Academic literature on the topic 'Interaction avec l'ARN'

Les ARNs non codants sont des régulateurs de l'expression génétique à plusieurs niveaux. Chez la bactérie et chez la souris, des ARNs non codants (6S et B2) ont la propriété de se lier à l'ARN polymérase et d'inhiber son activité. Afin de déterminer si l'ARN polymérase II (RNAPII) humaine était associée à des ARNs non codants, une immunoprécipitation anti-RNAPII a été réalisée sur des cellules HeLa mitotiques. Les ARNs co-immunoprécipités ont été purifiés et marqués et l'ARN U1 s'est trouvé particulièrement enrichi par rapport au contrôle. Cette co-immunoprécipitation reflète l'association de la snRNP U1 avec la RNAPII. Pour vérifier cette association sur un site de transcription actif, des lignées ont été établies avec l'insertion en multiples copies d'un gène à un site unique, créant ainsi un unique super site de transcription visualisable par FISH (Fluorescence In Situ Hybridization). Deux lignées distinctes ont été créées, l'une avec un gène comportant un intron, l'autre avec le même gène où l'intron comporte trois mutations ponctuelles abolissant l'épissage. Alors que les snARNs U2, U4, U5 et U6 sont absents du site non épissé, l'ARN U1 est enrichi de la même façon indépendamment de l'épissage. La présence des protéines spécifiques de la snRNP U1 indique que la snRNP U1 est recrutée au complet au site de transcription. Ces résultats laissent supposer un rôle pour l'association RNAPII - U1snRNP dans l'épissage cotranscriptionnel.

Les protéines hnRNP A1/UP1 sont en mesure d'interagir directement avec des séquences télomériques humaines. L'expression de l'une ou l'autre de ces protéines dans les cellules de mammifères provoque un allongement des télomères chez celles-ci. De plus, la forme recombinante de la protéine UP1 est en mesure de recruter l'activité télomérasique à partir d'un lysat cellulaire in vitro. Afin d'établir les bases moléculaires qui régissent les interactions entre les séquences télomériques, ces protéines et l'ARN de la télomérase, nous avons étudié les interactions de chacun des domaines de liaison à l'ARN pour leur habileté à interagir avec les acides nucléiques. Nous avons pu établir que les deux domaines sont impliqués dans la liaison à des acides nucléiques distincts. Le premier RRM est nécessaire pour interagir de façon spécifique avec les répétitions d'ADN télomériques alors que le second RRM est nécessaire pour permettre une liaison spécifique à l'ARN de la télomérase. Nos études de liaison en gel de retardement ont de plus permis de montrer que les protéines A1 et UP1 sont en mesure d'interagir avec l'ARN de la télomérase. Nous avons également pu établir, par des essais de protection, que la présence de la protéine UP1 entière est essentielle pour permettre une protection efficace contre l'action de la DNase I. Nos études de chromatographie suggèrent que les protéines A1 et UP1 peuvent interagir simultanément avec les répétitions d'ADN télomériques et l'ARN de la télomérase in vitro. Nous avons également montré que cette interaction pouvait résister à une incubation dans un extrait nucléaire complexe. Ces résultats suggèrent que l'interaction ARN de la télomérase-A1-ADN télomérique est possible dans un contexte cellulaire normal. Nos résultats supportent un modèle dans lequel la protéine A1 recruterait la télomérase aux extrémités des chromosomes de vertébrés.

Il est admis, tant dans les pays a haut niveau socio-economique, que dans les pays en voie de developpement, que le rotavirus est responsable d'un pourcentage important de diarrees neonatales aussi bien chez l'homme que chez l'animal. Au cours des dernieres annees, l'etude moleculaire des proteines nonstructurales du rotavirus a ete considerablement entravee par les difficultes a obtenir des reactifs mono-specifiques. Pour la production de tels reactifs, nous avons exprime dans le systeme baculovirus les proteines nonstructurales, nsp2 et nsp3, et produit des lignees cellulaires hybrides (hybridomes) secretant des anticorps monoclonaux contre ces deux proteines. La proteine nsp2 recombinante a ete purifiee par colonne echangeuse d'ions et par colonne d'affinite. L'etude de la proteine nsp2 recombinante et de la proteine produite dans des cellules ma104 infectees par le rotavirus a permis de determiner l'existence des formes oligomeriques de cette proteine. Nous avons suggere la presence des ponts disulfures intra-chaine dans cette proteine. Les proprietes de fixation des arn viraux de la proteine nsp2 ont egalement ete testees par pontage aux uv in vivo (dans des cellules ma104 infectees par le rotavirus et dans des cellules sf9 infectees le recombinant bacnsp2). Dans des cellules infectees par le rotavirus, nsp2 est etroitement liee aux 11 segments d'arn double brin. Nous avons aussi immunoprecipite un complex viral ayant une activite replicase. Ce complex est constitue des proteines structurales vp1, vp2 et vp6, et de la proteine nonstructurale nsp2

La transcription est une reaction hautement regulee orchestree autour de l'arn polymerase qui agit au travers de nombreux contacts avec differents partenaires (facteurs de regulation, l'adn, l'arn synthetise, des topoisomertases,. . . . ). Une etude structurale permettant de positionner ces differents contacts sur l'arn polymerase est un element important pour comprendre les mecanismes de la transcription et sa regulation. Les methodes de radiocristallographie ou par rmn permettant d'atteindre le resolution atomique ne sont pas a l'heure actuelle envisageable pour ces enzymes de grande taille. Seule la microscopie electronique permet de calculer des enveloppes tridimensionnelles a une resolution plus modeste qui ne permet pas de localiser directement ces sites. La microscopie electronique offre une alternative interessante qui est l'identification de domaines fonctionnels au niveau de l'enveloppe tridimensionnelle a l'aide de sondes structurales. L'interet de la localisation spatiale de domaines fonctionnels est qu'elle permet de definir des contraintes geometriques qui permettent de tester un certain nombre de modeles proposes. Cette these illustre une telle approche. L'enzyme etudiee est l'arn polymerase i de levure pour laquelle une enveloppe tridimensionnelle de l'enzyme a ete calculee a 3 nm de resolution. Deux types de sondes ont ete utilises pour determiner l'architecture quaternaire de l'enzyme et elucider l'interaction de l'enzyme avec l'adn. L'arrangement spatiale de sept des quatorze sous-unites la composant a ete etudie par l'observation d'immun-complexes formes entre l'enzyme et des anticorps diriges specifiquement contre les sous-unites. La localisation des epitopes permet par extrapolation de definir l'arrangement spatial des differentes sous-unites entre elles. La localisation des sites d'interaction de l'adn et l'arn quant a eux ont ete etudie par l'observation de complexes d'elongation stables arretes par l'omission d'un nucleotide.

Mes travaux de recherche sont centrés sur la compréhension des relations structure-fonctions de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1. Le travail réalisé au cours de ma Thèse de Doctorat dans le groupe de B. et C. Ehresmann (UPR 9002 du CNRS) à l'ULP, a porté sur l'étude de la dimérisation de l'ARN génomique du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) 1. Une propriété ubiquitaire des rétrovirus est l'encapsidation de deux molécules d'ARN génomique associées près de leur extrémité 5'. Cette caractéristique, qui traduit l'existence d'une forte pression de sélection, représente un avantage évident pour la recombinaison pendant la rétrotranscription. Elle permet en particulier au virus de se répliquer malgré la présence de lésions dans l'ARN génomique et favorise la variabilité génétique. Nos travaux nous ont permis d'aboutir à plusieurs résultats importants : (1) la dimérisation implique une séquence localisée en amont du site donneur d'épissage 2. Elle est initiée par un mécanisme de reconnaissance de type boucle-boucle entre les deux monomères, au niveau d'une structure en épingle à cheveux très conservée dans les différents isolats du VIH-1, que nous avons appelée DIS (Dimerization Initiation Site) 3; 4. Cette tige-boucle est également appelée SL1. La boucle du DIS possède 9 nucléotides, dont 6 forment une séquence auto-complémentaire. Nous avons montré que l'étape initiale de la dimérisation est réalisée par des appariements Watson-Crick entre les séquences autocomplémetaires de chacun des deux monomères 5; 6; 7. Cependant, ces appariements ne sont pas les seules interactions stabilisant le dimère. Un modèle tridimensionnel du complexe boucle-boucle du DIS obtenu sur la base de résultats de cartographie en solution montre l'existence d'interactions non-canoniques formées par les purines flanquant la séquence autocomplémentaire 8; 9. (2) Le DIS joue un rôle essentiel dans la réplication du virus au niveau de l'encapsidation de l'ARN génomique et de la synthèse de l'ADN proviral double brin 10. (3) Il est possible d'inhiber la dimérisation in vitro par des oligonucléotides sens et antisens 11; 12.<br />En 1997-1998, j'ai effectué un stage post-doctoral dans le laboratoire du Dr. Heinrich Gottlinger (DFCI, Harvard Medical School, Boston, MA, USA). Mon travail était de comprendre le mécanisme de régulation qui permettrait aux précurseurs protéiques viraux de se fixer à la membrane plasmique, lieu d'assemblage des virions. J'ai ainsi confirmé l'existence d'un switch conformationnel de l'acide myristique localisé en N-terminal de la protéine de Matrice du VIH 13.<br />Depuis mon retour à Strasbourg en 1999 dans l'équipe du Dr. Roland Marquet, je me suis intéressé de nouveau au monde de l'ARN et plus précisément au repliement de l'ARN génomique du VIH-1. Ainsi, après avoir mis en évidence un motif de structure tertiaire dans la région 5'-terminale de cet ARN 14, nous avons, en collaboration avec Markus Dettenhofer (Baltimore, MD, USA), caractérisé pour la première fois la structure secondaire de cet ARN dans les cellules infectées et les particules virales 15; 16. Cette avancée technologique nous a permis par la suite (1) d'analyser avec Valérie Goldschmidt (doctorante) les variabilités structurales existantes au sein du complexe d'initiation de la rétrotranscription 17 et (2) de montrer, en collaboration avec l'équipe de Philippe Dumas (UPR 9002), que des antibiotiques de la famille des aminoglycosides se fixent spécifiquement dans la boucle du DIS de l'ARN génomique du VIH-1 non seulement dans un système in vitro 18 mais également en culture cellulaire 19.<br />Récemment, nous avons initié un nouveau projet sur le rôle de la protéine virale Vif dans la réplication virale du VIH-1 et sa relation avec l'ARN génomique (travail de thèse de Simon Henriet). Outre ses activités sur la synthèse de l'ADN proviral, la stabilité du core viral ou encore l'intégration du provirus, nous avons montré que la protéine Vif se fixe de façon spécifique et de manière coopérative aux régions localisées dans la région 5'-terminale du génome rétroviral 20. En particulier, la tige-boucle TAR (région 1-57) est un point de nucléation nécessaire à la propagation de la fixation de Vif à l'ARN (de 5‘ vers 3') mais semble insuffisante pour stabiliser ces interactions.<br /> De nombreuses perspectives découlent directement de ces travaux. Nous souhaiterions étudier la dimérisation de l'ARN génomique du VIH-1 directement dans la cellule et ainsi répondre à plusieurs questions fondamentales : où se forme le dimère d'ARN génomique ? Le DIS, ou la dimérisation, sont-ils nécessaires au transport et à l'encapsidation de l'ARN génomique ? La maturation du dimère d'ARN dans les particules virales est-elle liée à un remaniement conformationnel au niveau du DIS ? Des résultats préliminaires obtenus en collaboration avec par l'équipe de M. Mougel (UMR 5121, Montpellier) indiquent que le DIS pourrait effectivement être un signal positif pour le transport nucléo-cytoplasmique. Ces résultats nous encouragent ainsi à poursuivre le développement de nouveaux agents antiviraux dérivés des aminoglycosides dirigés contre le DIS (collaboration avec P. Dumas, UPR 9002 et P. Pale, UMR 7123-ULP). <br />Dans les perspectives liées à la compréhension du rôle de Vif dans la réplication virale, nous étudierons en particulier son action sur l'initiation de la rétrotranscription et sur la régulation de l'expression des protéines APOBEC-3G/3F. Les protéines APOBEC sont des cytidines désaminases qui ont été identifiées dernièrement et dont l'action hypermutatrice lors de la synthèse du brin (-) de l'ADN proviral est létale pour le virus. Ces protéines, exprimées exclusivement dans les cellules non permissives, sont exclues des particules virales en présence de Vif et dirigées vers la voie du protéasome. Nous étudierons entre autre la régulation de la traduction des protéines APOBEC par Vif (identification des régions de l'ARNm nécessaires) et analyserons les changements conformationnels éventuels au niveau de la région 5' non traduite de l'ARNm induits par la fixation de Vif. <br /> L'ensemble de ces travaux devrait nous permettre de contribuer à la compréhension des mécanismes qui régulent la structure tridimensionnelle de la région 5' non traduite de l'ARN génomique du VIH-1, et à plus long terme d'identifier des molécules capables d'interagir avec les différents domaines structuraux de cette région.

Le développement du cancer et la réponse aux traitements sont associés à des variations de la régulation post-transcriptionnelle qui entraîne une modification du protéome qualitativement et/ou quantitativement. La régulation post-transcriptionnelle implique des protéines de liaison à l’ARN (RBP), interagissant avec des éléments cis comme les séquences, les modifications ou les structures de l’ARN. Parmi ces éléments cis, les structures non-canoniques nommées ARN G-Quadruplexes (RG4), et les modifications N6-Méthyladénosines (m6A), jouent un rôle critique dans le modelage post-transcriptionnel guidant l’expression des gènes du cancer, et leur ciblage est actuellement envisagé par des essais pré-cliniques. L’un des défis majeurs de ce champ de recherches repose sur la compréhension des mécanismes contrôlants la sélectivité des sites modifiés en m6A, leur reconnaissance et leur suppression, ainsi que sur l’identification des régulateurs de la structuration des RG4. Pour répondre à ces défis, la colocalisation entre les RG4 et les m6A et leur régulation mutuelle doit encore être étudiée de manière claire. Un autre objectif clé consiste à relier les interactions entre les protéines liant les RG4 dans les transcrits et leurs fonctions biologiques liées au cancer en tirant parti des prédictions de la structuration des RG4 et des données expérimentales sur les RG4 et les RBP. Mon projet de thèse aborde ces deux défis centrés sur la régulation cis- et trans- des RG4, en utilisant des approches multidisciplinaires incluant la bioinformatique, la biologie moléculaire et cellulaire. Pour cartographier et caractériser globalement les régulateurs agissant en trans sur les RG4, nous avons développé QUADRatlas (https://rg4db.cibio.unitn.it), une base de données de RG4 identifiés expérimentalement et prédits par ordinateur dans le transcriptome humain, liés à leurs fonctions biologiques et à leurs associations aux pathologies (Bourdon et al, NAR, 2023). Ce travail offre un accès à un large catalogue construit manuellement de protéines de liaison aux RG4 connues, complété par un vaste ensemble de données de sites de liaison de RBP pour découvrir de nouvelles interactions potentielles RG4-RBP. Notre étude sur l'interaction entre les RG4 et les m6A a révélé leur colocalisation dans le transcriptome codant humain. Nous avons démontré in vitro que la stabilité des RG4 n'était pas inhibée par la présence de m6A. Cependant, nous avons montré que la stabilisation des RG4 diminuait le niveau global de m6A dans les lignées cellulaires cancéreuses. Pour expliquer cet effet, nous avons étudié la capacité des RBP à se lier aux RG4, m6A ou aux RG4 contenant des m6A (RG4(m6A)). Nous avons découvert que les RG4s pouvaient agir comme des plateformes pour les protéines de liaison aux m6A et ainsi réguler leur présence sur les transcrits. Ce travail fournit des informations essentielles sur la régulation mutuelle de deux éléments cis majeurs de l'ARNm par les RBP. De futures analyses seront nécessaires pour découvrir l’effet de la colocalisation RG4(m6A) sur l’expression des gènes du cancer<br>Cancer development and response to treatments are associated to post-transcriptional rewiring which in turn modifies the cancer proteome qualitatively and/or quantitatively. Post-transcriptional regulation involves RNA binding proteins (RBP) interacting with cis-acting elements like RNA sequences, modifications or structures. Among the cis-regulators, non-canonical structures, called RNA G-Quadruplexes (RG4), and N6-methyladenosines modifications (m6A), play a critical role in shaping post-transcriptional expression of cancer genes and their targeting is currently investigated in pre-clinical studies. One major challenge in the field lies in understanding the mechanisms controlling selectivity in m6A deposition, reading and removal, as well as deciphering RG4 folding and regulators. Whether m6A and RG4 colocalize and regulate each other remains to be fully investigated. Another key challenge is to link RG4-protein interactions in transcripts to cancer-relevant biological functions by leveraging predictions of RG4 structuration and experimental data on RG4 and RBP.My thesis project tackled these two challenges centered on the cis- and trans- regulation of RG4s, using multidisciplinary approaches including bioinformatics, molecular and cellular biology. To globally map and characterize RG4 trans-acting regulators, we developed QUADRatlas (https://rg4db.cibio.unitn.it), a database of experimentally-derived and computationally predicted RG4 in the human transcriptome, linked with their biological function and disease associations (Bourdon et al, NAR, 2023). This work provides a broad access to a manually curated catalogue of known RG4-binding proteins, complemented with an extensive RBP binding sites dataset to discover new potential RG4-RBP interactions. Our study on the interplay between RG4 and m6A revealed their colocalization in the human coding transcriptome. We demonstrated in vitro that RG4 stability was not inhibited by m6A presence. However, we showed that the stabilisation of RG4 decreased global m6A level in cancer cell lines. To explain this effect, we studied the ability of RBP to bind RG4, m6A or RG4 containing m6A (RG4(m6A)) and found that RG4 could act as a platform for m6A binding proteins and thus regulate their presence on transcripts. This work provides insights on the co-regulation of two major mRNA cis-acting elements by RBP. Future analyses will then be needed to unravel the effect of RG4(m6A) colocalization on cancer gene expression

L'IRES du VHC est organisé en une structure secondaire, complexe et hautement conservée, qui comprend quatre domaines distincts (I-IV). Cette organisation permet la liaison directe du facteur d'initiation eucaryote eIF3 et de la sous-unité 40S du ribosome. Le facteur d'initiation eucaryote eIF3 est un complexe de 13 protéines (~ 800 kDa). Certaines de ses sous-unités montrent une affinité pour l'ARN, et parmi elles deux possèdent des motifs de reconnaissance à l'ARN (MRR) : eIF3b (aa : 185-268) et eIF3g (aa : 239-317). Afin de déterminer l'implication de ces motifs dans l'interaction ARN-protéine, nous avons cloné les domaines contenant ces motifs MRR, ainsi que les protéines entières eIF3b et eIF3g. Nous avons ensuite étudié l'interaction de l'ARN et/ou domaines d'ARN avec le complexe eIF3 et/ou protéines ou domaines protéiques en utilisant la méthode de rétention sur filtre. Nous avons ainsi calculé les différentes constantes apparentes de dissociation entre : eIF3/IRES, eIF3b/IRES et MRR-eIF3b/IRES. Ces résultats montrent que la sous-unité eIF3b se lie directement au domaine III de l'IRES via son motif MRR situé dans le domaine N-terminal. Dans un deuxième temps, nous avons utilisé la spectroscopie RMN pour identifier précisément les acides aminés impliqués dans la reconnaissance de l'ARN viral. En utilisant différentes techniques telles que FBA, RMN et SAXS, il s'avère que le domaine IIId (30 nucléotides) représente le motif minimum impliqué dans l'interaction MRR-eIF3b/IRES. Enfin, la technique de SAXS a été mise à profit pour étudier la structure tridimensionnelle de l'IRES libre en solution.

Selon le paradigme structure-fonction, la fonction d'une protéine dépend de sa structure, et une connaissance approfondie de cette structure révèle des mécanismes fonctionnels essentiels. Cependant, ce paradigme est remis en question par les protéines intrinsèquement désordonnées (IDPs), qui, bien qu'elles n'aient pas de structure stable, restent fonctionnelles. Le facteur d'initiation de la traduction eucaryotique 4B (eIF4B) est une IDP clé dans la régulation de l'initiation de la traduction chez les eucaryotes. Cofacteur essentiel de l'hélicase eIF4A, eIF4B est crucial pour la traduction des ARNm dotés de longues régions 5' non traduites structurées. Il possède plusieurs domaines fonctionnels, dont le domaine structuré du motif de reconnaissance de l'ARN (RRM) en N-terminal, la région désordonnée DRYG, riche en aspartate, arginine, tyrosine et glycine, et la région désordonnée riche en arginine (ARM) en C-terminal. Les domaines RRM et ARM sont connus pour se lier à l'ARN, tandis que la région DRYG est essentielle à l'auto-association de l'eIF4B. La surexpression d'eIF4B dans les cellules cancéreuses pourrait influencer la formation des granules de stress, et son activité est régulée par la phosphorylation, en particulier aux sites Ser406 et Ser422.Malgré l'importance de l'eIF4B, seul son domaine RRM structuré a été caractérisé au niveau atomique. Les détails moléculaires de sa région intrinsèquement désordonnée (IDR) restent inconnus, car ces protéines sont difficiles à étudier en raison de leur hétérogénéité conformationnelle et de leur comportement dynamique. Pendant ma thèse, j'ai poursuivi quatre objectifs :(i) caractériser structurellement l'IDR de l'eIF4B à l'état monomérique ;(ii) explorer la dynamique conformationnelle et les interactions de l'IDR au niveau moléculaire lors de l'oligomérisation et de la condensation à l'échelle mésoscopique ;(iii) étudier les dynamiques conformationnelles de l'IDR lors des interactions avec l'ARN ;(iv) analyser l'impact des mutations phosphomimétiques de l'eIF4B sur l'auto-association, sur la séparation de phase et sur les interactions ARN-protéine.Grâce au transfert d'énergie par résonance de Förster à molécule unique (smFRET), j'ai étudié l'IDR de l'eIF4B en tant que monomère, révélant un comportement conformationnel non uniforme et une flexibilité variable selon les régions. La région DRYG, bien que désordonnée, est étonnamment compacte, tandis que la région C-terminale (CTR) est plus étendue et flexible. Ces caractéristiques sont largement dictées par la composition spécifique de chaque sous-région. SmFRET a aussi permis d'analyser l'oligomérisation de l'eIF4B et les changements conformationnels associés. L'augmentation de la concentration protéique au-delà d'un certain seuil a conduit à une séparation de phase d'eIF4B. Ces analyses ont permis de cartographier un paysage d'auto-association complexe d'eIF4B, passant des monomères aux oligomères et aux gouttelettes condensées. Les mutations phosphomimétiques S406E et S422E n'affectent que peu l'oligomérisation d'eIF4B, mais réduisent sa tendance à la séparation des phases.Enfin, une combinaison d'expériences smFRET et RMN a permis d'étudier les interactions eIF4B-ARN. Il en ressort que la liaison concerne principalement la région 332 à 457, qui se compacte lors de la liaison à l'ARN. Cette interaction dépend de la force ionique, suggérant que les interactions électrostatiques en sont le moteur principal, tandis que la spécificité pour les ARN riches en guanosine indique des interactions π-π supplémentaires. Notamment, les mutations phosphomimétiques Ser406 et Ser422 affectent significativement l'affinité de liaison entre l'eIF4B et l'ARN. En résumé, ce travail offre une compréhension approfondie du comportement conformationnel de l'eIF4B et des mécanismes de ses interactions, fournissant des éclaircissements sur la manière dont une protéine sans structure stable peut remplir des fonctions essentielles<br>The structure-function paradigm defines that protein function is determined by its structure, and detailed structural knowledge provides critical insights into its functional mechanisms. This paradigm has been challenged with the intrinsically disordered proteins (IDPs) that lack a stable structure, yet they are functional under physiological conditions. Eukaryotic translation initiation factor 4B (eIF4B) is an IDP involved in the regulation of translation initiation in eukaryotes. As an essential co-factor of RNA helicase eIF4A, eIF4B is particularly important for translation of mRNAs with long and structured 5' untranslated regions. It contains several defined functional domains/regions, including the structured N-terminal RNA recognition motif (RRM) domain, the disordered DRYG region, enriched with aspartate, arginine, tyrosine and glycine and the disordered C-terminal arginine-rich motif (ARM) region. While the RRM and ARM domains mediate RNA binding, the DRYG region is essential for eIF4B self-association. eIF4B is overexpressed in cancer cells, and may influence stress granule formation. The cellular activity of eIF4B is regulated by phosphorylation, notably at Ser406 and Ser422 residues.Despite its importance, only the well-structured RRM domain has been characterized at atomic level. The molecular details of its large intrinsically disordered region (IDR) are still unknown, as proteins of this nature are difficult to characterize due to their conformational heterogeneity and dynamic behavior. During my PhD work I had four objectives:i) structural characterization of eIF4B IDR in its monomeric state;ii) characterization of conformational dynamics and interactions of eIF4B IDR on the molecular level upon oligomerization and upon condensation on the mesoscopic scale;iii) investigation of conformational dynamics of eIF4B IDR upon RNA interactions;iv) analysis of the impact of key phosphomimetic mutations on eIF4B protein - protein interactions, eIF4B condensation and eIF4B - RNA interactions.Using single-molecule Förster resonance energy Transfer spectroscopy (smFRET) I studied the eIF4B IDR as a monomer, demonstrating its non-uniform conformational behavior and flexibility, with different regions showing varying degrees of compactness and dynamics. Although the DRYG region is disordered, it is surprisingly compact, whereas the CTR is more expanded and flexible. These characteristics are largely dictated by the specific sequence composition of each subregion. smFRET also enabled probing eIF4B oligomerization behavior and associated protein conformational changes. Increasing the protein concentration above certain thresholds lead to eIF4B phase separation, which was studied by dedicated phase separation assays. Altogether, these experiments enabled mapping of the self-association landscape of eIF4B, which represents a complex transition from monomers to oligomers to condensed droplets. Interestingly, phosphomimetic mutations, such as S406E and S422E minimally affect eIF4B oligomerization, but considerably reduce the phase separation propensity.Finally, I used a combination of smFRET and NMR experiments to investigate eIF4B - RNA interactions, confirming that binding primarily involves the 332 to 457 region (overlapping with previously identified ARM region), which undergoes compaction upon RNA binding. The binding is ionic strength dependent, suggesting that electrostatic interactions are the main driving force, while sequence specificity towards guanosine-containing RNAs, indicates additional π-π stacking interactions. Importantly, the Ser406 and Ser422 phosphomimetic mutations within the RNA binding region significantly affect eIF4B-RNA binding affinity.Altogether, this work provides a detailed molecular understanding of conformational behavior of eIF4B and mechanisms of its interactions

Bien que le Virus Respiratoire Syncytial, responsable de la bronchiolite du nourrisson, soit aujourd’hui un problème de santé publique majeur, il n’existe encore aucun vaccin ou antiviral curatif contre ce pathogène. Le manque de données sur les étapes clés du cycle viral et sur les interactions virus-cellule freine le développement de nouvelles molécules antivirales.Nous avons étudié l’interactome de deux protéines virales : la polymérase L et le facteur de transcription M2-1. Dans ce but, nous avons mis au point un crible s’appuyant à la fois sur des critères d’interactomique et sur des critères fonctionnels.La première étape consistait à identifier des partenaires potentiels de M2-1 et L par des co-immunoprécipitations couplées à une approche de protéomique quantitative. Pour plus de pertinence, ce crible a été réalisé sur cellules infectées, grâce des virus recombinants produits par génétique inverse. Ceci nous a permis d’identifier 45 et 137 partenaires potentiels de L et M2-1 respectivement. Une étude systématique de l’impact de l’inhibition de 15 partenaires potentiels de M2-1 sur la multiplication virale a mis en avant trois candidats : ILF2, PABPN1 et PABPC1.Nous nous sommes par la suite concentrés sur PABPC1. L’inhibition de l’expression de PABPC1 altère la multiplication virale, mais nous n’avons pas pu mettre en évidence un effet spécifique sur la transcription ou la traduction virale. Son interaction avec M2-1 a été confirmée, et le domaine MLLE de PABPC1 a été identifié comme le site de liaison à M2-1. L’interaction entre M2-1 et PABPC1 a été observée à la fois dans le cytoplasme et dans les IBAGs, des sous-structures concentrant les ARNm viraux au sein des corps d’inclusion viraux. Nous avons formulé l’hypothèse que M2-1, liée à PABPC1, accompagne les ARNm viraux après leur sortie des corps d’inclusion. Ceci suggère un rôle de M2-1 dans le devenir des ARNm viraux en aval de leur transcription<br>Although the Respiratory Syncytial Virus, responsible of bronchiolitis in infants, represents a major public health problem, there are currently no vaccine or curative antiviral directed against it. The lack of information on key steps of its viral cycle and on virus-cell interactions hinders the development of new antiviral molecules.We chose to study the interactome of two viral proteins: the polymerase L and the transcription factor M2-1. To do so, we developed a screen based on interactomic and functional criteria.The first step consisted in identifying potential binding partners of M2-1 and L by co-immunoprecipitations coupled to quantitative proteomics. For better relevance, this screen was realised on infected cells, thanks to recombinant viruses produced by reverse genetics. 45 and 137 potential binding partners of M2-1 and L respectively were thus identified. A systematic study of the inhibition of 15 potential partners of M2-1 and its impact on viral multiplication enabled the selection of three candidates: ILF2, PABPN1 and PABPC1.We chose to concentrate on PABPC1. The inhibition of PABPC1’s expression reduces viral multiplication, but no specific effect on viral transcription or translation was brought to light. Its interaction with M2-1 was confirmed, and the MLLE domain of PABPC1 was identified as the M2-1 binding site. The interaction between M2-1 and PABPC1 was observed both in the cytoplasm and in IBAGs, substructures of viral inclusion bodies where viral mRNA accumulate. We formulated the hypothesis that M2-1, with PABPC1, stays with viral mRNA after leaving inclusion bodies and during their translation. This suggests a role for M2-1 in the fate of viral mRNA downstream of transcription