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Dissertations / Theses on the topic 'Hémoprotéines'
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Bouzhir, Latifa. "Etude des hémoprotéines senseurs à oxygène bactériens FixL et Dos." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2006. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00002324.
Full textAbstract:
L'adaptation à l'environnement est essentielle pour la survie de tout organisme, des bactéries à l'Homme. Pour s'adapter rapidement aux milieux extrêmement variés et aux fluctuations environnementales, les procaryotes ont adopté des systèmes élaborés, capables de détecter et de réagir aux molécules vitales ou toxiques à leur développement. Outre les facteurs de stress tels que température, pH, la cellule doit s'adapter aux variations de concentration de nutriments et de gaz diatomiques. En effet, la modification d'un ou plusieurs paramètres de l'environnement déclenche une altération de l'expression des gènes, permettant des changements dans la composition protéique et ainsi une adaptation du métabolisme aux nouvelles conditions. Un paramètre environnemental particulièrement essentiel est le taux d'oxygène. Le passage à la vie limitée en oxygène, ou inversement, a été particulièrement étudié chez les bactéries. Celles-ci disposent de plusieurs chaînes de transporteurs d'électrons et utilisent à tout moment celle qui leur est la plus favorable sur le plan énergétique. En présence d'oxygène, accepteur d'électrons le plus favorable, les bactéries utilisent la respiration oxygènée, qui se caractérise par la synthèse d'enzymes du type cytochrome oxydase, alors qu'en absence d'oxygène ou en condition de basse pression d'oxygène (ou hypoxie), elles mettent en place la respiration par le nitrate, caractérisée par la synthèse de quinones respiratoires comme intermédiaires (Pelmont J., 1993). Le transporteur final de la voie " nitrate " est la nitrate réductase, enzyme clé inhibée par l'oxygène. La présence d'oxygène diatomique impose donc aux bactéries de profonds changements de leur métabolisme, soit parce qu'elles doivent réajuster leur système de production d'énergie, soit parce qu'elles doivent lutter contre la toxicité de l'oxygène ; pour cela elles disposent de tout un arsenal enzymatique. La connaissance des processus biochimiques par l'intermédiaire desquels ces adaptations sont réalisées est essentielle à la compréhension du fonctionnement cellulaire.
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Polack, Thomas. "Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2003. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00005255.
Full textAbstract:
Le transfert de ligands (de petites molécules telles que l'oxygène, NO, CO ou CN) dans les hémoprotéines est un processus situé au cœur de nombreuses fonctions biologiques : stockage et transport de ligands, catalyse enzymatique, ou encore détection de ligands. L'aptitude de ces protéines à accomplir leur fonction s'appuie en particulier sur leur capacité à discriminer les différents ligands et à les transférer de façon réversible de l'hème vers le solvant.<br /><br />Les différentes étapes du transfert de ligand du site de liaison, l'hème, à l'extérieur de la protéine, ont lieu sur des échelles de temps couvrant plusieurs ordres de grandeur. Notre étude concerne les premières étapes du transfert de ligand qui se déroulent à l'échelle femtoseconde. Il s'agit dans le cas de la myoglobine du passage du ligand de l'hème à un site voisin à l'intérieur de la poche de l'hème (dit docking-site). Nous accédons au transfert grâce à une sonde située dans le domaine infrarouge moyen (5 µm). Ainsi, nous sommes directement sensibles aux changements de la vibration du ligand CO au cours du transfert.<br /><br />Le temps de déphasage vibrationnel du ligand CO (1 picoseconde) est long devant la dynamique du transfert. Ceci est à l'origine d'effets de cohérence et interdit, aux temps courts, une interprétation simple des expériences de transmission résolues spectralement. Afin de s'affranchir de ces effets, nous avons mis en place et utilisé deux méthodes complémentaires. Dans une première configuration expérimentale, la transmission de l'échantillon est intégrée spectralement, l'obtention du signal faible a nécessité une détection d'une grande sensibilité. Dans une deuxième configuration, nous accédons à la vibration du ligand au cours du transfert par la détection homodyne du champ émis par le ligand au cours du transfert. Cette approche originale de détection du champ émis a nécessité la stabilisation en phase d'une séquence d'impulsions infrarouge.<br /><br />Nous avons développé une fonction de réponse non-stationnaire qui décrit la réponse de l'échantillon et permet la simulation de ces deux types d'expériences. Nous présentons également une représentation spectro-temporelle originale de la réponse non-stationnaire.<br /><br />Nous avons mené des expériences sur la myoglobine, une hémoprotéine qui est un système de référence pour l'étude du transfert de ligand. Dans cette protéine, nos expériences de transmission différentielle intégrée spectralement ont permis d'observer une diminution progressive de la force d'oscillateur du ligand au cours du transfert. Cette interprétation est confirmée par des simulations basées sur un modèle phénoménologique. De façon surprenante, cette variation de force d'oscillateur ne suit pas le changement quasi-instantanée de la fréquence vibrationnelle. A notre connaissance, il s'agit de la première observation d'une diminution progressive de la force d'oscillateur vibrationnelle suite à la rupture d'une liaison chimique. Corrélée à la distance hème-ligand, cette force d'oscillateur est potentiellement une sonde du transfert de ligand.
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Lai-Thi, Thanh-Lan. "Propriétés physico-chimiques et structurales de deux hémoprotéines de cyanobactérie thermophile." Thesis, Paris 11, 2015. http://www.theses.fr/2015PA112187/document.
Full textAbstract:
La photosynthèse permet de convertir l’énergie solaire en énergie chimique. Ce processus met en jeu un grand nombre de protéines et complexes protéiques. Le premier complexe de la chaîne photosynthétique est le photosystème II où a lieu l’oxydation de l’eau. Le PSII est composé des protéines D1 et D2. Chez la cyanobactérie thermophile Thermosynechococcus elongatus, il y a trois gènes qui codent trois protéines D1 différentes. La première partie de la thèse décrit le développement d’outils protéomiques basés sur les gels d’électrophorèse 2D pour étudier le protéome des trois différents variants, qui expriment chacun une seule protéine pour D1. Peu de différences ont été trouvées. Toutefois, un seul des variants exprime Tll0287. La deuxième partie de la thèse décrit la caractérisation de Tll0287 avec différents techniques : spectroscopies d’absorption UV-visible ou de résonance Raman et spectro-électrochimie. Tll0287 a été identifié comme un cytochrome de type c, mais il présente beaucoup de caractéristiques inattendues. Les spectres d’absorption UV-visible et de résonance Raman de Tll0287 réduit montrent une dépendance vis-à-vis du pH. Deux formes d’hèmes sont présents dans chacun des états oxydé et réduit. Un changement du ligand cystéine a été observé quand l’hème est réduit. Les titrages redox présentent de multiples potentiels à pH 10 et pH 5. Tll0287 peut fixer une molécule de CO à pH 7,6. Ces caractéristiques suggèrent que Tll0287 pourrait être une protéine senseur. De plus, la structure cristallographique montre que Tll0287 n’a pas un repliement classique d’un cytochrome de type c mais celui d’une protéine senseur. Les mutants de délétion du gène tll0287 ont été construits et aideront à comprendre la fonction de ce nouveau cytochrome. La troisième partie décrit l’étude de PsbV2 : un autre cytochrome de type c. Afin d’obtenir en quantité suffisante la protéine pour permettre sa caractérisation, elle a été surexprimée dans un système homologue en utilisant le promoteur de l’enzyme de la rubisco. Le potentiel redox de PsbV2 a été déterminé, comme étant très bas, inférieur à -460 mV (vs SHE, pH 5). Le spectre d’absorption UV-visible de la forme réduite a été caractérisé. La structure cristallographique de PsbV2 a été résolue et a révélé une cystéine comme ligand axial et un repliement proche de celui de cytochromes connus de T.elongatus. Bien que Tll0287 et PsbV2 présentent une cystéine comme ligand axial, leurs structures et leurs propriétés physico-chimiques suggèrent que leurs fonctions sont bien différentes. Une contribution majeure de cette thèse est la caractérisation d’un nouveau senseur à hème de type c chez les cyanobactéries et le développement d’outils nécessaires pour son étude<br>Photosynthesis converts solar energy into chemical energy. This process involves a large number of proteins and protein complexes. The first protein complex in the photosynthetic chain is Photosystem II within the oxidation of water takes place. PSII is composed of the D1 and D2 proteins. In the thermophile cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus, three genes encoded three different D1 proteins. The first part of this thesis describes the development of proteomics tools based on 2D gel-electrophoresis to study the proteome of three different variants, each expressing a single different D1 protein. Very few differences were found. However, only one expressed the protein Tll0287. The second part of the thesis describes the characterization of Tll0287. It was characterized using different techniques: electronic absorption and Raman resonance spectroscopies and spectro-electrochemistry. Tll0287 has been previously identified as a c-type cytochrome, but it presents some unexpected characteristics. The UV-visible absorption and Raman resonance spectra of reduced Tll0287 show a pH dependence. The reduced and oxidized states each had two different forms of the heme. A switch of ligands from a cysteine to histidine was observed in the reduced state. Redox titration showed multiple midpoints at pH 10 and 5. Tll0287 was shown to fix a CO molecule at pH 7.6. These physical properties suggested that Tll0287 could be a sensor. The crystallographic studies reveal that Tll0287 does not have a classical c-type cytochrome fold and is similar to other known sensor proteins, strengthening the hypothesis that it is a sensor. Deletion mutants were constructed that will help to better understand the function of this new cytochrome. The third part describes a study of the PsbV2, another c-type cytochrome. In order to obtain sufficient quantities to carry out characterization of this protein, it was overexpressed in a homologous system using the promotor of the rubisco enzyme. The redox midpoint potential of PsbV2 was found to be very low, below -460 mV (vs SHE, pH 5). The UV-visible absorption spectrum of the reduced form was determined. The crystallographic structure of PsbV2 was solved and reveals an axial cysteine ligand. Although both Tll0287 and PsbV2 share this feature, their different structures and physico-chemical properties suggest that their functions are unlikely to be similar. A major contribution of this thesis is the characterization of a new c-type cytochrome sensor in cyanobacteria and the development of proteomic tools required to study it
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Kariyawasam, Bowithanthri Kalani. "Nouvelles métalloenzymes artificielles obtenues par couplage covalent de complexes métalliques dans une protéine naturelle (Xylanase A) et dans des protéines artificielles (αReps) Functionalized Artificial Bidomain Proteins Based on an α‑Solenoid Protein Repeat Scaffold: A New Class of Artificial Diels−Alderases Recent advances in the field of artificial hemoproteins: New efficient eco-compatible biocatalysts for nitrene-, oxene- and carbene-transfer reactions Artificial iron hydrogenase made by covalent grafting of Knölker’s complex into xylanase: Application in asymmetric hydrogenation of an aryl ketone in water A new artificial hemoprotein with inducible peroxidase- and monooxygenase-like activities". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2019. http://www.theses.fr/2019SACLS518.
Full textAbstract:
Dans un contexte de développement durable, les enzymes sont des outils biologiques puissants pour catalyser des réactions avec de très grandes efficacités et spécificités. Inspirée des enzymes et de la catalyse organométallique, l’élaboration de métalloenzymes artificielles émerge depuis plusieurs années comme une stratégie de choix pour fournir aux chimistes de nouveaux biocatalyseurs, en accord avec les principes de la chimie verte. Elles sont construites par l’insertion par interactions supramoléculaires ou couplage covalent, d’un ion ou d’un complexe métallique au sein d’une protéine, qui leur apporte un environnement hydrophobe protecteur et chiral. Lors de cette thèse, plusieurs métalloenzymes artificielles ont été construites par couplage covalent de complexes métalliques dans deux protéines hôtes, qui sont la Xylanase A (Xln) et les protéines artificielles de la famille des Reps. Dans un premier temps, une hydrogénase artificielle a été construite dans le mutant XlnS212C par ancrage covalent d’un complexe de fer appelé complexe de Knölker. L’hydrogénase artificielle obtenue, XlnS212CK, s’est avérée capable de catalyser l’hydrogénation par transfert d’hydrure de la trifluoroacétophénone, TFAC, sans excès énantiomérique. Dans un second temps, quatre Diels-Alderases artificielles ont été construites à partir de la protéine bidomaine (A3_A3’) de la famille des αReps. Les deux meilleures Diels-Alderases, qui ont conduit respectivement au meilleur rendement et la meilleure énantiosélectivité dans la réaction de l’azachalcone sur le cyclopentadiène, ont été élaborées respectivement par fixation covalente de complexe de cuivre de ligands phénanthroline et terpyridine dans un mutant F119C de A3_A3’ : (A3_A3’)F119Phen-Cu(II) et (A3_A3’)F119Terpy-Cu(II). Finalement, une nouvelle hémoprotéine artificielle a été construite par couplage covalent de la méso-tétraphénylporphyrine de manganèse Mn(III)TPP-NHMal dans le mutant (A3_A3’)Y26C. L’hémoprotéine artificielle formée BH MnTPP seule ne montre aucune activité catalytique pour l’oxydation de co-substrats par H2O2. Cependant, de manière inattendue, l’addition d’imidazole et d’une autre protéine αRep, bA3-2, qui se fixe de manière spécifique sur A3_A3 et provoque son ouverture, permet non seulement de déclencher l’activité peroxydase de BH MnTPP, mais également une activité monooxygénase qui catalyse la sulfoxydation du thioanisole par H2O2. Il s’agit du premier exemple décrit à ce jour de métalloenzyme artificielle dont l’activité peut être induite par la fixation d’une protéine partenaire<br>In a context of sustainable development, enzymes are powerful biological tools to catalyze reactions with very high efficiencies and specificities. Inspired by enzymes and organometallic catalysis, the development of artificial metalloenzymes has emerged for several years as a strategy of choice to provide the chemists with new biocatalysts, in accordance with the principles of green chemistry. They are constructed by the insertion by supramolecular interactions or covalent coupling of an ion or a metal complex within a protein, which provides them with a protective and chiral hydrophobic environment. In this thesis, several artificial metalloenzymes were constructed by covalent coupling of metal complexes into two host proteins, Xylanase A (Xln) and artificial proteins of the Reps family. Initially, an artificial hydrogenase was constructed in the XlnS212C mutant by covalent anchoring of an iron complex known as the Knölker complex. The artificial hydrogenase obtained, XlnS212CK, was found to be capable of catalyzing hydride hydrogenation of trifluoroacetophenone, TFAC, without enantiomeric excess. In a second time, four artificial Diel-Alderases were constructed from the bidomain protein (A3_A3') of the αReps family. The two best Diels-Alderases which led respectively to the best yield and the best enantioselectivity in the reaction of azachalcone on cyclopentadiene were developed respectively by covalent attachment of copper complex of phenanthroline and terpyridine ligands in a mutant F119C of A3_A3' (A3_A3')F119Phen-Cu (II) and (A3_A3')F119 Terpy-Cu (II). Finally, a new artificial hemoprotein was constructed by covalent coupling of the manganese meso-tetraphenylporphyrin Mn(III)TPP-NHMal in the (A3_A3')Y26C mutant. The artificial hemoprotein formed BH-MnTPP alone shows no catalytic activity for the oxidation of co-substrates by H2O2. However, unexpectedly, the addition of imidazole and another αRep protein, bA3-2, which binds specifically to A3_A3’ and causes it to be opened, not only triggers the BH-MnTPP peroxidase activity but also a monooxygenase activity which catalyzes the sulfoxidation of thioanisole by H2O2. This is the first example described to date of artificial metalloenzyme whose activity can be induced by the attachment of a partner protein
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Cianetti, Simona. "Dynamic regulation of proteins involved in nitric oxide signal transduction." Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066195.
Full text
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Salard-Arnaud, Isabelle. "Les NO-Synthases bactériennes: caractérisations spectroscopiques et biochimiques : Etude d'un mutant." Paris 5, 2008. http://www.theses.fr/2008PA05S009.
Full textAbstract:
Chez les mammifères, le monoxyde d'azote joue un rôle essentiel dans un grand nombre de processus. Il est synthétisé par des hémoprotéines appelées NO-Synthases qui catalysent l'oxydation de la L-arginine. Le séquençage des génomes bactériens a permis de caractériser des gènes codant pour des protéines homologues aux domaines oxygénases des NOS de mammifères : les « NOS bactériennes ». Leurs rôles biologiques et leur implication dans le caractère pathogène de ces bactéries ne sont pas encore établis. Nous avons étudié les propriétés spectroscopiques de trois NOS bactériennes ainsi que leurs propriétés catalytiques vis-à-vis des substrats endogènes des NOS de mammifères et de N-alkyl hydroxyguanidines. Enfin, nous avons étudié le phénotype d'une souche de Staphylococcus aureus délétée du gène codant pour la NOS. Notre étude a permis de mieux caractériser ces nouvelles protéines et de mettre en évidence les analogies et les différences entre NOS de mammifères et de bactéries<br>Mammalian nitric oxide synthases (NOS) are heme-thiolate proteins that catalyse the oxidation of L-arginine to citrulline and nitric oxide. Recent genomes sequencing revealed that genes related to the oxygenase domain of mammalian NOSs exist in some gram-positive prokaryotes. Despite many studies, the role and biological function of these prokaryotic NOSs remain unclear. We have performed a spectroscopic study of these new heme-protems using UV-visible and EPR spectroscopy, and investigated their in vitro reactivity towards several substrates including L-arginine and hydroxyguanidines. Our studies reveal analogies and differences between mammalian and bacterial nitric-oxide synthases
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Ventalon, Catherine. "Ascension vibrationnelle dans les hémoprotéines à l'aide d'impulsions infrarouges à dérive de fréquence." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2003. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00000964.
Full textAbstract:
La compréhension des réactions biochimiques qui se d'eroulent au sein des protéines est un enjeu fondamental de la biologie actuelle. Dans ce travail, nous nous sommes principalement intéressés aux premières étapes de ces réactions, qui se produisent à l'échelle de la centaine de femtosecondes. Traditionnellement, l'étude de ces premières étapes se fait à l'aide d'impulsions ultracourtes dans le domaine visible ou ultraviolet : ces impulsions font passer la molécule sur un état électronique excité, ce qui permet de déclencher la réaction étudiée de manière ultrarapide et très efficace. Dans ce travail, nous avons exploré une nouvelle voie d'excitation des molécules biologiques : nous avons utilisé des impulsions infrarouges, de manière à placer l'énergie directement dans les vibrations de la molécule. Cette technique permet théoriquement d'explorer la surface de potentiel de la protéine loin de sa région harmonique, et même d'approcher l'état de transition de la réaction catalysée par la protéine. Pour communiquer le plus d'énergie possible à la molécule, nous avons utilisé des impulsions infrarouges intenses et à dérive de fréquence qui permettent de gravir efficacement l'échelle vibrationnelle considérée. Dans une première étape, nous avons engendré des impulsions infrarouges intenses dont l'énergie est de quelques microjoules et le spectre s'étend sur 170 cm−1 environ. Nous avons ensuite caractérisé ces impulsions par diverses méthodes : nous avons notamment mesuré leur phase spectrale au moyen d'une technique HOT SPIDER, ce qui constitue la première mesure de phase spectrale autoréférencée pour des impulsions centrées autour de 10 μm. Dans une seconde étape, nous avons utilisé ces impulsions infrarouges pour exciter la vibration d'une molécule de CO liée à la myoglobine, puis à l'hémoglobine. Dans ce dernier cas, nous avons démontré l'ascension vibrationnelle de la molécule de CO jusqu'au 7ème niveau excité : nous avons ainsi réalisé la première expérience d'ascension vibrationnelle dans une molécule biologique ou plus généralement dans une macromolécule. Cette technique d'excitation nous a permis d'obtenir des données spectroscopiques nouvelles sur la carboxy-hémoglobine telles que la position et la largeur des raies d'absorption des différentes transitions vibrationnelles, les temps de vie des niveaux excités ainsi que la presence d'une anharmonicité électrique importante.
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Hijazi, Ismail. "Coordination de l'oxygène moléculaire par des hèmes de synthèse." Rennes 1, 2010. http://www.theses.fr/2010REN1S087.
Full textAbstract:
Ce travail de thèse concerne la synthèse et l’étude de la relation structure/activité de modèles biomimétiques de 2 hémoprotéines : La cytochrome c oxydase (CcO) pour l’activation du dioxygène : nous avons synthétisé des modèles bioinspirés de cette enzyme, possédant différents substituants de type phénol afin de mimer le groupement OH de la Tyrosine 244 (Tyr244) présent dans la CcO. L’influence de ces substitutions sur l’affinité pour le dioxygène a été étudiée. Cependant nous n’avons pas pu établir de corrélation entre l’activité catalytique (réduction à 4 électrons de l’oxygène moléculaire) des modèles et le type de substituant en position para du phénol. La myoglobine pour le transport (coordination réversible) de l’oxygène : nous avons conçu une série de ligands possédant des groupes de type acide carboxylique en position apicale afin de vérifier l’hypothèse de Pauling selon laquelle le complexe oxygéné est stabilisé par une liaison hydrogène. Ainsi l’effet de tels substituants sur l’affinité pour l’O2 à été évalué. La présence d’une liaison hydrogène entre l’O2 et un groupement carboxylique de nos modèles est fortement suspectée. Dans les deux séries, nous avons obtenu des complexes oxygénés stables et caractérisés notamment par RMN, UV, IR, RX et RPE<br>This thesis work concerns the synthesis and the study of the structure/activity relation of biomimetic models of 2 natural hemoproteins : cytochrome c oxidase (CcO) for the activation of dioxygen : We have synthesized bioinspired models of this enzyme, with different substitutions in para position of a phenol group to mimic the OH group of tyrosine 244 (Tyr244) present in CcO. The influence of these substitutions on the dioxygen affinity has been studied. However, no evidence for a correlation between structure and catalytic activity (4e- reduction of dioxygen) was found. Myoglobin as dioxygen carrier (reversible binding of dioxygen) : we have designed a series of ligands with carboxylic acid groups in apical position to verify the hypothesis of Pauling according to which the oxygen adduct is stabilized by a hydrogen bond. Thus the effect of such substitution on the affinity for O2 was evaluated. Both the structural study of several models and the measured dioxygen affinities strongly suggest a hydrogen bond between O2 and a carboxylic group. In both series, stable dioxygen adducts were prepared and characterized by NMR, UV, IR, RX, including EPR
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Ventalon, Cathie. "Ascension vibrationnelle dans les hémoprotéines à l'aide d'impulsions infrarouges intenses à dérive de fréquence." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2004. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00008323.
Full textAbstract:
La compréhension des réactions biochimiques qui se déroulent au sein des protéines est un enjeu fondamental de la biologie actuelle. Dans ce travail, nous nous sommes principalement intéressés aux premières étapes de ces réactions, qui se produisent à l'échelle de la centaine de femtosecondes. Traditionnellement, l'étude de ces premières étapes se fait à l'aide d'impulsions ultracourtes dans le domaine visible ou ultraviolet : ces impulsions font passer la molécule sur un état électronique excité, ce qui permet de déclencher la réaction étudiée de manière ultrarapide et très efficace.<br />Dans ce travail, nous avons exploré une nouvelle voie d'excitation des molécules biologiques : nous avons utilisé des impulsions infrarouges, de manière à placer l'énergie directement dans les vibrations de la molécule. Cette technique permet théoriquement d'explorer la surface de potentiel de la protéine loin de sa région harmonique, et même d'approcher l'état de transition de la réaction catalysée par la protéine. Pour communiquer le plus d'énergie possible à la molécule, nous avons utilisé des impulsions infrarouges intenses et à dérive de fréquence qui permettent de gravir efficacement l'échelle vibrationnelle considérée.<br /><br />Dans une première étape, nous avons engendré des impulsions infrarouges intenses dont l'énergie est de quelques microjoules et le spectre s'étend sur 170 cm-1 environ. Nous avons ensuite caractérisé ces impulsions par diverses méthodes : nous avons notamment mesuré leur phase spectrale au moyen d'une technique de HOT SPIDER temporel, ce qui constitue la première mesure de phase spectrale autoréférencée pour des impulsions centrées autour de 10 µm. <br /><br />Dans une seconde étape, nous avons utilisé ces impulsions infrarouges pour exciter la vibration d'une molécule de CO liée à la myoglobine, puis à l'hémoglobine. Dans ce dernier cas, nous avons démontré l'ascension vibrationnelle de la molécule de CO jusqu'au 7ème niveau excité : nous avons ainsi réalisé la première expérience d'ascension vibrationnelle dans une molécule biologique ou plus généralement dans une macromolécule. Cette technique d'excitation nous a permis d'obtenir des données spectroscopiques nouvelles sur la carboxy-hémoglobine telles que la position et la largeur des raies d'absorption des différentes transitions vibrationnelles, les temps de vie des niveaux excités ainsi que la présence d'une anharmonicité électrique importante.
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Ventalon, Catherine. "Ascension vibrationnelle dans les hémoprotéines à l' aide d' impulsions infrarouges intenses à dérive de fréquence." Palaiseau, Ecole polytechnique, 2003. http://www.theses.fr/2003EPXX0059.
Full text
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Gélinas, Stéphanie. "Caractérisation des complexes oxygénés générés par l'oxyde nitrique synthase inductible (INOS)." Thesis, Université Laval, 2007. http://www.theses.ulaval.ca/2007/24681/24681.pdf.
Full text
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Ruzié, Christian. "Nouvelles porphyrines synthétiques pour la coordination du dioxygène." Rennes 1, 2005. http://www.theses.fr/2005REN1S014.
Full textAbstract:
Les études réalisées au cours de ce travail concernent le développement de modèles biomimétiques de la myoglobine. L'influence sur l'affinité pour le dioxygène de substitutions sur les fonctions amine primaire de la tren greffée sur la porphyrine a été évaluée à partir d'un modèle de porphyrine tonnelle présentant une affinité et une stabilité remarquable pour le dioxygène. La stabilité des complexes oxygénés de deux dérivés a été déterminée en milieu protique. La réactivité de nanomatériaux silylés incorporant nos modèles a été évaluée. Une porphyrine fonctionnalisable sur les deux faces a été synthétisée. Son caractère bifonctionnalisable a été démontré. Une approche originale sur l'atropoisomère A2B2 de la TAPPH2 a permis d'accéder à des composés mixtes comportant une base axiale intramoléculaire et une protection de la face distale. La convergence de la synthèse a été montrée permettant d'accéder à de nouveaux modèles de la myoglobine. La stabilité et l'affinité des complexes de fer ont été déterminées.
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Lo, Mamadou. "Vers des modèles génériques d’hémoprotéines : cas de cytochrome c oxydase." Strasbourg, 2009. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2009/LO_Mamadou_2009.pdf.
Full textAbstract:
Le travail décrit dans ce manuscrit est consacré à la synthèse de modèles génériques d’hémoprotéines multifonctionnels obtenus à partir d'une porphyrine à anse phénanthroline. Deux nouveaux modèles de cytochrome c oxydase résultant des ces modèles génériques ont été préparés par introduction de deux bras pyridiniques en positions distale et proximale. L’étude à l’état solide d’un des complexes de zinc a révélé un environnement pentacoordiné proximal autour de l’atome de zinc. Cette géométrie pentacoordinée a également été observée, à l’aide de la RPE, avec les complexes correspondants de fer(III). Des études parallèles en UV-visible et RMN du proton ont permis de montrer que les complexes de fer(II), obtenus par réduction chimique, présentent une géométrie hexacoordinée autour de l’ion ferreux. Il a pu être montré que la fixation d'oxygène moléculaire nécessite une occupation préalable du bras pyridine en position distale. L’étude de la fixation de l’oxygène sur nos édifices a été effectuée en réduisant soit le complexe de fer(III) hexacoordiné avec le N-méthylimidazole soit le complexe binucléaire [fer(III) pentacoordiné - cuivre(I)]. Finalement, il a été démontré que les performances électrocatalytiques en réduction à 4 électrons de l'oxygène moléculaire augmente avec l'affinité des complexes ferreux pour l'oxygène gazeux<br>The work described in this manuscript is devoted to the synthesis of multifunctional hemoproteins generic models obtained from phenanthroline-strapped porphyrin. Two models of cytochrome c oxidase resulting from these generic models were prepared by attaching two pyridines arms at the distal and proximal positions. The solid state study of one zinc complex showed a proximal pentacoordinated environment around the zinc atom. This pentacoordinated geometry was also observed by EPR in the corresponding iron(III) complex. UV-visible and proton NMR studies of the iron(II) complex, obtained by chemical reduction, revealed a hexacoordinated geometry around the ferrous ion. It was shown that oxygen binding required prior occupation of a distal pyridine arm. The oxygen binding study on our compounds was carried out by reducing the hexacoordinated iron(III) complex with Nmethylimidazole or the binuclear [iron(III) pentacoordinated-copper(I)] complex. Finally, it was shown that the electrocatalytic performance in 4-electron reduction of molecular oxygen increased with the affinity of the ferrous complex for oxygen gas
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Marboutin, Laure. "Etude des interactions protéine-métal par spectroscopie infrarouge dans le domaine des basses fréquences." Aix-Marseille 2, 2006. http://www.theses.fr/2006AIX22071.
Full textAbstract:
L'analyse de complexes d'une hémoprotéine (MP8) par spectroscopie infrarouge (IR-TF) de différence couplée à l'électrochimie a permis d'identifier dans l'IR moyen (1800-1000 cm-1) des bandes IR sensibles à l'état redox du fer, spécifiques de l'hème, du peptide et des deux ligands axiaux imidazole et histidine. L'adaptation de l'appareillage optique a permis d'obtenir pour la première fois des spectres IR-TF de différence pour des métalloprotéines en solution dans le domaine de l'IR lointain (1000-50 cm 1), où sont détectées les vibrations métal-ligands. L'étude dans l'IR lointain de la superoxyde dismutase et des complexes de la MP8 a permis d'attribuer les premiers modes de vibrations métal-ligands IR pour une métalloprotéine redox. Les fréquences IR de ces modes sont directement corrélées à la force des liaisons et offrent un outil expérimental fin pour l'analyse des propriétés des sites métalliques qui contrôlent la réactivité de nombreuses métalloprotéines<br>Structural changes accompanying the change in the redox state of the iron in various complexes of MP8, a model for hemoproteins, were studied by FT-IR difference spectroscopy coupled to electrochemistry in the mid-IR (1800-1000 cm-1). We identified IR redox heme markers, sensitive to the electronic or coordination state of the iron. The specific IR bands of the two axial ligands imidazole and histidine allowed us to provide the first direct determination of their pKa. We also modified the IR set-up to record spectra with redox metalloproteins in the far IR domain (1000-50 cm-1), wherein metal-ligand vibrations are expected to contribute. For the first time, we identified metal-ligand vibration in hemoproteins and in superoxide dismutase. The IR bands frequencies are highly dependent on the bond strength and offer a useful experimental tool to study the properties of metallic active sites that control the reactivity of various metalloproteins
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Melin, Frédéric. "Synthèse de porphyrines à anse phénanthroline : Nouveaux modèles de cytochrome C oxydase." Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2005. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2005/MELIN_Frederic_2005.pdf.
Full textAbstract:
Ce travail décrit la mise au point de nouveaux modèles du site actif bimétallique (fer-cuivre) de la cytochrome c oxydase, à partir d’une porphyrine superstructurée à anse phénanthroline synthétisable à l’échelle du gramme en peu de temps. L’originalité de ce système réside dans le fait que le site de coordination prévu pour le cuivre (phénanthroline) et la porphyrine sont maintenus dans une géométrie contrôlée. Quelques informations importantes sur la cytochrome c oxydase (structure, mécanisme postulé pour la réduction tétraélectronique du dioxygène qu’elle catalyse) sont regroupées en début de mémoire. Les principaux modèles structuraux et fonctionnels de la littérature, et les études physicochimiques réalisées au laboratoire sur la porphyrine à anse phénanthroline sont aussi rappelés. La suite du manuscrit décrit en détail les évolutions synthétiques réalisées pour essayer de corriger les défauts de base de la porphyrine à anse phénanthroline. Une méthode de fonctionalisation de la porphyrine a été développée et nous a permis d’obtenir une série de nouveaux composés, différant du système initial par l’encombrement de la porphyrine, l’incorporation d’imidazoles ou leur solubilité. Il a été suggéré que la coordination proximale du système naturel (un résidu Histidine) est importante pour la catalyse et doit donc être reproduite dans les modèles. C’est pourquoi une part importante de ce mémoire est consacrée à l’étude par UV/Visible, RMN, et RPE de la coordination des imidazoles substitués ou non avec les composés synthétisés et métallés au zinc(II) et fer(III). Les structures en phase solide de trois complexes d’inclusion d’imidazoles dans ces édifices ont été obtenues. La dernière partie de ce mémoire est consacrée aux études électrochimiques de l’efficacité de ces composés comme catalyseurs de la réduction du dioxygène. Une très bonne sélectivité vis-à-vis du mécanisme à 4 électrons est obtenue avec les modèles à imidazoles incorporés et métallés au fer(III) seul<br>This work describes the development of new models of the bimetallic active site (Fe-Cu) of cytochrome c oxidase based on a superstructurated phenanthroline-strapped porphyrin that is rapidly available on a gram scale. In this original system, the coordination site chosen for copper (phenanthroline) and the porphyrin are maintained in a controlled geometry. The most important features of cytochrome c oxidase (structure, postulated mechanism for the four electron reduction of molecular oxygen) are described in the first part of this report. The main models from the literature and the previously available analytical studies of the phenanthroline-strapped porphyrin are also presented. The synthetic evolutions carried out in order to correct the shortcomings of the starting edifice are discussed in the following parts of this manuscript. A synthetic strategy for the functionalisation of the phenanthroline-strapped porphyrin has been developed, giving access to a series of new compounds. In some of these compounds, the steric hindrance around the porphyrin has been increased; others carry built-in imidazoles, and for one of them, the solubility in organic solvents has been enhanced. The proximal coordination of the natural system (one Histidine) is known to have a strong influence on catalytic efficiency. Therefore, this type of coordination has been reproduced in our models. One important part of this report describes the UV/Visible, NMR and EPR studies of the coordination of imidazoles to zinc(II) or iron(III) porphyrins. The solid-phase structures of three inclusion compounds of imidazoles in our edifices are also presented. The efficiency of our compounds in the reduction of molecular oxygen is discussed in the last part of this report. The electrocatalytic studies have shown that the iron(III) compounds with built-in imidazoles selectively catalyse the four electron reduction of molecular oxygen
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Jabbour-Abdelnour, Jamal. "Modification de la structure et de l'activité peroxydase des hémoprotéines modèles lors de l'interaction avec les solvants organiques." Compiègne, 1998. http://www.theses.fr/1998COMP1098.
Full textAbstract:
L'effet des solvants organiques miscibles à l'eau sur l'activité peroxydase est étudie avec trois hémoprotéines : la peroxydase de raifort HRP, l'hémoglobine bovine Hb (transporteur d'oxygène) et la microperoxydase MP-11 (undécapeptide) provenant de la digestion du cytochrome C (transporteur d'électrons). Les résultats montrent que tous les solvants utilisés dénaturent la HRP. L'éthylène glycol active l'Hb, tandis que l'éthanol, le 1- propanol, le 1-butanol et l'acétone la dénaturent. L'acétonitrile active l'Hb et la MP-11, l'activation du MP-11 est plus important. L'éthanol active la MP-11 et le 1-propanol n'a pas d'effet dénaturant sur celle-ci. Les spectres de différence montrent qu’à forte concentration de solvants, les molécules de ce dernier réagissent avec le fer de l'hème de l'Hb. Ces spectres montrent que l'éthanol réagit avec l'environnement du fer de l'hème de la MP-11. Le changement de l'environnement de l'Hb se traduit par changement de sa conformation et de ses propriétés fonctionnelles. IMAC met en évidence un changement d'exposition des résidus histidine à la surface de l'Hb induit par les solvants.
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Fournier, Clémence. "Etude du système Hxu d'acquisition de l'hème de l'hémopexine de Haemophilus influenzae." Paris 7, 2010. http://www.theses.fr/2010PA077182.
Full textAbstract:
Haemophilus influenzae est une bactérie à Grain négatif dont l'hôte unique est l'homme. Elle est responsable de nombreuses infections, notamment les méningites et otites moyennes de l'enfant. Une des particularités de cette bactérie est qu'elle a un besoin essentiel en hème exogène: elle ne possède pas les enzymes nécessaires à la biosynthèse de la protoporphyrine IX qui est le précurseur direct de l’ hème. H. Influezae dort donc subvenir à ces besoins en hème en utilisant les sources d'hème présentes dans son environnement. Cette bactérie étant majoritairement extracellulaire, les sources d'hème qu "elle rencontre sont les hémoprotéines du sérum : l'hémoglobine relâchée après hémolyse, l’hémoglobine-haptoglobine, l’hémopexine. H. Influemae a développé des systèmes lui permettant d'acquérir l’hème lié à ces hémoprotéines. Le système étudié ici est le système Hxu (Hemopexin utilization) qui permet à la bactérie d'acquérir et d'utiliser l’hème de l’hérnopexme. L'hémopexine est une hémoprotéine du sérum qui possède une très forte affinité pour l'hème (Kd < 10-13M-1). Le travail effectué a permis de reconstituer le système Hxu dans des souches d’ Escherichia coli auxotrqphes pour l’hème qui deviennent alors capables d'utiliser l'hème de l'hémopexine. Pour cette activité, le complexe TonB d’Haemophilus est indispensable, ainsi que la présence des trois protéines du système. L'étude du système a permis d'établir un nouveau mécanisme d'acquisition de l’hème de l’hémopexine ; l'interaction entre HxuA et l’hémopexine induit un relarguage de l’hème de l’hémopexine dans le milieu<br>Pathogens and commensals Gram-Negative bacteria have evolved different Systems to acquire iron and heme from hemoproteins. These involve specific receptors located in the outer membrane. Haemophilus influenzae is a Gram-negative bacterium that has an absolute requirement for exogenous heme, as it does not possess the enzymes necessary for the heme biosynthetic pathway except for the last one. It can in particular acquire heme from the serum glycoprotein, hemopexin, that has a very high affinity for heme, via the HxuCBA System. HxuC is a TonB dependent outer membrane receptor; it eau acquire free heme but needs HxuB and Hxu A to acquire heme from hemopexin. HxuB and HxuA are the two components of a TPS system (two partner secretion), The HxuCBA System, has been functionally reconstituted in E, coli where it allows the acquisition of heme from hemopexin. Tins activity is strictly dependent of the presence of H. Influenzae TonB complex in the bacterium. HxuA and a variant of HxuA protein, which is released in the medium, were purified and we showed that they can restore the acquisition of heme from hemopexin in a hxuA mutant of H. Influenzae and in a E. Coli. Strain that only expresses the HxuC receptor. We showed by various experiments that HxuA and hemopexin form a 1:1 stoechiometric complex. The affinity of HxuA for apo and holo-hemopexin was determined and is in the nanomolar range. When the complex between HxuA and holo-hemopexin is formed heme changes environment and seems to be released from hemopexin. It therefore allows an exogenous heme/hemophore receptor to utilize heme from hemopexin. In this work, we describe a new mechanism of heme acquisition from a hemoprotein
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Lechauve, Christophe. "Relations structurales et fonctionnelles des hémoprotéines hexacoordinées : les globines de vertébrés, neuroglobine et cytoglobine, et la protéine senseur bactérienne, EcDos." Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066484.
Full textAbstract:
La neuroglobine (Ngb) et la cytoglobine (Cygb) sont deux protéines, découvertes chez les vertébrés, qui adoptent une un repliement de type globine. La Ngb est cytoplasmique et exprimée dans les tissus nerveux alors que la Cygb est cytoplasmique (parfois nucléaire) et ubiquitaire. EcDos est une hémoprotéine senseur directe de l’oxygène de Escherichia coli qui adopte un repliement de type PAS. Ces trois protéines présentent un hème hexacoordiné par un résidu distal : histidine (Ngb et Cygb) et méthionine (EcDos). L’hexacoordination est réversible car le résidu distal peut être déplacé pour libérer le site de liaison et permettre la fixation d’un ligand externe. Chez ces protéines l’affinité pour les ligands externes est fortement dépendante de leurs structures. Nous avons montré que la Cygb et EcDos en solution sont respectivement monomériques et dimériques. Chez la Cygb, la liaison de l’O2 et du CO, est couplée à l’état redox des cystéines impliquées dans la formation d’un pont disulfure intrachaîne. Chez EcDos, les propriétés dynamiques de la Met dépendent de l’état de ligation, de l’interface entre les sous-unités et de la présence du domaine enzymatique, et de plus, l’interaction entre les sous-unités est à l’origine d’une liaison coopérative de l’O2. Ces hémoprotéines présentent une affinité pour l’O2 analogue (1-70 mmHg) leur permettant d’assurer la liaison avec l’O2 dans les cellules. Enfin, l’étude de la Ngb nous a permis de montrer une forte interaction de charge avec la protéine prion et une co-localisation de ces protéines dans les cellules ganglionnaires de la rétine. Ces résultats nous ont amenés à postuler un rôle de la Ngb comme chélateur de la protéine prion
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Didier, Amandine. "Modèles biomimétiques de la cytochrome c oxydase appliqués à la réduction du dioxygène en eau." Rennes 1, 2002. http://www.theses.fr/2002REN10085.
Full textAbstract:
Ce travail s'inscrit dans le cadre de la chimie biomimétique. Il rapporte les synthèses et les études spectroscopiques et électrochimiques de modèles du site actif de la cytochrome c oxydase, enzyme catalysant le réduction du dioxygène exclusivement en eau. Plusieurs familles de molécules ont été élaborées : trois générations de porphyrines à cage tripodale et deux à piquets aromatiques. Nous avons confirmé sur des familles structurellement très différentes que les dérivés monométalliques de fer présentaient une activité séléctive de réduction du dioxygène. Leurs analogues bimétalliques fer-cuivre présentent systématiquement une activité passant par des processus mixtes. La présence d'une base azotée proximale intramoléculaire n'est pas indispensable pour l'obtention d'un catalyseur biomimétique. Un cycle catalytique faisant intervenir un ntermédiaire de type hydroperoxo, plutôt que l'espèce de type m-peroxo, a été postulé. Enfin, une dernière série de modèles a été envisagée, il s'agit de modèles structuraux dérivés des porphyrines ± tonnelles α présentant un piquet fonctionnalisé susceptible de mimer la triade histidine/ tyrosine/ CuB présente au niveau du site distal de l'ion cuivre.
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Decroos, Christophe. "Synthèse et évaluation métabolique de sondes moléculaires destinées à l'Oxymétrie et l'imagerie in vivo par résonance paramagnétique électronique." Paris 5, 2011. http://www.theses.fr/2011PA05S001.
Full textAbstract:
La concentration en O2 est un paramètre physiologique primordial. L'oxymétrie in vivo est importante pour l'aide au diagnostic, au traitement et au pronostic dans le cas du cancer. L'oxymétrie par RPE repose sur l'utilisation de sondes radicalaires dont la largeur du signal est directement proportionnelle à la concentration en O2. Les radicaux persistants tris-(p-carboxyltétrathiaaryl)méthyle (TAM) possèdent les propriétés requises pour être utilisés comme sondes oxymétriques. Cependant, aucune donnée sur le métabolisme de ces composés utilisés in vivo n'était disponible au début de notre travail. Nous avons étudié leur réactivité et leur métabolisme in vitro. Nous avons montré que les radicaux superoxyde et alkylperoxyle oxydent ces radicaux en quinone-méthides par un mécanisme de décarboxylation oxydative spécifique d'oxydants à trois électrons. En présence de microsomes hépatiques, il se forme deux métabolites: le triarylméthane par réduction et la quinone-méthide par oxydation impliquant les cytochromes P45O et leur réductase. Les peroxydases en présence d'hydroperoxyde transforment les TAM en quinone-méthide avec la formation intermédiaire du cation triarylméthyle TAM+. Ce cation TAM+ est réactif vis-a-vis de divers nucléophiles d'importance biologique en formant des adduits covalents. Enfin, nous avons developpé une nouvelle méthode générale d'accès à de nouveaux derivés TAM non symétriques par réaction entre le cation TAM+ et différents nucléophiles (ipso-substitution nucléophile aromatique dépendant d'une décarboxylation oxydative). Nos résultats ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement de sondes plus stables utilisables in vivo<br>O2 concentration is an essential physiological parameter. In vivo oximetry might be helpful for the diagnosis, the prognosis, as well as for the treatment in the case of cancer. EPR oximetry is based on the use of paramagnetic probes the linewidth of which is directly proportional to O2 concentration. Persistent tris(p-carboxyltetrathiaaryl)methyl (TAM) radicals have required properties to be used as EPR oximetry probes. However, at the beginning of our work, no data was available about the metabolism of these probes used in vivo. We studied their reactivity and their metabolism in vitro. We showed that superoxide and alkylperoxyle radicals efficiently oxidize these radicals to the corresponding quinone-methide by an oxidative decarboxylation mechanism, specific of three electron oxidants. In the presence of hepatic microsomes, two major metabolites are formed: the triarylmethane by reduction and the quinone-methide by oxidation, involving cytochromes P45O and their reductase. Peroxydases in the presence of hydroperoxide catalyze the oxidation of TAM into the quinone-methide with the intermediate formation of the trityl cation TAM+. This cation TAM+ appeared to be reactive toward biological nucleophiles by forming covalent adducts. Finally, we also developed a new general method to access to new dissymetric TAM radicals through a reaction between trityl cation TAM+ and various nucleophiles (ipso-nucleophilic aromatic substitution coupled to an oxidative decarboxylation). Our results offer new perspectives for the development of stable probes for in vivo use
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Zambolin, Silvia. "Etudes fonctionnelles et structurales du système HXU d'acquisition de l'hème de l'hémopexine chez Haemophilus influenzae." Sorbonne Paris Cité, 2015. http://www.theses.fr/2015USPCC171.
Full textAbstract:
Haemophilus influenzae est une bactérie à Gram-négatif dont l'hôte unique est l'homme. Etant auxotrophe pour l'hème, elle présente à la membrane externe de nombreux systèmes lui permettant d'acquérir l'hème lié aux hémoprotéines humaines. Le système étudié ici est le système Hxu (Hemopexin utilization), qui permet l'acquisition de l'hème de l'hémopexine. Le système Hxu est composé d'un récepteur de membrane externe HxuC, et d'une protéine HxuA sécrétée par son partenaire HxuB. Des études précédentes ont montré que HxuA forme des complexes à très haute affinité avec l'hémopexine et que l'hème est relargué suite à cette interaction, devenant disponible pour le récepteur HxuC. Au cours de cette thèse, afin d'étudier du point de vue structural l'acquisition de l'hème par le système Hxu, un variant soluble de la protéine HxuA, appelé HxuAdm, a été purifié et cristallisé. La structure cristallographique de HxuAdm a été obtenue à une résolution de 1. 6Å: elle représente la première structure pleine longueur d'une protéine TpsA (Two Partner Secretion A) à avoir été résolue. En utilisant différentes techniques, notamment Microscopie Électronique en Transmission, Calorimétrie Isotherme de Titration (ITC) et Chromatographie, il a été démontré que HxuA interagit seulement avec le domaine N-terminal de l'hémopexine. Le complexe HxuA-NterF-Ipx a ensuite été cristallisé, et sa structure résolue à 2. 8Å. L'étude détaillée de la structure d'HxuA en complexe comparé avec celle de HxuA libre a permis de proposer un mécanisme d'éjection de l'hème de l'hémopexine. Le mécanisme a été validé avec la construction de mutants de HxuA, dont l'un a été cristallisé en complexe avec l'hème-hémopexine<br>Haemophilus influenzae is a gram-negative bacterium whose unique host is human. Being heme auxotroph, it displays at the outer membrane several systems that allow it to acquire heme from human hemoproteins. Here we studied the Hxu system, which allows heme acquisition from hemopexin. The Hxu system is made up of an outer membrane receptor HxuC and the "Two partner secretion" mates HxuB and HxuA. Previous studies showed that HxuA makes very high affinity complexes with hemopexin and that heme is discharged from hemopexin upon formation of the complex, becoming available for the receptor HxuC. With the purpose of studying from a structural point of view heme acquisition from hemopexin, we purified and crystallized a soluble variant of HxuA, called HxuAdm. HxuA structure was obtained at 1. 6Å resolution. It represents the first full-length structure of a TpsA (Two partner secretion A) to have been solved. With a combination of different techniques, including Transmission Electron Microscopy, Isothermal Titration Calorimetry and Chromatography, we showed that HxuA interacts only with the N-terminal domain of hemopexin (NterHpx). The complex between HxuA and NterHpx was then crystallized and its structure solved at 2. 8 Å resolution. Comparison between the structures of free and hemopexin-bound HxuA led us to propose a mechanism of heme ejection from hemopexin. The mechanism was validated with the construction of HxuA mutants, one of which was crystallized in complex with heme-hemopexin
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Turbis, Karine. "Caractérisation des variants R100 et D191 de la protéine de dégradation de l'hème ChuS." Master's thesis, Université Laval, 2015. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27237.
Full textAbstract:
ChuS est une protéine provenant d'une bactérie pathogène de l'humain qui a la capacité de lier et de dégrader l'hème de l'hôte pour en libérer le fer nécessaire à la croissance bactérienne. Deux résidus potentiellement importants du site actif, l'arginine 100 (R100) et l'acide aspartique 191 (D191) ont été investigués afin de mieux comprendre leur rôle dans la catalyse par ChuS. Nos résultats révèlent que le résidu D191 n'est pas essentiel à l'activité catalytique, mais qu'il est important pour la stabilité du complexe entre l'enzyme et l'un de ses substrats (hème) alors que le résidu R100 est absolument essentiel à l'activité catalytique. Nos études cinétiques et spectroscopiques détaillées fournissent des informations qui permettent de mieux comprendre le mécanisme catalytique de ChuS. Elles aident ainsi à obtenir une meilleure compréhension des voies d'acquisition de l'hème comme source de fer chez les bactéries pathogènes et à définir de nouvelles cibles thérapeutiques.
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Aublin, Johanne Treuffet. "Transfert de ligand dans la cytochrome c oxydase observé par des expériences femtosecondes infrarouge intégrées et résolues spectralement." Palaiseau, Ecole polytechnique, 2006. https://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00002200.
Full text
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Popescu, Razvan Alexandru. "Dynamique Moléculaire de la petite molécule au biopolymère : une Porphyrine modèle du site actif des hémoprotéines et une Calciprotéine, la Nereis diversicolor Sarcoplasmic calcium binding protein." Paris 6, 2004. http://www.theses.fr/2004PA066270.
Full text
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Moreau, Magali. "Etude du mécanisme d'oxydation des guanidines par les no-synthases. Recherche de nouveaux précurseurs de No." Paris 5, 2005. http://www.theses.fr/2005PA05S014.
Full textAbstract:
Le monoxyde d'azote, NO, est un messager cellulaire important chez les mammifères. Il est sythétisé par oxydation de la L-arginine, catalysée par des enzymes appelés NO synthases (NOS). Dans les situations physiopathologiques correspondant à un déficit de NO, une stratégie serait de mettre au point des substrats exogènes de NOS. Dans un premier temps, nous avons pu montrer que des guanidines simples pouvaient être substrats de la NOS inductible. Dans une seconde partie, nous avons montré l'influence de la nature de la guanidine sur le découplage des électrons et la production d'espèces activées de l'oxygène. Des études de cinétique rapide, spectroscopies Raman de résonance et infrarouge nous ont permis de proposer des mécanismes différents pour les étapes de transfert proto-électron dans le processus d'activation de l'oxygène, dependant de la nature de la guanidine. Enfin, nous avons muté un résidu valine du site acftif et montré son importance pour la transformation et la reconnaissance des composés non-aminoacides. En conclusion notre étude a permis de caractériser de nouvelles molécules pour l'étude du mécanisme des NOS qui pourraient aussi être de nouveaux outils pharmacologiques pour l'étude de pathologies associées à des dysfonctionnements des NOS<br>Nitric oxide (NO) is an importnat signal molecule in mammalian systems and is produced via the oxidation of L-arginine, a reaction catalyzed by enzimes known as NO synthases (NOS). To adress physipathological conditions associated with NO deficiency, a strategy is to identify exogenous substrates for NOS. For the forst time, we demonstrated that simple guanidines could serve as substrates for inducible NOS. Secondly , we showed the influenceof guanidine on electron decoupling and on the production of recative oxygen species. Studies using stopped-flow kinetics, infrared and resonance Raman spectroscopy enabled us to propose differential mechanisms for the electron- and proton- transfer steps in the NOS-dependent, oxygen-activation process, contingent upon the guanidine derivative. Finally, using NOS mutant constructs, modified in one Valine residue at the active site, we revealed the importance of active site structure in the transformation and recognition of non-aminoacid compositions. In conclusion, our research has led to the characterization of novel molecules useful for studying mechanisms of NOS and that could also serve as novel pharmacological tools in studies associated with NOS dysfunction
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Vorburger, Pauline. "Variations autour d'une porphyrine à anse phénanthroline : un site distal dynamique." Phd thesis, Université de Strasbourg, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00754973.
Full textAbstract:
L'objectif de ce travail est l'obtention de mimes efficaces d'hémoprotéines telles le cytochrome P450, la myoglobine ou la cytochrome c oxydase, grâce à des variations synthétiques autour d'une porphyrine à anse phénanthroline (Porphen). Un nouveau modèle de cytochrome c oxydase a plus particulièrement été analysé ici. Il est préparé par substitution des deux positions meso d'une Zn-Porphen. Des phénomènes dynamiques ont été observés et étudiés par RMN 1H, mettant en évidence la présence d'atropoisomères et la coordination-décoordination de la pyridine proximale sur le zinc. Le remplacement du zinc par du fer a ensuite permis l'étude de la coordination d'un sixième ligand exogène dans un site distal dynamique. L'évolution de la géométrie du complexe a été suivie par spectrophotométrie UV-Visible et RPE. En présence de ligands azotés de type midazoles, il se forme dans tous les cas des complexes [1 récepteur/ 1 substrat]. La forte affinité de notre modèle pour le dioxygène a été montrée à la fois par spectrophotométrie UV-Visible, RMN 1H et par résonance Raman. Que ce soit en UV-Visible ou en RMN, la réversibilité du dioxygène a été montré par son remplacement par du CO. La souplesse de cette nouvelle architecture a été mise en évidence, par l'observation d'une relative flexibilité lors des études par spectroscopie IR de la fixation de CO dans le site distal. Cette adaptabilité est également à l'origine d'un comportement assez surprenant en électrochimie, où la réduction du fer(III) et l'oxydation du cuivre(I) en présence de O2 sont facilitées. En électrocatalyse, la réduction de O2 par ce nouveau modèle de cytochrome c oxydase n'est pas facilitée en terme de potentiel, mais efficace quant à la contribution d'un mécanisme à 4 électrons.
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Yoo, Byung-Kuk. "Investigation of the mechanisms of regulations, activation, and deactivation of Guanylate Cyclase, the endogenous NO-receptor, and NO-sensors." Palaiseau, Ecole polytechnique, 2010. https://theses.hal.science/docs/00/59/58/14/PDF/Thesis_YOO.pdf.
Full textAbstract:
Le récepteur endogène du NO, la guanylate cyclase (sGC) est l'objet de thèse. Cette enzyme synthétise le GMPc après fixation du NO. L'outil principal utilisé est la spectroscopie d'absorption résolue en temps picoseconde-nanoseconde. Nous avons montré que la fixation simultanée du CO et d'activateurs (YC-1, Bay 41-2272) induisent un hème 5c-CO, à l'instar du NO seul, expliquant l'activation synergique. Nous avons identifié toutes les étapes de l'interaction sGC-NO en mesurant la dynamique du NO de la picoseconde à la seconde. Cette dynamique dans la protéine entière est comparée à celle de la sous-unité beta (1-190) isolée et celle de senseurs de NO bactériens. Un mutant de la myoglobine (H93C) à été utilisé comme modèle pour l'étude de l'hème dans les états 4- et 5-coordonnés. Enfin, nous avons mesuré la variation d'absorption dans la bande III de la Mb et Hb pour mesurer le mouvement du Fer de l'hème aprés fixation du NO. Nous avons cherché un inhibiteur potentiel et un ligand endogène de la sGC<br>The endogenous NO receptor, soluble guanylate cyclase (sGC) is the subject of this thesis. This enzyme synthesizes cGMP after NO binding. The main tool used is time-resolved picosecond-nanosecond absorption spectroscopy. We have shown that the simultaneous binding of CO and activators (YC-1, Bay 41-2272) induce a 5c heme-CO, like NO, explaining the synergistic activation. We identified all steps of the sGC-NO interaction by measuring the dynamics from picosecond to second. This dynamics of the entire protein is compared with that of the isolated beta subunit (1-190) and bacterial NO sensors. A myoglobin mutant (H93C) was used as a model for the study of heme in the 4- and 5-coordinated states. Finally, we measured the band III absorption of Mb and Hb to measure the movement of the heme iron after NO binding. We also investigated a potential inhibitor and an endogenous ligand of sGC
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Wu, Xiaojing. "Contribution to the Development of Advanced Approaches for Electron and Molecular Dynamics Simulations in Extended Biomolecules." Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2018. http://www.theses.fr/2018SACLS252/document.
Full textAbstract:
Cette thèse porte sur deux projets visant au développement de nouvelles approches pour simuler les dynamiques moléculaire et électronique avec application à des biomolécules étendues. Dans la première partie nous cherchons à améliorer significativement la précision des simulations des propriétés rédox des protéines. Dans ce contexte, l'objectif est de recourir à de champ de force reposant sur une description multipolaire des interactions électrostatiques (AMOEBA) pour estimer les potentiels redox d'hémoprotéines. Nous avons dérivé des paramètres pour AMOEBA afin de décrire précisément les interactions électrostatiques avec l'hème. Une amélioration très encourageante est obtenue par rapport aux champs de forces standard. Le second projet vise à développer de nouvelles méthodes pour étudier la dynamique des électrons dans des biomolécules à l'échelle attoseconde en incluant les effets d'environnement. Nous avons conçu un couplage original entre la théorie de la fonctionnelle de la densité dépendant du temps (RT-TDDFT) et un modèle de mécanique moléculaire polarisable (MMpol). Une implémentation efficace et robuste de cette méthode a été réalisée dans le logiciel deMon2k. L'utilisation de techniques d'ajustements de densités électroniques auxiliaires permet de réduire drastiquement le coût de calcul des propagations RT-TDDFT/MMpol. La méthode est appliquée à l'analyse de la dissipation d'énergie dans l'environnement d'un peptide excité par un impulsion laser<br>This thesis involves two projects devoted to the development of advanced approaches for simulating molecular and electron dynamics in extended biomolecules. The first project aims at significantly improving the accuracy of redox potentials of proteins by numerical simulations. A sophisticated force field relying on a multipolar description of electrostartic interactions (AMOEBA) is used to perform molecular dynamics simulations onheme proteins. We derived parameters for AMOEBA to accurately describe electrostatic interactions with hemein both ferrous and ferric states. Very encouraging improvements are obtained compared to the standard force fields. The second project aims at developing original approaches for simulating ultrafast electron dynamics in biomolecules in contact to polarizable environments. We devised acombination of Real-time Time-Dependent Density Functional Theory (RT-TDDFT) and polarizable Molecular Mechanics (MMpol). An efficient and robust implementation of this method has been realized in deMon2k software. Density fitting techniques allow to reduce the computational cost of RT-TDDFT/MMpol propagations. The methodology is applied to understand the mechanisms of energy dissipation of a peptide excited by a laser pulse
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Vieille, Thibault. "Applications des impulsions femtosecondes infrarouges : façonnage programmable et spectroscopie bidimensionnelle." Palaiseau, Ecole polytechnique, 2014. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-01077034/document.
Full textAbstract:
La mise au point des lasers femtosecondes, en particulier dans le moyen-infrarouge, a ouvert une voie d’étude des systèmes biologiques, où les couplages et les fluctuations impliquent des déphasages ultra-rapides. Ce travail participe à l’élaboration d’outils pour l’étude de systèmes vibrationnels, ici la carboxy-hémoglobine HbCO. L’approche du contrôle optimal, d’une part, détermine empiriquement le profil optimal d’une impulsion en vue d’un objectif, nécessitant la programmation d’impulsions de formes arbitraires. Nous avons étudié un prototype d’une technologie acousto-optique de façonnage d’impulsions infrarouges, le Dazzler, conçu par la société FASTLITE. Pour cela, une méthode adaptée de mesure du champ, effectuant la mesure homodyne d’une réplique de l’impulsion dans le domaine visible, a été mise au point. Puis, la production et la mesure d’impulsions infrarouges de formes complexes comprenant un saut de phase spectrale, ont été réalisées, montrant l’adéquation du Dazzler pour des expériences de contrôle cohérent dans les hémoprotéines. D’autre part, la spectroscopie multidimensionnelle mesure la réponse non-linéaire d’un échantillon, constituant un outil puissant d’étude de la surface de potentiel. Un spectromètre bidimensionnel a donc été finalisé, qui combine une géométrie simplifiée, une excellente résolution, une procédure d’auto-calibration itérative et précise, et une solution simple pour éliminer la principale source de bruit. Des mesures de la fonction de corrélation à deux temps de la fréquence de résonance du CO ont enfin été comparées à des résultats préliminaires issus d’avancées théoriques récentes, montrant un accord prometteur pour leur validation<br>Mid-infrared femtosecond lasers have recently provided a new tool to study complex ultrafast dynamics, especially in biological systems such as hemeproteins. Using these lasers, two kind of powerful experiments can be planned. The first type contains optimal control experiments, in which the principle is to find the optimal shape of a pulse in order to reach one desired final state. This approach requires a way to produce an arbitrary shape of pulses, so in a first part we have worked on a new kind of linear programmable acousto-optic pulse-shaper called Mid-infrared Dazzler, which is produced by the company FASLITE. For this sake, we have implemented a new method to measure weak mid-infrared pulses with complex shapes, based on the homodyne detection of a replica of the mid-infrared field into the visible domain. Then, we have produced and measured shaped pulses which exhibit complex shapes like pi-steps in the spectral phase. This demonstrates the ability of the Dazzler to be used in optimal control experiments with hemeproteins. The second type of experiments contain the multidimensional coherent spectroscopy experiments, which are powerful tools to probe ultrafast dynamics since the principle is to measure the complete non-linear response function, which permits to disentangle the different microscopic informations. We have finalized the building of an innovative two-dimensional spectrometer, which exhibits a simple geometry, an excellent spectral resolution in both axes, an iterative and very precise self-calibration method, and a simple and efficient trick to remove the signal from scattering. Our first measurements of the Frequency-frequency correlation function of the CO vibration bound to Hemoglobin shows a promising agreement with recent progress in the modelization of ultrafast fluctuations
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Yoo, Byung-Kuk. "Etude des mécanismes de la régulation, activation et désactivation de la guanylate cyclase, récepteur endogène du monoxyde d'azote, et de senseurs de NO." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2010. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00557106.
Full textAbstract:
Le récepteur endogène du NO, la guanylate cyclase (sGC) est l'objet de thèse. Cette enzyme synthétise le GMPc après fixation du NO. L'outil principal utilisé est la spectroscopie d'absorption résolue en temps picoseconde-nanoseconde. Nous avons montré que la fixation simultanée du CO et d'activateurs (YC-1, Bay 41-2272) induisent un hème 5c-CO, à l'instar du NO seul, expliquant l'activation synergique. Nous avons identifié toutes les étapes de l'interaction sGC-NO en mesurant la dynamique du NO de la picoseconde à la seconde. Cette dynamique dans la protéine entière est comparée à celle de la sous-unité beta (1-190) isolée et celle de senseurs de NO bactériens. Un mutant de la myoglobine (H93C) à été utilisé comme modèle pour l'étude de l'hème dans les états 4- et 5-coordonnés. Enfin, nous avons mesuré la variation d'absorption dans la bande III de la Mb et Hb pour mesurer le mouvement du Fer de l'hème aprés fixation du NO. Nous avons cherché un inhibiteur potentiel et un ligand endogène de la sGC.
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Pujol, Manon. "Ingénierie de métalloenzymes pour la catalyse abiologique." Electronic Thesis or Diss., Aix-Marseille, 2023. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/230310_PUJOL_718skm30lico606bv439mbsvs_TH.pdf.
Full textAbstract:
Dans un contexte de développement durable, l’industrie se tourne vers des procédés qui respectent les principes de la chimie verte (ex: remplacement des catalyseurs chimiques par des enzymes). Cependant, beaucoup de réactions industrielles n’existent pas dans la nature et plusieurs protéines héminiques ont alors été modifiées pour les catalyser. A côté, seules quelques enzymes non héminiques dépendantes du fer et une protéine à cobalt ont été décrites pour les transferts de carbènes et nitrènes alors que d'autres métaux les catalysent. Nous avons cherché à réorienter l'activité d'une classe de métalloenzymes à cuivre, les lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), afin de développer des biocatalyseurs les réactivités abiologiques. Pour cela, la sphère de coordination du cuivre de la LPMO SmAA10 a été modulée par mutagenèse pour créer de nouveaux motifs de coordination. Les mutants ont été caractérisés puis évalués sur leur capacité à catalyser des réactions non-naturelles. De bonnes activités ont été obtenues pour certaines transformations (ex : réarrangement de Doyle-Kirmse). Ces activités étant similaires à celle du cuivre en solution, nous nous sommes demandé si les réactions étaient catalysées au site actif des enzymes. En nous concentrant sur le réarrangement de Doyle-Kirmse, nous avons montré que la LPMO ne perdait pas de manière significative son cuivre. En revanche, nous mettons en évidence l’addition d’un carbène sur un résidu du site actif d'un mutant, entraînant la libération du cuivre. Nous avons ensuite étendu la gamme des réactions non naturelles catalysées par les hémoprotéines en réalisant un réarrangement de Sommelet-Hauser avec une myoglobine évoluée<br>In the context of sustainable development, chemical industries turn progressively towards processes respecting the criteria of green chemistry, via for example the replacement of chemical catalysts by enzymes. However, lots of industrial reactions do not exist in nature. To over come this limitation, several hemoproteins have been engineered to catalyze abiological reactions. Besides, only few non-heme iron-dependent enzymes and one cobalt protein were also reported for carbene and nitrene transfers whereas other metals catalyze them. We first aimed to repurpose the activity of a class of copper metalloenzymes, the lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs), to develop new biocatalysts for new-to-nature reactivities. To repurpose the LPMO activity, the copper coordination sphere within the SmAA10 LPMO was modulated by site directed mutagenesis to create new metal coordination motifs. The mutants were characterized and were then assessed for their capacity to catalyze non-natural reactions. Good activities were obtained for some abiological transformations (i.e. : the Doyle-Kirmse rearrangement). These activities being similar to that of copper in solution, we wondered if the reactions were really catalyzed at the enzyme active site. Focusing on the Doyle-Kirmse rearrangement, we found no evidence that the wild-type LPMO significantly loses some copper. In contrast, we high light the carbene addition to an active site residue to a specific LPMO mutant, resulting in its copper release. Next, we extended the non-natural reactions range catalyzed by hemoproteins by performing for a Sommelet-Hauser rearrangement with an evolved myoglobin
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Lafite, Pierre. "ETUDE du CYTOCHROME P450 2J2 HUMAIN :Recherche de substrats et d'inhibiteurs sélectifs ;Détermination de la topologie de son site actif." Phd thesis, Université René Descartes - Paris V, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00192090.
Full textAbstract:
Ce manuscrit présente une étude fonctionnelle et structurale du cytochrome P450 2J2 humain (CYP2J2), enzyme exprimée dans les tissus cardiovasculaires, dont les rôles biologiques sont mal connus. En utilisant la terfénadone comme base structurale, qui est un composé oxydé régiosélectivement par le CYP2J2, plusieurs composés ont été synthétisés se sont révélés être des inhibiteurs affins et sélectifs du CYP2J2. En particulier, un inhibiteur très affin et compétitif (Ki = 160 nM) et deux substrats suicides efficaces du CYP2J2 (kinact/Ki 3000 L/mol/s) ont été mis en évidence. L'étude de l'oxydation de ces composés par le CYP2J2 a révélé une régiosélectivité surprenante, en faveur d'une position chimiquement moins réactive vis-à-vis des oxydations. La caractérisation du site actif du CYP2J2 et l'identification de résidus importants pour la reconnaissance des dérivés de terfénadone a pu être réalisée en construisant un modèle par homologie 3D de cette enzyme et par le docking de certains dérivés dans le site actif du CYP2J2. Enfin, une étude préliminaire des rôles biologiques possibles du CYP2J2 a été réalisée en étudiant les effets inhibiteur de ce P450. En conclusion, ce travail a permis de caractériser les premiers outils biochimiques d'étude des rôles biologiques du CYP2J2, de proposer une première topologie du site actif du CYP2J2, et d'affiner les rôles biologiques du CYP2J2.
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Renko, Zafiarisoa Dolor. "Synthèse totale de porphyrines protégées sur leurs deux faces (Porphyrines "Gyroscopes")." Paris 6, 1986. http://www.theses.fr/1986PA066274.
Full textAbstract:
La synthèse d'une nouvelle génération de porphyrines protégées sur leurs deux faces a été réalisée. Il s'agit d'un dérivé d'une octamethylporphyrine substituée en ses positions méso alpha et gamma par deux groupes phényles eux-mêmes fonctionnalises en position ortho et ortho par des anses peptidiques d'acides aminés optiquement actifs. L'une des anses comporte une pyridine. La synthèse totale de cette porphyrine a été effectuée en vue d'obtenir de nouveaux modèles d'hémoprotéines et de nouveaux catalyseurs d'époxydation asymétrique.
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Caillet-Saguy, Célia. "Etude de l'interaction de l'hémophore HasAsm avec ses partenaires : l'hème et le récepteur spécifique de membrane externe HasR." Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077185.
Full textAbstract:
L'hémophore HasA, sécrété dans le milieu extracellulaire par S. Marcescens, est un transporteur d'hème, qui extrait Thème des hémoprotéines de l'hôte et le délivre à un récepteur de membrane externe spécifique HasR. Le fer de Thème de holoHasA est ferrique et présente une coordination originale histidine 32/tyrosine 75. Un troisième résidu du site de fixation de Thème, H83, forme une liaison hydrogène forte avec Y75, augmentant son caractère tyrosinate et stabilisant la coordination fer-Y75. Les holoprotéines sauvage et mutées au niveau de ces trois résidus ont été caractérisées par spectroscopies UV, RMN, rR et RPE. Les noyaux du squelette et les Cb de holoHasA ont été attribués au moyen d'expériences RMN 15N et 13C en détection directe. Des résonances des ligands axiaux ont été détectées. Nous avons montré que HasA présente un équilibre thermique haut spin/bas spin associé à la modulation de la force de la liaison de coordination fer de Thème-ligand axial Y75, elle-même modulée par la force de la liaison hydrogène Y75-H83. Chez le mutant Y75A, H83 devient un ligand alternatif. Chez le mutant H83A, on observe une série d'équilibres dépendant du pH entre des espèces de coordination variable et pour lesquelles Y75 n'est plus ligand. L'espèce pentacoordonnée détectée à pH physiologique, avec H32 pour unique ligand, pourrait représenter un intermédiaire possible du mécanisme de transfert de Thème au récepteur HasR. Le processus de transfert de Thème de HasA à HasR a été étudié par des expériences RMN HSQC TROSY CRINEPT sur les complexes apoHasA-HasR et holoHasA-HasR en micelles de détergent et a permis d'identifier les régions de HasA impliquées dans l'interaction<br>The extracellular hemophore HasA from S. Marcescens is a heme carrier protein that extracts heme from host hemoproteins and shuttles it to a specific outer membrane receptor HasR. In HasA, heme iron is ferric and has an original coordination with a Histidine 32/Tyrosine 75 axial ligands pair. A third residue of the binding pocket, H83, forms a tight hydrogen bond with Y75, increasing the tyrosinate character of Y75 and stabilizing the Y75-heme iron coordination. Wild-type and mutated holoproteins, H32A, Y75A and H83A, were characterized by UV, NMR, rR and EPR spectroscopies. Using 13C/15N-direct detection NMR experiments, optimized for paramagnetic proteins, it has been possible to assign backbone nuclei and Cb of holoHasA. Resonances of the axial ligands have been detected by 1D NMR experiments. We have shown that HasA presents a thermal high spin/low spin equilibrium related to the modulation of the strength of the heme iron-Y75 axial ligand coordination bond which is modulated by the Y75-H83 H-bond. In the Y75A mutant, H83 becomes an alternatif ligand. In the H83A mutant, removal of H83 causes detachment of the Y75 ligand, thus giving rise to a series of pH dependent equilibria among species with different axial ligation. The five coordinated species detected at physiological pH, with H32 as axial ligand, may represent a possible intermediate of the heme transfer mechanism to the membrane receptor HasR. The heme release process from HasA to HasR were investigated by CRINEPT-TROSY HSQC NMR experiments on apoHasA-HasR and holoHasA-HasR complexes in DPC micelles allowing the mapping of the regions of HasA involved in the HasA-HasR interaction
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Balducci, Lodovico. "Dynamics of hemeproteins by femtosecond X-ray techniques." Thesis, Rennes 1, 2019. http://www.theses.fr/2019REN1S115.
Full textAbstract:
Récemment, la mise au point de techniques de radiographie à résolution temporelle a ajouté la dimension temporelle à la recherche dans le domaine de la biologie structurale et celles-ci se sont avérées être d'excellents outils pour suivre l'évolution structurale des protéines lors d'une réaction. En particulier, les sources de rayons X de 4ème génération (appelées lasers à électrons libres et à rayons X), avec des impulsions de l'ordre de la femtoseconde et des fluences extrêmement élevées, sont capables de sonder des ensembles de molécules essentiellement gelées dans le temps dans des conditions physiologiques. Après un aperçu des études publiées dans la littérature scientifiques, une introduction de base des techniques utilisées est présentée, accompagnée d'une description du dispositif expérimental et du flux de réduction des données. Les deux derniers chapitres sont consacrés à la présentation des résultats obtenus au cours de deux séries d'expériences réalisées au LCLS (SLAC, Menlo Park, CA, USA), pour étudier les changements structuraux des protéines dans la réaction de photodissociation prototypique du monoxyde de carbone chez des hemoprotéines. Au cours de la première expérience, la modification structurelle globale de trois hemoprotéines a été sondée par une technique de diffusion à résolution temporelle, afin d'observer d'éventuelles différences dans ce que l'on appelle le ''protein quake'' lié à la structure de la protéine. Dans la deuxième expérience, le site actif de la myoglobine a été sondé au cours de la même réaction par absorption de rayons X. Les spectres XANES à résolution temporelle ont été comparés à des calculs théoriques, dans le cadre de la théorie de la diffusion multiple, afin d'obtenir une image détaillée de la dynamique ultrarapide. Un bref projet secondaire portait à mesurer précisément des modèles de diffusion statique de la carboxyhémoglobine, afin de définir ses structures d'équilibre multiple par comparaison avec des combinaisons linéaires de structures cristallographiques connues. En conclusion, dans cette thèse de doctorat, nous avons essayé d'apporter quelques petits éléments dans la compréhension de la dynamique ultrarapide des protéines, en appliquant à la fois des méthodes d'analyse standard (Guinier), mais aussi des méthodes presque inexplorées (calculs de diffusion multiple sur des données à résolution temporelle). Selon le système et le niveau de détail requis, ces méthodes, appliquées ici aux à des systèmes modèles, peuvent être considérées d'excellents outils dans la recherche ultérieure sur des protéines plus complexes<br>Recently, the development of time resolved X-ray techniques has added the time dimension to structural biology studies, and have proven to be great tools to track proteins during the course of a reaction, or a specific conformational change. In particular the 4th generation X-ray sources (so called X-ray Free-Electron Lasers), with femtosecond pulses and extremely high fluences, are capable of probing ensembles of molecules essentially frozen in time under physiological conditions. After an overview of the past studies in the field, a basic introduction of the used techniques, the description of the experimental set-up and the flow of data reduction are presented. The last two chapters are devoted to present the results obtained during two separate sets of experiments, conducted at the XPP beamline of the Linac Coherent Light Source (SLAC, Menlo Park, CA, USA), to study the protein's structural changes, upon prototypical photo-dissociation reaction of carbon monoxide from heme proteins. During the first experiment, the global structural modification of three heme proteins has been probed by means of time resolved scattering technique, in order to observe eventual differences in the so called “protein-quake” depending on the protein's structure. In the second experiment, the active site of myoglobin was probed, during the same reaction, by X-ray absorption. The time resolved XANES spectra have been compared with theoretical calculations, in the framework of the multiple scattering theory, in order to retrieve a detailed picture of the ultra-fast dynamics. A further small side-project dealt with the precise measurement of static scattering patterns of carboxy hemoglobin with the goal of defining its multiple equilibrium structures by comparison with linear combinations of known crystallographic structures. In conclusion, in this Ph.D. thesis we tried to add some small pieces in the understanding of ultra-fast proteins dynamics by applying both standard (Guinier) and almost unexplored (multiple scattering calculations on time resolved data) analysis methods: depending on the system and the level of details required, these methodologies, here applied on model systems, can be considered excellent tools for further research on more complicated proteins
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Treuffet, Johanne. "Transfert de ligand dans la cytochrome c oxydase observé par des expériences femtosecondes infrarouge intégrées et résolues spectralement." Phd thesis, Ecole Polytechnique X, 2006. http://pastel.archives-ouvertes.fr/pastel-00002200.
Full textAbstract:
L'étude dynamique des hémoprotéines, indispensable à la compréhension du fonctionnement de leur site actif, a considérablement progressé grâce aux expériences de spectroscopie. Nous avons étudié dans ce cadre le transfert du ligand CO au sein du site actif bimétallique de la cytochrome c oxydase, du Fer de l'hème à l'atome de Cuivre, par spectroscopie femtoseconde infrarouge. Les expériences dans l'infrarouge permettent d'analyser les caractéristiques vibrationnelles des molécules et de suivre ainsi directement le transfert du ligand par l'intermédiaire de sa signature vibrationnelle. Afin de résoudre le transfert étudié, qui se produit sur une échelle subpicoseconde, l'expérience doit avoir une résolution femtoseconde. Deux expériences pompe-sonde femtoseconde dans le domaine infrarouge, une expérience intégrée spectralement et une expérience résolue spectralement, ont été mises en place. Ces deux expériences ont apporté des informations complémentaires sur le transfert du ligand CO au sein du site actif de la cytochrome c oxydase. Dans le cas de l'expérience intégrée spectralement, un signal supplémentaire dû à l'absorption des molécules d'hème a été identifié et soustrait aux cinétiques afin d'isoler le signal induit par le transfert du CO. Le temps caractéristique de ce transfert a ainsi pu être évalué à 400 fs. Lors de l'expérience résolue spectralement, l'évolution des raies d'absorption du CO présente un décalage de 200 fs qui suggère une composante balistique dans le transfert. L'expérience résolue spectralement a été réalisée à l'aide d'une nouvelle technique de mesure du spectre infrarouge par conversion vers le visible, développée au laboratoire. Cette technique, qui offre un meilleur rapport signal sur bruit et une meilleure résolution que les approches concurrentes, a permis d'acquérir un ensemble de spectres différentiels suffisant pour valider expérimentalement une nouvelle technique de filtrage des oscillations de cohérence. Nous avons réalisé des simulations de dynamique moléculaire qui modélisent le transfert du ligand CO dans la cytochrome c oxydase, du Fer de l'hème vers l'atome de Cuivre. Ces simulations sont en bon accord avec les résultats expérimentaux et ont montré que le trajet emprunté par le CO lors de son transfert est reproductible, ce qui corrobore un transfert balistique.
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Brunel, Albane. "Etude du mécanisme d’activation de l’oxygène par les NO-Synthases." Thesis, Paris 11, 2012. http://www.theses.fr/2012PA112290/document.
Full textAbstract:
Le monoxyde d'azote est exclusivement synthétisé chez les mammifères par une famille d’hémoprotéines, les NO-Synthases. Le cœur de l’activité des NO-Synthases est l’activation de l’oxygène c'est-à-dire l’activation de l’intermédiaire réactionnel FeIIO2. Cette étape est contrôlée par la réactivité intrinsèque du fer, par les transferts de proton et les transferts d’électron. Elle doit être parfaitement maîtrisée car elle contrôle le chemin catalytique emprunté et la nature du produit final. Comprendre l’étape d’activation de l’oxygène est essentiel à la compréhension du rôle biologique et/ou pathologique de la NO-Synthase de mammifère. Cette question s'étend aux NO-Synthases bactériennes pour lesquelles on ne connait ni le mécanisme moléculaire ni la fonction biologique. Ce manuscrit propose une analyse approfondie de l’étape d’activation de l’oxygène de la NO-Synthase. Dans un premier temps, nous avons étudié l’influence de l’environnement proximal sur la réactivité intrinsèque du fer et l’activation de l’oxygène. Nous avons généré des protéines mutées qui modifient les propriétés électroniques de la liaison proximale de l’hème. Ces protéines mutées ont été caractérisées par différentes spectroscopies (résonance paramagnétique électronique, Raman de résonance). Dans un second temps nous avons directement étudié le complexe FeIIO2, en présence d’analogues de substrat, grâce à des analyses de cinétique rapide en flux continu et en flux arrêté (stopped-flow). Dans un troisième temps, le rôle du cofacteur tetrahydrobioptérine dans le transfert de proton et d’électron a été étudié par une méthode de piégeage à des temps très courts : le freeze-quench. L'ensemble de nos résultats montrent que l’activation de l’oxygène est régulée par les propriétés électro-donneuses du ligand proximal et par le réseau de liaisons H distal. Nous mettons en évidence des différences dans le rôle redox du cofacteur tetrahydrobioptérine entre la NO-Synthase de mammifère et la NO-Synthase bactérienne. La difficulté majeure pour comprendre l’étape d’activation de l’oxygène de la NO-Synthase réside dans la complexité et la rapidité de la réaction catalytique. Dans ce contexte, nous avons cherché à adapter une méthodologie qui a prouvé son efficacité dans le cas des cytochromes P450 : la cryo-réduction couplée à des sauts en température<br>Nitric oxide is exclusively synthesized by NO-Synthases in mammals. The heart of the NO-synthase activity is oxygen activation, which corresponds to the activation of the FeIIO2 intermediate. This step depends on the heme electronic properties and on the electron and proton transfers. Oxygen activation has to be well mastered to control exactly the nature of the end-product. Understanding the oxygen activation step is necessary to better understand the biological/pathological role of the mammalian NO-Synthases. Furthermore, bacterial NO-Synthases function and oxygen activation mechanism are unknown. This PhD work proposes a deep analysis of the oxygen activation step in NO-Synthases. First, proximal environment has been studied with mutated proteins. These mutations impact the electronic properties of the heme proximal bond. Spectroscopic analyses of these mutants have been done by electron paramagnetic resonance and resonance Raman. Then, we have studied the FeIIO2 intermediate with substrate analogs which has necessitated continuous flow and stopped-flow analyses. Finally, the role of the tetrahydrobiopterin cofactor in the electron and proton transfer has been studied and clarified thanks to a very fast trapping method : the freeze-quench. Our results show that the oxygen activation step is elaborately controlled by the proximal bond electron donation and the distal H bond network. At the same time we show some differences between mammalian and bacterial NO-Synthases concerning the redox role of the tetrahydrobiopterin cofactor. The major obstacle to understand the oxygen activation step resides in the complexity of the active site chemistry and the rate of catalytic reactions. For this reason, we propose to adapt an already successful protocol to trap some intermediates in the cytochromes P450 mechanism : cryo-reduction coupled with temperature jumps
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Janot, Jean-Marc. "Étude de l'intermédiaire flavosémiquinone du flavocytochrome b2." Paris 6, 1986. http://www.theses.fr/1986PA066112.
Full text
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Berthe, Thierry. "Contribution à l'étude d'une protéine hémique de plante supérieure, la peroxydase : étude de l'influence de la lumière sur la biosynthèse de l'apoprotéine et de certaines enzymes de la voie des tétrapyrroles." Rouen, 1996. http://www.theses.fr/1996ROUES046.
Full textAbstract:
Les peroxydases ont été étudiées dans l'hypocotyle de la plantule de lin afin d'identifier les isoformes pouvant être impliquées dans le contrôle de la croissance par la lumière. Différents profils de distribution des peroxydases ont été obtenus après focalisation isoélectrique d'extraits protéiques provenant de plantules étiolées ou transférées à la lumière. Dans la partie basale de l'hypocotyle, deux modifications majeures ont été observées à la lumière : l'apparition d'une isoforme de pI 9,5 et l'intensification d'une bande correspondant à une isoforme de pI 9. Par amplification par PCR, nous avons pu démontrer la présence de trois ADNc codant pour des peroxydases dans l'hypocotyle. Il apparaît, après hybridation Northern, que l'expression des ARNm correspondant à l'un d'entre eux est stimulée par la lumière dans l'hypocotyle et la racine. L'activité peroxydasique dépendant de l'association de l'apoprotéine avec l'hème, nous avons abordé l'étude de la voie de biosynthèse des tétrapyrroles en nous focalisant sur la 5-aminolevulinate deshydratase (5-ALAD, E. C. 4. 2. 1. 24). La lumière augmente l'activité et la quantité de cette protéine sans modifier le niveau de ses transcrits. Il est suggéré que cette enzyme est exprimée, à l'obscurité, de façon constitutive dans les cotylédons contrairement aux hypocotyles.