Dissertations / Theses on the topic 'Ingegneria tissutale'

Questa tesi desidera essere un contributo nel campo della modellistica cardiaca, sfruttando un modello elettromeccanico fortemente accoppiato per affrontare due temi di notevole rilevanza e innovativi: le patologie cardiache, in particolare l’ipertrofia, analizzando il comportamento di strutture con geometria a complessità crescente (fibra, campione di parete e ventricolo); l’ingegneria tissutale cardiaca, in particolare le colture in vitro progettate per diventare patch impiantabili. La dissertazione è organizzata come segue. Il Capitolo 1 riassume i principali tratti anatomici e fisiologici del tessuto cardiaco dei mammiferi, aggiungendo l’esempio di patologia considerata in questa tesi, cioè l’ipertrofia, ed una breve discussione sulle colture cardiache. Il Capitolo 2 descrive in dettaglio il modello elettromeccanico e l’algoritmo più generali impiegati per simulare qualunque struttura cardiaca in questa tesi. Il Capitolo 3 riporta i risultati delle simulazioni riguardanti la risposta elettromeccanica di una fibra cardiaca caratterizzata da crescita ipertrofica di tessuto in modo eccentrico mentre è soggetta a diversi protocolli di eccitazione-contrazione; un’analisi sui feedback meccanici è inclusa. Il Capitolo 4 tratta la risposta elettromeccanica di un campione di parete cardiaca che si contrae liberamente in condizioni di ipertrofia concentrica, di cui sono analizzati i fenomeni di crescita tissutale e dispersione delle fibre. Il Capitolo 5 studia la risposta elettromeccanica di un ventricolo colpito da stenosi aortica e ipertrofia concentrica (caratterizzata da sola crescita tissutale) durante un intero ciclo cardiaco; come nel Capitolo 3, si indaga anche sul ruolo dei feedback meccanici. Il Capitolo 6 analizza gli effetti elettromeccanici dettati dalla scelta di una specifica struttura intrinseca ed uno specifico spessore per una coltura cardiaca che si sviluppa in un patch a fini di trapianto. Il Capitolo 7 trae le conclusioni generali di questo lavoro.
This thesis would like to contribute to the field of cardiac modeling by exploiting a strongly-coupled electromechanical model to face two challenging and innovative topics: cardiac pathologies, in particular hypertrophy, by analyzing the behavior of structures with an increasing geometric complexity (fiber, wedge and ventricle); cardiac tissue engineering, in particular the in vitro cultures designed to become implantable patches. The dissertation is organized as follows. Chapter 1 resumes the main anatomical and physiological features of the mammalian cardiac tissue, adding the example of pathology considered in this thesis, i.e. hypertrophy, and a brief discussion on cardiac cultures. Chapter 2 describes in detail the most general form of the electromechanical model and of the algorithm employed for simulating any cardiac structure in this thesis. Chapter 3 reports the simulation results about the electromechanical response of a cardiac fiber characterized by eccentric hypertrophic growth while it is subjected to different excitation-contraction protocols; an analysis on the mechanical feedbacks is included. Chapter 4 deals with the electromechanical response of a cardiac wedge contracting freely under concentric hypertrophic conditions, whose phenomena of tissue growth and fiber dispersion are analyzed. Chapter 5 studies the electromechanical response of a ventricle affected from aortic stenosis and concentric hypertrophy (characterized by tissue growth only) during an entire cardiac cycle; as in Chapter 3, the role of the mechanical feedbacks is investigated too. Chapter 6 analyzes the electromechanical effects dictated by the choice of a specific intrinsic structure and thickness for a cardiac culture developing into a patch for transplantation. Chapter 7 draws the overall conclusions of this work.

Le cellule staminali sono molto rare e per questo il loro impiego in campo clinico è problematico. L’utilizzo del cordone ombelicale, che risolverebbe il problema del donatore, ha purtroppo un’applicazione limitata a causa proprio del numero insufficiente di cellule staminali. Per questo motivo è di fondamentale importanza lo sviluppo di un sistema per l’espansione delle cellule staminali. Nello stesso tempo, per l’applicazione delle cellule staminali in ingegneria tissutale (ad esempio per la riparazione del tessuto osseo) risulta indispensabile l’individuazione di uno scaffold idoneo a tale scopo. Per questo motivo, da un lato è stato studiato un sistema per l’espansione delle cellule staminali emopoietiche di cordone ombelicale, dall’altro è stato fatto uno screening di scaffold diversi per l’applicazione in ingegneria del tessuto osseo. In un nostro precedente studio è stato dimostrato che l’interleuchina (IL)-16 è capace di indurre le cellule CD34+ a proliferare e differenziare in cellule dendritiche mature. In questo lavoro, è stato investigato il ruolo dell’IL-16 nell’espansione delle cellule CD34+ isolate da sangue di cordone ombelicale. E’ stato osservato che l’IL-16 aggiunta al cocktail di base costituito da stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3, aumenta significativamente il numero delle cellule CD34+, della popolazione più primitiva CD34+CD38-, dei progenitori emopoietici e delle LTC-IC (long-term-culture-initiating-cells), non alterando la capacità delle cellule CD34+ di differenziare in linfociti-B e cellule natural killer (NK). L’aggiunta dell’IL-16 aumenta l’attività migratoria delle cellule CD34+ espanse e diminuisce la percentuale delle cellule CD34+CD4+. Questi risultati sembrano suggerire che l’IL-16 possa avere un ruolo importante nell’espansione delle cellule staminali emopoietiche e possa essere utilizzata in clinica per l’espansione delle cellule CD34+ (Articolo I). Scaffold diversi di policaprolattone (PCL) sono stati analizzati al fine di individuare un nuovo biomateriale in grado di promuovere il differenziamento delle cellule staminali mesenchimali di coniglio in osteoblasti. I risultati ottenuti dimostrano che lo scaffold PCL/TZ-HA, ottenuto mescolando PCL e proteina termoplastica zeina, sembra favorire l’adesione ed il differenziamento osteogenico, dimostrando un ottimo potenziale applicativo nell’ingegneria del tessuto osseo (Articolo II). Recentemente è stato sviluppato un nuovo modello dello sviluppo tumorale basato sulle cellule staminali tumorali. Con l’introduzione di tale ipotesi si è fatta avanti la necessità di individuare nuovi marcatori molecolari e sviluppare nuove terapie. Studi precedenti hanno dimostrato che l'aumento d’espressione dei recettori Eph e dei loro ligandi ephrin è in vari casi collegato con fenomeni di progressione tumorale ed angiogenesi. In questo lavoro, è stata valutata l'espressione dei ligandi ephrin-B1-B2 e dei recettori EphB1-B4 in linee cellulari di rabdomiosarcomi e tumori primari. I risultati ottenuti evidenziano deregolazione sia dei ligandi sia dei recettori nelle linee cellulari, mentre un generale aumento dell'espressione delle proteine analizzate è stato registrato nei tumori primari. E’ stata inoltre dimostrata anche una correlazione tra l'espressione di EphB2 ed EphB4 in entrambi i tipi tumorali. La generale deregolazione dell'espressione genica e le correlazioni registrate tra ligandi e recettori e tra EphB2 e EphB4 suggeriscono un ruolo di ephrin-B e EphB nello sviluppo dei RMS (Articolo III).
Stem cells are very rare and this represents a big problem for clinical application. The use of umbilical cord blood, that could be a good alternative source of stem cells, is limited because of the poor number of stem cell that is not sufficient for transplantation. Accordingly, it will be very important to develop an assay to expand ex-vivo stem cell population. At the same time, for stem cell application in tissue engineering (for example bone tissue engineering) it could be very important to prepare a scaffold. This is why we studied an assay for ex-vivo expansion of hematopoietic stem cells isolated from cord blood and we did a screening of biomaterials for bone tissue engineering. A previous work reported that interleukin (IL)-16 can induce CD34+ hematopoietic cells to proliferate and differentiate in-vitro into phenotypically and functionally mature DCs. In this study, the effects of IL-16 on the expansion of CD34+ cells from human cord blood were investigated. IL-16 added to a basal cocktail (BC) composed of stem cell factor (SCF), Flt-3 ligand (FL), thrombopoietin (TPO), IL-6 e IL-3,of cytokines significantly enhanced the expansion of CD34+ cells, CD34+CD38-, early stem cells progenitor cells and long-term-culture-initiating-cells (LTC-IC). Moreover, CD34+ cells expanded with IL-16 maintained the capacity to differentiate into the lymphoid-B and -NK lineage. The addition of IL-16 to BC increased the migratory capacity of expanded CD34+ cells compared to BC alone and decreased the percentage of CD34+CD4+ cells. Overall, this study suggests that IL-16 may have a new role in promoting the expansion of hematopoietic stem cells and may represent a new tool for the expansion of CD34+ cells for clinical applications (Paper I). Scaffolds of different composition have been analysed to develop a novel multiphase biomaterial able to promote osteogenic differentiation of rabbit mesenchymal stem cells (rMSC). Results demonstrated that the multi-phase PCL/TZ-HA system showed improved rMSCs adhesion and osteoblast differentiation, thus demonstrating great potential for bone regeneration. (Paper II). Recent advances in tumour progression introduce the concept of cancer stem cells. According to this hypothesis, it will be important to identify new tumour markers and to develop new therapeutic strategies. Previous works demonstrated that increased expression of Eph receptors and their ephrin ligands have been implicated in promoting angiogenesis and tumour progression in several malignancies. Here the expression of mRNA for ephrin-B and EphB receptors in rhabdomyosarcoma (RMS) cell lines and primary tumours were measured. A dysregulation of both ligands and receptors was found in all cell lines. A global up-regulation of ephrin-Bs and EphB receptors in RMS tumours was found. In embryonal tumours, a correlation between ligand and receptor was found. A correlation between EphB2 and EphB4 receptors was demonstrated in both tumour types. The dysregulation of ephrin-B and Eph-B in RMS and the correlations between ligand and receptors and between EphB2 and EphB4 suggest a possible role for ephrin-B and EphB in RMS development (Paper III).

Ogni giorno nel mondo vengono eseguite migliaia di procedure chirurgiche per sostituire o riparare tessuti che sono stati danneggiati da malattie o traumi. L'ingegneria tissutale rappresenta una strategia alternativa che mira a rigenerare i tessuti danneggiati combinando cellule e biomateriali altamente porosi che fungano da impalcature (scaffolds). In questa tesi compilativa si presenta un approccio recentemente proposto per la rigenerazione del tessuto osseo. Saranno inizialmente descritte caratteristiche e proprietà dell'osso a livello macro e microscopico e il processo riparativo fisiologico. Si illustreranno quindi i principi dell'ingegneria tissutale, evidenziando i biomateriali utilizzabili, le cellule indicate per la rigenerazione e i rapporti funzionali tra di esse e lo scaffold che deve sostenerne la crescita. Successivamente si descriverà il concetto di ‘biomimetica’ dello scaffold e i metodi impiegati per migliorarne la funzionalità, imitando sia l'aspetto meccanico sia quello biologico della reale matrice ossea; verrà trattato infine un caso di scaffold biomimetico realizzato con nanocompositi, che appare un promettente sostitutivo dell'osso.

I poliuretani sono da anni dei validi candidati per la Tissue Engineerig. Il presente elaborato analizza la struttura, composizione e modalità di realizzazione di poliuretani per poi focalizzarsi su composti espansi. Si è fatta una particolare attenzione sugli utilizzi degli scaffold poliuretanici per le varie tipologie di tessuti e conseguentemente dei requisiti che devono necessariamente possedere. Inoltre, si è fatta un'analisi sulle principali tecniche di caratterizzazione di tali supporti, quindi uno studio sull'invecchiamento in vitro, calcificazione in vitro, citocompatibilità in vitro e, infine, biocompatibilità in vivo prendendo come riferimento i testi presenti nella letteratura.

Lo scheletro è un tessuto dinamico, capace di adattarsi alle richieste funzionali grazie a fenomeni di rimodellamento ed alla peculiare proprietà rigenerativa. Tali processi avvengono attraverso l’azione coordinata di osteoclasti ed osteoblasti. Queste popolazioni cellulari cooperano allo scopo di mantenere l’ equilibrio indispensabile per garantire l’omeostasi dello scheletro. La perdita di tale equilibrio può portare ad una diminuzione della massa ossea e, ad una maggiore suscettibilità alle fratture, come avviene nel caso dell’osteoporosi. E’ noto che, nella fisiopatologia dell’osso, un ruolo cruciale è svolto da fattori endocrini e paracrini. Dati recenti suggeriscono che il rimodellamento osseo potrebbe essere influenzato dal sistema nervoso. L’ipotesi è supportata dalla presenza, nelle vicinanze dell’osso, di fibre nervose sensoriali responsabili del rilascio di alcuni neuro peptidi, tra i quali ricordiamo la sostanza P. Inoltre in modelli animali è stato dimostrato il diretto coinvolgimento del sistema nervoso nel mantenimento dell’omeostasi ossea, infatti ratti sottoposti a denervazione hanno mostrato una perdita dell’equilibrio esistente tra osteoblasti ed osteoclasti. Per tali ragioni negli ultimi anni si è andata intensificando la ricerca in questo campo cercando di comprendere il ruolo dei neuropeptidi nel processo di differenziamento dei precursori mesenchimali in senso osteogenico. Le cellule stromali mesenchimali adulte sono indifferenziate multipotenti che risiedono in maniera predominante nel midollo osseo, ma che possono anche essere isolate da tessuto adiposo, cordone ombelicale e polpa dentale. In questi distretti le MSC sono in uno stato non proliferativo fino a quando non sono richieste per processi locali di riparo e rigenerazione tessutale. MSC, opportunamente stimolate, possono differenziare in diversi tipi di tessuto connettivo quali, tessuto osseo, cartilagineo ed adiposo. L’attività di ricerca è stata finalizzata all’ottimizzazione di un protocollo di espansione ex vivo ed alla valutazione dell’influenza della sostanza P, neuropeptide presente a livello delle terminazioni sensoriali nelle vicinanze dell’osso, nel processo di commissionamento osteogenico.
Bone is a dynamic tissue, with the ability to adapt to its functional demands and repair itself by bone remodelling. The major effector cells of bone remodelling are osteoclast and osteoblast, they cooperate in order to maintain the balance between bone formation and bone resorption, essential for bone homeostasis. Disruption of this balance can diminish bone mass and micro-architectural integrity of the bone resulting in an increase in bone fragility and susceptibility to fractures, as evident in osteoporosis. It is known that, in the pathophysiology of the bone, a crucial role is played by endocrine and paracrine factors. Recent data suggest that bone remodeling may be influenced by the nervous system. The hypothesis is supported by the presence, in proximity of the bone, of sensory nerve fibers responsible for the release of some neuro peptides, like substance P. Iin capsaicin-treated animal has been shown the direct involvement of the nervous system in the maintenance of bone, this animal showed bone loss and increased bone fragility. For these reasons in recent years has intensified research in this field trying to understand the role of neuropeptides in the process of differentiation of mesenchymal precursors into osteogenic lineage. The mesenchymal stromal cells are undifferentiated multipotent cells present in the bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and dental pulp. In these districts, MSC are in a quiescent state until they are required to local repair or tissue regeneration. MSC, suitably stimulated, can differentiate into different types of connective tissue such as, bone, cartilage and adipose. The research was designed to optimize a protocol for ex vivo expansion and to evaluate the effect of substance P, neuropeptide in the sensory endings in the vicinity of the bone, in the process of picking osteogenic.

Lo scheletro è un tessuto dinamico, capace di adattarsi alle richieste funzionali grazie a fenomeni di rimodellamento ed alla peculiare proprietà rigenerativa. Tali processi avvengono attraverso l’azione coordinata di osteoclasti ed osteoblasti. Queste popolazioni cellulari cooperano allo scopo di mantenere l’ equilibrio indispensabile per garantire l’omeostasi dello scheletro. La perdita di tale equilibrio può portare ad una diminuzione della massa ossea e, ad una maggiore suscettibilità alle fratture, come avviene nel caso dell’osteoporosi. E’ noto che, nella fisiopatologia dell’osso, un ruolo cruciale è svolto da fattori endocrini e paracrini. Dati recenti suggeriscono che il rimodellamento osseo potrebbe essere influenzato dal sistema nervoso. L’ipotesi è supportata dalla presenza, nelle vicinanze dell’osso, di fibre nervose sensoriali responsabili del rilascio di alcuni neuro peptidi, tra i quali ricordiamo la sostanza P. Inoltre in modelli animali è stato dimostrato il diretto coinvolgimento del sistema nervoso nel mantenimento dell’omeostasi ossea, infatti ratti sottoposti a denervazione hanno mostrato una perdita dell’equilibrio esistente tra osteoblasti ed osteoclasti. Per tali ragioni negli ultimi anni si è andata intensificando la ricerca in questo campo cercando di comprendere il ruolo dei neuropeptidi nel processo di differenziamento dei precursori mesenchimali in senso osteogenico. Le cellule stromali mesenchimali adulte sono indifferenziate multipotenti che risiedono in maniera predominante nel midollo osseo, ma che possono anche essere isolate da tessuto adiposo, cordone ombelicale e polpa dentale. In questi distretti le MSC sono in uno stato non proliferativo fino a quando non sono richieste per processi locali di riparo e rigenerazione tessutale. MSC, opportunamente stimolate, possono differenziare in diversi tipi di tessuto connettivo quali, tessuto osseo, cartilagineo ed adiposo. L’attività di ricerca è stata finalizzata all’ottimizzazione di un protocollo di espansione ex vivo ed alla valutazione dell’influenza della sostanza P, neuropeptide presente a livello delle terminazioni sensoriali nelle vicinanze dell’osso, nel processo di commissionamento osteogenico.
Bone is a dynamic tissue, with the ability to adapt to its functional demands and repair itself by bone remodelling. The major effector cells of bone remodelling are osteoclast and osteoblast, they cooperate in order to maintain the balance between bone formation and bone resorption, essential for bone homeostasis. Disruption of this balance can diminish bone mass and micro-architectural integrity of the bone resulting in an increase in bone fragility and susceptibility to fractures, as evident in osteoporosis. It is known that, in the pathophysiology of the bone, a crucial role is played by endocrine and paracrine factors. Recent data suggest that bone remodeling may be influenced by the nervous system. The hypothesis is supported by the presence, in proximity of the bone, of sensory nerve fibers responsible for the release of some neuro peptides, like substance P. Iin capsaicin-treated animal has been shown the direct involvement of the nervous system in the maintenance of bone, this animal showed bone loss and increased bone fragility. For these reasons in recent years has intensified research in this field trying to understand the role of neuropeptides in the process of differentiation of mesenchymal precursors into osteogenic lineage. The mesenchymal stromal cells are undifferentiated multipotent cells present in the bone marrow, adipose tissue, umbilical cord and dental pulp. In these districts, MSC are in a quiescent state until they are required to local repair or tissue regeneration. MSC, suitably stimulated, can differentiate into different types of connective tissue such as, bone, cartilage and adipose. The research was designed to optimize a protocol for ex vivo expansion and to evaluate the effect of substance P, neuropeptide in the sensory endings in the vicinity of the bone, in the process of picking osteogenic.

L’estrazione di uno o più elementi dentari innesca una serie di processi biologici che modificano notevolmente l’alveolo post-estrattivo o la cresta alveolare, determinando una notevole contrazione ossea. L’obiettivo primario dello studio è valutare il potenziale rigenerativo dell’osso eterologo e PRF associato a terapia fotodinamica laser-assistita in siti post estrattivi. L’obiettivo secondario è valutare la sopravvivenza implantare nei pazienti trattati con questa tecnica di preservazione della cresta alveolare. Obiettivo terziario è valutare la guarigione della ferita chirurgica nelle settimane successive all’intervento. Sono stati selezionati 15 pazienti che necessitavano di estrazioni dentarie, sono stati raccolti i dati clinici e radiografici pre operatori; i pazienti sono stati preparati all’intervento chirurgico che è consistito nell’estrazione degli elementi compromessi, esecuzione della terapia fotodinamica laser-assistita, innesto di osso eterologo e PRF, sutura. A distanza di 9 mesi è stato effettuato il rientro chirurgico per il posizionamento di impianti e sono stati raccolti i dati post operatori. I risultati hanno mostrato una notevole riduzione della contrazione ossea in seguito a estrazione dentaria con la tecnica utilizzata, che ha permesso il posizionamento degli impianti in tutti i casi con un’ottima guarigione dei tessuti molli. Questa tecnica si è quindi mostrata molto efficace riducendo l’invasività chirurgica per i pazienti.

L’argomento trattato in questo elaborato riguarda una nuova tecnologia che si sta sviluppando nel settore dell’ingegneria tissutale: il Bioprinting. Nel seguito verrà data una definizione del processo, verranno analizzate le varie fasi di elaborazione, le tecniche ed i materiali utilizzati. Verranno infine riportati studi riguardanti alcune applicazioni della tecnica.

Grazie all’ingegneria tissutale, branca dell’ingegneria che si occupa della ricostruzione in vitro di tessuti, sta diventando sempre più concreta la possibilità di superare i principali limiti della medicina tradizionale, basata essenzialmente sul trapianto e sui trattamenti farmacologici, soluzioni non sempre praticabili e/o efficaci. Tramite lo studio dei biomateriali e delle loro proprietà è possibile realizzare soluzioni ad hoc per l’ingegneria tissutale di diversi tessuti. Nel caso particolare di questo studio, è stato realizzato mediante elettrofilatura uno scaffold a partire da una blend fisica di poli(butilene succinato) (PBS) e cheratina. Il primo è un polimero sintetico biocompatibile e approvato dalla Food and Drug Administration, con buone resistenza meccanica e lavorabilità, ma tempi di degradazione piuttosto lenti, a differenza della cheratina, polimero naturale, che risulta troppo rigido e difficile da processare, ma con buoni tempi di degradazione ed un’ottima biocompatibilità. Il tappetino elettrofilato così ottenuto è stato sottoposto a caratterizzazione molecolare, termica e meccanica. Inoltre, in vista di possibili applicazioni nell’ambito dell’ingegneria tissutale, il materiale è stato sottoposto anche a test di biodegradazione in ambiente enzimatico e prove di biocompatibilità in vitro. In conclusione, ogni tipo di indagine, seppur preliminare, ha comprovato che l’unione tra il PBS e la cheratina ha dato vita ad un nuovo biomateriale di supporto facilmente processabile e in grado di promuovere l’accrescimento, la migrazione e il differenziamento cellulare.

L’argomento trattato in questo elaborato riguarda la natura e le applicazioni di una nuova classe di biomateriali: i peptidi auto-assemblanti. La perdita di funzione di un organo o di un tessuto rappresenta una problematica rilevante sia sotto il profilo clinico sia per i costi di gestione. I trapianti sono infatti tra le terapie più sofisticate e onerose economicamente, complicate da altri aspetti quali una strutturale insufficienza di donatori e la necessità che i soggetti trapiantati vengano sottoposti cronicamente a regimi terapeutici immunosoppressivi che aumentano eventuali effetti collaterali. La terapia sostitutiva basata su organi artificiali è invece gravata dalla durata limitata dei dispositivi, nonchè da un non trascurabile rischio infettivo. La medicina rigenerativa, che sembra essere una soluzione adeguata per ovviare a tutte queste problematiche, è un settore emergente che combina aspetti della medicina, della biologia cellulare e molecolare, della scienza dei materiali e dell’ingegneria al fine di rigenerare, riparare o sostituire i tessuti danneggiati. In questo panorama, il ruolo dei biomateriali sta diventando sempre più importante grazie alla loro varietà e alle loro funzioni emergenti. Tra i biomateriali innovativi più promettenti troviamo i peptidi auto-assemblanti. Dopo un'introduzione sui principi dell'ingegneria tissutale, la tesi si focalizza sui peptidi auto-assemblanti e sulle loro applicazioni in campo biomedico, ponendo l'attenzione, in particolar modo, sulla realizzazione di scaffold per la rigenerazione del tessuto osseo, cardiaco, cartilagineo e nervoso, e sulla loro applicazione per il rilascio controllato di farmaci.

Il presente elaborato riassume un’analisi della letteratura scientifica corrente relativa all’approccio proposto dall’ingegneria tissutale per la sostituzione/rigenerazione del tessuto tendineo e legamentoso e analizza le fasi che conducono alla realizzazione di un costrutto con a bordo cellule specifiche. I tendini e i legamenti sono tessuti fibrosi specializzati che svolgono principalmente una funzione meccanica: i primi permettono la trasmissione delle forze dal muscolo all’osso per generare il movimento, i secondi invece garantiscono la stabilità tra le giunture ossee che collegano. Gravi lesioni di tali strutture sono associate all’insorgere di incombenti problematiche a livello motorio e la caratteristica peculiare di mancata rigenerazione spontanea ha indotto alla ricerca di fonti alternative per la loro ricostruzione. L’esperienza relativa alla preparazione e all’uso di innesti allogenici e xenogenici finalizzati alla rigenerazione tissutale mostrano una difficoltà nella coltura cellulare in vitro, una prolungata risposta infiammatoria in vivo, nonché dei tempi troppo lunghi per l’impianto. L’utilizzo di scaffold, ovvero supporti 3D realizzati con materiale sintetico (p.es. acido poliglicolico) o naturale (p.es. collagene) per ospitare la crescita di cellule adeguate, sembra un approccio alternativo promettente. In particolare, in questo documento sono state riassunte due esperienze di riparazione tissutale, ispirate alla strategia sopra indicata, per il recupero del tendine d’Achille e del legamento crociato anteriore (ACL) del ginocchio, due distretti affetti da lesioni di natura principalmente traumatica e caratterizzati da specifiche proprietà che devono essere soddisfatte in vitro e in vivo.

Nel presente lavoro di Tesi vengono proposti nuovi copoliesteri alifatici a base di acido polilattico PLLA, completamente bio-based. Il sistema è composto da una serie di copolimeri triblocco A-B-A, dove A, il blocco hard, è costituito da PLLA, mentre B, il blocco centrale soft, è un copoliestere alifatico statistico realizzato ad hoc, a base di poli(butilene succinato/azelato), caratterizzato da elevata flessibilità. I singoli blocchi sono uniti tra loro da esametilene diisocianato o HDI, noto estensore di catena, che consente l'ottenimento di polimeri ad alto peso molecolare. I campioni sintetizzati sono stati sottoposti a una dettagliata caratterizzazione molecolare, termica, strutturale e meccanica. I risultati ottenuti mostrano che grazie alla copolimerizzazione è possibile ottenere proprietà meccaniche migliori rispetto a quelle dell’omopolimero PLLA. Inoltre, la presenza del blocco soft all’interno della catena polimerica principale facilita il processo di biodegradazione. Studi di biocompatibilità in vitro hanno infine confermato che questo sistema è risultato in grado di supportare l’adesione e la proliferazione cellulare.

Grazie agli sviluppi delle nanotecnologie biomedicali nell’ambito del rilascio controllato di farmaci e dell’ingegneria tissutale, sta diventando sempre più concreta la possibilità di superare i principali limiti della medicina tradizionale, basata nel primo caso su somministrazioni ripetute e a livello sistemico di principio attivo, e nel secondo caso sul trapianto (con relativi problemi di rigetto e carenza di donatori) e su trattamenti farmacologici non risolutivi. Tramite lo studio dei biomateriali e delle loro proprietà è invece possibile realizzare soluzioni ad hoc per l’ingegneria tissutale e per il rilascio controllato e mirato di farmaco. Nel presente studio, sono stati realizzati, mediante elettrofilatura, scaffolds a partire da blend fisiche di poli(butilene succinato) (PBS) e cheratina, a diversa composizione. Il primo è un polimero sintetico biocompatibile e approvato dalla Food and Drug Administration, con buone resistenza meccanica e lavorabilità, ma tempi di degradazione piuttosto lenti, a differenza della cheratina, polimero naturale, che risulta troppo rigido e difficile da processare, ma con buoni tempi di degradazione ed un’ottima biocompatibilità. Le blend sono state sottoposte a studi di miscibilità, mentre sui tappetini elettrofilati è stata effettuata una caratterizzazione morfologica, termica e meccanica. Inoltre, in vista di possibili applicazioni nell’ambito dell’ingegneria tissutale e del rilascio controllato di farmaco, si sono svolti anche test di biodegradazione in ambiente enzimatico e prove di biocompatibilità in vitro, nel primo caso, e studi di rilascio di diclofenac, comune antinfiammatorio, e test di adesione alla pelle, nel secondo caso. In conclusione, ogni tipo di indagine, seppur preliminare, ha comprovato che l’unione tra il PBS e la cheratina ha dato vita a nuove miscele facilmente processabili per potenziali utilizzi in due ambiti biomedicali di particolare interesse applicativo.

BACKGROUND: In the western world the prevalence of valvular heart diseases in general population account for 2%, and is constantly increasing due to ageing phenomena of the population. Current surgical therapies imply the use of mechanical and biological valves for the replacement of the diseased valve. Unfortunately in the long term this substitute valves lead patients to complications or reoperations. By using Tissue Engineering (TE) technologis, a science that combines contributions from engineering and biology, it is being investigated whether it is possible to create a new viable valve substitute that, similarly to healthy human valves, can withstand in vivo mechanical stress and undergo remodelling and growth after implantation, especially in paediatric patients. AIM OF THE STUDY: The purposes of this study are: Understand efficacy of UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC decellularisation methods applied to Bovine Pericardium (BP), Calf Pericardium (CP) and Porcine Pericardium (PP), To test recellularisation potential of UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC BP, Physical and structural characterisation of CF and PP, before and after TRITDOC treatment. The obtained acellular scaffolds are considered as potential materials to be used for TE heart valve production. MATERIALS AND METHODS: BP has been decellularized using three methods: UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC. Istological and immunoistochemical techniques has been used to verify the complete decellularization of tissue and the organization of the Extracellular Matrix (ECM). Bovine fibroblasts (Pericardiocytes) and human endothelial cells (HUVEC) have then been seeded on serosal layer. Many seeding have been done in order to test different cellular densities and culture media. Spectrophotometric Landegren and MTT Tests and Haematoxylin and Eosin (H&E) have been carried on to check the seeding processes. At the same time others samples of BP UTRIDOC have been funzionalized with a syntethic, proadhesive peptide RGD sequence and Pericardiocytes have been seeded. TRITDOC protocol has been also applyed to CP and PP. These Pericardia have been collected and cutted in four anatomical areas: VsxANT, VdxANT, VsxPOST, VdxPOST. Density, thickness and water content HAVE been determined for each area and have been compared with non-tReated Pericardia. To check decellularisation and matrix preservation of these samples the following techniques have been applied: H&E, DAPI, immunohistochemistry and electron transmission microscopy (TEM). Removal of the xenoantigen alpha-Gal has been assessed by means of ELISA test. RESULTS: As been shown the three methods of decellularisation are able to remove cellular component from pericardial tissues and maintain ECM organization. Cellular seeding tests have showed Pericardiocytes adhesion on PB UTRIDOC serosal surface, after 6h and 18h of culture. Moreover, after 7 days Pericardiocyte begin to migrate into ECM of BP UTRIDOC e TRICOL maintaining an active metabolism. When using syntethic, proadhesive peptide RGD, Pericardiocytes better adhere to the BP UTRIDOC. HUVEC cells are able to adhere to the BP UTRIDOC in 1h, 3h, 5h and 24h since seeding, but they does not form a continous layer. However, they form it after 7 days on the BP TRITDOC and they keep espression of vWf and CD31. The whole TRITDOC CP display a significant decrease of water content (p<0,05), a not significant decrease of thickness (p>0,05), while density significantly increased (p<0,05), compared to the non-treated samples. In TRITDOC PP, both the VsxANT and VdxANT showed a not significant increase of thickness (p>0,05) and a significant decrease in water content (p<0,05), compared to non-trated samples. On the contrary both VdxPOST and VsxPOST display a not significantly decrease of thickness and of water content and neither change in density (p>0,05). Moreover, for the mentioned above physical features, the VsxANT area in CP and VdxANT area in PP proved to be the most homogeneous specimens, compared to the other areas in the same species. Structural analyses demonstrated complete decellularisation in both CP and PP TRITDOC. Matrix architecture and collagen fibres organization were grossly maintained by the TRITDOC treatment, as exhibited by histology and TEM analysis. The xenoantigen alpha-Gal was completely removed from CP and PP after TRITDOC decellularisation. CONCLUSIONS: the tested decellularisation protocols, UTRIDOC, TRICOL and TRITDOC, produce bovine and porcine pericardial scaffolds that are acellular, non-cytotoxic, and exhibit normal organisation of the ECM. The TRITDOC BP, seems to be suitable for cellular seeding of human endothelial cells HUVEC. TRITDOC decellularisation of CP and PP identified specific pericardial areas more prone for use in TEHV. Further studies should be carried out to assess the mechanical performances of such scaffold, prior and after in-vitro cell seeding
PRESUPPOSTI DELLO STUDIO: Nel mondo occidentale la patologia valvolare cardiaca presenta una prevalenza del 2% nella popolazione generale, ed è in costante crescita dato l’invecchiamento della popolazione. La terapia chirurgica attuale utilizza sostituti valvolari meccanici e biologici, che frequentemente portano i pazienti al reintervento o all'insorgenza di complicanze. L'Ingegneria Tissutale (TE), disciplina che unisce il contributo dell'ingegneria e della biologia, potrebbe permettere di creare sostituti valvolari dotati di patrimonio cellulare autologo e vitale in grado di andare incontro a rimodellamento e crescita in accordo con lo stato fisiologico dei pazienti, in particolare quelli pediatrici. SCOPO DELLO STUDIO: Gli scopi di questo studio sono stati: verificare la capacità di decellularizzazione dei metodi UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC quando applicati al Pericardio Bovino (PB), al Pericardio Bovino di Vitello (PBV) e al Pericardio Porcino (PP); testare il potenziale di ricellularizzazione del PB UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC e caratterizzare strutturalmente e fisicamente il PBV e il PP prima e dopo decellularizzazione TRITDOC che si è rivelato un promettente metodo per l'adesione cellulare endoteliale. Gli scaffolds ottenuti sono stati valutati come biomateriali di base per l'Ingegneria Tissutale delle valvole cardiache (TEHV). MATERIALI E METODI: Il PB è stato decellularizzato utilizzando tre metodi denominati rispettivamente: UTRIDOC, TRICOL E TRITDOC. Verificata la completa decellularizzazione del tessuto e l'organizzazione della Matrice Extracellulare (MEC) tramite tecniche istologiche ed immunoistochimiche, sulla superficie sierosa del tessuto sono stati seminati fibroblasti bovini (Pericardiociti) e cellule endoteliali umane (HUVEC). Le semine sono state eseguite in diverse condizioni sperimentali per testare la densità cellulare più promettente e i terreni di coltura più adatti. I risultati delle semine sono stati indagati attraverso colorazione dei campioni con Ematossilina ed Eosina, Test di Landegren e Test MTT. Il PB UTRIDOC è stato successivamente funzionalizzato con una sequenza peptidica sintetica proadesiva RGD (arginina, glicina, acido aspartico), ed è stata testata l'adesione dei Pericardiociti. Il protocollo TRITDOC è stato poi applicato anche al PBV e al PP. In quest'ultimi esperimenti i pericardi sono stati espiantati dopo sacrificio degli animali e suddivisi in 4 aree anatomiche: VsxANT, VdxANT, VsxPOST, VdxPOST. Per ogni area dei pericardi trattati TRITDOC e non trattati sono stati determinati lo spessore, la densità e il contenuto d’acqua medi. La qualità della decellularizzazione e la preservazione delle matrici sono state valutate tramite istologia, DAPI, immunoistochimica (IHC) e microscopia elettronica a trasmissione (TEM). L'eliminazione dell'antigene xenogenico alpha-Gal dai PBV e dai PP TRITDOC, è stata valutata tramite test ELISA. RISULTATI: Tutti i metodi di decellularizzazione sono in grado di eliminare totalmente la componente cellulare dai tessuti pericardici, inoltre mantengono inalterata l'organizzazione generale della MEC. I test di semina cellulare hanno mostrato che i Pericardiociti aderiscono alla superficie sierosa del PB UTRIDOC dopo 6h e 18h dalla semina e cominciano ad entrare nella MEC dopo 7 giorni nel PB TRICOL e UTRIDOC, mantenendo un metabolismo attivo. In presenza del peptide proadesivo sintetico RGD, i pericardiociti aderiscono meglio al PB UTRIDOC anche utilizzando concentrazioni cellulari di semina minori. Le cellule HUVEC riescono ad aderire alla superficie sierosa del PB UTRIDOC se seminate per 1h, 3h, 5h e 24h, ma non formano un monostrato continuo. Dopo un tempo di 7 giorni dalla semina invece, aderiscono più uniformemente sul PB UTRIDCOC e formano un monostrato sul PB TRITDOC, mantenendo l'espressione dei marcatori endoteliali vWf e CD31. Considerando l’intero PBV, il trattamento TRITDOC causa una riduzione dello spessore (p>0,05), un incremento della densità (p<0,05) e una parziale disidratazione del tessuto (p<0,05). Nel PP TRITDOC, nel VsxANT e nel VdxANT lo spessore è aumentato non significativamente (p>0,05) e il contenuto d’acqua si è ridotto invece in maniera significativa (p<0,05), mentre nel VdxPOST e nel VsxPOST lo spessore e il contenuto d’acqua si sono ridotti in modo non significativo (p>0,05). Dopo decellularizzazione, la densità del PP non si è modificata significativamente (p>0,05) rispetto al tessuto nativo. Inoltre, le aree che ricoprono il VsxANT nel PB e il VdxANT nel PP sono risultate le più omogenee per le proprietà fisiche sopra menzionate, sia prima sia dopo decellularizzazione. Le analisi morfo-strutturali eseguite, l’istologia e la valutazione al TEM hanno rilevato una struttura della matrice e un’organizzazione delle fibre collagene sostanzialmente preservata dal trattamento TRITDOC. CONCLUSIONI: I protocolli di decellularizzazione UTRIDOC, TRICOL e TRITDOC producono scaffolds pericardici bovini e porcini acellulari, non citotossici e con una MEC strutturalmente preservata. Il PB TRITDOC sembra lo scaffold più adatto per la semina di cellule umane endoteliali HUVEC. La decellularizzazione del PBV e del PP con il protocollo TRITDOC, ha inoltre permesso di individuare delle aree pericardiche di potenziale interesse per la TEHV. Studi approfonditi sulle prestazioni meccaniche e sul ripopolamento cellulare di queste matrici permetteranno una valutazione più accurata dell’effetto del trattamento

The aim of this thesis is the development of a Quality System in a tissue engineering laboratory. Implementing a Quality Management System (QMS) in a tissue engineering laboratory, as in any other production activity of goods or services, means to efficiently organize and systematically control all activities that help to ensure the quality of the product and satisfy the needs of users. The "Quality Management System" of any organization is defined as the organizational structure, responsibilities, procedures, processes and resources for implementing quality management, including all activities which directly or indirectly contribute to quality. In the QMS of a tissue engineering laboratory should be necessarily included the technical requirements, with special focus on the aspects related to product safety, crucial if the result of research is applied in humans. For this purpose, an extensive search of the legislation regulating the matter and of related technical standards and guidelines, both European and Italian, has been accomplished. With the publication of Regulation (EC) No 1394/2007 of 13 November 2007, engineered tissues are now considered advanced therapy medicinal products, so in this thesis are detailed the related legal references, with particular regard to: origin of cells and tissues; good manufacturing practice (GMP); structure of facilities for aseptic production; qualification and validation; patient, product and its raw materials traceability; clinical trials; efficacy and adverse reactions control; risk management system. As a basis for a Quality Management model, ISO 9000 standard has been considered. This model is based on the principles of quality management that lead to continous performance improvement. The aspects of quality management according to ISO 9000 (quality of process) and GMP (quality of product), are largely overlapping and partially complementary. Compliance with GMP and ISO 9000 certification contributes to increase the overall safety of products, ensuring through external audits of independent institutions the reliability of the work. The suitability of engineered tissue to implant is in fact the result of a series of quality controls not only on the engineered product, but also on the whole system, so to achieve the monitoring of the whole process.
Scopo del lavoro di tesi è lo sviluppo di un Sistema Qualità in un laboratorio di ingegneria dei tessuti. Introdurre un Sistema di Gestione per la Qualità (SGQ) in un laboratorio di ingegneria tissutale, come in ogni altra attività di produzione di beni o servizi, significa organizzare in maniera efficiente e controllare sistematicamente tutte le attività che concorrono a garantire il livello qualitativo del prodotto e soddisfare le esigenze degli utilizzatori. Per “Sistema di Gestione per la Qualità” di una qualsiasi organizzazione si intende la struttura organizzativa, le responsabilità, le procedure, i processi e le risorse destinati ad attuare la gestione della qualità, comprese tutte le attività che, direttamente o indirettamente, contribuiscono alla qualità. Nel SGQ di un laboratorio di ingegneria tissutale devono essere necessariamente inseriti anche i requisiti tecnici, con particolare riguardo gli aspetti relativi alla sicurezza del prodotto, fondamentali se il risultato della ricerca è applicato sull’uomo. E’ stata effettuata a questo scopo una estesa ricerca della legislazione che regola la materia, sia europea che italiana, e delle relative norme tecniche e linee guida. Con la pubblicazione del Regolamento (CE) n. 1394/2007 del 13 novembre 2007 i tessuti "ingegnerizzati" sono attualmente considerati medicinali per terapie avanzate, pertanto nel lavoro di tesi sono stati approfonditi i relativi riferimenti normativi, con particolare riguardo a: provenienza delle cellule e dei tessuti umani; buona pratica di fabbricazione (GMP); struttura degli impianti per produzione in asepsi; qualifica e convalida; tracciabilità del paziente, del prodotto e delle sue materie prime; sperimentazione clinica; controllo dell’efficacia e delle reazioni avverse; sistema di gestione del rischio; formazione del personale. Come base per un modello di Gestione per la Qualità è stata considerata la norma ISO 9000, fondata sui principi di gestione per la qualità che guidano al miglioramento continuo delle prestazioni. Gli aspetti di gestione della qualità secondo le ISO 9000 (qualità di processo) e GMP (qualità di prodotto), sono in gran parte sovrapponibili e in parte complementari. La conformità alle norme GMP e la certificazione ISO 9000 contribuiscono ad accrescere la sicurezza complessiva dei prodotti, garantendo tramite le verifiche esterne di Enti indipendenti l'affidabilità del lavoro svolto. L'idoneità del tessuto ingegnerizzato all'impianto è, infatti, il risultato di una serie di controlli di qualità non solo sul prodotto ingegnerizzato, ma su tutto il sistema, in modo da ottenere il monitoraggio dell'intero processo.

La terapia rigenerativa cellulare ha attirato in questi ultimi anni un'attenzione sempre maggiore da parte dei ricercatori; numerosi studi, pre-clinici e clinici hanno messo in evidenza come questo tipo di approccio terapeutico abbia le potenzialità per far recuperare la funzionalità cardiaca compromessa. Tuttavia, i risultati dei primi trials clinici hanno dato sinora risultati controversi. E' stato dimostrato che le cellule staminali adulte, sia che esse originino dal tessuto muscolare che dal midollo osseo, non si differenziano in cardiomiociti in grado di migliorare la funzionalità cardiaca. Dati recenti suggeriscono l'esistenza di cellule staminali cardiache residenti nel cuore adulto, con potenzialità di differenziamento verso i vari tipi cellulari presenti nel cuore (cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce). Le cellule staminali cardiache rappresentano l'opzione più promettente per la terapia rigenerativa cardiaca: infatti, esse non comportano problematiche di tipo etico né tantomeno complicanze di natura immunologica come le cellule staminali embrionali. Recentemente un gruppo di ricercatori ha isolato con successo cellule staminali cardiache (CSCs) da frammenti bioptici endomiocardici umani, espandendole in vitro per diverse generazioni e conservandone le potenzialità differenziative in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce.Purtoppo la terapia cellulare, in generale, soffre ancora di limitazioni correlate alla variabilità dell'engrafment cellulare e all'alta percentuale di morte per apoptosi che fa seguito al trapianto (circa 80%). Inoltre, questo tipo di approccio risulta inadeguato o quantomeno insufficiente in caso di lesioni infartuali di notevoli dimensioni. Parallelamente, la ricerca nel campo dell'ingegneria tissutale applicata alla patologia cardiaca ha compiuto notevoli progressi negli ultimi anni e numerosi studi in vivo e in vitro ne attestano le notevoli potenzialità terapeutiche. Sono state infatti recentemente sviluppate, tecniche di bio-ingegneria che prevedono l'incorporazione delle cellule staminali in matrici biodegradabili con formazione di biocomplessi, al fine di migliorare la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali stesse in vivo. Tali costrutti incorporano gli elementi cellulari in una struttura tridimensionale che può essere utilizzata per sostituire l'area di miocardio danneggiata in una maniera più fisiologica ed efficace: infatti, le matrici a base di collagene sono in grado di reintegrare la matrice extracellulare cardiaca danneggiata a seguito dell'insulto ischemico. Tuttavia non sono stati ancora identificati i biocomplessi matrice/cellula staminale più adeguati. La nostra ipotesi è che le cellule staminali cardiache autologhe possano rappresentare la scelta più efficace e realistica da utilizzare per la creazione di biocomplessi. La possibilità di mettere a confronto, l'attività biologica delle CSCs, con quella di altri tipi di cellule staminali adulte (sulle quali sono già stati condotti numerosi studi pre-clinici e clinici), dovrebbe definitivamente individuare e caratterizzare i vantaggi e gli svantaggi del migliore biocomplesso applicabile nella pratica clinica. La creazione di un modello sperimentale animale ottimale e la messa a punto di protocolli diagnostici per il monitoraggio in vivo del comportamento delle cellule staminali servirà come punto di partenza per la realizzazione di studi pre-clinici in animali di grande taglia e di studi clinici di fase I-II.
Cell therapy for regeneration, has received extensive attention and the accumulated evidence from both pre-clinical and clinical studies suggests that it has the potential to restore heart function. However, the results from first clinical trials are mixed, with benefits ranging from absent to transient and, at most, marginal. These studies indicate that adult stem cells, whether muscular or bone marrow-derived, fail to generate new cardiomyocytes, capable to improve cardiac function. Emerging evidence suggests that several subpopulations of resident cardiac stem cells (CSCs) have the ability to differentiate into cardiac myocytes, vascular smooth muscle and endothelial cells. CSCs represent a logical source to exploit in cardiac regeneration therapy bacause, unlike other adult stem cells, they are likely to be intrinsecally programmed to generate cardiac tissue in vitro and to increase cardiac tissue viability in vivo. In addition, autologous CSCs can be employed avoiding ethical and immunological problems associated with the use of embryonic stem cells. Recently, a group of our network has successfully isolated CPCs/CSCs from small biopsies of human myocardium and expanded them ex vivo trough several generations without loosing differentiation potential into cardiomyocytes and vascular cells, bringing autologous transplantation of cardiac stem cells closer to clinical translation. However cell therapy in general suffers limitatations related to variable cell retention, survival and significant cell death or apoptosis, early after implantation in the diseased myocardium. Furthermore, cell transplantation may not always be suitable for catastrophic events like large myocardial damage. For this reason, hybrid therapies that incorporate tissue engineering are being developed as potentially new therapeutic approaches for repair of myocardial tissue. Tissue engineering (TE) involves seeding a biodegradable scaffold with cells that grow into morphologically recognizable tissue both in vitro and in vivo. Recent advances in cell culture and TE have facilitated the development of suitable cell-engineered biodegradable grafts. The optimal biomaterials and cell types, however, have not been identified. Our hypothesis is that autologous cardiac stem cells could represent the most efficient and reliable cell type to be used for an hybrid therapy (tissue engineering/stem cells) to restore myocardial function in ischemic myocardial desease. TE joints the physical replacement of the diseased structure with new cardiac tissue built from a biodegradable scaffold, with the regenerating activity of the optimal cell types. A bioengineered tissue graft (biocomplex) would be the ideal treatment to repair cardiac ischemic diseases. The possibility to compare the biological activity of the CSCs with other adult SCs, should definitely individuate and characterize the advantages and disadvantages of the best clinical applicable biocomplex. Moreover, the creation of the appropriate animal model and the realization of diagnostic protocols aimed to monitor the in vivo cell fate, will be used as pre-clinical background for large animals and phase I-II clinical studies.

Ribonucleases (RNases) are proteins involved into many biological processes and hydrolysis of ribonucleic acid. The topic of this study has been the structural and functional characterization of three bovine proteins, namely RNase-A, Angiogenin-1 (bANG) and Lactogenin. The enzymatic, pro-angiogenic and cytotoxic activity has been evaluated. RNase-A is the best known protein showing a strong ribonucleolytic activity and a low cytotoxic action. bANG is a single-chain polypeptide stimulating angiogenesis; it has a weak ribonucleolytic activity necessary, but not sufficient, to induce the neoformation of blood vessels. Lactogenin, also named RNase BL-4, has been relatively poorly studied. In this study the relationship between molecular structure and biological activity of the three RNases has been evaluated by spectroscopy, ribonucleolytic activity analysis and, finally, by their effects on the viability of human endothelial or cancerous cellular cultures. High homology level of primary structure is resulted for all three under study proteins. Moreover, disulfide architecture is preserved except the missing of one bridge in bANG and the presence of a pyroglutamic residue at the N-terminus of Lactogenin. It is known that RNase-A is far more active in cleaving dinucleotide substrates as CpG and UpG in comparison with Lactogenin and bANG. On the other hand, Lactogenin presents a higher specificity for UpG instead of CpG than bANG. Angiogenin has been treated with immobilized trypsin in order to obtain its tryptic peptides and identify which part of protein is more involved into biological activity. The research study has shown that bANG stimulates the proliferation and capillary-like structures formation of Huvec endothelial cells in Matrigel in vitro angiogenic assay. The fragment 1-6 (N-terminal, termed P1) and the fragment 56-61 have stimulated a cellular proliferation response comparable to the native protein's one while the C-terminal fragment 103-124 has exhibited an inhibition effect. Moreover, in the presence of all the fragments P1, 56-61 and C-terminal the cells have demonstrated branch points formation, after seeding on Matrigel. The activity of Lactogenin has been comparable to the one of bANG, even if less strong, while RNase-A have not stimulated HUVEC cells' proliferation or differentation on Matrigel. Angiogenin and Lactogenin have been shown to promote the migration of cultured endothelial cells and the neovascularization in the chicken chorioallantoic membrane. The attachment and growth of HUVEC cells on synthetic materials such as polycaprolactone scaffolds seem to be improved by the addition of Angiogenin and its N-terminal fragment to the culture medium. The cytotoxic properties of RNase-A, bANG and Lactogenin have been valuated by using some tumor cell lines. bANG has expressed a stronger cytotoxic potential, inducing cell death by an apoptotic mechanism. In comparison with RNase A, the major cytotoxicity of bANG could be explained as a minor interaction with the RNAse inhibitor (RI). This hypothesis has been verified modelling bANG structure on the complex human Angiogenin-hRI, as the protein conformation is not so different in the complex from the free form. Many different contacts with hRI have been observed in hANG and bANG. One of the principal anchorage sites of hRI to hANG is resulted the Pro 88 residue, which lies within a hydrophobic pocket defined by three tryptophan residues of hRI. In bANG, the replacing of Pro88, with Ser89 causes a steric and electrostatic strain in the inhibitor enzymatic complex, decreasing the susceptibility of bANG to the inactivation by RI. Further studies will clarify the binding of bANG to hRI by calculating the inhibition constant.

Oltre 1,5 milioni di persone negli Stati Uniti e in Europa subiscono ogni anno un intervento chirurgico al menisco. Il menisco riveste un ruolo fondamentale nell’articolazione del ginocchio offrendo stabilità e sostegno. Agisce da ammortizzatore favorendo una distribuzione uniforme delle forze, inoltre lubrifica l’articolazione. Nella chirurgia ortopedica, le lesioni meniscali del ginocchio sono tra le più frequenti e se non vengono trattate adeguatamente e in tempi brevi, possono portare all’insorgenza di artrosi. Ad oggi, il trattamento delle lesioni meniscali è più orientato a metodi conservativi e all’approccio chirurgico comunemente noto come meniscectomia, cioè la rimozione totale o parziale della porzione di menisco lesionata. Tuttavia, questo metodo induce cambiamenti nelle condizioni di carico dell’articolazione del ginocchio, fino a causare il restringimento dello spazio articolare e la degenerazione della cartilagine. In questi casi, considerati i pro e i contro, si può valutare un trapianto anche se è scarsa la disponibilità di donatori. Negli ultimi anni, grazie allo sviluppo dell’ingegneria dei tessuti biologici, si sono sviluppati supporti porosi chiamati scaffold, in grado di promuovere l’accrescimento e il differenziamento cellulare, e di rispondere a caratteristiche meccaniche del tessuto che si vuole rigenerare. L’obiettivo di questo elaborato è quello di approfondire le strategie di scaffolding più recenti per la rigenerazione del tessuto meniscale, analizzando quindi i biomateriali più utilizzati, le fonti cellulari e i fattori di crescita impiegati per la proliferazione delle cellule all’interno dello scaffold col fine di creare nuovo tessuto meniscale. Vengono inoltre presentati alcuni esempi di applicazioni in vivo e in vitro di studi recenti.

L'ingegneria tissutale è una branca delle scienze biomediche che negli ultimi anni si sta sviluppando come mezzo risolutivo per numerose problematiche mediche. Un'applicazione di particolare importanza è il trattamento di patologie cardiovascolari, le quali sono una delle principali cause di morte nel mondo. La mancanza di tessuto autologo e i problemi legati alle terapie cardiache, hanno incentivato numerosi studi basati sulla ricerca di biomateriali adeguati alla realizzazione di tessuti sintetici sostitutivi. In questo ambito, il polibutilene succinato (PBS) riveste sicuramente un ruolo importante. La sua biocompatibilità insieme alla biodegradabilità, non sono però sufficienti a renderlo idoneo ad applicazioni miocardiche, a causa dell’elevata rigidità. Allo scopo di migliorare le proprietà meccaniche del PBS nell’ottica di un’applicazione nel campo della rigenerazione del tessuto cardiaco, ma senza andare a detrimento delle proprietà già buone, il presente lavoro di Tesi propone un nuovo copolimero a base di PBS. Tale materiale è stato ottenuto tramite reazione di estensione di catena di un blocco hard (PBS) e un blocco soft (costituito da un copolimero statistico P(BSNS)). Il materiale ottenuto è stato analizzato sia sottoforma di film che di scaffold. Dopo una prima caratterizzazione molecolare (1H-NMR e GPC), il copolimero multiblocco è stato sottoposto anche ad analisi termica (DSC e TGA), diffrattometrica (WAXS) e meccanica. Si è evidenziato un miglioramento della stabilità termica e soprattutto una diminuzione del modulo elastico unitamente all’aumento dell’allungamento a rottura, in particolare nello scaffold. E’ stata inoltre valutata la velocità di degradazione idrolitica, evidenziandone una riduzione rispetto all’omopolimero. I risultati ottenuti confermano il miglioramento delle proprietà non soddisfacenti del PBS, indicando il copolimero multiblocco, oggetto della presenti Tesi, come materiale più idoneo alle applicazioni sopracitate.

Nonostante il forte calo della mortalità per malattie cardiovascolari, tali disfunzioni rappresentano ancora la prima causa di morte in Europa. L’unico vero trattamento è il trapianto di cuore che però presenta diverse complicanze, tra cui la scarsa disponibilità di organi e il rigetto da parte dell’organismo curato. Per superare questi problemi, la ricerca si sta focalizzando sullo studio di nuovi polimeri biocompatibili e biodegradabili, per la realizzazione di strutture porose tridimensionali in grado di supportare la crescita e l’adesione cellulare. Tra i polimeri sintetici sperimentati per questa applicazione, il poli(butilene succinato) (PBS) rappresenta un ottimo candidato. Nonostante i promettenti risultati già ottenuti dal punto di vista di biodegradabilità e biocompatibilità, il PBS presenta però proprietà meccaniche poco adatte all’impiego qui descritto, proprio perché l’applicazione miocardica richiede particolari caratteristiche di modulo di Young (E) e un ritorno elastico comparabile con quello del miocardio naturale. Nella presente Tesi è stato sintetizzato e caratterizzato un nuovo copolimero statistico a base di PBS che presenta proprietà meccaniche funzionali all’MTE (Miocardial Tissue Engineering). In particolare, è stato inserito all’interno della catena polimerica, il neopentil glicole, che ha portato a un aumento della stabilità termica, proprietà di particolare interesse in fase di lavorazione del materiale, e una diminuzione del grado di cristallinità. La ridotta capacità a cristallizzare del copoliestere ha un effetto diretto sulle proprietà funzionali, tra le altre, sulla risposta meccanica e sulla velocità di degradazione idrolitica in ambiente fisiologico. In particolare, i risultati ottenuti hanno evidenziato come la copolimerizzazione abbia determinato una maggiore plasticità del materiale finale insieme a una maggiore velocità di degradazione idrolitica, entrambi spiegabili sulla base del ridotto grado di cristallinità.

Date le sollecitazioni meccaniche alle quali è sottoposta, la cartilagine, soprattutto quella articolare, è facilmente danneggiabile e la mancanza di vascolarizzazione la rende un tessuto incapace di auto-rigenerarsi. Il fallimento della chirurgia tradizionale ha incentivato negli ultimi venti anni lo sviluppo di nuove tecniche di ingegneria tissutale che prevedono la rigenerazione del tessuto cartilagineo in vitro, e il suo successivo impianto nella zona lesionata. Generalmente si preferisce utilizzare cellule staminali mesenchimali adulte (MSCs), e il tessuto adiposo si è rivelata la fonte di estrazione più conveniente.Inoltre le ATSCs (Adipose Tissue Stem Cells) possono essere facilmente isolate dalla componente vasculo-stromale (SVF) del tessuto adiposo prelevata in seguito a un intervento di liposuzione: quindi, a differenza delle MSCs estratte da midollo osseo (BMSCs- Bone Marrow Stem Cells), la loro estrazione dal paziente richiede un intervento meno invasivo e meno rischioso. Il tessuto cartilagineo non è raggiunto dai vasi sanguigni, e la sua formazione nella fase embrionale avviene ad una concentrazione di O2 notevolmente inferiore a quella ambientale. Questo ha indotto gli studiosi a pensare che un ambiente ipossico possa non soltanto favorire il differenziamento condrogenico di cellule staminali in coltura, ma anche facilitare il mantenimento del fenotipo condrocitico, mimando l'ambiente fisiologico avascolare della cartilagine.Lo scopo di questa tesi è stato la messa a punto di un protocollo di coltura cellulare in condizioni di ipossia per indurre differenziamento condrogenico di ATSCs. La metodica standardizzata verrà impiegata in laboratorio per sviluppare la ricerca di base nello studio della rigenerazione della cartilagine.

L’ablazione transcatetere è ad oggi la tecnica che ha mostrato maggior successo nel trattare pazienti affetti da fibrillazione atriale. Nell'isolamento elettrico delle vene polmonari (PVI) mediante ablazione transcatetere a radiofrequenza, l'identificazione dell’ostio delle vene polmonari (PVos) all'interno della giunzione vena polmonare-atrio sinistro (PV-LA) è il perno operativo per la rilevazione della posizione precisa dell’obiettivo dell'ablazione. La PVI dovrebbe avere come target l'antro delle vene polmonari (PVan), identificato empiricamente come la regione tra PVos e la camera atriale sinistra (LA). Tuttavia, non esiste alcun accordo anatomico universale sulla definizione di PVos, e quindi l'identificazione del PVan sulla ricostruzione elettro-anatomica 3D si basa solo su ipotesi empiriche. Infatti, la mappatura elettro-anatomica anche integrata con dati di imaging da tomografia computerizzata non è risolutiva nella identificazione della zona antrale e si porta dietro tutti i limiti dei metodi di imaging utilizzati. Nella PVI ampie lesioni sulla parete di LA all'esterno di PVan sono considerate non necessarie e potenzialmente dannose. La mappatura dell'impedenza (Im) di PV-LA mediante circuito generatore è stata proposta sulla base della dimostrazione dell’esistenza di un gradiente di impedenza dall'interno del PV a LA, dovuta ad una diversa composizione dei tessuti che caratterizzano i due distretti. Gli obiettivi di questo studio osservazionale che utilizza il sistema di mappaggio CARTO3 (Biosense Webster) integrato con dati di tomografia computerizzata (CT) sono stati in primo luogo quello di caratterizzare i gradienti impedenza punto-punto nella giunzione PV-LA con l’utilizzo di un catetere con misura di forza di contatto mantenuta stabile e, in secondo luogo, quello di valutare la definizione spaziale di PVos e PVan come rappresentata dalla mappa elettroanatomica 3D multi-modale rispetto alla loro definizione mediante mappatura delle impedenze.

Il tessuto cartilagineo è privo di capacità intrinseche di auto-rigenerazione, quindi, un suo danneggiamento spesso progredisce in una condizione cronica riducendo la qualità di vita. Una grossa percentuale della popolazione mondiale è affetta da malattie osteocondrali e, per questo motivo, si è sempre in cerca di alternative più efficaci: le attuali tecniche chirurgiche sono approssimative e, nella maggior parte dei casi, non risolvono interamente il problema nella lunga durata. Negli ultimi anni, gli approcci di ingegneria tissutale mirano a fornire metodologie sempre più innovative. Tra queste, l’utilizzo della stampa 3D ricopre sempre maggiore interesse. In questa tesi compilativa sono presi in considerazione una serie di lavori pubblicati negli ultimi anni, inerenti alle diverse tipologie di 3D bioprinting per la rigenerazione cartilaginea. Verranno quindi descritti i principali meccanismi e fasi di stampa, i principali biomateriali e le principali tecniche di analisi e lavorazione per valutare affidabilità, maturazione in vitro, biocompatibilità dei costrutti ottenuti, al fine di evidenziare le possibili applicazioni in vivo. Notevoli passi in avanti sono stati ottenuti nell’ottimizzazione del 3D bioprinting e, seppure esistano ancora tanti limiti da superare (es.: la vascolarizzazione), gli ultimi studi, permettono di essere fiduciosi sul futuro utilizzo di questa tecnologia.

L’Ingegneria dei Tessuti biologici è un ambito interdisciplinare che si pone l'obiettivo di ristabilire le originali funzioni fisiologiche di tessuti e organi danneggiati mediante la loro integrazione o sostituzione con costrutti bioibridi. Nei termini di Medicina Rigenerativa si vuole quindi rappresentare una solida alternativa alle tecniche di trapianto utilizzate in ambito clinico. Questo approccio si basa sulla semina di cellule da donatore a bordo di scaffold biocompatibili per realizzare costrutti rappresentativi di tessuti biologici, e possibilmente in futuro, organi funzionali e impiantabili. Le tecniche analitiche non-distruttive utili per valutare la maturazione di tali costrutti sono oggetto di attivo sviluppo. In questo lavoro di tesi viene presentato l’utilizzo della Tomografia a Impedenza Elettrica (EIT) in ambito di Ingegneria dei Tessuti biologici. Le caratteristiche dell’EIT, una metodologia di imaging moderna che si basa sulle variazioni di conduttività all’interno del campione analizzato, sono dunque state confrontate con metodologie tradizionali per lo studio di costrutti ingegnerizzati bioibridi. Nell’analisi dei principi di ricostruzione delle immagini e di modalità di impiego dell’EIT, sono state esaminate in particolare due tipologie operative: l’EIT a differenza di tempo e l’EIT a differenza di frequenza. Benché utilizzino entrambe lo stesso principio di funzionamento, esse si differenziano in alcuni aspetti fondamentali che le rendono più adatte, rispettivamente, al monitoraggio temporale del campione o alla valutazione delle caratteristiche della sua componente cellulare. Il risultato di questa analisi mostra che l’EIT ha notevoli importanti potenzialità analitiche. In particolare, la non-invasività del metodo è significativamente rilevante nel mantenimento delle proprietà del campione analizzato, sia ai fini del suo studio, sia nei termini del suo possibile impianto.

Il lavoro della presente Tesi è consistito nella preparazione e caratterizzazione di un copolimero triblocco A-B-A ad elevato peso molecolare, dove A è costituito da acido polilattico (PLLA) e B è un copolimero statistico a composizione equimolare poli(butilene/trietilene succinato), precedentemente studiato e caratterizzato da un comportamento meccanico elastomerico e da una cinetica di degradazione idrolitica lenta. Il rapporto tra i due blocchi A e B è stato fissato vicino all’equimolarità. Dai risultati ottenuti si evince come le proprietà meccaniche del copolimero triblocco siano significativamente diverse da quelle dell’omopolimero e, soprattutto, migliorative in vista di impieghi del materiale nell’ingegneria dei tessuti molli: infatti, il modulo elastico si è ridotto di due ordini di grandezza, mentre l’allungamento a rottura è aumentato di un ordine e mezzo. Per quanto concerne la cinetica di riassorbimento idrolitico, i risultati, seppure preliminari sembrano molto promettenti: la cinetica del PLLA risulta difatti rallentata per copolimerizzazione. Da ultimo, ma non meno importante, è da segnalare un miglioramento della stabilità termica (parametro importante per la processabilità di un biomateriale) del PLLA per copolimerizzazione.

Ogni anno vengono praticati a livello mondiale più di due milioni di interventi di bone grafting. L’incidenza delle patologie legate al tessuto osseo, causate da traumi, malattie o tumori, sta sempre più aumentando, anche a causa dell’invecchiamento della popolazione mondiale. Come diretta conseguenza si riscontra una crescita della richiesta di trattamento dei difetti dell’osso. Le tecniche ad oggi adottate nella pratica clinica, quali autograft ed allograft, presentano delle complicanze, come infezioni, morbidità del sito donatore, perdita di proprietà meccaniche del tessuto. L’ingegneria dei tessuti si pone come strategia innovativa per la riparazione del tessuto osseo, attraverso l’utilizzo di scaffolds realizzati con biomateriali su cui coltivare cellule staminali da indirizzare verso il fenotipo osteogenico. Poiché risulta di fondamentale importanza ricreare in vitro un ambiente di coltura il più fedele possibile a quello in vivo, nel presente elaborato si analizzano applicazioni di costrutti all’interno di bioreattori. Una corretta interazione tra questi dispositivi, i biomateriali e le cellule permette di aumentare sia l’efficacia che la controllabilità e la riproducibilità dei processi dell’ingegneria dei tessuti. È quindi la combinazione intelligente dei vari fattori caratterizzanti l’ingegneria tissutale ossea che può portare a colmare quel gap presente tra ricerca e applicazione, affinché una strategia così promettente trovi un’effettiva trasposizione nella pratica clinica.

Grazie ai continui progressi dell’ingegneria tissutale, branca dell’ingegneria che si occupa della ricostruzione in vitro di tessuti, sta diventando sempre più concreta la possibilità di superare i principali limiti della medicina tradizionale, fino ad ora limitata al trapianto di organi provenienti da donatori e a trattamenti farmacologici diretti non solo al sito di destinazione ma a tutto l’organismo (con possibili effetti collaterali). Tramite lo studio dei biomateriali e delle loro proprietà è possibile realizzare soluzioni ad hoc per l’ingegneria tissutale di diversi tessuti. Nel presente studio, è stato realizzato mediante elettrofilatura uno scaffold in P(BSBTDTP), un copolimero a base di PBS contenente co-unità ditiodipropioniche, caratterizzate dalla presenza del legame -S-S-, potenzialmente capace di migliorare la biocompatibilità e biodegradabilità dell’omopolimero. Il PBS è infatti un polimero sintetico biocompatibile già approvato dalla Food and Drug Administration, ma caratterizzato da un alto grado di cristallinità, che porta a lunghi i tempi di degradazione e a proprietà meccaniche spesso non adatte ad applicazioni nell’ingegneria dei tessuti molli. Il tappetino elettrofilato ottenuto tramite electrospinning è stato sottoposto inizialmente a caratterizzazione molecolare, termica e meccanica. Inoltre, in vista delle possibili applicazioni nell’ambito dell’ingegneria tissutale, il materiale è stato sottoposto anche a test di biodegradazione in ambiente enzimatico e prove di biocompatibilità in vitro. In conclusione, dalle indagini fatte, seppur preliminari, è risultato che lo scaffold realizzato in P(BSBTDTP), porta ad una migliore adesione e proliferazione cellulare e ad una velocità di degradazione in ambiente biologico leggermente superiore al suo corrispondente in PBS.

Nel presente lavoro di Tesi si è voluto far luce sui principali campi di applicazione di alcune nuove tecnologie in ambito biomedicale, quali l’ingegneria tissutale ed i dispositivi di somministrazione di farmaci attraverso meccanismi di controllo intelligenti. Più in dettaglio, si è analizzato il contributo in questi settori dei materiali polimerici ibridi, costituiti da una combinazione di polimeri di sintesi e di origine naturale, in particolare della cheratina nelle sue varie forme. Infatti, la preparazione di blend di cheratina con altri polimeri di tipo sintetico rappresenta una strategia vincente per migliorare le prestazioni non soddisfacenti della cheratina, come la sua difficile lavorabilità ed eccessiva rigidità, senza andare a detrimento di quelle già ottime, come la sua biocompatibilità. Inoltre, diversi studi hanno dimostrato che a partire da queste blend, è possibile ottenere vari tipi di dispositivi, come micro- e nanoparticelle, membrane e tappetini elettrofilati, che si sono rivelati tutti ottimi candidati come supporti per la medicina rigenerativa o dispositivi altamente performanti per il rilascio controllato e mirato di farmaco, settori il cui mercato è in continua e costante crescita.

Le malattie respiratorie colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, indipendentemente dalla fascia d'età o dallo status socioeconomico, emergendo come una delle principali cause di disabilità e morte. Molte di esse possono alterare la struttura e la funzione di diversi tratti respiratori, influenzando in modo sostanziale la vita dei pazienti. Purtroppo, il numero di persone affette da questi disturbi è drammaticamente in aumento a causa della pandemia da COVID-19 in corso. In caso di ampie alterazioni strutturali, i trattamenti medici disponibili e le strategie chirurgiche standard sono inefficaci o totalmente inapplicabili. Nonostante gli approcci chirurgici e le strategie di “tissue-engineering” (TE) proposti per affrontare questa urgente necessità medica, ad oggi nessuna strategia è diventata una procedura clinica ben consolidata e applicata di routine. Una delle maggiori difficoltà riscontrate in questi approcci clinici è la rigenerazione di un epitelio stabile sul costrutto trapiantato. Questa caratteristica è indispensabile per preservare la funzionalità respiratoria, evitare infezioni, formazione di tessuto di granulazione e re-stenosi. La fonte cellulare più appropriata per la rigenerazione dell’epitelio respiratorio in approcci di TE sarebbero le cellule epiteliali adulte del tessuto stesso. Tuttavia, la loro espansione in-vitro è resa difficile dal fatto è stato osservato siano capaci di dividersi efficientemente solo per pochissimi passaggi, oltre i quali perdono il loro potenziale di differenziazione e la capacità di formare una barriera funzionale. Pertanto si pensa che tali cellule siano inadatte e inaffidabili per approcci di TE. In questo studio abbiamo dimostrato la sicurezza e l’efficacia di un sistema di coltura, clinicamente validato per l’espansione di diversi tessuti epiteliali, nel mantenere il potenziale di proliferazione e differenziazione a lungo termine delle cellule epiteliali delle vie aeree. Inoltre, abbiamo stabilito dei controlli di qualità riproducibili da adottare nei diversi stadi di un approccio di TE. Tali controlli di qualità comprendono/verificano 1) le proprietà rigenerative delle cellule estratte dalla biopsia, 2) l'espressione di alcuni marcatori critici che identificano l'identità cellulare, l'integrità tessutale e il differenziamento epiteliale precoce delle colture. Questi marcatori devono essere verificati sia durante l'espansione cellulare in-vitro, sia durante il processo di TE. 3) Di cruciale importanza, abbiamo identificato le cellule staminali dell'epitelio delle vie aeree. Queste cellule sono in grado di auto-rinnovarsi, sopportando anche condizioni di differenziazione estreme per rigenerare il tessuto, mantenendo la sua eterogeneità fisiologica. Abbiamo ipotizzato l'uso di alcuni fattori di trascrizione, come possibili marcatori molecolari da adottare, in alternativa all'analisi clonale, per la valutazione della percentuale di cellule staminali all'interno di una coltura delle vie aeree. Inoltre, le molte analisi condotte a livello di singola cellula ci ha permesso di comprendere i meccanismi alla base del processo di specializzazione cellulare. Questo ci ha portato a proporre un modello che descrive come il rinnovamento epiteliale delle vie aeree e il processo di differenziazione potrebbero avvenire. Infine, grazie alle conoscenze acquisite durante la caratterizzazione delle colture in-vitro e alla coerenza dei risultati ottenuti da molti donatori umani, abbiamo deciso di avviare uno studio pilota che prevede la ricostruzione di uno pseudo-turbinato per il trattamento dei pazienti affetti da sindrome del naso vuoto. In questa tesi, presentiamo anche la nostra strategia di TE e i dati ottenuti dalle fasi iniziali su cui si basa questo approccio.
Respiratory diseases affect millions of people globally, regardless of age, group or socioeconomic status, emerging as one of the major causes of disability and death overall. Many diseases can alter the structure and function of the different tracts of the respiratory system, substantially affecting the patients' life. Even worst, the number of people affected by these disorders is dramatically increasing due to the ongoing COVID-19 pandemic. In the case of wide structural alterations, the available medical treatments and the standard surgical strategies are ineffective or totally inapplicable. Despite the surgical based approaches and the tissue-engineering (TE) strategies tested to face this urgent medical need, the positive results obtained have been very few and, to date, no strategy has become a well-established and routinely-applied clinical procedure. One of the major difficulties encountered in these clinical approaches is the regeneration of a stable/self-renewing epithelium onto the transplanted graft. This feature is imperative to preserve the respiratory function, avoid infections, granulation tissue formation and re-stenosis. In TE strategies, the adult airway epithelial cells would be the most appropriate cellular source for restoring the airway epithelium. However, many difficulties have been encountered in the in-vitro expansion of these cells. Indeed, they were described as effectively dividing for a very limited number of passages, beyond which they lose their differentiative potential and the ability to form a functional barrier. Therefore, it is reported that autologous airway epithelial cells do not meet the clinical regeneration needs and are unsuitable and unreliable cell sources for TE approaches. In the present study, we proved the ability of a culture system, largely used for the clinical expansion of different epithelial tissues, to safely and effectively maintain the long-term proliferative and differentiation potential of airway epithelial cells. Moreover, we established reproducible quality controls to be adopted from the biopsy collection up to the first steps of the generation of a TE construct. These quality controls include/verify 1) the tissue-regenerative properties of the cells extracted from the biopsy, 2) the expression of some critical markers identifying the cellular identity, the tissue integrity and the early epithelial differentiation of the cultures. These markers have to be verified during both the in-vitro cell expansion and during the TE process. 3) Crucial, we assessed the heterogeneity of the basal cells, identifying the stem cells of the airway epithelium. These cells can self-renew, withstanding even extreme differentiation conditions to regenerate the tissue, maintaining its physiological heterogeneity. Here, we hypothesized the use of some transcription factors as possible molecular markers to be adopted, alternatively to the clonal analysis, to evaluate the percentage of stem cells within an airway culture. Moreover, the multiple analyses conducted at the single-cell level allowed us to understand the mechanisms that underlie the cellular differentiation/specialization process. Therefore, here we propose a model showing how the airway epithelial renewal and differentiation process could occur. Finally, thanks to the knowledge acquired during the in-vitro cultures characterization and to the consistency of the results obtained from many human donors, we decided to start a pilot study envisaging the reconstruction of a pseudo-turbinate for the treatment of Empty Nose Syndrome’s patients. In this manuscript, we present our TE strategy and the data obtained by the initials steps on which this approach is based.

La cura e il trattamento delle ferite cutanee è oggi oggetto di studio e ricerca sperimentale in numerosi ambiti scientifici. Grazie alla convergenza fra ingegneria tissutale e medicina rigenerativa, è stata presentata una bio-stampante 3D in grado di realizzare dei sostituti epiteliali da impiantare in situ, ovvero direttamente nella zona danneggiata, per agevolare la guarigione di lesioni estese. La tecnologia è in fase di sviluppo, ma le prove sperimentali eseguite con successo in laboratorio sono numerose, alimentando la speranza che l’approccio possa essere utilizzato sull’essere umano. Il dispositivo consente di rilasciare “layer by layer” cellule e biomateriali in modo preciso e accurato, a dare origine a un tessuto ingegnerizzato che riproduce la struttura di una cute sana migliorando il processo di guarigione in termini di rapidità di intervento, accresciuta funzionalità del tessuto e superiore estetica del risultato dell’intervento riparativo.

Ogni anno 11 milioni di persone necessitano di cure legate alle ustioni il cui trattamento (in caso di lesioni estese) comporta l'asportazione chirurgica della pelle danneggiata e la ricostruzione della lesione con l'aiuto di sostituti della pelle. La creazione di un tessuto cutaneo 3D in vitro deve considerare la presenza delle diverse componenti del tessuto nativo (vasi sanguigni ecc.) e delle sue funzioni primarie biologiche e biomeccaniche. Attraverso un adeguato trattamento sarà possibile creare modelli di tessuto malato per studiare patologie come tumori o malattie cutanee. I costrutti potranno essere utilizzati anche per effettuare test in vitro di farmaci e cosmetici. Le tecniche tradizionali per realizzarli presentano limiti come l’impossibilità di avere un controllo preciso sulla porosità degli scaffold e sulla distribuzione cellulare in essi, o il rischio di incorrere in stress fisico/chimici sui biomateriali. Possono essere implementate solo in vitro. La 3D bioprinting ha le potenzialità per colmare tali limiti, portando ad ottenere un tessuto sempre più fisiologicamente simile a quello nativo e adatto ad essere impiantato. Questa tecnologia gode di altri benefici come la possibilità di stampare costrutti su misura, con struttura identica al sito della ferita e disposizione cellulare omogenea, che consente una maggiore vitalità cellulare in tutte le zone del costrutto. Consente anche una notevole riduzione dei tempi di generazione del costrutto. Vengono presentate le principali tecniche di 3D bioprinting attualmente utilizzate, i metodi di pre- e post-processing, pregi e difetti di ogni tecnica evidenziando i risultati migliori ottenuti con esse. Inoltre, ci si focalizzerà su alcuni lavori presenti in letteratura, che propongono varie modifiche apportate ai bioinchiostri o alle stampanti, per stampare un tessuto cutaneo strutturalmente completo. Si discutono infine le sfide future alle quali si andrà incontro e le innovazioni possibili in questo ambito.

La ricerca nell’ambito dell’ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa ha consegfuito importanti sviluppi negli ultimi anni grazie alla realizzazione di sistemi di coltura cellulare 3D e bioreattori in grado di riprodurre e controllare accuratamente le condizioni ambientali. Tuttavia, la valutazione delle caratteristiche degli scaffold e la comprensione delle complesse interazioni cellule-microambiente circostante risulta ancora carente e associata a limitazioni, associate, ad esempio, alla manipolazione analitica della matrice polimerica, che può comportare la compromissione della vitalità cellulare. Superare questi limiti significa quindi utilizzare approcci non-distruttivi, in grado di migliorare la qualità e l’affidabilità della sperimentazione in vitro. In questo progetto di tesi vengono proposte tecniche non-distruttive e non-invasive basate su misure di impedenza e misure spettrofotometriche, per la caratterizzazione della cellularità a bordo di scaffold in alginato, collagene e chitosano. La misura elettrica è stata effettuata tramite analisi d’impedenza e ricostruzione di mappe di conducibilità; quella ottica attraverso un'indagine spettroscopica. Le misure sono state confrontate per valutarne precisione e validità nella quantificazione.

L’ingegneria tissutale rappresenta oggi una delle tematiche più importanti di ricerca in ambito medico-ingegneristico. Questa disciplina si pone come obiettivo di far fronte alla mancanza, sostituzione o riparazione di tessuto attraverso lo sviluppo di scaffolds opportunamente ottimizzati. I polimeri naturali rappresentano una classe di materiali particolarmente indicata per soddisfare i requisiti richiesti soprattutto per la biocompatibilità che spesso li caratterizza. La gelatina è uno dei materiali che si presta alla realizzazione di scaffolds innovativi ad altissima biocompatibilità nonostante le scarse proprietà meccaniche e la facilità di degradazione. Proprio per questo è possibile migliorarne le prestazioni attraverso l’ottimizzazione di processi di blending con altri polimeri, in questo caso le nanofibre di cellulosa e l’impiego di agenti reticolanti. Lo scopo di questo lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ceramici (ISTEC-CNR) di Faenza, è la progettazione, lo sviluppo e la caratterizzazione di scaffolds polimerici porosi a base di gelatina e nanocellulosa opportunamente reticolati per un ampio range di applicazioni nell’ambito dell’ingegneria tissutale. A questo scopo, sono stati sviluppati cinque dispositivi 3D porosi, ottenuti tramite liofilizzazione, che differiscono per il tipo di processo reticolante applicato. Il progetto ha previsto una prima fase di ricerca bibliografica che ha permesso di conoscere lo stato dell’arte sull’argomento trattato. Si è potuto così procedere alla realizzazione degli scaffolds e a una prima caratterizzazione di carattere chimico-fisico e morfologico. A questo punto, sulla base dei dati ottenuti, sono stati scelti i campioni su cui effettuare ulteriori caratterizzazioni meccaniche. In ultimo, sono stati analizzati e rielaborati tutti i risultati.

Ogni anno nel mondo vengono segnalati più di 33 milioni di infortuni muscoloscheletrici, con significative ripercussioni socio-economiche in termini di ore di lavoro perse e spese economiche conseguenti. Essi costituiscono una delle più frequenti diagnosi in campo ortopedico, rappresentando oltre il 30% di tutte le diagnosi nelle visite muscoloscheletriche effettuate ogni anno. Al giorno d’oggi si conoscono numerose strategie per il trattamento dei tendini danneggiati. Tra queste, gli interventi chirurgici prevedono l’innesto di materiali biologici o sintetici all’interno del sito danneggiato, costituendo una strategia semplice e rapida se paragonati al processo di guarigione naturale; tuttavia, essi hanno dei limiti che possono portare a un insuccesso del trattamento. L’ingegneria tissutale costituisce un promettente approccio da applicare quando la guarigione naturale o la sostituzione chirurgica falliscono. Attualmente, differenti tipologie di cellule e di biomateriali vengono utilizzati per disegnare sostituti tissutali ingegnerizzati. In particolare, gli scaffold possono essere realizzati con biomateriali di origine sintetica o biologica e attraverso diverse tecniche di fabbricazione. Tra queste il cell-electrospinning ha raggiunto un elevato livello di interesse nel campo della medicina rigenerativa. Esso è basato sulla normale tecnica di elettrofilatura, ma aggiunge il vantaggio di poter incapsulare le cellule nelle micro/nanofibre. Grazie a questa tecnica è quindi possibile ricreare in maniera più fedele l’ambiente della matrice extracellulare, preservando e promuovendo la normale attività cellulare. Nonostante ciò, esistono ancora diversi limiti da superare prima che i costrutti tissutali tendinei possano essere utilizzati in ambito clinico. Studi futuri che integrano diversi materiali e tecniche di produzione potranno quindi essere di supporto per il trattamento delle patologie tendinee.

L’ingegneria tissutale è un settore multidisciplinare che applica i principi dell’ingegneria per realizzare dei sostituti biologici capaci di ripristinare una determinata funzione dell’organismo. Si avvale dell'utilizzo di alcuni dispositivi, come bioreattori, e di scaffolds, ovvero strutture tridimensionali capaci di sostenere e promuovere la formazione e la crescita cellulare. I recenti progressi in questo campo e nella medicina rigenerativa hanno dimostrato l'importanza di comprendere le complesse interazioni delle cellule con il microambiente circostante, al fine di sviluppare sistemi terapeutici di successo. Pertanto, sono necessarie tecniche di valutazione efficaci fin dalle fasi iniziali di ricerca e sviluppo, in modo da selezionare o progettare scaffolds con proprietà adeguate. La valutazione dello stato e delle caratteristiche delle popolazioni cellulari all'interno di queste strutture, inoltre, risulta fondamentale per poter sfruttare al meglio le tecniche di coltura cellulare in 3D. Per questa ragione, una linea di ricerca attiva presso il laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare "Silvio Cavalcanti" DEI - UOS Cesena si propone di sviluppare metodi non invasivi al fine di caratterizzare le strutture tridimensionali e di studiare il comportamento di popolazioni cellulari cresciute al loro interno. Lo scopo principale di questa tesi è stato lo studio dell'efficacia di un metodo alternativo per la quantificazione dell'assorbanza di scaffolds polimerici vuoti a diverse concentrazioni di calcio, utilizzando uno strumento di dimensioni ridotte che possa essere integrato in un bioreattore. Tali misure sono state confrontate con quelle di uno strumento professionale, ovvero il lettore multipiastra Tecan, in modo da analizzarne la precisione e la validità. Dai risultati ottenuti, queste tecniche di indagine sembrano essere molto promettenti per la valutazione non distruttiva di scaffolds per colture cellulari 3D.

Negli ultimi anni, lo sviluppo di applicazioni biomedicali d'avanguardia come la medicina rigenerativa ed il rilascio controllato di farmaci ha spinto la ricerca scientifica verso lo studio di nuovi materiali dalle proprietà idonee, primi fra tutti i poliesteri alifatici. Tra questi, il poli(butilene succinato), materiale approvato dalla Food and Drug Administration, è stato oggetto di numerose ricerche scientifiche negli ultimi anni, in quanto presenta buona stabilità termica, bassi costi di produzione e lavorazione, ed ottima biocompatibilità. Con lo scopo di rendere questo polimero adatto a soddisfare un'ampia varietà di applicazioni, andando a migliorare le sue caratteristiche non soddisfacenti, mantenendo quelle già buone, è possibile utilizzare diverse strategie, tra cui la copolimerizzazione, la miscelazione con altri polimeri, sia sintetici che naturali, oppure la realizzazione di compositi organico/inorganici. Questa Tesi fornisce dunque un'analisi critica e comparativa delle principali applicazioni in ambito biomedicale del PBS e di alcuni suoi copolimeri, blend e compositi, effettuata a partire dalla letteratura scientifica più recente.

La ricerca nell'ambito dell'ingegneria tissutale e della medicina rigenerativa ha subito importanti sviluppi negli ultimi anni, con la realizzazione di sistemi di coltura cellulare 3D. L'utilizzo di idrogel polimerici, in particolare, si è rivelato un'importante risorsa sia nello sviluppo di nuove terapie, sia in studi di differenziamento. La valutazione delle caratteristiche degli scaffold e delle popolazioni cellulari al loro interno, tuttavia, risulta ancora associata a numerose limitazioni, quali la necessità di disgregare la struttura o di compromettere la vitalità cellulare. Lo sviluppo di approcci di misura non distruttivi e in grado di effettuare valutazioni in real-time, migliorerà significativamente la qualità e l'affidabilità della sperimentazione in-vitro. Il lavoro presentato in questa tesi consiste in uno studio preliminare di caratterizzazione di idrogel vuoti attraverso misure di impedenza, che affianca alle valutazioni ottenute con uno strumento professionale, le misure di un impedenziometro portatile e a basso costo, realizzato specificatamente per questa applicazione. Oltre alla caratterizzazione elettrica di idrogel di alginato a diverse concentrazioni di calcio, vengono descritte la scelta dei componenti hardware del sistema portatile e le caratteristiche dei software di acquisizione e analisi, realizzati in ambienti Arduino e Matlab rispettivamente. Benché non completamente ottimizzato, questo metodo ha rilevato una correlazione inversa tra concentrazione di calcio e impedenza a bassa frequenza che si è mantenuta consistente nei due strumenti. La valutazione d'impedenza a diverse frequenze, inoltre, apre la possibilità di misurare anche altri parametri, come può essere la vitalità di una popolazione di cellule, a frequenze superiori. Queste caratteristiche rendono l'approccio proposto molto promettente e potenzialmente in grado di promuovere il passaggio da sistemi di coltura tradizionale ad approcci 3D più accurati e affidabili.

The pressing needs related to the processes of drug and therapy development for diseases such as type 2 diabetes, have increased the demand for new technologies and protocols. In vitro models are extremely helpful for physiological and drug screening studies; however they are time consuming and expensive. A theoretical approach through mathematical modeling could help in the understanding of the biology of the system and to rationalize these experiments. The aim of this thesis has been the development of a multiscale and multidisciplinary approach to model three-dimensional cell and tissue culture. The final application was the rationalization of an ex vivo model of human adipose tissue to characterize the pathophysiological conditions of type 2 diabetes mellitus. Mathematical models were developed for describing cell culture in dynamic systems, aiming to analyze the effect of macroscopic variables on cell microenvironment properties and therefore on their fate. We investigated the role of experimental conditions like the flow rate and the culture chamber configuration on cell proliferation, and we tested the efficiency of a discontinuous management of cell cultures in a microfluidic chip. In addition, in a three-dimensional perfusion bioreactor, we studied the effect of heterogeneous culture conditions (within porous scaffolds) in the cell microenvironment on the cell growth. The model linked the macroscopic variables to the cell microenvironment properties predicting cell growth as a function of the experimental conditions and the scaffold pore size distribution. The effect of endogenous and exogenous factors on the intracellular processes was also investigated. In particular, we coupled the mass transport model to the insulin signaling pathways model, studying the influence of this hormone on the cell glucose metabolism. We finally proposed a mathematical model for the ex vivo human adipose tissue culture in a microfluidic platform, supporting the design and realization of the device itself. This system has been used for studying the tissue response to an insulin stimulation and the pathophysiological conditions of type 2 diabetes. These results show interesting applications for the experimental design and optimization of culture conditions, and they mark a step towards an efficient development of drug tests or therapies.
Le forti necessità legate allo sviluppo di farmaci e terapie per malattie quali il diabete di tipo 2, hanno portato alla crescente domanda di nuove tecnologie e protocolli. Modelli in vitro sono estremamente utili per studi fisiologici e screening farmacologici; tuttavia questi sono dispendiosi e richiedono molto tempo. Un approccio teorico attraverso la modellazione matematica può facilitare lo studio della biologia del sistema e aiutare nella razionalizzazione degli esperimenti. Lo scopo di questa tesi è stato lo sviluppo di un approccio multi-scala e multi-disciplinare per modellare colture tridimensionali cellulari e di tessuto. L’applicazione finale ha previsto la razionalizzazione di un modello ex vivo di tessuto adiposo umano con lo scopo di caratterizzare le condizioni fisiopatologiche del diabete di tipo 2. Modelli matematici sono stati sviluppati per descrivere colture cellulari in sistemi dinamici, al fine di analizzare l’effetto di variabili macroscopiche sulle proprietà del micro-ambiente e quindi sull’evoluzione cellulare. Abbiamo investigato il ruolo delle condizioni sperimentali, come ad esempio la portata e la configurazione della camera di coltura, e testato l’efficienza di una gestione discontinua delle colture cellulari in piattaforme microfluidiche. Inoltre, nel caso di un bioreattore a perfusione per colture cellulari tridimensionali, abbiamo studiato l’effetto di condizioni di coltura eterogenee nel micro-ambiente cellulare (a causa dello scaffold poroso) sulla crescita cellulare. Il modello relaziona le variabili macroscopiche alle proprietà del micro-ambiente cellulare predicendo la crescita in funzione delle condizioni sperimentali e della distribuzione della dimensione dei pori dello scaffold. In aggiunta è stato analizzato l’effetto di fattori endogeni ed esogeni sui processi intra-cellulari. In particolare, abbiamo integrato il modello di trasporto di materia con il modello per il signaling dell’insulina, studiando l’influenza di questo ormone sul consumo cellulare di glucosio. Infine, è stato proposto un modello matematico per descrivere la coltura ex vivo di tessuto adiposo umano in una piattaforma microfluidica per assistere nella fase di progettazione e realizzazione della piattaforma stessa. Questo sistema è stato utilizzato per studiare la risposta del tessuto sottoposto ad uno stimolo di insulina e le condizioni fisiopatologiche del diabete di tipo 2. Questi risultati hanno interessanti risvolti applicativi per la progettazione di esperimenti e l’ottimizzazione delle condizioni di coltura, segnando un passo in avanti verso lo sviluppo di terapie e tests farmacologici.

INTRODUCTION: This multistep work has investigated tissue engineering of the liver as approach for treating end-stage liver diseases by different projects. Engineering of hepatic tissue based on primary hepatocytes offers new perspectives in this field. However, generation of thick, 3D liver tissue has been limited by the lack of vasculature in the engineered constructs; hepatocyte survival is transient if limited by insufficient vascular-network formation. To overcome this limitation and establish a vascularized construct, we firstly worked on designing a novel microfluidic-based bilayer device with a discrete parenchymal chamber modeled upon hepatic organ architecture. The design enables the device concept to serve as both a platform technology for drug discovery and toxicity, and for the continuing development of an improved liver-assist device. Thereafter the designed device has been moved to an in vivo animal model (project 2), evaluating the liver-assist device platform with a microfluidic-modeled vascular network in a femoral arteriovenous shunt model in rats. On this basis, we proceeded with efficiently differentiating precursor liver cells into mature cells within 3D bioreactor systems in different culture conditions. Combined and distinct methods have been tested to enhance the in vitro differentiation of liver precursor cells (project 3). Finally, new smart 3D scaffolds cultured with a mixed population of hepatocytes and mesenchymal stem cells have been implanted in vivo (project 4), after adequate preconditioning in the previous bioreactor system, to induce angiogenesis processes. These different approaches can be efficiently put together for the final realization of an in vivo bio-artificial liver construct. METHODS: Project 1: 18 assembled devices with continuous flow have been tested for the capability of transporting of metabolites and small proteins while protecting an adjacent cell culture from the effects of shear stress. Devices were seeded with HepG2/C3A and primary hepatocytes in different culture conditions to test the final capability of the system to maintain an efficient dynamic culture. Project 2: 16 devices (assembled in project 1) with rat primary hepatocytes and 12 with human HepG2/C3A cells were tested in athymic rats in a femoral arteriovenous shunt model. Several parenchymal tube configurations were evaluated for pressure profile and cell survival. The blood flow pattern and perfusion status of the devices was examined by laser Doppler scanning. Cell viability and serum protein secretion functions were assessed. Project 3: Pluripotent Human Liver Stem Cells (HLSCs) were seeded onto 18 3D "smart scaffolds" composed by a biocompatible collagen-sponge. The scaffold was connected to a novel perfusion bioreactor able to ensure long-term uniform flow of medium through the material sponges; stem cells medium and co-culture with hepatic stellate cells (HSCs) were added in different conditions. Tissue engineering strategies based on the co-cultivation of HLSCs with hepatic stellate cells (ITO) and with several combinations of medium were applied. Morphological and functional assays were performed at day 3, 5 and 7 of the in vitro perfusion condition Project 4: 12 scaffolds composed by 3D hyaluronan-derivative [a benzyl ester of hyaluronan (HYAFF®), seeded with a population of human mesenchymal stem cells (HMSCs) and hepatocytes in different ratio, were firstly cultured in the previous bioreactor system to induce a preconditioning stimulus for proliferation and regeneration. The scaffolds were then implanted onto the omentum of 12 nude rats and then rolled into a 3-D pocket structure. Morphological assays were performed to test the neoangiogenesis properties of HMSCs and establish hepatocytes viability after 7 days. RESULTS: Project 1: The assembled device was able to sustain both human hepatoma cells and primary rat hepatocytes by continuous in vitro perfusion of medium, allowing proliferation and maintaining hepatic functions such as serum protein synthesis and metabolism. The mathematical model estimated the best flow rate for perfused cultures lasting up to 14 days. Project 2: The testing in femoral arteriovenous shunt model was successfully established in all animals. Blood flow was homogeneous through the vascular bed and replicated native flow patterns. Survival of seeded liver cells was highly dependent on parenchymal chamber pressures. The tube configuration that generated the lowest pressure supported excellent cell survival and function. Project 3: The hepatic differentiation of HLSCs from adult liver has been improved in 3D collagen scaffolds, confirmed by morphological and functional assays; the flow of perfusion medium (assured by the bioreactor system) enabled the in vitro organization of the cells into liver clusters even in the deeper levels of the sponge. This preliminary experiment has shown that collagen sponge and dynamic in vitro condition not only promote formation of cellular bodies of HLSCs but also enhance a more rapidly functional differentiation into a mature hepatic population. Project 4: The final ongoing project moved to the in vivo model. After a preconditioning period in the bioreactor assembled in project 3, cultured HYAFF®) 3D scaffold (with hepatocytes plus HMSCs or hepatocytes alone) have been implanted in rats. New tissues consisting of neo-angiogenesis’ clusters organized in vessel-like structures formed by 1 week, and the hepatocyte mass survived during all the study-time. Vascular structures, identified by H&E staining, were positive for von Willebrand factor. Hepatocytes were immunohistochemically positive for albumin and CK8-18-19. These results suggest that our “bio-engineered-reactor” is characterized by a steady neovasculature potentiality and keeps capacity for supporting hepatocyte viability. CONCLUSIONS: A preliminary multistep approach to generate in vivo morphologically and functionally complex new tissue has being constituted from simple monolayer. This ongoing work represents a preliminary step toward the final engineer of liver-organoid vascularized construct.
INTRODUZIONE: Il progetto oggetto di questa tesi si è proposto di applicare le tecniche di ingegneria tissutale come approccio alla realizzazione di costrutti epatici per il supporto metabolico delle malattie del fegato; la realizzazione del lavoro si è sviluppata attraverso la successione multistep di diversi progetti tra loro complementari. L’ingegnerizzazione di tessuto epatico attraverso colture di epatociti primari infatti offre nuove prospettive in questo ambito; tuttavia la realizzazione di strutture 3D è spesso limitata dalla mancanza di una struttura vascolare in grado di costituire un adeguato supporto nutritivo. D’altra parte gli epatociti sono cellule ad alto metabolismo e la loro sopravvivenza è limitata in condizioni ipossiche, in mancanza di una sufficiente rete vascolare. Al fine di superare questo problema e di ottimizzare le condizioni per il supporto di nutrienti, abbiamo innanzi tutto rivolto l’attenzione alla realizzazione di un bioreattore bilayer, sviluppato nelle 2 dimensioni, e ingegnerizzato partendo da dati noti di microfluidodinamica; inoltre in grado di proporre un sistema di coltura basato sulla anatomia microscopica del fegato. Tale design ha permesso la realizzazione di un bioreattore in grado di costituire una piattaforma da utilizzare come unità di drugtesting, ma anche per la successiva realizzazione di un sistema di assistenza epatica (progetto 1). Sulla base dei dati ottenuti, il progetto è stato in seguito traslato nel modello in vivo e il bioreattore è stato testato nel piccolo animale; l’impianto del device è stato realizzato ex vivo mediante il confezionamento di uno shunt artero-venoso femoro-femorale (progetto 2). Il lavoro è stato quindi implementato sviluppando sistemi di coltura nelle 3 dimensioni (progetto 3); diverse combinazioni di coltura su scaffolds 3D in perfusione continua, all’interno di nuovi bioreattori, sono state testate per l’induzione differenziativa di cellule staminali (precursori epatocitari di origine umana). I successi ottenuti hanno spinto alla realizzazione dell’ultimo step (progetto 4). Smart scaffolds 3D di nuova generazione sono stati utilizzati per allestire colture 3D attraverso diverse combinazioni di popolazioni cellulari (epatociti primari + cellule mesenchimali staminali o soli epatociti primari), inducendo processi di neoangiogenesi. Dopo adeguato preconditioning in bioreattori in vitro, lo scaffold è stato in seguito impiantato in vivo, nel piccolo animale. METODI: Progetto 1: 18 bioreattori ingegnerizzati a flusso continuo sono stati testati per la loro capacità di trasporto di metaboliti all’interno di un compartimento parenchimale ove le colture cellulari sono state protette dagli effetti nocivi di shear stress. I bioreattori sono stati sottoposti a semina con cellule HepG2/C3A ed epatociti primari in diverse condizioni di coltura, al fine di testare la capacità del sistema di mantenere in vitro una coltura dinamica, vitale ed efficiente dal punto di vista metabolico. Progetto 2: 16 bioreattori (precedentemente ingegnerizzati nel progetto 1) sono stati utilizzati e sottoposti a coltura con epatociti primari e 12 con cellule umane HepG2/C3A; i bioreattori sono stati impiantati ex vivo in ratti atimici attraverso la realizzazione di uno shunt artero-venoso femoro-femorale. Il setting del bioreattore exvivo ha previsto diverse configurazioni, testate sotto il profilo dei parametri di vitalità cellulare sulla base dei relativi dati di pressione e di flusso nelle diverse configurazioni. Il pattern di flusso ematico e la perfusione del sistema sono stati esaminati attraverso laser Doppler scanning. La vitalità cellulare e la funzionalità metabolica sono state inoltre verificate. Progetto 3: una popolazione di Pluripotent Human Liver Stem Cells (HLSCs) è stata coltivata su 18 "smart scaffolds" 3D, composti da spugne di collagene biocompatibile. Lo scaffold è stato inserito in un nuovo bioreattore per la perfusione di strutture 3D in grado di garantire flussi uniformi di medium; medium per cellule staminali e colture miste con cellule stellate del fegato (HSCs) sono state aggiunte in diverse condizioni di coltura. Le diverse combinazioni sono state testate attraverso l’esecuzione di studi morfologici e funzionali rispettivamente nei giorni 3, 5 e 7 della perfusione in vitro. Project 4: 12 scaffolds 3D, costituiti da un derivato dell’acido ialuronico [a benzyl ester of hyaluronan (HYAFF®) sono stati sottoposti a semina con popolazioni di cellule staminali mesenchimali di origine umana (HMSCs) ed epatociti in diverse combinazioni; è stata allestita una coltura in perfusione continua nel bioreattore precedentemente descritto (preconditioning). In seguito gli scaffolds sono stati impiantati nell’omento di 12 ratti atimici, costituendo una tasca “rolled” 3D. Studi morfologici sono stati eseguiti al fine di valutare i processi di neoangiogenesis sostenuti dalle cellule HMSCs e valutare la vitalità epatocitarie a 7 giorni dall’impianto. RISULTATI: Progetto 1: Il bioreattore ingegnerizzato si è dimostrato in grado di sostenere entrambe le popolazioni cellulari in studio, comprese colture primarie di epatociti (notoriamente più sensibili), attraverso la realizzazione di una perfusione continua di medium sovrapponibile a flussi fisiologici. Tale circostanza ha favorito sia i processi di proliferazione cellulare che la funzione metabolica epatocitaria (sintesi proteica). Il modello matematico del sistema ha permesso di sostenere una coltura dinamica fino a 14 giorni. Progetto 2: Il bioreattore, collegato all’animale attraverso il confezionamento di uno shunt femorale artero-venoso, ha realizzato un sistema di perfusione ex vivo. Il flusso ematico all’interno del network vascolare si è dimostrato omogeneo nel tempo ed ha ricostituito il fisiologico pattern di flusso artero-venoso del fegato. La sopravvivenza cellulare ha dimostrato alti valori dipendentemente dai valori pressori raggiunti all’interno della camera parenchimale. La configurazione del sistema che ha generato la minore pressione all’interno della camera parenchimale ha dimostrato anche i migliori risultati in termini di sopravvivenza cellulare. Progetto 3: con l’intenzione di costituire strutture 3D, la differenziazione epatica di cellule HLSCs da fegato umano è stata indotta in scaffolds di collagene; i test morfologici e gli assays funzionali hanno confermato la maturazione. Il flusso continuo di perfusione del medium (garantito dal bioreattore) ha favorito in vitro la distribuzione delle cellule in clusters organizzati fino alle porzioni più profonde dello scaffold. Gli esperimenti hanno dimostrato che la spugna di collagene e le condizioni di coltura dinamica in vitro sono in grado di promuovere non solo la formazione di aggregati di HLSCs ma anche di favorire una più rapida maturazione verso fenotipi epatici maturi. Progetto 4: lo step finale, ancora in corso, ha previsto l’induzione della neoangiogenesi in vivo. Dopo un processo di preconditioning della coltura cellulare nel bioreattore precedentemente ingegnerizzato (progetto 3), scaffolds 3D di HYAFF® con combinazioni diverse di epatociti primari e MSCs, sono stati impiantati nei ratti. Il costrutto cosi ottenuto a 7 giorni dall’impianto ha dimostrato, alla immunofluorescenza, la formazione di iniziali clusters in cui si sono identificati eventi neoangiogenetici con formazione di strutture simil-vascolari. Gli epatociti sono sopravissuti durante tutto il periodo di studio; positiva la ricerca, alla immunofluorescenza, per albumina, CK8-18- 19. Le strutture vascolari, identificate dapprima con colorazione EE, si sono dimostrate positive alla immunofluorescenza per il fattore di von Willebrand. I dati sono suggestivi per ulteriori studi nell’ambito dei processi di neoangiogenesi. CONCLUSIONI: Gli approcci preliminari ci hanno permesso di raggiungere e ottenere in vivo risultati promettenti nella ricostituzione di costrutti epatici caratterizzati da processi neoangiogenetici, partendo da semplici layers 2D. I risultati sono suggestivi per sviluppi futuri di ingegnerizzazione di organoidi epatici.

L’ingegneria tissutale è un’emergente disciplina che raccoglie ed integra competenze mediche, biologiche e ingegneristiche. Uno dei suoi scopi è la rigenerazione o la sostituzione dei tessuti biologici danneggiati da patologie o traumi, che viene raggiunto creando dei dispositivi bioingegnerizzati, chirurgicamente impiantabili, integrando cellule, scaffold biocompatibili e fattori bioattivi (quali farmaci, citochine e fattori di crescita) in grado di promuovere la rigenerazione garantendo l’integrazione con i tessuti ospiti circostanti. Questa tecnologia trova grande applicazione in numerosi ambiti clinici come la dermatologia, la chirurgia plastica ricostruttiva, la chirurgia oro-maxillo-facciale e l’ortopedia. La cellula ideale richiesta per l’ingegneria tissutale deve mostrare un buon potenziale autorigenerativo, la capacità di sostituire funzionalmente il tessuto danneggiato e deve essere presente con una disponibilità piuttosto elevata, in quanto potrebbe essere necessario intervenire su difetti molto estesi. Le cellule staminali mesenchimali (MSC, Mesenchymal Stem Cells), oggi coinvolte in molte tecniche di medicina rigenerativa, sono presenti nel midollo osseo e in altri tessuti adulti. Esse sono in grado di differenziare, se stimolate opportunamente, in cellule appartenenti alla linea mesenchimale quali osso, cartilagine, tessuto adiposo e muscoli. Attualmente il midollo osseo è la fonte più comunemente utilizzata per l’isolamento delle MSC (BMSC, Bone Marrow Stromal Cells), ma presenta alcune limitazioni quali la necessità dell’anestesia generale durante il prelievo, la sensazione dolorosa avvertita dal paziente nel post-operatorio e la scarsa resa cellulare. Una fonte alternativa di MSC è stata individuata nel tessuto adiposo sottocutaneo, prelevabile mediante semplici interventi di liposuzione; i vantaggi dell’utilizzo di questo tessuto, normalmente considerato di scarto, sono il prelievo in anestesia locale, e la possibilità di ottenere grandi quantità di tessuto e, di conseguenza, un elevato numero di cellule. Lo scopo del nostro studio è stato quello di valutare l’idoneità del tessuto adiposo umano come fonte di cellule staminali mesenchimali, analizzando dapprima le caratteristiche delle hASC (human Adipose-derived Stem Cells) allo stato indifferenziato e successivamente inducendo il differenziamento delle hASC verso la linea condrogenica, osteogenica ed adipogenica per una futura applicazione clinica. In questo studio in vitro sono state analizzate cellule hASC (human Adipose derived Stem Cells) isolate da tessuto adiposo sottocutaneo prelevato mediante liposuzione da 23 pazienti, di età compresa fra i 20 e i 60 anni (4 uomini e 19 donne, età media: 38 ± 11 anni), opportunamente informati e che hanno sottoscritto il consenso all’utilizzo di tale materiale biologico per sperimentazioni di base. I campioni di tessuto, in quantità variabile fra i 20 e i 250 ml per ciascun donatore, e provenienti da differenti distretti corporei (addome - glutei – coscia - ginocchio), sono stati processati mediante digestione enzimatica con collagenasi di tipo I ottenendo una “Stromal Vascular Fraction” (SVF) dalla quale le hASC sono state separate adesione per aderenza. La resa cellulare, dopo la digestione e prima della semina, è stata di 4,3X105 cellule/ml di tessuto adiposo digerito, con una variabilità piuttosto elevata, ma non correlata all’età del donatore. Dopo circa 10 giorni dall’isolamento le hASC appaiono una popolazione omogenea di tipica forma fibroblastoide, che viene mantenuta oltre il XIV passaggio in coltura. Dopo circa una settimana di “latenza” post isolamento, le hASC, seminate ad una densità di 104 cellule per cm2, hanno cominciato a duplicare rapidamente raggiungendo una confluenza dell’80-90% ogni 2 -3 giorni. La capacità clonogenica delle hASC è stata valutata utilizzando il saggio CFU-F (Fibroblast - Colony Forming Unit) dal quale emerge che il potenziale clonogenico si riduce gradualmente in relazione al periodo di mantenimento in coltura, con una percentuale di precursori clonogenici compresa fra il 10% e il 20% al I o II passaggio, e di circa il 3% al VII e VIII passaggio. Le cellule hASC sono state quindi caratterizzate immunofenotipicamente mediante analisi citofluorimetrica, valutando l’espressione di marcatori specifici delle cellule staminali mesenchimali; oltre il 95% delle hASC esprimono elevati livelli di CD13, CD90 (Thy-1) e CD105/SH2 (Endoglin), circa il 90% sono CD44+, l’80% sono CD29+ e circa il 75% delle hASC esprimono il CD54 (ICAM-1), mentre il CD49d è presente in una percentuale che varia fra l’85% e il 30%. E’ stata inoltre osservata una scarsa espressione di CD14 (1%-9%) e l’assenza di CD45, CD71 e CD106. La valutazione citofluorimetrica ha inoltre permesso di valutare le dimensioni e la granulosità delle varie popolazioni confermandone l’omogeneità. E’ stata anche valutata l’espressione di alcuni marcatori precoci di staminalità all’esordio e ai primi passaggi in coltura: sorprendentemente il CD34 è risultato significativamente espresso in cellule appena isolate (20-60%) come anche il CD271 (p75 NGF receptor, NGFR), anche se in percentuale inferiore (10%-20%); l’espressione di CD34 si riduce poi significativamente in cellule in coltura passando a una positività del 10-30%, mentre CD271 passa a un 5-7% di cellule positive al III passaggio e scompare del tutto dal XIII passaggio. Sulla base di queste osservazioni sono attualmente in corso ulteriori studi caratterizzazione delle sottopopolazioni CD34+ e NGFR+. Il passo successivo è stato quello di determinare la potenzialità differenziativa delle hASC: cellule al IV passaggio allo stato indifferenziato al sono state indotte a differenziare, in presenza di specifici medium, verso la linea adipogenica, condrogenica o osteogenica. Le hASC differenziate verso la linea adipogenica presentano già dopo 7 giorni numerosi vacuoli che risultano ricchi di trigliceridi apolari. Il differenziamento condrogenico è stato indotto con cellule cresciute in 3D in “pellet culture”; dopo 21 giorni di differenziamento le hASC sono state in grado di depositare una matrice simil-cartilaginea ricca di glicosamminoglicani, con aumento significativo di deposizione di circa il 23% rispetto alle cellule mantenute in terreno non induttivo. Cellule hASC differenziate verso la linea osteogenica in due diversi terreni differenziativi, OM1 e OM2, a diversi tempi di coltura (14-21-28 giorni), sono invece state analizzate valutando la deposizione di calcio, l’attività di fosfatasi alcalina (ALP) e l’espressione intracellulare di Osteopontina (OPN), proteina tessuto-specifica. Le hASC coltivate in medium osteogenico, in particolare OM2, differenziano efficientemente rispetto alle hASC non trattate e, infatti già dopo 14 giorni di coltura si osserva un significativo aumento dell’attività fosfatasica e la comparsa di OPN. Inoltre le hASC cresciute in OM2 depositano abbondante calcio extracellulare, che, dopo 21 giorni, risulta di circa 2.5 volte superiore rispetto a quello determinato su cellule non differenziate. Poiché gli scaffold rivestono un ruolo fondamentale in alcune applicazioni di medicina rigenerativa, soprattutto in ambito ortopedico, dove, almeno inizialmente, devono fornire anche un supporto meccanico, abbiamo analizzato il comportamento delle hASC, sia indifferenziate, che già differenziate verso la linea osteogenica, a contatto con alcuni biomateriali utilizzati in campo ortopedico ed odontoiatrico. Le hASC sono state quindi seminate su idrossiapatite, osso bovino deproteinizzato, frammenti di osso umano spongioso di banca, viti di titanio, schiume di poliuretano e fibre di alginato di calcio, per determinare se questi potessero essere dei validi supporti per la crescita e il differenziamento delle hASC. Al microscopio elettronico a scansione (SEM) è stato osservato che le hASC hanno aderito stabilmente a tutti i materiali testati, seppur con qualche differenza dovute alle proprietà di superficie del materiale, e in nessun caso si sono verificati effetti di citotossicità riconducibili ai biomateriali. Le hASC seminate sugli scaffold porosi sono state in grado di produrre livelli di calcio superiori rispetto a quelli prodotti dalle cellule in monostrato, avvalorando l’ipotesi dell’osteoconduttività degli scaffold testati. Infine, non avendo riscontrato differenze in termini di adesione o di potenziale differenziativo tra hASC indifferenziate seminate sugli scaffold e cellule hASC precedentemente differenziate e poi seminate in, si può considerare la possibilità di utilizzare nella pratica clinica in un unico step chirurgico alcuni costrutti hASC-scaffold subito dopo il prelievo e la purificazione. I nostri risultati confermano l’ipotesi che il tessuto adiposo sottocutaneo contiene cellule multipotenti in grado di differenziare verso la linea osteogenica, condrogenica o adipogenica, e che quindi potrebbero essere utilizzate in medicina rigenerativa in alternativa alle cellule mesenchimali isolate da midollo. Il nostro studio proseguirà incentrando le ricerche sull’analisi in vitro delle hASC e dei fenomeni che regolano il differenziamento, e sulle applicazioni delle hASC in vivo in modelli animali, studiando in particolare le modalità di integrazione dei costrutti hASC-scaffold, selezionati in vitro, in particolari lesioni critiche osteocondrali in roditori e ovini.

Engineering applications of ceramic foams Nature offers several examples of cellular materials, such as cork and sponges that man has been using for thousands of years; only recently, he started producing artificial materials mimicking these structures. This approach allowed to extend the range of materials’ physical properties, allowing engineering solutions unfeasible with dense matter. In the last decade, there has been an increasing interest in the development of highly porous ceramic materials. In fact, these materials show the unique capability of conjugating properties of ceramics (high temperature resistance, chemical inertia) to properties typical of their cellular structure (low density, high permeability, thermal shock resistance). The aim of this PhD work is to explore ceramic foams for two different engineering fields: energy conversion systems and biomaterials. A method for the preparation of ceramic foams was developed, involving the preparation of a ceramic powder loaded polyurethane foam. For energy applications, the technique was used to produce porous anode layers for intermediate temperature solid oxide fuel cells. Cermet nickel/yttria-stabilized zirconia foams with hierarchical porosity were prepared following different processing routes and characterized in terms of morphology, porosity and electrical conductivity. In the application for biomaterials, the foaming technique was used for the preparation of bioactive glassceramics shaped accordingly to a patient specific geometry. This involved the segmentation of a three dimensional model of a bone portion, reconstructed from computer axial tomography data. Foam materials in the SiO2-CaO-P2O5 were prepared and characterized in terms of morphology and cristallinity. Bioactivity was assessed in vitro, confirming the formation of a bone-like hydroxylapatite layer on the surface of the material. Both applications showed the great potential of the in situ foaming technique for the preparation of cellular ceramics with tailored porosity.

L’ingegneria dei tessuti molli, quali il miocardio, sta sempre più emergendo come approccio alternativo alle terapie tradizionali. In questo ambito, i poliesteri costituiscono una classe di polimeri promettente, poiché le variegate strutture chimiche che li caratterizzano permettono di soddisfare un’ampia gamma di esigenze. Negli ultimi anni, l’attenzione della ricerca si è incentrata sul poli(butilene succinato)(PBS). Il PBS, tuttavia, possiede proprietà meccaniche non ottimali per l’ingegneria dei tessuti molli; inoltre i tempi di degradazione sono lunghi; ciò è dovuto al grado di cristallinità e all’idrofobicità, entrambi elevati. Nell’ottica di migliorare le proprietà non soddisfacenti di tale omopolimero, sono stati sintetizzati e caratterizzati nuovi copoliesteri alifatici a base di PBS biocompatibili e biodegradabili. In particolare, sono stati realizzati un copolimero a blocchi e uno statistico a base di Pripol 1009, un diacido commerciale (Croda), e un copolimero a blocchi a base di neopentil glicole, valutando sia l’effetto del tipo di comonomero introdotto nel PBS (Pripol 1009 vs. neopentil glicole) che quello dell’architettura molecolare (copolimero statistico vs. copolimero multiblocco). I materiali sintetizzati sono stati processati in forma di film attraverso pressofusione e di scaffold tramite elettrofilatura. Oltre alla caratterizzazione molecolare, film e scaffold sono stati sottoposti anche ad analisi termica, diffrattometrica, meccanica e a studi di degradazione idrolitica in condizioni fisiologiche. I risultati ottenuti hanno evidenziato la possibilità di modulare sia le proprietà meccaniche che la velocità di degradazione in condizioni fisiologiche. Tutti i copolimeri, infatti, presentano caratteristiche di elastomeri termoplastici e dei profili di degradazione variabili rispetto all’omopolimero, che li rendono adatti per applicazioni nel campo dell’ingegneria dei tessuti molli.

Considerando che la prima definizione strutturata di biomateriali è stata formulata solo 50 anni fa, e che 100 anni fa i biomateriali come li conosciamo ora non esistevano nemmeno, possiamo affermare che rappresentano un punto cruciale del progresso scientifico, rivoluzionando la biomedicina. Molti aspetti della medicina clinica, compreso il trattamento di patologie croniche, il delivery di piccole molecole, la produzione di dispositivi medici e l’ingegneria tissutale non sarebbero gli stessi senza i recenti sviluppi di questa classe di materiali. L’ampia gamma di applicazioni per cui possono essere progettati, le caratteristiche uniche e la possibilità di adattare il costrutto finale ad un’ampia varietà di scopi garantiscono un interesse ancora molto elevato attorno al loro sviluppo. La possibilità di implementare nuovi aspetti e tecnologie e ottenere prodotti più complessi rende i biomateriali validi candidati per affrontare delle sfide aperte nel trattamento di molteplici condizioni patologiche ed espandere i confini della medicina moderna. In questa tesi, viene proposta, per molteplici applicazioni, la derivatizzazione chimica e la formulazione di polimeri sia di origine sintetica sia naturale. La combinazione di diverse classi di polimeri e le loro proprietà, oltre allo sfruttamento del concetto di multivalenza, sono alla base di tutti i progetti presentati. Viene descritto lo sviluppo di nanoparticelle polimeriche multimodali, basate su una combinazione di acido poli-γ-glutammico e chitosano, per la visualizzazione delle isole pancreatiche e delle cellule β derivate da cellule staminali pluripotenti indotte. Questo tipo di strumento potrebbe essere cruciale nella trasposizione in clinica di terapie rigenerative per il diabete di tipo 1, basate sull’utilizzo di pancreas bio-artificiali, dal momento che consente l’imaging di specifiche cellule ad alta sensibilità e quindi il monitoraggio della vitalità all’interno di questi tipi di dispositivi. Queste nanoparticelle sono versatili e, decorandole con diversi agenti di targeting e detecting, è possibile sviluppare nanomateriali adatti al monitoraggio della sopravvivenza, attecchimento, proliferazione e funzione di trapianti cellulari e lo sviluppo e validazione dell’applicazione di tecnologie di imaging all’avanguardia che facilitano l’impiego di nuove terapie rigenerative su modelli preclinici con animali di grandi dimensioni e su pazienti. Inoltre, è stata sviluppato uno scaffold polimerico lineare basata su un polimero sintetico coniugato con un analogo del naturale delle cellule β pancreatiche (exendina-4, Ex4), e può portare a nuovi agenti terapeutici o di diagnostica. Infatti, il polimero presenta più siti disponibili per successiva coniugazione di ulteriori oggetti. I prodotti sintetizzati possono essere utilizzati anche come vettori per il rilascio controllato di Ex4. Un altro coniugato polimerico è stato sviluppato e studiato, in concomitanza con una libreria di piccole molecole basate sul mannosio, per il trattamento del batterio Pseudomonas Aeruginosa. In questo caso, il chitosano è stato scelto come componente polimerica, sfruttando la sua tenue attività antibatterica e la possibilità di essere usato come scaffold, combinato con la capacità di interagire con LecB di solfonati e solfossimmine derivati dal mannosio, che sono stati coniugati al polimero. Infine, un idrogelo ibrido composto da acido ialuronico e gelatina è stato sviluppato per la biostampa 3D con cellule U87. L’idrogelo proposto è reticolato chimicamente e ricorda con le sue specificità la matrice extracellulare naturale cerebrale in composizione e caratteristiche. Questo tipo di materiale può servire come modello 3D di glioblastoma e può essere utilizzato per uno screening più affidabile e conveniente di farmaci antitumorali, anche considerando l’elevata malignità, resistenza verso trattamenti antitumorali e alto tasso di ricorrenza del tumore.
Considering that the first structured definition of biomaterials was given only 50 years ago and that 100 years ago biomaterials, as we think about them today, did not even exist, we could claim they have been a crucial point in scientific advances, as they revolutionized many aspects of biomedicine. Thinking about the state-of-the-art of many fields in medicine and biotechnologies, biomaterials are widely employed. Many aspects of clinical medicine, including chronic conditions treatment, drug delivery, medical device manufacturing, and tissue engineering would not be the same without all the recent advances in the development of this class of materials. The wide range of applications they can be designed for, the unique characteristics, and the possibility to tune them and adapt the final construct for an extended variety of cases and purposes ensure a still high hype around their development. Even though much progress has been made, the possibility to implement new aspects and technologies and obtain more smart and complex products makes biomaterials valid candidates to face opening challenges in the treatment of multiple pathological conditions and expand the boundaries of modern medicine. In this thesis, the chemical derivatization and formulation of polymers of both synthetic and natural origin for multiple applications are proposed. The combination of different classes of polymers and so of their properties, and the exploitation of the concept of multivalency, underlie all the presented projects. Hence, we show the development of multimodal polymeric nanoparticles, based on a combination of poly-γ-glutamic acid (γ-PGA) and chitosan, for the imaging of porcine pancreatic islet and induced pluripotent stem cell-derived β-cells. This kind of tool might be crucial in the clinical translation of type 1 diabetes regenerative therapies involving bio-artificial pancreas, since it allows the imaging of specific cell types with high sensitivity and therefore the monitoring of β cells viability inside this kind of device. The proposed nanoparticles are highly versatile, and by decorating different targeting and detecting agents it is possible to develop nanotools suitable for monitoring of survival, engraftment, proliferation, function, and whole-body distribution of the cellular transplants and the development and validation of the application of state-of-the-art imaging technologies facilitating the provision of new regenerative therapies to preclinical large animal models and patients. Furthermore, a linear polymeric scaffold based on a synthetic polymer conjugated to an analogue of natural ligand of pancreatic β-cells (exendin-4, Ex4) has been developed, and can lead to new therapeutics and diagnostics agents. Indeed, the polymer displays more available sites for subsequent conjugation of other entities. The synthesized compounds may function per se as Ex4 controlled release carriers. Another polymeric conjugate, together with a library of mannoside-based small molecules, has been designed and studied for the treatment of Pseudomonas Aeruginosa bacterium. In this case, chitosan has been selected as polymeric component, exploiting its mild antimicrobial activity and its capability to serve as a linear scaffold and combining it with the lectin B targeting capability of mannoside-derived sulfonates and sulfoximines. Lastly, a hybrid hydrogel made of hyaluronic acid and gelatin has been developed for 3D bioprinting with U87 cells. The proposed hydrogel is chemically crosslinked and resembles in its features the natural extracellular matrix (ECM) brain composition and characteristics This kind of material may serve as a model of glioblastoma for 3D cell culture and can be used for more reliable and convenient antitumoral drug screening routes, considering the high malignancy, resistance towards antitumoral treatments and the high recurrence rate.

Il tessuto muscolare scheletrico costituisce circa il 40% della massa corporea ed è di fondamentale importanza per un organismo in quanto è responsabile dei movimenti, della postura e dell’equilibrio, oltre che di importanti funzioni metaboliche. La perdita di questo tessuto può essere causata da una malattia progressiva oppure da un danno accidentale e tuttavia il muscolo scheletrico ha la capacità di rigenerarsi in modo rapido e completo così da prevenire la perdita di massa muscolare. Le cellule satelliti, cellule localizzate tra la membrana plasmatica e la lamina basale di ciascuna fibra, sono considerate le cellule staminali muscolari: in occasione di un qualsiasi processo degenerativo, esse vengono attivate ed iniziano a proliferare. Le cellule figlie migrano per formare catene di cellule satelliti disposte longitudinalmente sotto la lamina basale, qui si fondono tra di loro o con altri miotubi preesistenti per formare nuove fibre muscolari multinucleate. Le cellule satelliti hanno una limitata capacità proliferativa e probabilmente non possono sostenere molteplici cicli di rigenerazione durante fasi ripetute di degenerazione e rigenerazione, ciò è verosimilmente la causa della natura progressiva delle distrofie muscolari. L’ingegneria tissutale del muscolo, ovvero l’utilizzo di un’impalcatura artificiale a supporto di mioblasti/cellule staminali, sta delineandosi da alcuni anni come una strategia terapeutica innovativa per la cura di molte malattie del sistema muscolare scheletrico. Lo scopo dell’ingegneria tissutale è recuperare tessuti ed organi persi, danneggiati o compromessi, partendo da cellule proliferanti in coltura per terminare con strutture cellulari differenziate tessuto-simili. La matrice extracellulare (ECM) gioca un ruolo essenziale nel determinare il comportamento delle cellule durante i processi di rimodellamento tissutale che portano a strutturare tissuti maturi. Quindi, è auspicabile controllare il differenziamento cellulare durante la rigenerazione del tessuto, mimando l’ECM mediante l’uso di materiali ingegnerizzati. La modifica delle proprieta’ biofisiche e meccaniche di questi biomateriali puo’ essere usata come strategia per indurre risposte cellulari specifiche. Inoltre, un biomateriale iniettabile sotto forma di idrogel, avendo queste caratteristiche, ha come vantaggio ulteriore quello di essere facilmente engrafted in vivo al fine di trasportare cellule staminali e/o molecole bioattive per promuovere il rinnovamento tissutale. La nostra ricerca ha avuto come scopo l’utilizzo di un idrogel iniettabile fatto di glicole polietilenico (PEG) coniugato al fibrinogeno, il PEG-fibrinogeno (PF). Questo biomateriale è stato usato come scaffold per la ricostruzione muscolare in vitro ad opera di mesoangioblasti (Mabs), cellule progenitrici mesodermiche associate ai vasi, e di mioblasti (cellule satelliti, SCs) isolati freschi. Inoltre il PF è stato testato come carrier per il delivery dei Mabs in vivo al fine di incrementare il processo rigenerativo di muscoli danneggiati. Gli scaffold di PF usati per le colture in tre-dimensioni in vitro hanno permesso una buona sopravvivenza cellulare ed hanno accelerato il processo differenziativo in muscolo scheletrico, portando alla formazione di miotubi contrattili entro le ventriquattro ore (normalmente, le colture in due dimensioni richiedono tre giorni prima di esibire la formazione di miotubi). Inoltre, utilizzando il biomateriale con un disegno più complesso, cioè contenente al suo interno dei microcanali creati con la microablazione laser, il PF ha permesso l’allineamento delle cellule lungo i canali, quindi il differenziamento e la formazione di fibre muscolari mature ben orientate. In una prima serie di esperimenti in vivo siamo riusciti ad indurre il differenziamento di tessuti simil muscolo da PF e Mabs impiantati sotto la cute in topi immunodeficienti. Il PF ha mostrato di essere in grado di promuovere la crescita ed il differenziamento dei precursori miogenici, proprio come accade in vitro, portando alla formazione di un vero e proprio organoide, senza dare segni di tumorigenicità. Nella seconda serie di esperimenti in vivo, invece, il PF è stato usato come carrier di Mabs in muscoli danneggiati (tibiali anteriori) di topi immunodeficienti. La presenza del PF ha permesso un’aumentata sopravvivenza delle cellule trapiantate, una migliore ritenzione cellulare in situ e un complessivo miglioramento nell’engraftment cellulare, che si è tradotto in una più rapida rigenerazione del tessuto danneggiato. In conclusione, i biomateriali ed in particolare gli idrogel come il PF possono essere facilmente utilizzati per il trasferimento di cellule muscolari scheletriche, mediante una semplice procedura di iniezione one-step, e quindi potrebbero avere un enorme impatto nel trattamento di patologie degenerative a carico dei muscoli scheletrici, come la distrofia muscolare.
Tissue engineering aims to replace lost, damaged or failing tissue and organs, starting with cultured proliferating cells and ending with tissue-like structures. The extracellular matrix (ECM) plays a pivotal role in determining cell behavior during tissue remodelling processes leading to complete differentiated structures. Therefore it is desirable to control cell differentiation during tissue regeneration by mimicking the ECM using engineered biomaterials. To modify the biophysical and mechanical properties of these biomaterials can be used as a strategy to elicit specific cellular responses. Moreover, an injectable hydrogel biomaterial, having such capabilities, should have the advantage to be easily engrafted in vivo in order to carry stem cell and/or bioactive molecules to promote tissue renewal. Our research is thus focused on the use of an injectable hydrogel made from polyethylene glycol (PEG) conjugated to Fibrinogen. The PEG-Fibrinogen (PF) is used as scaffold for in vitro muscle reconstruction, seeded and cultured with mesoangioblasts (vessel associated progenitor cells) and freshly isolated muscle satellite cells (SCs). The PF, which can be controlled in terms of its matrix modulus, is tested in vivo as mesoangioblast carrier for muscle regeneration. The PF scaffold used for in vitro 3-D cultures promoted good survival of miogenic precursors and accelerated skeletal muscle differentiation (contractile myotubes) within 24 hours (normally, 2-D cultures take three days to exhibit myotube formation). The confining geometry of the microchannels created with microablation in the PF scaffolds promoted the development of oriented mature muscle fibers. Sub-cutaneous PF/miogenic precursors implants in Rag2 Chain -/- mice were able to form a “muscle organoid”. Finally, in vivo experiments using PF as a cell carrier showed increased transplanted cell survival, ameliorated in situ cellular retention and an overall improvement in cell engraftment. Injectable hydrogel biomaterials can be readily applied for skeletal muscle cell delivery by a simple one-step injection procedure and could have a noteworthy impact in the treatment of muscular dystrophy.

Nonostante generalmente si preferisca utilizzare i condotti arteriosi, la grande vena safena (SV) rimane indispensabile per il bypass aortocoronarico, specialmente nella malattia coronarica multi-vasale. È stato scoperto che il rimodellamento precoce causato da alterazioni meccaniche a carico della parete del vaso gioca un ruolo chiave nella malattia da trapianto di vena safena. Il meccanismo rimane, tuttavia, sconosciuto. Lo scopo di questo lavoro è quello di dimostrare l'esistenza di un effetto meccanico nel fallimento dell'innesto venoso, dovuto ai cambiamenti nelle condizioni emodinamiche che si verificano a seguito del trapianto in posizione coronarica. I segmenti di vena safena di pazienti sottoposti a bypass coronarico sono stati stimolati all’interno di un bioreattore in grado di mimare le condizioni emodinamiche venose o coronariche. Cellule muscolari lisce e cellule progenitrici avventiziali derivate dalla vena safena umana sono state stimolate meccanicamente in vitro utilizzando lo strumento Flexcell. La differenziazione pro-patologica delle cellule residenti nella vena, derivante dall'esposizione al flusso coronarico, è causata da un fenomeno meccano-percettivo. In particolare, le cellule avventiziali vengono attivate a seguito del rilascio di Trombospondina-1 da parte delle cellule muscolari lisce nelle vene esposte al flusso coronarico, suggerendo così una connessione tra lo stress meccanico sperimentato dalla parete vascolare e il rimodellamento del bypass. Inoltre, un'analisi dell'arricchimento genico dei trascritti differenzialmente modulati dallo stress meccanico, ha rivelato il coinvolgimento di un circuito trascrizionale meccano-sensitivo (HIPPO/YAP/TEAD pathway) nelle cellule stimolate meccanicamente. Questi risultati suggeriscono l'esistenza di un effetto "meccano-paracrino" dovuto al stress di parete negli innesti di vena safena. Sia il reclutamento delle cellule progenitrici avventiziali, sia il loro differenziamento verso il fenotipo fibrotico, sono eventi potenzialmente coinvolti nell’insorgenza della malattia da trapianto di vena safena.
Despite the preferred application of arterial conduits, the greater saphenous vein (SV) remains indispensable for coronary artery bypass grafting (CABG), especially in multi-vessel coronary artery disease. Early remodeling induced by altered wall mechanics has been recognized to play a key role in SV graft disease. The mechanism remains, however, unknown. The aim of this work was to unveil the existence of a mechanical effect in SV graft failure, due to changes in the hemodynamic conditions occurring in SV grafts after transplantation into coronary position. SV segments from patients receiving coronary artery bypass grafts were stimulated in a coronary ‘pulse-duplicator’ bioreactor with either CABG or venous hemodynamic conditions. Human saphenous vein derived-smooth muscle cells (SMCs) and adventitial progenitors (SVPs) were mechanically stretched in vitro using Flexcell Tension System. The pro-pathological differentiation of resident cells in the vein, resulting from exposure to coronary flow, derives from a mechano-perception phenomenon. In particular, adventitial cells are activated by the release of Thrombospondin-1 by stretched smooth muscle cells in the veins exposed to coronary flow, thus suggesting a connection between the mechanical stress experienced by the vascular wall and the remodeling of the bypass. In addition, a gene enrichment analysis of transcripts up/downmodulated by mechanical stress revealed the involvement of a mechanosensing transcriptional circuitry (HIPPO/YAP/TEAD pathway) in cells stimulated with the cyclic strain. These findings suggest the existence of a ‘mechano-paracrine’ effect due to CABG-specific wall strain in SV grafts. This process has consequences for recruitment of adventitial progenitor cells, and a fibrotic-like process possibly involved in pathologic programming of SV graft failure.

This research project focused on study of adult stromal cells derived from equine and canine mesenchymal tissue and the application of these cell sources in musculoskeletal injuries, particularly in tendon repair. Adult MSCs gained general attention in both human and veterinary medicine, however despite the advances in this field, much studies are needed in order to better understand MSCs behavior. With this goal the following research project focused on: - A comprehensive characterization and study in vitro of mesenchymal stromal cells derived from peripheral blood of horses (ePB-MSCs) and from adipose tissue of dog (cA-MSCs). Moreover the possibility to cryopreserve these cells in the long-term period and the delivery methods of both ePB-MSCs and cA-MSCs in the short-term period was verified. - The use of MSCs from peripheral blood and from adipose tissue in the tendon regeneration process was investigated in two different work: the use of adipose tissue derived MSCs in the re-cellularization of a human biocompatible scaffold, and the use of MSCs derived from ovine peripheral blood injected in experimental tendon lesions of the deep digital flexor tendon (DDFT) in a ovine model. The full characterization of both ePB-MSCs and cA-MSCs was achieved using FACS sorting in order to identify the Cluster of Differentiation (CD) expression on the surface of these cells, by the study of population doubling time (PDT), the analysis of telomerase enzyme presence by Real Time PCR, and the alkaline phosphatase positivity. The differentiative potential of both ePB-MSCs and cA-MSCs was assessed by the in vitro induction of these cells into osteo, muscular and adipogenic lineages and verified by expression of tissue specific gene, like PPAR-y, Desmin, and Osteopontin (SPP-1). The same characterization and differentiative potential were then verified on ePB-MSCs and cA-MSCs after 1 year. Results obtained from this study furnished novel information on adult MSCs and confirmed the possibility to cryopreserve these cells in the long-term period for their potential applications in clinical field. The study on delivery of both ePB-MSCs and cA-MSCs in the short-term period, performed by exposing cells to different media, time and temperature, lead to the conclusion that cells could be delivered in PBS at room temperature no longer than 9-12 hrs; cells were also monitored for CD expression, for apoptotic resistance and ß-galactosidase activity during different time intervals. The second challenge of this research project was on study of regeneration capability of adult MSCs derived from peripheral blood and from adipose tissue in tendon pathologies. A first work was performed using MSCs derived from human lipoaspirate in order to recellularize a human tendon scaffold to be used as insert in full-thickness lesions of flexor hand tendons. A previous re-cellularization was successfully obtained using Tris solution and enzymatic digestion, and the absence of native genonic DNA were assessed by standard PCR. Moreover a good protocol for re-cellularization was obtained, using a collagen matrix gel, which helped a good penetration of stromal cells inside the biocompatible scaffold. Secondly a comparation study among the effect of PB-MSCs, platelet rich plasma (PRP) or combination of both on tendon healing was performed using ovine model. Experimental lesions were made using collagenase 1A injection in the left deep digital flexor tendon (DDFT) of 18 Bergamasca sheep, using the right DDFT as internal control (lesioned, not treated). Sheep were further divided in two groups, the first euthanized after 1 month and the second after 4 months, and tendon were then analyzed by histological and immunohistochemical assays. Results obtained after 4 months showed a significant difference between the treated tendon of all group respect to the relative internal control (lesioned, not treated); notably after 4 months the group that received the treatment with MSCs alone or in combination with PRP, showed significant improvement of the healing process respect to PRP treated group, becoming similar to the normal healthy tendons.
Il seguente progetto di ricerca ha avuto l’obiettivo di studiare in modo approfondito le cellule stromali adulte derivate da sangue periferico di cavallo e da tessuto adiposo di cane e successivamente verificare le loro potenzialità applicative nelle patologie muscolo-scheletriche, in modo particolare nella rigenerazione tendinea. Negli ultimi anni le cellule stromali adulte di derivazione mesenchimale hanno sollevato l’attenzione della comunità scientifica sia in medicina umana che veterinaria, per la potenzialità che possono rivestire nel trattamento di patologie che a tutt’oggi non trovano completa risoluzione clinica. Tuttavia nonostante i notevoli progressi fatti in questo campo di ricerca, ulteriori approfondimenti sono necessari per comprendere del tutto i diversi meccanismi delle cellule stromali adulte sia in vivo che in vitro. Questo studio ha avuto la finalità di: - Effettuare una completa ed esaustiva caratterizzazione delle cellule staminali adulte isolate a partire da sangue periferico di cavallo (ePB-MSCs) e da tessuto adiposo di cane (cA-MSCs). È stata poi indagata la possibilità di criopreservare entrambi i tipi di cellule per un anno, ed infine è stato studiato l’effetto di parametri ritenuti importanti nell’influenzare la vitalità cellulare durante la spedizione delle cellule nel breve periodo evitando il congelamento. - Indagare l’uso di cellule stromali isolate da sangue periferico e da tessuto adiposo nella rigenerazione tendinea in due diversi studi: il primo con l’obiettivo di ottenere la ricellularizzazione di uno scaffold tendineo precedentemente decellularizzato, il secondo con l’obiettivo di verificare il contributo alla rigenerazione tendinea in vivo di cellule stromali isolate da sangue periferico di pecora, immesse in lesioni sperimentali indotte con collagenasi 1A. Per l’ottenimento di una completa caratterizzazione di entrambe le ePB-MSCs e le cA-MSC è stato utilizzato il FACS sorting per analizzare l’espressione dei cluster di differenziamento (CD) presenti sulla membrana cellulare di queste cellule, inoltre è stato effettuato lo studio del tempo di duplicazione cellulare (PDT) e la positività alla fosfatasi alcalina. La potenzialità differenziativa delle ePB-MSCs e delle cA-MSCs è stata verificata mediante l’induzione al differenziamento in vitro di queste cellule verso tessuto osseo, muscolare e adiposo, e successiva verifica dell’espressione di specifici geni, quali la PPAR-y la Desmina e l’ostopontina (SPP-1) mediante PCR. Gli stessi esperimenti effettuati per definire la caratterizzazione di entrambe le ePB-MSCs e le cA-MSCs sono stati effettuati dopo un anno di criopreservazione delle stesse, concludendo che le caratteristiche di staminalità non cambiano nelle cellule stromali adulte di entrambe le specie dopo congelamento. É stata effettuata un’indagine sull’effetto che diversi mezzi di coltura, tempo e temperatura hanno sulla sopravvivenza di entrambe le ePB-MSCs e le cA-MSCs durante la spedizione nel breve periodo. Le cellule stromali di entrambe le specie sono state analizzate per l’espressione dei cluster di differenziamento, per la presenza di resistenza all’attività apoptotica e per la positività alla beta- galattosidasi. I risultati ottenuti hanno portato alla conclusione che le cellule stromali adulte possono essere spedite in soluzione salina (PBS) a temperatura ambiente per non più di 9-12 ore. Il secondo obiettivo di questo progetto di ricerca è stato finalizzato all’applicazione delle cellule stromali isolate da sangue periferico e da tessuto adiposo nella rigenerazione tendinea. Il primo lavoro effettuato ha previsto l’utilizzo di MSCs derivate da lipoaspirato umano per la ricellularizzazione di uno scaffold tendineo umano con la finalità di utilizzarlo nelle lesioni totali dei tendini flessori della mano. Lo scaffold biocompatibile è stato in precedenza decellularizzato grazie all’utilizzo di soluzioni detergenti ed enzimatiche. L’assenza di residuale materiale genomico è stata verificata tramite PCR. Questo studio ha permesso di mettere appunto una tecnica di ricellularizzazione efficiente che, avvalendosi dell’ausilio di una matrice gelificante di collagene, ha garantito una buona penetrazione cellulare all’interno della matrice dello scaffold. Il secondo lavoro effettuato sulla rigenerazione tendinea, ha avuto la finalità di paragonare l’effetto di tre diversi trattamenti (cellule stromali derivate da sangue periferico di pecora (sPB-MSCs), sPB-MSCs + platelet rich plasma (PRP), e PRP) sulla rigenerazione tendinea a 1 mese e a 4 mesi dopo lesione sperimentalmente indotta sul tendine flessore profondo delle falangi di pecora (DDFT). Dopo eutanasia delle pecore a 1 e 4 mesi i tendini sono stati analizzati tramite analisi istologica e immunoistochimica; i risultati ottenuti dopo 4 mesi hanno evidenziato una differenza significativa nel grado di riparazione tissutale tra tutti i gruppi di pecore trattate e i loro rispettivi controlli interni (lesionati, non trattati). Inoltre le pecore che hanno ricevuto il trattamento con sPB-MSCs hanno dimostrato avere il migliore processo riparativo tendineo rispetto al gruppo di pecore trattato solo con PRP per tutti i parametri istologici valutati, risultando molto più simili al tendine sano usato come controllo positivo.

Background. Repair of skeletal muscle loss due to trauma, surgical resection or malformations represent a challenge for clinicians. Several attempts to create a bioscaffold to substitute skeletal muscle have been done but no satisfying results were obtained due to lack in regeneration process and functionality of repaired tissue. Some studies on tissue engineering investigated the application of decellularized extracellular matrix (ECM) derived from skeletal muscle observing positive effect towards regeneration. It is becoming relevant the role of tissue-specificity in the field of tissue engineering. This study aims to compare the regenerative effect of both tissue-specific and no tissue-specific scaffolds when applied in a volume of volume muscle loss. Muscle regeneration and macrophagic response are investigated. Material and Methods. Decellularized extracellular scaffold from murine skin, intestine and rhabdomyosarcoma (ARMS) were obtained using a detergent-enzymatic protocol. Scaffolds’ characteristics were investigated. Wild type mice were used as animal model for in vivo implantation on diaphragm and tibialis anterioris muscles. Samples were obtained at sequential timepoints and analysed with Histology, DNA quantification techniques, Immunofluorescence, Real-time PCR. Results. Decellularized ECM scaffold were obtained from each tissue. Moreover, their ECM maintained ultrastructure and composition. Implantation in vivo showed a regeneration of new, centre nucleated myofibers when muscle scaffold was used. No significant regeneration was observed with other scaffolds. With muscle implants, macrophagic response was present and characterized by organized distribution of cells. Conclusions. The decellularization protocol used in this study demonstrated to be effective in maintaining ECM properties even if in absence of cells. Pro-regenerative results obtained only with implantation of muscle-derived scaffolds underline the importance of tissue-specificity in order to obtain the ideal material to repair muscular defects.
Premesse. Il trattamento della perdita di sostanza muscolare dovuta a traumi, resezioni chirurgiche o malformazioni rappresenta ancora una sfida in ambito medico. In passato sono stati creati diversi bioscaffold che potessero sostituire il tessuto muscolare ma i risultati sono stati poco soddisfacenti a causa del mancato stimolo alla rigenerazione tissutale e del mancato recupero funzionale. Alcuni studi hanno hanno esaminato le potenzialità rigenerative di bioscaffold derivati da matrice extracellulare di muscolo scheletrico. In ambito di ingegneria tissutale risulta sempre più importante la specificità tissutale dello scaffold. Questo studio mette a confronto il potenziale rigenerativo di scaffold tessuto-specifici e non in un modello di perdita di sostanza muscolare. In particolare vengono studiati i meccanismi di rigenerazione muscolare e la risposta macrofagica. Materiali e Metodi. Utilizzando un protocollo di decellularizzazione detergente-enzimatico, sono stati ottenuti da modello murino scaffold di matrice extracellulare di cute, intestino, rabdomiosarcoma. Di tali scaffold sono state studiate le caratteristiche intrinseche. Come modello animale è stato utilizzato il topo wild type. Gli scaffold sono stati impiantati chirurgicamente a livello del diaframma e del muscolo tibiale anteriore. I campioni, prelevati a timepoints diversi, sono stati esaminati con istologia, quantificazione del DNA, Immunofluorescenza, Real-Time PCR. Risultati. E' stato possibile ottenere scaffold di matrice extracellulare decellularizzata da ciascun tessuto esaminato. La struttura e la composizione della matrice extracellulare è stata preservata nonostante il trattamento di decellularizzazione. L'applicazione in vivo di scaffold derivati da muscolo ha indotto la rigenerazione di nuove fibre muscolari centro-nucleate. L'applicazione in vivo degli scaffold derivati dagli atri tessuti non ha condotto a rigenerazione tissutale. Una volta applicato lo scaffold derivato dal muscolo la risposta macrofagica è stata significativa e caratterizzata da una distribuzione regolare delle cellule. Conclusioni- Il protocollo di decellularizzazione utilizzato in questo studio è risultato efficace nell'ottenere matrici extracellulari decellularizzate pur preservando le caratteristiche della matrice stessa. Lo stimolo rigenerativo ottenuto solamente mediante impianto di matrice muscolare sottolinea l'importanza della specificità tissutale nell'ottica di ottenere un valido sostituto in caso di danno con perdita di sostanza.