Academic literature on the topic 'Hybridation in situ fluorescente (FISH)'

Abstract Abstract 4699 Objectives We have evaluated the possibility to use the new BD Cytometric Bead Array to detect the presence of the BCR-ABL fusion protein2 in peripheral blood samples with a routine blood hematology analyser, the Abbott Cell-Dyn Sapphire, for a quick identification of those positive samples, both at diagnosis and at follow up to detect the MRD. This pilot study was carried out on 5 samples with different level of BCR-ABL fusion protein2 plus 2 control samples positive and negative respectively: results were compared with those obtained with the BD FACScanto and the standard FISH analysis reference method. Methods Flow cytometry allows for the discrimination of particles on the basis of attributes such as size and fluorescence. BD Cytometric Bead Array (CBA) systems provide a way of coupling a soluble analyte or set of analytes with beads of known size and fluorescence, making it possible to detect analytes through flow cytometry.1 The BD” BCR-ABL Protein Kit uses this technology to detect BCR-ABL fusion proteins2 in human blood research samples. Cell-Dyn Sapphire is a routine automated hematology analyzer for full blood count. Moreover the system employs immuno-fluorescence analysis technology, similar to that used on a dedicated fluorescence flow cytometer, for analysis of MAb applications. BD FacScant is a routine dedicated flow cytometer using 6 fluorescence channels. FISH (Fluorescence In Situ Hybridation) is a cytogenetic technique using fluorescent probes that bind to only those part of the chromosome with which they show a high degree of sequence similarity in interphase nuclei and on metaphase chromosome. FISH detects and localizes the presence, the absence or the translocation of specific DNA sequences on chromosomes. In this patients' category, LSI bcr/abl dual fusion DNA probe hybridises to chromosome 22q11.2 (breakpoint cluster region SpectrumGreen) and to chromosome 9q34 (abl oncogene SpectrumOrange). In interphase nuclei of normal cells, the probe signals generally appear as two distinct signals of each colour. In the pathological cells with bcr/abl translocation, individual orange and green signals from the normal 9 and 22 chromosome and two orange/green fusion signals (one each from the derivative 9 and 22 chromosomes) is observed. We have analysed 200 nuclei in fluorescence microscopy for each sample. Statistical analyses were performed using the MedCalc program comparing the median fluorescence values obtained by the 2 cytometers and with the standard diagnostic procedure. Results Correlation of median fluorescence data between the BD FACScanto and the CD Sapphire is excellent with a Correlation coefficient r = 1,0000 and a Significance level P<0,0001 (Fig 1). The Box –and –whisker Multiple comparison graph of the CD method versus the FISH reference one is represented in Figure 2. The results of our pilot study demonstrate the robustness of this new diagnostic tool in detecting the presence of the BCR-ABL fusion protein2 in the routine Laboratory of Hematology. The main limit to use this tool is now represented by the high cost of the BD Cytometric Bead Array. Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare.

11510 Background: Immunohistochemistry (IHC) assay for HER2 in breast cancer (BC) identify patients (pts) who are at benefit from Trastuzumab (T) therapy. The percentage (%) of positive cells is not known to have prognostic significance. Methods: We analyze pts that received T as a treatment for metastatic BC in our center, in monotherapy or in combination with other agents, and to ascertain whether the % of her-2 positive cells can be a predictive factor of response to therapy with T. We define HER-2 positive cells according to the Envision method 3+, valuating the percentage of cells with positive result. If the result of the IHC was 2+, we use fluorescence in situ hybridation (FISH). For a total of 36 patients treated, the results of the % were available only for 21 patients. The median of positive cells was 90% (range 30–100%) and it was taken to define low percentage of positive cell tumors (LPPCT) or high percentage of positive cells tumors (HPPCT). We evaluated the initial response (disease progression-stability versus parcial-complete response), the time to progression (TTP) and the overall survival (OS) of pts on T. We used the log-rank test to determinate the TTP and Fisher’s exact text to determinate the initial response and the OS on therapy with T. Results: TTP to T was significantly higher in LPPCT (median 19 months, CI 10–28) than in HPPCT (median 13 months, CI 7–19) (p=0.037). We didn’t find significant differences regarded to baseline characteristics of the patients, response nor OS. Conclusions: We find that the % of HER2-positive cells is significantly correlated with the TTP in patients on T therapy. The percentage of HER2-positive cells can be at clinical interest as a predictive factor of response to her-2 targeted therapy and it must be confirmed with a large number of pts. No significant financial relationships to disclose.

623 Background: The overall incidence of male breast cancers (MBC) is around 1% of all breast cancers and is on the rise.Most of our current knowledge regarding its biology and treatment strategies has been extrapolated from its female counterpart. However, from literature data, it is more and more evident that MBC has biological differences compared with female breast cancer (FBC). While hormone receptors are more frequently positive in MBC than in FBC, HER-2 seems to be less expressed in MBC than in FBC, with data ranging from 0 to 18%; no data on Ki-67 have been so far reported. Methods: We retrospectively analyzed the immunohistochemical expression of hormone receptors status, HER-2 protein expression, and Ki-67 in 76 consecutive MBCs, treated within the Humanitas Institutes Network on Cancer Research (INCaRe). HER-2 determinations were carried out according to ASCO/ACP and NEQAS guidelines: cases with score 2+ at IHC were further examined by fluorescent in situ hybridation (FISH). Results: From 2000 to 2011, we treated 76 male breast cases (age 25-87, median 64): 72 patients (94%) had ductal carcinoma and 4 had rare histotypes (2 papillary, 1 mucinous and 1 cribryform). Thirthy-two of 76 patients (42%) had positive axillary lymph-nodes, while 6 (8%) were metastatic at diagnosis. Of these, estrogen receptor and progesterone receptor were positive in 96% and 93% patients respectively; HER-2, evaluable in 67 patients, was positive in 11 (16%). Ki-67 was evaluable in 75 patients and was > 20% in 24 cases (32%), with 20/24 (26%) with Ki-67 > 30%. Grading was evaluable in 65 patients: G1 in 2 (3%), G2 in 41(63%) and G3 in 22 (34%), respectively. Conclusions: In these series, MBC show different patterns from FBC, with some favorable aspects such as higher hormone receptor status and much lower HER-2 expression and some unfavorable features, such as higher Ki-67 values. Although further studies are needed to confirm these data, different treatment strategies would be suggested in MBC than its female counterpart.

Abstract Abstract 4384 Background Different recurrent cytogenetic abnormalities have shown clear prognostic value in patients with Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL). Acquisition of cytogenetic aberrations during evolution of the disease (i.e. clonal evolution) may have clinical implications. Objective of the study To analyze the frequency of clonal evolution and its potential clinical consequences. Methods and Materials We retrospectively collect data from 80 patients diagnosed of CLL, who had been made at least two Fluorescence In Situ Hybridation (FISH) studies, with probes for gene ATM (11q22), gene p53 (17p13), 13q14 region and centromeric probe for chromosome 12. Clonal evolution was found in 16 out of 80 cases (20%), 8 male and 8 women, median age 70 years (41-80). Initial FISH was normal in 9 cases, deletion (del) of 13q14 region was observed in 5, and trisomy of chromosome 12 (+12) in 2 cases. Median of previous lines of treatment were 1 (0-6): Chlorambucil 7, Fludarabine (F) 1, Cyclophosphamide (C) 1, FC combination 3, FC plus Rituximab (FCR) 2, Alemtuzumab 3, CVP 2, CHOP 1, autologous stem cell transplantation (SCT) 1, Bendamustine 4. By flow cytometry, 5/9 analyzed cases were CD38-positive and 3/6 were ZAP70-positive. Out of 13 treated patients, complete response (CR) criteria (by 2008 iwCLL guidelines) were reached in 2, and PR in 8. Median duration of response (DR) were 14 months (0-42), and median time to retreatment (TTR) were 18 months (1-60). Results As clonal evolution, FISH abnormalities detected were: del (p53) in 8 cases, del (ATM) in 7 cases (2 associated with p53 deletion); del(13q) in 3 (homozigous in 2 patients). Treatment were given to 12 patients (75%), indicated in 10 for progressive adenopathies (6/7 cases with del(ATM) y 7/8 with del(p53)), 5 for anemia and 4 for thrombocytopenia (all of them had del(p53)), 3 for short LDT and 3 for B symptoms. Rescue regimens were: FC (4), FR (1), FCR (1), Pentostatin+R (1), Alemtuzumab (1), Cyclophosfamide (2), CHOP+R (1), allogeneic SCT (1). 7/12 responded, including 1 case that reached CR. Median DR was 5 months (0-29), with TTR 9 months (1-41). As following lines they had: Alemtuzumab +/- Methylprednisolone (3), Chlorambucil (1), CVP (1), CHOP (1), Rituximab (1), FR (1), Bendamustine (1). After a median follow-up of 9 months (3-60) from clonal evolution, 5/16 had died, after 3-32 months (median 9). 4 of them died because of disease progression and/or infectious complications. 1 patient had a second malignancy, dying from metastatic prostate cancer. Conclusions This retrospective series shows the relevance of clonal evolution in CLL. Selection of clones with deletion of ATM or p53 genes frequently associates with adenopathy progression, while p53 deletion seems to correlate more specifically with cytopenias. Treatment-free and overall survival seem to get compromised. Usefulness of performing FISH at regular intervals might warrant further studies. Disclosures: No relevant conflicts of interest to declare.

e15537 Background: Inhibitors of tropomyosin receptor kinase (TRK) have shown promising activity against neurotrophic TRK ( NTRK) fusion-driven cancers, regardless of tumor histotype or cell of origin. NTRK gene fusions are observed in less than 1% of colorectal cancers (CRCs). CRCs harboring wild-type BRAF and KRAS and MisMatch Repair deficiency (dMMR)/MicroSatellite Instability (MSI) due to MLH1 hypermethylation have been associated with NTRK fusions in small cohorts of non-metastatic tumors. We aimed at evaluating the incidence of NTRK fusions among dMMR/MSI metastatic CRCs (mCRC) for which there is a need for innovative therapies, as well as the associated clinical characteristics of these patients (pts) carrying NTRK fusion-positive tumors. Methods: Tumor samples of dMMR/MSI mCRC pts, paired primary and metastasis or primary alone, were obtained from a French multicenter retrospective cohort and from a single-center cohort of patients treated by immune checkpoint inhibitors (ICI) (Saint-Antoine Hospital, Paris). Clinico-pathological data including KRAS and BRAFV600E status, MMR proteins and MLH1 methylation status were available for all pts. All samples were screened for TRK expression by immunohistochemistry (IHC) using a pan-TRK antibody (clone EPR17341, Abcam; positivity: 1% of labeled tumor cells)) and for NTRK1 and NTRK3 gene rearrangements, by fluorescent in situ hybridation (FISH). A threshold of 15% nuclei positive for a break apart signal was considered positive for gene rearrangement. Results: A total of 158 pts with dMMR/MSI mCRCs (paired samples: n=39; primary only: n=119) were screened. Tumor samples of 10 patients (6.3%) harbored NTRK fusion genes by FISH ( NTRK1=8; NTRK3=2). Only four of these 10 patients had TRK immunoreactivity. One patient showed a discordance between metastasis harboring NTRK1 fusion (+) and primary tumor being negative. Eight tumors were sporadic with MLH1 hypermethylation. The remaining 2 cases were related to a MMR gene germline mutation (Lynch syndrome) with concurrent loss of MSH2 and MSH6 expression and isolated loss of MSH6 respectively. One Lynch-related tumor was KRAS mutated, one sporadic MLH1-negative tumor was BRAF V600E mutated. Four patients out of 91 treated by ICI had tumors with NTRK fusions. Three have shown radiological response according to iRECIST criteria (two complete responses, one partial response with 25 to 54 months of follow up) and one had primary resistance to ICI. Conclusions: Frequency of NTRK1/3 fusions is 6.3% in our dMMR/MSI mCRCs population. These fusions are not restricted to sporadic cases. The diagnostic accuracy of pan-TRK IHC is low. Optimal testing algorithms for theragnostics remain to be defined in this setting.

La spectroscopie de molécule unique joue aujourd’hui un rôle majeur dans de nombreux domaines allant de la physique fondamentale à la biologie. Dans ce contexte, mes travaux ont conduit au développement théorique et instrumental de deux méthodes d’investigation orientées vers la biologie. La première visait à caractériser la dynamique de complexation du calcium par la sonde calcique fluorescente Oregon Green Bapta5N communément employée pour l’analyse des signaux intracellulaires. Pour y parvenir, nous avons développé un dispositif expérimental de spectroscopie de corrélation de fluorescence à un et deux photons présentant une sensibilité proche de la molécule unique. Grace à ce dernier, nous avons pu étudier plusieurs aspects de la photophysique de la sonde et avons évalué ses limites ainsi que l’intérêt de l’appliquer in vivo. La seconde a consisté à développer une technique d’Hybridation In-Situ de Fluorescence (FISH) semi-quantitative afin de cartographier l’expression de gènes dans le cerveau de drosophiles adultes. Nous avons surmonté deux difficultés majeures, en obtenant, pour la première fois, des résultats reproductibles et semi-quantitatifs chez la drosophile adulte. Je présente ici une nouvelle approche où l’amplification enzymatique a été remplacée par une détection optimisée et un protocole réduisant l’impact de l’autofluorescence. Des résultats sur divers gènes exprimés dans le cerveau des drosophiles adultes y sont exposés au même titre qu’une étude visant à mieux comprendre une pathologie de retard mental. Pour conclure, j’ai mis en évidence la capacité de notre technique à résoudre des sondes uniques ce qui ouvre la voie vers de nouvelles applications
Single-molecule-like spectroscopy plays a major role in many domains, from fundamental physics to biology. In this framework, my dissertation focuses on instrumental and theoretical developments of two biological-related applications. The first experiment aims at characterizing the dynamics of calcium binding by the fluorescent calcium probe Oregon-green Bapta5N commonly employed in cell signaling analysis. To achieve it, I have developed an experimental set-up of fluorescence correlation spectroscopy that exhibits sensitivity close to that of single-molecule detection. Either monophotonic or biphotonic excitations can be used. I have investigated the several aspects of the photophysics of the probe and evaluated the interest and limitations of such an approach for future in-vivo measurements. The second one is devoted to the development of a semi-quantitative Fluorescent In-Situ Hybridization (FISH) technique for mapping gene expression in the adult drosophila brain. Two difficulties have to be solved. First, we succeeded in obtaining reproducible results with drosophila adult brain. Secondly, while most of the FISH protocols are not quantitative since they need a strong enzymatic, we achieved semi-quantitative detection of RNA probes. I will present results on a new approach for which enzymatic detection is replaced by a sensitive detection and a protocol which reduces autofluorescence contribution. Results will be presented for several genes in adult drosophila brain to validate the methods as well as an interesting application on a mental retardation disease. To conclude, I show that the method exhibits a single RNA sensitivity which opens the way to new applications

Les segregations meiotiques des chromosomes 2, 7, 14 et 22 sont etudies par fish deux-couleurs sur les noyaux spermatiques interphasiques de sujets a caryotype somatique normal et de sujets porteurs d'une anomalie numerique constitutionnelle. Ces profils de segregation etant similaires chez les sujets 46,xy et chez les sujets 46,xy/47,xxy et 47,xyy, nous suggerons que la presence du gonosome surnumeraire n'a pas d'influence sur la segregation des autosomes. Les segregations meiotiques des chromosomes x et y sont etudiees par fish trois-couleurs. La cohybridation des deux sondes gonosomales et d'une sonde autosomale (sonde specifique du chromosome 1) est la technique la plus directe pour distinguer les hyperhaploidies des diploidies et en connaitre l'origine. Ainsi 142050 spermatozoides provenant de 5 sujets 46,xy, 27097 spermatozoides provenant d'un sujet 46,xy/47,xxy et 13722 spermatozoides provenant d'un sujet 47,xyy ont ete analyses. Les resultats observes chez le sujet 46,xy/47,xxy, compares a ceux obtenus chez les sujets normaux, nous permettent de proposer pour les spermatocytes 47,xxy, un modele de segregation reguliere des gonosomes, les deux chromosomes x formant un bivalent xx et le chromosome y un univalent. L'analyse de la segregation des gonosomes chez le sujet 47,xyy, d'une part, confirme l'hypothese de l'elimination du chromosome y surnumeraire dans la majorite des cellules germinales 47,xyy a un stade premeiotique, et d'autre part, suggere que quelques spermatogonies 47,xyy seraient aptes a accomplir la meiose. Le devenir de ces cellules pourraient etre lie a leur aptitude a former un bivalent sexuel homologue, l'univalent x etant ensuite perdu au cours de l'anaphase i. L'ensemble de ces resultats nous permettent de proposer un modele theorique de segregation pour les lignees germinales comportant trois chromosomes sexuels. Dans les spermatocytes i (47,xxy ou 47,xyy) les trois gonosomes s'organiseraient de facon a former un bivalent homologue (xx ou yy) associe a un univalent, respectivement, y ou x. Cette organisation serait le prerequis au bon deroulement de la meiose

Les inversions sont des anomalies chromosomiques de structure résultant d'une double cassure sur un même chromosome et d'un retournement à 180° du segment chromosomique ainsi généré. Ces inversions sont dites péricentriques si les points de cassure sont localisés de part et d'autre du centromère, ou paracentriques dans le cas contraire. Chez l'Homme, la fréquence estimée des inversions péricentriques est de 0. 012% à 0. 07% et de 0,01% à 0,05% pour les inversions paracentriques (McKinlay-Gardner et Sutherland, 2004). Les porteurs hétérozygotes ne présentent généralement pas d'altération phénotypique mais sont susceptibles de rencontrer des problèmes de reproduction en raison de perturbations du processus méiotique conduisant à des troubles de la spermatogenèse et/ou à la production de gamètes génétiquement déséquilibrés. De nombreuses inversions ont été identifiées chez l'Homme et dans les espèces animales d'élevage. Cependant, peu d'études de ségrégation méiotique d'inversions ont été publiées à ce jour chez l'Homme (par exemple Morel et al. 2007), et aucune dans les espèces animales d'élevage. L'analyse méiotique de différentes inversions identifiées chez le porc dans le cadre du programme national de contrôle chromosomique mis en œuvre par notre laboratoire présente un double intérêt. Le premier est zootechnique. En effet, lors de la mise en évidence d'une inversion chez un futur reproducteur, sa réforme était jusqu'à présent systématiquement conseillée aux éleveurs. Toutefois, l'application de ce principe peut s'avérer difficile et/ou non optimal car elle peut conduire à l'élimination d'individus par ailleurs génétiquement intéressants et ainsi induire une baisse de l'efficacité des programmes de sélection. Raisonner l'utilisation des reproducteurs sur la base d'une prédiction de l'effet potentiel des remaniements nous semble une alternative raisonnable. L'un des objectifs de la Thèse est donc la mise au point et l'évaluation d'une méthode de prédiction basée sur l'estimation du pourcentage de gamètes déséquilibrés dans des échantillons de semence. Le second objectif est cognitif. En effet, des difficultés d'ordre technique et/ou éthique rendent difficile l'acquisition de certaines connaissances concernant le comportement méiotique de remaniements chromosomiques chez l'Homme. C'est le cas par exemple de l'effet du sexe du parent porteur sur le comportement et les produits de la méiose en présence d'une inversion. Le recours à un modèle animal (le porc en l'occurrence, dont la structure chromosomique est proche de celle de l'Homme) permet de s'affranchir de certaines contraintes, et d'apporter de nouvelles connaissances dans des domaines non encore documentés. Un autre objectif de la Thèse est, dans cet esprit, de réaliser une étude comparée des ségrégations méiotiques " mâle " et " femelle " d'une même inversion et ainsi de déterminer l'influence du sexe du porteur sur les effets de l'anomalie. L'analyse des profils de ségrégation méiotique " mâle " a été réalisée par la méthode de SpermFISH (hybridation in situ en fluorescence sur noyaux de spermatozoïdes décondensés). Les ségrégations méiotiques femelles ont pour leur part été étudiées par analyse de métaphases II d'ovocytes de truies maturés in vitro. Dans les deux cas, des sondes moléculaires de type BAC ont été utilisées. Les études d'appariement méiotique ont été réalisées à partir de biopsies testiculaires réalisées chez un verrat porteur d'une inversion péricentrique du chromosome 4. Ces échantillons ont été analysés par des méthodes d'immunocytologie à l'aide d'anticorps permettant de détecter spécifiquement certaines protéines. Les études de ségrégation méiotique de 7 inversions de tailles et de types différents ont été réalisées : les pourcentages de gamètes génétiquement déséquilibrés variaient de 0,6% à 4%, suggérant que ces inversions ont un impact très limité sur la reproduction. De manière surprenante, la proportion de gamètes anormaux produits n'est pas corrélée avec la taille du fragment inversé, comme cela est le cas chez l'Homme. La comparaison des profils de ségrégation " mâle " et " femelle " pour une inversion du chromosome 4 n'a pas non plus montré de différence de production de gamètes déséquilibrés entre les deux genres (4% et 3,6% respectivement). Le sexe du porteur ne semble donc pas être un facteur déterminant pour la production de gamètes anormaux. L'analyse des phases précoces de la méiose pour un animal porteur de la même inversion péricentrique du chromosome 4 à montré un comportement méiotique particulier du bivalent: plus de 90% des cellules montraient en effet un appariement non homologue de la région inversée. De plus, des évènements de crossing over dans la région inversée du chromosome 4 n'ont été observés que dans 5% des cas. Le comportement des chromosomes est responsable de la faible recombinaison dans la région inversée et donc de la faible proportion de gamètes génétiquement déséquilibrés estimée (4% en moyenne). Ces résultats demandent néanmoins à être confirmés par d'autres analyses. L'étude en cours des phases précoces de la méiose chez deux porteurs d'inversions péricentriques du chromosome 8 devraient nous permettre très prochainement d'approfondir nos connaissances sur le comportement méiotique des chromosomes en présence d'inversion. Par ailleurs, la mise au point de nouvelles techniques au sein du laboratoire, telles que la production de cellules souches induites (iPS) porcines, nous permet aussi d'envisager à moyen terme l'étude de l'intégralité du processus méiotique mâle en présence d'une inversion
Inversions are structural chromosomal rearrangements formed when a chromosome breaks in two places and the fragments reverses orientation. The inversion is pericentric if the breaks occur on either side of the centromere, paracentric in other cases. Prevalence estimates in human population range from 0. 012% to 0. 07% for pericentrics and from 0,01% to 0,05% for paracentrics (McKinlay-Gardner et Sutherland, 2004). Usually, both para- and pericentric inversions are phenotypically harmless, but the presence of an inversion can occasionally lead to severe reproductive disorders due to spermatogenesis impairements and the production of genetically unbalanced gametes. Many cases of inversions have been described in humans as well as in other animal species. However, relatively few studies have reported meiotic segregation pattern analyses of inversions in males (for example Morel et al. 2007), and none were reported on domestic animals. Meiotic analyses of various inversions identified in the pig species, thanks to the national program of chromosomic control, have a double interest. The first is zootechnical. When an inversion is detected in a boar, the breeders are always advised to sacrifice the animal. However, it can be difficult to eliminate individuals with a high genetic value and then induce a lowering in the efficiency of selection programms. Using a prediction of the potential effects of rearrangements to advise the breeders seem to be a good alternative. One of the thesis purpose is then to create a predictive method based on the percentage of unbalanced gametes in semen samples. The second interest is more linked to basic research. Indeed, it can be difficult to acquire knowledge on meiotic behaviour of chromosomal rearrangements in Man due to technical and/or ethical reasons. For example, little is known on an " sex " effect on meitoic behaviour during meiosis for inversion carriers. The use of an animal model (like the pig species) is a great opportunity to analyze the meiotic behaviour of chromosomes in inversion carriers, and then to have a better understanding on not well documented domains. That is why an other purpose of this thesis was to carried a comparative study of meotic segregations in males and females carriers of the same anomaly, and then determine a potential " sex " effect. Meotic segregation pattern analyses were carried out using the SpermFISH technique (fluorescent in situ hybridization on decondensed sperm nuclei) for males, and FISH on metaphase II oocytes matured in vitro for females. In both cases, molecular probes (Bacterial Artificial Chromosome) were used. Studies of pairing behaviour were carried out on testicular samples of an inversion of chromosome 4 carrier, using immunocytological techniques (use of specific antibodies against proteins of interest). Meotic segregation pattern analyses were carried out for 7 inversions (different length of the inverted fragment and different type) : percentage of unbalanced gametes ranged from 0,6% to 4%, suggesting a limited impact on reproduction. Surprisingly, the length of the inverted fragment is not correlated to the proportion of unbalanced gametes (unlike in Man). Comparison of " male " and " female " segregation profiles for an inversion of chromosome 4 did not show either any difference concerning the production of unbalanced gametes (4% and 3,6% respectively). The gender of the carriers do not seem to be a major factor for the production of unbalanced gametes. Analyses of early stages of meiosis for a carrier of the same pericentric inversion showed a specific meiotic behaviour of the bivalent : a non homologous pairing of the inverted region was seen in more than 90% of the cells analysed. Moreover, crossing overs in the inverted region were relatively rare (5 % of the cells). This chromosomal behaviour explains the low recombination rate in the inverted region, and then the low proportion of unbalanced gametes produced (mean of 4%). These results have to be confirmed by other analyses. Studies of the early stages of meiosis in two carriers of pericentric inversions of chromosome 8 should allow in the future a better understanding of the meiotic behaviour for inversion carriers. Moreover, the use of new techniques, such as production of induced pluripotent stem cells (iPS), could allow, in the future, analyses of the whole male meiotic process in inversion carriers

Depuis quelques années, des déviations aromatiques qualifiées de terreuses ou moisies sont observées dans les vins de plusieurs régions viticoles françaises, en Beaujolais, dans le Val de Loire ou dans le Bordelais. Tous les types de vins peuvent être touchés. La principale molécule responsable de ces altérations est la géosmine. Elle est vraisemblablement produite très précocement à la vigne, par des micro-organismes présents sur les raisins. Par ailleurs, divers micro-organismes sont connus pour produire cette molécule, comme des bactéries actinomycètes, appartenant notamment au genre Streptomyces ou des moisissures du genre Penicillium. Nous avons mis au point des outils méthodologiques pour la détection simple, rapide et précoce des micro-organismes responsables de la production des molécules à l'origine des défauts terreux dans les vins. La technique FISH est utilisée pour la détection précoce des Streptomyces sur les raisins grâce à la sonde HGC. Cependant, aucun Streptomyces n'est détecté par la méthode FISH sur nos échantillons de raisins, bien qu'ils soient vraisemblablement présents, puisqu'ils ont été détectés par méthodes de microbiologie classique. La présence de spores de moisissures très majoritaires masque vraisemblablement la présence de ces micro-organismes. Concernant les moisissures, la détection des espèces productrices de géosmine n'est pas possible par la technique FISH par manque de sondes spécifiques
Since a few years, sensorial defects defined as earthy or musty odours have been detected in some wines of several French wine-producting regions like Beaujolais, Loire Valley and Bordeaux. All types of wines can be concerned. The molecule responsible for these defects is geosmin. It is produced very early in the vineyeards by micro-organisms present on the grapes. We also know that actinomycete bacteria, including the Streptomyces genus or fungi belonging to the Penicillium genus cans produce geosmin. We have developed methodological tools for an easy, quick, and early detection of the micro-organisms responsible for the production of the molecules causing the earthy defects in wines. The FISH method is used for the early detection of Streptomyces on grapes using the HGC probe. However, no Streptomyces has been detected with the FISH technique on our grapes'samples, even if they were probably there as they have been detected by classic mircrobiological methods. This Gan be caused by a large majority of fungal spores in the samples, masking the presence of these micro-organisms. Regarding the moulds, the detection of geosmin-producing species is not possible du to the lack of specific probes

Le Myélome Multiple (MM) est une hémopathie maligne Caractérisée par une infiltration plasmocytaire de la moelle osseuse. Elle représente 10% des hémopathies malignes. Certaines anomalies chromosomiques sont des facteurs pronostiques utiles au suivi thérapeutique du patient. Cette étude a permis d’identifier et de préciser les anomalies chromosomiques de 94 patients atteints de MM entre Janvier 2000 et Décembre 2005, par des techniques conventionnelles, mais également par des techniques moléculaires de d’Hybridation In Situ en Fluorescence (FISH) et FISH 24 couleurs. Parmi ces anomalies, les réarrangements du chromosome 1 ont été mis en évidence chez 65 patients. La perte ip et le gain lq sont les anomalies les plus fréquentes, mais nous avons également mis en évidence des translocations sauteuses de ce chromosome chez 6 patients. Nous avons mis en évidence un réarrangement du gène IGH chez 39% de ces patients, certains réarrangements étant complexes. Par ailleurs, 56% des patients de la cohorte présentent une délétion 13q14, et 9,9% une délétion 17pl3. Enfin, les caryotypes de deux patients ayant rechuté en leucémie à plasmocytes ont été comparés. Une étude statistique portant sur les corrélations éventuelles entre les données cytogénétiques et les données cliniques et biologiques a révélé l’importance de la ploïdie. Certains patients présentent ainsi des caryotypes extrêmement complexes ne pouvant qu’aggraver la pathologie. Cette étude a permis de mettre en exergue des loci d’intérêt et propose des hypothèses de dérégulations géniques. Une meilleure connaissance des mécanismes d’évolution du MM pourrait ainsi permettre d’améliorer la prise en charge de ces patients pour lesquels il n’existe pas encore de thérapeutiques curatives
Multiple myeloma (MM) is a malignancy cf the terminally-differentiated B cells that accounts for 10% of ail hematological malignancies. Some chromosomal abnormalities are important prognostic factors. This study is a cytogenetic work on 94 MM patients between January 2000 and December 2005, using conventional and molecular cytognetics technics, like Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) and 24 colours FISH. Thus, 65 patients revealed chromosome 1 abnormalities. These abnormalities were most frequently a loss of lp arm and a gain of lq arm; jumping translocations were observed in 6 patients. Moreover, twenty-two patients (39%) had an 1Gb! translocation, which were sometimes complex, 56% had 13q14 deletion and 99% had l7pl3 deletion. Finally, we compared two MM karyotypes with their plasma cell leukemia karytopes. Statisticai study was used on cytogenetic, clinical and biological data and revealed the importance of ploidy. Some patients presented very complex karyotypes, probably increasing the pathology. This study showed loci of interest and proposed genetic deregulations hypotheses. Setter mechanism knowledge about MM evolution will permit to propose better treatments for this fatal pathology

La localisation d’ARNm a été découverte en 1983 dans les ovocytes et les embryons des ascidies. Depuis, plusieurs exemples d'ARN localisés ont été trouvés dans de nombreux organismes, y compris les plantes, les levures, les champignons, les insectes, les poissons et les mammifères. Les ARNm localisés contribuent à de nombreuses fonctions biologiques, telles que le développement embryonnaire, la division cellulaire asymétrique, la migration cellulaire, la signalisation, la plasticité neuronale et plein d’autres ...Jusqu'à présent, quelques études ont analysé la localisation d’ARNm de manière systématique. Trois d'entre eux ont été effectués chez la drosophile pendant l'embryogenèse, l'oogenèse ou le stade larvaire et ont analysé environ 16000 ARN au total. Les deux autres études ont été réalisées dans des cellules de mammifères et ont analysé près de 1000 ARNm chacune. Ces études ont montré l'importance de la localisation d’ARNm dans les cellules humaines et son implication dans différents processus biologiques. L'objectif de ma thèse était donc d'augmenter le débit des techniques FISH à l’échelle de molécule unique (smFISH) et d'étudier la localisation d’ARNm dans les cellules HeLa de manière systématique.Une limitation de smFISH est le coût de sondes fluorescentes, qui limite le nombre d'ARNm qui peut être analysé. Par conséquent, j'ai développé un protocole alternatif dans lequel des sondes pour de nombreux gènes ont été synthétisées comme un pool d'oligonucléotides (40 par gène en moyenne, plus de 12000 au total). Les sondes spécifiques d’un ARNm donné ont ensuite été amplifiées par PCR et converties en simple brin par transcription in vitro. J'ai généré un protocole complet, à partir de la conception de la sonde et jusqu'à l'acquisition de l'image. Je me suis intéressé à l’étude des ARNm du cycle cellulaire. En effet, les gènes du cycle cellulaire ont été largement étudiés au niveau de la protéine, mais on sait peu de choses sur la localisation de leurs ARNm. Pendant la mitose, les cellules subissent d'importantes modifications morphologiques et la traduction locale pourrait être un moyen d'atteindre la localisation des protéines. Le screening sur ces ARNm est en cours.Parallèlement à ces expériences, j'ai réalisé des expériences de smFISH sur 100 gènes choisis au hasard et 50 régulateurs de la transition G2/M du cycle cellulaire, en utilisant un protocole de smFISH classique. Dans cette configuration, on disposait d'une collection de lignées cellulaires HeLa, dans laquelle chaque cellule contient un chromosome artificiel bactérien avec le gène d'intérêt marqué au GFP. Par conséquent, en utilisant des sondes qui s'hybridaient à la séquence GFP, je pourrais utiliser le même ensemble de sondes marquées pour étudier la localisation de tous les ARNm. Un autre avantage est que la localisation des protéines pourrait être évaluée simultanément. Mes résultats indiquent que 4 ARNm ont montré une localisation spécifique lors du screening de 100 gènes choisis d’une manière aléatoire et 15 ARNm parmi les 54 régulateurs de la transition G2 / M. Ces ARNm appartiennent à cinq classes de localisation: "blobs", qui sont des agrégats d'ARNm cytoplasmiques; «clusters», qui sont des zones de concentration locale élevée d'ARNm, mais où une molécule unique d’ARNm peut encore être résolu; «nuclear membrane », où les ARNm se concentrent autour de l'enveloppe nucléaire; "spindle", qui sont des ARNm accumulés sur l'appareil de division mitotique, “spots" qui sont des agrégats d'ARNm cytoplasmiques où une molécule unique d’ARNm ne peut pas être résolu, et qui sont plus grands que les blobs. La colocalisation entre l'ARNm et la GFP, qui suggère une traduction locale, n'a été trouvée que pour 1 ARNm.Ces screenings aléatoires et ciblés effectués à petite échelle montrent une fréquence et une diversité inattendues dans les modèles de localisation d’ARNm. Cela ouvre la voie pour effectuer des screenings à plus grande échelle
MRNA localization was discovered in 1983 in ascidian oocytes and early embryos. Since then many examples of localized RNAs have been found in many organisms, including plants, yeast, fungi, insects, fish and mammals. Localized mRNAs contribute to many biological functions, such as embryonic patterning, asymmetric cell division, cell migration, signaling, neuronal plasticity and others…Until now, only few studies analyzed RNA localization in a systematic manner. Three of them were done in Drosophila, during embryogenesis, oogenesis or larval stage and analyzed around 16000 mRNAs in total. The two other studies were done in mammalian cells and analyzed nearly 1000 mRNAs each. These studies opened a door and raised questions regarding the importance of mRNA localization in human cells and its implication in different biological processes. The goal of my thesis was thus to increase the throughput of single molecule FISH techniques (smFISH) and to study mRNA localization in HeLa cells in a systematic manner.One limitation in smFISH is the cost of the fluorescent oligonucleotide probes, which limits the number of mRNAs that can be analyzed. Therefore, I developed an alternative protocol in which probes for many genes were synthesized as a pool of oligonucleotides (40 per gene in average, more than 12000 in total). Gene-specific probes were then amplified by PCR and converted into single strand by in vitro transcription. I generated a complete protocol, starting from probe design and up to image acquisition. I was interested in studying cell cycle genes. Indeed, cell cycle genes have been extensively studied at the protein level but little is known concerning the localization of their mRNAs. During mitosis, cells go through important morphological modifications and local translation could be a mean of achieving protein localization. This screen is ongoing.In parallel to these experiments, I performed a smFISH based screen on 100 randomly chosen genes and 50 regulators of the G2/M transition of the cell cycle, using a traditional smFISH protocol. In this set-up, I took advantage of a library of HeLa cell lines, in which each cell line contains a bacterial artificial chromosome with the gene of interest tagged with GFP. Therefore, using oligonucleotides hybridizing to the GFP sequence, I could use the same probe set to study the localization of all the tagged mRNAs. A further advantage is that protein localization could be assessed simultaneously. My results indicate that two mRNAs showed a specific localization when screening 100 random genes, and 16 mRNAs among the 50 regulators of the G2/M transition. These mRNAs belong to five localization classes: "blobs", which are cytoplasmic mRNA aggregates; "clusters", which are areas of high local mRNA concentration but where individual mRNA can still be resolved; "nuclear envelope", where mRNAs concentrate around the nuclear envelope; "spindle", which are mRNAs accumulating on the cell division apparatus during mitosis, “spots" which are cytoplasmic mRNA aggregates where individual mRNA can’t be resolved and are bigger than blobs. Interestingly, colocalization between mRNA and GFP, which suggests local translation, was only found for 1 mRNA.These random and targeted screens performed at small-scale show an unexpected frequency and diversity in mRNA localization patterns, therefore pointing to new functions related to this process. This will stimulate future studies aiming at performing screenings at a higher scale

Les travaux presentes dans cette these s'integrent dans le projet europeen human genome; ils s'inscrivent plus precisement dans le contexte de l'analyse in situ de l'organisation du genome humain. Avec pour objectif de developper des approches originales de cartographie physique et fonctionnelle, nous avons mis au point des methodes d'analyse interactive d'images de sondes hybridees in situ adaptees a l'ordonnance lineaire de genes sur la molecule d'adn et a l'etude de la distribution de sequences genomiques dans le noyau cellulaire interphasique. Tirant profit des avantages du systeme home (highly optimized microscope environment) applique a la microscopie en fluorescence, sept genes codant pour des proteines en doigts de zinc ont ete ordonnes sur le chromosome 19 par cartographie interphasique. Si l'adequation du systeme home pour cette approche cartographique est confirmee, nous serons a meme de fournir une methode adaptee a la localisation precise et rapide de sequences specifiques sur le genome, rapprochant ainsi par un raccourci operationnel appreciable, les acquis de la genetique moleculaire et de la cytogenetique pour une connaissance cartographique acceleree du genome humain. Dans la perspective d'ouvrir de nouvelles voies d'investigation pour l'analyse des relations spatiales et fonctionnelles adn-proteines dans le noyau interphasique, nous avons developpe une technique combinant l'hybridation in situ de sondes fluorescentes et la detection immuno-cytochimique de proteines nucleaires. La co-localisation du centromere du chromosome 1 et des nucleoles a ainsi ete mise en evidence dans une lignee cellulaire de cancer du sein dont les caracteristiques genetiques avaient ete prealablement determinees par la cytogenetique interphasique. L'analyse interactive des images obtenues apres double marquage, nous a permis de documenter la signification fonctionnelle de l'association entre le chromosome 1 et les nucleoles