Dissertations / Theses on the topic 'Immunoadsorption'

Thesis (Ph. D.)--Massachusetts Institute of Technology, Dept. of Chemical Engineering, 2003.<br>Page 126 blank.<br>Includes bibliographical references (p. 113-114).<br>This electronic version was submitted by the student author. The certified thesis is available in the Institute Archives and Special Collections.<br>Dialysis-related amyloidosis (DRA) is a frequent complication of end-stage renal disease that has been associated with the accumulation of 2-microglobulin (2m). Excluding transplantation, existing kidney replacement technologies are believed to remove insufficient quantities of P2m for the prevention of DRA, as they are non-specific and based on size-exclusion. A proposed DRA therapy is to use immunoadsorptive particles within an extracorporeal Vortex Flow Plasmapheretic Reactor (VFPR) to specifically remove 2m from blood. The compartmental design of the VFPR allows for the use of small adsorbent particles (100 m) that possess inherent mass-transfer advantages over the larger ones (>400 gIm) that are required for safe contact with whole blood for this application. Demonstrating the efficacy of this technology as a therapy for DRA would support its tailored application for treating other pathologies that are caused by circulating compounds such as sepsis, liver failure, autoimmune disease, drug overdoses, and genetic disorders. Whole anti-P2m antibodies (BBM.1) were immobilized onto agarose beads and used within a VFPR to remove donor baseline and defined quantities of recombinant 32m from whole human blood, in vitro. A dynamic immunoadsorption model was developed for the VFPR that was based upon the independent characterization of the mass-transfer processes within the VFPR and the thermodynamics of the immunoadsorbent. The experimentally-observed and model-predicted dynamics of 32m clearance from the blood indicate that the process controlling the rate of P2m removal was the hemofiltration rate (50 mL-plasma/min), which was on the order of the reported supply rate of 2m into the vasculature (70 mL-plasma/min).<br>(cont.) Single-chain variable region (scFv) antibody fragments offer several potential advantages over whole antibodies due to their size and genetic definition, as well as their amenability for microbial expression and in vitro evolution. Hence, a BBM.1 scFv was expressed by a yeast display vector and its affinity was quantified with a fluorescence-activated cell sorter (KD = 0.008 +/-proposed therapy to treat and/or prevent DRA.<br>by Eric A. Grovender.<br>Ph.D.

La hyalinose segmentaire et focale (HSF) est une maladie rénale sévère dont la physiopathologie est complexe. La récidive de la maladie après transplantation rénale et l’obtention de sa rémission après un traitement par immunoadsorption (IA) illustre l’implication d’un facteur circulant dans sa physiopathologie, capable de se fixer à la protéine A. Récemment, suPAR a été rapporté comme agent causal et marqueur de la HSF. Le premier objectif de notre travail a été de vérifier si suPAR se fixe à la protéine A. Le deuxième objectif a été d’identifier le facteur circulant responsable de la récidive de la HSF après transplantation rénale, à partir de l’analyse par spectrométrie de masse des protéines liées à la colonne de protéine A après (IA). Premièrement, nous avons mesuré la concentration de suPAR par un test ELISA parmi les protéines fixées à la colonne de protéine A après IA chez 7 patients atteints de HSF récidivantes et dans le sérum de 13 patients atteints de HSF récidivantes et de 11 contrôles sains. Le sérum des patients a été immunoadsorbé in vitro sur bille de protéine A sépharose. Nous avons quantifié suPAR avant et après la procédure et dans l’éluat des protéines fixées à la protéine A. La concentration de suPAR est plus élevée chez les patients atteints de HSF récidivantes par rapport aux groupes contrôles. La concentration de suPAR est très faible dans les proteines éluées à partir de la colonne de protéine A, indiquant que suPAR ne se lie pas à la protéine A et n’est pas le facteur circulant élué par les colonnes de protéines A. Deuxièmement, nous avons identifié le FC à partir des protéines fixées à la colonne de protéine A par une caractérisation des protéines par spectrométrie de masse chez des patients traités pour récidive de HSF et chez un patient contrôle. Nous avons recherché le FC dans le sérum de patient atteint de HSF, de patient ayant une néphropathie diabétique et chez des contrôles sains. L’effet de la protéine recombinante du FC a été testé in vitro sur une culture de podocytes et in vivo chez la souris. Nous avons identifié une forme sérique de CASK (calcium calmoduline sérine thréonine kinase), à partir des protéines fixées à la colonne de protéine A après IA. CASK est présente uniquement dans le sérum de patients atteints de HSF et non dans les groupes contrôles. In vitro, la protéine recombinante de CASK (CASKr) induit une redistribution de l’actine du cytosquelette des podocytes en culture par une interaction avec CD98. CASKr altére la perméabilité des podocytes à l’abumine et induit in vivo une protéinurie chez la souris associé à un effacement des pédicelles.En conclusion, suPAR ne se fixe pas à la protéine A ni in vivo ni in vitro. Une forme sérique de CASK est impliqué dans la récidive de la HSF avec comme cible potentiel CD98 sur le podocyte<br>Focal and segmental glomerulosclerosis (FSGS) is a serious disease, the pathogenesis of which is unknown. Its recurrence after transplantation (Tx) and its partial remission after treatment with immunoadsorption (IA) on a protein A column indicate the existence of a circulating factor (CF) responsible for the disease that is able to bind to a protein A column. Recently, the soluble receptor of urokinase (suPAR) was described as the factor responsible for FSGS. The first aim of my work was to test the capacity of suPAR to bind to protein A and to be eliminated by IA. The second aim was to identify the CF responsible of the recurrence of the disease after renal transplantation from the analysis of proteins eluted from protein-A columns from patients with rFSGS who had undergone therapeutic (IA). First, we measured suPAR in eluates of protein A columns from 7 patients with recurrent FSGS after Tx (rFSGS) treated with IA, and in the serum of 13 patients with rFSGS and 11 healthy donors (HD). Additionally, the plasma of these patients was immunoadsorbed in vitro on a protein A Sepharose column and we quantified suPAR in the eluates and in pre- and post-column samples. The concentration of suPAR was higher in the plasma of patients with rFSGS than in the plasma of HD patients. However, the concentration of suPAR was similar before and after IA on protein A for the rFSGS and HD samples. The suPAR concentration was very low in the eluates from protein A columns incubated with plasma from HD or rFSGS patients. However, 85% of rFSGS patients showed a decrease in immunoglobulin G and proteinuria. Secondly, we analyzed proteins eluted from protein-A columns from patients with rFSGS who had undergone therapeutic immunoadsorption. Compared to control a differential band was identified by mass spectrometry. The expression of this protein was tested by immunochemical methods in sera from healthy controls, from patients with proteinuria caused by diabetic nephropathy, and from rFSGS patients. The effect of the recombinant protein was evaluated in vitro (podocytes) and in vivo experiments (mice). A soluble form of calcium/calmodulin-dependent serine/threonine kinase (CASK) eluted from protein-A columns was identified by mass spectrometry. CASK was immunoprecipitated only in the sera from patients with rFSGS. Recombinant CASK induced reorganization of the actin cytoskeleton of cultured podocytes through an interaction with CD98 at the cell surface. In vitro, CASK increased the permeability of podocyte monolayers, and induced proteinuria and foot-process effacement in miceIn conclusion, suPAR does not significantly bind to protein A in vitro or in vivo. Soluble CASK acts as a permeability factor in patients with rFSGS bindinding CD98 on podocytes

Für die dilatative Kardiomyopathie gibt es bisher keine kausalen Therapiemöglichkeiten. Verschiedene kardiale Autoantikörper sind an der Pathogenese der Erkrankung beteiligt. Diese können durch eine Immunadsorptionsbehandlung entfernt werden. Das Ziel dieser Studie war es, die hämodynamischen Effekte einer Immunadsorption mit nachfolgender Immunglobulin-G-Substitution zu untersuchen. Dazu wurden 18 Patienten (NYHA III-IV, linksventrikuläre Ejektionsfraktion < 30 %) eingeschlossen und zufällig der Behandlungs- oder Kontrollgruppe zugeteilt. An drei aufeinanderfolgenden Tagen erfolgte eine Immunadsorptionsbehandlung. Abschließend wurde polyklonales Immunglobulin-G substituiert. Die Behandlung wurde insgesamt viermal in monatlichen Abständen durchgeführt. Die hämodynamischen Messungen erfolgten mit Hilfe eines Swan-Ganz Thermodilutionskatheters. Nach drei Monaten waren der Herzindex und der Schlagvolumenindex in der Behandlungsgruppe signifikant angestiegen. Der systemvaskuläre Widerstand wurde signifikant gesenkt. Außerdem wurde ein Anstieg der echokardiographischen linksventrikulären Ejektionsfraktion sowie eine Reduktion des linksventrikulären endsystolischen und enddiastolischen Durchmesser Index beobachtet. Die echokardiographischen Veränderungen waren auch im Verlauf nach einem halben Jahr stabil nachweisbar. Die günstige Beeinflussung der hämodynamischen Parameter wurde zudem von einer Verbesserung der klinischen Beschwerdesymptomatik - repräsentiert durch die Einteilung nach der NYHA-Klassifikation - begleitet. Hingegen wurden in der Kontrollgruppe für alle genannten Parameter keine signifikanten Veränderungen beobachtet. Die Effekte der Immunadsorption werden hauptsächlich auf die Elimination der Autoantikörpern zurückgeführt, wenngleich andere Einflüsse - wie ein Einfluss der Immunglobulinsubstitution oder anderer immunmodulatorischer Komponenten - nicht ganz ausgeschlossen werden können. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass Immunadsorptionsbehandlungen bei dilatativer Kardiomyopathie als Ergänzung zur medikamentösen Basistherapie zur Verbesserung der Herzfunktion und zur Linderung der Beschwerdesymptomatik beitragen.<br>There is no causal therapy for the treatment of dilated cardiomyopathy. Various cardiac antibodies have been detected. These antibodies are extractable by immunoadsorption. The aim of the study was to assess the hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin G substitution. 18 patients with dilated cardiomyopathy (New York Heart Association III-IV, left ventricular ejection fraction < 30%) were randomly assigned either to the treatment group or to the control group. The patients were treated by immunoadsorption on three consecutive days. After the final session polyclonal immunoglobulin G was substituted. The procedure was repeated four times at one-month intervals. Hemodynamic mesurements were made by Swan-Ganz-catheterization. After three months cardiac index and stroke volume index increased significantly. Systemic vascular resistence decreased. Although, the echocardiographic ejection fraction increased, while there was a reduction of the left ventricular endsystolic and enddiastolic diameter index. The echocardiographic changes persisted after six months. The hemodynamic changes were accompanied by an improvement regarding the New York Heart Association classes in the treatment group. In contrast, all parameters did not change throughout the six months in the control group. Presumably the hemodynamic effects result from elimimation of cardiac antibodies. Although there may be an influence of different immunmodulatory components or of the immunoglobulin G substitution, too. In conclusion, Immunoadsorption and subsequent immunoglobulin G substitution improves cardiovascular function in addition to conventional drug therapy.

L'encapsulation de molécules d'intérêt thérapeutique est une technique développée dans le domaine biopharmaceutique afin de remédier aux problèmes d'instabilité des molécules en milieu biologique. Notre travail a consisté à mettre au point différentes particules polymères dans le but de développer deux types d'applications différentes: l'administration par voie orale d'un principe actif non administrable jusqu'alors par cette voie et la conception d'un immunoadsorbant original. La technique d'encapsulation par double émulsion (hydrophile dans lipophile dans hydrophile) et extraction/évaporation de solvant a été utilisée dans l'ensemble de notre travail. Cette technique a permis d'une part d'encapsuler un principe actif hydrophile, l'héparine de bas poids moléculaire (HBPM), et d'autre part d'incorporer des fragments membranaires d'érythrocytes humains porteurs d'antigènes sériques dans une matrice polymère, dont les caractéristiques physico-chimiques varient suivant l'application en question. La section 1 est dédiée aux travaux concernant l'incorporation de l'HBPM, anticoagulant actuellemen administré uniquement par voie parentérale, dans des micro- et nanoparticules polymères. Des polymères biodégradables et non biodégradables ont été utilisés. Les particules solides ainsi obtenues ont fait l'objet d'une caractérisation in vitro (taille, charge superficielle, taux d'encapsulation, cinétique de libération, conservation de l'activité biologique, répartition de l'HBPM marquée à la fluorescéine au sein de la matrice polymère des microparticules). Une étude in vivo préliminaire a ensuite été réalisée chez l'animal. De l'HBPM encapsulée dans des nanoparticules a été administrée par voie orale à des lapins et l'activité biologique plasmatique obtenue au cours du temps a été comparée à celle obtenue après administration intraveineuse d 'HBPM libre en solution aqueuse. L'activité biologique plasmatique a été déterminée par une méthode classique (dosage chromogénique de l'activité anti-Xa) et par une méthode en cours de développement permettant de suivre la génération et l'inhibition de la thrombine: la thrombinographie. Les pics d'activité plasmatique obtenus témoignent de l'efficacité de notre système. La section 2 est consacrée à la mise au point d'une colonne d'immunoépuration dont les éléments de basesont des microparticules encapsulant des ghosts érythrocytaires. Les microparticules obtenues, non biodégradables et non chargées, ont été placées en tube et en colonne afin d'étudier la capacité d'adsorption d'anticorps anti-A, anti-B et anti-Kell en solution aqueuse ou plasmatique avec les antigènes membranaires encapsulés. Les antigènes de groupe sanguin A ou B et du système Kel incorporés dans nos particules conservent leur pouvoir antigénique et restent capables de dépléter les solutions éluées. Au vu des potentialités de ce système, cette invention fait l' objet d'une demande de brevet français. En conclusion, nous avons démontré qu'une même technique d'encapsulation pouvait être utilisée à la foispour développer une forme pharmaceutique et un biodispositif médical. Ces travaux ont en effet mis en évidence les potentialités d'une part des nanoparticules quant à l'administration orale de l'HBPM et d'autre part des microparticules en tant qu'immunoadsorbant.

L'objectif de ce travail était de développer une méthode de traitement de l'échantillon permettant l'analyse par LC-MS2 d'adduits formés entre des composés neurotoxiques organophosphorés (OPNA) et la butyrylcholinesterase, protéine plasmatique. En vue d'une automatisation totale du processus analytique, une étape d'immunoextraction a été couplée à un réacteur de digestion enzymatique (IMER), suivie d'une analyse par microLC-MS2 afin de détecter le peptide adduit par l'OPNA. Tout d'abord, la synthèse d'IMER de pepsine a été optimisée. L'IMER le plus performant a été appliqué à la digestion de la BuChE afin d'analyser le peptide biomarqueur d'intoxication, par nanoLC-MS2. Un IMER de pepsine, de dimensions supérieures a pu être rapidement intégré à un système d'analyse microLC-MS2, permettant la digestion de la BuChE et l'analyse en ligne du peptide cible. Dans un second temps, une méthode d'extraction sélective a été développée par immobilisation de différents anticorps anti-BuChE sur un support solide appelé immunoadsorbant. Le protocole d'immunoextraction a été mis au point, puis les immunoadsorbants ont été caractérisés en termes de sélectivité et de rendement d'extraction avant d'envisager son couplage au digesteur enzymatique. La faisabilité du couplage a pu être clairement démontrée et ce dispositif automatisable a été appliqué à l'analyse de la BuChE de plasma humain, dopé par des OPNA. Cela a permis la détection rapide et sensible des adduits OPNA-BuChE, à partir de très faibles quantités de plasma<br>The objective of this work was to develop a sample treatment method for the LC-MS2 analysis of adducts formed between organophosphorus nerve agent (OPNA) and butyrylcholinesterase, a plasmatic protein. In order to fully automate the analytical process, an immunoextraction step was coupled to an enzymatic digestion reactor (IMER), followed by microLC-MS2 analysis to detect the OPNA-peptide adduct. First, the synthesis of pepsin-based IMER was optimized. The most powerful pepsin-based IMER was applied to the digestion of HuBuChE to generate the peptide used as biomarker of OPNA intoxication that was further analyzed by nanoLC-MS2. This pepsin-based IMER was then integrated into a microLC-MS2 analytical system, allowing the on-line digestion of HuBuChE and the analysis of the target peptide. In a second step, a selective extraction method was developed by immobilizing anti-HuBuChE antibodies on a solid support, called immunosorbent. The immunoextraction protocol was developed and the immunosorbents were characterized in terms of selectivity and extraction yield before being coupled to the IMER. The feasibility of the coupling was clearly demonstrated and this automatable device was used for the analysis of HuBuChE from human plasma, spiked with OPNA. This allowed the fast and sensitive detection of OPNA-BuChE adducts in very small amounts of plasma

Afin de prévenir le rejet de greffe chez des patients hypersensibilisés, il est primordial d'éliminer ces anticorps anti-HLA. Les traitements actuels sont basés sur l'injection d'immunoglobulines seule à forte dose ou associée à la plasmaphérèse. Cependant, la plasmaphérèse n'étant pas spécifique des anticorps anti-HLA, nous avons envisagé la réalisation d'une technique plus spécifique susceptible de remplacer. Dans ce contexte, nous avons entrepris de synthétiser des résines constituées de billes de polystyrène fonctionnalisé par des groupements d'esters méthyliques d'acides aminés figurant comme prépondérants dans la structure des antigènes HLA. Après la mise au point d'un dosage ELISA fiable des anticorps anti-HLA-A2, il s'agissait de sélectionner dans un premier temps les résines possédant une forte affinité pour ces anticorps. Les résultats montrent que parmi les résines synthétisées, les dérivés des sulfamides d'esters méthyliques de la thréonine se distinguent par l'existence de caractéristiques d'adsorption intéressantes<br>Patients with high titre anti-HLA antibodies are highly sensitized and a increased risk of graft rejection. So the effective removal to anti-HLA antibodies, prior to operation, may increase the graft survival in these patients. To prevent the graft rejection, intravenous immnoglobulin injection alone or associated to the plasmapheresis procedure have been used to treat these allosensitized patients. However, this plasmapheresis is not specific to the anti-HLA antibodies so we decided to realise a more specific technique. Within this context, the development of new adsorbers which could selectively eliminate anti-HLA antibodies is of interest and selects at first the copolymer with higher affinity to these antibodies. In this aim, we carried out the synthesis and the study of purely synthetic random copolymers. This copolymers results from the random substitution of crosslinked polystyrene beads with sulfamides of amino-acids involved in the HLA antigen structure. The latter are crucial in HLA antigen structure

碩士<br>正修科技大學<br>化工與材料工程研究所<br>95<br>Dialysis-related amyloidsis（DRA）is a major complication in patients undergoing long-term replacement therapy. The most common clinical manifestations of dialysis-related amyloidsis are carpal turnel syndrome and various arthropathies. The pathogenesis of dialysis-related amyloidsis is assoicated with beta 2-microglobulin （β2m）as the precursor of amyloid fibril deposits in long-term homodialysis patients. Beta 2-microglobulin accumulation is related to increased serum levels of beta 2-microglobulin that are characteristic of chronic renal failure. During the last decades, it has become the most important surrogate parameter for the characterization of dialysis efficiency with regard to middle molecule removal in vivo. A new concept, an immunoadsorption wall, which combines the principles of immunoisolation and immunoadsorption is proposed to remove beta 2-microglobulin. This study introduces a newly developed method for the formation of a stationary phase superficially embedded with immunoadsorbent, that is partially incomplete two-stage polymerization of acrylamide. However, a substantial amount of immunoadsorbent needs to be flushed away after the copolymerization process. The potential application of immunoadsorption, a biologically specific to remove macromolecules, in the treatment and understanding of DRA is discussed. There are two types of immunoadsorption walls. Two types of immunoadsorption walls were simultaneously manufactured under the same experimental condition by the precoupling procedure and the postcoupling procedure. Similar removal patterns were observed. The levels of beta 2-microglobulin decrease from 185.8 μg/ml to 11.37 μg/ml for precoupling procedure and from 186.6 μg/ml to 9.92 μg/ml for postcoupling procedure. It could be found that the maximun binding capacity is 105.7 μg/cm2 for the precoupling procedure and 105.9 μg/cm2 for postcoupling procedure immunoadsorption walls, respectively. The binding activity of the prepared immunoadsorption walls was well maintained for the 10 time of adsorption and desorption cycles, being 90％ of original maximun binding activity

碩士<br>正修科技大學<br>化工與材料工程研究所<br>100<br>Dialysis-related amyloidosis caused by the accumulation of beta-2-microglobulin (β2M) is a major complication after long-term dialysis. In recent years, our laboratory has been devoted to develope the immunoadsorption wall (iWall) technology for effiective removal of β2M. How it still reguires sophisticated skills to successfully manufacture an iWall. In this study, a novel approach based on the thermal equilibrium principle was used to improve the manufacturing process. In addition, a post-polymerigation modification step was apperdeed in order to handling minimize hemolyris after handling whole blood with iWall the biocompatibility of the prepared iWall was evaluated by the accelerated clotting time(ACT) and hemolysis free hemoglobin.

博士<br>國立清華大學<br>化學工程學系<br>87<br>For the time being, the accomplishments of artificial organs have greatly alleviated the pains following inexorable functional degeneration or organ failure. In fact, the clinical practice of artificial organs outnumbers that of organ transplantation by 100 fold because of availability. However, a variety of critical issues and complications remain intractable in the development of artificial organs. Therefore, improvements/or breakthroughs in the existing technologies would be the key to exploring new therapeutic strategies and thereby upgrade the quality of treatments. In this thesis, two auxiliary techniques are proposed and attempted for the development of artificial kidney and bioartificial liver. One is the concept of an immunoadsorption wall that is address to the removal of beta-2-microglobulin; and the other is the application of centrifugal force to improve the immobilization efficiency of hepatocytes for a bioartificial liver reactor. To date, beta-2-microglobulin (B2M) accumulation and its clinical consequences remain one of the unsolved problems of renal replacement therapy. Removal during treatment by membranes permeable to B2M or whatever non-transplant techniques currently available is less than that accumulated between treatments. The concept of an immunoadsorption wall is a separation technique based on the combination of immunoisolation and immunoadsorption for removal of B2M. In this process, B2M molecules initially transport through immunoisolation barrier by diffusion, and then they are adsorbed onto the surface of a stationary phase that is formed by tightly packing the immunoadsorbent. The present investigations suggested that application of the concept to clinical use seems feasible and worthwhile. The concept, if validated, will help shape a novel multi-task type of artificial kidney based on the combination of different separation technologies. On the other hand, severe liver insufficiency, in particular a morbidity known as fulminant hepatitis, remains a highly lethal disease resistant to preservative treatment or blood purification therapies. It is now widely postulated that incorporation of the metabolic activities of intact, functioning hepatocytes are required to sustain patients* lives. A packed bed type of bioartificial liver using reticulated polyvinyl formal (PVF) resin as a substrate for hepatocyte attachment has been developed; however, the immobilization efficiency was estimated a low level of ca. 30 %. In this regard, a centrifugal cell immobilization (CCI) method based on the alternate action of centrifugal force and cell resuspension was attempted. The present study shows that higher efficiency (maximum ca. 75%), high density (107 cells/cm3-PVF), and relatively short period of immobilization time (ca. 15 min) can be attained by this newly developed method. Thus, it is concluded that the CCI method can provide an useful and effective means to immobilize cells within PVF cubes, which may overcome the major problem facing scaling up the packed-bed reactor system.