Le sequencage partiel de la fetidine 40 montre qu'elle correspond a la proteine recombinante. Excepte le degre de glycosylation, rien d'autre ne differencie actuellement la fetidine 40 de la fetidine 45

Certaines thérapies faisant appel à des anticorps sont confrontées aux problèmes de risques pathogènes transmissibles ou d’inefficacité. Les anticorps polyclonaux anti-Rhésus D humains utilisés dans la prévention de l’allo-immunisation fœto-maternelle (AIFM) RhD, présentent parfois un risque infectieux, d’allergie ou d’hypersensibilité. Les anticorps anti-tumoraux ont montré peu d’efficacité à cause de la faible immunogénicité des cellules cancéreuses et la sur expression des protéines régulatrices du complément. L’efficacité du système immunitaire peut être améliorée en augmentant l’immunogénicité des cellules cibles. Nous proposons un nouveau concept qui vise à augmenter le recouvrement des cellules cibles par des anticorps grâce à la déviation des immunoglobulines post-vaccinales antitétaniques attirées sur une grappe d’antigènes tétaniques. Une telle amplification devrait permettre la destruction des cellules par les systèmes effecteurs de l’immunité humorale (CDC) et / ou cellulaire (ADCC). L’outil de ciblage et destruction des cellules est basé sur des protéines recombinantes bifonctionnelles. Ces molécules présentent deux entités : une fonction de ciblage par un anticorps dirigé contre un antigène de surface spécifique de la cellule cible (anti-Glycophorine A (GPA), anti-RhD ou anti-antigène carcino-embryonnaire (ACE)) et une entité immunogène d’antigènes tétaniques. L’assemblage des deux entités est assuré par le système multimérisant de la C4 Binding Protein (C4BP). Nous avons réussi à montrer dans un premier temps la faisabilité du concept de ciblage et destruction des cellules par déviation de la réponse immune vaccinale sur un modèle de GR à forte densité antigénique. Nous avons par la suite validé in vitro ce concept sur GR RhD dans la perspective de la prévention de l’AIFM RhD à l’aide d’hétéromultimères ciblant l’antigène RhD. Finalement, l’application de notre concept par ciblage de l’ACE a permis la destruction des cellules cancéreuses dans un modèle d’inhibition de développent tumoral chez les souris nude.

L’homéostasie du fer est régulée par l’hepcidine, peptide hyposidérémiant d’origine essentiellement hépatique, qui agit par inhibition de l’absorption intestinale du fer et de son recyclage par les macrophages. Ce travail propose de mettre en évidence l’intérêt d’une approche du rôle et de la régulation de l’hepcidine en pathologie, à partir de sa quantification dans la circulation. Après une mise point du dosage par spectrométrie de masse en tandem et une validation dans des modèles pathologiques chez l’homme et la souris, nous avons étudié les anomalies du métabolisme du fer dans plusieurs pathologies. Dans un modèle murin d’obésité, nous avons montré qu’une augmentation de l’hepcidine circulante due à la contribution du tissu adipeux permet d’expliquer les phénotypes décrits chez l’homme, une carence martiale et/ou une surcharge en fer, tout en ouvrant la perspective d’une nouvelle voie de régulation. Cependant une diminution de l’absorption intestinale en fer serait en partie indépendante de l’hepcidine. Chez des patients atteints de maladie de Gaucher, l’absence de modulation de l’hepcidine sérique, malgré une hyperferritinémie fréquemment observée, a révélé une séquestration locale de fer. Enfin, la variation des taux d’hepcidine sérique dans un modèle murin d’hémolyse chronique selon le fond génétique a permis d’illustrer l’impact de l’hepcidine circulante sur le phénotype de surcharge martiale. Au travers de ces différentes applications nous avons montré comment la quantification de l’hepcidine sérique peut aider à la compréhension d’anomalies de l’homéostasie du fer chez l’homme et l’animal
Iron homeostasis is regulated by hepcidin, a negative iron regulator peptide, mainly produced by hepatocytes, which acts by inhibiting the intestinal iron absorption and its recycling by macrophages. This work proposes to highlight the interest of approach to the role and regulation of hepcidin in pathology, from its quantification in blood. After developing a tandem mass spectrometry assay and validating it in human and mice disease patterns, we studied iron metabolism disorders in several pathologies. In a mouse model of obesity, we showed that an increase of circulating hepcidin due to the adipose tissue contribution helps explaining phenotypes described in humans, iron deficiency and / or iron overload, while opening the prospect of a new regulatory pathway. However a decrease in intestinal iron absorption is partly independent of hepcidin. In Gaucher disease patients, the absence of modulation in serum hepcidin despite frequently high ferritinemia observed, revealed a local iron sequestration. Finally, the change in serum hepcidin levels in a chronic hemolysis mouse model, according to the genetic background, has illustrated the impact of circulating hepcidin on iron overload phenotype. Through these different applications we showed how quantification of serum hepcidin may help understanding iron homeostasis abnormalities in humans and animals

Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité cellulaire (transports d’ions et de nutriments, transduction de signal, interaction cellule-cellule). Afin de les étudier, ces protéines doivent être produites in vitro. La production classique de ces protéines membranaires intégrales dans des microorganismes présente de nombreuses difficultés liées à leur structure complexe mais aussi à des problèmes de toxicité, empêchant la production de nombre d’entre elles. En outre, pour être produites efficacement, ces protéines ont besoin d’un environnement amphiphile. Dans cette thèse, afin de pallier à ces difficultés, nous avons d’une part utilisé un système d’expression protéique acellulaire, non affecté par la physiologie des cellules vivantes. En outre, nous avons choisi de les intégrer dans des bicouches lipidiques planes reconstituées artificiellement. Dans une première partie, nous avons mis au point l’intégration d’une protéine membranaire intégrale formant un pore, l’alpha hémolysine, dans une bicouche lipidique supportée. Certaines protéines nécessitant un espace plus important de part etd’autre de la membrane, nous avons, dans une seconde partie, développé une bicouche lipidique espacée et ancrée par fusion de liposomes sur des surfaces d’or. Nous démontrons qu’il est possible d’y incorporer des protéines membranaires de type Aquaporine Z sous certaines conditions. Dans une troisième partie, dédiée à la formation de membranes biomimétiques utilisant des molécules lipidiques provenant d’Escherichia coli, nous montrons que la modification de la composition membranaire ne semble pas avoir d’incidence sur l’incorporation de protéines. Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des premiers essais d’insertion de protéines membranaires, de type alpha hémolysine, dans des bicouches suspendues afin de montrer que ces protéines produites par le système d’expression acellulaire sont fonctionnelles
Integral membrane proteins play an essential role in the cell integrity preservation (transport of nutrients and ions, signal transduction, cell-cell interaction). In order to study these proteins, they have to be produced in vitro. Classical production of integral membrane proteins in microorganisms present many difficulties associated with their complex structure and also toxicity problems, preventing production of many of them. Moreover, to be efficiently produced, these proteins require an amphiphilic environment. In order to overcome these difficulties, we used a cell-free protein expression system, unaffected by the physiology ofliving cells. In addition, we chose to integrate them into artificial planar lipid bilayers. In a first part, we have developed the integration of an integral membrane protein forming a pore, the alpha hemolysin, in a supported lipid bilayer. Some proteins require more space on each side of the membrane, therefore in a second part, we have developed a tethered lipid bilayer membrane by liposome fusion on gold surfaces. We demonstrate that it is possible to incorporate membrane protein Aquaporin Z under certain conditions. The third part is dedicated to the formation of biomimetic membranes using lipid molecules from Escherichiacoli, we show that the membrane composition do not affect the protein incorporation. Finally, we have tested alpha hemolysin membrane proteins insertion in suspended lipid bilayers membranes to show that these proteins produced by the cell-free expression system are functional

Le comportement de la membrane de l'hématie et en particulier la mesure de sa résistance osmotique présente un intérêt diagnostique pour le clinicien. De nombreuses pathologies hémolytiques influencent considérablement cette résistance (maladies hémolytiques auto-immunes, sphérocytose héréditaire,). Quelques appareils commercialisés permettent d'étudier les propriétés rhéologiques de la membrane, mais aucun ne réalise spécifiquement la mesure de la résistance des membranes jusqu'à leur rupture. Actuellement seule la technique manuelle proposée par DACIE est utilisée en routine par les laboratoires d'analyses médicales. Dans ce travail, il est développé un appareil (fragilimètre) destiné à la mesure de la résistance des membranes à l'hémolyse provoquée. Le principe consiste à faire évoluer progressivement la force ionique, de 0,154 M à environ 0,025 M d'une suspension d'hématies diluées dans une solution tampon. La variation de pression osmotique engendrée au niveau de la cellule provoque l'ouverture de pores par lesquels s'échappe l'hémoglobine. La mesure en temps réel de l'intensité de transmission lumineuse traversant une solution de sang total diluée renseigne sur le phénomène. Les résultats obtenus renseignent directement sur la résistance de la membrane qui est considérée optiquement comme une particule diffusante. La détermination de la transmission initiale, à 50% et totale permet d'apprécier les caractéristiques de l'hémolyse. Les études ont porté principalement sur l'analyse d'échantillons de sang témoins frais à 37°C et incubé 24 h à 37°C. Les résultats des valeurs obtenues sur ces 2 populations permettent au système de les distinguer aisément. L'expérience, entièrement automatisée, est réalisée en moins de 20 min.

Le globule rouge est une cellule simple avec l’une des fonctions les plus importantes de l’organisme : participer aux échanges gazeux et fournir l’oxygène aux tissus. C'est un disque biconcave hautement élastique grâce à un réseau de protéines du cytosquelette et de protéines membranaires spécifiques. La fonction, ainsi que la structure des globules rouges sont altérées dans plusieurs pathologies humaines telles que les hémoglobinopathies et les anomalies de membrane. La drépanocytose est une maladie héréditaire génétique caractérisée par une hémoglobine anormale qui polymérise en conditions hypoxiques provoquant la déformation des globules rouges circulants. La drépanocytose se caractérise également par une anémie hémolytique chronique et des crises vaso-occlusives douloureuses dues à l'obstruction des capillaires.Dans le but de mieux comprendre les mécanismes responsables des manifestations cliniques, nous avons étudié les propriétés mécaniques et adhésives des globules rouges de patients atteints de drépanocytose en évaluant 1) l'impact de contraintes mécaniques répétées sur la survie des globules rouges à l'aide d'un appareil microfluidique qui mime la microcirculation et 2) le rôle du stress oxydant dans l'activation des protéines d'adhérence érythroïde.Nous avons conçu une puce microfluidique et montré que le stress mécanique est un paramètre critique sous-jacent à l'hémolyse intravasculaire dans la drépanocytose et que des taux intracellulaires élevés d'hémoglobine fœtale préviennent cette lyse. Outre ces résultats, nous avons constaté que le traitement à l'hydroxyurée protège les globules rouges de la lyse lors d'un stress mécanique, même en l'absence d'expression de l'hémoglobine fœtale. D'autre part, nous avons étudié la structure et la fonction de la protéine d'adhérence érythroïde Lu/BCAM dans des conditions oxydantes en utilisant des approches biochimiques et d'imagerie. Nous avons observé que le stress oxydant active la fonction adhésive de Lu/BCAM par des modifications post-traductionnelles qui modifient sa distribution membranaire. Nous décrivons un nouveau mécanisme qui affecte les interactions en cis de Lu/BCAM à la surface cellulaire et qui pourraient expliquer l'adhérence anormale des globules rouges à la laminine en l'absence d'événements de phosphorylation.En conclusion, nous avons développé un modèle microfluidique reproduisant les dimensions physiologiques des microvaisseaux humains, permettant d’évaluer les caractéristiques cellulaires jusque-là inexplorées dans la drépanocytose. Nous montrons que le stress mécanique répété est en partie responsable de l'hémolyse chez les patients atteints d'anémie falciforme, ce qui pourrait contribuer aux niveaux élevés de stress oxydant en raison de l'hème libre dans la circulation. Nos travaux démontrent l'importance de la dimension mécanique dans l’obstruction des capillaires et la contribution critique du stress oxydant dans l'adhérence anormale des globules rouges dans cette maladie. Améliorer la déformabilité des globules rouges et cibler le stress oxydant pour inhiber l'adhérence des globules rouges serait une stratégie prometteuse pour cibler les principales caractéristiques de cette pathologie et alléger le fardeau de la maladie
The red blood cell is a simple cell with one of the most important functions in the organism, that is fulfilling the gas exchange function and delivering oxygen to the tissues. It is a highly elastic biconcave disk thanks to a network of specific skeletal and membrane proteins. The function and structure of the red cell are altered in several human pathologies like hemoglobinopathies and membrane disorders. Sickle cell disease is a genetic hereditary disorder characterized by abnormal hemoglobin that polymerizes under hypoxic conditions leading to the sickling and alteration of circulating red cells. The hallmarks of sickle cell disease are hemolytic anemia and painful vaso-occlusive crises due to the obstruction of fine capillaries.With the aim of better understanding the mechanisms behind these clinical manifestations we investigated the mechanical and adhesive properties of red blood cells from patients with sickle cell disease by assessing 1) the impact of repeated mechanical stress on red cell survival using a microfluidic device that mimic human microcirculation, and 2) the role of oxidative stress in the activation of erythroid adhesion proteins.We designed a microfluidic device that allowed us to show that mechanical stress is a critical parameter underlying intravascular hemolysis in sickle cell disease and that high intracellular levels of fetal hemoglobin protect against lysis. Furthermore, we found that treatment with hydroxyurea protects red blood cells from lysis upon mechanical stress even in the absence of fetal hemoglobin expression. On the other hand, we investigated the structure and function of the erythroid adhesion protein Lu/BCAM under oxidative conditions using biochemical and imaging approaches. We observed that oxidative stress activates the adhesive function of Lu/BCAM through post-translational modifications that alter its membrane distribution. We describe a novel mechanism that affects Lu/BCAM cis-interactions at the cell surface that might account for the abnormal adhesion of sickle red cells to laminin in the absence of phosphorylation events.In conclusion, we developed a microfluidic device replicating the physiological dimensions of human microvessels that allows assessing previously unexplored cellular characteristics in sickle cell disease. We show that repeated mechanical stress is partly responsible for hemolysis in patients with sickle cell disease, which might contribute to the high levels of oxidative stress because of free heme in the circulation. Our work demonstrates the importance of the mechanical dimension in the blockade of small capillaries and the critical contribution of oxidative stress in the abnormal adhesion of red cells in this disease. Improving red cell deformability and targeting oxidative stress to inhibit red cell adhesion would be promising strategies to target the main hallmarks of this pathology and alleviate the disease burden

Ce travail de thèse s'attache à identifier des plantes et/ou molécules à activités cytotoxique, antioxydante, anti-inflammatoire et antivirale ciblant le virus du chikungunya (CHIKV) dans le but de trouver des alternatives thérapeutiques vis-à-vis du stress oxydatif et de l'inflammation, mécanismes impliqués dans les maladies chroniques non transmissibles (diabète, obésité…), et de la maladie du chikungunya, maladie vectorielle réémergente. La première partie de ces travaux présente les résultats obtenus lors d'un criblage d'activités biologiques réalisé sur une sélection de dix-huit plantes endémiques et indigènes de La Réunion. Les activités ciblées ont été les activités cytotoxiques sur une lignée cellulaire humaine (cellules THP-1), les activités antioxydantes évaluées par un test in cellulo d'hémolyse et par quatre tests chimiques (TEAC/DPPH/FRAP/ORAC) ainsi qu'une évaluation de la teneur en composés phénoliques (test FOLIN) et les activités anti-inflammatoires testées sur des macrophages murins (cellules RAW-BlueTM). Les résultats obtenus ont permis de mettre, plus particulièrement, en évidence les activités de différents extraits : cytotoxique pour Carissa spinarum, antioxydantes pour Agarista buxifolia et Dryopteris wallichiana et anti-inflammatoire pour Stillingia lineata et Indigofera ammoxylum. La deuxième partie du travail est consacrée à l'étude phytochimique d'une espèce indigène de La Réunion, Stillingia lineata, choisie en raison des résultats obtenus lors de ce criblage biologique préliminaire et de ceux du programme Phytochik. Un fractionnement bioguidé par un test antiviral, réalisé sur des cellules Vero (cellules rénales de singe vert Cercopithecus aethiops) contaminées par le CHIKV, a conduit à l'isolement de trois macrocycles diterpéniques rares de type tonantzitlolone dont l'un présente une structure non caractérisée jusque-là, et d'un pimarane de structure nouvelle. La 4'-acétoxytonantzitlolone a été identifiée comme molécule candidate contre le CHIKV (CE50 = 7 μM). Des relations structure-activité ont pu être définies ; la présence d'un groupement oxygéné sur la chaîne latérale des tonantzitlolones semble jouer un rôle important sur la réponse antivirale de ces squelettes diterpéniques
The aims of this PhD work were to identify plants and/or molecules with cytotoxic, antioxidant, anti-inflammatory or antiviral (chikungunya virus , CHIKV) activities in order to find therapeutic alternatives towards oxidative stress and inflammation, mechanisms involved in chronic noncommunicable diseases (diabetes, obesity ...), and chikungunya disease, reemerging vector-borne disease. The first part of this work presents the results obtained from a biological screening carried out on a selection of eighteen endemic and indigenous plants of La Réunion. The targeted activities were cytotoxicity on a human cell line (THP-1), antioxidant activities evaluated using an in cellulo hemolysis assay and four chemical tests (TEAC / DPPH / FRAP / ORAC) together with an evaluation of the content of phenolic compounds (FOLIN test) and anti-inflammatory activity tested in murine macrophages (RAW cells-BlueTM). The results allowed to highlight activities of different extracts in particular : cytotoxic for Carissa spinarum, antioxidant for Dryopteris wallichiana and Agarista buxifolia and anti-inflammatory for Stillingia lineata and Indigofera ammoxylum.The second part of this work is devoted to the phytochemical study of Stillingia lineata, an indigenous species of La Réunion chosen because of the results obtained in this preliminary biological screening and those carried out in Phytochik programme. Bioassay-guided fractionation performed on Vero cells (green monkey kidney cells Cercopithecus aethiops) infected with CHIKV led to the isolation of three rare macrocycle-type diterpenes called tonantzitlolone and a new pimarane. The 4'-acetoxytonantzitlolone was identified as a candidate molecule against CHIKV (EC50 = 7 μM). Structure-activity relationships have been defined, the presence of an oxygenated group on the side chain of tonantzitlolones seems to play an important role in the antiviral response of the diterpene skeleton