Dissertations / Theses on the topic 'Infections bactériennes à Gram négatif'

Chez les bactéries à Gram négatif, toutes les protéines destinées à la membrane externe sont synthétisées avec une séquence signal qui est clivée lors de leur acheminement. Ce clivage s’effectue lors du passage de la membrane interne, par LepB pour les protéines intégrales de la membrane externe ou par LspA pour les lipoprotéines. Les séquençage du génome de Dickeya dadantii a permis de mettre en évidence une seconde machinerie de sécrétion de type II nommée Stt (pour Second Type Two). En aval de ce système se trouve un gène dénommé pnlH dont le produit est homologue à des pectines lyases. L’étude de cette protéine a montré qu’elle est un substrat de la machinerie Stt qui permet son passage de la face interne de la membrane externe à sa face externe. En l’absence de Stt ou chez Escherichia coli, PnlH est localisée à la face interne de la membrane externe. Cet ancrage est dû à l’extrémité N-terminale de la protéine qui n’est pas clivée lors du passage de la membrane interne et contient toute l’information pour l’adressage de la protéine. En effet, la fusion des 41 premiers acides aminés de PnlH à des protéines de différents compartiments cellulaires provoque l’adressage de celle-ci à la membrane externe. L’analyse plus approfondie de cette partie N-terminale montre certaines caractéristiques d’une séquence signal Tat-dépendante, permettant le passage de la membrane interne par le système Tat. L’analyse de mutants de la séquence signal ou de la machinerie Tat a confirmé que celle-ci est nécessaire pour le transfert de PnlH à travers la membrane interne. Ainsi, l’analyse de l’adressage de PnlH à la membrane externe a permis de mettre en évidence une nouvelle voie d’acheminement de protéines à la membrane externe des bactéries. Ce nouveau mécanisme de ciblage de protéines à la membrane externe est probablement répandu puisque PnlH est aussi localisée à la membrane externe quand elle est exprimée dans le E. Coli. PnlH n’étant pas détectée comme substrat de la machinerie Tat par les programmes de prédiction, cela suggère qu’il reste à découvrir d’autres protéines de la membrane externe Tat-dépendante encore non identifiées
In Gram negative bacteria, ali the proteins destined for the outer membrane arc synthesized with a sequence signal which is cleaved during their routing. This cleavage is perfonned during the passage of the inner membrane, by LepB for outer membrane proteins (OMPs) or by LspA for lipoproteins. The sequencing of the genome of Dickeya dadamii allowed to bring to Light a second type II secretion machinery named Stt (for Second Type Two). Downstream to this system is a gene called pnlH, the product of which has homology with pectin lyases. The study of this protein showed that it is a substrate of the Stt machinery which allows its passage from the inner face to the outer face of outer membrane. In absence of Stt or in Escherichia coli, PnlH is localized in the inner face of the outer membrane. This anchoring is due to the terminal extremity of the protein which is not cleaved during the crossing of the inner membrane and contains all the information for the addressing of the protein. Indeed, the fusion of the first 41 amino acids of PnlH with proteins of various cellular compartments allows the addressing of these hybrids to the outer membrane. A more detailed analysis of this N-tenninal part shows characteristies of a Tat-dependant sequence signal, allowing the passage of the inner membrane by the Tat system. Analysis of mutants of the sequence signal or of the machinery Tat confirmed that this one is necessary for the passage of PnlH through the inner membrane. So, the analysis of the addressing of PnlH to the outer membrane allowed the identification a new way of routing of proteins to the outer membrane of bacteria. This new mechanism of targeting of proteins in the outer membrane is probably widespread because PnlH is also localized in the outer membrane when it is expressed in E. Coli. Since PnlH is not detected as a substrate of the Tat machinery by the prediction programs this suggests that other Tat targeted outer membrane proteins remain to be identified

Les infections nosocomiales et la résistance bactérienne aux antibiotiques sont répandues au niveau mondial avec une prévalence plus élevée dans les pays en développement aux ressources limitées dont le Liban. Au Liban, les données épidémiologiques sur la résistance chez les bactéries à Gram négatif aux antibiotiques de dernier recours dans les hôpitaux et sur les infections nosocomiales sont rares. Objectifs : Nous avons conduit trois travaux visant à répondre aux objectifs suivants : une première étude pour identifier et comparer les différentes bactéries identifiées dans les infections communautaires et les infections nosocomiales, en mettant l'accent sur les comorbidités et les facteurs sociodémographiques associés. Puis deux études ciblant la résistance aux antibiotiques de dernier recours chez les bacilles à Gram négatif afin d’en décrire l’épidémiologie et d’identifier les caractéristiques des patients associées à cette résistance. La mortalité chez les patients porteurs d’un bacille à Gram négatif résistant aux carbapénèmes a été analysée. Méthodes. Le premier travail a consisté en une étude de cohorte rétrospective, multicentrique, menée dans cinq hôpitaux. Les données ont été recueillies à l'aide d'une fiche standardisée (données démographiques : genre et âge, maladies sous-jacentes et type d’infection acquise). Les deux autres études ont reposé sur une étude de cohorte prospective à partir d’une base de données constituée dans neuf hôpitaux libanais entre 2016-2017 (caractéristiques des patients, variables liées à l’hospitalisation et variables liées aux caractéristiques de l’infection). Les données ont été collectées et traitées avec Statistical Package for the Social Sciences SPSS, version 24. Des régressions logistiques ont été utilisées pour définir le profil des patients pour chaque type de résistance (céphalosporines de 3° génération- C3G, fluoroquinolones, aminosides, carbapénémes) observées chez les bacilles à Gram négatif (entérobactérales, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii). Une analyse de sensibilité basée sur les résultats extrêmes des valeurs manquantes relatives à la sensibilité des bactéries a permis de prendre en compte les données manquantes et de fournir des résultats robustes. Résultats. La première étude a montré l’importance des bacilles à Gram négatif résistants aux antibiotiques au sein des infections nosocomiales mais aussi des infections communautaires avec deux facteurs indépendants de l’acquisition d’une infection nosocomiale : âge avancé et état d'immunosuppression. Les deux autres études ont montré des pourcentages de résistances élevées chez les bacilles à Gram négatif ciblés et ont permis d’établir différents profils de patients pour chaque type de résistance. Par exemple, pour Escherichia coli, la résistance aux C3G était associée à une admission antérieure à l’hôpital et à la présence d’une sonde urinaire. De la même façon, la résistance aux carbapénèmes chez les bacilles à Gram négatif était associée aux patients chirurgicaux, à la présence d’une sonde urinaire ainsi qu’à une infection pulmonaire ou du site opératoire. Concernant la mortalité globale, le modèle proportionnel de Cox a montré que la résistance aux carbapénèmes était associée à une différence significative en termes de survie hospitalière chez les patients porteurs de bacilles à Gram négatif non fermentants par rapport aux bactéries sensibles. Conclusions. Nous avons rapporté la résistance aux antibiotiques de derniers recours chez les entérobactérales (E. coli et entérobactérales non- E. coli) et les bacilles à Gram négatif non fermentants identifiées dans des hôpitaux libanais où les données épidémiologiques sont rares. La description des profils de patients porteurs de ces souches bactériennes résistantes permettra aux cliniciens de prescrire une antibiothérapie probabiliste adaptée
Hospital-acquired infections and bacterial resistance to antibiotics are widespread worldwide, with a higher prevalence in developing countries with limited resources, including Lebanon. In Lebanon, epidemiological data on resistance among Gram-negative bacteria to antibiotics of last resort in hospitals and on nosocomial infections are scarce. Aims: We conducted three studies to meet the following objectives: a first study to identify and compare the different bacteria identified in communityacquired infections and nosocomial infections, focusing on associated co-morbidities and sociodemographic factors. This was followed by two studies targeting resistance to last-resort antibiotics in Gram-negative bacilli, in order to describe the epidemiology and identify patient characteristics associated with this resistance. Mortality in patients with Gram-negative bacilli resistant to carbapenems was analyzed. Methods. The first study was a retrospective, multicenter cohort study conducted in five hospitals. Data were collected using a standardized form (demographic data: gender and age, underlying diseases and type of acquired infection). The other two studies were based on a prospective cohort study using a database compiled in nine Lebanese hospitals between 2016 and 2017 (patient characteristics, variables related to hospitalization and variables related to the characteristics of the infection). Data were collected and processed using Statistical Package for the Social Sciences SPSS version 24. Logistic regressions were used to define the profile of patients for each type of resistance (3rd generation cephalosporins-3GC, fluoroquinolones, aminoglycosides, carbapenem) observed in Gram-negative bacilli (Enterobacteria, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii). A sensitivity analysis based on the extreme results of the missing values for bacterial sensitivity was used to take account of the missing data and provide robust results. Results. The first study showed the importance of Gram-negative bacilli resistant to antibiotics in both hospital and community-acquired infections, with two independent factors in the acquisition of a nosocomial infection: advanced age and immunosuppression. The other two studies showed high percentages of resistance in the targeted Gram-negative bacilli and established different patient profiles for each type of resistance. For example, in Escherichia coli, resistance to 3GC was associated with previous hospital admission and the presence of a urinary catheter. Similarly, resistance to carbapenems in Gram-negative bacilli was associated with surgical patients, the presence of a urinary catheter, and pulmonary or surgical site infection. In terms of overall mortality, the Cox proportional model showed that carbapenem resistance was associated with a significant difference in hospital survival in patients with nonfermenting gram-negative bacilli compared with susceptible bacteria. Conclusions. We report on resistance to antibiotics of last resort in enterobacteria (E. coli and Non-E. coli enterobacterales) and non-fermenting Gram-negative bacilli identified in Lebanese hospitals, where epidemiological data are scarce. Describing the profiles of patients carrying these resistant bacterial strains will enable clinicians to prescribe appropriate probabilistic antibiotic therapy

La découverte de molécules antibiotiques au XXe siècle a permis de traiter plusieurs maladies infectieuses bactériennes, auparavant mortelles. Cependant, cette avancée thérapeutique s'est suivie d'une utilisation massive, répétée et inadéquate des antibiotiques, conduisant à la montée de l'antibiorésistance. Ce phénomène est alarmant puisqu'on estime à 4,95 millions le nombre de décès associés à la résistance aux antibiotiques en 2019. L'un des mécanismes de résistance mis en place par les Enterobacterales et les bactéries à Gram négatif en général est la (sur)expression des pompes d'efflux. Ces pompes sont capables de prendre en charge plusieurs classes d'antibiotiques différentes, diminuant ainsi leur concentration intrabactérienne et les rendant inefficaces. Une des stratégies envisagées pour contourner ce phénomène de résistance est le développement d'inhibiteurs de pompes d'efflux qui, en combinaison avec un antibiotique, pourront offrir une nouvelle alternative thérapeutique pour traiter les infections bactériennes résistantes.AcrAB-TolC est une pompe d'efflux de la superfamille RND exprimée chez les Enterobacterales telles qu'Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae. Afin d'identifier des inhibiteurs de cette pompe, une chimiothèque de 1280 fragments a été criblée sur E. coli en combinaison avec un antibiotique modèle substrat de cette pompe, permettant la sélection d'un composé hit appartenant à la famille des pyridylpipérazines. Ce hit n'a pas d'activité antibactérienne intrinsèque, mais il est capable de potentialiser l'activité d'un panel d'antibiotiques par inhibition directe de la protéine AcrB. Des premières études de relations structure-activité ont permis d'identifier deux séries chimiques, la série quinoléine/quinoxaline et la série pyridine. Des modifications structurales autour de ces trois noyaux ont été réalisées grâce à un design rationnel basé sur les structures co-cristallographiques obtenues avec AcrB. 80 composés ont ainsi été synthétisés afin d'identifier des analogues plus puissants et d'établir de nouvelles relations structure-activité. L'introduction de différents substituants possédant une fonction amine a notamment permis de créer de nouvelles interactions avec des résidus acides de la poche d'AcrB. Les paramètres physicochimiques et pharmacocinétiques in vitro des composés les plus prometteurs ont ensuite été mesurés, ce qui a permis la sélection d'un composé pour une étude de pharmacocinétique chez la souris. Afin de sonder plus largement la diversité chimique des substituants introduits sur les noyaux quinoléine et pyridine, une chimiothèque de 672 triazoles a été synthétisée via une réaction de cycloaddition catalysée au cuivre. Le but était d'augmenter la puissance des composés en créant de nouvelles interactions avec la poche d'AcrB tout en diminuant la cytotoxicité et l'activité antibactérienne intrinsèque des composés. Ceci a permis d'identifier de nouveaux composés ayant des activités prometteuses et qui seront prochainement resynthétisés afin de caractériser leur effet biologique et de mesurer leurs propriétés ADME
The discovery of antibiotics in the 20th century allowed to treat a number of previously fatal bacterial infectious diseases. However, this therapeutic progress was followed by a massive, repeated and inappropriate use of antibiotics, leading to the rise of antimicrobial resistance. This phenomenon is alarming, with an estimated 4.95 million deaths associated with antibiotic resistance in 2019. One of the resistance mechanisms developed by Enterobacterales and overall Gram-negative bacteria is the (over)expression of efflux pumps. These bacterial pumps are able to extrude several classes of antibiotics, thereby reducing their intrabacterial concentration and rendering them ineffective. One strategy being considered to circumvent this phenomenon is the development of efflux pump inhibitors which, in combination with an antibiotic, could offer a new therapeutic alternative to treat resistant bacterial infections.AcrAB-TolC is an efflux pump of the RND superfamily found in Enterobacterales such as Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. In order to identify inhibitors of this pump, a chemical library of 1280 fragments was screened on E. coli in combination with a model antibiotic substrate of this pump, leading to the selection of a hit compound belonging to the pyridylpiperazine family. This hit has no intrinsic antibacterial activity, but is able to potentiate the activity of a range of antibiotics by direct inhibition of the AcrB protein. Initial studies of structure-activity relationships have allowed the identification of two chemical series, the quinoline/quinoxaline series and the pyridine series. Structural modifications around these three cores were carried out using a rational design based on the co-crystallographic structures obtained with AcrB. 80 compounds were therefore synthesised in order to identify more potent analogues and establish new structure-activity relationships. In particular, the introduction of different substituents with an amine function allowed to create new interactions with acidic residues in the AcrB binding pocket. The physicochemical and in vitro pharmacokinetic parameters of the most promising compounds were then measured, leading to the selection of one compound for a pharmacokinetic study in mice. In order to enrich the chemical diversity of substituents introduced on the quinoline and pyridine rings, a chemical library of 672 triazoles was synthesised via a copper-catalysed cycloaddition reaction. The aim was to increase the potency of the compounds by creating new interactions with AcrB while reducing the cytotoxicity and intrinsic antibacterial activity of the compounds. This led to the identification of new compounds with promising activities, which will soon be resynthesised in order to characterise their biological effect and measure their ADME properties

L’émergence des bactéries résistantes aux béta-lactamines et aux carbapénèmes, a abouti à la réintroduction de la colistine comme agent de dernier recours pour traiter les infections dues à ces germes. Cependant, les résistances chromosomique et plus récemment plasmidique à la colistine ont apparu. Ce problème de bactéries multi-résistantes a par la suite déclenché la publication d’articles alarmants sur les dangers de ces germes. Pour répondre à la dramatisation médiatique liée à ce problème, mon projet de thèse vise à proposer des stratégies thérapeutiques pour traiter les infections dues aux bactéries multi-résistantes. Dans un premier temps, nous avons testé l’activité d’un large panel comprenant des anciens antibiotiques contre les bactéries résistantes aux carbapénèmes et d’autres résistantes à la colistine. Plusieurs familles d’antibiotiques ont été efficaces contre ces 2 types de bactéries résistantes.Dans un deuxième temps, nous avons évalué l’activité d’antibiotiques combinés en vue de détecter une synergie d’action. Deux combinaisons synergiques ont été retenues : colistine + sulfadiazine et colistine + acide fusidique. Ces associations d’antibiotiques ont démontré un effet bactéricide sur une collection de bactéries Gram négatives résistantes à la colistine, et ceci indépendamment du mécanisme de résistance
The emergence of beta-lactam and carbapenem resistant bacteria, resulted in the reintroduction of colistin as an agent of last resort to treat infections caused by these bacteria. However, chromosomal resistances and more recently plasmidic to colistin appeared. This problem of multidrug-resistant bacteria subsequently triggered the publication of alarming articles on the dangers of these germs. To answer the media dramatization related to this problem, my thesis project aims to propose therapeutic strategies to treat infections due to multiresistant bacteria.Initially, we tested the activity of a large panel including old antibiotics against carbapenem resistant bacteria and others resistant to colistin. Several families of antibiotics have been effective against these two types of resistant bacteria.In a second step, we evaluated the activity of combined antibiotics in order to detect a synergistic action. Two synergistic combinations were retained: colistin + sulfadiazine and colistin + fusidic acid. These combinations of antibiotics have shown a bactericidal effect on a collection of Gram-negative colistin-resistant bacteria, independent of the resistance mechanism

L’augmentation et la dissémination de la résistance aux β-lactamines chez les bacilles à Gram négatif, particulièrement les Entérobactéries, les bactéries du genre Pseudomonas et Acinetobacter, représentent un problème majeur de santé publique. Les infections nosocomiales causées par ces bactéries multi-résistantes (BMR) ont conduit à une augmentation de la mortalité, de la morbidité et du coût de traitement. L’utilisation abusive et non contrôlée de ces antibiotiques a grandement contribué à la large diffusion de cette résistance. Ainsi, face à cette préoccupation mondiale et suite à de nombreuses recommandations, plusieurs études épidémiologiques et moléculaires ont été rapportées afin de contrôler et de surveiller la diffusion et la dissémination des BMR. Contrairement à de nombreuses régions dans le monde, il existe peu d’informations concernant la caractérisation moléculaire des gènes de résistance aux β-lactamines des bacilles à Gram négatif isolés en Tunisie et surtout en Libye. C’est dans cette optique que ce projet de Thèse de Doctorat s’articule avec comme objectifs: (i) mettre en évidence la prévalence des bacilles à Gram négatifs multi-résistants isolés aux niveaux des hôpitaux tunisiens et libyens (ii) identifier le support génétique de la résistance aux β-lactamines de ces souches cliniques (iii) étudier la diversité clonale des souches multi-résistantes par typage moléculaire
The increase and spread of β-lactam resistance in gram negative bacteria especially Enterobacteriaceae, Pseudomonas and Acinetobacter (E.P.A) species have become a major concern worldwide. The hospital-acquired infections caused by MDR bacteria have led to an increase in mortality, morbidity and cost of treatment. The frequent misuse of antibiotic drug has greatly contributed to worldwide dissemination of antibiotics resistance. Front of this worldwide concern, and various recommendations, several epidemiological and molecular studies have been reported in order to control the spread and the dissemination of these MDR. Unlike many parts of the world, there is little information concerning the molecular characterization of the β-lactam resistance genes of Gram-negative bacilli isolated in Tunisia and especially in Libya. Therefore, it is in this context that the project of this thesis was conducted with essential objectives: (i) highlight the prevalence of multi-resistant Gram negative bacilli isolated in Tunisian and Libyan hospitals (ii) identify the genetic support of resistance to β-lactams of these clinical strains (iii) study the clonal diversity of the multi-resistant strains by molecular typing (iii) study the molecular epidemiology of these BMRs in these countries in order to control the decision-making process of the treatment and the rapid identification of epidemics by implementing appropriate control measures for the spread of infections and especially developing new tools and software for the diagnosis and monitoring of potential MDR bacteria in Mediterranean countries

Les ump kinases bacteriennes constituent une classe particuliere des nucleoside monophosphate kinases. Elles ne montrent aucune homologie de sequences et de structure avec celles-ci mais s'apparentent aux proteines de la famille des carbamate kinases. Leur forme active est hexamerique et regulee par l'utp et le gtp. Leur localisation intracellulaire peripherique inhabituelle suggere d'autres fonctions biologiques. Les etudes cinetiques de ces enzymes ont montre des differences notables de regulation par les nucleotides entre les ump kinases des organismes de bacteries a gram-positif et celles des organismes a gram-negatif. Les premieres montrent une dependance cooperative de l'activite en fonction de la concentration d'atp. Les effecteurs se lient au meme site, le site allosterique, et agissent sur l'affinite pour l'atp independamment de la presence de magnesium. Au contraire, aucune cooperativite pour les substrats n'est observee pour les ump kinases de bacteries a gram-negatif ; cependant l'ump en exces est inhibiteur. Les effecteurs se lient sur deux sites differents, le site allosterique pour le gtp dont le role est principalement de lever l'inhibition par exces de substrat alors que le site utp chevauche le site actif. L'utp, inhibiteur uniquement sous forme non complexee au magnesium, diminue les affinites pour l'ump et pour l'atp selon un mecanisme que nous nous proposons d'appeler inhibition competitive cooperative. Plusieurs structures 3d d'ump kinases bacteriennes ont ete resolues ces deux dernieres annees et ont mis en evidence les acides amines impliques dans la catalyse, l'oligomerisation et la communication entre les sous-unites de l'hexamere
Bacterial ump kinases are a particular class of nucleoside monophosphate kinases and show similarities to proteins of carbamate kinases family. They are hexameric and subject to a complex regulation by gtp and utp. They are localized near the membranes suggesting another biological function. Kinetics studies showed significant differences in the activity regulation by nucleotides between enzymes from gram-negative and gram-positive bacteria. Atp binding is cooperative for ump kinases from gram-positive bacteria. Both effectors bind to the same allosteric site and act independently of magnesium. They show opposite effects, le. Decrease of atp affinity for utp and increase of atp affinity for gtp. Dependence of activity of ump kinases from gram-negative bacteria is hyperbolic in function of atp and exhibits a biphasic behaviour in function of ump where ump in excess is strongly inhibitory. Gtp and utp have two distinct binding sites. Gtp reverses inhibition by excess of ump with only slight changes in substrate affinities for enzymes from gram-negative bacteria. Utp acts only in mg-free form by increasing the km for both substrate and its binding site overlaps the active site of ump kinases from gram-negative bacteria via a mechanism named competitive and cooperative inhibition. Despite the diversity in responses to nucleotides as substrates or effectors, ump kinases from gram-negative and gram-positive bacteria share overall fold and quaternary structure as shown by the three-dimensional structures resolved during the last two years. In addition, these studies pointed at amino agios responsible for catalysis, oligomerization or cross-talk between subunits of the hexamer

Les infections dues aux bactéries gram-négatif multi résistantes en particulier la résistance aux carbapénèmes, représentent un problème majeur de santé publique. La hausse des taux de résistance à ces antibiotiques a conduit à la réutilisation de la colistine, comme alternative thérapeutique de dernier recours. Notre travail de thèse s'est concentré sur l'étude épidémiologique de la résistance aux antibiotiques d’isolats cliniques au Liban. Nos travaux se sont scindés en 4 chapitres, avec trois objectifs principaux; (i) l'étude des bactéries résistantes aux carbapénèmes, (ii) l'élucidation des mécanismes moléculaires de la résistance à la colistine (iii) l'émergence de bactéries à Gram-positif résistantes à la vancomycine. Initialement, une revue de la littérature sur l'épidémiologie et les facteurs de risque associés à l'infection bactérienne au cours de conflits armés et catastrophes naturelles en Asie et au Moyen Orient a été rédigée. Dans le deuxième chapitre nous avons cherché à voir l'effet du changement de traitement de la combinaison colistine-carbapénème à la colistine en monothérapie sur la résistance d’A. baumannii, en plus de la détection du blaVIM-2 codé par plasmide. Dans le troisième chapitre, nous avons détecté la propagation de bactéries gram-négatif résistantes à la colistine en raison de la mutation des (pmrA /pmrB, phoP/phoQ), ou mgrB. Enfin, nous détectons l'émergence du gène vanA d'E. faecium. Il serait nécessaire de mettre en place des enquêtes de surveillance de l’usage des antibiotiques pour éviter la propagation de souches résistantes à ces antibiotiques au Liban
Infections due to multidrug-resistant gram-negative bacteria especially the resistance to carbapenems, have become a major public health problem. This increase in resistance to antibiotics has led to the resuscitation of colistin, as a last-resort treatment option. Our PhD work focused on the epidemiological study of the antibiotic resistance of clinical isolates in Lebanon. This thesis is divided into 5 chapters with three main objectives; (1) the investigation of carbapenem-resistant bacteria in Lebanese hospitals. (2) the Elucidation of the molecular mechanisms of colistin-resistant bacteria in Lebanese patients, and (3) the emergence of vancomycin-resistant gram-positive bacteria in Lebanon. At the start of this thesis, we have prepared a literature review on the epidemiology and the risk factors associated with bacterial infection in conflict wounded and natural disaster in Asia and the Middle East. The second chapter aimed to see the effect of the shift of treatment from colistin-carbapenem combination to colistin monotherapy on the prevalence and resistance of A. baumannii, in addition to the detection of the plasmid-encoded blaVIM-2 gene. In the third chapter, we have detected the spread of colistin-resistant gram-negative bacteria due to mutation of the two-component systems (pmrA /pmrB, phoP/phoQ), or mgrB. We detect the emergence of vanA of Enterococcus faecium resistant to vancomycin. This observation confirms that colistin resistance in Gram-negative bacteria is indeed increasing. In conclusion, it appears necessary and urgent to set up surveys to monitor the use of antibiotics to prevent the spread of resistant strains in Lebanon

Le microbiote digestif humain joue un rôle essentiel et bénéfique pour son hôte mais il est également impliqué dans un nombre croissant de pathologies. Les connaissances sur la composition de cet écosystème ont récemment été révolutionnées grâce à l’utilisation de techniques moléculaires. Cependant, ces techniques comportent des limites importantes. C’est ainsi que le concept de « culturomique » a été introduit ; il consiste en la multiplication de milieux et conditions de culture et l’identification rapide de colonies bactériennes par spectrométrie de masse (MALDITOF) ou par amplification et séquençage du gène de l’ARN ribosomal 16S. Dans la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence une association entre la présence de Clostridium butyricum dans les selles et la survenue d’entérocolite ulcéro-nécrosante que ce soit par méthodes de pyroséquençage et culture ou par PCR quantitative en temps réel spécifique de C. butyricum; identifié après séquençage du génome complet de toutes nos souches de C. butyricum, la présence du gène de la β-hémolysine (toxine). Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons montré par cuturomique que les bactéries à Gram-négatif (BGN) étaient fréquemment disséminées au sein du microbiote cutané transitoire des patients hospitalisés en réanimation ; le réservoir serait essentiellement digestif. En conclusion, le microbiote digestif constitue un réservoir sousestimé de bactéries pathogènes. La microbiologie moderne incluant les nouvelles méthodes de culture permet d’étendre de manière considérable les connaissances sur la composition de cet écosystème et son implication en pathologie humaine
He human gut microbiota plays an important and beneficial role in its host but it is also involved in a growing number of diseases. Knowledge of the composition of this ecosystem have recently been revolutionized by the use of molecular techniques. However, these techniques have significant limitations. Thus, the concept of "culturomics" has been introduced; it consists of the multiplication of culture conditions and the rapid identification of bacterial colonies by mass spectrometry (MALDI-TOF) or by PCR 16S RNA gene sequencing. In the first part of this work, we have demonstrated an association between the presence of Clostridium butyricum in the stool and the occurrence of necrotizing enterocolitis whether by pyrosequencing methods and Culture or by quantitative PCR specific real time C. butyricum; identified after sequencing the complete genome of all our strains of C. butyricum, the presence of the gene of β-hemolysin (toxin). In the second part of this work, we showed by cuturomics that Gram-negative bacteria (BGN) were frequently spread out over the transitional skin microbiota of patients hospitalized in intensive care; the reservoir would essentially digestive. In conclusion, the gut microbiota is an underestimated reservoir of pathogenic bacteria. Modern microbiology including new culture-based methods is currently extending exponentially our knowledge on gut microbiota giving rise to new insights into the pathogenesis or the transmission of infectious diseases

Le fer est un élément important de plusieurs métabolismes et fonctions physiologiques. Il possède la propriété de gagner ou de perdre facilement un électron, passant ainsi de la forme ferreuse (FeII) à la forme ferrique (FeIII), et inversement. C'est cette propriété qui lui confère un rôle primordial dans les phénomènes d'oxydations et de réductions biologiques. Bien qu'il soit très abondant dans la croûte terrestre, le fer est très peu soluble en milieu aérobie et à pH physiologique et est de ce fait est très peu biodisponible. La concentration de FeIII libre dans l'environnement est d'environ 10-18 M, bien trop basse pour les bactéries pathogènes qui exigent une concentration de l'ordre de 10-5 à 10–7 M pour établir et maintenir une infection. Pour contourner le problème de la faible disponibilité de fer, les bactéries ont développé différents mécanismes d'acquisition de ce métal. Le mécanisme le plus répandu implique la synthèse et la sécrétion des sidérophores, ayant une très forte affinité pour leFeIII. Après leur sécrétion, les sidérophores chélatent le Fe3+ dans le milieu extracellulaire et le transportent au travers de la membrane externe via les récepteurs TonB-dépendants (RTBDs). Les RTBDs sont également impliqués dans le transport d'autres molécules comme l'hème. Durant cette thèse nous nous sommes intéressés à l'étude structurale des RTBDs de différentes bactéries à Gram-négatif et aussi au devenir, au niveau du périplasme, de la ferri-pyoverdine, après son transport à travers la membrane externe via le RTBD FpvA chez P. aeruginosa. Pour les études structurales, nous nous sommes intéressés à 4 RTBDs (ShuA, SuxA, FauA et FetA). Nous avons défini et optimisé un protocole de surexpression, de purification et de cristallisation pour les RTBDs. Le protocole mis en place est rapide, efficace et reproductible. Il nous a permis de purifier, de cristalliser rapidement et de collecter des données de diffraction pour 4 RTBDs. La structure de ShuA a ensuite été résolue à 2,6 Å, celle de FauA à 2,3 Å de résolution par le Dr D. Cobessi. Celle de FetA est actuellement en cours d'affinement à 3,2 Å. Pour les études fonctionnelles, nous nous sommes intéressés à l'implication des gènes du cluster fpvCDEFGHJK dans l'acquisition du fer par la voie Pvd chez P. aeruginosa. Ce cluster est conservé chez toutes les espèces de Pseudomonas produisant la Pvd, il est organisé en 2 opérons, fpvCDEF et fpvGHJK, séparés par 32 paires de bases. Les résultats obtenus pendant cette thèse, suggèrent l'implication des protéines FpvCDEF dans la dissociation périplasmique de la ferri-pyoverdine par réduction du FeIII en FeII. En effet, la mutation de ces gènes abolie complètement le transport du fer par la Pvd. Le phénotype sauvage a été restauré par l'addition du DTT, suggérant l'implication de ses protéines dans la dissociation périplasmique de la ferri-pyoverdine par réduction du FeIII en FeII. Nous avons également montré que la protéine FpvG est une protéine périplasmique dont l'expression est régulée par les niveaux de fer. Les études de spectrométrie de masse et de dosage des métaux ont montré que cette protéine était également capable de lier directement le fer. Enfin, l'étude des interactions protéine-protéine a montré une interaction entre les protéines FpvG et FpvA, confirmant l'implication de la protéine FpvG dans le transport du fer par la Pvd. FpvG serait probablement impliquée dans la prise en charge du fer dans le périplasme après sa dissociation de la Pvd et assurant ensuite son transport vers le cytoplasme via le transporteur ABC FpvHJ. L'ensemble de ces résultats a permis également de montrer que le transport du fer via la Pvd implique des mécanismes très différents de ceux qui sont décrits précédemment pour les sidérophores utilisés par E. coli.

WGS permet d'analyser et de déchiffrer l'étude de résistances de bactéries multirésistantes(MDR), en comprenant les différents mécanismes de résistance, les annuaires génétiques. Au cours de ma thèse de doctorat, j'ai réalisé: 1 revue de la littérature sur l'utilisation de nouveaux outils de diagnostic contemporains et les capacités dans la détection des foyers dans les maladies infectieuses causées par MDR. L'identification et l'analyse de résistances de bactéries multirésistantes Comme étant des Shewanellalgae, normalement de l'environnement marin, dans notre cas une souche clinique isolée du lavage bronchoalvéolaire d'un patient hospitalis avec pneumonie et Chryseobacteriumin dologenes, isolé d'une fibrose kystique du patient. Dans cette analyse, nous pouvons montrer que les bactéries environnementales telles que les S.algae peuvent être un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques. L'analyse exhaustive de ces bactéries a montré leur capacité à s'adapter à leurs écosystèmes, y compris l'acquisition de nouveaux éléments génétiques par transfert latéral de gènes. La détection des gènes impliqués dans la synthèse de peptides synthetasenon ribosomale et de polycétide synthétase peut avoir un rôle dans leur capacité à survivre dans des environnements hostiles tels que le tractus respiratoire des patients atteints de fibrose kystique ou leur présence chez des patients ayant subi plusieurs antibiotiques. Nous avons réalisé une analyse standardisée «insilico» afin de déterminer la résistance de ces bactéries et la présence de métabolites secondaires associés aux bactériocines et aux NRPS/PKS. L'application du NTS pour le séquençage du génome bactérien de nouvelles espèces bactériennes isolées dans le microbiome humain nous a permis de développer une plateforme capable d'analyser ces nouvelles espèces dans les 48heures. Ce travail permet de mieux comprendre la biodiversité des bactéries isolées dans le microbiome humain
Theuse of WG Sallows to analyze and to decipherthe study of resistome of Multi Drug Resistant bacteria (MDR), understanding the different resistance mechanisms, genetic directories and their dissemination mechanisms at global level. During them y thesis I have achieved: 1. A literature review on the use of new contemporary diagnostic tools and capabilities in detecting out breaksin infectious diseases caused by MDR. 2: The identification and the analysis of resistome of multidrug resistant bacteria from clinical isolates suchasShewanellaalgae, normally marine environmental, in our case clinical strain isolated from the broncho alveolar lavage of a hospitalized patient with pneumonia and Chryseobacteriumin dologenes, isolated from a patient cysticfibrosis. In this analysis, we can show that environment albacteria suchas S.algae can be a reservoir of antibiotic resistance genes. The exhaustive analysis of these bacteria showed their ability to a dapttotheirecosystemsincludingtheacquisitionofnewgeneticelementsbylateralgenetransfer. The detection of genes in volved in the synthesis of nonribosomal peptide synthetase and polyketide synthases may have a role in their ability to survive in hostile environments suchas therespiratorytractofCFpatients or their presence inpatients having suffered multipleofantibiotic. 3:In this work,through theuse of the NTS onnew bacterial species isolated from human microbiome,we have a chieveda standardized analysis"insilico"to determine there sistome of these bacteria and the presence of secondary metabolites associated bacteriocins and the NRPS/PKS. The application of the NTS for sequenc in go bacterial genome of new bacterial species isolated in the human microbiome, allowe dus to develop a platform capable of analyzing the senew species within 48

La détection, la surveillance et la diffusion de la résistance des bactéries aux antibiotiques est un enjeu majeur au niveau mondial depuis la découverte et la diffusion de bactéries multi résistantes, en particulier la résistance aux carbapénèmes, spécifiquement chez les Entérobactéries et les bactéries du genre Pseudomonas et Acinetobacter. L’émergence et la dissémination des pathogènes Gram- résistants aux carbapénèmes est un contributeur significatif de la morbidité et la mortalité du patient. Malgré les efforts radicaux dans le contrôle de l’infection et les améliorations dans le diagnostique moléculaire, les bacilles Gram- résistants aux carbapénèmes demeurent une formidable menace vue que quelques agents antimicrobiens sont actifs et très peu devraient être disponibles dans le futur proche.L’origine et la source des gènes de résistance dans le monde sont mal connues et des travaux récents suggèrent que les animaux domestiques et sauvages, l’environnement mais également le tube digestif des mammifères et des humains pourraient représenter un réservoir et une source importante de gènes de résistance susceptibles d’être transmissibles à l’homme. C’est dans cette optique que ce projet de thèse s’articule avec comme objectifs : (i) la réalisation d’études épidémiologiques moléculaires d’isolats cliniques et animales résistants aux carbapénèmes isolés dans le basin Méditerranéen et la caractérisation des supports moléculaires de cette résistance ; (ii) la description de nouveaux mécanismes de résistance a l’imipenème ; et enfin (iii) le séquençage de génomes d’isolats cliniques résistants aux carbapénèmes et l’analyse de ces derniers
The detection, monitoring and dissemination of bacterial resistance to antibiotics are a major issue worldwide since the discovery and spread of multi-resistant bacteria, in particular resistance to carbapenems, specifically among Enterobacteriaceae and bacteria of the genus Pseudomonas and Acinetobacter.The emergence and dissemination of carbapenem-resistant Gram-negative pathogens is a significant contributor to patient morbidity and mortality. Despite radical efforts in infection control and improvements in molecular diagnostics, carbapenem-resistant Gram-negative bacilli remain a formidable threat as few antimicrobial agents are reliably active and very little is expected to be available in the near future.The origin and source of resistance genes in the world are not well known and recent works suggest that domestic and wild animals, the environment (soil, water, rivers ..) but also the digestive tract of mammals and humans could represent a reservoir and an important source of resistance genes that may be transmissible to humans.It is in this context that this thesis project articulates with the following objectives: (i) The achievement of molecular epidemiological studies on carbapenem-resistant clinical and animal isolates collected from countries in the Mediterranean basin (Lebanon, Libya, France) and the characterization of the genetic determinants of this resistance; (ii) the description of new resistance mechanisms to imipenem; and finally (iii) The genome sequencing of clinical isolates resistant to carbapenems, the analysis of these genomes and the identification of mechanisms and genetic supports of the resistance to carbapenems and other antibiotics

Les antibiotiques sont actuellement parmi les médicaments les plus utilisés, mais les schémas thérapeutiques optimaux ne sont pas toujours bien définis. Le but de cette thèse était de développer des modèles pharmacocinétiques (PK) et pharmacodynamiques (PK/PD) décrivant les profils de concentrations des antibiotiques ainsi que leurs effets et le développement de résistances bactériennes afin d’optimiser les schémas thérapeutiques.Un modèle PK de population sur la colistine et sa prodrogue, le colistine methanesulfonate (CMS), a été développé chez les patients recevant la colistine par voie aérosol et/ou sous hémodialyse (HD). Les résultats ont montré un net avantage de la voie aérosol pour le traitement des infections pulmonaires avec une dose de 2 MUI de CMS. Pour les patients sous HD une dose de 1.5 MUI de CMS 2 fois par jour est recommandée avec une dose supplémentaire de 1.5 MUI de CMS après chaque séance de HD.L’évaluation des performances de différents modèles PK/PD via à une approche par simulation a montré l’importance d’effectuer des études suffisamment longues ainsi que d’obtenir des données microbiologiques complémentaires afin de décrire le développement de la résistance bactérienne.Un modèle PK/PD incluant taux de mutation et résistance adaptative à la colistine d’une souche bioluminescente de Pseudomonas aeruginosa a été développé à partir de données in-vitro. Une résistance rapide, importante et partiellement réversible a été décrite. Ces résultats confirment l’importance des 24 premières heures dans le traitement des infections, que la colistine seule ne peut pas complétement éliminer les mutants de Pseudomonas aeruginosa et que des associations semblent nécessaires
Antibiotics are among the most commonly prescribed drugs, however optimal dosages are not yet well defined. The aim of this thesis was to develop pharmacokinetic (PK) and pharmacokinetic-pharmacodynamics (PK/PD) models that characterize the course of antimicrobial drug concentrations and effects over time, with an emphasis on the development of resistance. These models were applied to optimize dosing regimens of antimicrobial therapies.A population PK model for colistin and its prodrug, colistin methanesulfonate (CMS) was developed in critically ill patients receiving colistin by nebulization and/or undergoing an intermittent hemodialysis (HD). Results predicted clear benefits of using aerosol delivery of 2MIU CMS dose for the treatment of pulmonary infections. For patients with HD session dosing regimen of CMS should be 1.5 MIU twice daily with an additional dose of 1.5 MIU after each HD session.An assessment of the performances of different PK-PD models by using a simulation approach have shown the importance of longer study designs and of complementary microbiological data to predict accurately bacterial resistance development. A semi-mechanistic PK/PD model that incorporates mutation rate and adaptive resistance development of a bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa against colistin was developed based on in-vitro data. A high, quick and partially reversible resistance was described. These results confirm that the first 24 h of treatment are critical in the management of infections, that colistin alone cannot eradicate completely the mutants of Pseudomonas aeruginosa that were selected during the experiments and that combination therapies seem necessary

Nous avons évalué les différents aspects de la synergie entre des antibiotiques classiques et les huiles essentielles de certaines plantes, endémiques du Maroc, sur des bactéries résistantes impliquées dans les infections nosocomiales. Il s’agit de Thymus maroccanus, T. broussonetii, T. pallidus, T. riataraum et Rosmarinus officinalis. La combinaison de ces huiles essentielles avec des antibiotiques a révélé que parmi 80 combinaisons testées, 71% des combinaisons ont montré une synergie totale, 20% un effet synergique partiel et 9% des combinaisons n’ont pas d’effet synergique. De plus, les huiles essentielles de T. maroccanus et T. broussonetii ont pu augmenter considérablement la sensibilité de plusieurs isolats résistant au chloramphénicol. Elles peuvent restaurer la sensibilité au chloramphénicol en produisant une compétition vis-à-vis de son extrusion en bloquant les pompes impliquées dans son efflux. Par ailleurs, l’huile essentielle de T. maroccanus augmentait la perméabilité de la membrane des bactéries étudiées, et favorisait la libération des protéines intracellulaires dans le milieu extérieur. Elle perméabilise à la fois la membrane interne et la membrane externe des bactéries, mais sans causer une dégradation détectable des constituants cellulaires. Des altérations protéiques ont été associées à l'exposition prolongée aux composés naturels testés. Ces altérations se sont traduites par un efflux accru dont l'effet synergique est renforcé par la baisse du niveau de porines qui peuvent être impliquées dans la diffusion passive de ces antimicrobiens naturels, ce qui confère aux bactéries testées une tolérance accrue à ces composés
We evaluated different aspects of the synergy between conventional antibiotics and essential oils of some Moroccan endemic plants, on resistant bacteria involved in nosocomial infections. These plants were: Thymus maroccanus, T. broussonetii, T. pallidus, T. riataraum and Rosmarinus officinalis. Out of 80 combinations tested between these two essential oils and antibiotics, 71% showed total synergism, 20% had partial synergistic interaction and 9% showed no effect. Combination with carvacrol, the major constituent of T. maroccanus and T. broussonetii, showed also an interesting synergistic effect in combination with ciprofloxacin. Moreover, T. maroccanus and T. broussonetii essential oils increased chloramphenicol susceptibility of several resistant isolates. they could restore sensitivity to chloramphenicol producing a competition to its extrusion by blocking the efflux pumps expressed in the isolates and involved in its efflux. Furthermore, T. maroccanus essential oil increased permeability of studied bacteria membrane, and favoured intracellular proteins release into the external medium. Thymus maroccanus essential oil permeabilized both outer and inner membranes of tested bacteria, but without causing detectable degradation of cellular constituents. Protein alterations have been associated with prolonged exposure to natural compounds tested, an increased efflux associated with a lower level of porins that may be involved in the passive diffusion of these natural antimicrobials, conferring a native protection to bacteria towards these natural compounds

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à gram-négatif et un pathogène opportuniste humain qui peut engendrer des infections de type aigu ou chronique. Les infections aiguës sont caractérisées par un mode de vie planctonique des bactéries, la production du système de sécrétion de type III qui cible les cellules de l’hôte et une faible expression des deux petits ARN non codant RsmY et RsmZ. Au contraire, l’infection chronique est caractérisée par un mode de vie sessile au sein d’un biofilm, la producion du système de sécrétion de type VI Hsi1 impliqué dans la compétition bactérienne et une forte expression de RsmY et RsmZ. Le contrôle de ces états infectieux dépend d’un réseau de régulation complexe impliquant notamment le système à deux composants GacS/GacA ainsi que les histidine kinases RetS et LadS qui régulent l’expression des deux petits ARN. Ces deux ARN agissent par titration des répresseur post-transcriptionnels RsmA et RsmF permettant ainsi la traduction des transcrits des facteurs de virulence. Si les mécanismes de ces 3 voies et le fonctionnement des petits ARN Rsm ont été étudiés, des inconnues subsistent en ce qui concerne la connexion de LadS avec GacS/GacA et/ou RetS et comment s’effectue la transition entre les deux modes d’infection en réponse à RsmY et RsmZ. Au cours de ma thèse, j’ai pu montrer que i) le rôle activateur de LadS est dépendant de la voie GacS/GacA et ii) la transition entre les infections aiguës et chroniques est dépendante de la concentration en petits ARN Rsm et qu’elle est progressive engendrant l’existence d’états intermédiaires où la bactérie présente à la fois des marqueurs de l’infection aiguë et de l’infection chronique
Pseudomonas aeruginosa is a gram-negative bacterium and a human opportunistic pathogen responsible for acute and chronic infections. Acute infections are characterized by a planktonic lifestyle of the bacteria, the production of the type III secretion system that targets the host cells and a low concentration of the two small non-coding RNAs RsmY and RsmZ. In contrast, chronic infections are characterized by a sessile lifestyle into a biofilm, the production of the type VI secretion system Hsi1 involve in bacterial dueling and a high concentration of RsmY and RsmZ. The control of these states of infection depends on a complex regulatory network that mainly implies the GacS/GacA two-component system and the RetS and LadS histidine kinases which control the expression of the two small RNAs. These two RNAs act by titrating the post-transcriptional repressor RsmA (and RsmF) thus allowing the translation of the virulence factors’ mRNAs. While the overall mechanisms of these three pathways and the functioning of RsmY and RsmZ have been studied, gray areas remain to be lighten on one hand with regard to the connection of LadS with GacS/GacA and/or RetS and on the other hand concerning the transition between the two infectious modes in response to the two small RNAs. During my Ph.D, I demonstrated that LadS acts through the GacS/GacA pathway and I showed that the transition between the acute and chronic infections depends on the concentration of the small RNAs Rsm. I also pointed out that the transition is progressive what leads to the existence of intermediate states where a bacterium present both acute and chronic markers

Bien que considérées comme étant sous contrôle durant la seconde partie du 20ième siècle avec la découverte des antimicrobiens, les maladies infectieuses demeurent une menace bien réelle pour l’humanité. Quelque soit l’état de connaissance que nous avons sur ces maladies, toutes demeurent imprédictibles. Afin de lutter contre ce phénomène, de nombreuses stratégies de surveillance ont été développées amenant à la mise en place de divers outils informatiques de surveillance épidémiologique visant à détecter et identifier, le plus précocement possible, des événements anormaux. L’objectif initial de notre travail a consisté à mettre en place, au sein de l’Institut Hospitalo-Universitaire Méditerranée Infection et à partir du logiciel Microsoft Excel, deux nouveaux outils informatiques de surveillance épidémiologique visant à identifier, de façon hebdomadaire et automatisée, des événements anormaux sur la base des données de microbiologie clinique issues du laboratoire du Centre Hospitalo-Universitaire Timone à l’Assistance Publique- Hôpitaux de Marseille (AP-HM). Une fois cette étape achevée, nous avons par la suite travaillé au développement d’une structure de surveillance complète intégrant l’investigation et la validation des alarmes émises par les systèmes de surveillance créés, l’émission d’alertes à l’Agence Régionale de Santé (ARS) de la région Provence-Alpes Côte d’Azur (PACA), la valorisation des cas d’événements anormaux confirmés par des publications scientifiques, ainsi que la mise en place de rétro-informations et de bulletins épidémiologiques hebdomadaires visant à informer les acteurs locaux de la surveillance épidémiologique des maladies infectieuses
Although considered under control in the second half of the 20th century with the discovery of antimicrobials, infectious diseases remain a serious threat to humanity. Regardless of the state of knowledge we possess on these diseases, all remained unpredictable. To fight this phenomenon, many monitoring strategies have been developed leading to the implementation of various epidemiological surveillance computer programs to detect and identify, as soon as possible, abnormal events including epidemic phenomena. The initial objective of our work was to implement, within the Hospitalo-Universitaire Méditerranée Infection and based on the Microsoft Excel software, two new automated computer-based programs for the weekly automated epidemiological surveillance of abnormal epidemic events using clinical microbiological data from the Timone teaching hospital of of Assistance Publique- Hôpitaux de Marseille (AP-HM). Once completed, we then worked to develop a comprehensive monitoring structure incorporating the investigation and the validation of alarms emitted by the established surveillance systems, the transmission of alerts to the Regional Health Agency (ARS) of the Provence-Alpes Côte d'Azur (PACA), the public dissemination of confirmed abnormal events by publishing scientific articles, and the implementation of feedback and weekly epidemiological bulletins to inform local infectious diseases epidemiological surveillance actors

L’usage abusif et excessif des antibiotiques a exacerbé le phénomène d’antibiorésistance, à travers la planète. Aujourd’hui, la lutte contre l’antibiorésistance est devenue une priorité mondiale en matière de santé publique. En effet, chaque année, elle est responsable de plus de 700,000 décès dans le monde et d'ici 2050, elle causera plus de 10 millions de décès par an, si des actions concrètes ne sont pas mises en place afin de freiner le développement de ce phénomène. En plus des pertes humaines, le coût financier des soins afférents à l’antibiorésistance pourra atteindre 100,000 milliards de dollars dans le monde. Pour faire face à cette crise annoncée, plusieurs stratégies innovantes, parmi lesquelles l’usage des peptides antimicrobiens (PAMs), ont été proposées. Dans cette perspective, les bactériocines, qui sont des PAMs synthétisés par voie ribosomique pourraient contribuer à la solution thérapeutique. Récemment, la souche Lacticaseibacillus paracasei CNCM I-5369 s’est particulièrement distinguée pour son activité contre des germes pathogènes à Gram-négatif. Cette activité est due à 5 nouvelles bactériocines codées par des gènes chromosomiques orf010, orf012, orf023, orf030 et orf038. Toutefois, l’activité est pH-dépendante, c’est-à-dire qu’elle est exercée, uniquement à une valeur de pH ≤ 5. Dans le cadre de cette thèse, nous avons dans un premier temps, vérifiée l’expression de ces gènes lors de la croissance de la bactérie, en utilisant la technique de qPCR. Ainsi, nous avons observé que ces 5 gènes sont exprimés après 24 h de croissance, de façon concomitante à l’apparition de l’activité antimicrobienne indiquant ainsi un lien entre l’expression génique et la production des cinq bactériocines. Ces 5 bactériocines ont été exprimées en système hétérologue chez Escherichia coli Rosetta. Seule la bactériocine codée par orf030, appelée lacticaséicine 30, a pu être produite en grande quantité, contrairement aux autres bactériocines qui ont été produites mais demeurent piégées dans la fraction insoluble. Dans un deuxième temps, nous avons étudié la relation entre la structure de la lacticaséicine 30 et son activité contre les bactéries à Gram-négatif. Les prédictions de structure ont suggéré une organisation en 5 hélices  de la lacticaséicine 30. La proportion d’hélice-α était plus importante à pH 5 qu’à pH 7. Pour identifier les régions impliquées dans l’activité contre les bactéries à Gram-négatif, nous avons produit des peptides dérivés de la lacticaséicine 30 par une approche de biologie moléculaire. Ces peptides dérivés sont obtenus en réduisant leurs tailles, ou en insérant des mutations ciblées dans différentes régions. Ainsi, nous avons généré des formes plus courtes de la lacticaséicine 30, contenant soit sa région N-terminale (acides aminés 1 à 39), soit les régions centrale et C-terminale (acides aminés 40 à 111). De la même manière, un peptide dérivé contenant uniquement la première hélice de la région N-terminale a été également produite. Les mutations introduisant des substitutions des acides aminés ont été introduites au sein des hélices-α. Au regard de leurs activités, ces peptides dérivés ont permis de localiser l’activité antibactérienne essentiellement dans la région N-terminale, et nécessite à minima deux hélices-α. Par ailleurs, l’activité de ces variants peptidiques E32G, T33P, T52P et D57G reste sensiblement identique, contrairement à celles des variants E6G, T7P, D57G T52P, A74P, Y78S, Y93S et A97P qui ont été significativement altérées. Dans la dernière partie, nous avons testé l’activité de la lacticaséicine 30 contre un panel de souches cliniques à Gram-négatif et portant des résistances à la colistine. Les résultats obtenus ont mis en lumière une synergie entre la lacticaséicine 30 et la colistine et la réduction significative de l’expression des gènes mcr-1 et mcr-9, responsables de la résistance à la colistine
The excessive use of antibiotics has exacerbated the phenomenon of antibiotic resistance throughout the world. Today, the fight against antibiotic resistance has become a global public health priority. Indeed, every year, it is responsible for more than 700,000 deaths in the world and by 2050, it will cause more than 10 million deaths per year, if concrete actions are not implemented to curb the development of this phenomenon. In addition to the human losses, the financial cost of antibiotic resistance-related care could reach 100,000 billion dollars worldwide. To face this crisis, several innovative strategies, including the use of antimicrobial peptides (AMPs), have been proposed. In this perspective, bacteriocins, which are ribosomally APMs, could contribute to the therapeutic solution. Recently, the Lacticaseibacillus paracasei CNCM I-5369 strain has been particularly distinguished for its activity against Gram-negative pathogens. This activity is due to 5 new bacteriocins encoded by chromosomal genes orf010, orf012, orf023, orf030 and orf038. However, the activity is pH-dependent, i.e., it is exerted, only at a pH value ≤ 5. In the framework of this thesis, we first verified the expression of these genes during the growth of the bacteria, using the qPCR technique. Thus, we observed that these 5 genes were expressed after 24 h of growth, concomitantly with the appearance of antimicrobial activity indicating a possible link between gene expression and the production of the five bacteriocins. These 5 bacteriocins were expressed in a heterologous system in Escherichia coli Rosetta. It should be noted that only the bacteriocin encoded by orf030, called lacticaseicin 30, could be produced in large quantities, in contrast to the other bacteriocins which were produced but remain trapped in the insoluble fraction. In a second step, we investigated the relationship between the structure of lacticaseicin 30 and its activity against Gram-negative bacteria. Structural predictions suggested a 5-helix organization of lacticaseicin 30. The proportion of helix-α was greater at pH 5 than at pH 7. To identify the regions involved in the activity against Gram-negative bacteria, we produced lacticaseicin 30-derived peptides by a molecular biology approach. These derived peptides are obtained by reducing their sizes, or by inserting targeted mutations in different regions. Thus, we generated shorter forms of lacticaseicin 30, containing either its N-terminal region (amino acids 1 to 39), or the central and C-terminal regions (amino acids 40 to 111). Similarly, a derivative peptide containing only the first helix of the N-terminal region was also produced. Mutations introducing amino acid substitutions were introduced within the α-helices. With regard to their activities, these derived peptides localized antibacterial activity mainly in the N-terminal region, and requires at least two helix-αs. Furthermore, the activity of these peptide variants E32G, T33P, T52P, and D57G remained essentially the same, unlike to those of the variants E6G, T7P, D57G T52P, A74P, Y78S, Y93S, and A97P, which were significantly impaired. In the last part, we tested the activity of lacticaseicin 30 against a panel of Gram-negative clinical strains with colistin resistance. The results obtained highlighted a synergy between lacticase 30 and colistin and a significant reduction of the expression of the mcr-1 and mcr-9 genes, responsible for colistin resistance

Les infections respiratoires et plus particulièrement la pneumonie représentent la première cause de mortalité infantile dans le monde. L’essor des technologies de diagnostic moléculaire a permis de mettre en évidence une étiologie très hétérogène des infections respiratoires ainsi qu’un taux élevé de co-infection virale et bactérienne dont l’impact clinique reste difficile à évaluer. La recherche translationnelle menée au cours de ce projet de thèse avait pour objectif de décrire l’étiologie des infections respiratoires ainsi que l’impact des co-infections sur la modulation de la réponse immunitaire innée. Nous avons développé un modèle d’étude in-vitro d’infection successive de cellules présentatrice d’antigènes (CPA) humaines par le virus Influenza (IAV) et Streptococcus pneumoniae (SP) et étudié la modulation de la réponse inflammatoire. Les résultats obtenus démontrent que la co-infection des CPA par ces deux pathogènes majeurs de la pneumonie impacte fortement sur leur viabilité et induit une dérégulation importante de la réponse inflammatoire. Au cours de la co-infection, la chémokine pro-inflammatoire IP-10 est exprimée de manière synergique suggérant un rôle jusqu’à présent non décrit de cette chémokine dans la pathogénèse de la pneumonie. Nous avons également démontré que les micro-ARNs (dont le miR-200a-3p) participent activement à la régulation de la réponse inflammatoire, en ciblant des régulateurs de la voie de signalisation JAK-STAT (SOCS-6) et indirectement la voie de synthèse d’IP-10. Récemment, nous avons évalué la réponse inflammatoire d’enfants âgés de moins de 5 ans hospitalisés pour une pneumonie, en partenariat avec les équipes médicales et scientifiques du Paraguay via le réseau GABRIEL. Ce volet d’étude confirme 1) une étiologie variée de la pneumonie chez l’enfant et 2) un taux d’IP-10 sérique significativement plus élevé chez les enfants co-infectés et présentant une pneumonie très sévère
Respiratory infections, especially pneumonia are the leading cause of death among children under 5 years-old worldwide. Advances in molecular diagnostic have highlighted heterogeneous etiologies of respiratory infections with a high proportion of viral and bacterial co-infections whose clinical impact remain difficult to assess. The translational research conducted during this thesis aimed to describe the etiology of respiratory infections and the impact of viral and bacterial co-infections on the innate immunity.We have developed an in-vitro study model of sequential infection of antigen presenting cells (APC) by the human influenza virus and Streptococcus pneumoniae and studied the modulation of the inflammatory response. The results show that APC co-infection by those two major pathogens of pneumonia strongly impacts cells viability and induces a significant deregulation of the inflammatory response. During co-infection, pro-inflammatory chemokine IP-10 is synergistically expressed suggesting a role so far undescribed for this chemokine in the pathogenesis of pneumonia. We also demonstrated that micro-RNAs (including miR-200a-3p) actively participate in the regulation of the inflammatory response by targeting the signaling pathway regulators JAK-STAT (SOCS-6) and indirectly IP-10 signalling pathway.Recently, we evaluated the inflammatory response of children aged under 5 hospitalized for pneumonia, in partnership with medical and scientific teams of Paraguay involved in the GABRIEL network. This study confirmed 1) a varied etiology of childhood pneumonia and 2) a significant elevated IP-10 serum level among children with very severe pneumonia caused by mixed viral and bacterial co-infections

L’émergence de bactéries multirésistantes aux antibiotiques conduit la médecine humaine et vétérinaire à des impasses thérapeutiques. L’usage abusif des ATBs accélère et accentue fortement le processus d’antibiorésistance. Le but de mon travail de thèse était d’apporter une solution au problème de surconsommation d’ATBs en médecine vétérinaire, particulièrement dans les élevages, tout en garantissant la santé animale. Nous avons développé une approche de thérapie combinatoire basée sur l’association d’ATBs déjà existants avec des molécules adjuvantes. Nous avons ainsi évalué l’activité de différents dérivés polyaminés d’origine naturelle sur des pathogènes dits « ESKAPE » qui présentent une relevance clinique majeure en médecine humaine. Ces différentes études ont permis de développer des protocoles de criblage, mais également des méthodes permettant d’élucider leur impact sur la physiologie bactérienne.Nous avons testé l’activité de ces composés en combinaison avec le florfénicol, ATB couramment utilisé pour traiter les infections respiratoires chez le porc. Après avoir identifié un adjuvant au florfénicol, nous avons pu déterminer son mode d’action par différentes méthodes de fluorescence et de bioluminescence. Nous avons pu démontrer que le composé permet de potentialiser l’activité de l’ATB par une action membranotrope et par une inhibition de l'efflux, augmentant ainsi la concentration intracellulaire en ATB, mais également par une inhibition de la force proton motrice (FPM). La motricité flagellaire des bactéries, est un facteur de virulence fonctionnant avec la FPM nous avons pu mettre en évidence une inhibition de la mobilité par le composé
The constant increase of multidrug resistant bacteria is leaving clinicians and veterinarians with very limited options to treat bacterial infections. The main goal of my work was find a chemical solution to reduce the use of antibiotics in veterinary medicine, especially in swines, without affecting the health of the livestock. To achieve this goal, we have developed a drug combination approach based on the association of antibiotics with chemosensitizers, herein called adjuvants, some of which were polyamines derivatives from natural sources. To provide the proof of concept, combination of several derivatives from different chemical sources (marine sponges and plants) have been tested ex vivo on « ESKAPE » pathogens, which are among the most urgent bacterial threats. Results from these studies allowed us to develop procedures for screening antibacterial activities and methodologies for understanding the impact of the selected adjuvants on bacterial physiology.Florfenicol is a widely used antibiotic to treat respiratory infections in swine. Therefore, derivatives were further assessed in combination with florfenicol, and florfenicol adjuvants were identified. The mode of action of one chosen adjuvant on bacterial membranes was further investigated by using fluorescence and bioluminescence methods. Data showed that this molecule was able to potentiate the antibiotic activity by increasing its intracellular concentration (membranotrope activity and inhibition of efflux) but also causes inner membrane depolarization. Flagellar motility represents an important virulence factor which use PMF, and we showed a diminution of the motility's halo with our compound

Les PLLs sont une famille d’enzyme dont l’activité catalytique est double. L’activité lactonase permet entre autre de détruire les AHLs, molécules médiatrices de la communication chez les bactéries Gram négatives, empêchant ainsi la synchronisation à l’échelle de la population de la sécrétion de facteurs de virulence ou la formation de biofilm. Elles sont non seulement capables d’hydrolyser les molécules possédant un noyau lactone, mais aussi les phosphotriésters par promiscuité de substrat. L’activité phosphotriestérase permet de dégrader les composés organophosphorés (OPs) hautement toxiques, que ce soit les insecticides (Paraoxon) ou les agents neurotoxiques de guerre (Sarin, VX). Les travaux effectués ont consisté à évaluer l’efficacité de la PLL SsoPox, provenant de l’archée extrêmophile Sulfolobus solfataricus, pour empêcher la mise en place de la virulence et du biofilm chez Pseudomonas aeruginosa PAO1. Cette évaluation a été effectuée in vitro et in vivo via un modèle d’infection pulmonaire chez le rat. D’autre part, une étude in vitro a été réalisée sur 73 souches cliniques de P. aeruginosa isolés sur des patients atteints de pied diabétique, en évaluant la quantité de pyocyanine et l’activité protéolytique. Enfin, une phase prospective pour identifier de nouvelles PLLs a permis la caractérisation enzymatique et structurale de 2 nouvelles enzymes, SacPox et VmoLac, contribuant ainsi à affiner la connaissance sur cette famille et leur potentiel d’amélioration par ingénierie protéique. Au final, les PLLs offrent un intérêt biotechnologique majeur et peuvent mener à une valorisation concrète pour la santé humaine mais également pour la bioremédiation des OPs
Phosphotriesterase-Like Lactonases (PLLs) are a family of enzyme displaying a dual catalytic activity. Lactonase activity allows for, among others, the destruction of Acyl Homoserine Lactones (AHLs). These molecules mediate the communication in Gram negative bacteria, allowing them to synchronize group behavior like virulence factor secretion or biofilm formation. Beside their ability to hydrolyze molecules with a lactones moiety, PLL also show substrate promiscuity for hydrolyzing highly toxic organophosphate compounds (OPs), such as pesticides (i.e. Paraoxon) or Chemical Warfare Nerve Agents (CWNAs) (e.g. Sarin & VX). The work described here consisted in evaluating the efficacy of the PLL SsoPox, originating from the extremophile Archaea Sulfolobus solfataricus, to prevent virulence and biofilm formation on the model strain Pseudomonas aeruginosa PAO1. This evaluation was performed both in vitro and in vivo, by using a rat pulmonary infection model. A study has been performed on a strain collection of 73 clinical strains of P. aeruginosa isolated from diabetic foot, to assess the enzyme effects on pyocyanin secretion and protease activity. Finally, a prospective phase to identify new PLLs allowed for the enzymatic and structural characterization of two new enzymes, SacPox and VmoLac, thus contributing to refine the knowledge about this enzyme family and their engineering potential. In conclusion, PLLs are of prime biotechnological interest and could lead to developments in human health, but also for OPs bioremediation with a non aggressive decontamination solution

Listeria monocytogenes est l'agent étiologique de la listériose, une infection d'origine alimentaire peu fréquente mais avec un taux de mortalité de 25% chez l'homme. Nous avons d'abord caractérisé un mutant ferritine et montré l'importance du produit de ce gène dans la virulence, la résistance à des conditions de carence en fer et de stress thermique ou oxydatif. Nous nous sommes ensuite intéressés à la biodiversité de L. Monocytogenes, par une approche protéomique en étudiant 12 souches d'origines de sérovars et de niveaux de virulence variés. Sur la base des profils des protéines intracellulaires et sécrétées, une classification hiérarchique a montré deux groupes distincts, l'un comprenant les souches de sérovar 1/2a, l'autre les souches de sérovar 4b et 1/2b. Des spots protéiques spécifiques de chaque souche et des différents sérovars ont été identifiés par spectrométrie de masse MALDI-TOF avec pour objectif de mieux hiérarchiser et gérer le risque dû à L. Monocytogenes