Dissertations / Theses on the topic 'Immunologique'

Les molécules MIC sont des ligands du récepteur activateur NKG2D exprimé sur les lymphocytes T CD8+ et NK. Nous avons étudié le rôle de l'interaction MICA/NKG2D dans la maturation du répertoire T dans le thymus et dans la destruction de l'épithélium intestinal par les lymphocytes intra-épithéliaux dans la maladie coeliaque. L'acquisition de NKG2D dans le thymus T CD8+ les plus matures prêts à émigrer en périphérie. Les corpuscules de Hassal expriment MIC dans le thymus normal. L'hyperexpression de MIC au cours du thymone s'accompagne d'une diminution du pourcentage des cellules NKG2D+ qui présentent un phénotype moins mature. L' expression de MIC est très augmentéeà la surface des cellules épithéliales intestinales des patients avec une maladie coeliaque active et est induite in vitro par la gliadine. .
MICA molecules interact with the NKG2D activating receptor on CD8 T cells. We investigated the role of MICA/NKG2D interactions in the maturation of the T cell repertoire within the thymus and in the destruction of intestinal epithelium by intraepithelial T lymphocytes in celiac disease. MICA tetramers identified a small population of late stage CD8 single-positive thymocytes ready to emigrate to the periphery as naive cells. MICA molecules were expressed in the Hassal's corpuscules of normal thymus. MICA overexpression in thymona was associated with a decreased percentage of NKG2D positive thymocytes wich expressed a less mature phenotype. MICA is strongly expressed a less mature phenotype. MICA is strongly expressed at epithelial cell surface in patients with active celiac desease, and is induced by gliadin or its p31-49.

La thrombopénie immunologique ou purpura thrombopénique immunologique (PTI) est une maladie auto-immune rare responsable d'une destruction périphérique immunologique des plaquettes associée à une production médullaire inadaptée. Dans la première partie de ce travail, nous exposons les connaissances actuelles de sa physiopathologie ainsi que certaines données concernant la réponse immunitaire T, le rôle des lymphocytes T régulateurs (Treg), l'implication de la rate dans la réponse immunitaire ainsi que les modes d'action d'une thérapeutique anti-lymphocytaire B, le rituximab. Dans une seconde partie, nous rapportons les résultats obtenus chez 40 patients atteints de PTI. Nous avons montré que le taux des Treg circulants CD4+CD25HighFoxp3+ est similaire chez les patients et les témoins, avec une élévation de leur taux chez les sujets répondeurs aux traitements. A l'inverse, il existe un déficit quantitatif en Treg au sein de la rate des patients. L'analyse des sous-populations lymphocytaires B spléniques a montré une augmentation du taux de lymphocytes B de la zone marginale chez les patients. Concernant les mécanismes d'action du rituximab, nous avons montré qu'une déplétion lymphocytaire B sanguine et splénique n'est pas suffisante pour obtenir une rémission, et que les plasmocytes ne sont pas sensibles à cette thérapeutique. Par ailleurs, nous proposons un mécanisme d'échappement à ce traitement. En effet, nous avons montré que les patients résistants au RTX présentent une élévation du ratio Th1/Treg spléniques. Chez ces sujets non répondeurs, nous avons également observé une élévation du ratio lymphocytes T CD8+/CD4+, au sein de la rate, suggérant une participation des lymphocytes T cytotoxiques dans la physiopathologie du PTI. Ces résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension de la physiopathologie du PTI, notamment la possible implication des lymphocytes B de la zone marginale et le défaut de contrôle de la réponse immunitaire splénique par les Treg. Concernant le rituximab, son action sur la réponse immunitaire ne semble pas se limiter à une déplétion lymphocytaire B qui n'est pas suffisante pour obtenir une rémission. Un mécanisme d'échappement ou de résistance à cette thérapeutique passe par une orientation Th1 et une probable implication des lymphocytes T CD8+.

La these est composee de deux parties precedees d'une introduction generale decrivant les proprietes des cholinesterases. Dans la premiere partie, sont decrites les differentes etudes entreprises sur la caracterisation de la structure et de la fonction des cholinesterases. Ces travaux sont presentes sous la forme de 7 publications precedees d'un resume en francais. Dans le premier article, nous avons essaye de mettre en evidence une parente immunologique entre les formes asymetriques de l'ache et differents types de collagene. Dans le deuxieme article, nous abordons l'etude immunologique de l'ache de cerveau de rat. Les articles 3 et 4 sont consacres a des etudes de biologie moleculaire qui ont permis de caracteriser les precurseurs de l'ache des poissons electriques (gymnote et torpille) et de cloner un cdna d'une sous-unite catalytique de l'ache de torpille. Les articles 6 et 7 decrivent les proprietes de 2 series d'anticorps monoclonaux diriges contre l'ache des poissons electriques. La deuxieme partie de la these presente de facon beaucoup plus systematique, l'ensemble des travaux realises dans notre laboratoire sur l'utilisation de l'ache de gymnote en tant que marqueur dans des dosages immunologiques. Toutes les etapes aboutissant a la mise au point des dosages sont presentees de facon detaillee. A la fin de cette deuxieme partie, sont presentes 8 articles illustrant l'application de la methode au dosage de differentes substances d'interet biologique. Le travail effectue demontre clairement que l'ache de gymnote est un marqueur parfaitement adapte a la mise au point de dosages immunologiques

L'objet de cette thèse est la démonstration que le L-glutamate agit comme un "immunotransmetteur" à la synapse immunologique. Les cellules dendritiques contiennent un compartiment vésiculaire compétent pour l'exocytose régulée. Elles expriment des transporteurs vésiculaires spécifiques du glumate de la famille des VGLUT, connus pour signer le phénotype glutamatergique des synapses neuronales, et sont capables de libérer le glutamate par exocytose dépendante du calcium. Les thymocytes expriment un large répertoire de récepteurs du glutamate de tous types. En particulier, ils expriment des récepteurs NMDA fonctionnels, qui contribuent au signal calcique conduisant à l'apoptose dans un contexte de synapses immunologiques T-DC dépendantes de l'antigène, mimant la sélection négative thymique. Nous montrons que PSD-95 le prototype des protéines à domaine PDZ post-synaptiques, est recruté à la zone de contact T-DC, et est colocalisé avec le recepteur NMDA NR1 à la synapse immunologique
L-glutamate, the major excitatory neurotransmitter, also plays a role in peripheral tissues. Immune T cells express glutamate receptors and communicate through immunological synapses. T cell receptor signaling precedes mature immunological synapse formation, raising questions about the precise role of the synaptic structure. We show here that L-glutamate acts as an immunotransmitter at synapses between dendritic cells and thymic developing T cells. DCs express glutamate-specific vesicular VGLUT transporters and release glutamte through Ca2+- dependent exocytosis. Thymic T cells express functional NMDA receptors modulating the Ca2+ signal and apoptosis induced by T cell-DC interaction. NMDAR is corecruited with PSD-95 to contact zones, suggesting a role for TCR signaling in shaping a functional glutamatergic synapse. We propose that the glutamate release by DCs may elicit focal responses mediated by GluR signaling in developing T cells

Le syndrome d'hypersensibilité médicamenteuse ou DRESS (Drug Rash with Eosinophilia and Systemic Symptoms) est une réaction cutanée sévère secondaire à une prise médicamenteuse associée à de nombreuses atteintes viscérales. La réponse immunitaire au cours du DRESS est caractérisée par des lymphocytes T CD8+ activés, cytotoxiques, présentant un phénotype de localisation cutanée et dirigés contre des antigènes viraux de type EBV. Ces lymphocytes T CD8+ en expansion sont retrouvés au sein du système périphérique sanguin et dans les organes atteints (peau, foie, poumons). Nous avons démontré que le DRESS est caractérisé par la présence de nombreuses réactivations virales de type EBV, HHV-6, HHV-7 ; virus dont la production est intimement liées à la prise médicamenteuse. La présence de réactivations virales au cours du DRESS est corrélée à une forte augmentation du taux sérique d'IL-10. Au cours du DRESS, les lymphocytes B régulateurs correspondent à la principale source d'IL-10 dont la sécrétion est induite par les médicaments in vitro. L'analyse des caractéristiques cliniques et biologiques des patients présentant une évolution prolongée de la maladie nous a permis de mettre en évidence que la composante essentielle vers cette évolution semble être l'ethnicité du patient. Enfin, nous avons évalué l'efficacité du traitement du SHM par immunoglobulines intraveineuses. Nous montrons que ce traitement est ni sur, ni efficace et induit de nombreux effets secondaires indésirables. En conclusion, le syndrome d'hypersensibilité médicamenteuse est une maladie d'origine virale induite par la prise de médicament chez des individus présentant des spécificités génétiques
The drug hypersensitivity syndrome or DRESS (Drug Rash With eosinophilia and Systemic Symptoms) is a severe skin reaction secondary to drug intake associated with multiple organ involvement. The immune response in DRESS syndrome is characterized by activated CD8 T lymphocytes, cytotoxic, with a cutaneous homing phenotype and directed against viral antigens such as EBV. Expended populations of CD8+ T lymphocyte are found in the peripheral blood System and in the skin, liver and lungs. We demonstrated that DRESS is characterized by the presence of numerous viral reactivation such as EBV, HHV-6, HHV-7; virus whose production is closely linked to drug taking. The presence of viral reactivation in DRESS syndrome is correlated with a significant increase in serum IL-10. During DRESS, regulatory B lymphocytes are thé principal source of IL-10 secretion. In addition this cytokine secretion is induced by drugs in vitro. Analysis of clinical and biological characteristics of patients with a prolonged course of disease allowed us to demonstrate that the essential component to this prolonged course would be the ethnicity of the patient. In conclusion, we evaluated the effectiveness of treatment of DRESS with intravenous immunoglobulin. We show that this treatment is neither safe nor effective and induces many undesirable side effects. In conclusion, hypersensitivity syndrome is a viral disease caused by drugs in individuals with specific genetic

Caracterisation des recepteurs beta -adrenergiques humains a ete realisee par des methodes immunologiques (anticorps polyclonaux et anticorps monoclonaux ont ete developpes. Un anticorps anticodytypique ab2b4 reconnait egalement le recepteur beta -adrenergique et stimule l'activite de l'adenylate cyclase comme des ligands agonistes. Au cours de certaines maladies autoimmunes, l'existence d'autoanticorps diriges contre les recepteurs beta -adrenergiques ont ete detectes dans le serum de patients atteints de la maladie de chagas. Le developpement des groupes d'anticorps anti-recepteur obtenus permettront une etude structurale et fonctionnelle du systeme beta-adrenergique

Le cancer de la prostate est le premier cancer en incidence et le troisième au niveau de la mortalité chez les hommes canadiens. Selon les estimations de la société canadienne du cancer pour l'année 2020, près de 23 300 hommes recevront un diagnostic et 4 200 mourront de la maladie. Le cancer de la prostate est l'un des rares cancers à évolution lente. Toutefois, il présente beaucoup de variabilité dans les risques de récidive, de réponse aux traitements et de décès spécifique chez des patients ayant des caractéristiques clinico-pathologiques similaires. Il y a donc un grand besoin pour le développement d'outils prédictifs plus précis pour l'évolution et la classification de la maladie. Dans les dernières années il y a de plus en plus d'indices qui suggèrent qu'une analyse exhaustive des cellules immunitaires infiltrant les tumeurs pourrait aider à prédire l'évolution des cancers. Nous avons donc émis l'hypothèse que l'étude de l'infiltration de cellules immunes dans le microenvironnement du cancer de la prostate chez des patients traités par prostatectomie radicale pourrait prédire l'évolution de la maladie. Nous avons utilisé deux techniques pour analyser l'environnement immunitaire dans le cancer de la prostate. Tout d'abord, nous avons établi le profil d'infiltration immunitaire du microenvironnement prostatique cancéreux par des marquages immunohistochimiques, en nous intéressant non seulement au type, mais aussi à la quantité et à la localisation des cellules immunes dans les différents compartiments du microenvironnement tumoral. Nos expériences ont montré tout d'abord, que l'infiltration dans la zone centrale de la tumeur par des cellules présentatrices d'antigènes ne permet pas de prédire l'évolution du PCa. Toutefois, l'infiltration dans l'épithélium péritumoral normal et dans la marge tumorale par ces cellules est associée avec l'évolution de la maladie. Soit, en augmentant les risques de progresser vers une récidive biochimique, pour des fortes infiltrations de cellules dendritiques immatures CD209+ dans la marge tumorale et un PCa létal pour une forte infiltration de macrophages M2 CD163+ dans l'épithélium péritumoral normal. Ou bien en diminuant les risques de traitements d'hormonothérapie définitive ou de PCa létal, pour une forte infiltration de cellules dendritiques matures CD83+ dans l'épithélium péritumoral normal et la marge tumorale. Par la suite, nos analyses ont montré que la valeur prédictive de l'infiltration des lymphocytes se concentre principalement dans la zone centrale de la tumeur, tel que démontré par les risques accrus de récidive biochimique par des ratios intra tumoraux faibles de CD45RO/CD3 et hauts des FoxP3/CD45RO. Nous avons observé aussi des risques plus faibles de traitements d'hormonothérapie définitive pour des faibles ratios dans la tumeur de FoxP3/CD3 et FoxP3/CD45RO ainsi que, des risques diminués de PCa létal pour un haut ratio de CD45RO/CD3 dans l'épithélium tumoral. En complément, nous avons effectué une analyse du profil d'expression génique en ciblant une série de gènes liés à la fonction immunitaire à l'aide d'expériences de RT-qPCR dans le but de bonifier les expériences d'immunohistochimie. Ces expériences nous ont permis d'identifier un sous-groupe des gènes liés à la fonction des cellules présentatrices d'antigènes pour lequel une surexpression est associée à des taux de survie sans PCa léthal diminués. De plus, nous avons mis en évidence la protéine TIM-3 comme étant un point contrôle immunologique important dans la progression du PCa, puisque des taux élevés d'expression de ce PCI sont associées à des survies plus courtes sans besoin de traitements d'hormonothérapie définitive. Les résultats de nos travaux ont permis de mettre en évidence l'importance de tenir compte des compartiments de la tumeur dans une étude exhaustive de l'infiltration immune dans le PCa. En effet, nos données suggèrent que la valeur pronostique de l'infiltration immune dépend du type et de la densité des cellules infiltrés mais aussi de leur localisation dans le microenvironnement tumoral. De plus, nous avons pu identifier des acteurs importants dans l'évolution de la maladie, tels que les cellules exprimant FoxP3, CD45RO, CD163, CD209 ainsi que le point de contrôle immunologique TIM-3. La méthodologie de cette étude pourrait être adaptée à la réalité clinique en analysant les biopsies préopératoires. L'utilisation d'un tel outil pronostic en combinaison avec les tests clinico-pathologiques de routine pourrait aider à identifier les patients qui pourraient bénéficier d'immunothérapies intra-prostatiques avant la chirurgie destinée à renverser cet état immunosuppresseur dans un contexte de médecine de précision.
Prostate cancer is the most common cancer and the third leading cause of death from cancer among Canadian men. According to Cancer Canada, in 2020 23 300 men will be diagnosed and 4 200 men will die from prostate cancer. Prostate cancer is one of the rarest cancers to have a slow evolution. However, there is a considerable variation in disease recurrence, treatment response and disease-specific death between individuals showing similar clinico-pathological characteristics. There is therefore a great need for the development of more precise predictive tools for the evolution and the classification of the disease. In recent years, there is a growing evidence suggesting that a comprehensive analysis of tumor-infiltrating immune cells could help to predict cancer progression. We therefore hypothesized that the study of immune cell infiltration in the prostate cancer microenvironment in patients treated by radical prostatectomy can predict the evolution of the disease. We used two techniques to analyze the immune context in prostate cancer. First, we profiled the immune microenvironment of the prostate cancer by immunohistochemistry. By focusing not only on the type, but also the quantity and the localization of immune-infiltrating cells in the various compartments of the tumor microenvironment. Our experiments showed that antigen-presenting cells infiltrating the center of the tumor does not predict the evolution of prostate cancer. On the other hand, infiltration into the normal-like peritumoral epithelium and the tumor margin are associated with the evolutions of the disease either by increasing the risks of progressing to biochemical recurrence for high infiltration by immature CD209+ dendritic cells in the tumor margin and higher risks of lethal PCa for high infiltration by CD163+ M2 macrophages in the tumor margin and normal-like peritumoral epithelium. Or by reducing the risks of definitive androgen deprivation therapy (ADT) or lethal PCa for a high infiltration by mature CD83+ dendritic cells in the normal-like peritumoral epithelium and the tumor margin. Subsequently, our analyzes showed that the predictive value of lymphocyte infiltration is mainly concentrated in the tumor center, as demonstrated by the increased risks of biochemical recurrence by intra-tumor low ratios of CD45RO/CD3 and high ratio of FoxP3/CD45RO. In addition, a lower risk of definitive ADT for low tumor ratios of FoxP3/CD3 and FoxP3/CD45RO and a decreased risk of lethal PCa for a high CD45RO/CD3 ratio in the tumor epithelium was also observed. Secondly, we performed gene expression profile analysis targeting a series of genes related to immune function using RT-qPCR experiments to complement the immunohistochemistry experiments. These experiments allowed us to identify a subgroup of genes related to the function of antigen presenting cells in which, overexpression is associated with decreased rates of lethal prostate cancer-free survival. In addition, we identified TIM-3 as being an important immunecheckpoint in the progression of prostate cancer since high expression levels of TIM-3 are associated with shorter survival to definitive ADT. The findings of our work have highlighted the importance of tumor compartments in a comprehensive study of immune infiltration in prostate cancer. Indeed, our data suggest that the prognostic value of immune infiltration depends on the type and density of the infiltrated cells but also on their location in the tumor microenvironment. In addition, we were able to identify important players in the evolution of the disease, such as cells expressing FoxP3, CD45RO, CD163, CD209 and the immune checkpoint TIM-3. The methodology of this study could be adapted to clinical reality with the analysis of preoperative biopsies. The use of such a prognostic tool in combination with routine clinico-pathologic tests could help identify patients who might benefit from intra prostatic immunotherapies prior to surgery to reverse this immunosuppressive condition in a context of precision medicine.

Le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) a pour récepteur principal la molécule CD4 et infecte les lymphocytes T CD4+, mais aussi les macrophages et les cellules dendritiques. L'interleukine-16 (IL-16), le ligand naturel de la molécule CD4, est une chimiokine pour les lymphocytes T CD4 et les monocytes. L'IL-16 est capable d'inhiber la multiplication virale dans les lymphocytes t infectés. Après avoir clonée et produite la forme recombinante humaine, nous démontrons que seule la fraction tétramérique de l'IL-16 est responsable de l'inhibition de la multiplication du VIH, à, tropisme M et T, dans des cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) infectées. L'IL-16 est également capable d'inhiber la mort cellulaire de PBMC, issus de patients, induite par les anticorps anti-CD3, anti-CD95 et la dexaméthasone. La suppression de l'apoptose est en partie corrélée à la diminution de l'expression de CD95 sur les cellules CD4+ activées
Jusqu'à présent, peu ou pas d'études ont été réalisées pour évaluer l'activité de l'IL-16 sur les macrophages et les cellules dendritiques, bien qu'elles expriment la molécule CD4. Nous démontrons que l'IL-16 module, dans les macrophages et les cellules dendritiques, l'expression de récepteurs de surface (CD25, CD80, CD86, CD83), l'expression des (co)récepteurs du VIH (CD4, CCR5, CXCR4), et la sécrétion de cytokines (IL-10, IL1-RA, TNF-[Alpha] IL-6) et de chimiokines (MIP-1[Alpha], RANTES). Dans un second temps, nous démontrons que l'IL-16 est capable d'inhiber la multiplication du VIH dans les macrophages et les cellules dendritiques. Ses résultats suggèrent que l'IL-16 est une molécule intéressante dans le cadre d'une immunothérapie anti-VIH. La seconde partie de notre travail concerne le monoxyde d'azote (NO°), une molécule qui possède, entre autres, des activités antivirales. Notre objectif était d'établir une corrélation entre la libération de NO°, l'apoptose des cellules T et la multiplication virale dans les macrophages. Malgré une faible régulation de l'apoptose spontanée des PBMC, le NO° ne module pas la mort cellulaire des PBMC induite par les anticorps anti-CD3 ou la phytohémagglutinine. Par ailleurs, ni les PBMC issus de patients, ni les macrophages infectés par le VIH, ne libèrent du NO°, ce qui est confirmé par l'absence de régulation de l'ARN messager de la NO-synthase. Enfin, le NO° ne module pas la multiplication virale dans les macrophages confirmant un rôle mineur du NO° dans la pathogenèse du VIH

Production et caracterisation d'anticorps monoclonaux diriges contre des isotubulines par des techniques de dissection moleculaire. Etude de la microheterogeneite des tubulines du cytosquelette neuronal au cours du developpement

Les processus physiologiques necessaires au bon fonctionnement de chacune de nos cellules sont coordonnes sur la base d'une communication chimique qui fait intervenir largement si ce n'est uniquement des glycoproteines. L'objectif que nous avons poursuivi dans notre recherche a ete de comprendre comment la glycosylation peut, dans une situation physiologique normale autant que pathologique, controler l'activite biologique d'une glycoproteine douee d'activite hormonale telle que la thyrotropine (tsh) humaine. Cette hormone fait partie de la famille des glycoproteines incluant les gonadotropines, elle se compose de deux sous-unites glycoproteiques comportant respectivement deux et une chaines glycanniques n-liees. Nos travaux ont mis en evidence que la deglycosylation enzymatique de l'hormone native entraine un changement de conformation de la molecule par modification de ses domaines antigeniques. La molecule privee de ces glycannes garde sa capacite a induire la production de camp mais perd celle de stimuler la proliferation cellulaire. D'autre part, les glycannes presents sur les hormones glycoproteiques affectent la charge globale de ces molecules et sont responsables d'un polymorphisme naturel que nous avons pu caracteriser pour la tsh. Nous avons obtenu 7 glycoformes majoritaires pour l'hormone de point isoelectrique allant de 8,6 a 4,8. Ces isoformes ne possedent pas la meme potentialite a induire la production de camp ou la croissance cellulaire. Ainsi, la tsh peut adopter un nombre fini d'isoformes qui different par leur activite biologique et leur immunoreactivite

L’allergie est un problème de santé publique émergent dans les pays industrialisés. C’est une maladie multifactorielle influencée par la nature et les caractéristiques de l’allergène en cause. L’objectif de cette thèse était de caractériser certains allergènes du grain de blé sous forme purifiée ou recombinante et d’identifier les structures moléculaires responsables de leurs pouvoirs sensibilisants : les épitopes. Dans la superfamille des prolamines, la réduction des ponts disulfures diminue, et parfois même supprime, leur réactivité vis-à-vis des IgE. Par ailleurs, les domaines répétitifs et non répétitifs des protéines de réserve interagissent, ce qui favorise leur immunoréactivité. Il existe donc un effet de la structure sur l’immunoréactivité des allergènes de blé. A côté des épitopes continus, nous avons montré l’existence d’épitopes conformationnels dans les gluténines, les gliadines, la LTP1 et la serpine. La serpine pourrait être un bon marqueur d’une large sensibilisation aux protéines de blé. Plusieurs allergènes recombinants du blé sont maintenant caractérisés et disponibles pour les tests de diagnostic d’allergie respiratoire et alimentaire, et pourraient être des candidats pour l’immunothérapie spécifique
Allergy is an increasing public health problem in industrialized countries. It is a multifactorial disease influenced by the nature and characteristics of the allergen. The objective of this thesis was to characterize recombinant or purified forms of wheat grain allergens, and to identify the molecular structures responsible for sensitization: the epitopes. The reduction of disulfide bonds in the prolamin superfamily decreases, and sometimes suppresses, their IgE reactivity. The repetitive and non-repetitive domains of wheat storage proteins interact, which enhances their immunogenicity. There is a clear effect of the structure on the wheat allergens immunoreactivity. In addition to continuous epitopes, we showed the existence of conformational epitopes in gliadins, glutenins, LTP1, and Serpin-Z2B. Serpin-Z2B could be considered as a marker of large sensitization to wheat proteins. Several recombinant wheat allergens are now characterized and available for diagnosis of respiratory allergy and food allergy, and could be used for specific immunotherapy

Divers facteurs (agents oxydants, rayonnements) peuvent engendrer des modifications de bases de l'adn. Le premier volet de ce travail de these a consiste a identifier les produits de degradation des bases pyrimidiques par l'ozone. L'identification de ces composes a permis de mettre en evidence deux nouveaux derives et de conclure a un mecanisme d'action specifique. La suite du travail concerne la preparation d'anticorps diriges contre des modifications de bases de l'adn. Nous avons mis au point une nouvelle methode de preparation des antigenes destines a la production d'anticorps utilises pour la detection immunologique des lesions de l'adn. Ainsi, des anticorps polyclonaux diriges contre la 8-oxo-7,8-dihydroguanine (8-oxogua) ont ete obtenus. L'utilisation de ces anticorps a permis de preparer des colonnes d'immunoaffinite, en vue de prepurifier la 8-oxogua a partir de fluides biologiques. D'autres applications ont ete realisees avec des anticorps monoclonaux. Il s'agit du dosage de 8-oxogua et de dimeres de thymine (thy<>thy) dans de l'adn isole et cellulaire. Cependant, la specificite de l'anticorps dirige contre 8-oxogua s'est averee insuffisante pour doser cette lesion par immunologie. Par contre, l'anticorps dirige contre les thy<>thy a permis de mettre en evidence, par un dosage elisa, la formation de ce defaut dans un adn isole ayant subi l'action de l'uv du vide lors du vol spatial biopan. Par ailleurs, un dosage par cytometrie en flux a permis de detecter les dimeres de thymine directement dans l'adn cellulaire irradie par le rayonnement uv-b. Dans une derniere partie, nous avons recherche des anticorps specifiques de la 8-oxogua dans le serum de diabetiques de type i. Ce travail a permis de mettre en evidence des auto-anticorps diriges, non pas contre la lesion de l'adn recherchee, mais contre l'albumine humaine traitee par naio#4 et nabh#4

L’objectif de mon doctorat, réalisé dans le cadre d’une collaboration entre le laboratoire des protéines et nanotechnologies en sciences séparatives (institut Galien Paris-Sud) et le groupe Micro et Nano Système (institut d’électronique fondamentale) était d’étudier l’influence des monocouches autoassemblées, sur l’activité biologique du bio-récepteur dans une perspective de développement de biocapteur. Dans ce projet, nous avons choisi les organo-silanes qui peuvent se lier de manière covalente sur le silicium. Deux silanes (7-octenyl trichlorosilanes et le (3-aminopropyl)triethoxysilane) ont été étudiés, leur impact en terme de nature et de stabilité sur la fonctionnalité du bio-récepteur, des immunoglobulines G de souris, ont été évalué. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la fonctionnalité des anticorps greffés sur une mono couche auto-assemblée composée de 7-octenyltrichlorosilane (OTS) présentant à sa surface un groupement carboxylique. Une caractérisation spectroscopique par XPS et infra-rouge à transformé de Fourrier (FTIR) a tout d’abord été effectuée afin de vérifier la présence de ces groupements carboxyliques. L’homogénéité de la surface a été évaluée par AFM. Nous avons ensuite immobilisé ces anticorps, sur ces supports, de manière covalente et une étude topographique par AFM a été menée pour mesurer la répartition de ces anticorps. L’orientation des anticorps greffés a été évaluée à l’aide d’immuno-essais. Ensuite, nous avons comparé l’APTES, permettant l’obtention de plaques de silicium fonctionnalisé avec des groupements aminés à leur surface, avec l’OTS. Nous avons notamment comparé la capacité de capture des anticorps immobilisés sur ces deux types de silanes. Dans la dernière partie, l’impact du vieillissement d’un support immunologique préparé chimiquement en utilisant l’APTES a été évaluée sur le plan physico-chimique et biologique
The aim of my PhD thesis, conducted as part of a collaboration between the laboratory of protein separation sciences and nanotechnology (Paris-Sud Galen Institute) and the Micro and Nano System (basic electronics institute) group was to study the influence of self-assembled monolayers on the biological activity of bioreceptor toward biosensor development. In this project, we choose the organosilanes that can bind covalently to the silicon. Two silanes (7-octenyl trichlorosilane(OTS) and 3- aminopropyltriethoxysilane (APTES)) were studied., Their impact on the stability and the functionality of bio- receptor , model mouse immunoglobulin G (IgG), were evaluated. Spectroscopic characterization by XPS and infra- red Fourier transformed (FTIR) was first carried out to assess that the silanized surface exhibit carboxylic groups. The homogeneity of the surfaces was measured by AFM. Then, IgG were immobilized on these supports, covalently and a topographic AFM study was conducted to measure the distribution of these antibodies. The orientation of the grafted antibody was investigated by immune-enzymatic assays. We have also evaluated the binding capacity of the IgG immobilized on both surfaces. Then, the impact of aging on APTES surface was evaluated by spectroscopics and biological methods

Detection du lipopolyoside (lps) au cours de la purification de proteines issues d'escherichia coli. Mise au point d'une technique elisa par inhibition, application au controle de la purification de l'hormone de croissance humaine (hgh) produite par e. Coli. Comportement chromatographique du lps sur differents supports et au cours de la purification de l'hgh. Etude des interactions lps/proteines dans le cas de la serumalbumine et de l'hgh

La preparation des extraits solubles a partir des trophozoites de la souche rh, a permis d'etudier la structure antigenique de toxoplasma gondii a l'aide de la chromatographie sur gel sephacryl#(#r#) #s300 de l'electrophorese sur gel de polyacrylamide (sds-page), de la contre electro-immuno-diffusion (ceid) et de l'immuno-transfert. Des infestations experimentales ont ete realisees par des trophozoites de la souche rh et des kystes de la souche prugniaud chez la souris blanche pour pouvoir detecter et caracteriser des antigenes circulants toxoplasmiques agct par ceid, elisa-reverse et immunotransfert. A partir de l'extrait cytoplasmique, ont ete separees 4 fractions par chromatographie sur gel, 21 polypeptides de pm variant de 8 kda a 130 kda par sds-page. Par ceid le nombre de traits de precipitation est de 8, alors qu'en immunotransfert 28 polypeptides de pm 14 kda a 110 kda sont visualises. Quant a l'extrait membranaire, 2 fractions seulement ont ete separees par chromatographie sur gel et 8 polypeptides de pm compris entre 4 kda et 67 kda par sds-page. Comme pour l'extrait cytoplasmique, il y a 8 traits de precipitation en ceid et 23 polypeptides de pm allant de 14 a 110 kda en immunotransfert. La ceid appliquee a la detection des agct n'a permis d'obtenir des resultats positifs qu'a partir du 4eme jour de l'infestation et uniquement chez les souris inoculees par 1000 et 5000 trophozoites de la souche rh. En revanche, l'elisa-reverse a detecte ces agct des le premier jour de l'infestation des animaux aussi bien par 1000 et 5000 trophozoites que par 100 et 200 kystes de la souche prugniaud. Avec ces deux dernieres doses, les taux d'agct sont plus faible qu'avec la souche rh. De meme en immunotransfert, ces agct apparaissent des le premier jour independamment de la dose et la souche administree. Ils sont constitues de 7 polypeptides de pm allant de 22 a 110 kda. Cette technique a permis de deceler la provenance de ces agct. En effet, les agct de pm: 87 kda, 75 kda, 48 kda, et 22 kda sont cytoplasmiques,, ceux de pm: 110 kda et 24 kda ont une double origine, le polypeptide de pm 30 kda est exclusivement membranaire

La NADPH oxydase, Nox4, appartient à la famille des Nox qui génèrent les espèces radicalaires de l'oxygène, ROS, en transférant un électron à l'oxygène moléculaire. Malgré sa large distribution dans les tissus, Nox4 est encore mal comprise. Contrairement aux autres Nox, Nox4 est unique par son activité constitutive et sa capacité à former H2O2. Les ROS sont des espèces bactéricides dans les phagocytes et des outils de signalisation dans les cellules non phagocytaires en étant associés à de nombreuses pathologies inflammatoires et du vieillissement. Une étude de la structure en lien avec la fonction de Nox4 permettra de mettre l'accent sur un mécanisme de fonctionnement et sur de nouvelles cibles thérapeutiques. 5 nouveaux anticorps monoclonaux ont été générés contre une construction recombinante tronquée (AA: 206-578) de Nox4. La spécificité de 3 anticorps monoclonaux (8E9, 5F9, 6B11) a été confirmée par western blot dans les cellules HEK293 transfectées et le cortex de rein humain. L'anticorps 8E9 est le seul à permettre un marquage des cellules TRex-Nox4 sans perméabilisation par FACS. L'immunofluorescence confocale a montré que Nox4 est localisée dans la zone périnucléaire et le réticulum endoplasmique. La microscopie TIRF a confirmé sa présence dans la membrane plasmique. Un phénomène intéressant est que 5F9 ne détecte pas Nox4 à la membrane plasmique. L'épitope de 8E9 reconnaît une région sur la dernière boucle E extracellulaire de Nox4 (222H-E241), tandis que les anticorps monoclonaux, 6B11 et 5F9 marquent respectivement les régions 6B11 (389S-P416) et 5F9 (392D-F398). Par ailleurs, seuls 5F9 et 6B11 inhibent l'activité de Nox4, ce qui suggère que les deux régions marquées par ces ACm sont impliquées dans le transfert d'électrons. Une étude ciblée sur la boucle E de Nox4 a permis de montrer que le changement de 2 cystéines modifie la nature des ROS générés par Nox4 avec la production de O2- au lieu de H2O2. O2- est mis en évidence par la formation de peroxynitrite en présence de NO. Par ailleurs l'ACm 8E9 diminue la production de H2O2 dans les cellules COS7 qui expriment Nox4 à la membrane plasmique alors que celle de O2- est augmentée. Des constructions recombinantes de Nox4 (native ou tronquée) ont été générées par induction bactérienne, E.Coli, et par un système de transcription/traduction (RTS). Les protéines correspondantes, solubles, ont été produites à grande échelle et l'activité diaphorase mesurée; cette activité est constitutive. L'étude de la topologie membranaire de Nox4 et p22phox a été abordée en préparant des protéines de fusion avec l'ubiquitine marquée à la GFP. Cette méthode, TDUFA, particulièrement originale, devrait permettre d'appréhender la topologie de l'hétérodimère Nox4/p22phox, actif.

Le premier travail presente est une description epidemiologique d'une epidemie de tuberculose tres particuliere chez les indiens yanomami, ou la reponse immunopathologique a la tuberculose s'est averee de type spectral, a la difference des reponses plutot uniformes observees dans les populations d'origine occidentale. Nous avons pose l'hypothese que l'absence de pression selective negative serait responsable du maintien du spectre immunopathologique observe chez les yanomami. Les resultats de l'etude de ce first contact, nous ont incite a la recherche d'un systeme ou la reponse immunitaire cellulaire serait diminuee et la susceptibilite a la tuberculose augmentee. En etudiant la production d'ifn- et d'il-4, chez les malades souffrant de mycobacteriose et presentant une infection a vih concomitante, nous avons observe que le profil de cytokines changent de type th1, observe chez les malades immunocompetents, vers un profile de type th0 ou th2, au fur et mesure de l'aggravation de l'imunodepression. Nous avons aussi explore la possibilite d'employer une approche alternative en utilisant la distribution isotypique d'igg specifiques, comme un marqueur de la production locale de cytokines. Le propos de notre essai etait aussi de comparer l'importance relative entre la nature de l'antigene et les cytokines produites localement sur le profil de sous-classes d'igg. Nos resultats montrent la presence d'un profil de sous-classes d'anticorps, independamment de la nature de l'antigene, et specifique de la forme de la lepre : dans les formes dissemines sont les igg2 et dans les autres formes sont les igg1. La necessite de developper des outils diagnostiques nous ont conduit au developpement de nouveaux essais, appelee elispot, qui s'est averer efficace pour differentier la maladie active d'une infection latente. En suivant pendant les six mois de duree de traitement, une cohorte de patients avec une tuberculose active, nous avons conclu que l'elispot pouvait etre considere une methode valable pour la moniterisation de l'efficacite du traitement contre la tuberculose.

Pour comprendre les fluctuations d'abondance de certaines especes marines il est important de ne pas negliger leurs stades larvaires planctoniques. Les representants de ces organismes sont difficiles a identifier car les outils specifiques adaptes sont peu nombreux. L'objet de ce travail est de proposer, dans le cadre du pndr (programme national sur le determinisme du recrutement), une approche methodologique qui facilite la reconnaissance des larves de bivalves. L'espece cible est la coquille saint-jacques, pecten maximus et le site d'etude, la rade de brest (france). La voie suivie est immunologique. Parmi les molecules potentiellement immunogenes, les proteines sont retenues pour induire la production de serum anti-larves de pecten maximus. Ce choix necessite le developpement d'une technique d'extraction proteique adaptee aux echantillons larvaires de bivalves marins. Les extraits proteiques obtenus a partir de differentes especes sont analyses en electrophorese sds-page et sont specifiques. Ils permettent de tester analytiquement, en immunotransfert, la specificite des serums anti-extrait proteique larvaire de ce pectinide. Ces serums reagissent fortement vis a vis de l'extrait proteique de larves de pecten maximus mais presentent egalement de nombreuses reponses croisees vis a vis des extraits proteiques appartenant aux autres especes etudiees (aequipecten opercularis, chlamys varia, ostrea edulis, crassostrea gigas, ruditapes decussatus, ruditapes philippinarum, mytilus edulis). Differentes solutions sont envisagees pour reduire le taux de reponses croisees. L'epuisement des serums contre des extraits proteiques de crassostrea gigas permet d'eliminer la quasi-totalite de ces reponses sans nuire a la reconnaissance des extraits proteiques de pecten maximus. Ces serums epuises sont utilises directement contre des lots de larves de bivalves pour valider leur pouvoir de reconnaissance des larves de pecten maximus. Trois marqueurs secondaires destines a la reconnaissance du couple larve de pecten maximus/anticorps sont testes : la phosphatase alcaline, les billes magnetiques (dynal), la fluorescence (fitc). La fluorescence donne les meilleurs resultats et c'est cette technique qui est retenue et mise en application pour permettre de visualiser les larves de pecten maximus contenues dans des echantillons de plancton en provenance de la rade de brest. Ce dernier aspect de l'etude permet sur une annee, d'identifier des larves de pecten maximus en rade de brest et de retrouver une concordance certaine entre la presence de ces larves et les phases de reproduction des adultes. L'outil immunologique detecte les larves de pecten maximus parmi les autres organismes planctoniques et pourrait etre developpe pour de nombreuses especes a condition de disposer de quantite d'extrait proteique monospecifique suffisante pour induire la production d'anticorps.

Une serie d'anticorps monoclonaux diriges contre des cellules hemopoietiques de mouton fut produite afin d'etudier la physiologie et l'ontogenese du systeme immunitaire. Certains d'entre eux reconnaissent l'equivalent ovin de molecules deja decrites dans d'autres especes. Ils permettent la compartimentation du microenvironnement des organes lymphatiques