Academic literature on the topic 'Hybridation soustractive suppressive'

Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo) agent causal de la bactériose vasculaire du riz (BB) est une maladie entraînant d’importantes pertes de récolte en Afrique de l’Ouest. Sur la base d’analyses génétiques et du pouvoir pathogène de nouvelles souches de Xanthomonas oryzae ont été récemment identifiées en Afrique. Des différences entre les génomes de souches asiatique et africaine de X. O. Pv. Oryzae ont été mises en évidence (Gonzalez et al. 2007). Plusieurs gènes bactériens sont probablement activés lors des différentes étapes de l’interaction avec la plante. Les objectif de notre étude sont (i) identifier des différences au niveau génomique entre trois représentants de X. Oryzae (un africain et deux asiatique) génétiquement distincts et (ii) mieux comprendre le processus infectieux de la souche africaine Xoo MAI1 lors d’une interaction compatible avec le cultivar sensible O. Sativa sp. Nipponbare après infection (0, 12, 24 heures, 3 et 6 jours). Pour cela, nous avons combiné l’obtention de banques soustractives (SSH) à la réalisation d’une puce ADN. La quantification des populations bactériennes dans les tissus et des analyses du transcriptome bactérien in planta ont été développées. Deux banques SSH ont été réalisées, l’une à partir de la soustraction entre souches africaine et asiatique de Xoo (MAI1-PXO86), l’autre à partir de la soustraction entre Xoo MAI1 et la souche Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola BLS256. Dans les deux cas Xoo MAI1 a servi de « tester ». L’analyse des séquences par catégorie fonctionnelle montre que la majorité correspond à des protéines de fonction inconnue ou ne présentant aucune homologie, à des protéines impliquées dans la virulence, le transport et le métabolisme. Vingt séquences provenaint des deux banques SSH. Par comparaison des séquences SSH avec d’autres génomes de Xanthomonas, des séquences spécifiques à Xoo MAI1 ont été identifiées et validées par Southern blot. Nous avons construit une puce ADN Xoo comprenant 4708 éléments. Cette puce permet d’étudier la cinétique d‘expression des gènes bactériens lors de l’infection dans la plante. Afin de faire une analyse transcriptomique «in vivo», nous avons isolé les bactéries à partir des tissus infectés et extrait l’ARN. L’ADNc bactérien a été synthétisé et utilisé pour interroger la puce ADN lors d’une cinétique d’infection. Plusieurs gènes bactériens ont été identifiés comme étant « sur » ou « sous » régulés à différents temps après infection. Parmi eux, des éléments IS, gènes associés à l'adhérence, à la dégradation de la paroi cellulaire, et à la virulence. Enfin, nous avons effectué la mutagénèse d’un gène homologue de xopX chez Xoo MAI1, ce mutant semble être altéré dans sa capacité à induire des symptômes sur des variétés sensibles. Les résultats ainsi que les outils développés au cours de ces travaux devraient apporter de nouvelles connaissances sur les X. Oryzae en Afrique et ses différences avec les souches Asiatiques, et à la compréhension des mécanismes moléculaires qui entraînent la pathogénicité de Xoo.

Le propos de ce travail était d'étudier la différenciation des mérozoi͏̈tes de Plasmodium falciparum à travers son transcriptome. Premièrement, par hybridation soustractive suppressive, nous avons réalisé une banque d'ADNc spécifique de stade. Nous avons identifié 40 gènes exprimés spécifiquement lors de la morphogenèse des mérozoi͏̈tes, certains attendus car codant pour des protéines du mérozoi͏̈te (27,5%), les autres codant pour des protéines aux fonctions inconnues (72,5%). Nous avons caractérisé l'une de ces protéines, la dynamine 2 homologue. Exprimée uniquement lors de la schizogonie, elle pourrait être une molécule-clé de la différenciation des mérozoi͏̈tes et être impliquée dans la division mitochondriale. Deuxièmement, par puces à ADN, nous avons identifié dix gènes, encore non décrits, dont l'expression est significativement modulée par la rottlérine, un inhibiteur de protéines kinases qui stoppe la différenciation des mérozoi͏̈tes conduisant à la lyse du parasite
The aim of this work was to study the differentiation of Plasmodium falciparum merozoite through its transcriptome. First, by suppression subtractive hybridization, we have realised a stage-specific cDNA library. We have identified 40 genes specifically expressed during merozoite morphogenesis, some expected as coding for merozoite proteins (27. 5%), the other coding for proteins of unknown function (72. 5%). We have characterized one of these proteins, the dynamin-2-like. Expressed only during schizogony, it could be a key-molecule of the merozoite differentiation and be involved in mitochondrial division. Second, by microarrays, we have identified 10 genes, as yet unreported, whose expression is significantly modulated by rottlerin, a protein kinase inhibitor that stops merozoite differentiation leading to the parasite lysis

Staphylococcus xylosus est une bactérie ubiquitaire, commensale de la peau et des muqueuses de l'homme et des animaux. C'est un des principaux ferments utilisé en salaison. Ses propriétés technologiques étaient bien connues mais peu de données génétiques sur cette espèce étaient disponibles. Nous avons établi la première carte physique et génétique de la souche modèle S. xylosus C2a. Cette carte nous a permis d'avoir une estimation de la taille (2,89 Mb) et de l'organisation globale d'un chromosome de S. xylosus. Au sein de cette espèce, nous avons montré qu'il existait une grande diversité, tant au niveau des caractères phénotypiques (métabolisme des sucres, formation de colonies géantes) que génotypiques (profils génomiques, taille du chromosome). Nous avons étudié, par hybridation soustractive, la diversité du contenu génétique de souches de diverses origines. Le génome de la souche C2a a été soustrait à ceux d'un ferment et de deux souches isolées d'infections opportunistes. Au total, 78 kb de séquences d'ADN ont été identifiés, la majorité correspondant à des gènes du métabolisme. La distribution de ces fragments souchesspécifiques au sein de l'espèce S. xylosus révèle deux groupes dont un composé des souches présentant un risque potentiel. Ces fragments pourraient être utilisés dans des études épidémiologiques. La région de l'oriC est une zone d'insertion privilégiée de ces fragments sur les chromosomes de S. xylosus. Elle permet l'acquisition de matériel génétique important pour son adaptation à différentes niches écologiques. Le séquençage de cette zone chez différentes souches permettra d'évaluer la plasticité des génomes de S. xylosus.

Le groupe ‘M. mycoides’ constitue une branche phylogénétique homogène des mycoplasmes regroupant 6 taxons pathogènes des ruminants, responsables pour la plupart de maladies inscrites sur la liste de l’OIE. L’identification taxinomique sur laquelle repose le diagnostic reste délicate à cause de réactions antigéniques et génétiques croisées et d’un manque d’universalité intra-taxon des PCR, notamment pour les taxons Mcc, MmmLC et Mbg7. Une approche par hybridation soustractive sélective a été développée pour 1) appréhender les différences moléculaires entre ces 3 taxons ; 2) analyser globalement la diversité au sein du groupe ‘M. mycoides’ et 3) rechercher de nouveaux marqueurs d’intérêt diagnostique. Nos résultats montrent un important partage de séquences entre ces taxons, MmmLC et Mcc étant très polymorphes par rapport à Mbg7, plus homogène et qui représente une sorte de chimère entre les taxons Mcc et MmmSC. Nos données nous ont permis de développer un test PCR spécifique pour Mcc mais la diversité génétique du groupe ‘M. mycoides’ dépasse les frontières entre taxons rendant difficile et peu pertinente l’identification taxinomique. Un typage des souches en fonction de la virulence indépendamment de l’espèce serait l’approche diagnostique alternative. La faisabilité d’une telle approche a été explorée dans le cas du taxon MmmLC mais aucun critère susceptible de différencier les souches issues de foyers de celles issues de portage dans des troupeaux sans antécédent clinique n’a pu être mis en évidence. Ce continuum génétique entre souches, probablement lié à des transferts génétiques horizontaux, imposera à l’avenir une surveillance globalisée des mycoplasmoses
The ‘M. mycoides’ cluster, a homogenous phylogenetic branch of the Mollicutes, includes 6 taxa which are responsible for diseases in ruminants, most of which are listed by the OIE. Their taxonomic identification, on which current diagnosis is based, is impaired by antigenic and genetic cross-reactivity and by the lack of a universal, intra-taxon PCR assay, especially for the Mcc, MmmLC and Mbg7 taxa. A suppression subtractive hybridization approach was developed to: 1) define molecular differences between these 3 taxa; 2) analyze the overall genetic diversity within the ‘M. mycoides’ cluster and 3) search for new markers useful for diagnosis. Results obtained here showed that several sequences are shared across taxa, with Mcc and MmmLC being very polymorphic compared to Mbg7 which is more homogeneous, representing a sort of chimera between Mcc and MmmLC. From these analyses, a specific PCR assay was designed for Mcc identification but, because of the genetic diversity existing within the ‘M. mycoides’, the taxonomic identification of new strain appears less and less relevant. Instead, regardless of their species, strain typing on the basis of their virulence would offer an alternative approach for diagnosis. We assessed this type of approach for the MmmLC taxon but so far, our attempts to uncover markers that would distinguish pathogenic strains from carrier strains, isolated from herds with no clinical history, have failed. The genetic continuum observed between strains is remnant of horizontal gene transfers and imposes the development of a more global approach for mycoplasmosis surveillance

Dans les lymphomes anaplasiques à grandes cellules, la translocation t(2;5)(p23;q35) conduit à l'expression aberrante de la protéine NPM-ALK (Nucléophosmine-Anaplastic Lymphoma Kinase). Nous avons voulu étudier les gènes dérégulés dans ces lymphomes par la technique de SSH (Subtractive Suppressive Hybridization). La première étape est la reverse-transcription des ARNm. Nous avons montré que le rendement de cette étape pouvait être augmenté en ajoutant la protéine T4 gene 32. La SSH a été effectuée à partir d'une lignée de lymphome anaplasique portant la translocation comparée à des cellules d'un patient porteur de la tumeur sans translocation. Nous avons obtenu 92 clones et le séquençage nous a permis d'identifier 31 gènes sur-exprimés dans la lignée t(2;5) positive. Le profil d'expression se caractérise par des gènes de survie cellulaire. Certains sont impliqués dans la signalisation médiée par la PI-3 kinase décrite comme effectrice de la voie médiée par NPM-ALK.

Les phytoplasmes sont des bactéries phytopathogènes de la sève phloémienne non dsponibles en culture. Une technique dérivée de l'hybridation soustractive (SSH nous a permis de purifier et d'isoler l'ADN du phytoplasme du stolbur à partir de pervenche infectée. L'analyse comparée de 181 loci génétiques (113 kpb) indique que le génome du phytoplasme du stolbur contient environ 26 % G+C et que 83 % des 217 séquences codantes mises en évidence correspondent à une séquence homlologue chez 'Candidatus Phytoplasma asteris' (OY-M). Les gènes qui codent la riboflavine kinase et la protéine 1H10 homologue à une protéine de surface de mycoplasme sont absents chez 'Ca. P. Asteris'. La protéine de 59 kDa prédite in silico possède un peptide signal putatif et un domaine transmembranaire C-erminal qui permettraient sa sécrétion et son exposition à la surface du phytoplasme. Ces gènes pourraient jouer un rôle dans l'adaptation du phytoplasme à une famille spécifique d'insectes vecteurs
Phytoplasmas are phloem-restricted bacterial plant pathogens unvailable in culture. A modified Suppression Subtractive Hybridization (SSH) method allowed to isolate a nearly pure stolbur phytoplasma DNA from infected Catharanthus roseus periwinkle plants. Comparative analysis of 181 stolbur phytoplasma genetic loci (113 kbp) indicated that the G+C content of the stolbur phytoplasma genome should be about 26 %. Among 217 protein coding sequences, 83 % were homologous to 'Candidatus Phytoplasma asteris' (OY-M) genes. Two genes encoding proteins homologous to a mycoplasma surface protein and riboflavin kinase but absent in 'Ca. P. Asteris' were fully characterized. The stol-1H10 gene encodes a 59 kDa protein harbouring a putative signal peptide and a C-terminal transmembrane domain which should allow the matured 1H10 protein to be exposed at the phytoplasma surface. Such genes could play a role in the adaptation of stolbur phytoplasma to a specific family of insect vector

Parmi les nématodes gastro-intestinaux ayant un impact majeur sur la santé des ruminants Haemonchus contortus est l’espèce la plus pathogène. Actuellement, le contrôle des populations parasitaires repose sur les traitements anthelminthiques dont l’efficacité est limitée par l’émergence de parasites résistants. L'établissement de nouvelles stratégies de lutte (thérapeutiques ou vaccinales) repose actuellement sur l'identification de nouvelles cibles moléculaires. Ainsi, les gènes spécifiquement régulés lors de la phase précoce d’interaction du parasite H. contortus avec son hôte sont des cibles de choix. Afin d’identifier ces gènes, 4 banques d’H. contortus enrichies en ADNc spécifiquement exprimés au stade L4 (5 jours après infestation) ont été obtenues par la technique d’Hybridation Suppressive et Soustractive (SSH). Sur 400 clones criblés (dot-blot, RT-PCR), 51 clones d’intérêts ont été regroupés en 10 contigs. Les candidats possédant un peptide signal de sécrétion ont fait l’objet d’une étude plus approfondie. Les homologues de ces candidats ont été recherchés chez les deux autres principales espèces de strongles gastro-intestinaux (T. circumcincta et T. colubriformis) dans le but d’évaluer leur polymorphisme. La production et la purification des protéines recombinantes correspondant à ces candidats a également été réalisée afin de tester leur éventuel pouvoir immunogène
Gastro-intestinal nematodes such as Haemonchus contortus have a major impact on health of small ruminants world-wide. The control of infections remains largely based on anthelminthic treatments, but spreading of resistance has reduced their efficiency. An attractive solution would be the development of anti-nematode vaccines. Genes expressed during the early parasitic stage of H. contortus constituted our main targets. We have developed an approach based on SSH (Suppressive Subtractive Hybridization) technique and generated 4 subtracted cDNA libraries of H. contortus enriched in cDNA specifically expressed during L4 stage (five days post infection). 400 clones were analyzed by dot-blotand 51 clones regrouped in 10 contigs. All contigs were validated by RT-PCR. Homologues of candidates possessing a signal peptide were searched in T. colubriformis and T. circumcincta to evaluate their polymorphism. Recombinant proteins of theses candidates were produced and purified in order to know if they have a good vaccine potential with cross protection against two major gastro-intestinal nematodes