Dissertations / Theses on the topic 'In vitro toxicity tests'

L'objectif de cette thèse est d'améliorer la compréhension de la toxicité de diverses nanoparticules de synthèse (ENPs) pour l'homme et l'écosystème. Les travaux réalisés s’appuient sur la combinaison de données toxicologiques et d’un modèle environnemental - le modèle USEtox. En tant qu'élément important de l'évaluation de l'impact du cycle de vie, le facteur de caractérisation (CF) a été utilisé, dans ce travail, comme indicateur de toxicité pour l'homme et l'écosystème. Pour avoir accès aux courbes dose-réponse et à différentes données toxicologiques, des expériences in vitro ont été réalisées en exposant des neutrophiles porcins fraîchement isolés à trois types de nanoparticules de synthèse. Les modifications morphologiques, les taux de mortalité et la chimioluminescence des neutrophiles ont été évaluées. De plus, pour estimer le temps de persistance des nanoparticules de synthèse dans l'écosystème eau douce, un modèle basé sur la science des colloïdes a été développé. Il prend en compte les comportements spécifiques des nanoparticules de synthèse et inclut des recommandations sur le choix des paramètres hydrologiques régionaux. Enfin, une enquête documentaire exhaustive a été réalisée pour recueillir les données écotoxicologiques de diverses nanoparticules de synthèse. Dans le cadre du modèle USEtox, le CF toxicologique non cancérogène pour cuivre NPs et les CF écotoxicologiques pour 14 ENPs sont recommandés. Ces valeurs des CF pourraient être utiles à l'avenir pour évaluer les impacts environnementaux des produits contenant des ENPs
The objective of this thesis is to improve understandings of toxicity of various engineered nanoparticles (ENPs) to human and ecosystem. It is realized via coordinating toxicological data and a scientific consensus environmental model -- the USEtox model. As an important element in life cycle impact assessment, the characterization factor (CF) is employed as a toxicity indicator for human and ecosystem in this work. To obtain the firsthand dose-response phenomena and human toxicological data, in vitro experiments have been conducted by exposing freshly isolated porcine neutrophils to three kinds of ENPs (i.e. copper, nickel and aluminum oxide nanoparticles). The morphologies, mortality rates, and chemiluminescence, of neutrophils are observed or monitored. Additionally, to estimate the persistence time of ENPs in freshwater ecosystem, a fate model on the basis of colloid science is developed. It takes nano-specific behaviors of ENPs into account and includes recommendations of regionalized hydrological parameters. Finally, a comprehensive literature survey is accomplished to collect the ecotoxicological data of various ENPs. Under the framework of USEtox model, the non-carcinogenic human toxicological CFs for Copper NPs and the ecotoxicological CFs for 14 ENPs are recommended. These CF values could be useful in the future when evaluating the environmental impacts of products containing ENPs

Les nanofils d'oxyde de zinc (ZnONW) attirent beaucoup d'attention scientifique en raison de leurs propriétés optoélectriques, piézoélectriques et semi-conductrices, qui en font un bon candidat pour les capteurs et l'électronique intégrées dans les textiles. Ces applications augmentent les risques d'exposition cutanée, de qui rend l’étude de leur toxicité cruciale, d'autant plus que les études récentes démontrent une toxicité liée aux ions de zinc due à la dissolution. Malheureusement, la compréhension de l'impact des ZnONWs sur la peau est limitée. Par conséquent, l'objectif de ce projet est d'acquérir une compréhension approfondie du danger potentiel des ZnONWs sur la peau (humaine) in vitro et de la façon dont leurs propriétés physicochimiques sont liées à cela.Ici, une caractérisation physico-chimique étendue des ZnONWs a été effectuée dans des milieux de cultures de cellules (GlutaMAX) avec et sans sérum, et dans des suspensions milli Q eau (mQ H2O). Les résultats ont montré que la dissolution de la suspension stock, où les deux nanomatériaux ZnO (ZnONM) sont dans mQ H2O, a atteint une concentration en ions zinc à l'équilibre de 15 µg / mL immédiatement, tandis que les études de dimensions ont montré une forte agrégation dans GlutaMAX sans sérum et une agrégation réduite dans les milieux GlutaMAX avec du sérum . Il a été démontré que les conditions de stockage de l'incubateur à 5% de CO2 et à 37 ° C ont un impact sur la dissolution en abaissant le pH de la suspension aqueuse milli Q et en formant éventuellement des complexes de carbonate de zinc dans les milieux.L'examen de la cytotoxicité des ZnONW dans la monoculture cutanée et la comparaison avec les nanoparticules de ZnO (ZnONP) et le chlorure de zinc (ZnCl2) a montré que les ZnONM induisaient une cytotoxicité et une baisse de viabilité cellulaire significatives à partir de 40,2 µg / mL d'équivalent zinc, avec moins de 40% de cellules viables. La comparaison avec le ZnCl2 a montré une association claire entre la dissolution et la cytotoxicité cellulaire.Pour évaluer davantage l'impact réel des ZnONW dans la peau, un système de co-culture dans l'interface air-liquide (ALI) composé d'épiderme et de cellules cutanées du derme a été développé après uneoptimisation en monoculture de chaque type de cellule. Le système de modèle de peau 3D a été exposé aux ZnONPs, ZnONWs et ZnCl2. Pour empêcher la dissolution des ZnONW, une couche de dioxyde de titane (TiO2) de 5,75 ± SD 1,06 nm a été déposée par dépôt de couche atomique (ALD) sur les ZnONWs. Les ZnONWs recouverts de TiO2 ont également été testés pour leur toxicité sur le système de co-culture.Les résultats des expositions ont montré une mort cellulaire significative avec seulement 20% de cellules vivantes, après traitement aux ZnONMs et au ZnCl2 à 80,4 µg tandis que le traitement aux ZnONW revêtus de TiO2 maintenait au moins 75% de viabilité cellulaire même à 80,4 µg. Cependant, un examen plus approfondi des médiateurs (pro-) inflammatoires après le traitement a montré que les ZnONW revêtus de TiO2 augmentaient les niveaux d'interleukine (IL) 8 et 6 (pro-) inflammatoires par rapport aux ZnONW sans couche de TiO2. Cela pourrait soulever d'autres problèmes de toxicité
Zinc oxide nanowires (ZnONWs) are attracting a lot of scientific attention due to their optoelectrical, piezoelectrical and semiconducting properties, which make them a good candidate for sensors and wearable electronics. These applications increase the chance of skin exposure, hence the investigation of their safety is crucial, especially since studies on ZnONWs show a zinc ion related toxicity due to their dissolution. Unfortunately, understanding of ZnONWs impact on skin is limited. Therefore, it is the objective of this project to gain an insightful understanding of the potential hazard of ZnONWs upon (human) skin in vitro and how their physicochemical properties are related to this.Herein, an extensive ZnONWs physicochemical characterisation was performed in media with and without serum, and in milli Q water (mQ H2O) suspensions. Results showed the stock dissolution, where both ZnO nanomaterials (ZnONMs) are in mQ H2O, reached a zinc ion concentration at equilibrium of 15 µg/mL immediately, while size studies showed high aggregation in GlutaMAX without serum and reduced aggregation in GlutaMAX media with serum. Incubator storing conditions of 5% CO2 and 37oC were shown to have an impact on the dissolution by lowering the pH of the milli Q water suspension and possibly forming zinc carbonate complexes in media.Examining the cytotoxicity of ZnONWs in skin monoculture and comparing it to ZnO nanoparticles (ZnONPs) and zinc chloride (ZnCl2), showed that ZnONMs induced a significant cytotoxicity and cell death from 40.2 µg/mL zinc equivalent, with less than 40% viable cells. Comparison with the ZnCl2 showed a clear association between dissolution and cell cytotoxicity.To assess further the actual impact of ZnONWs in the skin, a co-culture system in Air-Liquid-Interface (ALI) consisting of epidermis and dermis skin cells was developed after monoculture optimisation of each cell type. The 3D skin model system was exposed to ZnONPs, ZnONWs and ZnCl2. To prevent the dissolution of ZnONWs, a 5.75±SD 1.06 nm Titanium dioxide (TiO2) shell was deposited via Atomic layer deposition (ALD) on the ZnONWs. The TiO2 coated ZnONWs were also tested for their toxicity on the co-culture system.Results of the exposures showed a significant cell death with only 20% alive cells, after ZnONMs and ZnCl2 treatment at 80.4 µg whilst the TiO2 coated ZnONWs treatment maintained at least 75% cell viability even at 80.4 µg. However, further examination of (pro-) inflammatory mediators after treatment showed that TiO2 coated ZnONWs increased levels of (pro-)inflammatory Interleukin (IL) 8 and 6 compared to bare ZnONWs. This could raise further safety issues

Carbofuran and chlorpyrifos are two well-known pesticides widely investigated, and its effects on different organisms have been previously reported in separate studies. For this reason were considered to be good model subtances, relevant from the environmental perspective. On the other hand, we selected this kind of compounds because they are used in many tones annually in agriculture and horticulture and they are significant especially in greenhouse-based production of vegetables and fruits in southern Europe, particularly Spain.

The general objective of this work was to compare the response of in vitro assays using cell lines with assays using fish in vivo in order to contribute to the development of alternative methods to the use of laboratory animals. Furthermore, we compared two types of cells, a fish cell line from an established culture and mammalian cells obtained from a primary cell culture, in order to see if there are similar responses based on common mechanisms of toxicity. A better knowledge of these mechanisms facilitates the interspecies extrapolation of the impact of environmental contaminants, which is one of the major challenges to ecotoxicologists.

In order to have a general point of view of the toxicity of these pesticides, single and in mixture, acute toxicity was evaluated using a battery of ecotoxicological model systems and indicators representative of a wide range of organisms. The systems studied included: RTG-2 fish cell line, primary cell cultures from bovine granulosa cells, the marine bacteria (Vibrio fischeri), three species of freshwater microalgae (Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus and Selenastrum capricornutum) and the vertebrates zebra fish (Danio rerio). Sublethal effects were also evaluated in both types of cells using several biomarkers such as assessment of the DNA damage as genotoxic indicator, inhibition of production of progesterone as indicator of the aromatase activity and inhibiton of acetylcholinesterase activity as indicator of exposure to pesticides measured also in zebra fish.

By comparing the obtained in vitro fish cell line and mammalian primary cell cultures results with currently used bacteria, algae and fish acute toxicity tests, it was possible to compare its sensitivity against these conventional toxicity tests.

As conclusions of the study we can say: 1) fish cell lines can be used as an alternative to the use of fish in laboratory; 2) the simultaneous use of in vitro fish cell lines with fish species allow to assess whether cellular responses in vitro could mimic toxicity responses of individual fish, thus to directly assess the ecological relevance of the proposed in vitro cell based test; 3) cell lines are the most sensitive bioassay of the studied battery; 4) the use of a battery of multispecies tests to determine the toxicity of any product is recommended; 5) The aquatic test using bacteria or microalgae are quite interesting, but they cannot be considered as a substitute for the studies on fish, because of they assess the effect of toxicants on other trophic levels, not on fish and 6) synergistic and antagonistic toxicity effects were observed with pesticide cocktails relative to pure compound toxicities.
Carbofuran i chlorpyrifos són dos pesticides àmpliament investigats. Els seus efectes en diferents organismes han estat prèviament estudiats en diferents treballs. Per aquesta raó es va considerar que serien bones substàncies model, rellevants des de una perspectiva medi ambiental. Per altra banda, aquesta classe de compostos són utilitzats anualment en moltes tones en agricultura i horticultura i són especialment importants en la producció de vegetals i fruites en hivernacles en el sud d'Europa, particularment en Espanya.

L'objectiu general d'aquest treball és comparar la resposta de assaigs in vitro utilitzant cèl·lules amb assaigs in vivo utilitzant peixos, per tal de contribuir al desenvolupament de mètodes alternatius a l'ús d'animals de laboratori. A més a més dintre dels assaigs in vitro, és van comparar dos tipus de cèl·lules, una línia cel·lular establerta de peix i un cultiu primari de cèl·lules de mamífer, per veure les diferents respostes basades en mecanismes comuns de toxicitat. El fet d'assolir un millor coneixement d'aquestos mecanismes facilita l'extrapolació entre espècies per l'avaluació de l'impacte de contaminants medi ambientals, la qual cosa és un dels majors reptes dels ecotoxicolegs.

La toxicitat aguda d'aquestos pesticides, individuals i en barreja, es va avaluar emprant una barreja de sistemes i indicadors de models ecotoxicològics . Els sistemes estudiats inclouen: la línia cel·lular RTG-2 , cultius primaris de cèl·lules de la granulosa d'ovaris de bovins, la bactèria marina Vibrio fischeri, tres espècies de microalgues, Chlorella vulgaris, Scenedesmus susbspicatus i Selenastrum capricornutum i com a model de vertebrat, el peix zebrafish, Danio rerio. Els efectes subletals també van ser avaluats en els dos tipus cel·lulars utilitzant biomarcadors, tals com l'avaluació del dany a l'ADN com indicador genotòxic, la inhibició de la producció de progesterona com indicador de l'activitat de l'aromatasa i la inhibició de la activitat de l'enzim acetilcolinestarasa com indicador de l'exposició als pesticides la qual també es va mesurar en zebra fish.

Al comparar els resultats obtinguts amb la línia cel·lular de peix i els cultius primaris de mamífer amb els resultats dels tests de toxicitat aguda amb bactèries, microalgues i peixos, va estar possible comparar la sensibilitat de les cèl·lules respecte els test de toxicitat convencionals.

Es poden extreure les següents conclusions d'aquest estudi:1) les línies cel·lulars poden ser utilitzades com alternativa al ús de peixos en laboratori; 2) l'utilització simultània de línies cel·lulars derivades de peixos amb peixos in vivo permet avaluar si les respostes in vitro poden imitar les respostes de toxicitat obtingudes amb els peixos, així es permet avaluar la rellevància ecològica del test basat en cèl·lules in vitro; 3) les línies cel·lulars són el bioassaig més sensible dels utilitzats en aquesta bateria; 4) es recomana l'ús d'una bateria de test multiespècies per determinar la toxicitat de qualsevol producte; 5) els tests aquàtics que empren bactèries o microalgues són interessants però no poden considerar-se substitutius dels estudis amb peixos, perquè avaluen l'efecte dels tòxics a un altra nivell tròfic i ; 6) s'observen efectes toxicològics sinèrgics i antagonistes quan s'utilitzen les barreges de pesticides en front dels compostos purs.
Carbofuran y chlorpyrifos son dos pesticidas ampliamente investigados. Sus efectos en diferentes organismos han sido previamente estudiados en diferentes trabajos. Por esta razón se considero que serian unas buenas sustancias modelo, relevantes desde una perspectiva medioambiental. Por otra parte, esta clase de compuestos son utilizados anualmente en muchas toneladas en agricultura y horticultura y son especialmente importantes en la producción de vegetales y frutas en invernaderos en e l sur de Europa, particularmente en España.

El objetivo general de este trabajo es comparar la respuesta de los ensayos in vitro utilizando células y los ensayos in vivo utilizando peces, para contribuir al desarrollo de métodos alternativos al uso de animales de laboratorio. Además dentro de los estudios in vitro se compararon dos tipos de células, una línea celular establecida de pez y un cultivo primario de células de mamífero, para ver las diferentes respuestas basadas en mecanismos comunes de toxicidad. El hecho de alcanzar un mejor conocimiento de estos mecanismos facilita la extrapolación entre especies para la evaluación del impacto de contaminantes medio ambientales, lo cual es uno de los mayores retos de los ecotoxicólogos.

La toxicidad aguda de estos pesticidas, individuales y en mezcla, se evaluó utilizando una mezcla de sistemas y indicadores de modelos ecotoxicológicos. Los sistemas estudiados incluyen: la línea celular RTG-2, cultivos primarios de células de granulosa de ovarios bovinos, la bacteria marina Vibrio fischeri, tres especies de microalgas, Chlorella vulgaris, Scenedesmus subspicatus y Selenastrum capricornutum como modelo de vertebrado, el pez zebra fish, Danio rerio. Los efectos subletales también fueron evaluados en los dos tipos celulares utilizando biomarcadores tales como la evaluación del daño al ADN como indicador geonotóxico, la inhibición de la producción de progesterona como indicador de la actividad aromatasa y la inhibición de la actividad del enzima acetilcolinesterasa como indicador de la exposición a los pesticidas la cual también se midió en zebra fish.

Al comparar los resultados obtenidos con la línea celular de pez y los cultivos primarios de mamífero con los resultados de los tests de toxicidad aguda con bacterias, microlagas y peces, fue posible comparar la sensibilidad de las células con los test de toxicidad convencionales.

Se pueden extraer las siguientes conclusiones de este estudio: 1) las líneas celulares pueden ser utilizadas como alternativa al uso de peces en laboratorio; 2) la utilización simultánea de líneas celulares derivadas de peces con los peces in vivo permite evaluar si las respuestas in vitro pueden imitar las respuestas de toxicidad obtenidas con los peces in vivo, así se permite evaluar la relevancia ecológica del test basado en células in vitro; 3) las líneas celulares son el bioensayo más sensible de los utilizados en esta batería; 4) se recomienda el uso de una batería de test multiespecies para determinar la toxicidad de cualquier producto; 5) los test acuáticos que utilizan bacterias o microalgas son interesantes pero no pueden considerarse substitutos de los estudios con peces, porque evalúan el efecto de los tóxicos a otro nivel trófico y; 6) se observan efectos toxicológicos sinérgicos y antagonistas cuando se utilizan las mezclas de pesticidas respecto los compuestos puros.

Gold nanoparticules (GNPs) are of great interest for several applications in nanomedicine ; espacially in imaging and sensing, drug delivery or photothermal therapy because of their unique physical and chemical properties. For all theses applications, a better understanding of the interaction of GNPs with biomolecules and their uptake into cells is of great importance. Thus the main objective of this thesis was to study the toxicity of GNPs in biological media based on their sizes, shapes and surface chemistries. Cytotoxicity studies on human cells were done in vitro in presence of six GNP samples having spherical and flower shapes. We compared the cytotoxic effects and showed that it was largely higher for flower-shaped GNPs than spherical ones. Further we built-up the optical assembly and the set-up of the Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). Followed by the set-up, the sensitivity, the resolution and other parameters were determined during the characterization of the FCS sytem. Then FCS was used to characterize fluorescent molecule-conjugated GNP, wich were fabricated in the interest of biomedical applications. In the next step, we characterized the diffusion behavior of MitoTracker dye labeled mitochondria by FCS in order to be able to compare in future the mitochondrial diffusion after incubating with GNPs, wich is described as the perspectives
Les nanoparticules d'or (NPO) sont d'un grand intérêt pour de nombreuses applications en nanomédecine (en particulier pour l'imagerie, la détection de pathologies, la délivrance de médicaments ou la thérapie photothermique) en raison de leurs propriétés physiques et chimiques. Pour toutes ces applications, une meilleure compréhension de l'interaction des NPO avec les biomolécules et leur absorption dans les cellules est d'une importance primoridale. Ainsi, l'objectif principal de cette thèse était d'étudier la toxicité des NPO dans les milieux biologiques en fonction de leurs tailles, leurs formes et leurs chimies de surface. Des études de cytotoxicité sur des cellules humaines ont été réalisées in vitro, en présence de six types différents de NPO de forme sphérique et de nano-fleur. Nous avons comparé les effets cytotoxiques et montré qu'ils étaient largement supérieurs pour les NPO en forme de nano-fleur par rapport au NPO sphériques. En outre, nous avons mis en place un système de corrélation de spectroscopie de fluorescence (CSF). La sensibilité, la résolution et les principaux paramètres du système ont été déterminés lors de sa caractérisation. La CSF a ensuite été utilisée pour caractériser des NPO fluorescentes fabriquées pour des applications biomédicales. Nous avons également caractérisé la diffusion de Mitotracker, un marqueur des mitochondries par CSF afin d'être en mesure de comparer la diffusion mitochondriale après incubation de NPO

Un problème fondamental pendant l'évaluation in vitro de la toxicité de composés organiques volatils (COVs) est le manque de connaissance de l'évolution de la concentration des COVs à laquelle les systèmes vivants sont exposés au cours des études expérimentales. Ce travail présente un nouveau dispositif expérimental conçu pour étudier l'exposition des systèmes vivants aux COVs. Le dispositif est formé de deux compartiments séparés par une membrane hydrophobe poreuse et permet des durées relativement longues de manipulations sans restreindre la respiration cellulaire. Une modélisation théorique qui couple la conservation de masse et du moment entre les différentes phases et la respiration des cellules hybridomes (ATCC CRL-1606) au sein du dispositif a été développée. Le modèle permet de prédire l'évolution de la concentration des COVs, de l'oxygène et du dioxyde de carbone dans le dispositif. Les résultats simulés pour le transfert des COVs ont revélé une bonne concordance avec les résultats expérimentaux et ont montré que le type de membrane et son diamètre, le coefficient de partage des COVs et la hauteur de la phase liquide ont une influence significative sur l'évolution de la concentration de ceux-ci dans la phase liquide. Néanmoins la disponibilité de l'oxygène au niveau des cellules dépend principalement de la densité cellulaire initiale, de la vitesse spécifique de consommation de ce gaz et de la hauteur du liquide alors que les paramètres liés à la membrane ont une influence sur le contrôle du pH
A major problem during in vitro evaluation of the toxicity of volatile organic compounds (VOC) is the lack of knowledge of the evolution of the concentration of such compounds during the course of experimental studies with living systems. This work presents the design of a novel experimental device for the study of cell culture exposure to VOCs. The device is made of two compartments separated by a porous hydrophobic membrane and allows relatively long durations of handling without restricting cellular breathing. A theoretical modeling which couples mass and moment conservation between the different phases inside the device with the breathing kinetics of hybridoma cells (ATCC CRL-1606) was developed. The model allows predicting the evolution of the concentration of the VOCs, the oxygen and the carbon dioxide inside the device. The simulations of the mass transfer of the VOCs simulated presented a good agreement with experiments and showed that the type of membrane and its diameter, the VOCs partition coefficient and the height of the liquid phase have a significant influence on the evolution of their concentration in the liquid phase. Nevertheless, the availability of oxygen for the cells depends mainly on the initial cellular density, the specific kinetics of consumption of this gas and on the height of the liquid phase, whereas the parameters related to membrane have an influence on the control of the pH

La pollution atmosphérique, et plus particulièrement la pollution particulaire d’origine anthropique constitue l'un des facteurs de risque environnemental les plus importants impliqués dans l’augmentation croissante de la morbi-mortalité liée aux pathologies respiratoires et cardio-vasculaires. Au coeur du domaine qu’englobent les activités pyrotechniques, que ce soit dans le domaine professionnel, civil ou militaire, les fumigènes sont référencés comme producteur important de particules et jouent donc un rôle non négligeable dans l’augmentation de cette pollution particulaire, exposant leurs utilisateurs aux différents aérosols émis.L’objectif général de cette étude exploratoire a été d’apporter des connaissances sur les caractéristiques physico-chimiques ainsi que sur la toxicité pulmonaire in vitro de particules émises lors d’activités pyrotechniques, et plus précisément de particules issues d’armes de petit calibre et de fumigènes.La caractérisation physico-chimique a démontré les particules de tir possédaient une granulométrie assez grossière (entre 3 et 7,5 μm) et étaient composées majoritairement d’éléments métalliques ; contrairement aux particules de fumigène qui appartiendraient à la classe granulométrique des particules fines (< 0,95 μm) et qui seraient majoritairement composées de molécules organiques différentes selon le type de fumigène. L’évaluation de la toxicité a été réalisée par une approche in vitro en utilisant des cellules épithéliales alvéolaires humaines (A549) exposées aux particules de tir et de fumigènes. Une étude de mutagénicité a été conduite à partir d’extraits organiques des particules de fumigènes. Parmi les particules testées, les particules de tir et du fumigène 1 ont induit une cytotoxicité. Les particules de fumigène 1 ont également induit un stress oxydant (augmentation de l’expression de l’ARNm de HO-1), une initiation de la réponse inflammatoire (augmentation de l’expression de l’ARNm d’IL-6 et IL-8) et des effets mutagènes.Les résultats de cette étude comparative ont démontré que les particules issues d’armes de poing et de fumigènes avaient une granulométrie, une concentration atmosphérique ainsi qu’une composition chimique différentes ; caractéristiques physico-chimiques responsables d’effets mutagènes et cytotoxiques différents ainsi que d’altérations des propriétés oxydantes et inflammatoires intrinsèques. Cette étude a mis en évidence la nécessité d’évaluer la toxicité des particules issues d’activités pyrotechniques en développant des moyens expérimentaux adaptés, depuis la collecte des particules jusqu’à l’évaluation de leurs impacts sanitaires
Air pollution, and particulary anthropogenic particulate matter, is one of the most important risk factors involved in the high rate of morbidity and mortality related to respiratory and cardiovascular diseases. In pyrotechnic field, be it professional, civil or military activities, smokes constitue an important particle producer playing a major role in particulate matter emmergence and thereby exposing users to the various emitted aerosols.The main purpose of this exploratory study was to provide knowledge on the physicochemical characteristics of particles emitted during pyrotechnic activities, more specifically particles from gunfire and smokes, and to assess their pulmonary toxicity in vitro.On the first hand, the physicochemical characterization demonstrates that firing particles had a rather coarse granulometry (3 to 7.5 μm) and were mainly composed of metallic elemets, despite smoke particles belong to the category of fine particles (< 0,95 μm) and are predominantly composed of different organic molecules according to the smoke type.On the other hand, in order to assess the pulmonary toxicity of particles, we exposed human alveolar epithelial cells (A549) in vitro to particles coming from either gunfire and to two of the four different smokes (smoke 1 and 4). The results of this study showed that some of these particles (gunfire and smoke 1 particles) induced a mutagenic effects from organic extracts, as well as cytotoxicity. Moreover, particles of smoke 1 were also able to give rise to an oxidative stress (increased HO-1 mRNA expression) and to initiate an important inflammatory response characterized by pro-inflammatory cytokine upregulation (increase in IL-6 and IL-8 mRNA expression).The results of this comparative study demonstrated that particles from gunfire and smoke have different particle sizes and chemical composition. These physicochemical characteristics are responsible for different mutagenic and cytotoxic effects as well as alterations of the intrinsic oxidizing and inflammatory properties. This study also made it possible to understand the different methods of toxicological evaluation of smoke particles

Les trichothécènes, mycotoxines produites par différentes espèces de Fusarium, ont une incidence rapportée dans le monde entier. Ces composés contaminent les produits agro-alimentaires, et sont à l'origine de mycotoxicoses humaines et animales, dont les symptômes se caractérisent entre autres par des troubles hématologiques. L’origine de ces troubles a été recherchée à l'aide d'un modèle de culture de progéniteurs hématopoïétiques granulo-monocytaires (CFU-GM) humains et de rat. Les trichothecenes les plus fréquemment détectes, les toxines T-2, HT-2, le diacétoxyscirpénol (DAS) et le déoxynivalénol (DON) ont été choisis pour mener cette étude. Leurs effets sur la prolifération des CFU-GM ont permis de mettre en évidence leur forte myélotoxicité. Les effets de T-2, HT-2, DAS et DON ont ensuite été recherchés sur la lignée érythroide humaine (BFU-E/CFU-E). Chez l'homme, les BFU-E sont beaucoup moins sensibles aux trichothécènes que les CFU-GM. Néanmoins, la différenciation des BFU-E est affectée par les trichothécènes. Afin de rechercher les cibles cellulaires des trichothécènes, de nouveaux outils d'étude de l'hématotoxicite ont été développés : une technique de culture de CFU-GM permettant la récupération des cellules après 14 jours ; le test MTT, jusqu'a présent non utilisable pour les CFU-GM ; le dosage des protéines totales et de l'activité LDH ; deux techniques d'évaluation des péroxydations lipidiques ; l'évaluation du pouvoir antioxydant de xénobiotiques, appliquée aux CFU-GM. Si la cible cellulaire majeure de T-2 sur les CFU-GM semble être la membrane plasmique, l'activité mitochondriale et les contenus protéiques de ces progéniteurs sont également affectés. Les atteintes membranaires de T-2 ne s'exercent pas par l'intermédiaire de péroxydations lipidiques. D’autre part, les différences de sensibilité entre les CFU-GM humains et de rat semblent s'expliquer par des mécanismes cellulaires différents.

Due à son " turn-over " rapide, le système hématopoi͏̈étique est une cible privilégiée pour la toxicité des xénobiotiques. Le but de ce travail a été l'optimisation des protocoles de tests in vitro d'étude en l'hématotoxicité et myélotoxicité, afin de les rendre plus fiables, reproductibles, et peu onéreux et, en même temps, de réduire l'utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles des tests clonogéniques in vitro ont d'abord été perfectionnés chez l'homme, transférés chez la souris et miniaturisés pour réduire les coûts. On a utilisé les cultures long-terme de moelle osseuse qui ont permis de mieux comprendre le rôle du microenvironnement. La caractérisation approfondie de la moelle osseuse humaine a permis d'aboutir à la définition de nouveaux end-points pour étudier l'hématotoxicité et deux nouvelles lignées cellulaires, dérivant de souris transgéniques, ont été utilisées comme modèle pertinent pour clarifier le rôle des cytokines dans les désordres lymphoprolifératifs
Due to its rapid turnover, the hemopoietic tissue is a sensitive target for xenobiotic toxicity. The aim of the work presented, was protocol optimisation of in vitro tests for hematotoxicity and myelotoxicity, in order to make them more reliable, reproductible and less costly, and to reduce the use of animals. In vitro clonogenic assays were first optimised using human models, then transferred to the murine model and miniaturised for cost reducing. Bone marrow long-term cultures were used to better understand the microenvironnment role. Moreover, human bone marrow characterisation gave rise to new end-points for evaluating hematotoxicity, such as telomerase activity. The study of in vitro model for hematopoietic system is still undergoing development. Two new cellular lines, from transgenic mouse lineage were employed as a useful model for clarifying cytokine role in lymphoproliferative disorders

Dans ce travail, le modèle cellulaire HeLa-CAT contenant le promoteur humain hsp70 couplé au gène de la Chloramphénicol acétyl transférase a été caractérisé vis-à-vis de divers polluants environnementaux et sur des échantillons complexes. Le système répond de façon précoce, i. E. Avant apparition de cytotoxicité, aux métaux lourds et à certains pesticides organochlorés. Avec les chlorophénols, l'induction du gène hsp70 est corrélée à un effet cytotoxique et au caractère lipophile des substances (logKow), révélant un effet aspecifïque (narcotique) conduisant à l'induction du promoteur hsp7O. Enfin, des agents strictement génotoxiques (composés anticancéreux) ou d'autres composés organiques (hydrocarbure polycyclique, autres pesticides) n'induisent pas le promoteur hsp7O. Le modèle est apparu utile pour mettre en lumière le mode d'action des toxiques. Une réponse précoce est liée à un stress oxydant généré par le cadmium ou la TCHQ, ce qui n'est pas le cas avec le pentachlorophénol (PCP). L'importance de la métabolisation hépatique du PCP et du benzo(a)pyrène sur l'expression des HSP est également montrée à l'aide du modèle HepG2. L'application du modèle à quatorze éluats de déchets industriels a montré une proportion importante de réponses positives (78%), une corrélation sigr. . Icative (p<0,01) étant observée entre l'induction hsp7O et la teneur en métaux des échantillons. Des corrélations significatives sont obtenues entre l'induction du gène hsp7O et la mesure de toxicité chronique dans les tests algues (p<0,001) et Ceriodaphnia duhia (p<0,001) ainsi que dans le test de toxicité aiguë sur daphnies (p=0,007). Ces résultats indiquent que l'induction hsp70 mesurée in vitro est pertinente pour prédire des effets in vivo. La validation de ce type de modèle peut être envisagée pour la caractérisation toxicologique de la pollution
Biomonitoring of pollution requires low cost effectiveness and easy to use bioassays. This has stimulated the use of reporter genes systems using stress inducible promoters. In this work, we aimed to characterize the potentiel of a in vitro cellular model containing the hsp ri! promoter linked to the chloramphenicol acetyl transferase gene as a simple test for the screening of environnent pollutants and complex mixtures. An early hsp7O induction, i. E. Before cytotoxicity, was observed with heavy metals and some pesticides. With chlorophenol compounds, hsp70 induction occurs at highly cytotoxic doses. A structure activity relationship is evidenced in relation to the octanol/water coefficient (Kow), showing that hsp7O induction by eight of the organic chemicals studied occurred through a non specific (e. G. Narcotic) process. No promoter induction was noticed with strictly genotoxic compounds (anticancer drags) or with others organies (polycyclic hydrocarbons, others pesticides). The patterns of gene expression shows the relevance of the cellular model to study the mechanisms leading to hsp70 induction. In HeLa cens, hsp70 induction by cadmium or tetrachlorohydroquinone (TCHQ), but not by pentachlorophenol (PCP), was mediated by an oxidative stress. On the second band, the influence of PCP and benzo(a)pyrene metabolization by cytochrome P4501A on HSP expression is suggested in HepG2 cells. Eventually, HeLa-CAT cells were applied to evaluate the in vitro toxicity of fourteen industrial wastes. Most of the tested samples (78%) induced the hsp7O promoter, showing a good correlation (p<0. 01) with metal content. Significant correlation were also observed between the in vitro test and in vivo ecotoxicity tests with algae (p<0. 001), Ceriodaphnia dubia (p<0. 001) 1ndDaphnia magna (p=0. 007). It appears that the proposed cellule model would be a good predictor of chronic toxicity on aquatic organisms and is pertinent to detect metals toxicity in complex mixtures. Its use in a battery of tests can be envisioned for the toxicological characterization of pollution

La barrière hémato-encéphalique (BHE), localisée au niveau des capillaires cérébraux, contrôle les échanges entre le sang et le compartiment cérébral et assure ainsi le maintien de l'homéostasie du système nerveux central (SNC). La présence de la BHE est un atout lors du développement de médicament à visée périphérique. En effet, en limitant le passage de nombreuses molécules, la BHE protège le SNC des effets potentiellement neurotoxiques de ces molécules. Toutefois, l‟exposition des cellules endothéliales des capillaires cérébraux à des agents chimiques est susceptible d‟engendrer une augmentation transitoire de la perméabilité de la BHE. Cette augmentation peut perturber l‟homéostasie cérébrale et permettre l‟entrée massive de molécules potentiellement neurotoxiques dans le SNC. La prise en compte de la BHE en amont de l‟étude de la neurotoxicité d‟un médicament est donc un élément important. De plus, la majorité des médicaments sont utilisés de façon chronique et les effets secondaires indésirables résultant d‟une administration chronique sont fréquemment liés à une atteinte cérébrale. Afin de répondre à cette problématique, notre modèle in vitro de BHE, qui consiste en une co-culture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales, a été adapté à l‟étude de la toxicité de molécules lors d‟un traitement prolongé. Les propriétés protectrices de la BHE deviennent une contrainte importante lors du développement de médicament à visée cérébrale. En effet, la présence de la BHE explique en partie les taux de succès très faibles des molécules lors du développement de médicaments à visée cérébrale. Afin de limiter les taux d‟échec, il est nécessaire de prédire efficacement la distribution cérébrale des composés en prenant en compte la BHE. Or, il est admis que l‟effet pharmacologique est lié à la concentration libre du médicament au niveau de sa cible. Ainsi, les nouvelles approches visent à prédire la concentration libre que la molécule atteindra dans le cerveau. Toutefois, les méthodes existantes pour prédire ce paramètre reposent sur une méthodologie in vivo et ne présentent pas un débit suffisant pour être utilisées lors des phases précoces du développement de médicaments. Une méthodologie in vitro pour obtenir le ratio de concentrations libres d‟une molécule entre le cerveau et le sang a été développée pour répondre à ce besoin. Le travail réalisé a permis de développer deux méthodologies in vitro. La première permet de prédire la toxicité chronique des molécules. En prédisant le ratio des concentrations libres entre le compartiment cérébral et sanguin des composés, la seconde facilite la sélection des médicaments candidats lors du développement de médicaments à visée cérébrale. Ces méthodologies pourront donc contribuer à diminuer les taux d‟échecs lors des phases précliniques et cliniques du développement de médicaments
The blood-brain barrier (BBB), located at the level of brain capillaries, is responsible for brain homeostasis maintenance by tightly controlling blood-borne substances access to the brain. The presence of the BBB is an asset during peripheral drug development. Indeed, the BBB protects the central nervous system (CNS) against potential neurotoxic effects of compounds by strongly limiting their passage. However, exposure of brain capillaries endothelial cells to chemical agents is likely to cause a transient increase in BBB permeability. This increase can disrupt brain homeostasis and allow the massive entry of potentially neurotoxic molecules in the CNS. Hence, taking into account BBB toxicity in alternative neurotoxicity studies is important. In addition, the CNS side effects of several drugs used chronically could be at least partly attributed to their toxicity at the level of the BBB causing unwanted, indirect effect on brain cells. To address this issue, our in vitro BBB model, which consist of a co-culture of brain capillary endothelial cells and glial cells, has been adapted to the evaluation of repeated-dose toxicity at the BBB. The protective properties of the BBB become a major hurdle during CNS drug development. One way to reduce theimportant attrition rate, consists in predicting the CNS distribution of drug candidates early in CNS drug discovery programs. The use of unbound brain concentrations has been shown to provide the best correlations with pharmacological data. Hence, new approaches aim to predict the free brain concentration of compounds. However, the determination of free brain / free plasma ratios requires both in vitro and in vivo experiments that are both animal and time consuming. Consequently, we have explored the possibility to directly generate free brain / free plasma ratios under steady-state and non-steady state conditions in our in vitro BBB model, thereby greatly simplifying existing experimental procedures.. The work presented herein aimed to develop two in vitro methodologies. The first one allows the study of repeated-dose BBB toxicity. The second one allows free brain / free plasma ratios assessment using an in vitro model of the blood brain barrier, which can drive the selection of CNS drug candidates with the most favourable target engagement. The use of these two methodologies may help to reduce attrition rates in drug discovery and development by appreciating the eventual central toxicity of systemic drug associated with BBB dysfunction and by identifying centrally acting-compounds with a desirable in vivo response in the CNS early on in the drug discovery process

Les trichothécènes, mycotoxines produites par différentes espèces de moisissures, sont à l'origine d'intoxications alimentaires graves qui touchent aussi bien l'animal d'élevage que l'homme. Les intoxications alimentaires humaines dues aux mycotoxines sont en général accidentelles. Les maladies décrites à la suite d'intoxications aux trichothécènes sont principalement l'Aleucie Toxique Alimentaire (ATA) rencontrée dans les pays d'Europe de l'Est et les pays en voie de développement, la Stachybotryotoxicose, rencontrée en Europe de l'Ouest et en Amérique du Nord, et " l'Akakabio disease " rencontrée dans le Sud-Est asiatique. L'origine de ses troubles est hématologique. En effet, les trichothécènes sont connues pour leur hématoxicité mais également pour leur immunotoxicité. Une cellule fait le lien entre ces deux toxicités : la cellule dendritique. Les cellules immunitaires sont produites par des cellules souches, au sein de la moelle osseuse. Parmi ces cellules, la cellule dendritique apparaît comme la cellule initiatrice de la réponse immunitaire primaire, capable de stimuler la prolifération des lymphocytes T naïfs. Le but de ce travail est de développer un modèle humain utilisant les cellules dendritiques générées in vitro à partir de monocytes. Ce modèle permettant d'étudier les effets de xénobiotiques sur la maturation des cellules dendritiques. Pour réaliser cette étude, il s'est avéré nécessaire de choisir un modèle cellulaire pertinent et d'optimiser ce modèle pour l'adapter à l'étude des effets immunotoxiques de contaminants de l'alimentation. Ce travail montre l'importance des études réalisées in vitro sur les cellules dendritiques humaines dans la compréhension des effets immunotoxiques de contaminants alimentaires. Il paraît pertinent de proposer que ces études soient réalisées très en amont au cours de l'exploration d'un effet immunotoxique
The trichothecenes, mycotoxins produced by various species of moulds, are at the origin of serious food poisonings which touch as well the livestock as the man. The human food poisonings due to the mycotoxins are in general accidental. The diseases described following intoxications with trichothecenes are mainly Aleucie Toxique Food (ATA) met in the countries of Eastern Europe and the countries in the process of development, Stachybotryotoxicose, met in Western Europe and North America, and “Akakabio disease” met in the South-East Asia. The origin of its disorders is hematologic. Indeed, the trichothecenes are known for their hematoxicity but also for their immunotoxicity. A cell establishes the link between these two toxicities: the dendritic cell. The immunizing cells are produced by cells stocks, within osseous marrow. Among these cells, the dendritic cell seems the initiating cell of the immunizing answer primary, able to stimulate the proliferation of the lymphocytes T naive. Taking into account the immunotoxicity of the mycotoxins, primarily on the lymphocytes T, it seemed relevant to study the effects of these molecules on the dendritic cells. To make this study, it proved to be necessary to choose a relevant cellular model and to optimize this model to adapt to the study of the adverse effects of contaminants of the food. The model using the CD34+ involves the majority formation of cells of Langerhans (dentritic cells of the skin). These last are implied in the cutaneous reactions, without interest for the study of the effects of food contaminants. This is why the choice was made on dendritic cultures of cells deriving from monocytes, rather than of cells CD34+. The aim of this work is to develop a human model using the dendritic cells generated in vitro from monocytes. This model allowing to study the effects of xenobiotic on maturation of the dendritic cells. This work shows the importance of the studies carried out in vitro on the human dendritic cells in the comprehension of the immunotoxic effects of food contaminants. It appears relevant to propose that these studies are carried out very upstream during the exploration of a immunotoxic effect

L'utilisation de matériaux semi-conducteurs est aujourd'hui en plein essor dans le domaine des nanobio technologies, notamment pour l'imagerie médicale. En particulier, les particules luminescentes magnétiquement diluées semblent être très prometteuses en tant que nanosondes bimodales en imagerie par résonance magnétique (IRM) et l'imagerie par fluorescence optique (EFO). Ce travail de thèse présente, dans un premier temps, l'optimisation du protocole de synthèse en milieu polyol de nanoparticules de type Zn₁₋MxS (x < 0,4) paramagnétiques et luminescentes. Puis, nous nous sommes intéressés à la préparation d'une solution aqueuse colloïdale de ces nanoparticules après leur fonctionnalisation par l'acide mercaptoacétique. Par ailleurs, en plus des caractérisations magnétiques effectuées sur les poudres, les résultats IRM effectués sur les colloïdes ainsi préparés confirment le comportement paramagnétique des particules de Zn₁₋xJMxS avec des valeurs de relaxivité longitudinale ri, mesurées à l'ambiante et à 3. 0 T, de 20 et 74 mM⁻¹. S⁻¹ pour une teneur respective en Mn²⁺ de 10 et 30 %. De plus, ces colloïdes émettent dans le visible (bleu) après une excitation à 405 nm. Pour permettre une éventuelle application de ces systèmes comme sondes, l'évaluation des risques de cyto- et génotoxicité des particules est indispensable. Elle a été réalisée sur des cellules ovariennes de hamster chinois (CHO) et a montré l'absence d'effets cyto- et génotoxiques avérés dans la gamme de concentrations étudiées (1 - 100 ug/mL) sur ces cellules. Ces résultats forts prometteurs, nous encouragent à considérer sérieusement les nano-objets préparés comme nanosondes bimodales pour l'imagerie duale par IRM et IFO
Semi-conductive nanomaterials have become of great interest lately in biotechnology area especially in medical imaging. Typically, magnetically diluted luminescent nanoparticles offer a real profit as potentially being bimodal probes in magnetic resonance imaging (RMI) and optical fluorescence imaging (OFI). The present work, firstly deals with the optimization through a polyol process of the synthesis of paramagnetic and fluorescent Zn!. XMnxS (x < 0,4) nanoparticles, secondly their functionalization with mercapto-acetic acid and eventually the preparation of their aqueous based colloids. The magnetic characterization and MRI measurements performed on post functionalized nanoparticles respectively before and after their dispersion as stable colloids both confirm the paramagnetic behavior of Zni_xMnxS (x < 0,4) nanomaterials. Indeed, regarding MRI, longitudinal relaxivity r₁ at room temperature and at 3. 0 T is of 20 and 74 mM⁻¹. S⁻¹ for a Mn²+ amount of respectively 10 and 30 %. Moreover, these colloids emit in the visible light range (blue) when excited at 405 nm. The use of these probes in any possible medical application is not conceivable unless their cyto- and genotoxicities are evaluated. Therefore, a serious study was carried out on chinese hamster ovarian cells (CHO) and evidenced the absence of any cyto- or genotoxic effects on these latter in the range of the nanoparticle studied concentrations (1-100 Hg/mL). These results make us seriously consider the ZnMnS hybrids as potential bimodal probes for dual MRI and OFI imaging

Orientadores: Nelci Fenalti Hoerhr, Roberto Rittner Neto
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-06T21:30:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sega_EstelaMunhoz_M.pdf: 1403353 bytes, checksum: 0aec5b888298032d359cc1b3cf0905b6 (MD5) Previous issue date: 2006
Resumo: Esse estudo analisou as propriedades toxicológicas de novos compostos organofosforados. Foram realizados experimentos para avaliar a atividade anticolinesterásica desses organofosforados, in vitro, no sangue total através do método de Ellman modificado. Para determinar a sua citotoxicidade foram utilizadas células PC 12, com as quais avaliamos a viabilidade celular após contato com os organofosforados e determinamos a IC 50, encontrando valores muito diferentes para os diversos organofosforados estudados. Estudos de toxicidade aguda in vivo foram realizados com camundongos, através da metodologia recomendada pela OECD nos quais determinamos a DL50 para três dos organofosforados estudados, sendo que um apresentou toxidade moderada. Foram analisados os efeitos dos solventes nas constantes de acoplamento JHH, JHH, JNC e 2Jnc em espectros de RMN de LH e 13C do cloreto de acetilcolina. Os valores das constantes de acoplamento em solventes de diferentes constantes dielétricas (s) não sofreram variações, indicando uma ausência de efeitos de solvente no equilíbrio conformacional do cloreto de acetilcolina (ACh). As constantes de acoplamento mostram que o sistema OCH2CH2N+ tem uma conformação gaúche (sinclinal). O Jnh e Jkc são observados na maioria dos solventes, mas não em solventes clorados e não são dependentes da viscosidade do solvente, esse comportamento foi explicado usando dados de medidas de Ti. Os valores dos coeficientes de difusão de RMN mostraram que a ACh tem uma grande tendência de se agregar quando dissolvida em solventes clorados, fato que pode explicar as diferenças observadas em valores de T1 para o 14N
Abstract: This study analyzed the properties of the news organophosphorus. Experiments had been carried through to evaluate the inhibition of acetylcholinesterase of these organophosphorus, in vitro, through the modified EUman's method. In order to determine its cytotoxicity cells PC 12 had been used, with which we evaluate the cellular viability after contact with the organophosphorus and determined the IC50, different values were found for the diverse organophosphorus. Studies of acute toxicity had been carried through with mice, following the methodology recommended by the OECD in which determine the DL50 for three of the organophosphorus studied, being that one presented moderate toxicity. Coupling constants values ( Jhh and Jnc) obtained from the 'H and 13 C NMR spectra of acetylcholine chloride (ACh) in several solvents with a wide range of dielectric constants (e) are remarkably invariant, indicating an absence of solvent effects in the conformational equilibrium of this compound. Those values show that the OCH2CH2N+ system occurs in a synclinal conformation. The Jnh and Jnc are observable in most solvents, but not in chlorine-containing solvents and are not dependent on solvent viscosity. This behavior was explained using data from Ti measurements. The measurement of NMR diffusion coefficients show that ACh has a greater tendency to aggregate when dissolved in chlorinated solvents, a fact that could explain the observed differences in 14N T1
Mestrado
Patologia Clinica
Mestre em Ciências Médicas

Après une étude bibliographique actualisée des différents modèles-feu de laboratoire et à grande échelle (dits semi-naturels) tentant d'objectiver ou de prédire les risques liés à la décompo­sition thermique des matériaux, deux nouveaux fours de laboratoire ont été mis au point. Ils ont l'avantage de prendre en compte l'énergie radiative des parois. L'un correspond à des conditions aéronautiques (débit d'air, géométrie de la cellule), l'autre est plus adapté aux conditions de feux dans les bâtiments et constitue un modèle à zones de température classiquement admis. Ce dernier permet également de prendre en considération les trois caractères fondamentaux du comportement des matériaux à l'incendie : inflam­mabilité, vitesse de combustion, toxicité des "fumées". La toxicité des atmosphères a été évaluée par voie analytique mais surtout par voie biologique par des critères létaux et sublétaux. Les intoxications ont été d'une part menées en ventilation contrôlée (toxicité suraiguë alvéolaire estimée par les déréglements de l'électro-encéphalogramme, électro-cardiogramme, pression artérielle et les modifications des paramètres sanguins) et d'autre part en ventilation spontanée (létalité, incapacitations, déréglement métabolique et atteinte du revêtement alvéolaire). Dans tous les cas, les capacités de récupération des animaux ont été estimées. Quatorze matériaux naturels et synthétiques ont été étudiés, représentant les principales classes utilisées en avionique et dans le bâtiment. Dans le but de classer ces matériaux en fonction de leur comportement au feu et de la toxicité de leurs produits de thermo­lyse, nous avons fait appel d'une part à une méthode d'analyse factorielle multivariée et d'autre part à une méthode qualitative d'évaluation des risques globaux dite des déclassements comparés.

Le chlorothalonil (2,4,5,6-tetrachloroisophtalonitrile) est un fongicide de contact employe en agriculture. Ce pesticide est nephrotoxique chez les rats mais ne l'est pas chez le chien. Il est classe par l'epa dans la categorie b 2 ou cancerigene probable chez l'homme. Le metabolisme du chlorothalonil chez les mammiferes passe par la conjugaison au glutathion suivie d'une succession de reactions enzymatiques donnant lieu a la formation de conjugues cysteine, d'acides mercapturiques, de metabolites thiols et thiols methyles. Nous avons compare la transformation in vitro du chlorothalonil et de conjugues au glutathion et a la cysteine par les contenus stomacaux, duodenaux et ccaux ou coliques de rats, de chiens et d'homme. Le chlorothalonil a ete transforme de facon qualitativement similaire entre les especes etudiees en metabolites 2,5,6-trichloroisophthalonitrile, 2,5,6-trichloro-4-hydroxy-isophthalonitrile, 2,5,6-trichloro-4-thioiso-phthalonitrile et 2,5,6-trichloro-4-methylthio-isophthalonitrile. L'absorption et la transformation in vitro du chlorothalonil et de conjugues au glutathion et a la cysteine par la muqueuse gastro-intestinale de rats conventionnels, de rats axeniques et de chiens ont ete etudiees en utilisant la technique des sacs digestifs retournes. Il s'est avere que l'absorption est tres faible quel que soit le substrat utilise. Des metabolites thiols methyles du chlorothalonil ont ete formes et absorbes en tres faible quantite. Par ailleurs, nous avons compare le metabolisme in vivo du chlorothalonil chez les rats conventionnels, axeniques et chez les chiens. Il semblerait que le metabolisme du chlorothalonil entre rats conventionnels et axeniques soit similaire. La quantite de metabolites thiols methyles excretes dans l'urine est plus importante chez les rats conventionnels que chez les chiens.

Les nanoparticules (NPs) représentent un danger potentiel pour la santé des travailleurs et du grand public, notamment en cas d’exposition par voie respiratoire. Si une NP est évaluée in vivo comme toxique chez l’animal, cela peut inciter à prendre des mesures pour réduire l’exposition de l’Homme à celle-ci, avant qu’il y ait des conséquences sanitaires graves. Les études in vivo sont donc d’une importance capitale afin de diminuer les potentiels risques sanitaires des NPs pour l’Homme. Néanmoins, dans un contexte de réduction du nombre d’animaux utilisés et compte tenu du nombre important de NPs existantes et de leur grande diversité physico-chimique, la toxicologie a besoin de modèles alternatifs, comme le in vitro, permettant de prédire de manière fiable les potentiels effets pulmonaires chez l’Homme. Des progrès importants ont été faits pour développer des modèles in vitro pulmonaires plus physiologiques et des méthodes d’exposition permettant de simuler l’inhalation de NPs in vitro. Cependant, des incertitudes existent quant à la capacité de ces nouveaux modèles in vitro à prédire les réponses observées in vivo dans les poumons après exposition à des NPs. Dans ce contexte, l’objectif de ce travail a été d’évaluer la capacité de plusieurs méthodes in vitro, de complexité différente, à prédire les effets toxiques observés in vivo chez le rat après exposition aiguë (24h) pulmonaire à des NPs métalliques faiblement solubles de TiO2 et de CeO2. Dans un premier temps, des expérimentations in vitro ont été effectuées afin d’évaluer si exposer des cellules alvéolaires à l’interface air-liquide (ALI) à des aérosols de NPs de TiO2 et de CeO2, générait des résultats différents par rapport à des expositions classiques à des suspensions en submergé. Dans un second temps, des expérimentations in vivo par aspiration intratrachéale ont été réalisées afin de comparer les réponses toxiques pulmonaires in vitro avec celles obtenues in vivo. Pour comparer les réponses pulmonaires in vivo et in vitro, des référentiels de dose similaires, notamment la masse par unité de surface ou par macrophage, ont été utilisés. Après 24h d’exposition, des réponses biologiques significatives (inflammation principalement) ont été observées in vitro à des doses inférieures à l’ALI par rapport au submergé. Nous avons par ailleurs souligné la nécessité de prendre en compte les doses réellement déposées sur les cellules ainsi que le débit de dose pour effectuer les comparaisons entre les deux méthodes d’exposition in vitro utilisées. Nous avons ensuite comparé les résultats in vitro avec ceux obtenus in vivo. Nous avons constaté que la méthode ALI générait des résultats plus prédictifs du in vivo, en termes de niveau d’activation des réponses toxiques à 24h. Finalement, nous avons établi un classement des quatre NPs utilisées dans notre étude et celles-ci ont été classées similairement in vivo et in vitro et quelle que soit la méthode utilisée in vitro. Nous avons par ailleurs montré l’importance de considérer la surface active des NPs pour établir ce classement. En conclusion, notre approche nous a permis de mieux évaluer le fossé existant entre le in vivo et le in vitro. Nos résultats soulignent l’intérêt d’utiliser des méthodes in vitro plus réalistes et plus proches de la physiologie humaine dans le but de modéliser les potentiels effets indésirables des NPs pour l’Homme. Cela ouvre des perspectives quant à l’utilisation et au développement de méthodologies in vitro de plus en plus représentatives des conditions d’exposition in vivo
Nanoparticles (NPs) represent a potential danger for workers and public, especially after inhalation. When a NP is shown toxic for the lungs in vivo in animals, this can incite regulators to implement measures to reduce human exposure risks. The in vivo studies are thus of utmost importance in reducing the potential health risks for humans. However, in a context of a diminution in the number of animals used in experimentations and considering the high number of NPs used and their physicochemical diversity, there is an urgent need for alternative methods, like the in vitro, which could be used to predict the potential health effects of NPs in human. Many progresses have been made recently to develop more physiological cell models and exposure methods simulating the inhalation of NPs in vitro. Nevertheless, uncertainties remain regarding the capacity of these new in vitro methods to predict the biological responses observed in vivo into the lungs after exposure to NPs. In this context, the aim of our study was to assess the ability of several in vitro methods, differing in complexity, to predict the adverse responses observed in vivo in rat lungs after acute exposure (24h) to several metallic and poorly soluble TiO2 and CeO2 NPs. For this, in vitro experimentations were first performed to assess if exposing alveolar cells in monoculture or in co-culture at the ALI interface to aerosols of NPs, generated different results compared to classic exposure in submerged conditions to suspensions. In a second step, rats were exposed by intratracheal aspiration of NP suspensions to compare the biological responses in vitro to those obtained in vivo. To compare the pulmonary responses in vivo and in vitro, similar dose metrics were selected, including the mass per surface unit or per macrophage. After 24h of exposure, significant biological responses (mostly inflammation) were observed at lower doses at the ALI compared to in submerged conditions. Moreover, we highlighted the necessity to take into account the deposited dose on the cells and the timing of the dose delivery in order to compare the two exposure methods used in vitro. When we compared the responses in vitro to those observed in vivo, we noticed that the ALI methods generated more predictive results than the submerged one, in term of biological activation levels after 24h of exposure. Finally, a ranking of the four NPs used in our study was provided and the NPs were ranked similarly both in vivo and in vitro and whatever the exposure method used in vitro. We also showed the importance of the surface area when ranking the poorly soluble NPs. In conclusion, the gap existing between the in vivo and the in vitro has been evaluated in our study. Our results highlighted the relevance of using more realistic in vitro exposure methods to model the potential adverse effects of NPs for human. This brings perspectives about using and developing in vitro methods mimicking more closely the in vivo exposure conditions

L'objectif de la thèse est de développer et d'évaluer une approche alternative pour prédire les profils cinétiques de molécules chez l'Homme. Dans cette approche, la disposition de substance dans l'organisme est décrite par un modèle PBPK. Ce dernier est paramétré en utilisant des outils statistiques et diverses sources d'informations. La paramétrisation du modèle PBPK dans le cadre d'une approche intégrée in silico/in vitro a été évaluée. Nos résultats ont montré que la pertinence des prédictions du profil cinétique dépend de la qualité des données et de l'état de notre connaissance sur la molécule. La possibilité d'échec de la méthodologie est donc importante. Nous avons alors évalué 2 pistes pour améliorer la prédictibilité de l'approche. Tout d'abord, nous avons évalué un nouveau système dynamique in vitro développé à l'UTC. Ce dernier offre un environnement plus réaliste pour les cellules en culture par rapport aux systèmes classiques; l'espoir étant d'améliorer la pertinence des estimations in vitro. Notre travail a porté sur la modélisation de cinétiques in vitro dans le système. Nos résultats préliminaires sur le métabolisme hépatique sont encourageants. Ensuite, nous avons évalué la généralisation de l'approche intégrée in silico / in vitro en intégrant d'informations in vivo disponibles chez l'Homme. Nous avons choisi l'ifosfamide comme preuve de concept. Nos résultats ont montré que toutes les données (QSAR, in vitro et in vivo) étaient nécessaires pour paramétrer le modèle. Enfin, nous avons montré un bon niveau prédictif du modèle paramétré en réalisant des exercices d'extrapolation entre différentes doses d'administration et entre individus de différent âge
In this work we report calibration methodologies of PBPK models using methods that are alternatives to animal experimentations. Our aim was to develop predictive PBPK models of xenobiotics disposition in humans. PBPK / in vitro / in silico approaches have already been implemented in several commercial PK softwares. We evaluated the predictability of this approach and showed that the goodness of the PK predictions was widely dependent on the precision of ADME parameters estimation, in particular relative to partition coefficients and metabolic parameters. To increase the predictability of PBPK models, we investigated two approaches. First we investigated the development of realistic techniques like cell microchips which provide an in vivo-like environment for cells in culture and may lead to more accurate estimations of ADME parameters, notably metabolism. We evaluated preliminary metabolic data obtained on a hepatic cells microchip developed by UTC. For this purpose, we proposed a mathematical model that account for the unspecific binding to the device and cell constituents. Our results showed that the metabolic clearance predictions were equally or more accurate than the predictions made using static devices. Second the calibration of PBPK models may combine in silico, in vitro information together with in vivo data available for humans like blood concentrations. To illustrate this PBPK / QSAR / in vitro / in vivo approach, we developed a PBPK model for ifosfamide. This exercise emphasized the complementarities of the several information sources used in the calibration step. Once parameterized, the model was used to extrapolate between doses and population groups

En vue d’une meilleure compréhension des phénomènes toxiques de la colchicine, nous avons entrepris l’étude « in vitro » de son métabolisme et de son éventuelle fixation covalente aux protéines hépatiques, ceci à l’aide de produits radiomarqués. Compte tenu de la complexité de la molécule de la colchicine il nous a semblé préférable d’introduire l’isotope dans le squelette. Nous avons donc élaboré un schéma réactionnel qui permettait d’accéder à la colchicine marquée sur le carbone en position 7. Afin de vérifier la fiabilité du schéma envisage et de préciser les conditions expérimentales pour chacune des 17 étapes, une synthèse en « traceur » a tout d’abord été réalisée. Par la synthèse à haute radioactivité spécifique (AS=55 mCi=2035 MBq/mmol) la (+/-) colchicine ¹⁴C-7 a été préparée avec un rendement de 2,5% à partir de 1700 mCi de carbonate de baryum ¹⁴C. Conjointement, la colchicine (méthoxyle-1¹⁴C) a été préparée par une méthode de marquage rapide sur un groupement latéral. Une étude préliminaire du métabolisme « in vitro », à l’aide de cette molécule radio marquée et de microsomes de foie de rats, a permis de mettre en évidence la fixation covalente de la colchicine aux protéines hépatiques ; sa dépendance vis-à-vis des monooxygénases à cytochrome P-450 a été confirmée. L’analyse des extraits organiques de ces incubats, par CLHP, permet de confirmer la présence de deux métabolites déjà décrits par SCHONHARTING : les déméthyl-2 et 3 colchicines. Trois nouveaux métabolites sont observés mais nous ne disposons pas de quantités pondérales suffisantes pour leur analyse structurale. En vue de l’élaboration d’un dosage de ce médicament par radio-immunologie nous avons synthétisé trois haptènes de la colchicine, dont les modifications portent sur les différents cycles, puis effectué leur conjugaison au sérum albumine bovine. La molécule de colchicine marquée au carbone 14 dans le noyau nous permettra d’approfondir les études métaboliques abordées lors de ce travail.

Cette étude a porté sur la recherche de nouveaux chélateurs du manganèse. La première partie est consacrée à la mise au point d'un protocole d'intoxication subchronique. La voie intraperitoneale a été retenue pour intoxiquer les rats, la voie orale n'étant pas suffisamment efficace, puisque moins de 2% du manganèse ingéré est absorbé. Ce résultat permet d'en déduire que les risques d'intoxication alimentaire sont très faibles voire nuls. Une accumulation de manganèse a été mise en évidence dans des tissus ciblés déjà connus (rate, système nerveux central, os, globules rouges), mais également dans la moelle osseuse. Dans nos conditions d'intoxication, l'accumulation de manganèse dans le cerveau n'a pas entraîné des modifications neurochimiques et histologiques. La deuxième partie de ce travail porte sur l'étude in vivo de nouveaux chélateurs préalablement sélectionnés, pour leur bon pouvoir complexant vis-à-vis du manganèse, par une étude technique in vitro. Les composés les plus efficaces in vitro (acides polyaminopolycarboxyliques) n'ont provoqué qu'une détoxification partielle de l'organisme; ils sont restés sans effet sur le manganèse fixé dans les globules rouges (hémoglobine). Ces résultats nous ont conduit aux hypothèses suivantes : le manganèse (Mn2+), aux propriétés chimiques voisines de celles du fer (Fe2+), se fixerait à la place de ce dernier non seulement dans l'hémoglobine, ce qui est déjà connu, mais également dans les cytochromes de la chaîne respiratoire. Ce ce fait, en se basant sur les potentiels redox standard des cytochromes contenant du manganèse, il a été possible de montrer l'incapacité de ces structures à réduire l'oxygène. Cette réduction incomplète de l'oxygène conduirait à la formation de radicaux libres qui sont susceptibles d'altérer les cellules et d'oxyder la dopamine en benzoquinones, impliquées dans les symptômes neurologiques observés dans les cas de manganisme
This study dealt with new manganese chelating agents. The first part is devoted to the development of a subchronic intoxication protocol. Rats were intoxicated by intraperitoneal injections, the oral route being not sufficiently effective since less than 2%of the ingested manganese are absorbed. This result suggests that the risks of intoxication by diet are very weak even null. Accumulation of manganese was observed in well-known target issues (spleen, central nervous system, bones, erythrocytes), but also in bone marrow. In our experimental conditions, the presence of manganese in the brain induced no neurochemical or histological modifications. The second part of this work concerns the in vivo study of new chelating agents selected beforehand for their in vitro effectiveness to complex with manganese. The most effective compounds in vitro (polyaminopolycarboxylic acids) caused only a partial detoxification of the organism; they remained without effect on manganese bound to the erythrocytes (haemoglobin). This results led us to the following assumptions : manganese (Mn2+), which chemical properties are close to those of iron (Fe2+), would take the place of this last not only in haemoglobin, that is already known, but also in the cytochromes of the respiratory chain. So, based on the standard redox potentials of the cytochromes containing manganese, it was possible to show the inability of these structures to reduce oxygen. This incomplete oxygen reduction would lead to the formation of free radicals which are capable of accelerating cells aging and oxidizing dopamine in benzoquinones, implied in the neurological symptoms observed in chronic manganism

En cas de contamination cutanée radiologique par des composés d’uranium, les seuls traitements actuellement employés consistent en un rinçage de la zone contaminée par de l’eau et des détergents, ou par une solution de sel calcique de l’acide diéthylène-triamine-pentaacétique (Ca-DTPA). Ces derniers ne sont cependant pas efficaces vis-à-vis de l'uranium. De plus, en l'absence de traitement d'urgence, le passage transcutané de ce radionucléide est rapide, et induit une exposition interne après sa distribution dans l’organisme par le biais de la circulation sanguine. Une partie de l'uranium ainsi biodisponible est alors stockée dans les organes cibles que sont principalement les reins et le squelette, où ses effets toxiques se manifestent. C'est pourquoi une formulation topique consistant en une nanoémulsion huile dans eau, incorporant des molécules de calixarène tricarboxylique en tant qu'agent chélatant spécifique de l'uranium, a été initialement développée. Les travaux menés dans le cadre de cette thèse visent à évaluer l'efficacité de décontamination ex vivo et in vivo de ce nouveau traitement d'urgence à la fois sur peaux intactes et sur peaux lésées superficiellement. Pour cela, le modèle d'excoriation a été utilisé. Des modèles de lésions reproductibles ont également été mis en place afin de mimer des incisions par micro-piqûres et microcoupures. Ces études démontrent que la nanoémulsion de calixarène pourrait constituer un traitement de décontamination efficace, moins agressif que l’emploi de l’eau savonneuse actuellement employée. Sa potentielle toxicité cutanée a également été évaluée in vitro par l'utilisation d'épiderme humain reconstitué, combinée à trois différents tests de toxicité (MTT, LDH et IL-1-α). Dans le cadre de ces études, il a ainsi été démontré que la nanoémulsion de calixarène n’induit pas de toxicité cutanée, même après un temps de contact prolongé jusqu'à 24 h
In case of radiological skin contamination by uranium compounds, the only treatments currently available consist in rinsing the contaminated skin area with water and detergent, or with a calcium salt of diethylene triamine pentaacetic acid (Ca-DTPA) solution. However, these procedures are not specific and no efficient treatment for cutaneous contamination due to uranium exists. In the absence of such treatments, uranium diffusion through the skin is fast, inducing an internal exposure after its distribution inside the body through the bloodstream. One part of the bioavalaible uranium is uptaken in target organs which are the kidneys and the skeleton, where its toxic effects occur. Therefore a topical formulation consisting of an oil-in-water nanoemulsion incorporating a tricarboxylic calixarene molecule, as a specific chelating agent for uranium, was previously developed. The work achieved in this thesis aimed at evaluating the ex vivo and in vivo decontamination efficiency of this new emergency treatment on intact and superficially wounded skin. For this purpose, skin excoriation model was used. Reproducible models of superficial wounds consisting of micro-cuts and micro-punctures were also developed in order to evaluate the efficiency of the nanoemulsion on physical wounds such as incisions. These studies showed that the calixarene nanoemulsion could be an efficient decontaminant treatment, less aggressive than using the current treatment: soaped water. Its potential cutaneous toxicity was evaluated on in vitro reconstructed human epidermis using three different toxicity tests (MTT, LDH and IL-1-α). These studies demonstrated that the calixarene nanoemulsion did not induce skin toxicity even after 24 h of exposure time

Un prion est une protéine de l’hôte capable d’acquérir une conformation pathogène et transmissible. Chez les mammifères, le prion est impliqué dans des pathologies neurodégénératives. La protéine qui nous intéresse, Ure2p, est un prion modèle de la levure Saccharomyces cerevisiae. Lors de mon travail de thèse, nous avons documenté la structure de Ure2p dans les fibres et montré que les domaines N- et C-terminaux de la protéine sont en interaction et impliqués dans la structure de la fibre. Nous avons aussi identifié avec des collaborateurs de l’Université de Florence certaines formes de Ure2p qui sont toxiques pour les cellules de mammifère puis nous avons cherché les raisons de cette toxicité. Enfin, nous avons étudié l’effet de facteurs cellulaires et de composés naturels sur la modulation de l’assemblage de Ure2p in vitro. Dans ce but, nous avons documenté l’effet des chaperons moléculaires sur la réaction d’assemblage en fibres et avons criblé la protéine avec une banque de composés d’origine naturelle
A prion is a host-encoded protein able to misfold into a pathological and transmissible conformation. In mammals, such protein is involved in neurodegenerative diseases. In this work we report the study of the Ure2p yeast prion model from the Saccharomyces cerevisiae. During my thesis, we documented the structure of Ure2p within fibrils and have shown that N- and C-terminal domains of the protein interact together and are tightly involved in the fibrils scaffold. In collaboration with co-workers from the University of Firenze, we identified toxic forms of Ure2p using mammalian cells assay. We also have investigated the rationale of this toxicity. Finally, we studied the effect of some cellular factors and natural compounds on the assembly of Ure2p in vitro. To this aim, we documented the effect of the molecular chaperones on the assembly reaction and screened the protein against a library of natural compounds

L'activation du lymphocyte T est régulée par l'intermédiaire de ses molécules de surface. Certaines de ces molécules sont pluripotentes et servent aussi bien à l'adhésion qu'à l'activation de la cellule. Nous avons étudié trois d'entre-elles: la molécule CD59 qui semble être un deuxième ligand (avec la molécule CD58, LFA-3) pour la molécule CD2, la molécule CD44, un récepteur du «homing» humain impliqué dans les mécanismes de régulation de l'activation des lymphocytes T et de la molécule VLA-4, une molécule de la famille des intégrines servant à fixer la fibronectine mais aussi la molécule de surface V-CAM et possédant un rôle de régulation de l'activation des lymphocytes T. Si l'activation des lymphocytes conduit le plus souvent à leur prolifération, une activation inadéquate peut entraîner leur mort par un mécanisme de suicide actif: l'apoptose. Nous avons étudié les mécanismes permettant d'entraîner cette mort cellulaire et nous avons pu mettre en évidence un mécanisme assez général dans le cas des lymphocytes T où une sécrétion d'IE gamma en l'absence de sécrétion d'IL2 sur une cellule activée entraîne la mort de cette dernière
D'autre part, nous avons proposé que la inappropriée dans la population lymphocytaire T CD4 adulte d'un programme de suicide cellulaire pourrait expliquer à la fois le dysfonctionnement précoce et la déplétion tardive des lymphocytes T CD4 chez les sujets infectés par le VIH. Nous montrons que la perte sélective de la capacité des lymphocytes T CD4 de sujets infectés par le VIH à proliférer in vitro est due à l'induction par les stimuli de la mort des lymphocytes T CD4. Ce processus de mort cellulaire présente toutes les caractéristiques de l'apoptose (nécessité d'une synthèse protéique et condensation de la chromatine et fragmentation de l'ADN). Ces résultats suggèrent que le suicide des lymphocytes T CD4 en réponse à l'activation pourrait aussi se produire in vitro et être responsable, indépendamment de tout effet cytopathogène du virus, de la réduction progressive du nombre de lymphocytes T CD4 qui aboutit au SIDA

L'épiderme humain est particulièrement bien adapté pour jouer une fonction essentielle de "barrière", il limite l'entrée des xénobiotiques et participe à l'homéostasie générale de l'organisme en régulant la perte en eau transépidermique. Cependant, cette "barrière protectrice" n'est pas absolue, elle est perméable à certaines substances, dont le degré de perméabilité varie en fonction de nombreux facteurs et notamment de la formulation. Le travail de thèse se base sur l’étude de la compréhension de la pénétration cutanée et de la maîtrise de l’absorption. Dans le sens de la promotion de l’absorption par l’utilisation de promoteurs d’absorption qui additionnés dans la formulation augmentent la pénétration de la molécule modèle, la caféine. Le 1,2-pentanediol s’avère être un nouvel agent promoteur très efficace à faible concentration par rapport à un mélange binaire éthanol/propylène glycol référent utilisé à forte concentration. Dans le cas de la benzophénone-3, un filtre UVA-B, la modulation de l’absorption a été ciblée dans le sens de la rétention. Pour cela, deux stratégies d’encapsulation ont été développées ; en premier la benzophénone-3 a été incorporée dans un système de type matriciel que sont les microsphères lipidiques solides, puis dans des microcapsules sous forme solubilisée dans un liquide. Ces deux formulations comparées à un véhicule liquide huileux ont montré une rétention significative du filtre solaire au niveau du stratum corneum alors que solubilisé dans la formulation huileuse il atteint le compartiment systémique. La dernière étape de ce travail a été de préciser l’influence d’une irradiation sur l’absorption cutanée de molécules qui présentent un caractère lipophile différent dont la caféine, la benzophénone-3 et l’octocrylène. Les niveaux de pénétration dans les différentes couches de la peau de ces substances ont été reliés à cette caractéristique physico-chimique et le flux à l’équilibre a été d’autant plus limité que la molécule était hydrophile.

Malgre les progres realises, grace a l'amelioration de la prevention, du depistage et de l'efficacite des traitements au cours des vingt cinq dernieres annees, le cancer est aujourd'hui la deuxieme cause pathologique de mortalite. Le developpement de medicaments plus efficaces est donc particulierement important. Ceci implique la mise au point de methodes generales de synthese totale ou d'hemisynthese, dans le but d'etablir une relation structure-activite. Ainsi, deux familles d'agents cytotoxiques, les 5,12-naphtacenequinones et les acetogenines d'annonaceae, ont ete etudiees. Les 5,12-naphtacenequinones qui sont des quinones tetracycliques, sont des composes peu decrits dans la litterature. Cependant, certains ont montre une activite biologique importante : ces composes possedent une capacite d'inhibition vis-a-vis des topoisomerases i et ii, enzymes essentielles a la replication de l'adn. Apres un rappel des proprietes et des mecanismes d'action des topoisomerases, la synthese d'analogues d'une naphtacenequinone isolee recemment, la saintopine, a ete etudiee. Une deuxieme partie concerne la synthese d'analogues d'acetogenines d'annonaceae, qui representent une famille originale de produits naturels. L'interet pour cette famille de produit est motive par leur potentiel biologique (cytotoxique, antitumoral, pesticide,). Cependant, des tests in vivo ont montre que leur activite est fortement limitee par leur toxicite. Afin d'augmenter la selectivite de ces molecules, la synthese de lactones et d'analogues d'acetogenines a ete realisee. Des tests biologiques (cytotoxicite, effet sur le cycle cellulaire) ont ete effectues sur ces deux familles d'agents cytotoxiques et ont permis d'etablir les premieres relations structure-activite.

O glioblastoma multiforme (GBM) é um tipo de câncer grave que acomete o sistema nervoso central (SNC), e a sobrevida dos pacientes é de aproximadamente 12 meses. O tratamento com o quimioterápico paclitaxel (PTX) reduz o GBM experimental e humano. No entanto, sua utilização é limitada pelas reações adversas graves que acarreta. A nanoemulsão rica em colesterol (LDE), a qual mimetiza a lipoproteína de baixa densidade, tem sido empregada como um sistema de entrega de fármacos eficiente em alguns casos de tumores. No presente trabalho visou-se avaliar a eficácia do oleato de PTX (OPTX), um derivado mais lipofílico do que o PTX, associado a LDE (LDE-OPTX) em ensaios in vitro e in vivo. Inicialmente, células tumorais da linhagem de glioblastoma murino GL261 foram incubadas com PTX em solução ou com LDE-OPTX, nas concentrações de 1 ou 10 µM. Os resultados obtidos mostraram que o tratamento in vitro com PTX e o LDE-OPTX causa toxicidade in vitro em células GL261 pela redução da proliferação e indução de apoptose, e que ainda reduz a secreção de MCP-1 (proteína quimiotáxica de monócitos). Os ensaios in vivo mostraram a toxicidade intensa do PTX comercial, uma vez que os animais com GBM não sobreviveram ao tratamento com 75mg/Kg, i.p., a cada 3 dias, e foram a óbito a partir do oitavo dia de tratamento. Diferentemente, os animais tratados com a mesma dose de LDE-OPTX sobreviveram ao tratamento, sem sinais de toxicidade, mas os dados obtidos mostraram que este protocolo de tratamento não foi eficaz para redução do volume tumoral. Assim, os animais com GBM passaram a ser tratados com doses diárias, i.p., de 15 mg/kg de PTX ou de 75mg/Kg de LDE-OPTX. Os resultados obtidos mostraram a ineficácia e eficácia dos tratamentos com PTX e LDE-OPTX, respectivamente, em reduzir o GBM; no entanto os animais tratados com LDE-OPTX apresentaram redução no peso corporal e no número de linfócitos circulantes. Em conjunto, os dados obtidos mostram a habilidade de preparação LDE-OPTX causar toxicidade in vitro nas células GL261 e sua eficácia terapêutica em dose elevada, em reduzir o GBM em modelo murino.
Glioblastoma multiforme (GBM) is a type of severe cancer that affects the central nervous system, and patient survival is about12 months. The treatment with the chemotherapeutic paclitaxel (PTX) reduces the experimental and human GBM, however, their use is limited by side effects. The lipid nanoemulsion (LDE), that is mimetic to low density protein, has been employed as an efficient drug nanocarrier to treat cancer. Therefore, the present study aimed to assess the effectiveness of the oleate PTX (OPTX), a more lipophilic derivative of PTX, associated to (LDE), in in vitro and in vivo studies. Initially, glioblastoma murine strain GL261 was incubated with commercial PTX solution or LDE-OPTX at concentrations of 1 or 10 µM. Data obtained showed that treatment with PTX or LDE-OPTX caused in vitro toxicity to GL261 cells, by reducing the proliferation and inducing apoptosis. Moreover, both treatments reduced the secretion of monocyte chemotacticprotein-1 (MCP-1). In vivo experiments showed the severe toxicity of commercial PTX, as mice with GBM did not survive to the treatment with 75mg/kg, i.p., each 3 days, and died after 8 days of treatment. Conversely, animals treated with the same schedule of treatment with LDE-OPTX survived until the end of treatment, without any toxicity signal. Nevertheless, the treatment was not effective to reduce the GBM volume. Hence, other sets of animals with GBM were treated with daily i.p. dose of 15mg/kg of PTX or 75mg/kg of LDE-OPTX. Data obtained showed the inefficacy and efficacy of PTX and LDE-OPTX treatments, respectively, to reduce the volume of GBM. Nevertheless, mice treated with LDE-OPTX lost weight and lower number of circulating lymphocytes. Together, our data show the ability of LDE-OPTX treatment cause in vitro toxicity on GL261 cells e the in vivo therapeutic efficacy of higher doses on GBM murine model.

Ce travail de thèse avait pour objectif d’étudier différents vieillissements des copolymères d’éthylène et de norbornène (ENC), utilisés comme conditionnement de produits pharmaceutiques. Grâce à la stratégie analytique adoptée qui a fait appel à différentes techniques de caractérisation, telles que les techniques séparatives comme la chromatographie d’exclusion stérique, la chromatographie liquide haute performance à polarité de phases inversée, les techniques spectrales dont la spectroscopie infra rouge à transformée de Fourier et la spectroscopie UV, les techniques d’analyse thermique à travers l’analyse thermogravimétrie et la calorimétrie différentielle à balayage, puis d’une étude de toxicité des produits de dégradations, nous avons pu mettre en évidence différents types de modifications dans le volume du matériau après vieillissement. La modification principale dans la masse du matériau, observée à la dose réglementaire de stérilisation (25 kGy), est la scission des chaînes du polymère qui s’accompagne de la création de composés de basses masses molaires, donc de migrants potentiels risquant d’influencer la sécurité d’emploi des ENC. Puis pour des doses élevées de rayonnement (150 kGy) et pendant 500h d’exposition UV, on a la réticulation des chaînes.La présence de l’additif (l’antioxydant phénolique l’Irganox 1010®) empêche la création des CBMM après vieillissements. Cependant, en absence d’additif, les vieillissements génèrent de nouveaux CBMM.Toutefois, l’étude de toxicité montre une certaine toxicité à 150 kGy du grade ENC
The aim of this thesis work was to study different ages of copolymers of ethylene and norbornene (ENC), used as packaging of pharmaceutical products. Thanks to the analytical strategy adopted using different characterization techniques, such as separation techniques such as size exclusion chromatography, reverse phase high performance liquid chromatography, spectral techniques including infrared spectroscopy transforming of Fourier and UV spectroscopy, thermal analysis techniques through thermogravimetric analysis and differential scanning calorimetry, and then a toxicity study of degradation products, we were able to highlight different types of modifications in the volume of the material after aging. The main modification in the bulk of the material, observed at the prescribed sterilization dose (25 kGy), is the cleavage of the polymer chains, which is accompanied by the creation of compounds with low molar masses, and therefore potential migrants, which are likely to influence ENC job security. Then for high doses of radiation (150 kGy) and for 500h UV exposure, there is the crosslinking of the chains. The presence of the additive (the phenolic antioxidant Irganox 1010®) prevents the creation of MBMM after aging. However, in the absence of an additive, aging generates new CBMMs. However, the toxicity study shows some toxicity at 150 kGy of the ENC

La recherche de nouvelles variétés de bananier résistantes à Mycosphaerella fijiensis nécessite la mise en œuvre de techniques faisant appel à la culture in vitro. L'établissement d'un test précoce de résistance est indispensable à la valorisation de ces méthodes. On a essayé de mettre au point des tests, permettant la reconnaissance de caractères de résistance portés par des cals ou des plantules issues de culture in vitro. Un extrait brut (E. B. ) a été obtenu à partir de cultures de M. Fijiensis. La cercosporine n'a pas pu être mise en évidence dans cet E. B. La toxicité du champignon et de l'E. B. Vis-à-vis de cals de bananier a été testée en les plaçant séparément dans la même boîte de culture. Seul le champignon s'est révélé toxique dans ces conditions, et ce sur toutes les variétés étudiées. L'inoculation du champignon en laboratoire s'est avérée très délicate. L'injection d'E. B. Dans la feuille des plantules de bananiers met en évidence son action toxique. Les variations du niveau de réaction des différentes variétés ne semblent pas en rapport avec leur niveau de résistance à M. Fijiensis. Si les résultats obtenus ne permettent pas encore la mise en place d'un test pratique de résistance, ils devraient contribuer à améliorer la connaissance des différents mécanismes de résistance
The research of new banana varieties resistant to Mycosphaerella fijiensis needs the use of technics involving in vitro culture. The establishment of an early test of resistance is necessary for the valorization of the methods. We tried to design some tests, permitting the detection of resistance characters carried by calluses or plantlets from in vitro culture. A crude extract (C. E. ) was obtained from cultures of M. Fijiensis. No evidence for the presence of cercosporin in this C. E. Was found. The toxicity of the fungus or of the C. E. Against calluses of banana was tested by placing them separately in the same Petri dish. Only the fungus was showed to be toxic in these conditions, and equally on all the varieties studied. The inoculation of fungus into leaves of banana in laboratory was difficult. The injection of C. E. In leaves of bananas reveals its toxic action. The variations of level of reactions among different varieties don't seem to be in relation with their resistance ability's. Even if the results obtained don't yet permit the establishment of a practical test of resistance, they might contribute to improve the knowledge of different mechanisms of resistance

Parmi les cancers de la peau, les mélanomes sont ceux qui entraînent le plus de décès. Actuellement l’arsenal thérapeutique permettant de traiter efficacement les patients à un stade avancé et/ou inopérables de la maladie est limité. De nouvelles stratégies thérapeutiques doivent donc être développées. La recherche et le développement de nouveaux dérivés imidazoquinoxalines (Imiqualines), qui font l’objet de ma thèse, s’inscrit dans cette démarche. Après une présentation épidémiologique et clinique du mélanome, des différentes voies moléculaires impliquées dans cette pathologie, ainsi que des nouvelles stratégies thérapeutiques développées pour son traitement, nous aborderons la partie expérimentale. Dans la première partie, j’exposerai la stratégie de synthèse qui nous a permis d’obtenir les imidazo[1,2-a]quinoxalines têtes de séries, EAPB0203 et EAPB0503, ainsi que leurs métabolites, puis je présenterai les résultats des tests d’activité in vitro et in vivo réalisés sur ces molécules. La deuxième partie concerne les méthodes de dosages mises au point et validées afin de quantifier les composés étudiés dans différentes matrices biologiques. Ces méthodes ont été validées selon les critères recommandés par la FDA et l’Union Européenne. La démarche qualité adoptée ici est fondamentale pour la validation des résultats des études qui seront menées par la suite in vitro et in vivo. La dernière partie de cette thèse concerne les études de toxicité ainsi que les études d’absorption, distribution, métabolisme et élimination qui ont été réalisées chez le rat. Je terminerai par une discussion-conclusion et donnerai quelques perspectives.

Ugljenične nanocevi (UNC) imaju sve veću primenu u elektronici, kompjuterskoj i optičkoj industriji, kao i u biomedicini. Dok proizvodnja jednoslojnih UNC nanocevi beleži sve veći rast poslednjih godina, rizik koji nosi izlaganje ovom nanomaterijalu ostaje nerazjašnjen. Oskudni i često kontradiktorni podaci o toksičnim efektima jednoslojnih UNC ukazuju na potrebu za daljim ispitivanjima. U našim istraživanjima ispitivane su promene u ćelijskom odgovoru kao i morfološke promene nakon delovanja jednoslojnih ugljeničnih nanocevi na ćelijskoj liniji humanih fetalnih fibroblasta pluća MRC-5 i ćelijskoj liniji humanog adenokarcinoma pluća A549. U ovoj studiji korišćene su jednoslojne ugljenične nanocevi koje su sadržale rezidualne nečistoće poput gvožđa. Citotoksičnost jednoslojnih UNC (engl. single-walled carbon nanotubes – SWCNT) je ispitivana kolorimetrijskim MTT testom. Tokom 24 i 48h niske koncentracije jednoslojnih ugljeničnih nanocevi (<250 μg/mL) pokazale su nisku toksičnost na proliferaciju i vijabilnost u obe ispitivane ćelijske linije. Ipak, pri visokim koncentracijama UNC (250-750 μg/mL) antiproliferativni efekat je bio blizu IC50 vrednostima. Na osnovu rezultata dobijenih MTT testom može se zaključiti da su maligne A549 ćelije osetljivije na delovanje jednoslojnih UNC u odnosu na normalne MRC-5 ćelije. Kombinacija ugljeničnih nanocevi sa prirodnim polifenolima (resveratrolom i proantocijanidolima) nije značajno uticala na citotoksičnost u MRC-5 ćelijama, za razliku od A549 ćelija gde je tretman kombinacijama umanjio toksičnost ugljeničnih nanocevi. Transmisionom elektronskom mikroskopijom ispitivan je efekat jednoslojnih ugljeničnih nanocevi na ćelijsku morfologiju i preživljavanje. Intracelularni agregati ugljeničnih nanocevi primećeni su u obe ćelijske linije, čime je potvrđeno da ugljenične nanocevi ulaze u ćelije. Imajući u vidu da nanomaterijali poput ugljeničnih nanocevi indukuju oksidativni stres i njime posredovanu apoptozu, na protočnom citometru je određivano prisustvo ćelija u apoptozi i nekrozi. Tretman ćelija sa jednoslojnim ugljeničnim nanocevima nije doveo do značajnog porasta broja apoptotskih ili nekrotičnih ćelija, što ide u prilog niskoj toksičnosti ovog nanomaterijala, odnosno ukazuje na alternativne mehanizme toksičnosti. Međutim kombinacija jednoslojnih ugljeničnih nanocevi sa antioksidantima, resveratrolom i proantocijanidolima indukuje veći procenat apoptoze i nekroze u odnosu na tretman samo sa nanocevima. Promene u ekspresiji gena praćene su lančanom reakcijom polimeraza (PCR). Komparativna analiza rezultata genske ekspresije MRC-5 i A549ćelija nakon tretmana sa jednoslojnim ugljeničnim nanocevima pojedinačno i u kombinaciji sa antioksidantima ukazala je na kompleksnost i raznolikost biološkog odgovora ispitivanih ćelija. U našem istraživanju ispitivana je i promena aktivnosti enzima antioksidativne zaštite i količine glutationa u ćeliji. Primena jednoslojnih ugljeničnih nanocevi u MRC-5 ćelijama dovodi po smanjenja specifične aktivnosti enzima SOD i GR, povećava specifičnu aktivnost GPx i ne utiče na promenu specifične aktivnosti GST i količine glutationa u ćeliji Primena jednoslojnih ugljeničnih nanocevi u A549 ćelijama dovodi po smanjenja specifične aktivnosti enzima SOD, ne utiče na promenu specifične aktivnost enzima GR, GST i GPx, i dovodi do povećanja količine glutationa u ćeliji. Ćelijska vijabilnost, morfološke promene, redoks homeostaza i ekspresija ispitivanih gena bile su promenjene nakon tretmana sa jednoslojnim ugljeničnim nanocevima. Iako su dobijeni rezultati značajni za procenu toksičnosti ugljeničnih nanocevi, neophodna su dalja istraživanja koja treba da doprinesu boljem razumevanju toksičnih efekata ugljeničnih nanocevi.
Carbon nanotubes are being actively introduced in electronics, computer science, and optics as well as for various biomedical applications. While production of single-walled carbon nanotubes (SWCNT) has escalated in recent years, the knowledge on risk associated with exposure remains unclear. Contradictory data on the toxic effects of single-walled carbon nanotubes highlights the urgent need for further studies. In this study we investigated the alterations in cellular response along with morphological changes induced by single-walled carbon nanotubes in human lung fibroblast cell line MRC-5 and adenocarcinoma human alveolar basal epithelial cells A549. In this study we used SWCNT containing large amounts of residual metallic impurities such is iron, and the iron concentration increased in dose dependent manner in cells exposed to SWCNT. Cytotoxicity was evaluated by MTT assay and SWCNT showed little cytotoxic effect on the proliferation and viability of two cell lines tested at the concentrations used (<250 μg/mL) within 24 and 48h. However exposing both cell lines to high concentrations (250-750 μg/mL) resulted in near IC50 values. Based on MTT test SWCNT were more cytotoxic to A549 cell line. Cytotoxicity of SWCNT in combination with natural polyphenols (resveratrol and proanthocyanidins) did not noticeably affect the cytotoxicity of SWCNT to MRC-5 cells. However introduction of polyphenols did reduce the cytotoxicity of SWCNT to A549 cells. Transmission electron microscopy was used to complement cytotoxicity assays and to investigate the pathological effect of internalized SWCNT on cell morphology and survival. Intracellular bundles of CNTs, possibly aggregated/agglomerated were observed in both cell lines, confirming internalization after 24h exposure. Since nanoparticles like carbon nanotubes are toxic mainly because they cause oxidative stress, often associated with an increased apoptosis we checked for apoptotic and necrotic cells using flow cytometry. Incubation with SWCNT did not result in pronounced apoptosis or necrosis supporting its low toxicity and possibly alternative mechanism of cell damage. However incubation with SWCNT in combination with resveratrol and proanthocyanidins induced higher levels of both apoptosis and necrosis than SWCNT alone. Changes in gene expression following exposure to SWCNT were evaluated by polymerase chain reaction PCR array which indicated complex and diverse change in expression of genes involved in apoptosis, cell proliferation and oxidative stress. Finally we investigated the modulation of the antioxidant enzyme system and the changes in the cytosolic levels of GSH. SWCNT reduced the specific activity of SOD and GR enzymes, increased GPx activity. No changes in intracellular levels of GSH were observed in MRC-5 cell line. Same treatment in A549 cell reduced the specific activity of SOD, had no effect on GR, GST and GPx activity, but increased intracellular levels of GSH. Cell viability, morphologic changes, redox homeostasis and gene expression were affected by the presence of SWCNT. Although our findings are useful in predicting human response against SWCNT exposure, further study is needed for better understanding of the effects of SWCNT.

Os óleos essenciais provenientes de plantas da flora Latino-americana, têm-se apresentado como candidatos à utilização em formulações cosméticas como fragrâncias, promotores de permeação cutânea, antioxidantes e conservantes naturais. A segurança de componentes da formulação deve ser avaliada por testes toxicológicos validados, que geram resultados reprodutíveis e confiáveis. Os ensaios de citotoxicidade (OECD/GD 129), fototoxicidade in vitro (OECD 432), micronúcleo in vitro (OECD 487) e atividade antioxidante intracelular correspondem a métodos alternativos pautados nos princípios dos 3R\'s: Refinament ou Refinamento; Reduction ou Redução; e Replacement ou Substituição. Com essa diretriz, o objetivo proposto foi avaliar a citotoxicidade, a fototoxicidade in vitro, o potencial genotóxico e a atividade antioxidante intracelular dos óleos essenciais das espécies Minthostachys setosa (Briq.) Epling, Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum e Drimys brasiliensis Miers provenientes de plantas da flora Latino-americana, candidatos ao uso em cosméticos. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação e foi avaliada a sua dispersão em meio de cultura. A partir dos resultados dos ensaios de citotoxicidade na linhagem BALB/3T3 clone A31, foi calculado o valor de concentração que inibe e 50 % (IC50) de células desafiadas. Na avaliação da fototoxicidade in vitro na linhagem BALB/3T3 clone A31 e no ensaio do micronúcleo in vitro na linhagem CHO-K1, verificou-se respectivamente, os potenciais fototóxico e genotóxico das amostras. Com exceção do óleo essencial da Drimys brasiliensis, a atividade antioxidante foi avaliada na linhagem WS1. Os óleos essenciais da Minthostachys setosa, Pimenta pseudocaryophyllus e Drimys brasiliensis não apresentaram potencial citototóxico, fototóxico e genotóxico, além disso, a atividade antioxidante foi expressiva para Pimenta pseudocaryophyllus.
Essential oils from plants flora Latin America, have been presented as candidates for use in cosmetic formulations as fragrances, skin permeation enhancers, antioxidants and natural preservatives. The safety of the formulation components should be assessed by validated toxicological tests. The cytotoxicity assays (OECD/GD 129), in vitro phototoxicity (OECD 432), in vitro micronucleus (OECD 487) and intracellular antioxidant activity correspond to alternative methods guided by the 3R\'s principles: Refinament, Reduction and Replacement. In this scenario, the proposed objective was to evaluate the cytotoxicity, phototoxicity in vitro, the genotoxic potential and intracellular antioxidant activity of Minthostachys setosa (Briq.) Epling, Pimenta pseudocaryophyllus (Gomes) Landrum and Drimys brasiliensis Miers essential oils, from Latin American plants candidates for use in cosmetics. The essential oils were extracted by hydrodistillation and its dispersion was evaluated in culture medium. The results obtained in cytotoxicity assays on line BALB/3T3 clone A31 was calculated the IC50. In vitro phototoxicity in BALB/3T3 clone A31 cell line and the micronucleus assay in vitro in the CHO-K1 cell line, it was verify phototoxic and genotoxic potential, respectively. With the exception of essential oil Drimys brasiliensis, the intracellular antioxidant activity was assessed in WS1 cell lines. In conclusion Minthostachys setosa, Pimenta pseudocaryophyllus and Drimys brasiliensis Miers essential oils showed no cytotoxic, phototoxic and genotoxic potential, moreover, the antioxidant activity was expressive for Pimenta pseudocaryophyllus.

L'étude chimique de deux ascidies, Eudistoma bituminis et Cystodytes violatinctus (Polycitoridae) provenant de Mayotte (Archipel des Comores, océan Indien) a été entreprise. Plus spécifiquement, l'analyse de la composition en acides gras et en stérols de chaque ascidie ainsi que l'isolement et l'identification de cinq alcaloïdes ont été effectués à l'aide des techniques chromatographiques classiques (CC, CG, CG/MS, CLHP) et spectroscopiques (IR, UV, SM, RMN proton et carbone 13, DEPT, HMQC, HMBC). L'identification d'une quarantaine d'acides gras a été réalisée à l'aide des esters méthyliques et des dérivés pyrrolidides. Une très faible teneur en acides gras polyinsaturés a été décelée dans les deux ascidies de Mayotte, contrairement aux teneurs préalablement détectées dans les ascidies citées dans la littérature. De surcroît, un acide gras saturé inhabituel chez les ascidies, l'acide phytanique, est présent à hauteur de 16,5 % dans E. Bituminis et à l'état de traces dans C. Violatinctus. L'analyse de la composition stérolique a révélé la présence d'une série de stérols analogues delta 0/delta 5 et du rare gorgostérol dans les deux espèces d'ascidies. Cependant, E. Bituminis se distingue par la présence d'une série de stérols delta 5,8 rares, isolés pour la première fois dans des ascidies et représentant 25,8% de la composition stérolique. L'isolement des métabolites secondaires a principalement permis d'identifier cinq alcaloïdes dont l'un d'entre eux, la ségoline C, représente un composé nouvellement identifié. La stéréochimie de ce nouveau composé a été élucidée par dichroïsme circulaire et par calculs de mécanique moléculaire à partir du logiciel PC model. Une série de tests d'activités a été réalisée sur les extraits bruts de ces ascidies ainsi que sur les alcaloïdes isolés. L'étude de l'inhibition de la division cellulaire des œufs d'oursins a tout d'abord été réalisée. Ensuite, des tests de cytotoxicité sur la lignée cancéreuse humaine THP1 in vitro et des tests d'activité antimalarique sur des souches sensibles et résistantes à la chloroquine ont été effectués. Les résultats obtenus s'avèrent prometteurs et permettent d'envisager des tests in vivo sur les molécules isolées. [Résumé de l'auteur]

As neolignanas, bem como as lignanas, apresentam diversas atividades biológicas comprovadas, sendo a licarina A uma neolignana diidrobenzofurânica, detentora de atividade leishmanicida. A partir dessa atividade e do interesse na produção de fármacos eficazes no tratamento dessa doença, a licarina A foi selecionada para estudo de metabolismo in vitro a partir de reações biomiméticas utililizando [Fe(TPP)Cl] e Mn(Salen) como catalisadores; sob ação de oxidantes (PhIO e mCPBA) em quatro solventes de polaridades distintas (AcOEt, MeOH, ACN, DCM), na proporção de 1:30:30 (catalisador:substrato:oxidante). Inicialmente, as reações realizadas foram submetidas às análises por CG-EM comprovando um produto de oxidação majoritário m/z 342, denominado metabólito A. Os solventes de menor polaridade (DCM e AcOEt), bem como o catalisador de Jacobsen, foram mais eficientes na geração desse metabólito. O aumento do tempo reacional bem como o aumento da concentração do oxidante não favoreceu a produção de metabólitos. Posteriormente, as análises dessas reações também foram realizadas por CLUE-DAD-EM/EM e sete metabólitos puderam ser identificados a partir do auxílio do estudo de fragmentação da licarina A bem como a partir de análises de RMN e EM dos metabólitos isolados por CLAE em escala semipreparativa. As análises de RMN dessas frações permitiram a determinação estrutural de um metabólito de m/z 343 [M+H]+ (metabólito 3) constituído de uma epoxidação nos carbonos C-7\'/C-8\' situados na cadeia lateral da licarina A. Sendo assim, quatro dos sete metabólitos (2, 3, 6 e 7) formados apresentaram m/z 343 [M+H]+ e espectros de massas tandem muito semelhantes, correspondendo aos possíveis diasteroisômeros do metabólito epoxidado, visto que a licarina A apresenta dois centros quirais. Outros três metabólitos foram produzidos e exibiram íons de m/z 361 [M+H]+, m/z 315 [M+H]+ e m/z 341 [M+H]+, correspondentes respectivamente a um diol vicinal em C-7\'/C-8\', um aldeído benzóico e um outro aldeído gerado a partir da oxidação da metila terminal em C-9\'. Foi realizado ainda o estudo de metabolismo in vitro com microssomas hepáticos de ratos, sendo que esse estudo foi capaz de reproduzir as reações biomiméticas a partir da produção do mesmo metabólito (2) (apresentando mesmo TR e mesmo espectro de UV). Em relação à toxicidade e aos possíveis danos que a licarina A poderia acarretar, um estudo de toxicidade aguda foi realizado sendo esse capaz de auxiliar na classificação da licarina A, sendo a mesma tóxica em doses > 300mg/kg e 2000mg/kg (categoria 4). Análises dos parâmetros bioquímicos realizadas foram capazes de determinar possível toxicidade hepática, a partir das alterações enzimáticas (AST, ALT, LDH, ALP) ocorridas. Contudo, análise microscópica de cortes dos tecidos (fígado, coração e rins) não determinaram nenhum comprometimento tecidual que pudesse evidenciar toxicidade.
Neolignans and lignans show several biological activities. Licarin A is a dihydrobenzofuranic neolignan, which exhibits leishmanicidal activity. For this reason, licarina A was selected to carry out the studies of in vitro metabolism. So biomimetic reactions were done by the use of [Fe(TPP)Cl] and Mn (Salen) catalysts, different oxidants (PhIO and mCPBA), as well solvents with different polarities (EtOAc, MeOH, ACN, and DCM), and the ratio of 1:30:30 (catalyst:substrate:oxidant). Initially, the reactions were analyzed by GC-MS and showed one major oxidation product of m/z 342 (metabolite A). The less polar solvents (DCM and EtOAc) and Jacobsen catalyst (Mn (Salen)) were more efficient for the production of metabolite A. The reaction time and concentration were increased, but they did not represent a higher production of metabolites. Subsequently these reactions were also analyzed by UPLC-DADMS/ MS and seven metabolites could be identified based on the fragmentation pattern proposed for licarin A, as well as from NMR and MS data of the metabolites isolated by HPLC. A metabolite of m/z 343 [M+H]+ (metabolite 3) was identified by NMR and MS/MS data and it consists of epoxidation in the carbons of C-7\'/C-8\' from licarin A. Therefore, four of the seven metabolites (2, 3, 6 and 7) exhibited m/z 343 [M+H]+ in the MS spectra and the MS/MS showed high similarity with the epoxided metabolite (metabolite 3). So these metabolites could be diasteroisomers of the metabolite 3. Three other metabolites were produced and exhibited ions at m/z 361 [M+H]+, m/z 315 [M+H]+ and m/z 341 [M+H]+, corresponding respectively to a vicinal diol in C-7\'/C-8\', benzylic aldehyde and other aldehyde generated from the oxidation of the terminal methyl at C-9\'. The study of in vitro metabolism by rat liver microsomes was also carried out, and this study was able to reproduce the biomimetic reactions by production of the same metabolite (2). The acute toxicity and potential damage of licarin A were evaluated and the results indicated toxicity for this compound at doses >300mg/kg and 2000mg/kg (category 4). Analysis of biochemical parameters were able to determine possible liver toxicity caused by enzymatic changes (AST, ALT, LDH, ALP). However, microscopic analysis of tissues sections (liver, heart and kidneys) did not show any tissue damage that could indicate toxicity.

Defeitos ósseos metafisários grandes criados após curetagem de tumores ósseos são normalmente tratados com implantação de cimento sólido de polimetilmetacrilato (PMMA). Com os novos cimentos porosos, reabsorvíveis ou não, espera-se melhores resultados clínicos com diminuição da incidência de soltura asséptica relacionada à necrose térmica do osso, à discrepância das características mecânicas e à ausência de osteointegração. A mistura de componentes efervescentes, como o bicarbonato de sódio e o ácido cítrico, produz cimentos porosos cuja biocompatibilidade e segurança nunca foram testadas, limitando sua utilização clínica. O objetivo deste estudo foi avaliar a eliminação de substâncias tóxicas e o efeito anticoagulante do citrato de sódio, um subproduto da reação. Em experimentos in vitro o cimento sólido de PMMA foi comparado aos cimentos porosos de PMMA e poliuretana de mamona nas duas formas comercialmente disponíveis (Poliquil® e Bioosteo®). Todos os elementos produzidos durante a preparação e a incubação dos cimentos foram analisados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência acoplada a espectrometria de massa e por proliferação de culturas das linhagens celulares NIH/3T3 e MRC-5 coradas com resazurina. Em experimentos in vivo defeitos ósseos criados nos fêmures de coelhos não preenchidos foram comparados com outros preenchidos com os cimentos porosos à base de PMMA e Poliquil®. Foram realizados ressonância magnética, análise dos parâmetros de coagulação antes, imediatamente, 1, 4 e 7 dias após a cirurgia e análise histológica do membro operado, dos rins e do fígado dos coelhos. Ambas as marcas de poliuretana de mamona (Bioósteo® e Poliquil®) liberaram 4,4\'diaminodifenilmetano e a marca Poliquil® liberou também 4,4\'-difenilmetano diisocianato. Ambos os compostos são considerados tóxicos à inalação ou ingestão. A proliferação celular das culturas das linhagens MRC-5 e NIH/3T3 sofreu redução menor que 20% quando em contato com os cimentos à base de poliuretana de mamona e menor que 35% quando em contato com o cimento poroso à base de PMMA, em comparação com o grupo de controle. A diluição do meio de cultura diminuiu este efeito. Acreditamos que a acidez do meio, devido à reação incompleta dos elementos efervescentes, pode ser a causa deste efeito. A análise histológica do fígado e dos rins mostrou algumas pequenas alterações na mesma proporção que no grupo controle. Inferimos que os cimentos porosos não causam toxicidade aguda sistêmica. Em todos os grupos, a análise histológica da área operada mostrou pequenos hematomas e uma ligeira reação de corpo estranho. Não foi encontrada reação inflamatória importante em nenhum dos grupos. Estes dados corroboram a hipótese de que os cimentos porosos são biocompatíveis. O leve efeito citotóxico observado in vitro não pôde ser detectado in vivo, provavelmente pelas condições locais de diluição. A produção de citrato parece não interferir com a coagulação. Os parâmetros de coagulação não sofreram alterações em qualquer momento após a cirurgia e a avaliação por ressonância magnética, assim como a análise histológica, descartou a formação de hematomas consideráveis. Concluímos que o cimento poroso à base de PMMA testado é seguro para o uso clínico, mas que os cimentos porosos à base de poliuretana de mamona eliminam substâncias tóxicas cuja repercussão clínica merece investigação específica.
Large metaphyseal bone defects created after benign bone tumor curettage are usually treated by solid bone cement (PMMA) implantation. Porous and absorbable cements are expected to improve clinical results by lowering incidence of aseptic loosening, heat promoted bone necrosis, bone/cement mechanical discrepancies and absence of bone integration. Effervescent components like sodium bicarbonate and citric acid can be mixed to PMMA producing porous cement that fits intraoperative requirements. Furthermore, castor oil polyurethane is a well-known absorbable cement that can be mixed to effervescent components to produce porous and absorbable bone cement. In vivo and in vitro toxicity of both products have never been tested to support its clinical use. The spurious production of toxic elements and the effect of citrate, an anticoagulant byproduct of the effervescent components reaction, were analyzed. In vitro experiments: The three experimental groups consisted of PMMA or one of the commercially available castor oil polyurethane cements (Poliquil® or Bioosteo®) mixed to the effervescent components specimens. These groups were compared to classic PMMA solid cement specimens. All the elements produced during preparation and incubation of the cements were analyzed by High Efficiency Liquid Chromatography coupled to Mass Spectrometry and by Resazurine microplate assay of NIH/3T3 and MRC-5 fibroblasts strains culture. In vivo experiments: Femoral defects were created in six rabbits per group and filled with PMMA or Poliquil® porous cements or left empty. Magnetic resonance of the limb, histology of the limb, kidneys and liver, and coagulation parameters of blood samples collected immediately after and 1, 4 and 7 days after surgery were analyzed. Castor oil polyurethane of both brands (Bioósteo® and Poliquil®) released 4,4\'-diaminodiphenylmethane. The Poliquil® brand released 4,4\'-diphenylmethane diisocyanate too. Both compounds are considered toxic. The MRC-5 and NIH3T3 cell strains proliferation was decreased in less than 80% in contact with polyurethane cements and less than 65% with PMMA, compared to the control group. Dilution of the medium diminished this effect. We believe that the acidity of the medium due to incomplete reaction of the effervescent components may be the cause of this finding. Liver and kidneys histology showed some slight changes in the same proportion as the control group. We infer that the cements do not cause acute systemic toxicity. In all groups, histologic analysis of the operated area showed small hematomas and a slight foreign body reaction. Significant inflammatory reaction could not be found in any of the study groups. Citrate formation from the effervescent components reaction seems to not interfere with coagulation. Inflammatory reaction around porous cements is similar to that of classic solid PMMA cement. The cytotoxic effect observed in vitro, could not be detected in vivo. Coagulation parameters did not changed at any time after surgery. Magnetic resonance imaging evaluation confirmed that there was no formation of larger hematomas than in specimens of the control group. In conclusion, the tested porous PMMA cement is safe and biocompatible for clinical use. The tested polyurethane porous cements eliminates toxic substances and deserves specific studies to verify clinical safety.

L'essor des biomatériaux et leur utilisation dans le domaine médical ainsi que le développement des méthodes alternatives aux tests in vivo sont à l’origine des techniques permettant de mesurer la cytocompatibilité et la cytotoxicité des matériaux. Un modèle base sur la culture organotypique, permet d'évaluer la cytocompatibilité et la cytotoxicité des matériaux au contact des tissus. Il repose sur la mesure de trois propriétés : la multiplication cellulaire, la migration cellulaire et l'adhésion des cellules au substrat. Ce travail a eu pour objet l'optimisation et la validation du modèle. L'optimisation a porté sur le développement d'une technique automatisée de la mesure de la viabilité cellulaire, utilisant un analyseur de particules multicanaux et qui a permis d'intégrer la viabilité comme quatrième paramètre de mesure au sein du modèle. La viabilité cellulaire est un facteur déterminant de la mesure de la toxicité. Puis dans le but d'appliquer la technique à d'autres tissus, nous avons réalisé la culture organotypique de peau humaine en étudiant différentes caractéristiques : la multiplication, la migration, l'adhésion, la viabilité cellulaires et la synthèse de matrice extracellulaire. La validation du modèle a été réalisée par deux analyses. La sensibilité du modèle a été prouvée en étudiant le comportement du tissu cutané embryonnaire, adulte et transforme prélevé sur la souris. Dans le cadre de l'étude de la biocompatibilité de matériaux destines à être placés au contact de la peau humaine, nous avons réalisé en parallèle une étude la cytocompatibilité et de la cytotoxicité en culture organotypique et en culture cellulaire. Les deux techniques de culture répondent avec la même sensibilité.

Le Laboratoire de Synthèses Métallo-Induites développe depuis plusieurs années des complexes cyclométallés du ruthénium à potentiel anticancéreux (RDC). Au cours de travaux antérieurs, une chimiothèque variée a été constituée et un composé ‘lead’ a été sélectionné pour approfondir les études biologiques. Néanmoins, ce complexe présente une faible solubilité en milieu biologique. Le travail exposé dans cette thèse a consisté à développer une nouvelle génération de RDC fonctionnalisés en utilisant les outils de la synthèse organique multi-étapes et ceux de la chimie organométallique. Pour cela, la stratégie a été de modifier un ligand, et en particulier la phénylpyridine, pour pouvoir y greffer une chaîne hydrosoluble telle qu’un acide aminé, un polyol et une polyamine. Une synthèse a pu être menée à terme et a permis de générer le premier RDC hydrosoluble portant une chaîne spermine (RDC-44). Ces complexes ont été évalués in vitro et in vivo
For several years, the ‘Laboratoire de Synthèses Métallo-Induites’ has been developing cycloruthenated complexes for their antitumor potential (RDC). During these previous works, a library of compounds has been constituted and has undergone biological screening. A lead compound has been selected to go into further pharmacological studies. Nevertheless, this complex possesses a poor solubility in physiological condition. The aim of this thesis was to develop a new generation of functionalized hydrosoluble RDCs using multi-steps organic syntheses and organometallic chemistry. The strategy was to modify a ligand, in particular the phenylpyridine, in order to graft a hydrosoluble chain like an amino acid, a polyol and a polyamine. One of the synthetic pathways has yielded to the first hydrosoluble RDC carrying a spermine side chain. These complexes have been screened by in vitro and in vivo tests

A utilização de biomateriais para os mais diversos destinos no corpo humano, tem tido uma ascensão considerável nessas últimas décadas, devido a inúmeras necessidades, como por exemplo, assistência às pessoas com patologias ósseas, acidentes automotivos, estética bucal entre outras. Ainda assim, existe a necessidade de se desenvolver novos materiais de aplicação biomédica, melhorando suas propriedades e permitindo o aperfeiçoamento de dispositivos. A biocompatibilidade é parte integrante dos processos de validação destes materiais, onde testes in vitro e in vivo são realizados. Esse trabalho avaliou a biocompatibilidade de ligas de titânio através dos testes de: hemocompatibilidade, citotoxicidade, toxicidade sistêmica e lavado peritoneal feito em ratos, que entraram em contato com extratos originados do eletrólito: saliva artificial mais associações com fluoreto de sódio, após contato com as ligas metálicas de Ti-6Al- 4V (parâmetro para os testes) e Ti- 10Mo (liga em teste). A liga Ti-10Mo e seus extratos demonstraram um comportamento de biocompatibilidade, sugerindo uma possível aplicação para a odontologia.
Biomaterial applications have increased in the last decade, since bone diseases, injury from accidents have reached an increasing number of people. In dentistic, biomaterials have also large use as to estetic application as well to recuperate the function. New biomaterials have been studied in order to get better mechanical properties allowing better performance of the biomedical device. Biocompatibility studies are part of the validation processes and in vivo testes and in vitro testes are carried out. The present work evaluated biocompatibility of Ti alloys through: haemocompatibility, cytotoxicity, systemic toxicity and washed peritoneal tests. Those tests were performed in rats which were in contact with extracts made from artificial salive plus NaF (low concentrations) with Ti-6Al-4V alloy (control test) and Ti-10Mo (under test). Alloy under test and its extracts shown biocompatible behavior suggesting for odontological applications.

Les allergies représentent un problème majeur dans le domaine des maladies professionnelles et ont un impact sérieux sur la vie des travailleurs. Les allergies professionnelles sont principalement cutanées et respiratoires ; elles peuvent être causées par des produits chimiques de bas poids moléculaire. Dans le passé, les tests destinés à identifier les produits susceptibles d’entraîner des allergies étaient réalisés sur l’animal. Or, la législation européenne engage à limiter le recours à l’expérimentation animale pour évaluer le pouvoir sensibilisant des substances chimiques, incitant à développer des tests in vitro de substitution. C’est dans ce contexte que nous avons cherché à développer des modèles de cultures cellulaires destinés à identifier les substances sensibilisantes. Un premier modèle utilisant des cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse (BMDC) de souris BALB/c a été développé et a donné des résultats prometteurs pour l’identification des produits sensibilisants et leur catégorisation selon leur puissance sensibilisante. De plus, la voie de signalisation Nrf2/Keap1 semble être impliquée dans la réponse de ce modèle cellulaire aux sensibilisants. Dans le but de compléter ce modèle et d’évaluer la capacité des BMDC à activer les lymphocytes T (LT), un modèle de coculture de BMDC et LT a été mis au point avec un sensibilisant de référence avant d’être testé sur un ensemble de produits de référence (sensibilisants cutanés et respiratoires, irritants et non sensibilisants). Les BMDC de notre modèle, exposées à des sensibilisants, se sont révélées capables d’activer les LT en coculture. Enfin, des essais préliminaires utilisant des cellules de souris de souche C57BL6/J dans notre modèle de coculture ont donné des résultats comparables à ceux obtenus avec des cellules issues de la souche BALB/c. Les modèles de cultures cellulaires BMDC et de coculture BMDC-LT sont prometteurs dans le cadre du développement de méthodes de substitution à l’expérimentation animale pour l’évaluation du pouvoir sensibilisant de substances chimiques
Allergies constitute an important issue in the field of occupational health and have a serious impact on the lives of workers. Occupational allergies are mainly contact and respiratory allergies and can be caused by low molecular weight chemicals. In the past, the tests that were used to identify the potential allergens were carried out on animals. However, European legislation has provided the impetus for reducing the use of animal testing to assess the sensitization potential of chemicals and promoted the development of alternative in vitro tests. In this context, we aimed to develop cell culture models to identify sensitizers. A first model using bone marrow derived dendritic cells (BMDC) from BALB/c mice was developed and showed promising results for identifying sensitizers and classify them according to their allergenic potency. Moreover, the Nrf2/Keap1 pathway seems to be involved in the response of this cell model to sensitizers. In order to supplement this model and to assess the functionality of BMDC, a BMDC-T cell (TC) coculture model was developed with a reference sensitizer before being tested on a range of reference sensitizers (cutaneous and respiratory sensitizers, irritants and non-sensitizers). The BMDC of our model, while exposed to sensitizers, were able to activate TC in coculture. Finally, preliminary tests using the cells of C57BL6/J mice in our coculture model showed that similar results to those obtained with cells from the BALB/c strain. The models of BMDC cultures and BMDC-TC coculture are promising for the development of alternative methods to animal experimentation assessing the sensitizing potential of chemicals

Depuis le 11 juillet 2013, date d’application du Règlement cosmétique (CE) No 1223/2009, les metteurs sur le marché sont dans l’obligation de mentionner sur leurs produits la Date de Durabilité Minimale (DDM), ou si celle-ci excède 30 mois, la Période Après Ouverture (PAO). L’estimation de ces dates n’est pas encadrée réglementairement. Cosmetics Europe, l’Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé, le Comité scientifique pour la sécurité du consommateur ou encore la Commission Européenne proposent des lignes directrices, mais les conditions d’étude pour la détermination de la DDM et de la PAO restent encore à l’appréciation de la personne responsable de la commercialisation du produit. L’objectif de ce travail était d’étudier les conditions nécessaires à la mise en place d’un protocole de mesure de la stabilité d’émulsions cosmétiques, permettant de déterminer la DDM du produit de manière fiable et rapide. Pour cela, une approche expérimentale sur une émulsion représentative de l’industrie cosmétique a été menée. L’évolution des paramètres organoleptiques, physico-chimiques et microbiologiques a été évaluée, en accéléré (température augmentée) et en temps réel. Une approche statistique a montré que les propriétés sensorielles évoluent différemment en fonction de la température et du matériau dans lequel l’émulsion est stockée. L’établissement d’un modèle de correspondance entre le vieillissement en conditions réelles et en conditions accélérées a pu être proposé pour certains paramètres physico-chimiques. Les études de microbiologie se sont tout d’abord concentrées sur la validation d’une méthode commerciale, alternative au dénombrement des germes aérobies totaux encadré par la norme ISO 21149, pour une application dans le domaine cosmétique. Après validation, la méthode a été utilisée comme un outil simple, rapide et économique pour le suivi de la stabilité microbiologique de l’émulsion de référence. La dégradation des conservateurs et de l’antioxydant présents dans la formule de référence a été suivie par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Ce suivi a permis de mettre en évidence l’effet probable de la lumière sur la dégradation des actifs de l’émulsion. A ces tests ont été associés une stratégie analytique visant à étudier la photostabilité de l’émulsion. Les études ont porté sur deux molécules : l’acide déhydroacétique et l’alpha-tocophérol. La stratégie a permis de caractériser les mécanismes impliqués dans les réactions de photodégradation. La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse multi-étapes (GC-MSn) et la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution en tandem (LC-HR-MS/MS) ont été utilisées pour la séparation et l'identification structurale des photoproduits. La détection des photoproduits majoritaires dans l’émulsion de référence, après irradiation UV-visible, montre la possible formation des photoproduits dans une matrice complexe de type émulsion huile/eau. Les résultats des tests de toxicité, in silico et/ou in vitro, ont démontré l’importance de prendre en compte la formation éventuelle de photoproduits dans l’évaluation de la sécurité d’un produit cosmétique
According to Cosmetic Regulation 1223/2009, implemented in July 2013, the manufacturer must mention the Date of Minimum Durability (DMD), or if DMD exceeds 30 months, the Period After Opening (PAO) on the product packaging. At the present time, no text regulates the procedures applicable to the validation of a DMD or a PAO. Some guidelines are published by Cosmetics Europe, the National Agency for the safety of medicines and health products, the Scientific Committee for consumer safety, or the European Commission; but the evaluation remains at the discretion of the person responsible for marketing the product. In this context, this work proposes recommendations to establish a stability protocol in order to quickly determine the DMD. Experimental approaches on an emulsion representative of the major category in the cosmetics industry have been established. Organoleptic, physicochemical and microbiological stabilities were evaluated. The emulsion stability has been tested in accelerated conditions and in real time. A statistical approach has been proposed to evaluate the product shelf life according to its organoleptic properties. The sensory properties of the cosmetic emulsion changed differently depending on the temperature and the material in which it has been stored. A mathematical correlation between the results of studies under normal and those obtained under accelerated conditions has been proposed for some parameters. A microbiological study focused on the validation of a commercially available method, alternative to total count of aerobic microorganisms, normed by the ISO 21149 for cosmetic application. Once validated, this method has been used as an economical, quick and easy tool to evaluate the microbiological stability of cosmetic emulsions. Gas chromatography coupled with mass spectrometry was used to follow the degradation of antioxidant and preservatives. To take into account the photostability of the emulsion, an analytical strategy was proposed to identify the mechanisms involved in phototransformation reactions. The study focused on two molecules: dehydroacetic acid and alpha-tocopherol. Both gas chromatography coupled with tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) and liquid chromatography coupled with ultrahigh resolution mass spectrometry (LC-UHR-MS) were used for the separation and the structural identification of photoproducts. The main photoproducts were detected in the reference emulsion after UV-visible irradiation, thus showing the possible formation of photoproducts in a complex oil/water emulsion. Both in silico and in vitro toxicity tests highlighted the need for taking into account the potential formation of photoproducts in the safety evaluation of a cosmetic product

Ce travail s’inscrit dans la problématique « pollution de l’air intérieur et prévalence de l’asthme ». Notre approche s’est voulue épidémiologique et expérimentale. Les effets de différents polluants de l’air intérieur sur la survenue d’infections des voies respiratoires basses ont été analysés chez 196 nourrissons de la cohorte PARIS. Pour étudier les effets in vitro des polluants aériens sur la réponse inflammatoire des cellules épithéliales respiratoires, un modèle d’exposition air-liquide adapté aux cellules alvéolaires et bronchiques a été développé. Concernant le volet épidémiologique, aucune relation entre les niveaux des polluants et la survenue d’infection des voies respiratoires basses n’est mise en évidence, hormis une tendance pour la nicotine ; l’effectif et le faible niveau d’exposition aux polluants (dont le formaldéhyde (FA)) sont à prendre en compte dans ce résultat. Le volet expérimental a permis de développer un modèle in vitro unique et modulable, permettant de faire varier divers paramètres (type cellulaire, polluant, traitement concomitant des cellules, nombre d’expositions,…). Les atmosphères d’exposition (FA-50 µg/m3 et Aspergillus fumigatus-Asp-7x108 spores/m3) ont été générées à des niveaux environnementaux et contrôlées. Dans nos conditions expérimentales, après sensibilisation cellulaire, le FA induit une modification modérée de la production d’IL-8 et de MCP-1. Le modèle a permis une exposition séquentielle au FA-Asp pour mimer la multi-exposition, qui n’a pas induit d’effet cellulaire majeur. Cette démarche originale peut se poursuivre en l’appliquant à des conditions se rapprochant plus encore de l’exposition humaine aux polluants aériens
This work lies within the framework of "indoor air pollution and asthma". Our approach is epidemiological and experimental. The effects of various pollutants in indoor air on the occurrence of lower respiratory tract infections were analyzed in 196 infants in the birth cohort PARIS. To study the in vitro effects of air pollutants on the inflammatory response of respiratory epithelial cells, an exposure model suitable for air-liquid alveolar and bronchial cells was developed. Regarding the epidemiological study, no association between the pollutant levels and the occurrence of lower respiratory tract infection was found, except for a tendency with nicotine. The absence of association could be related to the size of the population and the low pollutant levels (including formaldehyde (FA)). The in vitro model we developed showed to be flexible, with variable parameters (cell type, pollutant, sensitization, number of exposures,. . . ). The exposure atmospheres were generated at environmental levels, FA-50 µg/m3 and Aspergillus fumigatus-Asp-7x108 spores/m3, were controlled. In our experimental conditions, after cell sensitization, FA induced a moderate change in the production of IL-8 and MCP-1. The model of sequential exposure to FA-Asp, mimicking the multi-exposure, did not induce major cellular effect. This original approach may be continued by applying it to closer conditions to the human exposure to air pollutants

Les propriétés exceptionnelles des nanotubes de carbone (CNT) attirent de nombreux industriels dans les domaines de la microélectronique, des matériaux ou de la nanomédecine. Néanmoins, le risque sanitaire lié à ce nanomatériau reste encore mal compris. Des profils toxicologiques différents, dépendant des caractéristiques physico-Chimiques des CNT, ont été mis en évidence. Une approche « safer by design » est proposée, afin d’identifier les paramètres pouvant, dès la conception des CNT, pour limiter le risque sanitaire. Dans ce contexte, cette thèse avait pour objectif d’étudier l’impact sur la réponse in vitro d’une lignée de macrophages murins (RAW 264.7) de deux traitements de post-Production de CNT : la fonctionnalisation acide et le recuit haute température.Les groupements acides en surface des CNT fonctionnalisés ont entrainé une augmentation de la réponse pro-Inflammatoire sans influencer significativement la cytotoxicité. D’un autre côté, la fonctionnalisation acide, principalement par l’élimination des impuretés métalliques, a permis de diminuer le stress oxydant. Les CNT recuits à haute température étaient à l’origine d’une réponse pro-Inflammatoire plus importante que les CNT bruts, confirmant lasensibilité de cette réponse biologique à la chimie de surface. En revanche, le recuit n’a pas diminué significativement le stress oxydant malgré la purification des CNT, suggérant l’importance des défauts de structure sur cette réponse biologique. La fonctionnalisation acide de nano-Graphite et de noir de carbone a eu un impact similaire à celle des CNT sur l’activité biologique des macrophages. La comparaison de ces trois nanomatériaux fonctionnalisés semble s’accorder avec le paradigme mettant en exergue la toxicité spécifique des fibres et des plaquettes. Enfin, afin de compléter ces résultats, des études exploratoires sur les interférences entre les tests de toxicité et les CNT, ainsi que sur le stress oxydant, ont été conduites
Due to their exceptional properties, carbon nanotubes (CNT) have aroused a huge interest among in industrial fields such as microelectronics, material science and nanomedicine. Nevertheless, the health impacts of this nanomaterial still remain not well understood. The first toxicological studies pointed out that there is no unique response regarding the healthimpact of the CNT, but different toxicological profiles according to their various physicochemical properties. A safer by design approach is thus proposed to identify the parameters decreasing from their production the CNT biological impacts. In this context, this work aimed at studying the impact on the in vitro response from a macrophage cell line (RAW 264.7) of two post-Production treatments: acid functionalization and high temperature annealing.Surface acid groups from functionalized CNT enhanced the pro-Inflammatory response although the cytotoxicity remained stable. On the other hand, acid functionalization, through the elimination of metallic impurities, significantly decreased the oxidative stress. Annealed CNT increased the pro-Inflammatory response compared to the pristine CNT. It thus confirmed the sensitivity of this response for the changes in surface chemistry. However, the high temperature annealing did not influence the oxidative stress, despite of the CNT purification. It suggested that structural defects are also of importance for this response. Besides, the acid functionalization of nano-Graphite and carbon black displayed trends in the macrophage response similar to the acid functionalization of CNT. The comparison of these three carbon-Based nanomaterials seemed to conform to the fibre and platelets paradigm. Eventually, exploratory studies have also been conducted on the interferences between CNT and the toxicity assays, and on the oxidative stress

L’un des enjeux de l’industrie pharmaceutique aujourd’hui est de développer des modèles de foie in vitro fidèles pour améliorer la prédictivité des études précliniques, notamment l’étude de la toxicité et de l’efficacité des médicaments candidats. Ces dernières années, l’ingénierie tissulaire, approche multidisciplinaire pour développer des tissus, a mené au développement de nouvelles méthodes de culture cellulaire. Parmi elles, les cultures de cellules en 3D ou en perfusion ont permis d’obtenir des activités hépatiques similaires à celles observées in vivo. L’objectif de cette thèse est de combiner ces deux méthodes de culture cellulaire pour créer un modèle de foie in vitro encore plus fidèle. Pour cela, nous cherchons à développer un cryogel d’alginate intégré en micropuce avec des propriétés mécaniques adaptables à celles du foie en fonction de l’état physiologique à reproduire (foie sain ou pathologique). Dans la première partie, nous développons et caractérisons le cryogel d’alginate au niveau microscopique et macroscopique, à l’extérieur (échantillons cylindriques) puis à l’intérieur de la biopuce. Trois paramètres sont étudiés ici : la température de cryopolymérisation, la concentration d’alginate ainsi que la quantité d’agents réticulants. Les propriétés mécaniques, la porosité, l’absorption, l’interconnectivité des pores et la résistance au flux sont analysés.La deuxième partie vise à cultiver des cellules hépatiques au sein de ce nouveau dispositif. Pour cette étude de faisabilité la lignée cellulaire HepG2/C3A est utilisée. Les résultats montrent des cellules viables et fonctionnelles (production d’albumine, transformation d’APAP). De plus, nous observons une structure tissulaire 3D, qui se maintient après retrait du cryogel d’alginate. La dernière partie a pour but de complexifier le modèle hépatique, notamment par des co-cultures. Pour se rapprocher de la structure du sinusoïde, des cellules hépatiques sont cultivées avec des cellules endothéliales (HUVEC) selon deux approches. De plus, la possibilité de suivre des cellules tumorales circulantes (MDA-MB-231) dans le système est étudiée
Today, one of the challenges for the pharmaceutical industry is to develop accurate in vitro liver models to improve the predictability of preclinical studies, in particular the study of the toxicity and efficacy of drug candidates. In recent years, tissue engineering, a multidisciplinary approach to develop tissues, has led to the development of new cell culture methods. Among them, cell cultures in 3D or in perfusion allowed to obtain hepatic activities similar to those observed in vivo. The objective of this thesis is to combine these two cell culture methods to create an even more accurate in vitro liver model. To do so, we are seeking to develop an alginate cryogel integrated into a microchip with mechanical properties adaptable to those of the liver depending on the physiological state to be reproduced (healthy or pathological liver).In the first part, we develop and characterize the alginate cryogel at the microscopic and macroscopic level, outside (cylindrical samples) and then inside the biochip. Three parameters are studied here: the cryopolymerization temperature, the alginate concentration and the quantity of cross-linking agents. Mechanical properties, porosity, absorption, pore interconnectivity and flow resistance are analyzed. The second part aims to culture liver cells within this new device. For this feasibility study the HepG2/C3A cell line is used. The results show viable and functional cells (albumin production, APAP transformation). In addition, we observe a 3D tissue structure, which is maintained after removal of the alginate cryogel. The last part aims to complexify the hepatic model, in particular by co-cultures. To get closer to the sinusoid structure, liver cells are cultured with endothelial cells (HUVEC) according to two approaches. In addition, the possibility to follow circulating tumor cells (MDA-MB-231) in the system is studied