Academic literature on the topic 'Hypermutation somatique'

L’hypermutation somatique (SHM) des gènes des immunoglobulines est le résultat d’un processus initié par l’enzyme AID (activation-induced cytidine deaminase), une cytidine-désaminase. Deux mécanismes différents sont responsables de l’apparition des mutations au niveau des paires CG (phase I) et AT (phase II). Le mismatch U:G résultant de l’action de l’AID peut être répliqué, ce qui donnera des mutations de transition au niveau des paires CG, ou l’uracile excisé, formant un site abasique qui, répliqué, résultera en des mutations de transition/transversion au niveau des paires CG. Alternativement, le mismatch peut être reconnu par le système de MMR (mismatch-repair), qui excise le brin contenant l’uracile. C’est pendant sa resynthèse par une ADN-polymérase que sont introduites les mutations au niveau des paires AT. Deux mécanismes ont été proposés pour rendre compte de cette sélectivité : des ADN-polymérases error-prone spécifiques, et/ou l’incorporation de dUTP. Cependant, aucune donnée expérimentale n’avait encore été obtenue quant à la possible contribution de ce dernier. Nous avons mis au point une méthode basée sur la LA-PCR (ligation-anchored PCR), nous permettant d’identifier la présence d’uracile dans les gènes VkOx de souris immunisées, à la fois dans le contexte de mismatchs U:G (résultants de l’action de l’AID), et de paires U:A (résultants de l’incorporation de dUTP). Ces résultats montrent que le mécanisme d’incorporation de dUTP est impliqué dans l’hypermutation somatique, et pourrait constituer le mécanisme principal responsable de l’apparition des mutations de phase II

En introduisant fréquemment des mutations ponctuelles dans les régions variables des gènes d'immunoglobulines (Ig), le processus d'hypermutation somatique (SHM, initié par la déaminase AID) est essentiel pour augmenter l'affinité des anticorps. En marge de ses cibles physiologiques (les gênes d'Ig), AID peut induire des "dommages collatéraux" au niveau de cibles "illégitimes" qui sont appelées "off targets" (dont certains oncogènes, tel que Bcl6 fréquemment muté dans les lymphomes B). Le risque élevé de dommages collatéraux dans le génome des cellules B implique que les remaniements géniques soient précisément surveillés. Parmi les éléments cis-régulateurs impliqués dans cette surveillance, on compte l'activateur cEμ au locus des chaînes lourdes des Ig (IgH) et ses régions flanquantes d'attachement à la matrice nucléaire MARsEμ (étudiés en détails dans nos modèles de souris KO). Nous montrons que la délétion des régions MARsEμ diminue non seulement les mutations au locus des chaines lourdes des Ig (effet physiologique en cis) mais également au locus des chaines légères Ig situé sur un chromosome différent (effet de trans). A l'aide d'une outil bioinformatique (DeMinEr) que nous avons développé dans le but d'identifier des mutations rares, nous montrons également que les régions MARsEμ sont impliquées dans les dommages collatéraux infligés aux "off targets" des cellules B. Grâce à la technique de FISH 3D, nous proposons que les régions MARsEμ participent à la régulation de la SHM en influençant la position des cibles de AID dans le noyau des cellules B. Notre étude met en évidence un niveau de régulation spatiale du processus de SHM médié par les régions MARsEμ du locus IgH
By introducing frequent point mutations into the variable regions of immunoglobulin (Ig) genes, somatic hypermutation (SHM, initiated by the AID deaminase) is a driving force for antibody affinity maturation. It is now admitted that AID-induces mutations in germinal centre B cells could affect in parallel to their Ig genes physiological targets, illegitimates targets (including oncogenes) so calles "off targets" (such as Bcl6 with frequent point mutation in B lymphomas). The high risk of "collateral damage" in the B cell genome implies that remodeling events are precisely surveyed. Among cisregulatory elements involved (transcriptional enhancers and chromatin isolators and anchors...), one best candidate is the intronic region including the cEμ enhancer and iths flanking MARsEμ regions that we have been studying extensively using mouse KO model. We recently showed that MARsEμ deletion decreases SHM not only at Ig Heavy chain locus IgH (physiological cis effect) but surprisingly also at the Ig Light chain Kappa locus Ig, located on a different chromosome (trans effect). To extend the study of this intriguing trans effect, we developed a bioinformatic tool called DeMinEr that unveiled that MARsEμ regions were also involved in AID-induced collateral damages to "off-targets". Using FISH 3D, we show that MARsEμ regions harboured the potential not only to locally recruit SHM but also to cause dynamic changes of nuclear structures. The surprising cis and trans effect of MARsEμ deletion, impacting simultaneously nuclear positioning and SHM, revealed an additional level of regulation for targeting mutations to Ig and "off-targets" genes

Durant l’ontogénie B, le locus des chaines lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus de réarrangements géniques. Lors des phases précoces du développement B, indépendamment de la rencontre avec un antigène, les réarrangements VDJ permettent l’obtention d’un répertoire d’Ig fonctionnelles. Lors des phases tardives, l’hypermutationsomatique (SHM) permet l’augmentation de l’affinité de l’Ig pour son antigène tandis que larecombinaison isotypique (CSR) modifie ses fonctions effectrices. Ces évènements impliquent l’induction de lésions de l’ADN potentiellement oncogéniques, ce qui impose unerégulation très stricte. Cette régulation est assurée par divers éléments cis-régulateurs répartis tout au long du locus IgH, dont la région régulatrice en 3’ (3’RR). La 3’RR s’étend sur 30 kb et contient quatre activateurs transcriptionnels, les trois premiers formant une structure palindromique. Lors de ma thèse, j’ai utilisé plusieurs modèles murins porteurs de délétions de tout ou partie de la 3’RR pour étudier son rôle, ainsi que celui des différents éléments qui la compose lors des diverses étapes de l’ontogénie B. Nous avons pu déterminer comment la 3’RR régule précisément la CSR en ciblant spécifiquement la région switch acceptrice et caractériser le phénomène encore peu connu de CSR vers IgD. D’autre part, nous avons démontré l’importance de la 3’RR lors de la SHM et dans le développement des différentes sous populations lymphocytaires B. Enfin, la comparaison des résultats obtenus lors de l’analyse des différents modèles nous a permis de déterminer que la structure palindromique de la 3’RR est importante pour une SHM efficace, mais relativement dispensable lors de la CSR
During B-cell development, the heavy chains locus (IgH) undergoes three genic rearrangement events. During the early stages, before encountering the antigen, VDJ rearrangements allow the generation of a functional Ig repertoire. During the late stages, somatic hypermutation (SHM) increases the affinity of the Ig for its antigen, while class switch recombination (CSR) modifies its effector functions. These events imply thegeneration of potentially oncogenic DNA lesions, and thus require a strict regulation. This regulation is assured by several cis-regulatory elements spread along the IgH locus, including the 3’ regulatory region (3’RR). The 3’RR extends on more than 30kb and contains four transcriptional enhancers, the first three displaying a palindromic conformation. During my PhD, I investigated several mouse models carrying deletion of part or totality of the 3’RR to investigate its role during B cell development. We demonstrated how she precisely regulates CSR by specifically targeting the acceptor switch region, and described the poorly known mechanism of CSR toward IgD. Otherwise, we have demonstrated its importance during SHM and in the correct development of the different B cell subpopulations. Finally, by comparing the results obtained during the analysis of the various mouse models, we have demonstrated that the palindromic structure of the 3’RR is required for optimal SHM, but not for CSR

Pour augmenter l’affinité des anticorps sécrétés en réponse à un antigène, les gènes d’immunoglobulines subissent l’hypermutation somatique, une mutagénèse adaptative initiée par l’action de l’activation-induced cytidine deaminase (AID). L’uracile provenant de la désamination des cytosines par cette enzyme est réparé de façon erronée par la suite : si il est pris en charge par l’uracile N-glycosylase (UNG), enzyme à l’origine d’une réparation poursuivie habituellement par des composantes de la voie du "base-excision repair", il reste à sa place un site abasique franchissable par les ADN polymérases translésionnelles avec un taux d’erreur très élevé. Si le mésappariement U:G est reconnu par la voie du « mismatch repair », le brin d’ADN entourant le U est dégradé puis néo-synthétisé par une autre ADN polymérase translésionnelle particulièrement mutagène en face des bases T et A, la polymérase eta. Nous avons proposé que le choix entre ces deux voies de réparation mutagènes puisse être régulé en fonction du cycle cellulaire: les mutations des paires A:T seraient introduites dans les gènes d’immunoglobulines par la voie du mismatch repair en phase G1 alors que la voie erronée d’UN introduirait les autres mutations lors de la phase S. Nous sommes parvenus à restreindre l’activité de l’AID à deux parties distinctes du cycle, la phase G1 ou les phases S/G2/M, et nous avons établi le fonctionnement de ce système dans le modèle murin. De façon surprenante, nous avons détecté un taux de mutation proche du bruit de fond chez toutes les souris dont l’AID opérait uniquement dans les phases S/G2/M. Par contre, les souris dont l’AID a été restreinte en G1 présentaient un spectre de mutation diversifié sur les quatre bases et similaire au normal. A la lumière de ces résultats, nous proposons que les lésions introduites tout au long du cycle par l’AID soient diversifiées par les acteurs de l’hypermutation somatique pendant la phase G1, alors que les lésions seraient soit réparées de façon fidèle en dehors de cette phase-là, soit de faible impact. Afin d’expliquer le biais de brin dans l’hypermutation somatique observé pour les mutations sur les bases A :T, nous proposons pour l’ADN polymérase eta un rôle inhabituel de réparation du brin portant la « lésion », et non de synthèse translésionnelle classique en face de cette lésion. Nous avons analysé le profil, le taux et la distribution des mutations introduites par Pol eta sur un oligonucléotide cible pour l’hypermutation, qui a été inséré au locus des immunoglobulines et utilisé pour l’établissement des souris knock-in avec un fond génétique déficient ou non en UNG. Nos résultats, selon lesquels Pol eta continue de cibler le brin codant indépendamment de la localisation des « points d’entrée » en forme d’uraciles, contredisent les rapports déjà publiés sur ce sujet. De façon inattendue, nos résultats mettent en évidence une coopération entre les voies UNG et et les activités endonucléasique du mismatch repair, fournissant la cassure simple brin qui va permettre d'initier la resynthèse à fort taux d'erreur à l'origine de la mutagénèse A/T. Ces résultats résolvent aussi le paradoxe de la non-participation apparente du complexe effecteur du mismatch repair (Mlh1/Pms2) dans le processus d'hypermutation, en proposant qu'il fonctionne en redondance avec UNG, dans une distribution des tâches qui dépend du contexte de la séquence ciblée et de la densité du processus de deamination
Somatic hypermutation is a localized mutagenesis, essentially targeted to the immunoglobulin V region, and occurring during the immune response. This process is triggered by AID (activation-induced cytidine deaminase) that deaminates cytosines into uracils at the Ig locus. This lesion is further processed by Ung or the Msh2-Msh6 complex, with an abnormal outcome for both pathways that results in an increased mutation load. The Msh2-Msh6 complex recruits Pol eta to generate a short patch DNA synthesis with mostly mutations at A and T bases. To get further insight into this error-prone repair process, we have generated hypermutation substrates consisting in an A/T oligonucleotide of 100 bases with or without 3 cytidines in its core region, inserted by knock-in at the heavy chain Ig locus. Our aim was to compare the mutation frequency, distribution and mutation profile of substrates with C on either the coding or the non-coding strand on WT or Ung-deficient background, taking into account that Pol eta is a preferred A to G mutator. Our results suggest that Pol eta resynthesis may proceed on the coding strand, whatever the strand localization of the uracil, thus contradicting previous reports. Unexpectedly, our results revealed a cooperation between the Ung pathway and the endonuclease activity of the mismatch repair, with both of them providing the single-strand nick that allows initiation of the error-prone process that generates mutations at A and T bases. These results resolve the apparent paradox of the non-involvement of the mismatch repair effector complex (Mlh1-Pms2) in hypermutation, by proposing that it works redundantly with UNG, in a distribution of tasks that will depend upon the sequence context and the intensity of deamination activity. We have also constructed cell cycle restricted mutants of AID, to study in which phase of the cell cycle this atypical, mismatch repair driven, error-prone synthesis is taking place. Using the Fucci restriction system (degrons based on Cdt1 or Geminin peptides), we have generated AID constructs with proper restriction in either G1 or S/G2/M phases. These retroviral constructs have been used to transduce mouse hematopoietic stem cells from either AID -deficient mice and to restore immunodeficient animals, in order to analyze their immune response. We report that restriction of AID expression in S/G2/M part of the cycle yielded only background mutation frequency, while AID operating in the G1 phase is able to generate an equal proportion of A/T and G/C mutations at the Ig loci, thus demonstrating that uracils generated in G1 are substrates for both Ung- and mismatch repair pathways

L'hypermutation somatique et la communication isotypique sont deux volets essentiels de la maturation de la réponse immunitaire. De nombreux travaux se sont intéressés à ces processus sous leurs aspects transcriptionnels, notamment aux éléments cis-régulateurs, mais très peu de données concernant l'implication du récepteur à l'antigène des cellules B (BCR) sont aujourd'hui disponibles. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à la capacité d'IgM et d'IgA, de même affinité pour le même antigène, d'induire in vitro l'hypermutation somatique dans la lignée humaine BL2. Nous avons trouvé que les deux isotypes pouvaient induire l'hypermutation mais de manière dose-dépendante. Dans la deuxième partie, nous avons utilisé des BCRs natifs et chimériques pour étudier le rôle des domaines cytoplasmiques des isotypes commutés dans la transduction du signal et la down-modulation. Nous avons trouvé que ces domaines ne traduisaient pas de signal, mais qu'ils assuraient la down-modulation de leur BCR de manière strictement dépendante de la tyrosine conservée dans ces domaines, révélant ainsi un rôle régulateur de cette tyrosine. Dans le but d'évaluer le rôle de l'hétérodimère Ig"/Igβ dans la mémoire immunologique, en l'absence totale des domaines cytoplasmiques des isotypes non-IgM/IgD, nous avons cherché à bloquer la commutation isotypique. Nous avons délété, par recombinaison homologue, la majeure partie de l'intron I:-C:. L'analyse des souris obtenues a révélé une sévère diminution de la commutation isotypique, mais pas un blocage complet, avec un décalage significatif des sites donneurs de commutation vers l'exon I:, et une absence quasi-totale des mutations introduites par AID

Pour accomplir leurs fonctions essentielles, les chimiokines activent des récepteurs couples aux protéines G heterotrimeriques exprimés à la surface des leucocytes. Au-delà de cette interaction fondamentale avec leurs récepteurs, les chimiokines se lient de manière non covalente aux moities glycaniques (glycosaminoglycanes, gags) des protéoglycanes. De l'affinité des interactions avec les gags dépendent leur immobilisation tissulaire et la formation de gradients qui gouvernent les mécanismes de chimiotaxie et d'haptotaxie. L'intégrité de ces mécanismes pourrait être essentielle pour que les chimiokines puissent accomplir pleinement leurs fonctions biologiques, aussi bien en homéostasie que dans des situations physiopathologiques. Mon travail de thèse de doctorat s'inscrit dans une recherche pionnière initiée par mon laboratoire d'accueil. Il est axe sur l'étude du rôle in vivo des interactions des chimiokines CXCL12, chimiokine essentielle, et CXCL13 dans la régulation des réponses immunitaires, en particulier de la réponse humorale, dans laquelle CXCL13 et CXCL12 coopèrent positivement à son homéostasie. Les objectifs spécifiques du travail sont : i) la recherche du fonctionnement des centres germinatifs (CGS) des organes lymphoïdes secondaires chez des animaux portant une invalidation sélective de la fonction d'interaction des isoformes de CXCL12 avec les gags. Ii) l'identification et la caractérisation biochimique et fonctionnelle des déterminants moléculaires de CXCL13 complétée par une analyse structurelle de la protéine. Les données de mon travail montrent que chez les animaux mutants CXCL12gagtm/ gagtm il existe une très forte proportion de cgs configures de manière anormale, ou les compartiments DZ et LZ du CG ne sont pas bien délimités. Chez les animaux mutants, des cellules lz de grande taille sont fréquemment observees et expriment des marqueurs témoignant d'une activité mitotique. Ces cellules pourraient correspondre à des cellules du compartiment dz (centroblastes) ectopiquement localisées dans LZ comme conséquence de la disruption du gradient de CXCL12. Chez les animaux mutants on observe une diminution des mutations somatiques dans les gènes des immunoglobulines des cellules des cgs et post-cgs, qui s'accompagne de la diminution des anticorps de haute affinité produits en réponse à l'immunogène np. Nous concluons que les anomalies structurelles et fonctionnelles (cause et conséquence) dérivent de l'absence d'immobilisation de CXCL12. Chez l'animal mute, lorsque CXCL12 n'est pas fdœee à des surfaces cellulaires ou extracellulaires, la migration et localisation aberrante des cellules dz entraine un disfonctionnement de la production et la sélection des cellules b productrices des anticorps de haute affinité. L'abolition de l'interaction de CXCL12 avec les gags dans le cg serait ainsi à l'origine de la réponse immunitaire humorale sous-optimale observée chez les animaux CXCL12 gagtm/gagtm. Nous avons systématiquement effectue une mutagenèse CXCL13 murin et identifie d'abord les mutants qui conservaient une expression intacte dans les cellules eucaryotes. Puis, nous avons procédé a l'analyse fonctionnelle de chaque mutant avec, en parallèle, une évaluation de leurs interactions avec des gags immobilises soit in vitro (surface plasmonic résonance), soit in cellulo, à l'aide des cellules qui diffèrent génétiquement par leur expression des gags. Nos résultats montrent que deux déterminants moléculaires de CXCL13 coopèrent positivement dans la liaison sélective aux gags de type heparan sulphates (HSS). En outre, les mutants ainsi génères ont des expressions et des fonctions de Signalisation préservées via cxcr5. L'analyse structurale de la protéine CXCL13 montre aussi que les mutations dans les déterminants impliques dans la liaison aux HSS, n'affectent pas la structure générale de la chimiokine. Dans leur ensemble, ces résultats prouvent que l'invalidation par mutagenèse des Interactions du CXCL13 murin avec les hss est compatible avec une préservation de son expression et de ses fonctions biologiques. Ceci est une condition sine qua non pour développer une souris modifiée génétiquement permettant d'analyser sans biais le rôle in vivo de l'immobilisation de CXCL13 sur les protéoglycanes. La combinaison de deux mutations sur les deux gènes CXCL12 et CXCL13 devrait permettre la génération d'animaux viables. S'agissant des mutations affectant sélectivement l'interaction avec les protéoglycanes, sans diminution des pouvoirs agonistes de deux chimiokines, le modèle devrait permettre l'élucidation sans biais du rôle de l'immobilisation tissulaire de CXCL12 et CXCL13 sur leurs fonctions biologiques
To fulfill their core functions, chemokines activate receptors coupled to heterotrimeric g proteins expressed on the surface of leukocytes. Beyond this fundamental interaction with their receptors, chemokines also bind non-covalently to the glycan moieties (glycosaminoglycans, gags) of proteoglycans. Gags dependent tissue immobilization and formation of chemokine gradients that govern chemotaxis and haptotactic mechanisms largely relies in the affinity of gag/chemokine interactions. The integrity of these mechanisms might be essential for chemokines to fully perform their biological functions in homeostasis as well as in pathophysiological situations. My phd studies pursue a pioneer research initiated by my host laboratory. It focuses on the study of the role played in vivo by the interactions of the chemokines CXCL12, the only essential chemokine, and CXCL13 in the regulation of immune responses, and in particular, of the anamnestic b cell response wherein CXCL13 and CXCL12 positively cooperate to maintain the homeostasis of humoral immunity. Specific objectives of this work are: i) to study the structure and function of secondary lymphoid organs, and in particular of germinal centers (gc), in an animal model carrying a selective genetic invalidation of CXCL12/gags interactions; ii) to assess the capacity of CXCL13 to interact with gags and eventually to identify the molecular determinants accounting for and characterize the structure/function relationships of CXCL13/gags interactions. Our findingsshow that in the mutant animals CXCL12gagtm / gagtm there is a very high proportion of abnormally configured gcs, where dark zone (dz) and light zone (lz) compartment of the gc are not well defined. In mutant animals, large lz cells are commonly seen and express markers indicating mitotic activity. These cells might would correspond to centroblasts, that typically localizes in the dz compartment, ectopically settled in the lz as a consequence of the disruption of CXCL12 gradient. In mutant animals, a decrease is observed in the number of somatic mutations in gc- and post-gc-cell immunoglobulin genes, together with the reduction of high-affinity antibodies produced in response to the immunogen np. We conclude that the structural and functional abnormalities (cause and effect) derive from the absence of immobilization of CXCL12 in the dz compartment where this chemokines has been shown to accumulate preferentially in the gc structure. Mutant animals show aberrant migration and localization of dz cells which causes a dysfunction of both the production and selection of b cells expressing high affinity antibodies. The abolition of the interaction of CXCL12 with gags in the gc causes a Suboptimal humoral immune response in CXCL12gagtm/gagtmanimals. We have systematically performed a murine CXCL13 mutagenesis and first identified mutants that retained an intact expression in eukaryotic cells. Then we conducted functional analysis of each mutant together with an assessment of their interactions with immobilized gags either in vitro (surface plasmonic resonance) or in cellulo, using cells that differ genetically by their expression of gags. Our results show that two molecular determinants of CXCL13 positively cooperate to enable a selective, high-binding affinity of the chemokine to gags type heparan sulphates (hs). Furthermore, the mutant chemokines disabled of hs-binding capacity, exhibited a fully preserved, as compared to the wild type counterpart, cell-signaling functions via cxcr5. Structural analysis of the CXCL13 protein shows that mutations in the determinants involved in binding to hs do not affect the overall structure of the chemokine. Taken together, these results prove that the invalidation by mutagenesis of murine CXCL13 interactions with hs is compatible with the preservation of both expression and biological functions. This is a mandatory prerequisite for developing a genetically modified mouse, which would enable the study of the role played in vivo by the immobilization of CXCL13 on cell/tissue proteoglycans and makes conceivable the generation of viable animals encoding CXCL12 and CXCL13 genes. An animal model encompassing mutated CXCL12 and CXCL13 genes selectively disabled to complex with gags but expressing chemokines with intact agonist properties, would be an invaluable tool to perform an unbiased and complete study of the contribution of proteoglycan-anchoring to the biological roles of these important chemokines

L'hypermutation somatique (HMS) consiste en l'introduction de mutations ponctuelles dans les régions variables des immunoglobulines. Différents travaux ont suggéré que les mutations dans les gènes V seraient introduites lors de la réparation des cassures doubles brins. Afin d'évaluer cette hypothèse, nous avons utilisé la capacité de la TdT (terminale transférase) à incorporer des nucléotides sur des extrémités 3'OH de l'ADN laissant ainsi des cicatrices aux sites de cassures. Les résultats de nos travaux réalisés avec des souris TdT transgéniques montrent que même si des séquences N ont été mises en évidence au niveau des jonctions VJ des chaînes légères, aucune insertion N n'a été trouvée dans les régions V remettant ainsi en cause l'implication des cassures double brin dans l'HMS. Afin de mieux comprendre le mécanisme moléculaire de l'HMS, nous avons développé un modèle utilisant des vecteurs épisomiques nous permettant de distinguer les mutations G:C et A:T. Les mutations G:C correspondent à la phase I d'HMS et résultent directement de la déamination des cytidines par l'AID (activation induced cytidine deaminase), l'enzyme clé de l'HMS. Le mécanisme des mutations A:T (phase II de l'HMS) impliquent en plus de l'AID les facteurs de réparations des mésappariements mais n'est pas encore élucidé. En utilisant une série de vecteurs contenant le gène GFP inactivé par des codons STOP en différentes positions, nous avons évalué le niveau et le profil d'HMS de plusieurs lignées cellulaires. La mise en évidence de mutations A:T AID-dépendantes dans les cellules non B suggère que AID serait le seul facteur B-spécifique nécessaire pour déclencher les mutations au niveau des paires A:T
Somatic hypermutation (SHM) consists in introducing point mutations into the variable region of the rearranged immunoglobulin genes. A series of works proposed that in SHM the mutations would be introduced during the repair of double-strand breaks (DSB) within V genes. Taking opportunity of the availability of the TdT transgenic mice, that constitutively express TdT in ail B lineage cells, we have used a strategy exploiting the capacity of the TdT to add nucleotides on 3'OH DNA ends to detect DSN in V genes, if any. Our results show that although TdT activity could be evidenced at DSB of VJ junctions, no TdT insertions were detected in the V genes, suggesting that DSB are dispensable for the generation of mutations during SHM. In order to better understand the molecular mechanism of SHM we have developed a model using episomic vectors that enables us to distinguish between G:C and A:T mutations. G:C mutations correspond to the first phase of SHM resulting directly from the activity of AID (activation induced cytidine deaminase), the key enzyme of SHM, while AT mutations, which correspond to the second phase, implicate also the mismatch repair proteins, but the exact mechanism remains to be elucidated. A set of vectors containing a GFP gene, inactivated by the introduction of different STOP codons at various positions of the gene, was used to detect the hypermutation level of AID expressing cell lines. The existence of AID dependent A:T mutations detected by episomic vectors in a non B cell line suggests that AID is the only B specific factor necessary for triggering AT focused mutations

Durant l’ontogénie B, le locus des chaînes lourdes d’immunoglobulines (IgH) subit trois processus majeurs de réarrangements géniques. Lors de la phase précoce du développement B, indépendamment de la rencontre avec un antigène (Ag), les recombinaisons VHDJH donnent le répertoire diversifié des Ig fonctionnelles. Durant la phase tardive, suite à une activation par l’Ag, l’hypermutation somatique (SHM) permet l’augmentation de l’affinité de l’Ig à son Ag et la recombinaison isotypique (CSR) va modifier ses fonctions effectrices. Tous ces processus sont strictement régulés par différents éléments cis-régulateurs repartis tout au long du locus IgH. La région régulatrice en 3’ (3’RR) en est un. Elle s’étend sur environ 30 Kb et est constituée de quatre activateurs transcriptionnels, dont les trois premiers forment une structure palindromique. La 3’RR contrôle, chez le lymphocyte B-2 (LB-2), la transcription du locus IgH, le devenir de la cellule B, la SHM et la CSR mais elle n’a aucun effet sur les recombinaisons VHDJH et la diversité du répertoire antigénique. Les LB-1 représentent un petit pourcentage des LB totaux. Ils diffèrent des LB-2 par leur origine, développement, fonctions, marqueurs de surface et distribution tissulaire. Les LB-1 maintiennent l'homéostasie dans l'organisme et sont la source principale des Ig naturelles (NIgM et NIgA) au cours des premières phases d'une réponse immunitaire. Lors de ma thèse, nous avons étudié le rôle de la 3’RR sur le développement des LB-1. D’une façon identique aux LB-2, la 3’RR contrôle la transcription du locus IgH, le devenir des cellules B et la SHM dans les LB-1. A l’inverse des LB-2, la 3’RR joue un rôle indirect sur la diversité du répertoire antigénique dans les LB-1 et n’a aucun effet sur la CSR vers IgA. Ces résultats mettent en évidence, pour la première fois, la contribution de la 3'RR dans le développement d’une population cellulaire B à l’interface entre l’immunité innée et acquise. Ils renforcent nos connaissances sur le rôle des éléments cis-régulateurs du locus IgH dans le développement de ces deux immunités
During B-cell development, the immunoglobulin heavy chain locus (IgH) undergoes three major genic rearrangements. During the early stages, before encountering the antigen (Ag), VHDJH rearrangements allow the generation of the Ig repertoire. During the late stages, after encountering the Ag, somatic hypermutation (SHM) increases the affinity of the Ig for its Ag, while class switch recombination (CSR) modifies its effector functions. All these genetic events are strictly regulated by cis-regulatory elements spread along the IgH locus, including the 3’ regulatory region (3’RR). The 3’RR extends over more than 30kb and contains four transcriptional enhancers, the first three displaying a palindromic conformation. The 3'RR controls B2 B-cell IgH transcription, cell fate, SHM and CSR but not repertoire diversity. B1 B-cells represent a small percentage of total B-cells differing from B2 B-cells by several points such as precursors, development, functions, surface markers and tissue distribution. B1 B-cells act at the steady state to maintain homeostasis and during the earliest phases of an immune response by secreting natural Ig (NIgM and NIgA). During my PhD, we investigated the role of the 3'RR on B1 B-cells. Similarly to B2 B-cells, the 3'RR controls IgH transcription, cell fate and SHM in B1 B-cells. In contrast to B2 B-cells, 3'RR deletion indirectly affects B1 B-cell repertoire diversity and has no effect on their CSR towards IgA. These results highlight, for the first time, the contribution of the 3'RR in the development of a B-cell population at the interface between innate and acquired immunity. Moreover, these results strengthen our knowledge of the role of the cis-regulatory elements of the IgH locus in the development of these two immune responses

Pour augmenter l'affinité des anticorps sécrétés en réponse à un antigène, les gènes d'immunoglobulines subissent l'hypermutation somatique, une mutagénèse adaptative initiée par l'action de l'activation-induced cytidine deaminase (AID). L'uracile provenant de la désamination des cytosines par cette enzyme est réparé de façon erronée par la suite : si il est pris en charge par l'uracile N-glycosylase (UNG), enzyme à l'origine d'une réparation poursuivie habituellement par des composantes de la voie du "base-excision repair", il reste à sa place un site abasique franchissable par les ADN polymérases translésionnelles avec un taux d'erreur très élevé. Si le mésappariement U:G est reconnu par la voie du " mismatch repair ", le brin d'ADN entourant le U est dégradé puis néo-synthétisé par une autre ADN polymérase translésionnelle particulièrement mutagène en face des bases T et A, la polymérase eta. Nous avons proposé que le choix entre ces deux voies de réparation mutagènes puisse être régulé en fonction du cycle cellulaire: les mutations des paires A:T seraient introduites dans les gènes d'immunoglobulines par la voie du mismatch repair en phase G1 alors que la voie erronée d'UN introduirait les autres mutations lors de la phase S. Nous sommes parvenus à restreindre l'activité de l'AID à deux parties distinctes du cycle, la phase G1 ou les phases S/G2/M, et nous avons établi le fonctionnement de ce système dans le modèle murin. De façon surprenante, nous avons détecté un taux de mutation proche du bruit de fond chez toutes les souris dont l'AID opérait uniquement dans les phases S/G2/M. Par contre, les souris dont l'AID a été restreinte en G1 présentaient un spectre de mutation diversifié sur les quatre bases et similaire au normal. A la lumière de ces résultats, nous proposons que les lésions introduites tout au long du cycle par l'AID soient diversifiées par les acteurs de l'hypermutation somatique pendant la phase G1, alors que les lésions seraient soit réparées de façon fidèle en dehors de cette phase-là, soit de faible impact. Afin d'expliquer le biais de brin dans l'hypermutation somatique observé pour les mutations sur les bases A :T, nous proposons pour l'ADN polymérase eta un rôle inhabituel de réparation du brin portant la " lésion ", et non de synthèse translésionnelle classique en face de cette lésion. Nous avons analysé le profil, le taux et la distribution des mutations introduites par Pol eta sur un oligonucléotide cible pour l'hypermutation, qui a été inséré au locus des immunoglobulines et utilisé pour l'établissement des souris knock-in avec un fond génétique déficient ou non en UNG. Nos résultats, selon lesquels Pol eta continue de cibler le brin codant indépendamment de la localisation des " points d'entrée " en forme d'uraciles, contredisent les rapports déjà publiés sur ce sujet. De façon inattendue, nos résultats mettent en évidence une coopération entre les voies UNG et et les activités endonucléasique du mismatch repair, fournissant la cassure simple brin qui va permettre d'initier la resynthèse à fort taux d'erreur à l'origine de la mutagénèse A/T. Ces résultats résolvent aussi le paradoxe de la non-participation apparente du complexe effecteur du mismatch repair (Mlh1/Pms2) dans le processus d'hypermutation, en proposant qu'il fonctionne en redondance avec UNG, dans une distribution des tâches qui dépend du contexte de la séquence ciblée et de la densité du processus de deamination.