Academic literature on the topic 'Lactobacillus rhamnosus – Aspect moléculaire'

Les souches Lactobacillus rhamnosus RW-9595M et ATCC 9595 possèdent 17 cadres de lecture ouverts (ORF) identiques à 99 % identifiés comme gènes de biosynthèse putatifs des EPS. Par contre, les quantités produites diffèrent avec 543 mg l-1 pour RW-9595M et 108 mg l-1 pour ATCC 9595. La phosphorylation réversible a été proposée comme mécanisme pour réguler la polymérisation des EPS chez les bactéries lactiques. Parmi les protéines participant à la polymérisation, on propose la tyrosine kinase, la tyrosine phosphatase et la co-polymérase. Cette étude cherche à démontrer l’impact de la phosphorylation de ces protéines, surtout la co-polymérase (Wzd), sur le complexe de ces protéines chez L. rhamnosus. Afin de tester l’effet de la phosphorylation sur leurs interactions, Wzd (co-polymérase) et Wze (kinase) ont été exprimées chez L. lactis ou chez E. coli. Chez L. lactis ssp. cremoris, certaines combinaisons de gènes peuvent être associées à la production d'EPS in vivo. Chez E. coli, l'expression des gènes peut être contrôlée, permettant d'exprimer et de purifier des protéines dans le but d'effectuer l'étude de leurs interactions in vitro. Les clones de la souche L. lactis ssp. cremoris MG1363 (naturellement non productrice d’EPS) transformée avec l’opéron EPS de RW-9595M ou ATCC 9595 produisent respectivement 326 et 302 mg l-1, mais avec des rendements inférieurs à la production chez la souche d'origine RW-9595M. Lors des essais in vitro, Wzd et Wze ne s’autophosphorylent pas lorsqu'elles sont seules, mais ensemble elles forment un complexe. Le complexe entre ces deux protéines non phosphorylées permet la phosphorylation de Wzd par Wze en présence d’ATP. Wze est libérée par la déstabilisation de cette interaction suivant la phosphorylation. L’existence de Wzd phosphorylée et de l’ATP conduit à l’auto-phosphorylation de Wze par une interaction transitoire. De plus, l’activité de Wzd est modulée par la phosphorylation des tyrosines en permettant l’autophosphorylation de Wze. Or, la phosphorylation de Wzd peut être une étape de phosphorylation réversible pour la polymérisation des EPS. Cette étude contribue à la compréhension de la relation entre les caractéristiques et les fonctions biologiques des polymères d'EPS.<br>Lactobacillus rhamnosus RW-9595M and ATCC 9595 have 99 % identical 17 open reading frames (ORFs) identified as putative genes coding for EPS biosynthesis and both strains produce very different EPS amounts: 543 mg l-1 (RW-9595M) and 108 mg l-1 (ATCC 9595). Reversible phosphorylation has been proposed as a mechanism to regulate the polymerization of EPS in lactic acid bacteria and three proteins, tyrosine kinase, tyrosine phosphatase and co-polymerase are proposed to be responsible for this regulation. The aim of this project was to demonstrate the impact of the phosphorylation of these proteins, especially the co-polymerase (Wzd), on the protein complex for EPS polymerization in L. rhamnosus. To test the effect of phosphorylation on their interactions, Wzd and Wze were expressed in L. lactis subsp. cremoris and E. coli. In L. lactis subsp. cremoris, the presence of certain combinations of genes can be associated with EPS production yields. In E. coli, gene expression can be controled and the proteins purified in order to study their interactions and phosphorylation state in vitro. Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363, a non EPS-producing strain, was transformed with two recombinant plasmids coding for the genes required for EPS synthesis. These transformants with operons from either RW-9595M or ATCC 9595 produce 326 and 302 mg l-1 respectively, with lower yields than RW-9595M. The proteins encoded by wzd and wze are respectively the co-polymerase and the kinase which theoretically participate in determining the chain length of the EPS. These two proteins do not autophosphorylate when they are alone, but together form a complex. The non-phosphorylated complex of two proteins allows the phosphorylation of Wzd by Wze, in the presence of ATP. This phosphorylation destabilizes the protein interaction with Wze. The transient interaction with phosphorylated Wzd leads to autophosphorylation of Wze in the presence of ATP. In addition, the activity of Wzd is modulated by tyrosine phosphorylation allowing autophosphorylation of Wze. Thus, the phosphorylation of Wzd may be an additional step of reversible phosphorylation for polymerization of EPS. This study may help advance our understanding of the relationship between the characteristics and biological functions of these polymers.

Un procédé de fermentation basé sur une coculture des souches probiotiques Lactobacillus rhamnosus R et Lactobacillus rhamnosus RW9595M a été utilisé pour coproduire des exopolysaccharides (EPS) de poids moléculaires modulés. Dans cette étude, les deux souches ont été cultivées séparément et en coculture. Les souches ont été cultivées durant 72 h, à 37 °C, sous contrôle de pH à 6.0, et avec une agitation de 100 r.p.m. Deux milieux de culture ont été testés, le milieu minimum basai supplémenté (BMM-S) avec 1.1% (v/v) de tryptone et le perméat de lactosérum supplémenté (PLS) avec 1.1% (v/v) de tryptone, 0.5 mg /L de MgS04, 0.05 mg /L de MnS04 et 0.1% de Tween 80. La croissance cellulaire des souches et le poids moléculaire ont été mesurés au cours de la fermentation par dénombrement sur gélose et par HPLC-SEC, respectivement. Lorsque les souches ont été cocultivées dans le BMM-S en proportion de 1 :1, 991 ±30 mg/L d'EPS avec des poids moléculaires de 1.0 ± 0.21 x 106, 1.6 ± 0.16 x 106 Da, et 1.9 ± 0.18 x 105 Da, ont été obtenus. Dans le milieu PLS, les souches ont été cocultivées en proportion de 9:1 (R/RW9595M), 657 ± 90 mg/L d'EPS avec des poids moléculaires de 5.59 ± 0.82 x 104Da, ont été obtenus. La croissance cellulaire individuelle a été mesurée par qPCR-TaqMan pour les essais dans le milieu PLS. La concentration cellulaire maximale pour chaque souche était de 2.05 x 109 UFC/mL pour Lb. rhamnosus R, et de 3.67 x 108 UFC/mL pour Lb. rhamnosus RW9595M. Ce procédé est simple et économique pour la culture des probiotiques à haute valeur ajoutée en fabrications alimentaires.

Le microbiote exerce sur la santé humaine des effets bénéfiques essentiels qui peuvent être renforcés par l'administration de probiotiques. Ces micro-organismes vivants qui, selon la définition, administrés en quantité adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l'hôte, sont souvent issus de la flore humaine et appartiennent pour la plupart aux bactéries lactiques, en particulier au genre Lactobacillus. Ainsi la souche probiotique L. Rhamnosus Lcr35 lyophilisée avec son milieu de culture constitue le principe actif de produits pharmaceutiques indiqués dans le traitement des diarrhées et la prévention des vaginites, commercialisés de longue date dans de nombreux pays. L'objectif de notre travail a consisté à caractériser d'un point de vue moléculaire cette bactérie ainsi que ses interactions avec les cellules de l'hôte. L'utilisation de plusieurs techniques de typage moléculaire (séquençage, ribotypage, électrophorèse en gradient de température) a permis d'établir que la souche Lcr35 appartient effectivement à l'espèce L. Rhamnosus, avec une proximité plus grande vis-à-vis du probiotique L. Rhamnosus GG qu'avec la seule souche type de l'espèce. Les profils d'électrophorèse en champ pulsé et d'amplification génique (PCR) basée sur des séquences répétées (rep-PCR) de 2 isolats de Lcr35 issus de lots produits à 40 ans d'intervalle se sont avérés identique montrant l'excellente conservation de la souche au cours du temps. Au contraire, des profils nettement distincts ont été obtenus pour 7 autres souches du groupe des L. Casei par ailleurs phénotypiquement proches. Par une technique d'hybridation soustractive contre le génome de L. Rhamnosus GG, 5 séquences spécifiques de Lcr35, dont 2 phagiques, ont été mises en évidence. L'ensemble des résultats obtenus a conduit à développer des méthodes de PCR et de rep-PCR rapides et discriminantes permettant l'identification de la souche probiotique Lcr35 en routine. Afin de qualifier les mécanismes d'action de ce probiotique, nous avons dans un 1er temps cherché à déterminer quels étaient les gènes bactériens spécifiquement mis en jeu in vivo dans un modèle murin, en utilisant la resolvase-based in vivo expression technology (R-IVET). Bien que cette technique n'ait pas pu être menée à son terme avec succès, les différentes étapes réalisées sont présentées et interprétées dans ce mémoire. Par ailleurs, nous avons montré que L. Rhamnosus Lcr35 est capable d'adhérer rapidement et efficacement à des cellules humaines cervicales et vaginales immortalisées in vitro. Ce probiotique exerce également un effet microbicide vis-à-vis de Prevotella bivia et Gardnerella vaginalis, des pathogènes fréquemment associés aux vaginites bactériennes, ainsi qu'à l'encontre du principal agent des candidoses, Candida albicans. Ces résultats soulignent l'intérêt thérapeutique de la bactérie Lcr35 utilisée comme principe actif dans le traitement et la prophylaxie des affections vaginales microbiennes communes. Enfin, une analyse de la réponse de cellules épithéliales (intestinales et vaginales) et dendritiques humaines in vitro au contact de la souche Lcr35 a révélé des modifications transcriptionnelles significatives, notamment pour les cellules dendritiques. Les principales modifications d'expression concernent des gènes impliqués dans la réponse immunitaire, la présentation des antigènes, la transduction des signaux et - surtout chez les cellules épithéliales - les processus d'adhésion cellulaire. De plus, les modifications des réponses transcriptionnelles observées étaient étroitement corrélées à l'inoculum bactérien mis au contact des cellules, démontrant ainsi une relation effet-dose<br>Microbiota exert essential beneficial effects on human health which can be reinforced by administering probiotics. These live microorganisms which, according to their definition, confer a health benefit on the host when administered in adequate amounts, are often isolated from human flora and most belong to the lactic acid bacteria, in particular to the genus Lactobacillus. Thus, the probiotic strain L. Rhamnosus Lcr35 lyophilized with its culture medium constitutes the active substance of pharmaceutical products that have long been used in the treatment of diarrhoea and prevention of bacterial vaginosis in numerous countries woldwide. The aim of our work consisted in molecular characterization of this bacterium and its interactions with the host cells. Using several molecular typing methods (sequencing, ribotyping, temperature gradient gel electrophoresis), we established that strain Lcr35 belongs to the L. Rhamnosus species with a greater similarity to the probiotic L rhamnosus GG than to the species type strain. Patterns obtained from two isolates of Lcr35 sampled 40 years apart bu pulsed-field gel elctrophoresis and repetitive DNA element-based (rep-)PCR could not be distinguished, showing the excellent preservation of the strain over time. In contrast, seven strains belonging to the L. Casei group displayed clearly distinct patterns, despite being phenotypically close. Subtractive hybridization using the L. Rhamnosus GG genome as a driver revealed five Lcr35-specific sequences, of which two were phage-related. On the basis of these findings, rapid and discriminative PCR and rep-PCR methods for routine identification of the probiotic dtrain Lcr35 were developed. In order to qualify the mechanisms of action of this probiotic strain, we first tried to determine which genes were specifically involved in vivo in a murine model, using resolvase-based in vivo expression technology (R-IVET). Although this technique could not be carried through all its stages, those successfully completed are presented and commented on. We also showed that L rhamnosus Lcr35 was able to adhere rapidly and efficiently to immortalized human cervical and vaginal cells in vitro. The strain exhibited microbicidal activity against Prevotella bivia and Gardnerella vaginalis, pathogens frequently involved in bacterial vaginosis, and against the common fungal pathogen Candida albicans, the main causative agent of candidiasis. It is of interest, therefore, as a therapeutic agent for the treatment and prevention of common vaginal infection disorders. Finally, analysis of the response of human epithelial (intestinal and vaginal) and dentritic cells in vitro to contact with strain Lcr35 showed significant transcriptional modifications, especially ofr the dendritic cells. The main modifications in expression affect genes involved in immune response, antigen processing and presentation, signal transduction and - particularly in epithelial cells - cell adhesion processes. The modifications in transcriptional responses observed in the human cells were closely correlated to the bacterial inoculum in contact, thus demonstrating a dose-effect relationship

La cryopréservation engendre des dégradations variables de l’activité biologique et des fonctionnalités des bactéries lactiques, notamment chez Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, un starter de l’industrie laitière. Le but de ce travail a été d’identifier les marqueurs cellulaires de cryorésitance et de cryosensibilité afin de mieux comprendre les mécanismes de dégradation sous-jacents et d’améliorer les performances industrielles des bactéries lactiques. La cryopresérvation a ici été considérée comme une combination de deux stress majoritaires : froid et osmotique. Une attention particulière a été portée à l’analyse de la membrane cellulaire, un site majeur de dégradation lié à la congélation, mais également à la paroi cellulaire et aux protéines. De plus, les cellules ont été analysées à différentes échelles d’observation, de la population jusqu’à la cellule unique, afin de quantifier l’hétérogénéité des propriétés cellulaires existant au sein de populations. Dans une première partie de ce travail, des conditions de culture ont été comparées pour identifier deux souches de L. bulgaricus présentant des résistances contrastées vis-à-vis de la congélation. Une analyse génomique comparative des souches a également été menée dans le but de fournir des pistes de compréhension de ces comportements différents. Dans une seconde partie, des propriétés membranaires des cellules ont été évaluées en réponse aux stress froid et osmotique : composition en acides gras, organisation au niveau des chaînes d’acides gras et des têtes phospholipidiques, et fluidité.Leur fluidité membranaire a également été caractérisée à une échelle subcellulaire par microscopie de fluorescence au moyen du rayonnement synchrotron, permettant la quantification des hétérogénéités inter- et intra-cellulaires. Enfin, un développement technique et méthodologique a été entrepris afin de permettre l’analyse de bactéries individuelles en milieu aqueux par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, et ainsi leur signature biochimique en conditions natives. Ces approches complémentaires et multidisciplinaires ont révélé l’existence de propriétés et d’organisation différentes de la membrane des deux souches de L. bulgaricus. Différents types d’interaction entre les molécules cryoprotectrices du milieu extracellulaire et la membrane des deux souches a été proposé, pouvant être à l’origine des dommages causés à la souche sensible. De plus, une hétérogénéité plus importante au sein de la population sensible a été identifiée, attribuée à des différences en termes de composition biochimique et d’organisation au niveau de la membrane et de la paroi. Finalement, ce travail suggère quelques marqueurs cellulaires d’évaluation de la cryorésistance des bactéries lactiques, et fournit des méthodes de caractérisation de l’hétérogénéité biochimique au sein des populations. Ceux-ci pourraient être appliqués à l’étude de toute autre étape critique du procédé de production des bactéries lactiques, et pourraient être utiles pour aller vers la production de ferments homogènes au niveau de leur résistance<br>Cryopreservation leads to variable degradation of the biological activity and functionality among lactic acid bacteria (LAB), particularly Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, a dairy starter of industrial relevance. The aim of this work was to identify cellular markers of cryoresistance or cryosensitivity for better understanding the mechanisms of cell cryoinjury and increasing LAB industrial performances. Cryopreservation was here considered as a combination of cold and osmotic stresses. A particular focus was given to the analysis of the cell membrane, recognised as a primary site of cryoinjury, but also of the cell wall and proteins. Moreover, cells were analysed from the population level down to the single-cell level to quantify the heterogeneity of cell properties within populations. In the first part of this work, bacterial cultivation conditions were compared to identify two L. bulgaricus strains with markedly different cell cryoresistance. Moreover, a comparative genomic analysis of the strains was performed to provide some clues for the explanation of their different behaviours. In the second part of this work, the membrane properties were evaluated in response to the cold and osmotic stresses: fatty acid composition, organisation of fatty acyl and phospholipid headgroups, and fluidity.Subcellular membrane fluidity was also characterised by fluorescence microscopy using synchrotron radiation, enabling the quantification of inter- and intra-cellular heterogeneities. Finally, original methodological and technical developments were undertaken to achieve the analysis of individual bacterial cells in an aqueous environment by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy, for the analysis of the biochemical signature of cells under native conditions. These complementary multidisciplinary approaches revealed different properties and organisation of the membrane of both L. bulgaricus strains. It was proposed that different types of interaction between cryoprotectants of the extracellular matrix and the membrane of both strains could be at the origin of cryoinjury for the sensitive strain. Moreover, a high population heterogeneity characterised the cryosensitive strain, ascribed to differences in terms of biochemical composition and organisation of the membrane and cell wall. Altogether, this work suggests some cellular markers to evaluate LAB cryoresistance and provides methods to characterize population biochemical heterogeneity. These could be applied to any other stressful step of their production process, and should be useful for future production of homogeneous populations of resistant LAB