Dissertations / Theses on the topic 'Insuline – Administration'

Le diabète est une maladie chronique qui touche plus de 3 millions de personnes en France. Se traduisant par une perte du contrôle de la glycémie, son traitement actuel par injections pluri-quotidiennes d’insuline entraîne un inconfort des patients. D’autres voies d’administrations ont été développées, comme la voie orale qui constitue la voie d’administration la plus physiologique, la plus confortable et la mieux acceptée par le patient. Néanmoins, des contraintes physico-chimiques peuvent entraîner une perte de l’activité hypoglycémiante de l’insuline. Afin de la protéger et de permettre son administration orale, un vecteur pharmaceutique complexe a été élaboré par double encapsulation : un véhicule apportant une protection gastrique et des nanoparticules apportant une protection intestinale. L’insuline ainsi encapsulée au sein de ces nanoparticules est protégée du milieu intestinal et peut alors franchir la barrière intestinale pour rejoindre la circulation sanguine afin d’être libérée. Ces nanoparticules sont obtenues par coacervation complexe avec le chitosane, polymère naturel bioassimilable. Néanmoins, celui-ci présente une solubilité limitée à pH physiologique rendant difficile sa complexation avec l’insuline. Deux dérivés du chitosane ont été utilisés : un dérivé obtenu par modifications chimiques, le N-,O-carboxyméthyl chitosane (NOCC) et un sel de chitosane, le chitosane chlorhydrate. Une caractérisation approfondie de ces deux dérivés hydrosolubles du chitosane permet d’envisager la complexation de l’insuline à pH physiologique. L’étude de la complexation est réalisée dans le cas de ces deux dérivés. L’obtention de diagrammes de turbidité permet de définir la zone de formation des nanoparticules. Celles-ci présentent une taille moyenne comprise entre 300 et 500 nm, une charge positive (+ 40 mV) et contiennent en moyenne 85 à 90 % d’insuline encapsulée. Des études in vitro ont permis de montrer leur stabilité en milieu intestinal. Leurs propriétés biologiques ont été vérifiées à l’aide de manipulations in vivo sur des rats diabétiques. Ces essais ont montré la conservation de l’activité biologique de l’insuline et la capacité des nanoparticules à induire une diminution de la glycémie pouvant conduire à l’obtention de la normoglycémie, 8 heures après leur administration. Les nanoparticules obtenues à l’aide des deux dérivés hydrosolubles du chitosane protègent l’insuline (conservation de son activité biologique) du milieu intestinal et lui permettent de traverser la barrière intestinale. Ces résultats permettent la validation du concept d’encapsulation d’insuline par coacervation complexe. Les nanoparticules peuvent désormais faire partie intégrante du vecteur pharmaceutique complexe afin d’être administrées par voie orale
Diabetes mellitus is a chronic disease which affects more than 3 millions people in France. Translated by a loss of glycaemia control, its current treated by daily insulin injections entailing discomfort of patients. Other administrations way have been developed and the oral route constitute the most physiological, comfortable and best accepted by patients. Nevertheless, physico-chemical constraints can lead to lose hypoglyceamiant activity of insulin. To avoid it, a pharmaceutical complex vector was developed by double encapsulation: a vehicle bringing a gastric protection and nanoparticles bringing an intestinal protection. By this way, encapsulated insulin in nanoparticles is protected from the intestinal environment and can then cross intestinal barrier to join the blood circulation to be released. These nanoparticles were obtained by complex coacervation with chitosan, a natural and biocompatible polymer. Nevertheless, its low solubility at physiological pH makes its complexation with insulin difficult. Two different water-soluble chitosan derivatives were formed: one obtained by chemical modifications, N-, O-carboxymethyl chitosan (NOCC) and one chitosan salt, chitosan chlorhydrate. A detailed characterization of these two water-soluble derivatives allows insulin complexation at physiological pH. A complexation study made for these two compounds allows the definition of a complexation area where nanoparticles were formed. They had shown average size from 300 to 500 nm, positive charge (+40 mV) and encapsulation efficiency of 85-90 %. In vitro studies allowed to show nanoparticles stability as well as intestinal resistance. Their biological properties were verified by in vivo experiments on diabetic rats, showing the conservation of insulin biological activity and ability to induce glycaemia decrease going to normoglycaemia in 8 hours. Nanoparticles obtained with two water-soluble chitosan derivatives, protect insulin (conservation of biological activity) from the intestinal environment and allow it to cross intestinal barrier. These results permit the validation of insulin encapsulation by complex coacervation concept. Hence nanoparticles can be included in the complex pharmaceutical vector to be administered by oral way

Administration par voie orale.L’insulinothérapie permet aux diabétiques de réguler leur glycémie. La thèse s’inscrit dans le projet ORAIL Bis qui vise à développer un système d’administration orale d’insuline basé sur la double encapsulation de l’insuline. Le vecteur développé est composé d’une gélule contenant des particules (NP) d’insuline formulées à partir de chitosane (CS) par coacervation complexe ou d’acide (lactique-co-glycolique) (PLGA) par double émulsion. Les objectifs de la thèse sont de stabiliser les NP de chitosane par réticulation et lyophilisation, augmenter la biodisponibilité des NP de PLGA par mucoadhésion, les transposer à l’échelle industrielle. Les résultats ont montré que la combinaison des deux approches permet de réduire la taille des NP de CS, de maintenir une charge positive, de leur conférer une stabilité et une bioefficacité. La mucoadhésion n’a pas permis d’augmenter la biodisponibilité des NP de PLGA. Une charge négative permet d’améliorer leur efficacité biologique et sont transposable à échelle industrielle. L’encapsulation de ces NP dans une gélule a permis de valider in vivo le concept de double encapsulation de l’insuline
Insulinotherapy helps diabetics to regulate their glycaemia. This thesis is part of the ORAIL Bis project which aims to develop an oral insulin delivery system based on the double encapsulation of insulin. The developed vector is composed of a capsule containing insulin loaded particles (NPs) formulated with chitosan (CS) by complex coacervation or poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) by double emulsion solvent evaporation. The objectives of the thesis are to stabilize chitosan NPs by crosslinking and freeze-drying, increase the bioavailability of NPs PLGA by mucoadhesion and transpose them to the industrial scale. Results showed that the combination of both strategies reduces the size of CS NPs, maintain a positive charge, give them stability and bioefficacy. Mucoadhesion failed to increase the bioavailability of PLGA NPs. A negative charge allows to improve their biological efficacy and are transposed to industrial scale. The encapsulation of these NPs in an alginate capsule allowed to validate in vivo the concept of double encapsulation of insulin

Le but de ce travail a été de valider in vitro et in vivo une formulation d’insuline administrable par voie orale. Afin de permettre à l’insuline de franchir les barrières chimiques gastrointestinales (pH, enzymes) et physiques (épithélium intestinal), nous avons développé un système de double encapsulation. La première encapsulation permettant le passage de la barrière intestinale est réalisé à partir d’acide poly(lactique-co-glycolique) afin d’obtenir des nanoparticules par la méthode de double émulsion eau/huile/eau. La seconde encapsulation a consisté à intégrer ces nanoparticules dans une gélule gastrorésistante enrobée d’Eudragit® L100-55. Les nanoparticules (NP) synthétisées ont une taille moyenne de 165 ±4nm et un taux d’encapsulation de l’insuline de 95%. La toxicité a été évaluée par un test de viabilité sur une lignée de cellules intestinales, les Caco-2, en utilisant des concentrations de nanoparticules de 0 à 80 mg de PLGA/mL /cm2. Une toxicité apparaît mais à des doses supraphysiologiques. L’absorption des nanoparticules par les Caco-2 a été quantifiée par cytométrie en flux et visualisée par microscopie confocale. Il a été ainsi démontré que l’absorption des nanoparticules se fait selon un mécanisme clathrine-dépendant. Des rats diabétiques (STZ) ont reçu des NP par gavage sans qu’il y ait d’effet sur la glycémie, ce qui atteste que ces NP ne sont pas gastrorésistants, d’où la nécessité de la gélule entérique. Les administrations d’insuline en solution, faites par voie intraduodénale, n’ont aucun effet sur la glycémie, en revanche, l’insuline encapsulée administrée de la même façon induit une normoglycémie au bout de 8h. La biofonctionnalité intestinale des NP a été évaluée en administrant de l’insuline par voie intrapéritonéale et de l’insuline encapsulée par voie intraduodénale à des rats diabétiques et la biodisponibilité après administration par ces mêmes voies de peptide-C. La biofonctionnalité est d’au moins 20% et la biodisponibilité de 6,3%. La lyophilisation et le compactage des nanoparticules ont permis de les inclure dans les gélules entériques et de débuter des tests de glycémie après administration orale. Les procédures de synthèse utilisées permettent d’obtenir des NP absorbables par un épithélium intestinal in vitro et qui sont biofonctionnelles après administration intraduodénale. Cette nouvelle formulation de l’insuline semble être une approche prometteuse pour l’administration d’insuline administrable par voie orale
The purpose of this study was to develop a new formulation of oral insulin. Normally, peptide hormones like insulin are given by parenteral injections routes because they are destroyed by the acid and proteolytic enzymes in stomach and intestine. Our project focuses on insulin double encapsulation for oral administration. The first system of encapsulation of insulin is based on Poly(Lactide-co-Glycolide) Acid (PLGA) nanoparticles. This should allow the uptake and the transport across mucosal intestinal barrier. These nanoparticles are put in a gastroresistant capsule made of Eudragit® L100-55. After synthesis, the size of nanoparticles is 165 ±4 nm and the rate of encapsulation is around 95%. In vitro, the absorption has been quantify by flow cytometry and visualized by confocal microscopy. A clathrin dependant endocytosis pathway mechanism has been demonstrated. In vivo, the biofunctionnality of the nanoparticles was evaluated after subcutaneous injections. After nanoparticles gastric force feeding no effect was seen on the glycemia because nanoparticles are not gastroresistant. We measured the kinetic of the glycemia and the biofunctionnality of NP in streptozotocin-induced diabetic rats after intra-duodenal injections of insulin nanoparticles and intraperitoneal injections of insulin. The bioavaibility was evaluated after quantification of the C-peptidemia after intra-peritoneal injections of C-peptide and after intraduodenal injections of the same quantity of encapsulated C-peptide. Intraduodenal injections of insulin nanoparticles induce a significant decrease of glycemia 8h after injection. In comparison with intra-peritoneal injections, results showed that nanoparticles’ biofunctionnality is at less 20% and the biodisponibility is 6,3%. PLGA insulin-loaded nanoparticles are efficient and the biological effect of insulin is preserved. These polymeric particles allow the absorption of insulin through intestinal mucosa into the bloodstream. Thus this new delivery insulin formulation seems to be an interesting approach

Les traitements du diabète de type 1 vise à normaliser la glycémie grâce à l’insulinothérapie ou des greffes de pancréas et d’îlots pancréatiques. Cependant, des limites importantes persistent : voie d’administration non physiologique pour l’insulinothérapie et utilisation des traitements anti-rejets pour les greffes.En réponse à ces limites, nos travaux se sont concentrés sur la validation d’un dispositif de délivrance physiologique d’insuline et d’un dispositif d’encapsulation de cellules aux propriétés immunio-protectrices.Nous avons démontré l’efficacité du dispositif de délivrance d’insuline, bien accepté après implantation sur plusieurs modèles animaux et permettant une diminution efficace de la glycémie grâce à un premier passage hépatique. Notre dispositif d’encapsulation de cellules, grâce à sa période de pré-vascularisation, permet quant à lui d’assurer la survie et la fonction de cellules sécrétrices d’insuline chez le rat diabétique tout en prévenant une réponse immunitaire du receveur.Ces travaux permettent d’envisager de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement du diabète de type 1
Current treatments for type 1 diabetes aims to normalize glycemia via insulin therapy or pancreas and islet grafts. However, these approaches are limited by non-physiological administration route for insulin therapy and use of immune-suppresive drugs for grafts.To overpass these limitations, our work focused on validation of a physiological insulin delivery device and a cell encapsulation device which is immune protective.We demonstrated efficacy of our insulin delivery device, which was well tolerated in both small and large animal models, allowing efficient correction of glycemia via an hepatic first pass. Our cell encapsulation device, thanks to its pre-vascularization period, ensured survival and sustained function of insulin secreting cells on diabetic rats. In parallel, the device prevented formation by the recepient, of antibodies against encapsulated cells.Taken together, these data allow to consider these two approach as potential new treatments for type one diabetes

L’étude a portée sur le développement de micro- et nanoparticules polymères destinées à l’administration orale d’insuline. Une méthode de polymérisation radicalaire a été optimisée pour formuler des micro et des nanoparticules à base d’un polymère formant des hydrogels, le poly(acide de méthacrylique). Les particules ont ensuite été modifiées par greffage de résidus cystéine pour introduire des fonctions thiol en vue de renforcer les propriétés de bioadhésion et de promoteur d’adsorption des systèmes obtenus. Les particules ont montré des propriétés intéressantes de chargement en insuline et la libération se fait selon un mode de libération pH sensible. En effet, alors que l’insuline est majoritairement retenue dans la forme pharmaceutique à pH acide correspondant à un milieu gastrique, elle est libérée à un pH neutre voire légèrement basique retrouvé au niveau de l’intestin. Les systèmes ont montré une bonne capacité à améliorer le passage de l’épithélium intestinal sur des monocouches de cellules Caco 2 et sur de l’intestin isolé monté en chambres de Ussing. Au final, ces systèmes ont permis d’induire in vivo une réduction de la glycémie chez des animaux diabétiques et après une administration orale. Les essais menés sur des insulines modifiées ont permis d’identifier une stratégie de modification intéressante basée sur l’association de l’hormone à une cyclodextrine. En revanche, nos résultats suggèrent que la PEGylation de l’insuline n’apporte aucun bénéfice
The work carried out in this thesis was aimed to develop polymer micro- and nanoparticles for the oral administration of insulin. A method of radical polymerization was optimized to design micro and nanoparticles with a hydrogel forming polymer, poly(methacrylic acid) (PMAA). The particles were further modified by the grafting of cystein residues in order to introduce thiol functions which are believed to reinforce mucoadhesive and permeation enhancing properties of the formulation. The particles showed interesting loading properties for insulin and the release of the hormone was found to be pH dependent. Although insulin was mainly retained by the hydrogel particle in releasing medium mimicking the gastric environment, the hormone was released in conditions found in the intestine. The formulated systems have shown to improve the absorption of insulin through the intestinal mucosa in in vitro models including Caco 2 cell monolayers and the Ussing chambers. The microparticles selected from the in vitro experiments for in vivo studies have shown a capacity to deliver active insulin through the oral route to diabetic rats producing a reduction of the glycemia. Tests performed with modified insulin have allowed to identify that among the two strategies followed, this consisting on the association of insulin with a cyclodextrin was the most promising while the one based on the formation of an insulin-PEG conjugate did not brought any benefice

Le Stress Oxydant (SO) est bien connu pour être impliqué dans la survenue et le développement des complications du diabète. Il est causé, au moins en partie, par une élévation importante de la glycémie. Chez les sujets diabétiques, lathérapie par l'insuline est vitale et constitue la pierre angulaire de la thérapie. Mais elle ne permet pas d'éviter à long terme l'apparition de complications, résultant du SO induit par les épisodes hyperglycémiques persistants.Chez le sujet sain, des prises en charge nutritionnelles et/ou par l'activité physique ont démontré avec succès leur capacité à diminuer le SO. L'activité physique bien conduite présente de plus l'avantage d'exercer un effet glucorégulateur.L'objectif de ces travaux de thèse était donc de déterminer si l'association de différentes prises en charge pouvait permettre de mieux lutter contre le SO, en agissant par des mécanismes complémentaires, démontrant alors des effetsadditifs. En s'appuyant sur différents protocoles de supplémentation, de traitement à l'insuline et/ou d'entraînement en endurance, nos travaux ont mis en évidence démontré l'intérêt d'un composé alimentaire dérivé du soja, le PFS, dansla prise en charge du SO associé audiabète. Nos travaux ont également mis en évidence que l'insuline et l'entraînement en endurance améliorait le SO induit par l'hyperglycémie, via des mécanismes partiellement différents. Leur association dans la prise en charge du diabète leur permet de potentialiser mutuellement leurs effets respectifs

Actuellement, l'injection sous-cutanée d'insuline est le seul moyen pour les diabétiques de type 1 d'équilibrer leur glycémie. Les travaux de thèse entrent dans le cadre du projet ORAIL qui vise à développer un système de délivrance orale d'insuline basé sur la double encapsulation, et à valider l'efficacité et la sécurité de ce système in vitro dans des modèles d'épithélium intestinal, et in vivo chez le rat. Le vecteur pharmaceutique développé est composé d'une gélule contenant des nanoparticules (NPs) d'insuline formulées à partir d'acide (lactique-co-glycolique) par la méthode de double émulsion eau/huile/eau. Un premier objectif de la thèse a été d'évaluer chez le rat la gastrorésistance et l'entérosolubilité de la gélule sélectionnée pour l'encapsulation des NPs, par tomodensitométrie aux rayons X et par l'étude de la biodisponibilité de l'ibuprofène et de l'acétaminophène. Les résultats de ces travaux ont montré que la gélule est résistante en conditions gastriques et se dégrade au niveau de l'intestin. Un deuxième objectif a été de synthétiser des NPs d'insuline de taille croissante (100 à 800 nm), et d'évaluer l'internalisation de ces NPs et leur sécurité dans des cultures de cellules Caco-2, et dans des co-cultures de cellules Caco-2 et HT29-MTX. Les résultats de ces travaux ont montré que les NPs sont internalisées de manière dose et temps-dépendante, et que la taille de NPs permettant une internalisation optimale est de 400 nm après 4h d'incubation. Des études mécanistiques ont suggéré l'implication de mécanismes cavéoline-dépendants dans l'internalisation des NPs. Aucune toxicité des NPs n'a été observée quels que soient les paramètres étudiés (viabilité et mort cellulaire, augmentation de perméabilité, production de mucus, sécrétion de cytokines pro-inflammatoires). Dans une dernière partie de notre travail, nous avons montré que l'administration intraduodénale de NPs d'insuline de 200 et 400 nm à des rats diabétiques permettait une diminution significative de leur glycémie sans altération morphologique de leur paroi intestinale, données confortant nos résultats in vitro. Notre vecteur basé sur la double encapsulation semble donc être un système prometteur pour l'administration orale d'insuline. Le vecteur complet doit cependant être évalué in vivo chez le rat.

En raison de leur haute spécificité d’interaction, les protéines thérapeutiques sont de plus en plus utilisées et représentent une part majoritaire du marché pharmaceutique. Néanmoins, ces molécules sont fragiles et leur stabilité est une problématique majeure pour l'industrie pharmaceutique. La dégradation des protéines thérapeutiques peut survenir à chaque étape de leur cycle de vie : production, stockage, transport et administration au patient. Les modifications chimiques, l'exposition à des forces de cisaillement (fort débit fluidique), la température, le pH et les interactions avec les matériaux et/ou les interfaces gazeuses sont autant de facteurs qui peuvent nuire à la stabilité de ces protéines. De plus, l'utilisation croissante de dispositifs médicaux automatisés pour la manipulation et l'injection de protéines thérapeutiques augmente drastiquement le risque de dégradation. Dans cette thèse, nous étudions l’effet et le rôle de la triple interface solide/liquide/air sur l'agrégation des protéines. Ce phénomène se produit fréquemment dans les procédés de manipulation d’une solution de protéines thérapeutiques (cavitation, agitation…). Lors d’un mouillage intermittent, les interfaces air/liquide et liquide/solide se confondent en une seule et même interface appelée triple interface ou ligne triple. La ligne triple est une zone favorisant fortement l'agrégation des protéines. Notre étude, basée sur l’insuline, montre que la ligne triple cause une accumulation progressive de protéines qui déclenche, après une période de nucléation, leur agrégation, précisément à l’endroit de cette ligne triple. Nos résultats démontrent aussi que les forces de cisaillement, seules, n’entrainent pas l’agrégation de l’insuline. De plus, nous observons que la diminution de la tension superficielle (induite par l’ajout de polysorbates) d'une solution de protéines réduit le risque de formation d’agrégats. En conclusion de ce travail, nous proposons des recommandations pour la conception des dispositifs médicaux de préparation et d’administration de protéines thérapeutiques
Due to the high specificity of their interactions, proteins are increasingly used in therapy and represent a vast majority of the global pharmaceutical market. Nevertheless, these molecules are fragile and therapeutic protein stability is a major concern in pharmaceutical industry. Protein degradation and aggregation can occur at every step during production, storage, transport and delivery. In this thesis, we interrogate the possible role of intermittent wetting in protein aggregation. Intermittent wetting frequently occurs in protocols involving pumping (cavitation), agitation, and liquid handling. During intermittent wetting, the air/liquid and liquid/solid interfaces meet at a triple line or triple interface, which is a local trigger for protein aggregation because it concentrates the mechanical action of the recessing fluid on the surface adsorbed proteins. We study the effect of surface intermittent wetting on insulin aggregation. Our results demonstrate that the triple interface line, where an air/water interface meets a hydrophobic surface, allows progressive protein accumulation, and finally triggers local insulin aggregation. We also show that shear stress, alone, is not detrimental for protein stability. Additionally, Additives such as polysorbates were tested, showing that the modification of the surface tension of a protein solution impacts its ability to form aggregates. Based on this work, we propose recommendations for the design of drug delivery and preparation devices in order to limit the risk of protein aggregation at the triple interface

Le traitement du diabète de type 1 en boucle fermée représente un enjeu majeur tant sur le plan sociétal que thérapeutique. L’une des solutions consiste en une formulation thérapeutique basée sur des microvéhicules capables de délivrer la bonne dose d’insuline selon une cinétique adaptée aux variations de la glycémie. Les microgels sont des particules de polymère réticulé formant des édifices submicrométriques tridimensionnels gonflés par un solvant, dont le taux de gonflement dépend des conditions environnementales. Leur porosité permet à la fois l’encapsulation d’espèces et leur libération à une vitesse dépendant de leur diffusion à travers le réseau. Nous avons synthétisé des microgels à base de poly(N-alkylacrylamide) fonctionnalisés par des récepteurs du glucose dérivés de l’acide phénylboronique. Ces microgels, à la base thermosensibles, présentent la propriété de changer de volume en fonction de la concentration en glucose et se présentent comme d’excellents candidats pour la délivrance auto-régulée d’insuline dans le cadre du traitement du diabète. Ils permettent la délivrance répétée de doses d’insuline modulée par la glycémie. La quantité d’insuline encapsulée a pu être améliorée en structurant les microgels en architecture cœur-écorce ou capsule.En outre, nous avons utilisé ces microgels pour développer des capteurs au glucose, sélectifs vis-à-vis des autres saccharides et quelques études de cytotoxicité ont été amorcées et ont permis d’établir avec satisfaction que certains de nos objets n’étaient pas toxiques.Les résultats obtenus ont donc permis d’affirmer que la technologie des microgels sensibles au glucose peut répondre de manière conceptuelle aux attentes des patients diabétiques pour permettre la délivrance d’insuline en boucle fermée
Bioresponsive hydrogels can change many of their physical properties in response to the recognition of a target in the solution. In particular, changes in hydrogel swelling lead in turn to controllable changes in shape, volume, pore size, mechanical and optical properties. We focus our research on the development of glucose-responsive microgels which hold promising interest in the field of both sensing and drug delivery. These cross-linked polymer particles, made of highly swollen networks, can swell proportionally to the concentration of glucose in the surrounding medium. Since they are porous, they can entrap a drug and release it a rate dependent on their swelling degree, which is of particular interest in the case of insulin as a drug. Such systems could be used as self-regulated insulin delivery systems for diabetes treatment. With that aim, we have designed microgels able to sense glucose concentrations in the patho-physiological range, under physiological conditions. Insulin was successfully loaded into the nanogels and was shown to be released at a rate dependent on glucose concentration. Furthermore, microgels with a controlled internal structure were synthesized, such as core-shell microgels and capsules. These latter developments led to improvements in terms of insulin encapsulation efficiency and glucose-triggered delivery. Besides, other nanogel formulations were investigated, in order to improve both their biocompatibility as well as the selectivity of their response to glucose compared to other saccharides

Ce travail a pour vocation d’évaluer la potentialité de différents hydrogels sensibles au glucose pour la délivrance d’insuline en vue de développer de nouveaux traitements du diabète. Les systèmes doivent être biocompatibles et pouvoir se résorber in vivo. Pour cela, nous avons choisi d’utiliser un polysaccharide, l’acide hyaluronique (HA), dégradable par voie enzymatique. La réticulation est obtenue par une polymérisation radicalaire de méthacrylates, ou par couplage thiol-ène. La sensibilité au glucose est apportée par l’introduction de fonctions acide phénylboronique (PBA), connues pour former des liaisons ester réversibles avec les diols des saccharides. Deux types de gels sont étudiés : les gels simples où le PBA seul est greffé sur le HA, et des gels doublement réticulés où des motifs maltose sont greffés sur le HA et forment un deuxième réseau, dissociable par ajout de glucose.Dans ce travail, nous avons cherché à démontrer les capacités de cette classe de matériaux à encapsuler et délivrer l’insuline selon les pharmacocinétiques adaptées à l’application. La cinétique étant dépendante de la taille des gels, nous avons travaillé à plusieurs échelles, du macroscopique à l’échelle nanométrique, principalement visée pour une libération dans la circulation sanguine. Des particules de gel sont préparées à des échelles nanométriques et micrométriques grâce à des émulsions eau-dans-huile, obtenues respectivement par homogénéisation à haute pression et par microfluidique. Les gouttes formées servent de micro/nanoréacteurs où se produit la réticulation photoamorcée du HA préalablement modifié. L’échelle micrométrique a été choisie pour étudier plus précisément les interactions de l’insuline ainsi que des protéines modèles avec les matrices, grâce à la microscopie confocale qui permet de sonder la distribution des protéines dans le réseau. Nous avons ainsi étudié les propriétés d’encapsulation et de libération ainsi que les propriétés de gonflement des gels. L’impact de la composition et de la structure des gels est ainsi mis en évidence permettant d’optimiser les choix de formulation pour proposer une solution de libération contrôlée de l’insuline. Enfin l’encapsulation et le relargage d’insuline en présence de sucre est étudiée de manière quantitative pour des macrogels, dont la composition a été optimisée
This work aims to evaluate potential glucose sensitive hydrogels formulations as new medicine to treat diabetes. The gels have to be biocompatible and bioresorbable in vivo. To do so, we choose matrices of polysaccharide enzymatically degradable made of hyaluronic acid (HA). Crosslinking of the HA is done by radical polymerization reactions using methacrylates or thiol-ene chemistry. Glucose sensitivity is introduced thanks to phenylboronic acid moieties (PBA). PBAs are known for their ability to create reversible bonding with diols from saccharides. Two kind of gels are studied: simples ones where PBAs are grafted on the matrix, and doubly crosslinked ones where maltose groups grafted on HA form a second network, which can dissociate upon glucose addition. We investigated the ability of these materials to encapsulate and deliver insulin with the good pharmacokinetics. As kinetics depend on gel sizes, we worked at different scales, from macroscopic to nanometric scale, which allows release in the blood stream. Nano and microgels are prepared thanks to water-in-oil emulsions using respectively high pressure homogeneiser or microfluidic devices. Droplets formed are used as nano/microreactors where crosslinking of modified HA is photoinitiated. Micrometric scale is chosen to study interactions between insulin and model proteins with gel matrices, using confocal microscopy. This technique allows to study composition and structural effects. Encapsulation and release of proteins are studied as well as swelling variations. Then, encapsulation and release of insulin upon addition of monosaccharide is investigated quantitatively for macrogels, after formulation optimization

L'évolution pondérale des diabétiques de type 2 (DT2) est particulière avec une propension à prendre du poids sous insuline, et à l'inverse des difficulés à en perdre lors des programmes de réduction pondérale. Nos résultats montrent qu'après un an de traitement par insuline la prise de poids est faite préférentiellement de masse maigre et suggèrent qu'elle n'augmente pas le risque vasculaire. Nos résultats montrent également qu'au stade précoce de leur maladie, les DT2 peuvent perdre la même quantité de poids que les obèses et que dans les deux cas il n'a pas d'adaptation du métabolisme énergétique corps entier ou mitochondrial pouvant expliquer le plateau pondéral observé à partir du cinquième mois. Il n'y a pas non plus d'adaptation particulière du métabolisme énergétique chez les DT2, leur métabolisme de base n'étant pas différent de celui des obèses à poids stable comme après perte de poids et l'insulinorésistance n'est pas un déterminant du métabolisme énergétique
Weight change in type 2 diabetic patients (T2D) is distinctive with an inclination towards weight gain with insulin, and conversely a difficulty in weight loss in weight reduction programmes. Our results show that after one year of insulin treatment, resultant weight gain is composed primarly of fat-free mass and it appears not to incrase cardivascular risk. Our results also show that in the early stage of their disease, T2D lose the same amount of weight as obese nondiabetic patients and that in both cases there is non whole body or mitochondrial energy metabolism adaptation that can explain the stabilisation of weight observed from the 5th month onwards. Furthermore, there is no specific adaptation of energy metabolism in T2D as their basal metabolism is not any different to that of obese nondiabetic patients or after weight loss. Insulin resistance is not a determinant of energy metabolism

Les nanoparticules constituent une forme médicamenteuse d’avenir dans le domaine pharmaceutique. Capables de véhiculer de nombreux principes actifs, elles peuvent les libérer dans l’organisme après administration in vivo mais aussi les piloter vers des cibles prédéfinies. Ce travail repose sur la préparation, par une technique de double émulsion, de nanoparticules constituées de deux polymères : la poly-e-caprolactone et un polymère polyacrylique et polycationique (Eudragit® RS). La première partie a consisté en la mise au point de nanoparticules encapsulant de l’insuline et capables de la libérer in vitro et in vivo. Ces nanoparticules ont développé une activité hypoglycémiante après administration orale. En effet, l’inconvénient majeur du traitement du diabète par l’insuline reste un mode d’administration contraignant pour le diabétique : la voie injectable. La possibilité d’administrer l’insuline par voie orale constituerait un progrès révolutionnaire dans le domaine de la diabétologie. Les nanoparticules préparées ont donc démontré leur capacité à diminuer le glucose sanguin de rats diabétiques après administration orale. Le mécanisme de passage de l’insuline semble être dû à un contact intime entre le mucus chargé négativement et les nanoparticules de charge opposée créant ainsi un fort gradient local de concentration. La seconde partie du travail a consisté en la mise au point de nanoparticules dites furtives c’est à dire capables d’éviter leur reconnaissance par le système phagocytaire mononucléé après administration intraveineuse. L’objectif était de créer un procédé innovant de furtivité reposant sur la formation d’interactions électrostatiques entre l’héparine, glycosaminoglycane polyanionique, et l’Eudragit® RS, polymère polycationique. Le potentiel de furtivité a été démontré par l’augmentation in vivo de la demi-vie plasmatique de deux principes actifs de natures différentes : le chlorhydrate de propranolol et l’insuline
Nanoparticles are innovative dosage forms in drug delivery. They can act as prolonged release dosage forms but they also have the potentiality to target specific physiological compartments after in vivo administration. This thesis is based on the preparation of nanoparticles according to a double emulsion process. The nanoparticles are formed of two biocompatible polymers: poly-e-caprolactone and a polyacrylic and polycationic polymer (Eudragit® RS). The first part describes the development of insulin-loaded nanoparticles able to release insulin both in vitro and in vivo. It has been demonstrated that such nanoparticles incorporated high amounts of insulin and were able to display a hypoglycemic activity after oral administration. It is well known that the major drawback of diabetes treatment remains the injectable administration route for insulin. The ability to administer insulin orally would be a tremendous progress in the field of diabetes. Our prepared nanoparticles have demonstrated their ability to reduce blood glucose in diabetic rats after oral administration. It is believed that the positively charged insulin-loaded nanoparticles may interact with the negatively charged mucus and create a high local gradient concentration which would favor the intestine permeation. The second part of the thesis was devoted to the development of stealth nanoparticles able to avoid the recognition by the mononuclear phagocytosis system after intravenous administration. The objective was to create a new system based on the formation of electrostatic interactions between heparin, a polyanionic glycosaminoglycane, and Eudragit® RS, polycationic polymer. The stealth potential has been demonstrated by increasing the in vivo plasma half-life of two drugs namely propranolol hydrochloride and insulin

Les formes multiparticulaires injectables présentent l’inconvénient d’une libération initiale prématurée dont les conséquences sont une toxicité systémique si les concentrations sanguines du principe actif deviennent importantes ainsi qu’une modification de la libération. Pour résoudre ce problème, des microparticules composites ont été mises au point : il s’agit de microparticules encapsulant des nanoparticules. Le concept a d’abord été démontré in vitro en encapsulant des nanoparticules de poly(epsilon-caprolactone) dans un polymère non biodégradable en choisissant comme modèles une molécule de faible masse moléculaire (ibuprofène) et un peptide (acétate de triptoréline). L’originalité du travail réside dans le choix des polymères et des solvants retenus pour la fabrication des microparticules. Le solvant utilisé pour fabriquer les microparticules doit être un non-solvant du polymère des nanoparticules. L’acétate d’éthyle répondait à ces conditions puisqu’il ne dissout pas la poly(epsilon-caprolactone) mais que c’est un excellent solvant de l’éthylcellulose ou du polymère polycationique utilisé dans la première partie du travail. Sur la base d’études de libération in vitro, il a ainsi été démontré que les microparticules composites permettaient effectivement de fortement réduire cette libération précoce tout en continuant d’assurer une libération prolongée. Dans un deuxième temps, la réduction de la libération initiale a été confirmée par une étude in vivo chez le rat avec 2 principes actifs modèles : ibuprofène et insuline. Toutefois, le polymère de la matrice des microparticules a été remplacé par un copolymère biodégradable constitué d’acides lactique et glycolique. Il a été démontré que le nouveau concept de microparticules composites permettait de proposer une forme originale limitant la libération initiale des principes actifs suite à leur administration sous-cutanée ou intramusculaire tout en assurant une libération prolongée
Multiparticular injectable dosage forms present a burst effect known to lead to i) a systemic toxicoligal critical issue if blood concentrations of the drug are too high and ii) a change in the release profile due to a lower loading charge in microparticles. In order to solve this problem, composite microparticles have been developed: they consist in nanoparticles encapsulated in microparticles. Such a concept has been demonstrated in vitro by encapsulating poly(epsiloncaprolactone) nanoparticles in a non-biodegradable polymeric matrix with two model drugs: a small molecular weight drug (ibuprofene) and a peptide (triptorelin acetate). The novelty of the research work lies on the adequate choice of polymers and solvents used for microparticles manufacturing. Indeed, the solvent used to manufacture microparticles has to be a non-solvent of the nanoparticles polymer. Ethyl acetate was a good candidate since it does not dissolve poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles but is an excellent solvent for ethylcellulose and the polycationic polymer used in the first part of the work. Based on in vitro release studies, it was demonstrated that composite microparticles allowed the initial release to be strongly reduced together with a prolonged release. In a second part, the burst release reduction has been confirmed in vivo in rats with 2 drug models: ibuprofen and insulin. However, the microparticles polymer matrix was replaced by a biodegradable copolymer made of lactic and glycolic acids. It has been demonstrated that the novel composite microparticles were an innovative dosage form able to control the initial burst release often associated to microparticles after sub-cutaneous or intramuscular administration while still maintaining the prolonged release of the encapsulated drugs. Such a result can be associated with the more difficult diffusion of the drug through the two consecutive polymeric barriers of nanoparticles and microparticles

Les bio-médicaments sont aujourd’hui confrontés à un manque d’adhésion thérapeutique due principalement à leur voie d’administration parentérale. Pour pallier à cela, un système de double encapsulation composé d’une gélule gastro-résistante renfermant un système de nanoparticules (NPs) polymériques à base de PLGA a été développé apportant protection et absorption pour in fine une administration par voie orale. L’objectif de ce travail a été de mettre au point le système de NPs renfermant de l’insuline, en jouant sur la charge de surface afin d’augmenter la biodisponibilité. Ainsi, nous avons montré un meilleur passage intestinal des nanoparticules grâce à l’apport d’une charge de surface négative confirmé par une diminution de la glycémie in vivo. Ensuite les NPs ont été recouvertes d’acide hyaluroniqueafin de réduire la perte intestinale d’insuline. Une fois validé avec l’insuline, le système nanoparticulaire a été transposé à un second bio médicament d’intérêt, l’héparine. Ainsi, nous avons obtenu des paramètres physico-chimiques semblables à ceux obtenus avec l’insuline prouvant le transfert de notre technologie
Biologics are administrated by parenteral route due to their degradation in the gastrointestinal tract. This administration mode leads to lowadherence, showed by the low adherence for chronic diseases treatment. In order to increase adherence by reducing pain and adverse effects associated with treatment we developed a double encapsulation system to protect and increase biologic absorption for a future oral administration. Our system consists in encapsulated biologics inside PLGA nanoparticles (NPs), themselves encapsulated inside a gastroresistant vehicle. The aim of this work was to improve the system efficiency with insulin by NPs charges modification and intestinal release reduction and to transfer the technology to another molecule: the heparin. Negative charges improved the intestinal nanoparticle crossing as shown by the insulinopenic rat model with a decrease of glycaemia. To stabilize the NPs system in intestinal medium, a hyaluronic acid coating was tested and validated in vitro. When transferred to another biologics, we showed similar NPs chacacteristics with heparin than with insulin, revealing the transposition of our technic

Les nanogels sont de bons candidats pour la délivrance d’actifs. Ces réseaux de polymères réticulés et de taille nanométrique, sont gonflés d’eau. Ils sont donc capables d’encapsuler une protéine à l’intérieur de leurs pores et de la libérer en fonction de l’état de gonflement du réseau. Cet état peut être modulé par la densité de réticulation du réseau ou par l’application d’un stimulus externe tel que le pH, la température ou encore une biomolécule telle que le glucose. Ainsi, les nanogels sensibles au glucose se présentent comme des candidats idéaux pour administrer l’insuline de façon asservie à la glycémie. Afin de satisfaire aux critères de biocompatibilité et de biorésorption des vecteurs, nous avons choisi de développer des nanogels à base de polysaccharide, en particulier à base d’acide hyaluronique (HA). Ceux-ci sont obtenus par réticulation du HA, préalablement modifié par des fonctions réticulables telles que les méthacrylates, dans des nanogouttes d'émulsion eau-dans-huile. Des nanogels de taille et de porosité modulables ont été synthétisés grâce à un bon contrôle 1) de la modification chimique des précurseurs par des fonctions réticulables (taux de méthacrylation), 2) de l’émulsion matricielle (taille, stabilité), 3) des conditions de réticulation par photopolymérisation gouvernant le taux de conversion des méthacrylates. Ce savoir-faire a ensuite été appliqué à la synthèse de nanogels modifiés par des dérivés de l’acide phénylboronique, ligand du glucose, afin d’obtenir des matériaux dont le taux de gonflement varie en fonction de la glycémie. L’intérêt applicatif de ces objets a été évalué vis-à-vis des propriétés d’encapsulation de l’insuline, de dégradabilité enzymatique, et de biocompatibilité
Nanogels are an attractive class of delivery systems. These soft particles, made of highly swollen polymer network, can physically entrap a drug and release it at a rate depending on its diffusion though the network. Therefore, any change in the swelling degree can trigger the release kinetics. This parameter can be tuned by modifying the density of cross-links in the gel matrix or by changing the environmental conditions such as pH, temperature or analyte such as glucose. Thus, glucose-responsive nanogels are good candidates to be used as self-regulated systems for insulin delivery. To fulfill both biocompatibility and biodegradability criteria, our attention has been focused on the design of new nanogels made of polysaccharides, in particular made of hyaluronic acid (HA), as a main constituent. HA was at first covalently modified with polymerizable methacrylate functions and confined in nanoreactors during photopolymerization using water-in-oil miniemulsions as template. Biodegradable nanogels with a well-defined size and various cross-linking degrees were thus achieved, thanks to a good control of 1) the chemical modification of HA with methacrylates (degree of methacrylation) 2) the emulsion template (size, stability), 3) the photopolymerization conditions which governed the conversion rate of the polymerization. Further modification of the polysaccharide with phenylboronic acid as a glucose-sensitive group yielded nanogels whose swelling behavior could vary as a function of glucose concentration. These systems were further studied as insulin delivery systems. Moreover, their biodegradability, stability and biocompatibility were assessed

The fall in insulin sensitivity during adolescence is accentuated in insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM) and has been linked to enhanced growth hormone (GH) secretion. The rise in GH release is related to low insulin-like growth factor I (IGF-I) levels and low IGF bioactivity. Abnormalities of the IGF binding proteins (IGFBP's), including low insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) and elevated insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1) concentrations are also observed. The rise in GH concentrations may lead to increased insulin requirements that cannot easily be met by current treatment regimens and can result in deteriorating blood glucose control. GH release also enhances ketogenesis and has been linked to the development of microvascular complications. The impact of a subcutaneous injection of rhIGF-I (40 mug/kg) on GH concentrations, insulin sensitivity and the IGFBP's was studied in adolescents with IDDM (n=17). A control night was compared with a night when rhIGF-I was administered at 18.00h. Blood samples were taken regularly overnight and glucose concentrations controlled by a variable-rate insulin infusion. GH concentrations on the control night correlated with glycated haemoglobin levels. The administration of rhIGF-I led to a sustained increase in IGF-I levels, IGF bioactivity and reductions in GH secretion and the insulin infusion requirements to maintain euglycaemia. The change in GH secretion was due to reduced pulse amplitude rather than pulse frequency. The attributes assessing GH release correlated with free insulin concentations on control and rhIGF-I nights, and the reduction in GH release was related to the fall in insulin levels. The concentrations of IGFBP-3 did not fall after rhIGF-I as they did during the control study, but IGFBP-1 levels were unchanged. In longer term studies (n=6), daily rhIGF-I administration (40 ug/kg) for one month led to a reduced isophane insulin dose and a fall in glycated haemoglobin concentrations. GH levels were reduced and IGFBP-3 concentrations rose in 5 of the 6 subjects studied. The administration of rhIGF-I may have a therapeutic role in IDDM during adolescence by reducing GH concentrations and increasing insulin sensitivity.

Type-1 diabetes and influenza cause significant illness and unnecessary medical costs despite the existence of insulin for maintenance of diabetes and a vaccine for prevention of influenza. This dissertation describes three studies on the development and clinical translation of microneedles to improve the administration of these biopharmaceuticals. The first study reports on a sharp-tipped hollow metal microneedle designed to reduce manufacturing costs, improve insertion into skin, and improve fluid flow compared to other hollow microneedles used for drug delivery. The results showed sharp-tipped metal microneedles could be fabricated using an inexpensive electroplating and sacrificial micromolding process. Single-microneedle devices made by this method achieved high flow rates and delivered model drugs into tissue. The second study reports on insulin delivery using microneedles in children with type-1 diabetes. The results showed microneedle insertion was less painful, which is a promising result for improving injection compliance in children. Additionally, microneedle delivery showed rapid onset of insulin action compared to subcutaneous catheter delivery, which may enable automatic closed-loop insulin therapy. This was the first study of drug delivery to children using microneedles. The last study reports on microneedle patches for self-vaccination against influenza. Human subjects were recruited from greater Atlanta, were asked to self-administer placebo microneedle patches, and were then given a dynamic questionnaire to determine their views and preferences regarding influenza vaccination using microneedles compared to conventional intramuscular injection. The results showed that microneedles were usable by the participants, the introduction of microneedles may improve vaccination coverage by approximately 20%, and self-administration of vaccines may significantly reduce vaccination costs for a healthcare payer. This was the first study to assess the ability of human subjects to self- administer a microneedle patch and the first study to determine the potential impact of self-vaccination against influenza using a microneedle patch on vaccination coverage and vaccination cost. Overall, the fabrication advances and positive findings from human subjects research support additional translation of microneedles for insulin delivery and self-vaccination toward clinical use.

Glucose transporter 4 (GLUT4) in skeletal muscle plays a vital role in the maintenance of glucose homeostasis. Chapter 2 of this thesis develops an immunofluorescence microscopy method to generate novel information in human skeletal muscle on the effect of physiological stimuli on GLUT4 localisation, translocation to the plasma membrane and total protein content. Chapter 3 shows that training-induced increases in total GLUT4 protein content are driven by increases in the number of large and size of smaller intracellular GLUT4 storage clusters in human skeletal muscle. In chapter 4 the method successfully demonstrates GLUT4 translocation 30 min following glucose ingestion and 30 min after the start of moderate intensity cycling exercise in humans. GLUT4 translocation after glucose ingestion is transient and modest in comparison to the exercise response. Chapters 5 and 6 report no changes in GLUT4 translocation following an 80 min hyperinsulinaemic-isoglycaemic clamp in rats and a 2 h hyperglycaemic clamp in humans despite elevated rates of whole body glucose disposal in both experiments. This immunofluorescence method will be a valuable analytical tool in future studies investigating the mechanisms behind changes in muscle glucose uptake in response to obesity, age-related chronic diseases and therapeutic interventions including diet and exercise.

Thesis (Ph. D.)--West Virginia University, 2002.
Title from document title page. Document formatted into pages; contains xii, 118 p. : ill. (some col.). Includes abstract. Includes bibliographical references.

A restrição crônica de sal na dieta tem sido recomendada como medida não medicamentosa do tratamento da hipertensão arterial sistêmica. Entre os efeitos observados desta medida terapêutica tem sido descrita uma redução dos valores da pressão arterial (PA), tanto em indivíduos normotensos e pacientes hipertensos, assim como em animais de laboratório. Outros efeitos observados são alterações do metabolismo de carboidratos e de lípides. Tanto em indivíduos normotensos e pacientes hipertensos, assim como em animais de laboratório foram observadas maiores concentrações de peptídeo C e de insulina, sem alteração da glicemia e com redução da captação periférica de glicose pelos tecidos, caracterizando um estado de resistência à insulina. No metabolismo de lípides, uma outra conseqüência da restrição crônica de sal é a maior concentração plasmática de colesterol total e triacilgliceróis. Apesar da demonstração dos efeitos do sal sobre o metabolismo de carboidratos e lípides em humanos e animais existem dados conflitantes na literatura, com resultados opostos a estes descritos. Para melhor compreensão deste fenômeno, foi desenvolvido um estudo em nosso laboratório, o qual demonstrou que ratos Wistar machos que receberam restrição crônica de sal na dieta apresentaram maiores insulinemias medidas durante um teste de tolerância à glicose e sem a constatação de resistência à insulina em adipócitos isolados avaliada pela EC50 Entretanto, o que não ficou esclarecido neste estudo é se este quadro era restrito ao tecido estudado ou se ocorria no animal como um todo, ou seja, se era um fenômeno generalizado. Tendo em vista estes resultados, um outro estudo foi desenvolvido em nosso laboratório. Analisando o animal intacto, foi verificado que a restrição crônica de sal em ratos Wistar estava associada a uma menor sensibilidade à insulina medida por meio de um clamp euglicêmico hiperinsulinêmico (CLAMP) em animais anestesiados. Também foi observado maior peso corpóreo (PC) e maior massa dos tecidos adiposos. No intuito de se compreender quais eram os mecanismos envolvidos na menor sensibilidade à insulina durante a restrição de sal na dieta, também foi feito o pareamento de peso entre os animais que receberam dietas hipo (HO), normo (NR) ou hipersódica (HR) e mesmo sem diferença entre os PC, os animais sob restrição salina mantiveram-se insulino resistentes. Em uma nova etapa foi feito o bloqueio do sistema renina angiotensina com o uso de captopril (inibidor da enzima conversora de angiotensina) ou losartan (antagonista do receptor ATI de angiotensina II) tendo sido verificado que o captopril melhorou a sensibilidade à insulina, o que não ocorreu com o uso de losartan. Outra conseqüência da restrição crônica de sal na dieta é a maior atividade do sistema nervoso simpático (SNS) e uma menor atividade da via L-arginina (LA) / óxido nítrico (NO). Assim, o objetivo deste estudo foi verificar se o SNS e a via LA/NO são mecanismos envolvidos na menor sensibilidade à insulina durante a restrição crônica de sal. Para o desenvolvimento deste estudo, ratos Wistar machos receberam dieta HO, NR ou HR desde o desmame aos 21 dias de vida até completarem 12 semanas. Ao tornarem-se adultos, os ratos foram submetidos ao implante cirúrgico de cateteres e três a cinco dias após era realizado um CLAMP em ratos acordados. No dia do experimento, após um jejum de seis horas se realizava a coleta de sangue e medidas metabólicas e hemodinâmicas. Neste momento, um grupo de ratos recebeu prazosin e propranolol para o bloqueio do SNS e outro grupo recebeu veículo. Um terceiro grupo de animais recebeu LA e outro grupo recebeu D-arginina (DA). Um quinto grupo de animais que consumiu apenas a dieta HR recebeu diltiazem (bloqueador de canal de cálcio). Quarenta e cinco minutos após a infusão das drogas o CLAMP foi iniciado. Foram medidos PC, glicemias, insulinemias, lípides, nitrato/nitrito (NOx), PA sistólica (PAS), diastólica (PAD) e freqüência cardíaca (FC). O PC foi maior na dieta HO do que na NR e HR. Também foi observado maior PC na dieta NR do que HR. Em situação basal observaram-se maiores valores de glicemia e insulinemia durante a restrição salina em comparação aos ratos em dieta NR e HR. A PAS e PAD foram maiores na dieta HR em comparação aos ratos em dieta NR e HO, enquanto a FC foi maior nos ratos em dieta HO em comparação àqueles sob dietas NR e HR. Também foram observadas maiores concentrações plasmáticas de colesterol total (COL) e triacilgliceróis (TAG) durante a restrição salina. Os animais controle apresentaram menor sensibilidade à insulina em comparação àqueles em dieta NR ou HR. O bloqueio do SNS corrigiu o efeito do sal sobre a captação de glicose, não sendo mais observada diferença entre as dietas. O bloqueio do SNS não influenciou a glicemia mas reduziu a maior insulinemia nos ratos em dieta HO, não sendo mais observada diferença entre as dietas quanto às insulinemias ao início do CLAMP. A infusão de LA melhorou a menor captação periférica de glicose nos ratos em dieta HO, sem influência sobre os animais tratados com dieta NR ou HR. Diltiazen não modificou a sensibilidade à insulina apesar de ter reduzido a PA em intensidade semelhante ao bloqueio do SNS. O bloqueio do SNS reduziu os valores de PAS e PAD nas três dietas, com queda mais intensa dos seus valores nos animais sob sobrecarga salina, logo ao início do CLAMP. Diltiazen reduziu a PAS e PAD. DA não influenciou (p>0,05) os valores de PAS e PAD. Já a infusão de LA promoveu redução dos valores de PAS e PAD somente em ratos em sobrecarga salina e reduziu os maiores valores de FC observados nos ratos durante a restrição de sal na dieta. O bloqueio do SNS e a infusão de LA reduziram os maiores valores de TAG ao término do CLAMP, o que não foi observado nos grupos veículo e DA. Não foi observada modificação da concentração plasmática de COL entre os grupos independentemente dos fármacos ministrados. Durante a restrição salina foi observado menor concentração plasmática de NOx em comparação à sobrecarga salina. A infusão de LA promoveu um incremento na concentração plasmática de NOx ao término do CLAMP nas três dietas, o que não foi observado nos ratos tratados com DA. Ao término do CLAMP não foram observadas diferenças na concentração de NOx plasmático entre as dietas nos animais que receberam LA. A concentração plasmática de NOx nas três dietas foi menor nos ratos que receberam DA. Assim, o bloqueio do SNS e a ativação da via LA/NO melhoraram os efeitos metabólicos decorrentes da restrição crônica de sal.
Chronic dietary salt restriction is recommended as non-pharmacological measure of hypertension treatment. One of the observed effects of this therapeutic measure is the blood pressure (BP) decrease in normotensive subjects and in hypertensive patients, and also in laboratory animals. Another side effects observed are disorders of carbohydrate and lipid metabolism. Salt restriction induced higher C-peptide and insulin levels, without changes on plasma glucose, and lower glucose uptake by the tissues in normotensive subjects and in hypertensive patients, and also in laboratory animals, suggesting an insulin resistant state. Other consequences of salt restriction are higher plasma levels of cholesterol and triacylglycerols. Some studies have disclosed opposite results. With the objective to better understand these phenomena, a study was developed in our laboratory, that showed that male Wistar rats on chronic salt restriction presented higher insulin plasma levels measured during a glucose tolerance test, without insulin resistance in isolated adipocytes measured by the EC50 of the insulin - glucose uptake curve. It was not clear in this study if this phenomenon was restricted to the evaluated tissue or if it was a phenomenon in the whole animal. With these results, another study was developed in our laboratory. Analyzing the whole animal, chronic salt restriction in male Wistar rats was associated with lower insulin sensitivity measured by a euglycemic hyperinsulinemic clamp (CLAMP) in anesthetized rats. Higher body weight (BW) and adipose tissue mass was also observed. With the objective to understand the involved mechanisms in the lower insulin sensitivity due to dietary salt restriction, weight was paired among animals on low (LSD), normal (NSD) or high (HSD) salt diet, and even without BW difference, salt restricted animals were still insulin resistants. In another step, renin angiotensin system blockade with captopril (angiotensin enzyme conversion inhibitor) or losartan (angiotensin II type I receptor antagonist) was performed. It was observed that captopril, but not losartan, improved insulin sensitivity. Another consequence of salt restriction is a higher sympathetic nervous system (SNS) and a lower L-arginine (LA) / nitric oxide (NO) pathway activity. The objective of this study was to verify if SNS and LA / NO are mechanisms involved in the lower insulin sensitivity due to chronic salt restriction. Male Wistar rats received LSD, NSD, or HSD since weaning until adulthood. In the 12th week of age, catheters were inserted and three to five days latter, a CLAMP was performed in awaked rats. On the day of the experiment, after six hours fasting, blood samples were collected and metabolic and hemodynamic measures were done. At this moment, a group of rats received prazosin and propranolol for SNS blockade and another group received vehicle. A third group of animals received LA and a fourth group received D-arginine (DA). Another group of rats only on HSD received diltiazen (calcium channel blocker). Fourty five minutes after drug infusion the CLAMP was started. BW, plasma glucose, insulin, lipids, and nitrate/nitrite (NOx), systolic BP (SBP), diastolic (DBP), and heart rate (HR) were measured. BW was higher on LSD than on NSD and HSD. BW was also higher on NSD than HSD. Basal plasma glucose and insulin were higher during salt restriction than on NSD and HSD. SBP and DBP were higher on HSD than on NSD and LSD, and HR was higher on LSD than on NSD and HSD. Cholesterol (CHOL) and triacylglycerol (TAG) plasma levels were higher on salt restriction. LSD rats presented lower insulin sensitivity compared to animals on NSD or HSD. SNS blockade corrected effect of salt on glucose uptake. SNS blockade had no influence on glucose levels but reduced the higher plasma insulin in LSD rats, without differences in insulin levels between diets at the start of the CLAMP. LA improved the lower glucose uptake observed in LSD rats, with no influence on the rats on NSD or HSD. Diltiazen had no effect on insulin sensitivity. SNS blockade reduced SBP and DBP in rats on the three diets, with an intense BP fall on HSD rats at the start of the CLAMP. Diltiazen reduced SBP and DBP. DA had no influence in SBP and DBP. On the other hand, LA decreased SBP and DBP only in salt overloaded rats and reduced the higher HR observed on salt restricted rats. SNS blockade and LA infusion reduced the higher TAG concentration at the end of the CLAMP, which was not observed in vehicle and DA groups. COL level was not influenced by drug infusion. During salt restriction, lower plasma NOx was observed compared to salt overload. LA infusion promoted plasma NOx increment at the end of the CLAMP. At the end of the CLAMP, no difference was observed in plasma NOx among the rats on the three salt diets and infused with LA. Plasma NOx was lower in rats in the DA group. In conclusion, SNS blockade and LA/NO pathway activation improved the metabolic effects due to chronic dietary salt restriction.

Orientador: Marlus Chorilli
Resumo: O diabetes mellitus (DM) é uma síndrome metabólica caracterizada por deficiência na produção/secreção pancreática de insulina e/ou resistência à ação do hormônio nos tecidos alvo, resultando em hiperglicemia. Diversas pesquisas têm desencadeado o desenvolvimento de novos sistemas de administração de insulina que possibilitem a utilização de vias alternativas à parenteral, com destaque à administração de insulina por via nasal. Esta via tem-se mostrado promissora, pois pode promover uma rápida absorção do fármaco e aumentar a sua biodisponibilidade. Entretanto, existem mecanismos de depuração mucociliar que limitam a administração de fármacos, além da baixa permeabilidade do epitélio nasal, o qual dificulta a absorção de fármacos com alto massa molar. Uma estratégia para vencer tais barreiras é a utilização de sistemas nanoestruturados (lipossomas), pois são amplamente utilizados para o aperfeiçoamento da potencialização da ação terapêutica de fármacos. Além disso estes lipossomas foram funcionalizados com peptídeos de transdução de membrana (CPPs), tais como os peptídeos TAT e Penetratin (PNT), que atuam como promotores da penetração e absorção do fármaco, com posterior dispersão em hidrogel de hidroxietilcelulose. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar lipossomas contendo solução de insulina, funcionalizados com CPPs (TAT e PNT) e dispersos em hidrogel, avaliar o potencial pela via nasal, in vivo, para a melhora dos níveis séricos e efeito hipoglicemiante d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo)
Doutor

Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-09-12T14:40:58Z No. of bitstreams: 2 Gabrielle_Custódio2018.pdf: 1773314 bytes, checksum: 2eea15a0ee541c0d86fb3e257f910aeb (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5)
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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Estado do Paraná (FA)
The oral administration of insulin stands out as the most convenient, simple and compatible way for patients, since it provides comfort and it can control the glucose homeostasis. This study produced and evaluated a polymer-lipid nanotransporter for the oral delivery of insulin by double emulsion and solvent emulsification/evaporation using ethyl palmitate and hyaluronic acid (HA) of 13 and 55 kDa. The nanoparticles showed an average diameter of 300 nm, negative surface charge, encapsulation efficiency of 35% and they were thermally stable when analyzed by differential scanning calorimetry. The in vitro release with simulated gastrointestinal fluids demonstrated the protection ability to encapsulated insulin. The nanoparticles have shown to be safe at potential therapeutic concentrations, since they did not cause cytotoxicity to intestinal epithelial cells. Finally, the permeability of nanoencapsulated insulin through Caco-2 monolayers and Caco-2/HT29-MTX model correlated with the slow release rates and did not show differences between them. These results indicated that the molar weight of HA did not show differences in both the characterization and the therapeutic response of the prepared nanoparticles, which could be considered as a good carrier for the oral administration of insulin.
A administração oral da insulina destaca-se como o modo mais conveniente, simples e compatível com o paciente, pois proporciona conforto e é capaz de controlar a homeostase glicídica. Neste estudo foi produzido e avaliado um nanotransportador lipídico polimérico para a entrega oral da insulina por meio de dupla emulsão e emulsificação/evaporação do solvente utilizando etilpalmitato e ácido hialurônico (HA) de 13 e 55 kDa. As nanopartículas apresentaram diâmetro médio em torno de 300nm, carga superficial negativa, eficiência de encapsulação de 35% e apresentaram-se estáveis termicamente quando analisadas pela calorimetria diferencial de varredura. A liberação in vitro com fluidos gastrointestinais simulados demonstrou a capacidade de proteção à insulina encapsulada. As nanopartículas mostraram-se seguras em potenciais concentrações terapêuticas, uma vez que não originaram citotoxicidade para as células epiteliais intestinais. Por último, a permeabilidade da insulina nanoencapsulada através de monocamadas Caco-2 e modelo Caco-2:HT29-MTX correlacionaram-se com as taxas de liberação lenta e não apresentam diferenças entre si. Esses resultados indicaram que o peso molar do HA não apresentou diferenças tanto na caracterização quanto na resposta terapêutica das nanopartículas preparadas, podendo estas serem consideradas como um bom transportador para administração oral de insulina.

Encapsulation d'adn dans des liposomes contenant du lactosylceramide dont le sucre terminal est reconnu specifiquement par des recepteurs presents sur la membrane plasmique des cellules visees, c. A. D. , les hepatocytes et les cellules endotheliales du foie et egalement les lymphocytes de la rate. Injection par voie intraveineuse des liposomes. Role de l'endocytose, dans leur internalisation. Modele genetique constitue du gene de la preproinsuline i de rat insere dans des vecteurs retroviraux permettant l'expression du gene dans des celules non insulogenes

Microneedles have been developed as a minimally invasive alternative to painful hypodermic needles to deliver modern biotherapeutics. Previously, several in-vitro and in-vivo animal studies have been conducted to show that microneedles increase skin permeability to a wide range of molecules that cannot cross the skin using conventional transdermal patches due to the skin's stratum corneum barrier. However, only a limited number of studies have been performed to study microneedle-based drug delivery in human subjects. Therefore, the objective of this study was to perform the first-in-humans microneedle studies to: a) characterize skin repair responses to solid microneedle insertion to determine the extent of increased skin permeability coupled with predictions of pharmacokinetics of drug delivered through premeabilized skin, b) determine the effect of hollow microneedle-based infusion parameters on flow conductivity of skin and pain and thereby identify barriers to fluid flow into the skin from hollow microneedles, c) assess the safety and efficacy of systemic therapeutic effects through measurement of pharmacokinetic parameters, pain and irritation for microneedle-based insulin delivery in type 1 diabetes subjects, and d) assess the safety and efficacy of local therapeutic effects though delivery of lidocaine to the skin. Results showed for the first time that solid microneedle-treated skin reseals rapidly (< 2 h) in the absence of occlusion whereas occluded skin reseals slowly (3-40 h) depending on microneedle geometry as determined by skin impedance measurements. Increased microneedle length, number, and cross-sectional area led to slower recovery kinetics in the presence of occlusion. This thesis also demonstrated that the flow conductivity of skin decreased as fluid was infused to the dermis through hollow microneedles due to the dense structure of the dermis. Microneedle retraction, low flow rates, and the addition of hyaluronidase helped increase flow conductivity. Microneedles were able to deliver 800 µl of saline to the dermis without causing significant pain. Further, microneedle-based insulin delivery in type 1 diabetes subjects revealed that microneedles provided faster pharmacokinetics and improved glycaemic control than conventional subcutaneous catheters. Lastly, microneedle-based lidocaine injection demonstrated that microneedles were less painful, as effective, and more preferred than hypodermic needles in anesthetizing clinically relevant areas.

Ces deux volumes représentent la finalisation des résultats obtenus après 4 campagnes de terrain et permettent de replacer l'histoire qu'on savait pluri-millénaire de l'Ile des Pins dans une perspective diachronique fondée sur 3 axes principaux : le peuplement, les dynamiques internes -autrement dit l'évolution démographique, les bouleversements sociaux, les modifications de l'environnement liées à l'activité humaine,etc- et enfin les relations externes à savoir les réseaux d'influence, d'échange de matériaux, de savoir-faire et les contacts avec des populations nouvelles. Dans le premier tome, l'accent est mis sur le cadre de l'étude, survolant l'environnement naturel, le fonctionnement sociétal actuel, les connaissances archéologiques antérieures, les problématiques liées à la recherche monographique en Océanie. Sont ensuite présentées les pistes de recherches et les choix méthodologiques avant un bilan des données de prospection et de fouille acquise sur le terrain. Ensuite est présentée une synthèse sous la forme d'un parcours chronologique. Le second tome rassemble les annexes.

Abstract Polycystic ovary syndrome (PCOS) is the most common endocrine disorder in women of reproductive age. The main features of the syndrome include menstrual irregularities and hyperandrogenism. In addition to symptoms related to fertility, some women also suffer from an unfavourable metabolic profile including impaired glucose tolerance, dyslipidaemia and low-grade chronic inflammation. In the present studies we aimed to investigate the role of age on adrenal and ovarian androgen secretion in 79 women with PCOS and 98 healthy women, with special focus on the menopause. Furthermore, we studied the effects of combined hormonal contraceptives (CHCs) administered orally, transdermally and vaginally (n=42, healthy women, 9 weeks) and atorvastatin treatment (n=28, women with PCOS, 6 months) on androgen levels and metabolic factors. Androgen secretion capacity was analysed by using adrenal and ovarian stimulation tests and glucose tolerance by using oral and intravenous glucose tolerance tests. Furthermore, chronic inflammation was assessed via assay of C-reactive protein and pentraxin-3. Basal and stimulated adrenal and ovarian androgen production was elevated and levels remained higher in women with PCOS compared with healthy women even after the menopause. Furthermore, women with PCOS presented with enhanced insulin resistance and chronic inflammation, which persisted beyond menopausal transition. During CHC treatment, the route of administration was insignificant, and all treatments impaired insulin sensitivity and increased chronic inflammation. In women with PCOS, treatment with atorvastatin improved chronic inflammation and the lipid profile as expected, but worsened glucose tolerance and did not affect testosterone levels. Regardless of strict exclusion criteria, where only relatively healthy women with PCOS were recruited, the results showed that enhanced androgen secretion and unfavourable metabolic alterations associated with PCOS persist through menopausal transition. The findings emphasize the importance of monitoring glucose metabolism during the use of CHCs, especially in women with known risks of type 2 diabetes. Atorvastatin treatment exacerbates insulin resistance in women with PCOS and therefore the treatment should only be considered after individual risk assessment of cardiovascular disease and not just because of PCOS
Tiivistelmä Monirakkulainen munasarjaoireyhtymä (PCOS) on hedelmällisessä iässä olevien naisten yleisin hormonaalinen ongelma. Tyypillisiä PCOS:n oireita ovat munarakkuloiden epäsäännöllisestä kypsymisestä johtuvat kuukautiskierron häiriöt ja miessukuhormonien eli androgeenien liikatuotanto. Hedelmällisyyttä heikentävien oireiden lisäksi PCOS:än liittyy aineenvaihdunnan ongelmia, kuten heikentynyttä sokerinsietoa sekä taipumus rasva-aineenvaihdunnan häiriöihin ja krooniseen tulehdukseen. Tutkimuksessa selvitettiin ikääntymisen ja vaihdevuosien vaikutuksia lisämunuais- ja munasarjaperäiseen androgeenieritykseen 79 PCOS-naisella ja 98 terveellä naisella. Lisäksi tutkittiin eri yhdistelmäehkäisyvalmisteiden antoreittien (suu, iho, emätin) (n=42, terveet naiset, 9 viikkoa) ja atorvastatiinihoidon (n=28, PCOS-naiset, 6 kuukautta) vaikutuksia androgeenitasoihin ja aineenvaihdunnallisiin muuttujiin. Androgeenieritystä tutkittiin lisämunuaisten ja munasarjojen stimulaatiotesteillä ja sokeriaineenvaihdunnan muutoksia suun kautta ja suonensisäisesti tehtävillä sokerirasituskokeilla. Tulehduksellista tilaa mitattiin määrittämällä C-reaktiivisen proteiinin ja pentraksiini-3:n pitoisuuksia. Lisämunuaisten ja munasarjojen androgeenieritys oli PCOS-naisilla lisääntynyt terveisiin naisiin verrattuna, ja ero säilyi vaihdevuosi-iän jälkeen. PCOS-naisilla esiintyi myös enemmän heikentynyttä sokerinsietoa ja kroonista tulehdusta vielä vaihdevuosi-iän jälkeenkin. Hormonaalinen yhdistelmäehkäisy heikensi insuliiniherkkyyttä sekä pahensi pitkäaikaista tulehdusta annostelureitistä riippumatta. Atorvastatiinihoito puolestaan paransi pitkäaikaista tulehdusta sekä rasva-aineenvaihduntaa PCOS-naisilla, mutta huononsi sokerinsietoa ja insuliiniherkkyyttä eikä sillä ollut vaikutusta testosteronitasoihin. Koska poissulkukriteerit olivat tiukat, tutkimuksiin valikoitui varsin terveitä PCOS-naisia. Siitä huolimatta osoittautui, että PCOS:än liittyvä lisääntynyt androgeenituotanto sekä epäedulliset aineenvaihdunnan muutokset jatkuvat vielä vaihdevuosi-iän jälkeen. Hormonaalisen yhdistelmäehkäisyn käytön aikana olisi hyvä seurata sokeriaineenvaihdunnan muutoksia erityisesti niillä naisilla, joilla on kohonnut riski sairastua aikuistyypin diabetekseen. Atorvastatiinihoito huonontaa PCOS-naisilla insuliiniherkkyyttä, minkä vuoksi hoito tulisi aloittaa vain yksilöllisen riskiarvion perusteella