Dissertations / Theses on the topic 'Hormones peptidiques'

Cette thèse porte sur la découverte de gènes humains non caractérisés codant pour des précurseurs à hormones peptidiques. Les hormones peptidiques (PH) ont un rôle important dans la plupart des processus physiologiques du corps humain. Ce sont de petites protéines sécrétées générées après clivage de précurseurs plus larges codés par le génome. Dans la première partie de la thèse, l'on introduit des algorithmes, basés sur les chaînes de Markov cachées (HMM), qui vont nous permettent de modéliser les séquences protéiques des précurseurs à hormones peptidiques. On montre que l'on peut dégager des caractéristiques particulières au niveau de la séquence chez ce groupe de protéines et l'on s'attarde en particulier sur la modélisation de deux signaux toujours présents chez ces protéines, les peptides signaux et les sites de clivage par les prohormones convertases. On présente ensuite des algorithmes qui prennent en compte le degré de conservation des résidus le long d'alignements de protéines orthologues. On montre que ces nouveaux algorithmes améliorent de manière significative les résultats obtenus à l'aide des algorithmes classiques. Enfin, après lancement de l'algorithme sur des données de protéomes, l'on dégage une liste de candidats dont certains ont pu être étudiés au laboratoire. La deuxième et la troisième partie de la thèse présentent les conclusions que l'on peut tirer des données de Western blot relatives aux profils de sécrétion et de découpage (processing) de chacun des deux candidats les plus prometteurs, " spexine " et " augurine ". On présente des données d'expression sur la souris (hybridation in situ, immunohistochimie,...) que l'on a récemment obtenues sur ces nouvelles hormones peptidiques potentielles ainsi que des données fonctionnelles sur la " spexine ". En conclusion, l'on avance des hypothèses quant aux fonctions de ces deux protéines. Si les fonctions de ces nouveaux peptides nous sont encore inconnues, leur expression chez la souris, tant au niveau de l'ARN messager que de la protéine, révèle des pistes qui devraient soulever un intérêt certain chez les spécialistes du domaine des peptides. Enfin, dans la quatrième et dernière partie de la thèse, l'on présente pour quatre autres candidats (dont on n'a pu mener une étude approfondie) des données préliminaires d'expression de gène et de sécrétion in vitro après transfection de l'ADN codant pour ces protéines dans des cellules issues de lignées cellulaires pancréatiques.

L'hormone de croissance (GH) secrétée par l'hypophyse à une activité biologique qui est fondamentale pour la croissance linéaire d'un jeune organisme et pour le maintien de son intégrité à l'âge adulte. La sécrétion de GH est régulée par deux peptides hypothalamiques : le GH-releasing Hormone (GHRH), et la somastatine qui respectivement stimule et inhibe la sécrétion en hormone de croissance. Durant ces quinze dernières années, plusieurs équipes de recherche ont démontré que la sécrétion de GH pouvait également être stimulée par des peptides et des peptidomimétiques synthétiques appelés sécrétagogues de l'hormone de croissance tel que l'EP-51389, un composé du groupe Europeptides. Ces composés agissent à travers un mécanisme distinct de celui de la GHRH par intéraction avec un récepteur localisé principalement dans l'hypothalamus et l'hypophyse, le GSSR-la. Récemment, un peptide de 28 acides aminés appelé gréline, a été isolé et reconnu comme le ligand endogène de ce récepteur. Outre son activité sur la libération de GH, la ghréline exhibe un large spectre d'activités sur le système nerveux central et les tissus périphériques. Cette thèse est consacrée au développement de ligands du récepteur des sécrétagogues de l'hormone de croissance qui soient capables de moduler l'action de la ghéline endogène. Ce travail a abouti, dans un premier temps, à la découvert du composé JMV 2215, antagoniste potentiel. La synthèse d'analogues linéaires et semi-rigides de ce composé a par la suite été entreprise dans l'objectif de trouver des composés plus puissants.

Des facteurs seriques sont responsables de la diminution d'expression des recepteurs vip a la surface des cellules humaines igr39 derivees d'un melanome. Les recepteurs igf sont, comme le recepteur vip, surexprimes lorsque les cellules igr39 sont cultivees en absence de serum de veau ftal. Les proteines de liaison des igfs (les igfbps) secretees par les cellules sont elles aussi quantitativement alterees en fonction des conditions de culture. D'autre part, nous montrons que la deglycosylation partielle du recepteur vip par la pngase f en conditions natives conduit a la suppression d'une chaine oligosaccharidique, ce qui ne modifie ni la dynamique d'internalisation et d'expression du recepteur, ni les parametres de liaison du vip, et ne constitue pas un signal suffisant pour induire la degradation du recepteur. En revanche, la desialylation du recepteur vip par la neuraminidase conduit a la diminution de son affinite pour le ligand et de sa capacite a activer l'adenylate cyclase en reponse au vip. La mesure du temps de reapparition de recepteurs vip entierement glycosyles apres leur deglycosylation partielle nous a permis d'obtenir une approximation du temps de biosynthese de ce recepteur sur les cellules igr39: la moitie des recepteurs sont completement glycosyles en 9 a 12 heures

Les analogues de la LHRH, aussi bien agonistes qu'antagonistes, peuvent être employés dans le traitement de nombreuses pathologies hormonodépendantes. Le développement d'antagonistes peptidomimétiques est un axe majeur de la recherche dans ce domaine. L'usage des antagonistes permet d'éliminer le phénomène de 'flare-up' observé chez les agonistes et la recherche de structures non peptidiques devrait conduire à la mise au point de médicaments utilisables par voie orale. Nous basant sur des études structurales de la LHRH et de ses analogues, nous avons conçu trois séries de molécules de structure indolique ou dérivée (pyrroloquinoléine), peptidomimétiques antagonistes potentiels de la LHRH. L'accès à ces structures a été envisagé par différentes stratégies regroupant la cyclisation de Fischer ainsi que plusieurs hétérocyclisations pallado-catalysées. L'activité des molécules a été évaluée par un test fonctionnel in vitro ainsi que par la mesure de l'affinité pour le récepteur à la LHRH
LHRH analogs, agonists as well as antagonists, can be used in the treatment of many hormone-dependant diseases. The development of peptidomimetic antagonists is a subject of major interest in this field. Agonist activity avoids the 'flare-up' effect observed with agonists and the non-peptidic structure research should lead to orally active drugs. Working from structural studies of LHRH and its analogs, we have synthesized three groups of indole-based compounds, potentially LHRH-antagonists. Access to these structures has been considered by several strategies including Fischer reaction and several palladium-catalyzed heterocyclization. The activity has been evaluated by a functional in vitro assay and by direct measure of affinity for the LHRH receptor

Ce travail est consacre a la synthese et a l'etude pharmacologique d'analogues peptidiques et pseudopeptidiques de la bombesine. Une etude sur les relations structure-activite de la bombesine (bn) a ete developpee. Dans un premier temps, nous avons synthetise des analogues modifies au niveau du nonapeptide c-terminal par substitution d'aminoacides et introduction de liaisons pseudopeptidiques. L'introduction de liaisons hydroxyamides au niveau de la partie c-terminale a conduit a de puissants antagonistes sur la secretion d'amylase pancreatique induite par la bombesine et sur la proliferation cellulaire des fibroblastes swiss 3t3 de souris. Dans un deuxieme temps, nous avons synthetise des analogues cycliques et dimerises de la bombesine. La derniere partie de ce travail a ete la synthese d'analogues de la bombesine etendue du cote c-terminal par un residu glycine. Certains de ces analogues sont de puissants agonistes sur la proliferation cellulaire des fibroblastes swiss 3t3 de souris. Ces composes devraient nous permettre de savoir s'il existe des recepteurs specifiques de ces formes glycine etendue et si ces recepteurs sont impliques dans la proliferation cellulaire des fibroblastes swiss 3t3 de souris

Le travail presente dans ce memoire concerne la synthese et l'etude des proprietes pharmacologiques de nouveaux analogues de la neurotensine, dans le but d'obtenir des composes resistants vis-a-vis de la degradation enzymatique et possedant une puissante activite agoniste en analgesie ou en hypothermie par voie intraveineuse. Nous nous sommes interesses dans un premier temps a la preparation d'analogues cyclopeptidiques de la neurotensine (8-13). Cette approche nous a conduit notamment a un nouveau compose actif en hypothermie apres administration par voie intraveineuse. Dans une deuxieme partie, nous avons synthetise des analogues du fragment (8-13) de la neurotensine comportant soit des liaisons reduites et un residu d-trp 1 1 soit des aminoacides non proteinogeniques silyles dont nous avons au prealable developpe la synthese. Parmi les composes prepares, certains ont presente de bonnes affinites pour les recepteurs humain de la neurotensine (hntr1 et hntr2). Les proprietes biologiques de ces composes sont en cours d'evaluation. Enfin la derniere partie de ce travail concerne la synthese d'un analogue possedant un residu gem-diamine en position c-terminale, dans le but de mettre en evidence une interaction ionique entre la neurotensine et son recepteur de haute affinite ntr1. Nous avons egalement etudie les fragmentations caracteristiques de cette classe de composes en spectrometrie de masse electrospray. L'ensemble de ce travail a permis la preparation d'un nombre important d'analogues de la neurotensine qui permettront d'approfondir les relations structure-activite.

L'amidation est une des etapes du processus de maturation post-traductionnelle des hormones polypeptidiques. Elle est catalysee par la peptidylglycine -amidating monooxygenase (pam) qui reconnait des propeptides presentant une glycine carboxyterminale pour former un peptide carboxyamide biologiquement actif. Dans la premiere partie de cette these, nous avons caracterise une activite pam dans une tumeur pancreatique humaine secretant du vip, et dans une lignee d'insulinome de rat (rin-5f). Les 2 activites enzymatiques presentent des proprietes biochimiques analogues, mais different par leurs parametres cinetiques et leur poids moleculaire. Dans la deuxieme partie, nous montrons: i) que l'expression des arnm de la pam dans le pancreas de rat presente des variations au cours du developpement du pancreas avec des taux eleves au 18eme jour de gestation et un taux maximal a la naissance; ii) que dans le pancreas de rat in vitro, parmi les effecteurs testes (triiodothyronine, corticosterone, progesterone, glucose) aucun ne fait varier l'expression des arn de la pam. Cependant, la triiodothyronine a un effet negatif a la fois sur l'immunoreactivite et sur l'expression des arn de la trh et nous conduit a proposer certaines hypotheses

La caracterisation moleculaire du recepteur vip dans de nombreux systemes revele une grande variabilite dans les masses moleculaires apparentes. Cette hererogeneite moleculaire peut resulter soit de differences dans la longueur de la chaine peptidique, soit de differences dans la glycosylation. Pour discriminer entre ces deux hypotheses, nous avons entrepris l'etude de la structure de la partie oligosaccharidique du recepteur vip provenant de diverses especes (homme, rat et porc) et tissus (melanome, foie, jejunum et pancreas). Les masses moleculaires apparentes des complexes vip-recepteur controles s'echelonnent de 51,8 kda (foie de rat) a 71,2 kda (pancreas humain), la variation etant de 19,4 kda. Apres traitement par la pngase f, endoglycosidase qui clive la totalite des chaines oligosaccharidiques, la difference n'est plus que de 3,5 kda; les masses moleculaires se situent toutes dans la zone des 40 a 44 kda. Ceci indique que les recepteurs vip provenant de sources diverses ont des corps peptidiques de taille similaire et portent des quantites variables de sucres variant de 11,4 a 28,9 kda. En plus de l'heterogeneite moleculaire, il existe une heterogeneite dans la nature des residus glucidiques portes par les chaines glycanniques de ces differents recepteurs. Ces derniers ont une sensibilite variable a la neuraminidase et l'endo-b-galactosidase; aucun des recepteurs n'est sensible a l'a-mannosidase et l'endoglycosidase h. En outre, le recepteur vip d'origine humaine porte au moins trois chaines oligosaccharidiques par molecule de recepteur, exclusivement n-liees, tri-ou tetraantennees, majoritairement sialylees et parfois fucosylees

La peau est le plus important organe neuroendocrinien du corps humain et héberge une population estimée à 1012 bactéries, très majoritairement commensales ou symbiotiques. La Substance P (SP) est un acteur majeur de l’inflammation neurogène et est impliquée dans de nombreuses physiopathologies cutanées telles que les dermatites atopiques ou le phénotype de peau sensible. Cependant, le rôle joué par les micro-organismes cutanés dans ces physiopathologies n’est pas connu à ce jour, et l’interaction des neuropeptides cutanés avec la microflore bactérienne n’a jamais été étudiée. Dans un premier temps, une analyse détaillée de la flore bactérienne cutanée a été réalisée chez des individus à peau saine ou à peau dite sensible non pathologique. Les isolats bactériens collectés ont été identifiés par des techniques Pasteuriennes, de biologie moléculaire et par une analyse du protéome total via la technologie de spectrométrie de masse MALDI-TOF couplée au logiciel algorithmique Biotyper ®. Cette première étape a permis la sélection de quatre germes cutanés, considérés comme des représentants des différentes sous–populations de bactéries cutanées : Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus et Pseudomonas fluorescens. Les effets de la SP sur la virulence bactérienne cutanée ont ensuite été étudiés. L’exposition des souches bactériennes à la SP augmente de façon significative la virulence globale et l’adhésion bactérienne vis-à-vis des kératinocytes HaCaT. Pour deux des quatre souches, B. Cereus et S. Aureus, nous avons identifié les facteurs de virulence potentiellement impliqués dans ce phénomène. De plus, le facteur d’élongation Tu a été identifié comme étant le site de liaison à la SP chez B. Cereus. Enfin, nous avons observé que deux molécules bio-actives d’origine cosmétique peuvent antagoniser les effets pro-virulents de la SP. Ces observations supportent l’hypothèse selon laquelle SP modifie la virulence globale des membres de la microflore cutanée. Cette étude participe à la compréhension du rôle de la microflore cutanée dans les interactions physiologiques entre la peau et les microorganismes qui la colonisent
Human skin is the largest neuroendocrine organ, and hosts approximately 1012 bacteria, most of which are commensal or symbiotic. Substance P is a major actor of neurogenic inflammation, and is involved in various cutaneous disorders, such as atopic dermatitis or sensitive skin phenotype. However, the exact role played by the cutaneous micro-organisms in these disorders is unknown, and interactions between human neuropeptides and cutaneous bacteria were never investigated. During this work, a detailed analysis of cutaneous bacterial microbiota was realized within normal skin and sensitive skin volunteers. Bacterial isolates collected were identified with Pasteurian techniques, molecular biology techniques and MALDITOF mass spectrometry coupled to the Biotyper ® software. This first step led to the selection of four cutaneous germs, considered as representative of different cutaneous bacterial sub-populations: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus cereus and Pseudomonas fluorescens The effects of SP on cutaneous bacterial virulence were then studied. The exposure of bacterial strains with SP induced a significant raise in global virulence and adhesion properties of bacteria to kératinocytes HaCaT. For S. Aureus and B. Cereus strains, we were able to identify virulence factors potentially involved in such phenomenon. Moreover, the Thermo-unstable elongation factor Tu was identified as a SP binding site in B. Cereus. Finally, we observed that two bio-active cosmetic compounds were able to antagonize SP pro-virulent effects. These observations support the hypothesis that SP could act as a global virulence regulator of the cutaneous microflora. This study participates in the understanding of the role of such microflora within the physiological interactions between the skin and microbes that colonizes it

L'hormone de mélano-concentration (MCH) a été isolée initialement chez les poissons téléostéens sous la forme d'un peptide de 17 acides aminés. Chez les mammifères c'est un puissant neuropeptide orexigénique produit par des neurones hypothalamiques régulant la prise alimentaire. En 1999 et 2001, deux récepteurs de la MCH furent découverts, MCH-R1 et -R2, ils sont couplés aux protéines G et exprimés dans le cerveau. Le but de cette thèse était d'identifier les sites de liaison ou les récepteurs pour la MCH dans différentes lignées cellulaires et tissus. Pour cela, des radioligands stables et efficaces (125I-[Phe13, Tyr19]-MCH, 125I-[DPhe13, Tyr19]-MCH et [125I]-MCH) ont été développés et utilisés. De nombreuses lignées et tissus ont été testés dont 5 lignées de neuroblastome humain et 2 lignées murines, des melanocytes primaires humains, des neurones embryonnaires hypothalamiques de rat, des coupes de cerveau de rat et des membranes de cerveau de porc. 125I-[Phe13, Tyr19]-MCH et 125I-[DPhe13, Tyr19]-MCH ont mis en évidence des sites de liaison dans le mélanome murin mais se sont révélés inadéquats pour trouver le MCH-R1 ou -R2. Nous avons alors effectué avec [125I]-MCH une étude de structure-activité du MCH-R1 avec 12 analogues de la MCH, l'étude fonctionnelle utilisant le FLIPR. Pour 9 analogues il y a eu une bonne corrélation entre les IC50s et les EC50s. Nous avons aussi testé par RT-PCR des lignées pour l'expression des MCH-R et nous en avons trouvé une exprimant le MCH-R1 et produisant de surcroit la MCH:
Melanin-concentrating hormone (MCH), initially isolated from teleost fish as a 17-amino acid peptide, is a potent orexigenic neuropeptide in mammals where it is produced by hypothalamic neurons and participates in the regulation of food intake. In 1999 and 2001, two receptor subtypes for MCH were discovered, MCH-R1 and -R2. They are coupled to G-proteins and are mainly expressed in the brain. The purpose of this thesis was to identify MCH binding sites or receptors in various cell lines and tissues. To this end, stable and potent MCH radioligands were developed and applied: 125I-[Phe13, Tyr19]-MCH, 125I-[DPhe13, Tyr19]-MCH, and [125I]-MCH. Many cell lines and tissues were screened, amongst which 5 human neuroblastoma cell lines, 2 murine neuroblastoma cell lines, human primary melanocytes, mouse brain tumour, rat embryonic hypothalamic cells, rat brain cryostat sections and porcine brain membranes. Even though 125I-[Phe13, Tyr19]-MCH and 125I-[DPhe13, Tyr19]-MCH revealed specific binding sites in mouse melanoma cells, they were not suitable to find MCH-R1 or -R2. We therefore used [125I]-MCH to perform a MCH-R1 structure-activity study with 12 MCH analogues, which was extended to a functional study using the FLIPR assay. For 9 analogues, there was a good correlation between IC50s and EC50s. We also screened different cell lines for MCH-R expression by RT-PCR and identified a promising MCH-R1-expressing cell line, which also produces MCH: Kelly human neuroblastoma cells. MCH binding sites could be visualised on 2-D gels following crosslinking with MCH radioligand. In conclusion,these studies demonstrated that MCH receptor subtypes expressed on different cell lines display different ligand recognition profiles and hence require different types of radioligand for binding analysis. The human Kelly cell line appears to be an interesting model for analysis of novel MCH ligands as it endogenously expresses MCH-R

Ce travail est consacre a la synthese d'analogues peptidiques et pseudopeptidiques de la bombesine. Une etude sur les relations structure-activite de la bombesine a ete developpee. Dans un premier temps, nous avons synthetise des analogues modifies au niveau du nonapeptide c-terminal, en substituant certains residus d'acides amines essentiels pour la liaison de l'hormone a ses recepteurs et le declenchement de l'activite biologique. Dans un deuxieme temps, suivant notre hypothese de depart concernant le mecanisme d'action de la bombesine, nous avons introduit au niveau du dipeptide c-terminal des acides amines naturels ou exotiques, des liaisons peptidiques modifiees non hydrolysables, de type liaison carba, liaison methylene, liaison reduite, liaison oxymethylene, liaison hydroxyethylamine et hydroxymethylene. Ces quatre derniers types de liaisons modifiees introduits dans la sequence de la bombesine conduisent a de puissants antagonistes de l'hormone sur la secretion d'amylase pancreatique induite par la bombesine. Dans une troisieme partie, nous avons synthetise des analogues cycliques de la bombesine. Ces composes n'ont aucune activite biologique

De nos jours, les troubles du comportement alimentaire (TCA) sont un problème de santé publique majeur dont les patients présentent une altération de la régulation de la prise alimentaire. Les taux plasmatiques de ghréline, la principale hormone orexigène, sont perturbés au cours de ces troubles. De plus, l'administration de cette hormone chez les patients obèses stimule plus efficacement leur prise alimentaire suggérant ainsi un meilleur transport de la ghréline qui pourrait être assuré par les auto-anticorps dirigés contre la ghréline. Au cours de ces travaux de thèse, le rôle des auto-anticorps dirigés contre la ghréline a été étudié dans les troubles de la prise alimentaire. Une augmentation d'affinité pour la ghréline des IgG plasmatiques a été retrouvée au cours de l'obésité. Cette augmentation était responsable d'une meilleure fixation de la ghréline et d'une diminution de sa dégradation. Au cours de l'anorexie, des changements contraires ont été observés. La co-injection de ghréline avec IgG de patients ou de souris obèses stimulait plus efficacement la prise alimentaire chez les rongeurs et limitait l'apparition du phénotype anorexique dans un modèle murin d'anorexie. Ainsi, l'implication des auto-anticorps dirigés contre la ghréline dans la physiopathologie des TCA et de l'obésité a pu être suggérée et leur potentiel rôle dans le traitement de l'anorexie démontré. Le versant hédonique du contrôle de la prise alimentaire a également été étudié. En effet, l'influence de l'infusion d'un neuropeptide anorexigène l'a-MSH sur la libération de dopamine au niveau de l'aire hypothalamique latérale et du noyau accumbens a été observée par microdialyse
Nowadays, food intake disorders are a major public health problem. In those patients, a modification of their food intake regulation is observed. Plasmatic levels of ghrelin, the main orexigenic hormone, are impared in those diseases. Moreover, in obese patients, ghrelin injections are more efficient on food intake than in normal persons suggesting a better transport of this hormone in the blood circulation. Ghrelin reactive auto-antibodies could be responsible for this transport improvement. In this thesis work, the implication of the ghrelin reactive auto-antibodies was studied in food intake disorders. An affmity increase for ghrelin was identified in ghrelin reactive auto-antibodies from obese patients. It was responsible for a ghrelin effects improvement by a better transport due to the fixation increase and a better protection from its degradation. In anorexia, opposite changes were observed. Moreover, the co-injection of ghrelin with immunoglobulins from obese patients or mice stimulated more efficiently food intake and was beneficial against the anorectic phenotype in a murine model of anorexia. So, the implication of the ghrelin reactive auto-antibodies in the physiopathology of food intake disorders and their potential interest in the treatment of anorexia was demonstrated. The hedonic control of the food intake was also studied in this thesis. Indeed, the influence of a-MSH, an anorectic peptide, was studied by microdialysis on the dopamine liberation in lateral hypothalamic area and the nucleus accumbens

Le present travail est consacre au developpement, en collaboration avec les laboratoires fournier, de sondes non-peptidiques originales tritiees et/ou photoactivables dans le cadre de l'etude cartographique du recepteur at#1 de l'angiotensine 2, plus particulierement de l'analyse topographique de son interaction avec les ligands peptidiques et non-peptidiques. La strategie suivie pour leur conception est: 1) synthese et etude des proprietes de liaison de 2 non-peptides trities: (#3h)lf7-0156 et (#3h)lf8-0129 qui ont de plus permis d'evaluer l'incidence de mutations du recepteur sur la reconnaissance des non-peptides, 2) synthese des 2 derives photoactivables non-radioactifs, susceptibles de marquer des zones distinctes du recepteur, demonstration de la superiorite de l'un des 2, lf13-0023, a marquer irreversiblement les sites recepteurs, 3) synthese de la sonde photoactivable tritiee (#3h)lf13-0023, demonstration de son aptitude a photomarquer le recepteur at#1 recombinant exprime dans les cellules cho, avec un rendement eleve (10%). Sont proposees des etapes de purification partielle des complexes covalents non-peptide/recepteur qui permettront leur fragmentation et la comparaison des profils de fragmentation avec ceux obtenus avec des sondes peptidiques ; la perspective est d'obtenir des informations directes en faveur ou a l'encontre de points d'interaction communs du recepteur avec les 2 types de ligands. Il est prevu d'integrer les donnees biochimiques et de mutagenese dirigee dans l'elaboration de modeles d'interaction des ligands peptidiques et non-peptidiques avec le recepteur at#1

Cette etude porte sur les relations structure-activite dans l'heptapeptide c-terminal responsable de l'activite biologique de la cholecystokinine (cck); en particulier, nos syntheses ont porte sur les acides amines en position 32 et 33. Ces syntheses ont ete effectuees en phase liquide par la methode des esters actives ou grace au reactif de castro (b. O. P. ). La suppression de la phenylalanine en position 33 conduit a un analogue antagoniste des recepteurs de la cck: la cck-27-32-nh::(2). Ce compose nous a amene a elaborer toute une famille de tri- et tetrapeptides qui inhibent la secretion acide induite par la gastrine, hormone apparentee a la cck. Par cette etude on a mis en evidence le role fondamental du residu c-terminal de la cck pour l'activite biologique intrinseque de la cck et de la gastrine

La neurotensine (NT) est un peptide de 13 acides aminés présent tant au niveau central que périphérique. La NT agit à la fois comme un neurotransmetteur, une neurohormone ou un facteur trophique. A ce jour, trois récepteurs de la NT ont été identifiés chez les mammifères et nommés NTR1, NTR2 et NTR3. Chez les vertébrés, la stéroi͏̈dogenèse surrénalienne est soumise à un contrôle multifactoriel qui met en jeu des facteurs humoraux, nerveux et paracrines. La présence de NT a été rapportée dans les cellules chromaffines et des fibres nerveuses de la glande surrénale chez diverses espèces de vertébrés, suggérant que la NT pourrait être un facteur neuroendocrinien de régulation de la stéroi͏̈dogenèse surrénalienne. Les objectifs de notre travail étaient donc i) de rechercher la présence de la NT dans la surrénale chez la grenouille verte Rana esculenta et l'homme, ii) de déterminer les effets potentiels de la NT sur la stéroi͏̈dogenèse surrénalienne et iii) de caractériser le récepteur impliqué dans les effets corticotropes du peptide. Nos résultats démontrent que la NT, localisée dans des fibres nerveuses parcourant la glande surrénale de la grenouille, stimule la sécrétion de corticostérone et d'aldostérone par l'intermédiaire de deux récepteurs qui s'apparentent aux NTR1 et NTR2 décrits chez les mammifères. Nous avons également démontré que la [DTyr11]NT stimule l'activité sécrétrice des cellules corticosurrénaliennes via l'activation d'un récepteur différent de ceux de la NT. Enfin, certains fragments issus de la NT comme la NT1-11 augmentent la production de corticostérone et d'aldostérone par le biais d'un quatrième type de récepteur. Chez l'homme, la NT1-11 inhibe la sécrétion basale de cortisol par des cellules corticosurrénaliennes via l'activation d'un récepteur capable de lier également la NT. Ces données suggèrent pour la première fois l'existence de deux sous-types de récepteurs de la NT, différents des NTR1 et NTR2 de mammifères, exprimés au niveau surrénalien
Neurotensin (NT) is a tridecapeptide which acts as a neurotransmitter and/or a neuromodulator in the central nervous system and displays a wide spectrum of biological effects. NT is also abundant in the periphery where it is thought to function as a neurohormone. In mammals, the effects of NT are mediated by three types of receptors i. E. NTR1, NTR2 and NTR3. In vertebrates, the secretory activity of adrenocortical cells is under multifactorial control. Beside the humoral regulation there is clear evidence that various factors released by nerve endings, chromaffin cells or endothelial cells can also participate in the regulation of the activity of adrenocortical cells. The presence of NT has been reported in chromaffin cells and nerve fibers located in the adrenal gland of various vertebrate species, suggesting that NT could act as a neuroendocrine factor involved in the regulation of steroidogenesis. The aim of the present study was therefore three-fold i) to examine the presence of NT in the frog (Rana esculenta) and human adrenal gland, ii) to determine the potential effects of NT on adrenal steroidogenesis in both species, and iii) to characterize the receptor(s) involved in the corticotropic effect of the peptide. Our results demonstrate that NT, located in nerve fibers innervating the adrenal gland of amphibians, may stimulate corticosteroid secretion through two receptors which exhibit similarities with mammalian NTR1 and NTR2. We have also shown that [DTyr11]NT increases corticosteroid secretion through interaction with a third type of receptor which is not activated by NT. Finally, the N-terminal NT fragments are able to stimulate corticosterone and aldosterone secretion though activation of a fourth type of receptor. In human, NT1-11 inhibits cortisol secretion via a receptor which also binds NT. These data suggest for the first time the occurrence of two additionnal NT receptor subtypes, besides mammalian NTR1 and NTR2, in the adrenal cortex

L'objectif de ce travail est la recherche du rôle biologique de la TRH pancréatique. La TRH a été initialement isolée de l'hypothalamus et caractérisée comme pGlu-His-ProNH₂. Elle a ensuite été détectée dans le pancréas endocrine désigne comme deuxième site de synthèse du peptide. La TRH est synthétisée à partir d'un précurseur de haut poids moléculaire. La maturation complète de celui-ci génèrerait 5 molécules de TRH, et 7 peptides de connexion. Nous avons montré que la TRH secrétée par le pancréas a les mêmes caractéristiques chromatographiques que le peptide synthétique. La sécrétion de la TRH pendant le développement est stimulé par le glucose et l'arginine, tandis que ces mêmes secretagogues inhibent la sécrétion chez l'adulte. Fait intéressant, la sécrétion de la TRH augmente avec l’âge, en dépit de la chute des contenus pancréatiques. Nous avons caractérise deux peptides de connexion de la prepro-TRH: prepro-TRH160-169 et prepro-TRH178-199, dans des ilots de Langerhans, et le prepro-TRH178-199 dans le milieu de sécrétion. Concernant le rôle biologique de la TRH pancréatique, nous avons montré que: la TRH exogène stimule la sécrétion basale du glucagon; l'immunoneutralisation de la TRH endogène secrétée par l'anticorps anti-TRH inhibe significativement la sécrétion du glucagon induite par l'arginine, la sécrétion de somatostatine est légèrement inhibée. Sur une fistule pancréatique, la TRH inhibe la sécrétion exocrine des protéines, bicarbonates, et du sodium. Les résultats préliminaires sur les cellules acinaires indiquent une absence d'effet TRH. L'effet TRH, observe in vivo, serait medié par le système nerveux central. Au cours du développement, la TRH n'a pas d'effet sur les secrétions d'insuline et glucagon. Nous pensons qu'elle agirait sur le processus de prolifération des cellules insulaires. La TRH stimule la sécrétion du glucagon des cellules alpha. Il serait intéressant de rechercher l'action biologique des deux peptides de connexion. La détermination du mécanisme d'action de la TRH pancréatique implique la caractérisation des sites de liaison spécifiques. Ce travail a été publié dans: Endocrinology 1992, 130(3):1371-1379; Endocrinology 1992, 131(2) (à paraitre en aout); prostate tumeurs 1991, (7):9-10 et 1992(9):6-7.

Le VIP, le PHI/PHM ou le PACAP sont des neuropeptides impliqués dans le développement du système nerveux. Leurs effets sont transmis par les récepteurs VPAC1/2, polyvalents pour le VIP et le PACAP et PAC1 spécifique du PACAP. Un récepteur spécifique pour le PHI/PHM n'a pas encore été identifié. Le PHI peut interagir avec une haute affinité sur des sites insensibles au GTP, essentiels au neurodéveloppement des Rongeurs. Nous avons montré que: (i) Le PHI se lie sur des sites de haute affinité insensibles au GTP, dans différents organes de Rat nouveau-né. La sensibilité au GTP varie de 31 à 100% selon les tissus considérés chez l'adulte. Un composant de 24 kDa, apparenté à la calmoduline, pourrait réguler cette sensibilité au GTP au cours du développement. (ii) Le PHM et le VIP activent la croissance des lymphoblastes humains H9. Des sites de liaison de haute affinité appartenant probablement au récepteur VPAC1, insensibles au GTP, transmettraient les effets mitogènes du PHM
The neuropeptides VIP, PHI/PHM or PACAP modulate cells proliferation and differentiation, necessary for a normal neurodevelopment. They interact to VPAC1/2, receptors polyvalent for VIP and PACAP and PAC1, the PACAP-preferring receptor. A PHI/PHM specific receptor is not yet characterized. PHI can bind to high affinity GTP-insensitive sites, implicated in the Rodent neurodevelopment. We demonstrated that: (i) PHI could interact with high affinity GTP-insensitive sites only, in different newborn Rat tissues. GTP-sensitivity varied from 31 to 100% in the adult Rat tissues tested. A 24 kDa component, maybe a calmodulin-like protein, could regulate PHI binding sites GTP-sensitivity depending on developmental stages. (ii) PHM and VIP could stimulate the human H9 lymphoblasts proliferation. The VPAC1 receptor could probably transmit the PHM effects through high affinity GTP-insensitive binding sites

La POMC-A de truite possède une extension C-terminale (KREQWGREEGEEKRALGERKYHFQG). A l'aide d'anticorps spécifiques, une immunoréactivité de type EQWGREEGEE et YHFQ-NH2 a été localisée chez la truite arc-en-ciel adulte au niveau de cellules hypophysaires, de corps cellulaires hypothalamiques et de fibres nerveuses. L'analyse par HPLC couplée à une détection radioimmunologique a révélé l'existence de deux décapeptides EQWGREEGEE et ALGERKYHFQ-NH2. Les peptides apparentés à EQWGREEGEE ont été détectés dans l'hypophyse tôt au cours de l'ontogenèse et plus tardivement dans le cerveau. La maturation protéolytique du domaine C-terminal de la POMC-A génère deux formes peptidiques à différents stades du développement et diffère de celle observée chez l'adulte. Ainsi, la maturation post-traductionnelle de la POMC-A conduit chez la truite à la formation de deux nouveaux décapeptides qui pourraient exercer des fonctions biologiques en tant qu'hormones, neurotransmetteurs et/ou neuromodulateurs
The trout POMC-A exhibits a unique C-terminal extension (KREQWGREEGEEKRALGERKYHFQG) which has not been found in any other species investigated to date. Using specific antibodies, we have localized in the adult rainbow trout EQWGREEGEE- and YHFQ-NH2-immunoreactive material in numerous pituitary cells, hypothalamic perikarya and nerve fibers. HPLC analysis combined with radioimmunoassay detection has revealed the existence of two decapeptides EQWGREEGEE and ALGERKYHFQ-NH2. The presence of EQWGREEGEE-related peptides was detected in the trout pituitary early during ontogeny and in the brain only later. Processing of the C-terminal domain of POMC-A yieLds two peptide forms at different stages of development and differs from that observed in the adult. In conclusion, postranslational processing of POMC-A generates, in pituitary and various brain regions of the trout, two novel decapeptides that may exert biological activities as hormones, neurotransmitters and/or neuromodulators

Dans ce mémoire nous présentons une nouvelle méthode de marquage au tritium d'hormones peptidiques. Cette méthode fait appel à une protéase, la carboxypeptidase Y qui catalyse la formation de liaisons peptidiques, pourvu que les conditions thermodynamiques soient favorables. L'action réversible de la CPD-Y a été appliquée à la synthèse totale d'un pentapeptide, la Leucine-enképhaline, tritié sur chaque acide aminé, et dont la radioactivité spécifique est de 139 Ci/mmole. Le peptide obtenu présente, en outre, des propriétés biologiques (liaison aux récepteurs et immunoréactivité) identiques à celles de Leucine-enképhaline native
In this thesis we present a new tritium-labelling method of peptidic hormones. This method uses a proteolytic enzyme, carboxypeptidase Y, to catalyse peptide bonds. It has been applicated to stepwise synthesis of tritiated Leucine-enkephalin. The pentapeptide, labelled on each amino acid, has a specific radioactivity of 139 Ci/mmole. Moreover its biological properties (immunoreactivity and binding to specific receptors) are identical to native Leucine-enkephalin

La plupart des espèces restreignent leur fertilité à une période limitée de ,'année pour que la naissance des petits ait lieu au moment le plus favorable à leur survie, Par exemple, chez le hams1er Syrien mâle (Mesocricetus 8Ura!US), l'exposition à une phofopériocte courte (PC; 10h lumière / 14h obscurité) mimant la saison hivernale cause une Inhibition de l'axe reproducteur conduisant à une atrophie des testicules en 8 à 10 semaines. Les animaux ne sont alors plus en mesure de se reproduire. Chez les rongeurs salsonniel'8, la lecture du temps annuel se fait par l'intermédiaire de la mélatonine. Une hormone produite par la glande pinéale et doot la libération est proportionnelle à la durée de la nuit. En hiver, lorsque les nuits sont longues (PC), le pic noclume de mélatonlne l'est aussI. Inversement, en été (photopérlode longue, PL), lorsque les nuit sont courtes, la durée du pic nocturne de mélatonlne est réduite. Le message photopérlodique est ainsi converti en message hormonal capable de synchroniser la fonction de reproduction avec les saisons. Bien qu'exerçant un effet puissant sur l'axe gonadotrope, les sites d'actiOnsde la mélatonine demeurent mal connus. Nous avons récemment démontré que la mélatonlne contrôle l'expression de plusieurs gènes Impliqués dans la fonction de reproduction. Parmi ces gènes, Kissl code pour une fanille de pepUdes, les kisspeplines (Kp), qui se llent tous au même récepteur, le Klss1r, Les Kp Jouent un rOle crucial dans l'activation de l'axe gonadotrope car il a été démontré qu'une mutation perte de fonction dans le gène KIss1r empêche le declenchement de 13 puberté aussi bien chez l'être humain que chez la souris. Mon travall de thèse a consisté a étudier l'Implication des Kp dans les cycles saisonniers d'activité de l'axe gonadotrope chez le hamster et s'est articulé autour de trois grands axes. En premier lieu, la cartographie complete du système kisspeptlnergique a été réalisée par immun. Ohistochimle et hybridation in situ non radioactive chez le hamster Syrien mâle en PL (14h lumière 1 10h obscurité) (Ai). Deux populaUons de neurones exprimant l'ARNm du gene Kiss1 et les Kp ont ainsi été identifiées dans le noyau arqué (ARC) et le noyau antéroventrsl péri-ventriculaire (AIJPV). Des fibres à Kp ont été observées dans ces deux structures ainsi que dans d'autres réglons hypothalamiques (noyau préoptique médian, aire pré-optique médiane, aire hypothalamique antérieure, noyau paraventriculaire, hypothalamus dorsomédian) et extra hypothalamiques (noyau du lit de la strie terminale, noyau paraventriculaire du thalamus, amygdale centrale). L'expression du système kisspeptinergique etant fortement dépendante de la photoperiode, la cartographie de ce système a également été réalisée chez des hamstersimputée à la diminution du taux de testostérone. En revanche, dans l'AVPV où la testosterone exerce un rétrocontrOle positif. Nous avons démontré que le diminution de l'expression de Kiss1 en PC ou induite par la mélatonine est due à un effet indirect via la diminution des taux clrculants de testostérone. L 'ensemble de ces résultats Indique que dans l'ARC, la PC réduit l'expression de KIss1 par un effet direct de la mélatonlne sur l'hypothalamus alors que dans l'AVPV, la mélatonine diminue l'expression de Kiss1 via une réduction du taux de testostérone. L 'AVPV est une des réglons sexLJeliement dlmorphiques du cerveau et l'expression de Kiss1 est plus importante chez la femelle que chez le mâle. Afin d'approfondir nos données obtenues chez le mâle, l'effet de la mélatonine et de l'oestradiol sur j'expression de Kiss1 dans l'AVPV a été étudié chez le hamster Syrien femelle el des résultats similaires ont étés obtenus (A3). Dans une troisième partie, nous avons analysé les sites d'action périphériques des Kp (A2). Au laboratoire, nous avions démontré que l'administration chronique intracérébroventrlculaire de Kp durant 4 semaines ré-active l'axe gonadotrope du hamster doré mâle maintenu en PC, indiquant que les Kp sont capables de surpasser l'effet inhibiteur de la mélatonine sur J'axe gonadotrope. Des études précédentes chez le rat et la souris ayant démontré que les Kp stimulent l'axe gonadotrope lorsqu'elles sont administrées par voie cenlrale ~CV) ou périphérique (intrapéritonéale), nous avons étudié l'effet de l'administration chronique périphérique de Kp sur l'axe gonadotrope du hamster mâle maintenu en PC (A2). Nous avons testé différents protocoles d'administration de Kp et démontré que deux injections quotidiennes de Kp durant 5 semaines ré-activent l'axe gonadotrope. Afin d'identifier les structures cibles des Kp periphérlques, nous avons analysé l'expression de cFos aprés l'injection inlrapéritonêale de Kp (A2). Nous avons ainsi mis en évidence une forte activation de l'hypophyse anterieure par les Kp, activation dépendante du GnRH car abolie en présence d'acyJine, un antagoniste du GnRH. En conclusion, ce travail de thèse a permit de démontrer non seulement que Je système kisspeptinergique est fortement dépendant de la photopériode et de la mélatonine (via des mécanismes directs ou faisant intervenir les variations saisonnières du taux de stéroïdes sexuels circulantsJ, mais aussi que les neurones a Kiss1 répercutent l'information photoperiodique sur l'axe reproducteur, en particulier au niveau des terminaisons des neurones il GnRH de l'éminence médiane
To ensure the birth of the offspring at the most favourable time of year, photoperiod (or day-Iength) is "read" by most seasonal breeders to reslrict their fertility 10 a particular season. Annual variations of the photoperiod are translated into the release of the pineal hormone melatonin, the noctumal production of which relies on night-Iength. Previous experiments have demonstrated that the annual variations of melatonin secretion synchronise reproductive activity with seasons. For instance, exposure to a long nocturnal peak of melatonin for 8 to 10 weeks (like in short days conditions, SD) induces a marked gonadal atrophy in male Syrian hamsters (Mesocricetus auratus). Conversely, when transferred back ta long days (LD), a condition in which the nocturnal peak of melatonin is short, hamsters become sexually active within 6 weeks. Despite ils strong action on the reproductive axis, the precise sites and mechanisms of action of melatonin are still unclear. We recentiy reported that in the Syrian hamster, melatonin inhibits the expression of several hypothalamic genes, including Kissl, which might mediate the photoperiodic message to the reproductive axis. Kiss 1 encodes a family of peptides, the kisspeptins (Kp), that ail bind to the same receptor, Kiss1 r. Kp play a crucial role in the activation of the gonadotropic since a loss-of-function mutation in Kiss 1 r prevents puberty humans and rodents. My thesis work consisted in studying the implication of Kiss l-encoded peptides (kisspeptins, Kp) in the seasonal cycles of the reproductive activity. In a first part, the anatomy of the kisspeptinergic system was characterised in the Syrian hamster's brain in bath LD sexually active and SD sexually inactive individu ais. In a second part, investigated how photoperiod affects Kiss 1 expression and finally, in a third part, analysed the effects of exogenous administration of Kp and its site of action on the reproductive axis First of ail, the distribution of Kp fibres and cell bodies was characterised in the Syrian hamster's by immunohistochemistry and non-radioactive in situ hybridlsation. Two populations of Kiss 1 neurones were identified in the Arcuate nucleus (ARC) and in the Anteroventral periventricular nucleus (AVPV). Kp immunoreactive fibres were observed in both nucleus and in other hypothalamic (preoptic median nucleus, preoptic median area, anterior hypothalamic area, paraventricular nucleus, dorsomedial hypothalamus) and extra hypothalamic structures (Bed nucleus of stria terminalis, paraventricular nucleus of the thalamus, central amygdala). Since Kiss 1 expression is highly dependent on photoperiod, the distribution of Kp immunoreactive fibres was also analysed in SDadapted hamsters. The number of Kissl and Kp neurones is strongly decreased in SD sexually inactive hamsters. Fibres distribution is identical as in LD but fibres density is higher in SD, probably because of an accumulation of Kp into the fibres. To determine wether these fibres innervate fibres-containing structures or just go through them, we analysed the expression of cFos (a marker of cellular activity) alter an intracerebroventricular (ICV) injection of Kp and we found that cFos expression is increased in the preoptic median nucleus, the preoptic medial area, the paraventricular nucleus, the dorsomedial hypothalamus, the bed nucleus of stria terminalis and the paraventricular nucleus of the thalamus. This indicates that these brain structures areIrlnervalea Dy Kp libres and aclivated upon Kp release. The phenotype of the target neurones however remains to be determined. Ln a second part, 1 analysed how photoperiod affects Kiss 1 expression in the Syrian hamster. First of ail, we demonstrated that Kissl mRNA is highly expressed in the ARC and AVPV in LD-adapted male or female hamsters, while exposition to SD condition drastically reduces the number of Kiss 1 neurones in both structure and sex. Dally melatonin injections mimicking SD-like melatonln levels reduces Kissl expression in ARC and AVPV. By contrast pinealectomy in SD-adapted hamsters Increases the number of Kissl neurones in both nuclei, showing that melatonin mediates the effect of photoperiod on Kiss 1 neurones. The kinetic of melatonin effect on Kiss 1 neurones was also analysed and one or three weeks of daily melatonin injections do not affect Kissl expression whereas alter eight weeks of treatment, Kiss 1 expression reaches its minimal level. Noteworthy, SD exposure induces gonadal regression as weil as a massive reduction in testosterone levels. In rats and mice, testosterone strongly regulates Kissl expression in both ARC and AVPV and the SD- or melatonin-induced reduction in the number of Kissl neurones could be secondary to variations in testosterone plasmatic concentration. As a consequence, 1 also analysed the effect of gonadal hormones on Kissl expression in the Syrian hamster and 1 observed that testosterone up-regulates Kissl expression in the AVPV and down-regulates the number of ARC Kissl neurones. Thus, the SD- or melatonin-induced reduction in the number of ARC Kissl neurones is not secondary to a reduction in testosterone level. By contrast, in the AVPV where testosterone is stimulatory, the SD- or melatonin-induced down-regulation of Kiss 1 expression was found to be mediated by the SD- or melatonin-induced decrease in gonadal hormones levels. Ali together these data indicate that the SD-induced reduction in the number of ARC Kissl neurones is due to a direct effect of melatonin on the hypothalamus whereas the decrease in the number of AVPV Kiss 1 neurones is secondary to a reduction of testosterone levels. The AVPV is a sexually dimorphic brain nucleus with Kissl expression being higher in females. Thus, the effects of melatonin and oestradiol were analysed in females hamsters as weil and similar results were observed. Finally, in a third part, 1 analysed peripheral Kp sites of action. In the lab, we demonstrated that Kp chronic intracerebroventricular treatment for 4 weeks re-activates gonadal activity in SD-adapted male hamsters. This indicates that Kp overpass melatonin inhibitory effect on the reproductive axis. Previous studies showed that Kp trigger LH, FSH and sex steroids release when given centrally or peripherally. 1 thus studied the effect of several protocols of peripheral Kp long-term administration to SDacclimated sexually inactive Syrian hamsters. We demonstrated that 2 daily IP injections of Kp during 5 weeks restore gonadal activity. To identify the structure(s) involved in the peripheral effect of Kp, we studied the expression of cFos alter IP Injection of Kp. The anterior pituitary was found to strongly express cFos and this Kp-induced activation is GnRH-dependent since a GnRH antagonist prevented il. To conclude, this PhD work not only proved that the Kp system is strongly regulated by photoperiod and melatonin (via distinct mechanisms involving both direct effects and seasonal variations in gonadal hormones levels), but also that Kiss1 neurones impacts the photoperiodic message on the reproductive axis, probably at the level of GnRH nerve terminais of the median eminence

Bien que la regulation de la secretion de gh soit influencee par de nombreux facteurs aussi bien physiologiques (stress, alimentation, pulsatilite. . . ) que pharmacologiques, la voie finale de ce controle est exercee par l'hypothalamus, principalement par l'interaction de deux hormones hypothalamiques la gh-rh dont l'action est stimulante et la srih qui est inhibitrice. Dans le but de mieux comprendre ces interactions ainsi que le role respectif de ces deux neuropeptides dans le controle de la secretion somatotrope, nous avons utilise deux approches experimentales differentes et complementaires: l'une directe, permettant de mesurer la liberation de gh-rh et de srih dans le sang porte-hypophysaire du mouton dans des conditions basales, ou stimulee par un stress ou par des agents pharmacologiques, et l'autre indirecte, consistant a etudier les effets de l'immunoneutralisation gh-rh et la srih endogenes sur la secretion de gh, basale et stimulee. Les resultats obtenus chez le mouton a partir de ces deux methodes montrent que la gh-rh est le facteur principal du controle de la secretion pulsatile de gh et joue un role essentiel dans la stimulation de la fonction somatotrope induite par le stress ainsi que par les differents agents pharmacologiques testes. En revanche, le role physiologique de la srih est plus difficile a demontrer chez le mouton. En effet, son role dans la pulsatilite de la secretion de la gh semble minime au contraire du rat, et elle ne semble pas impliquee dans l'induction de la periode refractaire induite par la gh-rh, mais elle participe a la prevention de la desensibilisation des cellules somatotropes

Ce travail se situe a l'interface de la chimie et de la biologie. La chimie peptidique et pseudopeptidique a comme principal objectif la synthese d'outils pharmacologiques indispensables a la comprehension des phenomenes cellulaires complexes. Au cours de ce travail nous avons aborde, la synthese d'inhibiteurs necessaires pour la caracterisation d'une activite enzymatique, et la synthese d'analogues peptidiques afin de decrire les relations structure fonction d'un peptide et de son recepteur. Le depot amyloide de peptide a est sans doute l'evenement central qui rend compte de l'etiologie de la maladie d'alzheimer. La synthese d'inhibiteurs d'une des activites enzymatiques impliquee dans la liberation de ce peptide a ete l'objectif de ce travail. Cette activite appelee secretase pourrait appartenir a la famille des protease acide ou des metalloproteases. L'utilisation de la chimie combinatoire a conduit a la synthese d'une librairie pseudopeptidiques incorporant un motif chimique specifique des proteases acides. Les resultats biologiques obtenus nous ont conduit ensuite a la synthese de pseudopeptides inhibiteurs d'enzymes de type metalloprotease. D'autre part la synthese de ce peptide a long de 42 amino acides a ete effectuee en phase solide. Cette strategie est rapide et efficace et permet d'obtenir le produit final avec une purete satisfaisante. La derniere partie de ce travail concerne la synthese d'analogues du peptide intestinal vasoactif. L'incorporation d'une alanine sur chacune des 28 positions des acides amines constitutifs du vip, nous a permis d'obtenir des informations sur la relation structure fonction de ce peptide vis a vis de ses deux sous-types de recepteurs.

Ce travail est consacré à la synthèse d'hélices artificielles construites à partir d'un enchaînement de mimes contraints de dipeptides triés dans la littérature. La sélection des molécules candidates susceptibles de donner par leur enchaînement des structures en hélice a été réalisée à l'aide de la modélisation moléculaire.
Parmi ces molécules, l'acide-2-méthylaminophénylacétique (Ortho) a été utilisé pour construire différents oligomères. Les conformations des monomères Boc-Ortho-OH et Boc-Ortho-NHiPr ont été caractérisées par des études cristallographiques. Les analyses conformationnelles réalisées par RMN sur Boc-(Ortho)2-NHMe, Piv-(Ortho)2-NHMe, Boc-(Ortho)3-NHMe et Piv-(Ortho)3-NHMe semblent être en accord avec les prédictions des études de modélisation qui donne une structuration en hélice de type H1-10.
Le remplacement d'une partie et de la totalité de l'hélice α du hCRF (une hormone peptidique de 41 acides aminés) par des enchaînements de molécules contraintes a été réalisé en développant différentes stratégies en phase solide. Cependant, les tests de liaison des molécules au récepteur ont montré que les séquences 6-34 et 20-34 du hCRF ne pouvaient être remplacées sans perte totale de la liaison. Le même travail a été réalisé pour l'antagoniste 9-41hCRF où la substitution de la partie 9-34 entraîne une perte de la liaison au récepteur.

Le laboratoire développe un programme de recherche centré sur la conception et la synthèse de nouveaux antagonistes non peptidiques du récepteur de l’Urotensine II humaine. L’Urotensine II humaine est un peptide fortement vasoconstricteur et un ligand endogène du récepteur GPR14. Peu d’antagonistes sont décrits à ce jour dans la littérature, aussi de nouveaux antagonistes plus actifs pourraient avoir des applications dans le traitement de certaines pathologies vasculaires, notamment dans l’hypertension artérielle. Le laboratoire de modélisation moléculaire a élaboré un pharmacophore des antagonistes non peptidiques du récepteur GPR14 et un pharmacophore issu de la structure de l’UIIh résolue par RMN. Un criblage virtuel, réalisé sur la chimiothèque du CERMN et basé sur ces pharmacophores, a permis la mise en évidence de la famille des thiénoimidazolones comme affine pour ce récepteur avec un hit actif à 3,3 μM, le mr26207. Un travail de pharmacomodulations a été engagé à partir de ce hit dans cette famille afin d’améliorer son affinité vis-à-vis du récepteur GPR14. La synthèse chimique des nouveaux composés et les premiers résultats biologiques sont présentés. Parallèlement, nous avons développé une voie originale d’accès à des 3-aminothiéno[3,2-c]pyrazoles, isostères des thiéno[2,3-d]imidazoles, en utilisant une réaction d’amination catalysée par le palladium et avons étendu cette méthode à l’obtention de 3-aminoindazoles. Cette nouvelle plateforme hétérocyclique thiophénique pourrait être utilisée pour développer de nouveaux ligands du récepteur GPR14 mais aussi plus largement dans d’autres programmes de chimie médicinale
The laboratory is developing a research program based on the design and the synthesis of new non peptidic antagonists for the human urotensin II receptor. Human urotensin II is a vasoconstrictor peptide and an endogenous ligand for the GPR14 receptor. Only a few antagonists have been described in the literature, so new and more active antagonists could have applications in the treatment of vascular pathologies, notably in the arterial hypertension. The molecular modeling laboratory has defined a pharmacophore of non peptidic antagonists for the GPR14 receptor and a pharmacophore based on the UIIh structure resolved by NMR. A virtual screening of CERMN’s chemolibrary based on these pharmacophores has allowed us to underline the thienoimidazolone family as affine to this receptor with an active hit, the mr 26207 (IC50=3. 3μM). Based on this hit, a pharmacomodulations work was engaged in this family to improve its affinity towards GPR14 receptor. We present here the synthesis of new compounds and the first biological results in this series. We also have developed an original access to 3-aminothieno[3,2-c]pyrazoles, which could be considered as isoteres of the thienoimidazole ring, using a palladium-catalyzed amination reaction. Extension of this reaction to the synthesis of 3-aminoindazoles has been realized. This new heterocyclic scaffold could be used for the synthesis of new GPR14-receptor ligands and in other medicinal chemistry programs as well

Afin de permettre une meilleure compréhension du contrôle (neuro)endocrine de la reproduction des mollusques bivalves, des récepteurs couplés aux protéines G et des (neuro)peptides ont été recherchés chez Crassostrea gigas. Plusieurs variants transcriptionnels issus d'un gène unique codant les récepteurs Cg-GnRH-R, Cg-GnRH-RII et Cg-GnRH-RIII orthologues des récepteurs de type GnRH ont été caractérisés. La structure de ces récepteurs indique que Cg-GnRH-R d'une part et Cg-GnRH-RII/Cg-GnRH-RIII d'autre part constituent deux sous-types de récepteurs en terme de liaison du ligand. L'étude de l'expression de ces transcrits montre une régulation tissulaire spécifique de l'épissage alternatif de l'ARN pré-messager. Les transcrits codant Cg-GnRH-R s'expriment spécifiquement dans la gonade et ceux codant Cg-GnRH-RII et Cg-GnRH-RIII sont observés dans les tissus reproducteurs et non reproducteurs. Ainsi, le ligand lié par Cg-GnRH-R serait spécifiquement impliqué dans la régulation de la gamétogenèse et celui lié par Cg-GnRH-RII ou Cg-GnRH-RIII contrôlerait des fonctions reproductrices et non reproductrices. Dans la gonade, l'expression des différents ARNm est plus forte chez le mâle que la femelle et ce, à tous les stades de la gamétogenèse. Les mécanismes de contrôle de la reproduction entre mâles et femelles feraient donc intervenir des modalités distinctes notamment par l'expression différentielle de cette famille de récepteurs. Bien que la parenté évolutive de ces récepteurs avec les récepteurs de type GnRH ne signifie pas que leurs ligands soient de la GnRH, il est intéressant de constater que par immunohistochimie un peptide apparenté à la GnRH a été détecté chez C. Gigas.

Dans ce travail nous fait l'etude comparative, par resonance magnetique nucleaire (rmn) du proton (#1h) et du phosphore 31 (#3#1p), de pancreas de rats stimules par la ceruleine et de pancreas de rats a jeun. L'hplc et les controles cytologiques ont ete utilises pour apporter une confirmation a nos resultats. L'analyse par rmn #1h de la stimulation du pancreas par la ceruleine determine l'apparition d'une resonance a 1,80,2 ppm du pic de l'eau tissulaire ou 3,00,2 du tetramethylsilane pris comme reference externe. Parallelement les analyses relaxometriques ont monte que le temps de relaxation t#1 etait significativement augmente dans un pancreas stimule. La rn du #3#1p nous a permis d'observer une augmentation relative de phosphocreatine en debut de stimulation, suivie d'une baisse au moment ou la concentration d'atp augmente, et une augmentation significative de la glycerophosphorylcholine. Ces resultats suggerent que la resonance a 1,80,2 ppm serait liee a une augmentation du metabolisme des phospholipides et/ou a une augmentation de la fluidite membranaire. Un mouvement de protons consecutif a l'exocytose des grains de zymogene, accompagne d'une hydratation des produits enzymatiques excretes se traduirait par un accroissement des temps de relaxation. La synthese de pcr en debut de stimulation permettrait la phosphorylation de l'adp en atp afin de fournir l'energie necessaire aux multiples reactions cellulaires consecutives a la fixation de la ceruleine sur ses sites specifiques et l'expulsion hors de la cellule des grains de zymogene, alors que l'augmentation de la glycerophosphorylcholine serait le reflet probable de l'augmentation du turnover des phospholipides. Les analyses cytologiques, en microscopie photonique et electronique, ont egalement montre une augmentation importante des phenomenes d'exocytose des grains de zymogene qui serait un apport de membrane a l'apex des cellules acineuses et une augmentation de la fluidite des membranes

Ce travail de thèse a consisté à synthétiser des peptides à visée antidiabétiques, à déterminer leur structure tridimensionnelle et à étudier leur activité biologique lors de tests biologiques in vitro et in vivo. Les peptides étudiés dérivent soit des chaînes A et B isolées de l’insuline humaine soit de peptides décrits dans la littérature comme ayant une activité biologique. L’effet pharmacologique des peptides a été testé sur des modèles cellulaires et sur un modèle animal. Les études structurales réalisées par RMN, DC et dynamique moléculaire ont permis de proposer un modèle tridimensionnel pour deux de ces peptides. Une approche séquentielle impliquant la reconstruction du pont disulfure à partir du dérivé dithiol a été suivie lors de simulations de l’ordre de la microseconde. Enfin, une méthode générale d’étude de l’impacte de pont disulfure intramoléculaire dans le repliement des peptides a été mise au point par dynamique moléculaire en présence de solvant implicite « GB »
This work of thesis consisted in synthesizing antidiabetic peptides with aiming, determining their three-dimensional structure and studying their biological activity during in vitro and in vivo biological essay. Studied peptides derive either from chains A and B isolated from human peptide insulin or described in the literature like having a biological activity. The pharmacological effect of peptides was tested on cellular models and an animal model. The structural studies carried out by NMR, CD and molecular dynamics made it possible to propose a three-dimensional model for two of these peptides. A sequential approach implying the rebuilding of the disulphide bridge starting from derived the sulfhydryl was followed during simulations of about a microsecond. Lastly, a general method of impact study intramolecular disulphide bridge in the folding of peptides was developed by molecular dynamics in the presence of implicit solvent "GB"

La ghréline est une hormone peptidique essentiellement d'origine gastrique. Elle a d'abord été identifiée comme un sécrétagogue de l'hormone de croissance (GHS) endogène qui lie le récepteur des GHSs de type la (GHSR-1a). Outre son activité sur la sécrétion de l'hormone de croissance, cette hormone stimule la prise alimentaire et la prise de poids. Cette thèse est consacrée d'une part, au criblage in vitro de nouveaux ligands du GHSR-1a et d'autre part, à l'étude des voies de signalisation du récepteur activé. Ce travail a abouti à la découverte d'une série originale d'agonistes et d'antagonistes de haute affinité également actifs in vivo chez le rat et qui fait actuellement l'objet d'un dépôt de brevet. De plus, l'étude de la voie de signalisation de ce récepteur suggère que son activation entraînerait des évènements transcriptionnels, impliquant notamment l'activation de la phospholipase C, de la protéine kinase C epsilon et des ERK1/2
Ghrelin is a predominantly gastric peptide hormone. It was first identified as a endogenous growth hormone secretagogue which binds to the GHS receptor type 1 a (GHSR-la). Apart from stimulating the secretion of growth hormone, ghrelin also stimulates appetite and causes weight gain. The work in this thesis firstly involved the in vitro study of new ligands for the GHSR-1a and secondly the study of the downstream signalling pathway through which the active GHSR-1a elicits its biological responses. This work has resulted in the discovery of a new series of ligands, which not only display high affinity for the GHSR-1a, but are equally active when tested in vivo in experiments using the rat. A patent application based on this series of ligands is currently under development. The work investigating the downstream signaling pathway of the active GHSR-la, suggests that Phospolipase C, Protein Kinase C (Epsilon) and ERK1/2 are involved. In addition, it appears that GHSR-1a signalling could play a role in the regulation of nuclear transcription factors

Un premier travail s'est articulé autour de la synthèse et de la conception d'inhibiteurs d'une enzyme : la Dipeptidyl Peptidase IV, reconnue comme nouvelle cible thérapeutique dans le traitement du diabète de type 2. Nous avons utilisé les techniques de la synthèse en phase homogène et sur support solide afin de proposer deux nouvelles voies d'accès au NVP-DPP-728, inhibiteur de référence de l'enzyme. Nous avons appliqué les principes de la chimie combinatoire et de la synthèse parallèle pour préparer une chimiothèque focalisée de 384 composés, construits autour du motif tétrahydroisoquinoléine. Cette étude nous a permis d'identifier des inhibiteurs actifs sur l'enzyme et d'émettre des hypothèses sur les interactions enzyme-substrats de certains composés, à partir de la structure radiocristallographique de la DPP-IV. Un second travail nous a amenés à concevoir une stratégie de modulation de la structure d'un antagoniste du récepteur GnRH, à sept domaines transmembranaires, couplé à une protéine G. De cette étude, une chimiothèque focalisée de 480 acylisothiourées a été synthétisée et a permis le criblage du récepteur, dans un test fonctionnel et dans un test d'inhibition de la liaison du ligand à son récepteur. Enfin, dans un troisième volet, nous présentons une toute autre approche, consistant à concevoir et à synthétiser des chimiothèques généralistes, construites autour de la structure originale spiro[1,5-benzoxazépine-2,4'-pipéridine], dite " privilégiée ". Ce travail nous a conduits à mettre au point différents protocoles en phase homogène, permettant la pharmacomodulation de ce motif. L'étude de la structure par RMN et radiocristallographie d'un composé a été réalisée, et la synthèse d'une chimiothèque de 480 composés nous a permis de valider ce concept par la découverte d'un composé actif sur un récepteur 7TM, présentant toutes les caractéristiques d'un candidat médicament.

L'utilisation de peptides natifs en tant que medicaments se heurte a des inconvenients inherents a leur metabolisme et a leur manque de specificite. C'est dans le but de resoudre ces problemes que l'axe de recherche concernant les peptidomimetiques contraints a ete developpe. Nous avons synthetise des perhydrodiazepinones dont la structure s'apparente a celle des coudes presents dans certains peptides. Dans ce manuscrit, nous avons decrit differentes voies de synthese dont la principale implique une reaction de mitsunobu afin de realiser l'etape-clef de cyclisation. Cette strategie de synthese a ete adaptee sur supports (polyethylene glycol et resine de wang) dans le but d'obtenir un maximum d'outils utilisables en chimie combinatoire pour construire des librairies de ce type de molecules. Dans la derniere partie, nous avons augmente la diversite moleculaire de la structure en effectuant une synthese a partir d'un pool chiral permettant le controle de la chiralite de l'ensemble des carbones asymetriques.

Le glucagon, hormone polypeptidique de 29 acides amines, est rapidement clive, lorsqu'il est incube a la surface de cellules hepatiques en culture, en c-terminal du doublet de residus arginine situe en position 17 et 18. Cette maturation proteolytique mene a la formation du glucagon 19-29, ou miniglucagon, molecule qui demontre une activite biologique completement differente de celle du glucagon. Plusieurs efforts ont ete menes dans le but d'isoler, a partir d'extraits de membranes hepatiques, l'activite proteolytique responsable de cette conversion. L'etude de cette activite purifiee permit d'identifier les principales caracteristiques enzymatiques de cette protease et d'obtenir une sequence peptidique partielle. Les resultats presentes dans ce memoire demontrent que cette sequence peptidique partielle provenait en fait d'une proteine mitochondriale, la sarcosine deshydrogenase, presente a l'etat de contaminant dans la preparation enzymatique purifiee. L'adnc de cette enzyme a ete clone et la proteine correspondante caracterisee biochimiquement. Une etude de la localisation tissulaire de l'enzyme a ete realisee, demontrant une expression forte au niveau du foie, ainsi qu'un niveau d'expression considerable dans d'autre tissus tels que le poumon, le pancreas, le rein, le thymus et l'oviducte. Afin d'identifier l'enzyme responsable de la generation du miniglucagon, trois proteases hepatiques de la famille des convertases apparentees a la subtilisine ont ete exprimees sous forme de proteine recombinantes et testees in vitro pour leur capacite a cliver le doublet arginine central du glucagon. Seul pace4, et non la furine ou pc7, a demontre une capacite a generer le miniglucagon, et ce de maniere tres efficace. Le profil enzymatique du clivage du glucagon par pace4 correspond bien aux caracteristiques de la protease partiellement purifiee de membranes de foie, notamment au niveau de l'inhibition par des doses nanomolaires d'insuline. Cependant, ces etudes ont egalement demontre la presence dans les extraits membranaires hepatiques d'au moins une autre protease susceptible de generer le miniglucagon, et dont l'activite est insensible a l'insuline.

La bradykinine (bk) est une hormone peptidique endogene de 9 aminoacides intervenant au niveau physiologique dans de nombreux phenomenes tels que la bronchoconstriction, la vasodilatation ou le declenchement du signal douloureux. A ce jour 2 recepteurs de la bk ont ete clones : les recepteurs b 1 et b 2. Grace au developpement d'antagonistes selectifs puissants, l'implication des kinines a ete mise en evidence au niveau pathologique dans les phenomenes de douleur et d'inflammation. Le recepteur b 1 intervient notamment lors des inflammations de type rhinites allergiques ou infectieuses ou lors de l'hyperalgesie chronique. Cette these est consacree a la synthese chimique d'analogues pseudopeptidiques de la bk, selectifs des recepteurs b 1. Une demarche peptidomimetique a ete mise en uvre afin d'obtenir des antagonistes b 1 de structure de moins en moins peptidique. Par introduction de mimes non peptidiques dans la sequence d'antagonistes peptidiques b 2, de nouvelles molecules ont donc ete elaborees. Dans un premier temps, un mime de dipeptide de type benzothiazepinone (d-bt) introduit a l'extremite c-terminale, a permis d'obtenir 2 antagonistes puissants et selectifs du recepteur b 1 (jmv 1639 et jmv 1645). Dans un deuxieme temps, un mime contraint de tetrapeptide de type spirocyclique a ete introduit a la place du tetrapeptide central des molecules precedentes. La molecule obtenue (jmv 1640) a une bonne affinite pour le recepteur b 1 (ki = 24 nm), elle est selective et elle ne comporte plus que 3 aminoacides. Dans une derniere etape, nous avons fait une etude des relations de structure-activite, de rmn et de modelisation moleculaire, sur le compose jmv 1640 afin de determiner les positions essentielles pour l'affinite et pour essayer d'augmenter son activite.

La calcitonine, hormone-hypocalcémiante hypophos-phatémiante, est aussi le marqueur spécifique d'une tumeur humaine. Les séquences de cette hormone divergent entre les vertébrés mammaliens et non mammaliens. La présence chez l'homme de molécules réagissant avec des anticorps anti calcitonine de saumon pose problème de l'existence d'un deuxième gène Le but de ce travail a été de déterminer, pour la première fois, la structure de l'ARNm de la calcitonine d'un vertébré non mammalien, La calcitonine de poulet a été choisie car cette molécule est antigéniquement apparentée à celle de saumon. Un dosage radio immunologique hétérologue, spécifique de la calcitonine aviaire, a été réalisé et les cellules ultimobranchiales productrices de l'hormone localisées. Les ARNm des glandes ultimobranchiales ont été extraits et le messager de la calcitonine identifié par traduction et immunoprécipitation spécifique. L'ARNm de la calcitonine a été purifié et son ADNc cloné dans pBR322. Un clone sélectionné par la technique d'hybridation sélection positive a permis d'établir la séquence presque complète du messager de la calcitonine. Utilisant ce dernier ADN comme sonde, une banque génomique de poulet a été criblée; un phage contenant le gène de la calcitonine a été isolé, et sa séquence partiellement déterminée. La séquence complète du précurseur de la calcitonine aviaire a ainsi été élucidée. Cette polyprotéine a la même organisation que celle des précurseurs humains et murins : deux petites peptides encadrant la molécule de calcitonine à ses extrémités N et C terminales, et les sites de clivage protéolytique et d'amidation. La comparaison des séquences des ARNm des calcitonines aviaire et mammaliennes montre que la séquence de la molécule de la calcitonine ainsi que celle de la séquence signal sont fortement conservées, par contre les séquences des petides N et C terminaux ont varié de façon linéaire pendant l'évolution. Une sonde spécifique du messager de poulet, a démontré qu'un gène, codant pour une calcitonine de type vertébré non mammalien, était exprimé dans des tumeurs thyroïdiennes humaine et murine
Calcitonin shows considerable divergence in amino acid sequence between lower vertebrates and higher vertebrates. Immunoreactive salmon-like calcitonin molecules are present in the thyroid of man and rat. Elucidation of the almost complete sequence of chicken calcitonin mRNA revealed that the calcitonin precursor in chic kens had the same organization as in higher vertebrates (man and rat) but showed considerable differences in amino acid sequence. CDNA probes specific for chicken calcitonin mRNA hybridized to poly(A)-rich RNA extracted from a case of medullary carcinoma of the thyroid and from murine thyroid. These results suggest the expression in man and rat of a gene coding for an avian calcitonin-like precursor

Dans une premiere partie bibliographique, ce travail presente differentes modifications introduites dans les peptides bioactifs qui les transforment en structures pseudopeptidiques ou peptidomimetiques. Le but de ces modifications reside dans l'etablissement de relations structure-activite et d'autre part dans l'elaboration d'analogues metaboliquement stables, doues d'une meilleure selectivite et d'une biodisponibilite accrue. Dans une seconde partie, plusieurs approches sont decrites pour realiser la synthese d'une structure cyclique a sept atomes mimant une structure pseudo-cyclique gama-turn composee des residus isoleucine, alanine et glycine. Des retombees interessantes ont ete enregistrees, en particulier une methode de synthese d'alpha-aminoaldehyde alpha, alpha-disubstitue et celle d'un nouveau pseudopeptide de type cetoamine