Dissertations / Theses on the topic 'Isolats primaires'

La recombinaison est une source majeure de variabilité chez le VIH. L’impact profond de ce mécanisme sur la population du VIH est mis en évidence par la proportion de souches recombinantes circulantes dans la pandémie. Ce travail porte sur l'étude des mécanismes de génération et des premières étapes de sélection de formes recombinantes intra et inter sous-type: grâce à un système mis au point au laboratoire, nous analysons les produits de recombinaison après un seul cycle d'infection de cellules en culture, donc en l'absence de toute sélection. Nous avons mis en évidence l’existence de paramètres favorisant la recombinaison et établi une cartographie de la population de formes recombinantes que le mécanisme génère au sein du gène env. Nous montrons ensuite que cette population est remaniée par une contrainte de sélection simple, la fonctionnalité des protéines chimériques. Enfin, il apparaît que les effets combinés des prédispositions mécanistiques à la recombinaison le long du gène env et la sélection envers les recombinants altérés dans leur fonctionnalité peuvent suffire à expliquer la quasi-totalité des recombinants de ce gène de la nature.

La glycoproteine d'enveloppe du vih comprend une proteine de surface, la gp120, et une proteine ancree dans la membrane, la gp41, liees entre elles de facon non covalente. Cette glycoproteine assure l'entree du virus dans la cellule cible. Ainsi, la gp120 se lie au recepteur cd4 et aux corecepteurs (cxcr4 ou ccr5), exprimes a la surface des cellules cibles, et le peptide de fusion n-terminal de la gp41 qui va medier la fusion des membranes virale et cellulaire. Historiquement, les etudes des glycoproteines ont ete realisees le plus souvent sur la gp120 monomerique provenant de souches de laboratoire adaptees a la culture en lignee t (tcla). Or des etudes recentes ont montre qu'il existe des differences de conformation de la gp120/gp41 multimerique a la surface des virions d'isolats primaires ou de souches tcla. Dans le but d'etudier si ces differences pouvaient alterer le tropisme cellulaire, l'antigenicite, l'immunogenicite et l'usage de corecepteur, il nous est apparu essentiel de comparer le comportement des glycoproteines d'un isolat primaire (bx08) et d'une souche tcla (lai). Dans ce travail, les glycoproteines (env-bx08 ou env-lai) ont ete exprimees dans des cellules de mammiferes, par un vecteur viral defectif sfv (semliki forest virus) et caracterisees comme des molecules oligomeriques et fonctionnelles puisqu'elles induisent la fusion entre cellules exprimant les recepteurs appropries (cd4, cxcr4 /ou ccr5). L'utilisation de ce test de fusion a permis de mesurer l'effet inhibiteur de differentes molecules sur l'interaction de la glycoproteine avec les recepteurs cellulaires. Nous avons ainsi pu montrer en utilisant les ligands naturels des corecepteurs ccr5 et cxcr4 (b-chimiokines) ou le recepteur soluble cd4 tetramerique (cd4-igg2), que la fusion mediee par env-bx08 et env-lai est dependante du recepteur cd4, mais que seule la fusion mediee par env-bx08 depend du ccr5, alors que celle mediee par env-lai depend du cxcr4. Par ailleurs, nous avons montre que les anticorps monoclonaux les plus inhibiteurs de la fusion sont ceux diriges contre des epitopes conformationnels de la gp120 plutot que ceux diriges contre des epitopes lineaires, comme attendu compte tenu du fait que les glycoproteines d'enveloppe exprimees sont oligomeriques. La grande majorite des anticorps testes inhibe aussi efficacement la fusion mediee par l'enveloppe env-bx08 que par l'enveloppe env-lai, confirmant que la neutralisation du vih-1 n'est pas influencee par l'usage d'un corecepteur specifique (ccr5 ou cxr4). L'effet inhibiteur de divers peptides representant la sequence de la boucle v3 de la gp120 sur la fusion intercellulaire via le ccr5 ou le cxcr4 a montre que la boucle v3 semble determiner le choix de corecepteur. L'utilisation du cxcr4 semble requerir a la fois une boucle v3 de charge positive et la presence de certains acides amines dans quelques positions critiques, notamment d'un residu arginine en position 320.

Les essais de vaccination contre le VIH n'ont jusqu'ici pas permis d'induire des anticorps neutralisants (AcN) efficaces contre les isolats primaires (IP) du virus, bien que de tels AcN puissent être détectés dans une faible proportion des sérums de sujets infectés. Mon projet de recherche a consisté à caractériser les AcN présents dans ces échantillons et à étudier leur mode d'action, l'acquisition de ces connaissances fondamentales étant utile pour la mise au point d'immunogènes capables d'induire une réponse humorale neutralisante. L'activité neutralisante de sérums et de plasmas de 32 patients infectés a été recherchée vis-à-vis de 4 IP. La purification des immunoglobulines a permis d'attribuer la majeure partie de ces activités aux IgG, qui ont été purifiées pour l'étude du mécanisme d'action des AcN. Bien que les AcN n'empêchent pas l'attachement des IP aux PBMC, leur fixation sur le virus déjà associé à ces cellules n'a pas permis d'inhiber efficacement sa réplication. Les complexes AcN-IP, obtenus en l'absence de PBMC puis purifiés, ont au contraire un pouvoir infectieux très fortement réduit, ce qui suggère que les épitopes reconnus par les AcN sont accessibles sur le virus libre. Le blocage du site de fixation de la gp120 sur le récepteur CD4 ou la dissociation de la majorité des sous-unités gp120 à la surface du virus inhibent la réplication des IP sans diminuer leur attachement aux PBMC. Celui-ci engagerait donc d'autres récepteur(s) que le CD4 à la surface de ces cellules, et peut-être d'autres structures que la gp120 sur les virions. L'attachement des IP aux PBMC est de fait inhibé en partie après digestion des groupements héparane-sulfate cellulaires. L'étude de la fixation des IgG sur les IP a montré qu'il n'existe pas de corrélation entre celle-ci et la neutralisation. Les résultats obtenus suggèrent de plus que la majorité des IgG de patients pourraient se fixer sur le virus via des épitopes révélés suite à la dissociation de la gp120
HIV vaccination trials have not resulted in the induction of neutralizing antibodies (nAb) that were effective against primary isolates (PI) of the virus, while such nAbs have been detected in a little fraction of sera from infected patients. The aim of my research project was to characterize nAb in such samples and to study their mechanism of action, as the acquisition of this fundamental knowledge could be useful to design immunogens that may induce a neutralizing humoral response. The neutralizing activity of sera and plasmas of 32 infected patients was measured against four PI. The purification of immunoglobulins showed that most of the activities were mediated by IgG, and these Ig were purified for the study of the mechanisms of neutralization. The attachment of PI to PBMC was not inhibited by nAb, although their fixation to the virus that was already associated to the cells did not result in an efficient blocking of its replication. NAb-PI complexes, formed in absence of PBMC and purified, had lost most of their infectivity, suggesting that epitopes that are targeted by nAb are accessible on the free viral particles. The blocking of the gp120-binding site on CD4 or the shedding of the majority of the gp120 associated to the virus resulted in the inhibition of viral replication but did not impair the attachment of PI to PBMC. This early event is thus mediated by alternative receptors on the cell surface, and may also imply structures other than the gp120 on the virus surface. Indeed, heparan sulfate were shown to be partly responsible for the attachment of PI to PBMC. The study of the binding of IgG to PI particles showed that there is no correlation between binding and neutralization. Moreover, our results suggest that a large part of the binding of polyclonal IgG to viral particles may occur through epitopes that are exposed after the dissociation of the gp120

Le virus de l'immunodéficience humaine VIH-1 est responsable, chez l'homme, de la perte des lymphocytes T CD4+ et du syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA). L'entrée du virus dans les cellules cibles est effectuée par la glycoprotéine d'enveloppe composée de la sous-unité de surface gp120 et de la sous-unité transmembranaire gp41. La gp120 qui est la sous-unité la plus exposée permet la liaison du virus aux récepteurs cellulaires. Le récepteur CD4 initie l'interaction avec la gp120 et cette interaction provoque des changements conformationnels qui permettent l'interaction avec un co-récepteur appartenant à la famille des récepteurs aux chimiokines comme les récepteurs CXCR4 (virus lymphotropes) et CCR5 (virus monocytotropes). Dans le but d'étudier la gp120 de l'isolat primaire macrophage-tropique YU2, des mutations ont été effectuées dans une région très conservée de la gp120 chez les rétrovirus. Les résidus concernés appartiennent aux brins ?16 et ?17 qui composent une épingle à cheveux qui module la liaison aux récepteurs CD4 et CCR5. Ainsi, il semblerait que cet élément de structure de la gp120 joue un rôle charnière entre le site d'interaction au récepteur CD4 et le site supposé d'interaction avec le co-récepteur. La structure de la gp120 ainsi que sa liaison au récepteur CD4 ne sont pas affectées lorsque la substitution E381A est réalisée. Cependant, E381 joue un rôle critique dans la liaison au co-récepteur CCR5 par le biais d'un pont salin avec K207. Il a également été montré que d'autres résidus de l'épingle à cheveux ?16/?17 jouent un rôle important lors des interactions, comme les phénylalanines F376 et F383. Ainsi, les résultats obtenus suggèrent que l'épingle à cheveux ?16/?17 gouverne les interactions entre la gp120 et le co-récepteur CCR5. Les mutations effectuées ont un impact direct sur la surface du pont interdomaine et sur le site d'interaction avec le récepteur CD4 ainsi que sur le site supposé d'interaction avec le co-récepteur CCR5. Ces résultats éclaircissent le mécanisme de liaison au co-récepteur CCR5 et contribuent à la compréhension de l'entrée du VIH-1, ils pourraient être pris en compte pour la conception de molécules inhibitrices de l'entrée virale.

Le but du travail présenté dans ce mémoire, était d'étudier le mode de fonctionnement d'un canal unitaire potassique. Il a été précédé par la mise au point d'une technique d'isolation et de mise en culture primaire des cellules ventriculaires de coeur de mammifère (rats nouveau-nés). La seconde partie technique du travail a consisté à adapter la méthode de "patch clamp" proposée par HAMILL et coll., en 1981, à l'étude des canaux ioniques unitaires et aux courants macroscopiques des cellules cardiaques. Ceci nous a permis de montrer l'existence de plusieurs types de canaux Kea la surface de ces cellules. Malgré leur faible densité (1 canal/Ce) ces canaux ioniques transmembranaires doivent être groupés par petits nombres de 2 à 6 unités, en particulier pour ceux de type I, pour lesquels les enregistrements de type multi-canaux sont très souvent observés par rapport au petit nombre d'expériences où un seul canal est actif dans les fragments de membrane testés. Ce canal de type 1, sur lequel s'est focalisé l'ensemble de l'étude, a été défini comme étant un canal plutôt sélectif au K bien qu'il laisse perméer des ions Na avec un rapport de Perméabilité de PNa/PK = 0.056. Ce canal a la propriété de s'activer quand la membrane est dépolarisée, ce qui correspond à une augmentation de la probabilité d'ouverture du canal P en dépolarisation. D'autre part, la courbe courant/voltage du canal unitaire semble rectifier d'autant plus drastiquement que la concentration externe de K est élevée. II a également été montre que l'ion perméant pouvait influencer la conductance unitaire et le "gating" du canal. En effet, la propriété du canal a conduire les ions et son aptitude a passer dans l'état conducteur (état ouvert) augmente en fonction de [K]. La conductance du canal est un phénomène saturable qui rappelle les propriétés des systèmes enzymatiques. Une constante de dissociation apparente K = 100 mM a été évaluée pour le K pour une conductance maximale: y max - 50 pS avec [K]o = 500 mM. Ce travail a permis de montrer que le Na aurait un effet facilitateur sur la conductance pour les [K]o faibles. Le canal étudié a également la propriété intrinsèque de rectifier dans le sens entrant. Une série d'expériences a permis de montrer que le comportement global du canal pendant des impulsions de potentiels, dépendait du voltage avant et après les transitions. Ces expériences ont également permis de montrer que la propriété de rectification du canal était une caractéristique du canal dans l'état ouvert, et que cette rectification était un phénomène instantanément réversible en fonction du voltage qui correspond à une modification de la propriété de conduction du "pore". La cinétique du canal a été étudiée en détail à partir d'un modèle à 3 états de type C-0-C en fonction du potentiel transmembranaire et de la [K]o. Les effets d'inhibiteurs, tels que la 4.A.P., le Cs et le Ba, ont permis de montrer différents modes d'inhibition fonctionnelle de ce type de canal. Enfin, les canaux de type 1 ne sont pas sensibles à l'acétylcholine un activateur connu de certains types de canaux K.

L'utilisation de l'indicateur fluorescent QUIN 2 AM, sur les cellules glomérulées de la glande surrénale, a permis de montrer les mouvements de calcium suite à la fixation des hormones régulatrices sur leur récepteur. En effet, l'ACTH, l'angiotensine II et la vasopressine augmentent la concentration en calcium cytosolique libre. L'utilisation du bloqueur de canaux calciques voltage-dépendant, le vérapamil, a montré que l'augmentation de la [Ca2+]i induite par l'ACTH se fait par le biais de canaux calciques voltage-dépendant alors que celle induite par la vasopressine se fait via, soit des canaux calciques opérés par récepteur soit par la libération de calcium de réserves intracellulaires. Les études électrophysiologiques, sur les cellules de la zone glomérulée de la surrénale, ont montré, que ces cellules présentent un potentiel de membrane de -36 mV, ainsi que l'existence de différents courants ioniques, participant plus ou moins aux événements primaires du couplage excitation-sécrétion. En effet, l'existence d'un courant potassique sortant transitoire, d'un courant entrant potassique et de deux courants entrants calciques, un en présence de Cs et, l'autre en présence d'ACTH ou de TEA a été montrée. Le recouvrement des courbes d? et f? du courant calcique enregistré en présence d'ACTH ou de TEA, dans une gamme de potentiels entre -50 et -30 mV est responsable d'un flux entrant calcique de fenêtre. Ce courant de fenêtre, nécessaire pour maintenir le niveau basal de calcium intracellulaire, a déjà été prouvé par d'autres méthodes. L'étude des différentes cinétiques des courants enregistrés ainsi que les autres résultats obtenus dans les deux autres parties de cette étude, les dosages radioimmunologiques et les études de fluorescence ont permis d'émettre une hypothèse quant au mécanisme d'action de l'ACTH et de spéculer sur le mécanisme d'action de la vasopressine. En effet, l'hypothèse sur le mécanisme d'action de l'ACTH serait la suivante : les récepteurs de l'ACTH ont deux sites de liaisons de différentes affinités, le premier site de haute affinité, serait représenté par les canaux potassiques, l'ACTH en bloquant les canaux potassiques entrainerait une entrée de calcium, ce mécanisme ferait intervenir le calcium comme second messager. Le mécanisme d'action relié à l'autre site récepteur, ferait intervenir l'AMPc comme second messager. L'hypothèse spéculée sur le mécanisme d'action de la vasopressine serait la suivante : la liaison de l'hormone à son récepteur induit la stimulation de la phospholipase C conduisant à l'augmentation d'Ins P3. Ce dernier agirait sur la libération de calcium intracellulaire. L'entrée de calcium de l'extérieur semble moins évidente que dans le cas de l'ACTH.

La degradation des arn ribosomaux (arnr) par les acides amines et l'insuline a ete etudiee dans les hepatocytes isoles et en culture primaire provenant de rats nourris ad libitum. La vitesse de degradation des arnr a ete determinee a partir de l'accumulation de cytidine radioactive dans le milieu de suspension ou de culture, en presence de 0,5 mm de cytidine non radioactive. Les arnr ont ete marques in vivo par l'acide 6-#1#4corotique 60 h avant l'isolement des hepatocytes. Lorsque les hepatocytes etaient maintenus dans un milieu depourvu en acides amines, les arnr etaient degrades a une vitesse moyenne de 4%/h. Le catabolisme des arnr etait inhibe d'environ 65% en presence d'un melange complet d'acides amines a 10 ou 20 fois la concentration plasmatique normale. Toutefois, pour des concentrations physiologiques d'acides amines, l'inhibition de la degradation des arnr etait 3 a 4 fois superieure dans les hepatocytes en culture par rapport a celle obtenue dans les hepatocytes isoles. Cette difference de sensibilite entre les deux modeles persistait lorsque le rapport entre la quantite totale d'acides amines et le nombre de cellules etait modifie. Ainsi, la disponibilite en acides amines n'a pas semble responsable de la perte de sensibilite des hepatocytes isoles alors que la concentration en acides amines est apparue comme un determinant important de la reponse inhibitrice. Dans les hepatocytes en culture, le pouvoir inhibiteur de chacun des acides amines variait considerablement, la leucine et la phenylalanine etant particulierement importantes dans le controle de l'activite de degradation des arnr. Alors que l'insuline etait sans effet sur la degradation des arnr en l'absence d'acides amines, elle etait capable d'en potentialiser l'effet inhibiteur. A partir d'etudes morphologiques et biochimiques, nous avons egalement montre que le systeme lysosomal etait implique dans l'augmentation de la degradation des arnr et son controle par les acides amines dans les hepatocytes

Les fetidines 40 et 45, lipoglycoproteines du liquide coelomique de l'annelide oligochete eisenia fetida andrei, de masse moleculaire 40 et 45 kda, ont ete purifiees en chromatographie sur resine echangeuse d'anions a partir du liquide coelomique dialyse. Elles sont toujours hemolytiques apres purification, agissant sur les membranes d'hematies de mouton en formant des pores de diametre compris entre 1,9 et 2,6 nm. La lyse d'une cellule est provoquee par la fixation de 22000 molecules de fetidine, apres reconnaissance d'un recepteur lipidique comportant au minimum quatre lipides differents (phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine, sphingomyeline et cholesterol) et un ou plusieurs autres lipides de nature differente tels que des glycolipides. Elles ont une activite bactericide vis a vis de pathogenes pour le ver mais egalement pour l'homme ou les agrumes. Elles presentent en outre une activite peroxydase. Les activites hemolytique et antibacterienne (bacteriostatique) se retrouvent aussi au niveau de la proteine recombinante non glycosylee qui correspond a un adnc clone dans escherichia coli, adnc correspondant lui-meme a un gene de eisenia. Hormis ces activites, la proteine recombinante presente un nombre important d'acides amines aromatiques comme les fetidines, un site peroxydase et un site consensus de n-glycosylation (les fetidines sont des n-glycoproteines). Cette glycosylation protege les fetidines contre l'action des proteases. Le sequencage partiel de la fetidine 40 montre qu'elle correspond a la proteine recombinante. Excepte le degre de glycosylation, rien d'autre ne differencie actuellement la fetidine 40 de la fetidine 45

L’intégration croissante de la production éolienne ne participant pas au réglage de fréquence induit de nouvelles difficultés de gestion des systèmes électriques. Ces problèmes sont d’autant plus significatifs que le réseau est faible. La présente thèse vise à évaluer la performance et la fiabilité du réglage de fréquence des éoliennes à l’échelle du système électrique. Les études sont appliquées sur un réseau insulaire.D’abord, l’impact d’un fort taux de pénétration de la production éolienne sur l’allocation de la réserve primaire et sur le comportement dynamique du réseau est caractérisé. Il est montré que la participation des éoliennes au réglage de fréquence est techniquement indispensable pour le maintien de la sûreté du système électrique à partir d’un certain taux de pénétration. Deux solutions permettant aux éoliennes de contribuer au réglage de fréquence sont ensuite étudiées par simulations dynamiques. La performance d’une inertie émulée est caractérisée en considérant l’impact du point de fonctionnement initial des éoliennes et des paramètres du contrôleur. La contribution de la réserve éolienne à l’amélioration de la performance dynamique du système est également identifiée.Afin d’évaluer le potentiel et la fiabilité de la réserve éolienne, la dernière partie de ce travail est consacrée aux études statistiques prenant en compte la variabilité et l’incertitude de la prévision de la production. Deux stratégies du placement de réserve sont proposées et comparées. L’impact des erreurs de prévision sur le potentiel de réserve éolienne est également mis en évidence. Enfin l’énergie réglante d’une ferme et la plage de réglage du statisme éolien sont caractérisées
The increasing development of wind power that does not participate in frequency control leads to new challenges in the management of electrical power systems. The problems are more significant in weak power grids. The present thesis aims to evaluate the performance and the reliability of frequency response from wind turbines on a system-wide scale. Studies are applied onto an isolated power grid.First of all, the impact of high levels of wind penetration on primary reserve allocation and on grid dynamic behaviour is characterized. It is shown that the participation of wind turbines in frequency regulation is technically required for maintaining power system security from a certain wind penetration rate.Two solutions allowing wind turbines to contribute to frequency control are then studied through dynamic simulations. The performance of emulated inertia is characterized by taking into account the impact of initial wind operating point and controller parameters. The contribution of wind power reserve to system dynamic performance improvement is also identified.In order to assess the potential and the reliability of wind primary reserve, the last part of this research work is devoted to statistical analyses considering the variability and the prediction uncertainty of wind generation. Two strategies for reserve allocation are proposed and compared. The impact of forecast errors on the potential of wind power reserve is also highlighted. Finally the power frequency characteristic of a wind farm as well as the droop adjustment range is characterized