Dissertations / Theses on the topic 'Ilot langerhans'

Pathogenie autoimmune des diabetes insulinoprives chez l'homme, la souris et le rat. Des lymphocytes circulants alterent in vitro l'insulinosecretion des cellules d'ilots et peuvent presenter des anomalies du circuit de l'interleukine 2. Essai d'immunotherapie par la ciclosporine a

La membrane des cellules excitables se comporte comme un circuit electrique non lineaire. Cette non linearite permet une grande variete d'oscillations complexes, comme les oscillations en salves (bursting) qui sont le sujet de notre these. Les modeles proposes au cours de la these sont constitues par des systemes d'equations differentielles, ordinaires ou aux derivees partielles. Dans la partie i de la these, nous proposons d'abord un modele de l'activite electrique d'un neurone du homard. Nous montrons que, suivant l'intensite des stimuli mecaniques sur les dendrites, differents motifs de reponse entre oscillations dendritiques et axonales sont possibles. Ensuite, nous considerons un modele simplifie de la membrane neuronale, negligeant l'espace mais incluant la dynamique de ca i et les courants electriques qui en dependent. Nous obtenons un comportement connu comme bursting elliptique. Nous montrons par des simulations numeriques que la seule solution stable pour le couplage diffusif de deux bursters elliptiques est celle avec oscillations en phase durant la periode active. Nous retrouvons ce resultat analytiquement sur un modele simple de bursting elliptique, fonde sur la forme normale de la bifurcation de hopf generalisee. La partie ii de la these concerne la modelisation du comportement electrique des cellules du pancreas. Nous montrons que le courant d'echange na/ca modifie le rapport entre duree de la phase active et periode totale du bursting (plateau fraction) en fonction du glucose. Ceci permet de proposer un nouveau mecanisme liant la secretion d'insuline a la concentration de glucose. La modelisation d'un reseau heterogene de cellules couplees montre que le courant d'echange na/ca est crucial pour la regulation locale de ca i. Enfin, dans le cas de deux cellules couplees, nous demontrons l'existence d'un effet de memoire et l'influence d'une bifurcation de noeud-col sur la phase silencieuse du bursting et sur la transition vers la phase active.

La destruction sélective des cellules bêta des ilots de Langerhans pourrait être due à une réaction immunitaire dirigée contre elles. Etude de la phase effectrice de la réponse auto-immune c'est-à-dire l'immunité cellulaire, l'immunité humorale complément dépendante, la cytotoxicité cellulaire dépendante d'anticorps chez les diabétiques de type 1. L'évolution de ces paramètres a été étudiée en fonction de la durée clinique de la maladie et de la présence ou de l'absence de manifestations auto-immunes extra-pancréatiques.

Le but du travail a été d'étudier: 1) l'effet de la pentamidine sur les ilots de Langerhans incubes in vitro, afin de préciser son action cytotoxique et la sélectivité de cet effet; 2) de progresser dans la compréhension du mode d'action de la pentamidine par des études basées d'une part sur la comparaison avec d'autres substances toxiques pour la cellule b, (alloxane, streptozotoxine) et d'autre part sur la nature des altérations morphologiques causées par la pentamidine; 3) de tenter de reproduire chez l'animal les effets observés chez les patients traites par ce médicament.

Les travaux qui font l'objet de ce memoire ont porte sur la presence, au niveau des cellules insulaires, et le role des facteurs insulin-like growth factor i (igfi) et thyrotropin releasing hormone (trh). En utilisant un systeme d'ilots pancreatiques de rats neoformes en culture, nous demontrons que les cellules insulaires produisent et secretent un peptide qui par ses proprietes de poids moleculaire, hydrophobicite, point isoelectrique et antigenicite est identique a l'igfi biosynthetique. Nous montrons que dans le meme systeme experimental l'hormone de croissance humaine biosynthetique stimule la proliferation des cellules beta des ilots de langerhans. Le mecanisme d'action de l'hormone de croissance sur les cellules insulaires, direct ou medie par une production locale d'igfi n'a jusqu'a maintenant pas pu etre elucide. Au niveau du pancreas de rat adulte, nous avons mis en evidence, par des techniques d'autoradiographie quantitative la presence de sites de liaison a l'hormone de croissance humaine, ces sites de liaison semblant de type lactogenique. En utilisant le meme systeme experimental d'ilots fetaux neoformes en culture, nous demontrons que la trh est synthetisee dans les cellules du pancreas endocrine et colocalise avec l'insuline dans les memes granules de secretion. Le parallelisme entre les contenus insulaires en trh et l'activite enzymatique peptidylglycine alpha amidating monooxygenase qui intervient dans la derniere etape de la maturation post-traductionnelle de la trh nous permet de proposer que cette activite enzymatique pourrait representer une etape limitante de la synthese de la trh. Une des cibles de la trh pancreatique, colocalisee avec l'insuline dans les memes granules de secretion, pourrait etre le foie. Nous montrons que le substrat trh est degrade dans le foie par une protease a haut degre de specificite pour ce substrat generant un dipeptide biologiquement

Nous avons utilise un modele transgenique pour etudier la reponse immunitaire dirigee contre un antigene exprime specifiquement sur les cellules des ilots de langerhans. Le transgene est cr2 (cd21), recepteur humain du virus d'epstein-barr et de la fraction c3d du complement, exprime sous le controle du promoteur de l'insuline de rat. Nous avons realise des greffes d'ilots exprimant cr2 chez des receveurs non transgeniques f1 (b6xcba). Les donneurs d'ilots etaient rip-cr2 et de fonds genetiques differents : b6 (h2 b), cba (h2 k) ou f1 b6xcba. Bien que l'antigene etranger cr2 et le receveur soient constants dans l'ensemble des experiences, le fond genetique des ilots greffes influence la survie de la greffe. Les ilots d'animaux b6 cr2+ induisent une reponse humorale contre cr2 et une peri-insulite mais ne sont pas rejetes (survie < 150 jours). En revanche, les ilots cba cr2+ induisent une insulite destructrice et sont rejetes (moyenne de survie = 65+/23 jours). D'autres experiences ont demontre l'existence de mecanismes regulateurs capables de prevenir le rejet des ilots b6 exprimant cr2 : les ilots transgeniques f1 b6xcba ne sont pas rejetes et la transplantation simultanee d'ilots cr2+ b6 et d'ilots cba previent le rejet des ilots cba. Cette protection peut etre transferee par des splenocytes d'animaux greffes. L'analyse des cytokines secretees par les splenocytes des receveurs des differents types de greffes montre une production preferentielle d'interleukine-4 chez les animaux proteges contre le rejet. Par ailleurs, la realisation d'hybridomes t cd4 a partir de l'infiltrat nous a permis d'analyser la specificite de la reponse. Nous n'avons pas observe de diffusion de la reponse immunitaire a d'autres antigenes que cr2. Ces experiences montrent que l'expression d'un antigene etranger a la surface de cellules suffit donc a induire une reponse immunitaire et une destruction des cellules cibles. L'orientation de cette reponse (peri-insulite ou insulite destructrice et rejet) depend de l'origine genetique des ilots greffes et semble impliquer des interactions entre les cellules presentatrices de l'antigene presentes dans le greffon et celles du receveur.

Le traitement du diabete insulino-dependant par la greffe d'ilots de langerhans xenogeniques dans un systeme de pancreas bioartificiel permettrait de contourner deux obstacles a la greffe d'ilots humains : l'approvisionnement en tissu transplantable et l'immunotherapie a long terme. Nous avons mis au point une methode d'isolement et de cryopreservation d'ilots de langerhans de porc. Le travail a permis de montrer chez le rat que l'utilisation de la solution de preservatio d'organe uw (university of wisconsin) pour la digestion enzymatique du pancreas ameliorait la fonction insulinosecretoire des ilots isoles. Nous avons, dans un deuxieme temps, adapte la methode d'isolement d'ilots de langerhans humains, decrite par ricordi, a l'isolement d'ilots de langerhans de porc : 1) nous avons utilise la solution uw pour toutes les etapes de l'isolement, du prelevement a la purification, 2) nous avons optimise la methode par le prelevement en continue des ilots dissocies, ce qui permet la digestion complete du pancreas. Nous avons obtenu une augmentation du nombre d'ilots, le rendement de purification et la reponse insulinosecretoire etaient de meilleure qualite. Ces resultats ont ete confortes par des etudes histologiques demontrant la qualite des ilots. Enfin, nous avons etudie la fonction et la survie d'ilots de langerhans cryopreserves dans la solution uw contenant soit du polyethylene-glycol (peg) soit du dmso. Nous avons realise une etude comparative sur des ilots fraichement isoles ou cryopreserves. Nous avons observe une insulinosecretion similaire dans les deux cas, l'utilisation de la solution uw-peg comme cryoprotectant permet neanmoins de simplifier la methode. L'ensemble de ce travail demontre qu'il est possible d'isoler et de cryopreserver un grand nombre d'ilots de langerhans de porc et permet d'envisager la creation d'une banque de tissu transplantable.

Le diabète sucré insulinodépendant est une affection qui touche 150000 personnes en France, dont la gravité est essentiellement liée au développement de complications dégénératives vasculaires et nerveuses, conséquences de l'hyperglycémie chronique. Le traitement actuel, consistant en l'administration pluriquotidienne d'insuline est imparfait, car il ne mime pas la boucle de régulation glucose-insuline physiologique. Devant ces imperfections, on essaie actuellement de développer de nouveaux traitements tels que le pancréas bio artificiel : des ilots de Langerhans provenant de pancréas animaux sont placés entre deux membranes semi-perméables, laissant placer le glucose et l'insuline, mais pas les immunoglobulines et les lymphocytes, évitant ainsi le rejet immun : cette prothèse est alors branchée sur une dérivation artério-veineuse permettant ainsi d'adapter l'insulinosécrétion à la glycémie concomitante. Ce pancréas bio artificiel, contenant des ilots de Langerhans de rat et connecté directement sur un chien normal anesthésié sans pompe péristaltique, répond à une charge en glucose dans des conditions compatibles avec la physiologie. L'un des problèmes majeurs liés au développement d'un tel projet consiste à isoler en nombre suffisant les ilots de Langerhans, qui ne représentent qu'un pour cent de la masse pancréatique totale. A partir d'une méthode de digestion enzymatique par la collagénase élaborée sur le rat, nous avons développé l'isolement d'ilots de Langerhans à partir du pancréas de chien, puis de porc. Devant les résultats inconstants obtenus avec les ilots de porc, nous avons été conduits à automatiser la méthode d'isolement d'ilots de Langerhans de porc
Insulin-dependent diabetes is a disease which affects nearly 150 000 persons in France, whose gravity is essentially bound to the development of vascular and nervous complications. Actual treatment, consisting in multiple daily insulin injections, is not perfect because it does not reproduce the physiological glucose-insulin regulation. In front of these difficulties, new treatments, such as bioartificial pancreas, are developed : islets of Langerhans from animal pancreas are placed between two selective membranes, permeable to glucose and insulin, but not to immunoglobulins and lymphocytes, avoiding immune rejection. This bioartificial pancréas, containing rat islets of Langerhans and directly connected to a normal anaesthetized dog without any peristaltic pump, responds to a glucose load in conditions compatible with physiology. The major problem of this project is to obtain enough islets, which represent only one per cent of the total pancreas. We have developed an isolation method fromdog and pig pancreas, but inconstant results lead us to automatize this method

Le diabete de type 1 est caracterise par une hyperglycemie chronique liee a une carence en insuline. Le traitement actuel ne permet pas d'obtenir un controle parfait de la glycemie et n'elimine pas le risque d'apparition de complications secondaires. De nouvelles voies de recherche, ou l'insulino-secretion serait adaptee a tout moment aux variations de la glycemie, sont a l'etude. Un des axes de recherche consiste a developper un pancreas bioartificiel constitue d'ilots proteges des reactions immunitaires par une membrane artificielle biocompatible et semi-permeable. Ce systeme permet de resoudre le probleme du manque d'organes humains, puisqu'il autorise la xenotransplantation d'organes de porc. Ceci ne peut etre envisage qu'a la condition d'utiliser des porcs exempts d'organismes pathogenes specifiques (eops), pour diminuer les risques de transfert d'agents pathogenes porcins a l'homme. Nous avons demontre qu'il est possible d'isoler des ilots de porcs eops fonctionnels qui conservent leur capacite a repondre a de fortes concentrations en glucose plusieurs mois apres l'isolement. De plus, la cryopreservation est une etape essentielle dans la xenotransplantation, puisqu'elle permet de disposer a tout moment de la quantite d'ilots necessaires pour une transplantation. Nous avons montre qu'il etait possible de cryopreserver, en presence de polyethylene glycol, les ilots de porcs eops. Nous avons, de plus, mis en evidence qu'une periode de culture de 14 jours avant et apres cryopreservation etait indispensable pour etre dans les conditions optimales d'insulino-secretion. Nous avons, aussi, montre l'importance du nombre d'ilots encapsules dans les fibres sur la normalisation de la glycemie d'animaux diabetiques. Plus la densite cellulaire est elevee, plus le pourcentage de reussite de la greffe est eleve. Enfin, cette etude nous a permis de montrer qu'il etait possible d'utiliser les fibres de polysulfone comme membrane potentielle d'immunoprotection pour les ilots.

Depuis les résultats de l'équipe d'Edmonton publiés en 2000, la greffe d'îlots de Langerhans connaît un essor particulier avec plus de 500 patients diabétiques traités par cette thérapeutique dans le monde. Malgré ces progrès réels, les freins demeurent la nécessité d'un traitement immunosuppresseur prolongé, la rareté des pancréas disponibles et le caractère imprévisible des résultats de l'isolement des îlots. Après un bref rappel et un historique de la greffe d'îlots de Langerhans, nous avons présenté les techniques actuelles du prélèvement pancréatique ainsi que les résultats de l'isolement des îlots dans notre équipe. Nous avons ensuite montré l'influence de la nature du liquide de conservation sur les résultats de l'isolement. Nous avons également démontré chez le Porc le caractère prédictif de la masse endocrine évaluée in vivo chez le donneur sur le rendement de l'isolement. Dans un second temps, ces résultats ont été confirmés chez l'Homme et ont permis d'envisager une sélection rationnelle des donneurs en vue de l'isolement d'îlots
Since the publication of clinical results in 2000 by the Edmonton team, islet transplantation has been on the rise where more than 500 diabetic patients have received this new therapy around the world. Despite this real progress, drawbacks remain such as the use of a prolonged immunosuppressive regimen, scarce organ availability for isolation and the unpredictable nature of isolation methods. Following a brief historical overview of the islet transplantation, we presented the current techniques of pancreas procurement and our islet isolation results. We then showed the influence of the conservation solution on the results of islet isolation. We were also able to establish in the pig model the predictive value of the pancreatic endocrine mass assessed in vivo in the donor on the isolation outcome. Secondly, we confirmed these results in man allowing us to consider a rational selection of donors prior to islet isolation

La thyreoliberine (trh) a ete le premier neuropeptide hypothalamique isole et caracterise. Elle est issue d'une prohormone qui libere apres maturation proteolytique, la trh et des fragments peptidiques dont certains tels le protrh 160-169 (ps4) sont associes a des activites biologiques. La trh est egalement synthetisee par les cellules du pancreas endocrine. Ce tissu est constitue de cellules formant les ilots de langerhans, dont la principale fonction est la secretion d'hormones impliquees dans le controle de l'homeostasie glucidique. Pendant la periode neonatale, le pancreas endocrine produit transitoirement de grandes quantites de trh alors que celles-ci sont tres reduites chez l'adulte. La signification biologique de l'expression de la trh au cours du developpement demeure inconnue. Par contre, il a ete mis en evidence chez l'adulte que la trh stimule la secretion du glucagon. L'objectif de ce travail est la caracterisation du role de trh pancreatique. Nous l'avons aborde sous l'angle de la regulation hormonale en particulier par des approches de transfection, et nous avons etudie egalement l'activite de la trh sur la secretion du pancreas exocrine. La chute de la concentration pancreatique en trh au cours du developpement est associee avec l'augmentation de la concentration plasmatique des hormones thyroidiennes. Nous avons mis en evidence, a partir d'un modele in vivo d'hypothyroide et a partir d'ilots ftaux en culture, que les hormones thyroidiennes inhibent l'expression de la pptrh et que cet effet est, en partie, transcriptionnel. En outre, les hormones thyroidiennes regulent la maturation et la secretion des produits de la prohormone. Ces resultats vont dans le sens d'une implication directe des hormones thyroidiennes dans la chute de l'expression de la pptrh insulaire au cours du developpement et, ils associent la baisse de la secretion de ps4 avec celle de l'insuline. Les cellules des ilots de langerhans sont des cibles importantes des glucocorticoides qui inhibent la secretion de l'insuline induite par le glucose. A partir de primocultures d'ilots ftaux, nous avons montre que les glucocorticoides regulent positivement l'expression du gene de la pptrh insulaire et que cet effet est en partie transcriptionnel. Les glucocorticoides augmentent l'expression du gene de la pptrh insulaire et inhibent la secretion de la trh et de ps4. Parallelement a l'etude de la regulation hormonale de la pptrh insulaire, nous avons recherche d'eventuels effets de la trh et de ses peptides associes sur la secretion du pancreas exocrine. Nous avons travaille a partir d'un modele in vivo de rat et a partir d'un modele in vitro d'acini. Les resultats suggerent que les effets peripheriques de la trh sont dus a son produit de conversion, le cyclohis-pro (chp), et que ces effets necessitent l'innervation du nerf vague. Nous postulons que le dipeptide chp, produit par la conversion de la trh attenue les effets stimulant de la trh centrale. Ces donnees mettent en evidence une nouvelle activite associee au chp qui pourrait avoir des applications experimentales et cliniques.

Les thiosemicarbazones sont des chelateurs de l'ion zinc. Cet ion joue un role important dans le biosynthese de l'insuline et dans le stockage de l'insuline et du glucagon. Les travaux presentes dans cette these ont eu pour but d'etudier l'action de derives originaux de la thiosemicarbazide et de quelques homologues, sur les cellules des ilots de langerhans. La premier partie concerne la synthese chimique de thiosemicarbazones d'esters (sept) et d'amides (quatorze) et de treize semicarbazones homologues. De nombreuses reactions ont ete etudiees dont certaines etaient originales. Les caracteristiques physicochimiques (points de fusion, spectres infra-rouge, spectres de resonance magnetique nucleaire du proton) de chaque produit ont ete donnees. Les comportements de chaque structure synthetisee vis-a-vis des ions zinc, calcium et magnesium ont ete etudiees par les spectroscopie ultra-violet et de resonance magnetique nucleaire du proton. Ces comportements ont permis d'etablir l'existence ou non de chelates et la nature de ceux-ci. La partie biologique a consiste en l'etude fonctionnelle et cytotoxique sur les ilots de langerhans de l'activite des composes synthetises ainsi que sur d'autres types cellulaires extra-pancreatiques (hepatocytes, fibroblastes et cellules renales). Ces etudes ont ete realisees in vitro. Seules les thiosemicarbazones d'amides exercent de facon reproductible un effet inhibiteur et un effet toxique sur les cellules a insuline et un effet toxique sur les cellules a glucagon. L'etude structure-activite et les resultats physico-chimiques apportent des informations sur le mecanisme d'action de ces composes. Les composes les plus toxiques, les thiosemicarbazones d'amides, sont a la fois les molecules les plus lipophiles et celles qui presentent la plus grande aptitude a se complexer avec l'ion zinc. La presence de sulfate de zinc en milieu biologique supprime les effets inhibiteurs et toxiques des thiosemicarbazones d'amides. De tels composes pourraient avoir une application dans le traitement des insulinomes ou des glucagonomes

La transplantation d'îlots permet la restauration d'une insulino-sécrétion endogène chez les patients diabétiques de type 1 par greffe allogénique et limite les conséquences métaboliques d'une pancréatectomie en cas d'autogreffe. Le site de référence intrahépatique présente néanmoins de nombreuses limites. Dans le cadre d'autogreffe, le risque hémorragique accru chez les patients récemment opérés liée à l'injection nécessairement conjointe des îlots et d'héparine en intraportal doit faire privilégier une technique de greffe mini invasive. De nombreux sites d'implantation ont été décrits. L'hypothèse de ce travail de thèse était que la voie intramusculaire offrirait par rapport à la voie portale, l'avantage de simplifier l'acte de transplantation, de réduire le traumatisme pour le patient et d'améliorer la viabilité des îlots en limitant les processus inflammatoires immédiats et en optimisant les processus de néo-vascularisation.Dans une première partie, nous avons pu démontrer, dans un model préclinique, que le site intramusculaire permet la survie, la revascularisation et la sécrétion des îlots autogreffés. Nous avons décrit une technique de greffe permettant d'ameliorer le contrôle glycémique d'animaux autogreffés après pancréatectomie totale. Bien qu'inférieure à la voie intraportale, les tests fonctionnels nous ont permis de valider le site intramusculaire pour la greffe d'îlots autologues. Dans une deuxième partie, nous décrivons un cas clinique original confirmant la possible transposition en clinique de l'autogreffe d'ilots en intramusculaire après pancréatectomie partielle. Ce cas clinique, confirme la faisabilité et suggère son innocuité. Il était cependant difficile dans ce contexte de pancréatectomie partielle d'établir un rapport entre l'absence de développement de diabète et la greffe. Pour ce faire, nous décrivons dans une troisième partie, une étude pilote sur l'évaluation de la fonction des îlots autogreffés dans le muscle chez 8 patients ayant subi une pancréatectomie partielle. Dans ce but nous avons comparé la sécrétion d'insuline après stimulation par l'arginine mesurée simultanément dans le bras greffé et le bras non greffé après l'autogreffe par des tests de stimulation à l'arginine. Malgré une faible quantité d'ilots greffés, nous avons documenté une fonction primaire du greffon chez plus de la moitié des patients, ainsi que sa persistance à plus d'un an. Enfin, nous avons également montré que le gradient d'insulinémie entre le bras greffé et le bras systémique était corrélé avec la masse d'ilots greffés.Le muscle est donc un site phare pour le développement d'un site alternatif lors de greffe d'ilots intramusculaire. Le site intramusculaire permet un formidable site d'évaluation des îlots. Cette procédure, résolument mini-invasive, est particulièrement attractive par son extrême accessibilité aux biopsies, à l'imagerie et aux explantations. Cette accessibilité permet d'élargir les indications de greffe telles que l'autogreffe d'îlots provenant de pancréas tumoraux.

Introduction : L'utilisation des îlots humains de Langerhans est la référence pour la recherche, tant physiologique que pour le développement de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 2. La demande d'îlots de Langerhans humains pour des projets de recherche est en constante augmentation, cependant, la disponibilité est limitée et les différentes préparations d'îlots de Langerhans révèlent une grande variabilité entre elles.Objectifs : L'objectif principal de cette thèse était de proposer une alternative aux îlots de Langerhans humains natifs qui permettrait d’obtenir des îlots pancréatiques homogènes et en quantité abondante pour les projets de recherche.Pour ce faire, nous avions deux objectifs principaux : 1) la production de pseudo-îlots de diamètre contrôlé à partir de pancréas humain, et l'évaluation de leur fonction in vitro et in vivo par rapport à leurs équivalents îlots natifs ; 2) l'optimisation de la production de cellules endocrines pancréatiques à partir de différentes lignées de cellules souches pluripotentes et l'évaluation des effets de la progérine sur la différenciation et la maturation des cellules produites. Les cellules souches pluripotentes utilisées provenaient de donneurs sains (H1, WiCell) et de patients atteints de Progeria (HGPS, iStem).Matériel et méthodes : Les pseudo-îlots ont été formés dans un milieu d'îlots clinique (CMRL 1066 albumine humaine, insuline) pendant 7 jours en utilisant les Sphericalplate 5D (Kulgelmeiers) et comparés aux îlots natifs J1 (jour 1) et J7 (jour 7) du même donneur.La différenciation des cellules souches pluripotentes (cellules iPS DF19.9, H1 et iPS HGPS) a été optimisée par différents protocoles : le protocole Rezania, le SD Kit (StemCell Technologies) et le protocole Nostro. L'expression des gènes de maturation in vitro entre différentes lignées cellulaires a été évaluée par qPCR. L'expression des protéines a été évaluée par immunofluorescence et par cytométrie en flux (plateforme EGID).Pour la maturation in vivo, après la transplantation sous la capsule rénale de souris immunodéficientes, des mesures de glycémie et de c-peptide humain ont été effectuées, ainsi que des tests métaboliques comme l'ipGTT.12Résultats : Les pseudo-îlots (n=4) générés ont sécrété significativement moins d'insuline in vitro que les îlots natifs à J1 mais sans différence significative avec les îlots natifs à J7. Dans les deux groupes à J7, on a observé une diminution significative de l'insuline intracellulaire comparativement aux îlots natifs à J1. In vivo, les îlots natifs à J1 sécrètent significativement plus de c-peptide humain que les îlots natifs à J7, alors que la différence n'est pas significative entre les îlots natifs à J1 et les pseudo-îlots à J7. De plus, l'analyse morphométrique des greffons a révélé que les pseudo-îlots ont tendance à avoir plus de cellules glucagon-positives que les deux autres groupes.L'optimisation de la différenciation des cellules souches pluripotentes a permis d'obtenir plus de 95% d'endoderme pour les cellules H1 et 80% pour les cellules iPS HGPS. Pour les deux lignées, nous avons généré 95 % de progéniteurs pancréatiques. La comparaison des gènes de maturation a révélé que la progérine conduisait à une légère augmentation de la maturation cellulaire dans le groupe iPS HGPS par rapport aux cellules H1. Des marqueurs liés à l'âge (53BP1, IGF1r et yH2AX) ont été validés dans un pancréas provenant d'un donneur âgé et un insulinome. Cependant, aucune différence de la fonctionnalité in vivo n’a été observée. Six mois post transplantation, nous avons identifié yH2AX dans des cellules endocrines et non endocrine des greffons H1 alors que dans les greffons HGPS, nous l’avons observé dans une plus vaste proportion de cellules présentant différentes formes de noyaux [...]
Introduction: The use of human islets of Langerhans is the gold standard for research, both for physiological research and for the development of new therapeutic molecules for the treatment of type 2 diabetes. The demand of human islets for research projects is constantly growing however, the availability is limited and different islet preparations show significant variability between human pancreata.Objectives: The main objective of this thesis was to propose an alternative to native human islets that can provide homogeneous and abundant pancreatic islets for research. To do this, we had two main objectives: 1) the production of controlled diameter pseudo-islets from human pancreata, and the evaluation of their function in vitro and in vivo compared to their native islet counterparts; 2) the optimization of the production of pancreatic endocrine cells from different pluripotent stem cell lines and evaluation of the impact of progerin on the differentiation and maturation of the cells produced. Pluripotent stem cells from healthy donors (H1, WiCell) and from patients affected with accelerated aging disease Progeria (HGPS, iStem).Material and Methods: The pseudo-islets were formed in clinical islet medium (CMRL 1066 human albumin, insulin) 7 days using the 5D Sphericalplate (Kulgelmeiers) and compared to the native islets D1 (day 1) and D7 (day 7) from the same donor.The differentiation of pluripotent stem cells (iPS DF19.9, H1 and iPS HGPS cells) was optimized using different protocols: the Rezania protocol, the SD Kit (StemCell Technologies) and the Nostro protocol. For in vitro maturation gene expression among different cell lines was evaluated by qPCR. Protein expression was assessed by immunofluorescence technique and Flow cytometry analysis (EGID).For in vivo maturation, after transplantation under the kidney capsule of immunodeficient mice, blood glucose and human c-peptide measurements were assessed as well as metabolic test such as IPGTT were performed.Results: The pseudo-islets (n=4) generated in clinical islet medium secreted significantly less insulin in vitro than the native islets at D1 but with no significant difference from the native islets at D7. In both groups at D7, a significant decrease in intracellular insulin was observed compared10to native islets at D1. In vivo, the native islets at D1 secrete significantly more human c-peptide than the native islets at D7, while the difference is not significant between the native islets at D1 and the pseudo-islets at D7. In addition, morphometric analysis of the grafts revealed that the pseudo-islets tend to have more glucagon positive cells than the other two groups.Optimization of the differentiation of pluripotent stem cells allowed us to obtain more than 95% endoderm for H1 cells and 80% for iPS HGPS cells. For both lines, we generated 95% of pancreatic progenitor cells. The comparison of maturation genes revealed that progerin lead to a slight increase of cell maturation in the iPS HGPS group compared to H1 cells. However, no differences in in vivo function was observed. Age-related markers (53BP1, IGF1r, p16 and yH2AX) which validated in a pancreas from an elderly donor and an insulinoma. We identified yH2AX after 6 months transplantation of H1-grafts in endocrine and non-endocrine cells, while the expression in iPS HGPS-grafts appeared in the majority of cells, which had various shape of nucleiConclusion: This work provided positive results in terms of functional pseudo-islets and stem cells derived pancreatic endocrine cells. However, they remain preliminary and further studies must be conducted to provide realistic alternatives to native human islets for research

Notre laboratoire est interesse par la comprehension des mecanismes qui controlent la croissance et la differenciation des cellules beta du pancreas endocrine, les cellules qui synthetisent l'insuline. Notre travail a ete consacre d'une part a l'etude de facteurs de croissance des cellules beta tels que l'hormone de croissance et la prolactine et d'autre part a montrer que les facteurs impliques dans la differenciation et la survie des cellules neuronales pourraient avoir un role dans le developpement du pancreas endocrine. Nos resultats utilisant l'autoradiographie quantitative sur des coupes de pancreas nous permettaient de conclure a l'existence d'une liaison specifique de l'hormone de croissance humaine sur les ilots de langerhans, cette liaison presentait des caracteristiques cinetiques compatibles avec un role in vivo. Ces sites de liaison etaient presents sur la cellule beta. La specificite de ces sites de liaison etait lactogenique suggerant un role important de la prolactine sur la cellule beta. Bien que les cellules insulaires ne derivent pas de la crete neurale, elles partagent avec les neurones certaines molecules. Pour examiner plus avant cette relation, nous nous sommes demandes si des molecules importantes pour la differenciation et la survie des neurones tels le nerve growth factor (ngf), la laminine et la fetuine pouvaient induire des effets phenotypiques sur des cellules secretrices d'insuline en culture, et si les effets du ngf etaient dus au meme appareil de transduction et a l'activation des memes genes de reponse precoce que l'effet du ngf sur les cellules pc12, derivees d'un pheochromocytome de rat. En conclusion, certaines lignees de cellules insulino-secretrices, les cellules rinm5f ont le potentiel de developper sous l'influence du ngf des prolongements cytoplasmiques qui, parce qu'ils contiennent des neurofilaments, peuvent etre rapproches des prolongements neuronaux. Les recepteurs de haute et basse affinite au ngf sont non seulement exprimes par des lignees de cellules insulaires mais aussi par des cellules insulaires foetales en culture primaire. L'appareil de transduction du signal cree par l'adjonction de ngf est fonctionnel dans ces cellules. Ces recepteurs peuvent etre ajoutes a la liste des marqueurs neuronaux presents sur les cellules beta du pancreas. Ces cellules constituent donc un nouveau modele d'etudes des actions du ngf. L'importance de ces resultats, la signification physiologique de la presence de ces recepteurs restent a elucider. Ce travail est a notre connaissance le premier qui suggere que les facteurs de croissance nerveux pourraient jouer un role dans la differenciation precoce et la croissance du pancreas endocrine

In type 1 diabetes (T1D) a combination of genetic predisposition and environmental factors triggers islet inflammation (insulitis) leading to a selective and gradual destruction of the pancreatic beta cells. Beta cells mainly die through apoptosis, triggered at least in part by pro-inflammatory cytokines such as IL-1β, TNF-α and IFN-γ. Recent findings suggest that the mitochondrial pathway of cell death is involved in this death cascade. Array analysis indicated that TNF-α+IFN-γ induces transcription factors such as NF-ĸB, STAT1, and AP-1 in beta cells. We presently aimed to examine the pathway(s) of apoptosis triggered by TNF-α+IFN-γ in beta cells.

TNF-α+IFN-γ induces beta cell apoptosis through the intrinsic pathway of cell death. This involved activation of the BH3 only proteins DP5, PUMA and Bim. Knockdown (KD) of either DP5 or PUMA or both led to a partial protection of INS-1E cells (12-20%), while silencing Bim led to about 60% protection against cytokine-induced apoptosis. Bim is transcriptionally induced by activated STAT1. TNF-α+IFN-γ also induces downregulation of Bcl-XL, an anti-apoptotic Bcl-2 gene which inhibits Bim. Knocking down Bcl-XL alone led to increase in apoptosis, but this was prevented by the parallel KD of Bim.

The ultimate goal of our research is to protect beta cells from the autoimmune assault. Previous data revealed that JunB inhibits ER stress and apoptosis in beta cells treated with IL-β+IFN-γ. Here, TNF-α+IFN-γ up-regulated the expression of JunB which was downstream of activated NF-ĸB. JunB KD exacerbated TNF-α+IFN-γ induced beta cell death in primary rat beta cells and INS-1E cells. The gene networks affected by JunB were studied by microarray analysis. JunB regulates 20-25% of the cytokine-modified beta cell genes, including the transcription factor ATF3 and Bcl-XL. ATF3 expression was increased in cytokine-treated human islets and in vitro silencing of JunB led to >60% reduction in ATF3 overexpression. We confirmed direct JunB regulation of the ATF3 promoter by its binding to an ATF/CRE site. Silencing of ATF3 aggravated TNF-α+IFN-γ induced cell death in beta cells and led to the downregulation of Bcl-XL expression in INS-1E cells. Pharmacological upregulation of JunB using forskolin led to upregulation of ATF3 and consistent protection of these cells against cytokine-induced cell death, while genetic overexpression of JunB in mice increased ATF3 expression in the pancreatic islets and reversed the pro-apoptotic effects of cytokines on beta cells (±40 % protection).

As a whole, our findings indicate that TNF-α+IFN-γ triggers beta cell apoptosis by the upregulation of the pro-apoptotic protein Bim and downregulation of the Bcl-XL protein. These deleterious effects are at least in part antagonized by JunB via activation of ATF3.

Dans le diabète de type 1 (DT1), la combinaison de facteurs génétiques de prédisposition et de l'environnement déclenche l'inflammation des îlots de Langerhans (insulite) conduisant à une destruction sélective et progressive des cellules bêta du pancréas. Les cellules bêta meurent principalement d’apoptose, déclenchée au moins en partie par les cytokines pro-inflammatoires sécrétées par les cellules immunitaires comme l’IL-β, le TNF-α l’IFN-γ. De récentes découvertes suggèrent que la voie mitochondriale de la mort cellulaire jouerait un rôle dans la mort de ces cellules. L'analyse de réseaux de gène utilisant les biopuces d’ADN indique que l’association TNF-α+IFN-γ induit l’activation de facteurs de transcription tels que NF-ĸB, STAT1 et AP-1 dans la cellule bêta. Dans ce contexte, nous avons cherché à examiner les voies de l'apoptose déclenchées par le TNF-α+IFN-γ dans la cellule bêta.

En présence de TNF-α+IFN-γ les cellules bêta meurent par apoptose via la voie intrinsèque. L’activation des protéines pro-apoptotiques « BH3-seulement » dont DP5, PUMA et Bim étaient en cause de cette apoptose. Le « knockdown »1 (KD), de DP5 ou de PUMA, ou des deux en même temps conduit à une protection partielle des cellules INS-1E (12-20%), tandis que le KD de Bim conduit à environ 60% de protection contre l’apoptose induite par cette combinaison de cytokines. La transcription de Bim est induite par STAT1 activé. Parallèlement à la régulation positive de Bim, TNF-α+IFN-γ conduit à la régulation négative de la protéine Bcl-XL. Bcl-XL est une protèine anti-apoptotique de la famille de protèines Bcl-2 qui en general inhibe Bim. Réduire l’expression de Bcl-XL seul induit une augmention de l'apoptose, alors que le KD de Bim et Bcl-XL en parallèle empêche l'apoptose.

Le but ultime de notre recherche est de protéger les cellules bêta des agressions autoimmunitaires. Les données antérieures ont révélé que JunB inhibe le stress du réticulum endoplasmique et l'apoptose dans les cellules bêta traitées avec IL-β+IFN-γ. Nous avons observé que TNF-α+IFN-γ induit l'expression de JunB qui se produit en aval de NF-ĸB activé. Il est important de noter que l’inactivation de JunB par des agents interférants de l’ARN (siRNA) exacerbe la mort des cellules primaires bêta de rat et de cellules INS-1E induite par les cytokines. Les réseaux de gènes touchés par JunB ont été étudiés grâce a l'analyse en microréseaux. JunB règule 20-25% des gènes modifiés par des cytokines dans les cellules bêta, y compris le facteur de transcription ATF3 et Bcl-XL. L’expression d’ATF3 est augmenté dans les îlots humains traités avec les cytokines et la répression in vitro de JunB conduit à une réduction de >60% de l’expression d’ATF3. Nous avons confirmé la régulation d’ATF3 par JunB en montrant que JunB est directement lié au promoteur d’ATF3 via le site ATF/CRE. La diminution d’expression d’ATF3 en presence de TNF-α+IFN-γ a aggravé la mort cellulaire induite dans les cellules bêta et a conduit à la régulation négative de l'expression de Bcl-XL dans les cellules INS-1E. L’augmentation pharmacologique de JunB dans les cellules INS-1E par l’utilisation de forskolin a conduit à la régulation positive en aval d’ATF3 et par conséquente à la protection de cellules bêta vis-a-vis de effets indésirables des cytokines. Dans cette optique, la surexpression génétique de JunB dans le modèle Ubi-JunB de souris transgénique a conduit à une surexpression d’ATF3 dans les îlots pancréatiques et a permir d’inverser les effets pro-apoptotiques de cytokines sur la cellule bêta (protection ± 40%).

Globalement, ces résultats indiquent que TNF-α+IFN-γ déclenche l'apoptose des cellules bêta par la régulation positive du gène pro-apoptotique Bim et la régulation négative du gène anti-apoptotique Bcl-XL. Ces effets indésirables sont inhibé en partie par JunB via l’activation de ATF3.

1Pas d’équivalent en français. Signifie la réduction de l’expression d’un gène via utilisation d’un siRNA (agent interférant de l’ARN).

Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques
info:eu-repo/semantics/nonPublished

Dans les conditions normales, les organismes maintiennent une masse cellulaire endocrine stable tout au long de leur vie. En cas d’obésité, la masse de cellules b pancréatiques est capable de maintenir des taux de glucose plasmatique en augmentant la sécrétion en insuline. L’incapacité de ces cellules à fournir de l’insuline entraîne alors l’apparition d’une hyperglycémie et d’un diabète de type II. Cliniquement, la majorité des individus obèses ne développent pas de diabète car les îlots pallient à cette résistance à l’insuline. La preuve de l’adaptation de la masse d’îlots humains à l’obésité, in vivo, n’a pas été clairement décrite et, de plus, peu d’informations existent sur les mécanismes et les types cellulaires impliqués. Actuellement, la mise en évidence de l’augmentation de la masse des cellules b chez les humains obèses repose uniquement sur des études histologiques.But : Au cours de cette thèse, nous avons cherché, dans un premier temps (partie 1), à évaluer la morphologie des îlots pancréatiques et la distribution des cellules a et b chez des donneurs en état de mort cérébrale normaux, en surpoids et obèses. Dans un second temps (partie 2), nous avons étudié l’adaptation au cours du temps des îlots humains à un environnement obésogène. Nous avons montré ainsi que les îlots humains non diabétiques s’adaptent in vivo à l’obésité en modifiant la masse de cellules b, leur fonction et leur expression génique. En suite (partie 3), on a identifié le mécanisme de transdifférenciation des cellules alpha et beta en utilisant la méthode de lineage tracing. Finalement (partie 4), on a déterminé la différence sur l’expression de gène des ilots humains greffé chez les souris sous régime control ou régime riche en graisse en utilisant les puces d’ARN (Illumina).Methodes et Resultats: Des coupes de pancréas humains inclues en paraffines ont été analysées. Les donneurs obèses étaient caractérisés par une augmentation de la masse endocrine totale, de la taille des îlots, de la graisse intra-pancréatique et du ratio b:a dans les îlots, mais avec une diminution du ratio a:b dans les îlots. Au cours de l’étude longitudinale, des souris Rag2-/- non diabétiques ont été greffées sous la capsule rénale avec des îlots humains issus de donneurs en état de mort cérébrale (donneurs non diabétiques ou donneurs avec un dysfonctionnement métabolique déclaré). Les animaux ont été nourris pendant 2 semaines avec soit un régime contrôle soit un régime riche en graisse (high fat diet HFD). Un suivi du poids, du taux des triglycérides, de la glycémie et du C-peptide a été mis en place. Après sacrifice des souris, les greffons et les pancréas endogènes ont été analysés pour le volume endocrine, la distribution des cellules b et a et les mécanismes de régénération des cellules pancréatiques. Après 12 semaines sous régime gras, les souris montraient toutes les caractéristiques typiques de l’obésité, à savoir, une augmentation du poids, un doublement de la graisse abdominale, des triglycérides, de la glycémie et une sensibilité à l’insuline réduite. De plus, l’apparition sur ces animaux d’un doublement rapide de la quantité de C-peptide humain dans le sérum murin nous indique la mise en place d’une compensation fonctionnelle. Une analyse histologique des greffons a permis de mettre en évidence une adaptation de la masse endocrine des îlots avec une augmentation des cellules b. D’autres analyses ont identifié la prolifération et la néogénèse comme les mécanismes responsables de ce doublement de la masse endocrine humaine.Discussion: Ce nouveau modèle animal permet d’étudier, in vivo sur une longue période, l’adaptation des îlots humains à un environnement obésogène murin. Il peut être utilisé comme un outil dans le décryptage des voies de signalisation impliquées dans l’expansion des cellules b humaines et permettre également l’identification des facteurs prédisposant ces cellules à subir une décompensation
Under normal healthy conditions, organisms maintain a dynamic endocrinecell mass throughout life. Pancreatic beta cell mass are able to maintain plasma glucose levels increasing insulin secretion in conditions as obesity.Beta cell inability to compensate in insulin demand provokes hyperglycemia and Type 2 Diabetes. Clinically, most obese individuals do not develop diabetes because islets compensate for insulin resistance. Direct evidence that human islet mass adapts longitudinally to obesity in vivo was lacking and, moreover, little information was available on the mechanismsand cell type(s) involved.Current evidence for increased beta cell mass in obese humans (vs lean) is based entirely on postmortem histology.Aim: In this thesis, firstly (Part 1) we performed a descriptive cross sectional study by evaluating the pancreatic islet morphology and alpha and beta cell distribution from our archived human pancreatic sections of obese and normal subjects. Secondly, (Part 2) we explored the longitudinal adaptation of human islets to an obesogenic environment and showed direct evidence that non-diabetic human islets adapt bothendocrine and beta cell mass, function and gene expression to obesity in vivo. Thirdly (Part 3) we performed lineage tracing to determine which cell type alpha or beta give rise to the increase islet mass in obesity. Finally (Part 4) in this diet induced obesity model we developed, we looked at the differential gene expression with Illumina gene chips in a kinetic study on human islets which were laser capture microdissected at 6, 8 and 10 weeks on control or high fat diet.Methods: Archived human pancreatic sections were immunostained for endocrine, beta, alpha, fat. In the obese/immunodeficient mouse model, non-diabetic Rag2–/– mice were transplanted under kidney capsule with human islets from human brain-deceased donors (non-diabetics donors and donors with overt metabolic dysfunction). Animals were fed for 12 weeks with a control or high-fat diet (HFD), and followed for weight, serum triacylglycerol, fasting blood glucose and human C-peptide. After the mice were killed, human grafts and the endogenous pancreas were analyzed for endocrine volume, distribution of beta and alpha cells, and mechanisms of regeneration.Results: The cross-sectional study, performed on archived human paraffin embedded sections of normal weight, overweight, or obese subjects showed that obese donors were characterized by an increased total endocrine mass, bigger individual islet size, increased intrapancreatic fat, increased β to  cell ratio and decreased :β cell ratio in islets. In the longitudinal study, concomitant with the increased weight gain, doubling of abdominal fat, increased serum triacylglycerol and reduced insulin sensitivity in 12 week HFD animals we reported that human islet grafts showed functional compensation, measured as a more than doubling of fasting human C-peptide in mouse serum, and histological adaptation of islet endocrine mass including increased beta cells. Further analysis of the human grafts revealed proliferation and neogenesis as the responsible mechanisms for the doubling of the human endocrine mass.Discussion: This novel model allows, for the first time, longitudinal studies of human islet adaptation to an obese murine environment and may be instrumental in deciphering pathways involved in human beta cell expansion, as well as in helping to identify factors predisposing human beta cells to undergo decompensation

Le diabète mellitus, également désigné comme la maladie du siècle, est une pathologie mortelle qui affecte le système endocrinien. Les mécanismes liés à la rupture de la boucle de rétroaction, qui régule le métabolisme et induit le diabète, ne sont pas entièrement connus. La compréhension des mécanismes d'action de l'insuline est donc essentielle pour le développement de stratégies thérapeutiques efficaces afin du lutter contre cette maladie. Par conséquent, il est impératif de trouver un modèle robuste et fiable, capable de surmonter les limites de la culture cellulaire traditionnelle en 2D et de l'expérimentation animale, pour la recherche sur le diabète. L'objectif de cette thèse est de développer un nouveau modèle de co‐culture foie‐pancréas en utilisant des systèmes microphysiologiques avancés (MPs) afin d’aborder plus efficacement le mécanisme impliqué dans la régulation endocrinienne hépatique et pancréatique. Ce travail met en évidence la capacité des systèmes multi‐organes sur puce qui combinent la compartimentation avancée des cellules en 3D, la microfluidique et la technologie des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), pour atteindre une complexité biologique élevée et des fonctions rarement reproduites par une seule de ces technologies d’ingénierie tissulaire
Diabetes mellitus (DM) or the so called disease of the century is a life threatening dysfunction that affects the endocrine system. The mechanisms underlying the break in the feedback loop that regulates the metabolism and the consequent diabetes induction are not fully known. Understanding the mechanisms of insulin action is therefore crucial for the further development of effective therapeutic strategies to combat DM. Accordingly, it is imperative to find a robust and reliable model for diabetes research able to overcome the limitations of traditional 2D in vitro cell culture and animal experimentation. The aim of this thesis is to develop a new liver‐pancreas co‐culture model using advanced microphysiological systems (MPs) to tackle more effectively the mechanism involving the hepatic and pancreatic endocrine regulation. This work highlights the power of multi organ‐on‐chip systems that combines the advanced 3D‐cell compartmentalization, microfluidics and induced pluripotent stem cells (iPSC) technology to achieve a high biological complexity and functions that are rarely reproduced by only one of these tissue engineering technologies